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CN114423449A - 联合免疫调节及其用途 - Google Patents

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CN114423449A
CN114423449A CN202080038787.4A CN202080038787A CN114423449A CN 114423449 A CN114423449 A CN 114423449A CN 202080038787 A CN202080038787 A CN 202080038787A CN 114423449 A CN114423449 A CN 114423449A
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董一洲
李文清
张诚翔
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Abstract

本公开涉及用于调节免疫系统和用于治疗癌症和其他免疫疾患的组合物和方法。

Description

联合免疫调节及其用途
相关申请的交叉引用
本申请要求2019年3月25日提交的美国临时申请第62/823,184号的权益，所述美国临时申请以引用方式明确并入本文。
关于联邦政府赞助研究的声明
本发明根据国家卫生研究院(National Institutes of Health)授予的授权号R35GM119679下的政府资助产生。政府对本发明具有一定权利。
技术领域
本公开涉及用于调节免疫系统和用于治疗癌症和其他免疫疾患的组合物和方法。
背景技术
免疫疗法已成为治疗多种疾病(包括各种癌症)的革命性策略。由于关键的免疫调节分子和免疫信号被鉴定并制备为治疗剂，因此可以使用众所周知的癌症模型来测试此类治疗剂的临床有效性。免疫治疗策略包括施用疫苗、活化细胞、抗体、细胞因子和趋化因子。
肿瘤的生长和转移在很大程度上取决于它们逃避宿主免疫监督和克服宿主防御的能力。大多数肿瘤表达的抗原可以在不同程度上被宿主免疫系统识别，但是在许多情况下，免疫应答是不够的。未能引起效应T细胞的强烈激活可能是由于肿瘤抗原的弱免疫原性或由肿瘤细胞进行的不适当共刺激分子表达或缺乏共刺激分子表达。对于大多数T细胞，增殖和IL-2产生需要在T细胞受体接合期间的共刺激信号，否则，T细胞可能进入功能上无反应的状态。
迄今为止，已经开发了许多治疗剂和抗体作为免疫治疗剂来调节免疫系统。需要用于刺激免疫系统以治疗癌症和其他免疫疾患的新组合物和方法。
发明内容
本文公开了调节免疫系统以治疗癌症和其他免疫疾患的组合物和方法。发明人惊奇地发现，当将编码共刺激分子的mRNA与特异性结合该共刺激分子的抗体一起施用时，这种组合提供了改进的肿瘤疗法和总体存活率。
在一些方面中，本文公开了一种组合物，所述组合物包含：特异性结合共刺激分子的抗体、配体或其抗原结合片段；以及包含编码该共刺激分子的mRNA的纳米粒子。
在一些实施方案中，编码共刺激分子的mRNA被纳米粒子包封。
在一些实施方案中，共刺激分子选自ICOS、CD28、CD27、HVEM、LIGHT、CD40L、4-1BB、OX40、DR3、GITR、CD30、SLAM、CD2、CD226、半乳凝素9、TIM1、LFA1、B7-H2、B7-1、B7-2、CD70、LIGHT、HVEM、CD40、4-1BBL、OX40L、TL1A、GITRL、CD30L、SLAM、CD48、CD58、CD155、CD112、CD80、CD86、ICOSL、TIM3、TIM4、ICAM1或LFA3。在一些实施方案中，共刺激分子包括OX40。在一些实施方案中，共刺激分子包括4-1BB(CD137)。
在一些实施方案中，编码共刺激分子的mRNA包含异源5′非翻译区(5′UTR)。在一些实施方案中，编码共刺激分子的mRNA包含异源3′非翻译区(3′UTR)。
在一些方面中，本文公开了一种药物组合物，所述药物组合物包含药学上可接受的载体和有效量的特异性结合共刺激分子的抗体、配体或其抗原结合片段，以及包含编码该共刺激分子的mRNA的纳米粒子。
在一些方面中，本文公开了一种刺激T细胞的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的组合物，所述组合物包含：特异性结合共刺激分子的抗体、配体或其抗原结合片段；以及包含编码该共刺激分子的mRNA的纳米粒子。
在一些实施方案中，受试者是哺乳动物。在一些实施方案中，哺乳动物是人。
在一些方面中，本文公开了一种治疗癌症的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的特异性结合共刺激分子的抗体、配体或其抗原结合片段；以及包含编码共刺激分子的mRNA的纳米粒子。
在一些实施方案中，癌症包括结肠直肠癌或黑素瘤。在一些实施方案中，本文的组合物用于治疗局部肿瘤和转移性肿瘤两者。
在一些实施方案中，受试者是哺乳动物。在一些实施方案中，哺乳动物是人。
在一些实施方案中，所述方法还包括施用另外的治疗剂。在一些实施方案中，所述另外的治疗剂包括另外的免疫治疗剂。在一些实施方案中，免疫治疗剂选自抗PDL1抗体、抗PD1抗体、抗CTLA4抗体、或它们的组合。
附图简述
并入本说明书且构成其一部分的附图图解了下文所述的几个方面。
图1示出了用磷酸盐缓冲盐水(phosphate buffered saline，PBS)对照或纳米粒子(nanoparticle，NP)-OX40 mRNA处理的EG.7-OVA细胞。OX40阳性细胞通过流式细胞仪细胞分选分析进行定量。
图2A至图2B示出了在不同治疗之后，B16黑素瘤植入小鼠的肿瘤体积变化(图2A)和该小鼠的存活曲线(图2B)。NP+OX40抗体对比NP/OX40 mRNA+OX40抗体：P＝0.0010，对数秩检验。PBS对比NP/OX40 mRNA+OX40抗体：P＝0.0002，对数秩检验。NP代表空白NP；NP/OX40代表包含OX40 mRNA的NP。
图3示出了在不同治疗之后CT26结肠癌小鼠肿瘤模型的肿瘤体积变化。用PBS、纳米粒子(NP)+抗OX40抗体、纳米粒子(NP)/OX40mRNA+抗OX40抗体、和纳米粒子(NP)/OX40mRNA+抗OX40抗体处理小鼠。纳米粒子(NP)/OX40 mRNA在抗OX40抗体后6小时注射(注射间隔：6小时)；或者纳米粒子(NP)/OX40 mRNA与抗OX40抗体同时注射(注射间隔：0小时)。NP代表空白NP；NP/OX40代表包含OX40 mRNA的NP。
图4A至图4D示出了T细胞介导的癌症免疫疗法的刺激。图4A示出了通过纳米粒子递送共刺激受体mRNA，之后注射共刺激受体的激动性抗体(例如PL1-OX40 mRNA+抗OX40抗体)进行的增强抗体免疫疗法的图示。图4B示出了以下仿生化合物的代表性合成路线：磷脂和糖脂衍生物。i.Et3N、甲苯，室温；ii.Et3N、DMF、室温；iii.TFA、CH2Cl2，室温，iv.醛、Et3N、THF、NaBH(OAc)3。图4C至图4D示出了磷脂衍生物PL1至PL18(图4C)和糖脂衍生物GL1至GL16(图4D)的结构。
图5A至图5G示出了用于mRNA递送的仿生磷脂衍生的和糖脂衍生的纳米粒子。图5A示出了向E.G7细胞递送萤火虫荧光素酶(firefly luciferase，Fluc)mRNA的磷脂衍生的和糖脂衍生的纳米粒子的发光强度。图5B示出了PL1-OX40纳米粒子的冷冻-TEM图像。比例尺＝50nm。图5C示出了PL1纳米粒子向E.G7细胞递送GFP mRNA。图5D示出了E.G7细胞中PL1-CD137诱导的CD137表达。图5E示出了EG.7细胞中PL1-OX40诱导的OX40表达。图5F示出了单次注射游离GFP mRNA或PL1-GFP后B16F10肿瘤中GFP表达的方案。图5G示出了在B16F10肿瘤中用GFP mRNA(n＝4)或PL1-GFP mRNA(n＝5)单次瘤内注射后CD4+T细胞、CD8+T细胞中的GFP表达。图5A至图5E中的数据来自n＝3个生物学独立的样本。所有数据均表示为平均值±标准偏差。通过双尾学生t检验分析图5C、图5D、图5E和图5G中的统计显著性。*P＜0.05；**P＜0.01；****P＜0.0001；n.s.表示非显著的。
图6A至图6D示出了在用PL1-CD137 mRNA+抗CD137抗体治疗后B16F10肿瘤和A20肿瘤的消退。图6A和图6B示出了C57BL/6小鼠皮下(s.c.)植入B16F10黑素瘤细胞。PBS、PL1+抗CD137抗体或PL1-CD137+抗CD137抗体治疗后小鼠(n＝10只/组)的肿瘤体积(图6A)和存活率(图6B)。PL1-CD137(10μg mRNA/小鼠)和抗CD137抗体(16μg/小鼠)。每隔一天给予六次瘤内注射剂量。图6C和图6D示出了BALB/c小鼠皮下植入A20淋巴瘤细胞。用PBS(n＝10)、PL1+抗CD137抗体(n＝12)、或PL1-CD137+抗CD137抗体(n＝12)处理的小鼠的肿瘤体积(图6C)和存活率(图6D)。PL1-CD137(10μg mRNA/小鼠)和抗CD137抗体(16μg/小鼠)。每隔一天给予六次瘤内注射剂量。图6A和图6C中的数据表示为平均值±标准偏差。通过双因素方差分析来分析a和c中的统计显著性。通过对数秩(Mantel-Cox)检验分析图6B和图6D中的统计显著性。**P＜0.01；***P＜0.001；n.s.表示非显著的。
图7A至图7D示出了在用PL1-OX40+抗OX40抗体治疗后B16F10肿瘤和CT26肿瘤的消退。图7A至图7B示出了荷有B16F10黑素瘤细胞的C57BL/6小鼠。用PBS、PL1+抗OX40抗体、或PL1-OX40+抗OX40抗体治疗处理的小鼠(n＝10只/组)的肿瘤体积(图7A)和存活率(图7B)。PL1-OX40(10μg mRNA/小鼠)和抗OX40抗体(8μg/小鼠)。每隔一天给予六次瘤内注射剂量。图7C至图7D示出了BABL/c小鼠皮下植入CT26结肠癌细胞。用PBS、PL1+抗OX40抗体、或PL1-OX40+抗OX40抗体处理的小鼠(n＝10-11只/组)的肿瘤体积(图7C)和存活率(图7D)。PL1-OX40(10μg mRNA/小鼠)和抗OX40抗体(8μg/小鼠)。每隔一天给予六次瘤内注射剂量。图7A和图7C中的数据表示为平均值±标准偏差。通过双因素方差分析来分析图7A和图7C中的统计显著性。通过对数秩(Mantel-Cox)检验分析图7B和图7D中的统计显著性。**P＜0.01；***P＜0.001；****P＜0.0001。
图8A至图8H示出了用PL1-OX40+抗OX40抗体处理后A20肿瘤的消退。图8A示出了A20小鼠肿瘤模型和治疗方案的示意图。图8B示出了六次瘤内注射剂量的PBS、PL1-OX40(10μg mRNA/小鼠)、PL1+抗OX40抗体(8μg/小鼠)、或PL1-OX40+抗OX40抗体之后个体小鼠(n＝8-10)的肿瘤体积。图8C和图8D示出了肿瘤体积(图8C)和总体存活率(图8D)。图8E示出了对在用PL1-OX40+抗OX40抗体处理后具有完全应答的小鼠(n＝6)的再攻击。图8F示出了用于在用PBS(n＝5)、OX40 mRNA(n＝5)或PL1-OX40(n＝6)单次瘤内注射后评价CD8+T细胞上的OX40表达的治疗计划。图8G和图8H示出了在分别用PBS(n＝5)、PL1+抗OX40抗体(n＝4)、或PL1-OX40+抗OX40抗体(n＝6)进行六次瘤内注射后的免疫细胞分析(CD8+T细胞、CD4+T细胞、巨噬细胞、DC)。图8C、图8F和图8H中的数据表示为平均值±标准偏差。通过双因素方差分析来分析图8C中的统计显著性。通过对数秩(Mantel-Cox)检验分析图8D中的统计显著性。通过双尾学生t检验分析图8F和图8H中的统计显著性。*P＜0.05；**P＜0.01；***P＜0.001；****P＜0.0001；n.s.代表不显著。
图9A至图9J示出了PL1-OX40 mRNA+抗OX40抗体当与手术或检查点抑制剂组合时的抗肿瘤功效。图9A示出了PL1-OX40 mRNA+抗OX40抗体的治疗与手术的组合的示意图(肿瘤体积＜500mm3)。图9B示出了在用PBS、抗OX40(40μg)、或PL1-OX40(ψ)+抗OX40抗体(n＝10)进行六次瘤内注射后个体小鼠(n＝10只/组)的肿瘤体积。图9C和图9D示出了小鼠的肿瘤体积(图9C)和存活率(图9D)。图9E示出了接受PL1-OX40(ψ)+抗OX40(40μg)之后是手术以去除残留肿瘤的小鼠(n＝2)对比对照(n＝5)的再攻击肿瘤体积。图9F示出了PL1-OX40mRNA+抗OX40抗体与抗PD-1+抗CTLA-4抗体联合治疗的示意图。图9G示出了每隔一天接受六次剂量的PBS(n＝10)、抗小鼠PD-1+抗小鼠CTLA-4抗体(n＝10)、或PL1-OX40(ψ)+抗OX40(40μg)与抗PD-1抗体和抗CTLA-4抗体(n＝10)的个体小鼠的肿瘤体积。将抗小鼠PD-1+抗小鼠CTLA-4抗体每三天腹腔注射一次，共六次剂量。图9H和图9I示出了小鼠的肿瘤体积(图9H)和存活率(图9I)。图9J示出了对用PL1-OX40(ψ)+抗OX40(40μg)+抗PD-1+抗CTLA-4抗体(n＝6)对比对照(n＝7)进行的治疗完全应答的小鼠的再攻击肿瘤体积。图9C、图9E、图9H和图9J中的数据表示为平均值±标准偏差。通过双因素方差分析来分析图9C和图9H中的统计显著性。通过对数秩(Mantel-Cox)检验分析图9D和图9I中的统计显著性。***P＜0.001；****P＜0.0001；n.s.表示非显著的。
图10A至图10F示出了肺转移小鼠模型中的抗肿瘤功效。图10A示出了用PBS、抗PD-1+抗CTLA-4抗体、或PL1-OX40 mRNA+抗OX40抗体+抗PD-1+抗CTLA-4抗体处理的B16F10细胞的肺转移的示意图。以箭头示出了每三天接受PBS的腹腔注射(n＝7)、抗小鼠PD-1+抗小鼠CTLA-4抗体的腹腔注射(n＝8)、或PL1-OX40(ψ)的静脉注射+抗OX40的腹腔注射(100μg)+抗PD-1抗体+抗CTLA-4抗体的腹腔注射(n＝9)的小鼠。图10B示出了小鼠肺中的代表性黑素瘤转移。图10C示出了肺重量。图10D至图10F分别示出了对来自不同治疗(n＝4、5、5)的肺中CD8+T细胞、CD4+T细胞、Foxp3+CD4+(Treg)细胞的免疫细胞分析。图10C至图10F中的数据表示为平均值±标准偏差。通过双尾学生t检验分析图10C至图10F中的统计显著性。*P＜0.05；**P＜0.01；***P＜0.001；****P＜0.0001；n.s.表示非显著的。
图11示出了以下仿生脂质的结构：磷脂和糖脂衍生物。PL1和GL1作为代表性示例，由仿生头(磷酸根头或糖头)、可电离的氨基核和多个疏水尾构成。
图12A至图12C示出了磷脂衍生的和糖脂衍生的纳米粒子的表征。图12A示出了粒度(nm)和PDI。图12B示出了ζ电位(mV)。图12C示出了Fluc mRNA的包封率。所有数据均来自n＝3个生物独立样本，并表示为平均值±标准偏差。
图13示出PL1纳米粒子的内吞途径。将E.G7-OVA细胞用5-(N-甲基-N-异丙基)阿米洛利(EIPA)、盐酸氯丙嗪(CPZ)或甲基-β-环糊精(MβCD)处理。0.5小时后，用PL1-Alexa-Fluor 647标记的RNA纳米粒子处理细胞。在3小时后，通过流式细胞术分析细胞。所有数据均来自n＝3个生物学独立样本，并且表示为平均值±标准偏差。通过双尾学生t检验分析统计显著性。*P＜0.05。
图14A至图14C示出了在单次注射GFP mRNA或PL1-GFP mRNA后B16F10肿瘤中的GFP表达。在肿瘤微环境中用GFP mRNA(n＝4)和PL1-GFP mRNA(n＝5)单次瘤内注射后的巨噬细胞(图14A)和树突细胞(图14B)。图14C中的数据表示为平均值±标准偏差。通过双尾学生t检验分析统计显著性。**P＜0.01，***P＜0.001。
图15A和图15B示出了肿瘤生长曲线。图15A示出了C57BL/6小鼠皮下植入B16F10黑素瘤细胞。用PBS(n＝10)、PL1+抗CD137抗体(n＝10)、或PL1-CD137+抗CD137抗体(n＝10)处理的个体小鼠的肿瘤体积。PL1-CD137(10μg mRNA/小鼠)和抗CD137抗体(16μg/小鼠)。每隔一天进行一次肿瘤内注射，共六次剂量。图15B示出了BALB/c小鼠皮下植入A20淋巴瘤细胞。用PBS(n＝10)、PL1+抗CD137抗体(n＝12)和PL1-CD137+抗CD137抗体(n＝12)、PL1-CD137(10μg mRNA/小鼠)和抗CD137(16μg/小鼠)处理的个体小鼠的肿瘤体积。每隔一天进行一次肿瘤内注射，共六次剂量。
图16A和图16B示出了肿瘤生长曲线。图16A示出了C57BL/6小鼠皮下植入B16F10黑素瘤细胞。用PBS(n＝10)、PL1+抗OX40抗体(n＝10)或PL1-OX40+抗OX40抗体(n＝10)处理的个体动物的肿瘤体积。PL1-OX40(10μg mRNA/小鼠)和抗OX40抗体(8μg)。每隔一天进行一次肿瘤内注射，共六次剂量。图16B示出了BABL/c小鼠皮下植入CT26细胞。用PBS(n＝10)、PL1+抗OX40抗体(n＝11)和PL1-OX40+抗OX40抗体(n＝11)处理的个体动物的肿瘤体积。PL1-OX40(10μg mRNA/小鼠)和抗OX40抗体(8μg/小鼠)。每隔一天进行一次肿瘤内注射，共六次剂量。
图17A至图17B示出了免疫细胞群和细胞因子水平的分析。图17A示出了在肿瘤微环境中用PBS(n＝5)、OX40 mRNA(n＝5)或PL1-OX40 mRNA(n＝6)单次瘤内注射后CD4+T细胞、巨噬细胞和树突细胞的表面上的OX40表达。图17B示出了单次瘤内注射PBS(n＝5)、OX40mRNA(n＝4)或PL1-OX40 mRNA(n＝6)后的小鼠血浆细胞因子水平。所有数据均表示为平均值±标准偏差。通过双尾学生t检验分析统计显著性。**P＜0.01；***P＜0.001；****P＜0.0001；n.s.表示非显著的。
图18示出了CD4+T细胞或CD8+T细胞耗竭对PL1-OX40+抗OX40抗体治疗的免疫疗法的影响。IgG+PL1-OX40+抗OX40(n＝9)、抗小鼠CD8α+PL1-OX40+抗OX40(n＝9)、或抗小鼠CD4+PL1-OX40+抗OX40(n＝9)的肿瘤体积。所有数据均表示为平均值±标准偏差。通过双因素方差分析来分析统计显著性。***P＜0.001。
图19示出了六次剂量的瘤内治疗后的血浆细胞因子。PBS(n＝5)、PL1+抗OX40(n＝6)和PL1-OX40+抗OX40(n＝6)。数据表示为平均值±标准偏差。通过双尾学生t检验分析统计显著性。n.s.表示非显著的。
图20A至图20B示出了肺转移小鼠模型中的抗肿瘤功效。将2×105个B16F10细胞静脉注射到C57BL/6小鼠体内。小鼠每三天接受PBS的腹腔注射(n＝7)、抗小鼠PD-1+抗小鼠CTLA-4抗体的腹腔注射(n＝8)、或PL1-OX40(ψ)的静脉注射+抗OX40的腹腔注射(100μg)+抗PD-1抗体+抗CTLA-4抗体的腹腔注射(n＝9)。图20A示出了小鼠体重。数据表示为平均值±标准差。图20B示出了在静脉注射B16F10细胞后第19天小鼠肺中黑素瘤转移的图像。
图21A至图21D示出了在用PL1-OX40的瘤内注射和抗OX40抗体的腹腔注射处理后B16F10肿瘤的消退。图21A示出了B16F10小鼠肿瘤模型和治疗方案的示意图。图21B示出了六次瘤内注射剂量的PBS、PL1-OX40(ψ)(10μg mRNA/小鼠)和两次腹腔注射剂量的抗OX40抗体(150μg/小鼠)后个体小鼠(n＝10/组)的肿瘤体积。图21C至图21D示出了肿瘤体积(图21C)和总体存活率(图21D)。图21C中的数据表示为平均值±标准偏差。通过双因素方差分析来分析c中的统计显著性。通过对数秩(Mantel-Cox)检验分析图21D中的统计显著性。***P＜0.001；****P＜0.0001；n.s.表示非显著的。
图22示出了流式细胞术分析的门控策略。首先在FSC/SSC上对细胞进行门控以限定单个细胞。然后，对CD45阳性细胞、CD3阳性细胞、CD4/CD8阳性细胞和OX40/GFP阳性细胞进行门控。此外，对CD45阳性细胞、CD11b阳性细胞、CD11c/F4/80阳性细胞和OX40/GFP阳性细胞进行门控。
具体实施方式
本文公开了调节免疫系统以治疗癌症和其他免疫疾患的组合物和方法。
现在将详细参考本发明的实施方案，附图和实施例中说明了所述实施方案的示例。然而，本发明可以以许多不同形式来体现且不应该被理解为局限于文中所阐述的实施方案。
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科技术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。本文所用的术语“包括”及其变形与术语“包含”及其变形同义地使用并且是开放的、非限制性术语。尽管本文使用术语“包含”和“包括”来描述各种实施方案，但可使用术语“基本上由......组成”和“由......组成”来代替“包含”和“包括”，以提供更加具体的实施方案，并且也做了公开。除非上下文另外清楚地指出，如本公开内容中和所附权利要求书中所使用，单数形式“一(a/an)”、“所述”包括复数个指示对象。
提供以下定义是为了全面理解本说明书中使用的术语。
术语
如本文所用，术语“可以”、“任选地”和“可任选地”可互换使用并且意在包括条件发生的情况以及条件不发生的情况。因此，例如，制剂“可包含赋形剂”的陈述意在包括制剂包含赋形剂的情况以及制剂不包含赋形剂的情况。
术语“启动子”或“调节元件”是指位于转录起始上游或下游并且参与识别和结合RNA聚合酶和其他蛋白质以启动转录的区域或序列决定簇。启动子不必是细菌来源的，例如，源自病毒或其他生物体的启动子可用于本文所述的组合物、系统或方法中。术语“调节元件”旨在包括启动子、增强子、内部核糖体进入位点(internal ribosomal entry site，IRES)和其他表达控制元件(例如转录终止信号，例如聚腺苷酸化信号和聚U序列)。例如，在Goeddel，Gene Expression Technology：Methods in Enzymology 185，Academic Press，San Diego，Calif.(1990)中描述了此类调节元件。调节元件包括在许多类型的宿主细胞中指导核苷酸序列组成型表达的调节元件和仅在某些宿主细胞中指导核苷酸序列表达的调节元件(例如，组织特异性调节序列)。组织特异性启动子可以指导主要在所需的感兴趣组织，例如肌肉、神经元、骨骼、皮肤、血液、特定器官(例如肝脏、胰腺)或特定细胞类型(例如淋巴细胞)中表达。调节元件也可以以时间依赖性方式，例如以细胞周期依赖性或发育阶段依赖性方式指导表达，其也可能是或可能不是组织或细胞类型特异性的。在一些实施方案中，载体包含一个或多个pol III启动子(例如1个、2个、3个、4个、5个或更多个pol I启动子)、一个或多个pol II启动子(例如1个、2个、3个、4个、5个或更多个pol II启动子)、一个或多个pol I启动子(例如1个、2个、3个、4个、5个或更多个pol I启动子)、或它们的组合。pol III启动子的示例包括但不限于U6启动子和H1启动子。pol II启动子的示例包括但不限于逆转录病毒劳斯肉瘤病毒(Rous sarcoma virus，RSV)LTR启动子(任选地具有RSV增强子)、巨细胞病毒(cytomegalovirus，CMV)启动子(任选地具有CMV增强子)[参见例如Boshart等人，Cell，41：521-530(1985)]、SV40启动子、二氢叶酸还原酶启动子、β-肌动蛋白启动子、磷酸甘油激酶(PGK)启动子和EF1α启动子。术语“调节元件”还涵盖增强子元件，例如WPRE；CMV增强子；HTLV-I的LTR中的R-U5′区段(Mol.Cell.Biol.，第8(1)卷，第466-472页，1988)；SV40增强子；以及兔β-珠蛋白的外显子2与外显子3之间的内含子序列(Proc.Natl.Acad.Sci.USA.，第78(3)卷，第1527-31页，1981)。本领域技术人员将理解，表达载体的设计可取决于诸如待转化宿主细胞的选择、所需表达水平等因素。
术语“重组”是指人操纵的核酸(例如多核苷酸)或人操纵的核酸(例如多核苷酸)的拷贝或互补物，或者如果涉及蛋白质(即，“重组蛋白质”)，则是指由重组核酸(例如多核苷酸)编码的蛋白质。在实施方案中，包含与第二核酸(例如多核苷酸)可操作地连接的启动子的重组表达盒可包括作为人操纵(例如，通过在Sambrook等人，Molecular Cloning-ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.，(1989)或Current Protocols in Molecular Biology第1-3卷，John Wiley & Sons，Inc.(1994-1998)中所述的方法进行人操纵)的结果而异源于第二核酸(例如多核苷酸)的启动子。在另一示例中，重组表达盒可包含以核酸(例如多核苷酸)极不可能在自然界中发现的方式组合的核酸(例如多核苷酸)。例如，人操纵的限制性位点或质粒载体序列可以侧接于启动子或将启动子与第二核酸(例如多核苷酸)分开。本领域技术人员将认识到核酸(例如多核苷酸)可以以多种方式进行操纵并且不限于以上示例。
术语“表达盒”或“载体”是指核酸构建体，所述核酸构建体当被引入宿主细胞时，分别导致RNA或多肽的转录和/或翻译。在实施方案中，包含与第二核酸(例如多核苷酸)可操作地连接的启动子的表达盒可包括作为人操纵(例如，通过在Sambrook等人，MolecularCloning-A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.，(1989)或Current Protocols in Molecular Biology第1-3卷，John Wiley & Sons，Inc.(1994-1998)中所述的方法进行人操纵)的结果而异源于第二核酸(例如多核苷酸)的启动子。在一些实施方案中，包含与第二核酸(例如多核苷酸)可操作地连接的终止子(或终止序列)的表达盒可包括由于人操纵的结果而与第二核酸(例如多核苷酸)异源的终止子。在一些实施方案中，作为人操纵的结果，表达盒包含与第二核酸(例如多核苷酸)可操作连接的启动子和与第二核酸(例如多核苷酸)可操作地连接的终止子。在一些实施方案中，表达盒包含内源启动子。在一些实施方案中，表达盒包含内源终止子。在一些实施方案中，表达盒包含合成(或非天然)启动子。在一些实施方案中，表达盒包含合成(或非天然)终止子。
在两个或更多个核酸或多肽序列的上下文中，术语“同一”或“同一性”百分比是指这样的两个或更多个序列或子序列，所述两个或更多个序列或子序列是相同的或具有指定百分比的氨基酸残基或核苷酸为相同的(即，当比较和比对在比较窗口或指定区域内的最大对应时，在该指定区域内约60％同一性，优选61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的同一性)，如使用具有下述默认参数的BLAST或BLAST 2.0序列比较算法或通过手动比对和目视检查(参见例如，NCBI网站等)测量的。此类序列被称为“基本上同一”。该定义还涉及或可能适用于测试序列的补充。该定义还包括具有缺失和/或添加的序列，以及具有取代的序列。如下所述，优选的算法可考虑空位等。优选地，同一性存在于长度为至少约10个氨基酸或20个核苷酸的区域上，或更优选地存在于长度为10个至50个氨基酸或20个至50个核苷酸的区域上。如本文所用，氨基酸序列同一性百分比(％)被定义为在比对序列并引入空位(如有必要)以实现最大序列同一性百分比之后，候选序列中与参考序列中的氨基酸相同的氨基酸的百分比。为了测定序列同一性百分比的比对可以通过本领域技术范围内的多种方式实现，例如，使用公开获得的计算机软件诸如BLAST、BLAST-2、ALIGN、ALIGN-2或Megalign(DNASTAR)软件。可以通过已知方法确定用于测量比对的适当参数，包括在所比较序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。
对于序列比较，通常一个序列充当参考序列，将测试序列与该参考序列进行比较。当使用序列比较算法时，将测试序列和参考序列输入计算机中，指定子序列坐标(如有必要)和序列算法程序参数。优选地，可以使用默认程序参数，或者可以指定替代参数。然后序列比较算法基于程序参数计算测试序列相对于参考序列的序列同一性百分比。
适用于确定序列同一性百分比和序列相似性的算法的一个示例是BLAST和BLAST2.0算法，所述BLAST和BLAST 2.0算法分别描述于Altschul等人(1977)Nuc.Acids Res.25：3389-3402和Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.215：403-410中。用于执行BLAST分析的软件可通过国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)公开获得。该算法涉及首先通过以下方式来辨识高评分序列对(high scoring sequence pair，HSP)：辨识查询序列中长度为W的短词，所述短词当与数据库序列中相同长度的词比对时匹配或满足某个正值阈值得分T。T被称为邻域词得分阈值(Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.215：403-410)。这些最初的邻域词命中充当种子以用于启动搜索来找到包含它们的更长HSP。只要累积比对得分可增加，词命中就沿着每个序列在两个方向上扩展。对于核苷酸序列，使用参数M(一对匹配残基的奖励得分；总是＞0)和N(错配残基的惩罚得分；总是＜0)计算累积得分。对于氨基酸序列，使用评分矩阵来计算累积得分。当在以下情况下时，词命中在每个方向上的扩展停止：累积比对得分从其最大实现值下降了量X；由于一个或多个负评分残基比对的累积，累积得分变为零或更低；或到达任一序列的末尾。BLAST算法参数W、T和X确定比对的灵敏度和速度。BLASTN程序(用于核苷酸序列)默认使用为11的字长(wordlength，W)、为10的期望值(expectation，E)、M＝5、N＝-4以及两条链的比较。对于氨基酸序列，BLASTP程序默认使用为3的字长、为10的期望值(E)和为50的BLOSUM62评分矩阵(参见Henikoff和Henikoff(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：10915)比对(B)、为10的期望值(E)、M＝5、N＝-4、以及两条链的比较。
BLAST算法还对两个序列之间的相似性执行统计分析(参见例如，Karlin和Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5873-5787)。BLAST算法提供的一种相似性度量是最小总概率(P(N))，其提供了对两个核苷酸或氨基酸序列之间偶然发生匹配的概率的指示。例如，如果测试核酸与参考核酸的比较中的最小总概率小于约0.2，更优选小于约0.01，则认为核酸与参考序列相似。
措辞“密码子优化的”当涉及用于转化各种宿主的核酸分子的基因或编码区时，是指改变多核酸分子的基因或编码区中的密码子以反映选定生物体的典型密码子使用，而不改变由该DNA编码的多肽。此类优化包括用一种或多种更频繁地用于选定生物体的基因中的密码子替换至少一种、多于一种或大量的密码子。
当核酸被置于与另一核酸序列的功能关系中时，该核酸是“可操作地连接的”。例如，如果前序列或分泌前导序列的DNA表达为参与多肽分泌的前蛋白，则所述DNA与多肽的DNA可操作地连接；如果启动子或增强子影响序列的转录，则启动子或增强子与编码序列可操作地连接；或者如果核糖体结合位点经定位以促进翻译，则所述核糖体结合位点与编码序列可操作地连接。通常，“可操作地连接”是指被连接的DNA序列彼此靠近，并且在分泌前导序列的情况下是连续的并且处于阅读阶段。然而，可操作地连接的核酸(例如增强子和编码序列)不必是连续的。连接是通过在方便的限制性位点连接完成的。如果此类位点不存在，则根据常规实践使用合成的寡核苷酸衔接子或接头。在实施方案中，当启动子能够影响(例如相对于不存在启动子的情况进行调节)来自编码序列的蛋白质的表达时，启动子与该编码序列可操作地连接(即，该编码序列处于该启动子的转录控制下)。
术语“核碱基”是指具有沃森/克里克碱基配对功能的核苷酸部分。最常见的天然存在的核碱基腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、尿嘧啶(U)、胞嘧啶(C)和胸腺嘧啶(T)具有氢键合功能，所述氢键合功能可将一条核酸链与另一条核酸链以序列特异性方式结合。
如通篇所使用的，“受试者”(或“宿主”)是指个体。因此，“受试者”可包括例如驯养动物(例如猫、狗等)、家畜(例如，牛、马、猪、绵羊、山羊等)、实验室动物(例如，小鼠、兔、大鼠、豚鼠等)哺乳动物、非人类哺乳动物、灵长类动物、非人类灵长类动物、啮齿动物、禽类、爬行动物、两栖动物、鱼和任何其他动物。受试者可以是哺乳动物，诸如灵长类动物或人。治疗剂的施用可以以对治疗受试者有效的剂量和时间段进行。
如本文所用的术语“约”在涉及诸如量、百分比等的可测量值时，意在涵盖相对于该可测量值的±20％、±10％、±5％或±1％的变化。
如果核酸序列源自外来物种，或者如果来自同一物种，由于人类行为而从其原始形式被修饰时，则该核酸序列与第二核酸序列是“异源的”。例如，与编码序列可操作地连接的异源启动子(或异源5′非翻译区(5′UTR))是指编码序列来自与启动子所来源于的物种不同的物种，或者如果来自相同物种，则编码序列不同于天然存在的等位基因变体(例如，来自不同基因的5′UTR或3′UTR与编码共刺激分子的核酸可操作地连接)。
如本文所用，受试者的术语“治疗”包括向受试者施用药物以治愈、愈合、减轻、缓解、改变、补救、改善、提高、稳定或影响疾病或疾患、或疾病或疾患的症状。术语“治疗”还可以指减轻症状的严重性和/或频率，消除症状和/或根本原因、以及改善或补救损伤。
如本文所用，术语“预防”受试者的疾病、疾患或不希望的生理事件是指预防疾病、疾患或不希望的生理事件，或预防疾病、疾患或不希望的生理事件的症状。
药剂的“有效量”是指足以提供所需效应的药剂的量。“有效的”药剂的量将因受试者而异，具体取决于许多因素，诸如受试者的年龄和总体状况、一种或多种特定药剂等。因此，并不总是可以指定量化的“有效量”。然而，本领域普通技术人员可以使用常规实验来确定任何受试者情况下的适当“有效量”。此外，如本文所用，并且除非另外具体说明，否则药剂的“有效量”还可指涵盖治疗有效量和预防有效量两者的量。达到治疗效应所需的药剂的“有效量”可以根据诸如受试者的年龄、性别和体重的因素而变化。可以调整给药方案以提供最佳的治疗响应。例如，可每天施用若干分开的剂量，或者剂量可以如由治疗情况的紧急事件所指示按比例减小。
“药学上可接受的”组分可以指在生物学上或其他方面不是非期望的组分，即，该组分可以掺入本发明的药物制剂中并如本文所述施用于受试者而不引起显著的非期望的生物学效应或以有害方式与包含该组分的制剂的其他组分中的任何其他组分相互作用。当关于施用于人类使用时，该术语通常意味着该组分已满足毒理学和制造测试的要求标准，或者该组分包含在美国食品和药物管理局(U.S.Food and Drug Administration)编制的非活性成分指南(Inactive Ingredient Guide)中。
“药学上可接受的载体”(有时称为“载体”)是指可用于制备通常安全且无毒的药物或治疗组合物的载体或赋形剂，并且包括可用于兽医和/或人类药物或治疗用途的载体。术语“载体”或“药学上可接受的载体”可包括但不限于磷酸盐缓冲盐水溶液、水、乳液(例如油/水乳液或水/油乳液)和/或各种类型的润湿剂。如本文所用，术语“载体”涵盖但不限于任何赋形剂、稀释剂、填充剂、盐、缓冲剂、稳定剂、增溶剂、脂质、稳定剂或本领域公知的用于药物制剂的其他物质，并且如本文进一步所述。
“治疗剂”是指任何具有有益生物效应的组合物。有益生物效应包括治疗效应(例如，治疗疾患或其他非期望的生理病症)和预防效应(例如，预防疾患或其他非期望的生理病症)两者。所述术语还包括本文具体提及的有益药剂的药学上可接受的、药理学活性的衍生物，包括但不限于盐、酯、酰胺、前药、活性代谢物、异构体、片段、类似物等。当使用术语“治疗剂”时，或当具体辨识出特定药剂时，应理解该术语包括药剂本身以及药学上可接受的、药理学活性的盐、酯、酰胺、前药、缀合物、活性代谢物、异构体、片段、类似物等。
如本文所用，术语“控释”或“控释药物递送”或“缓释”是指以受控方式从给定剂型中释放或施用药物以实现所需的体内药代动力学特征。“受控”药物递送的一个方面是操纵制剂和/或剂型以建立所需的药物释放动力学的能力。
如本文所用的措辞“同时施用”、或“联合施用”是指化合物在同一时间点或紧接着彼此施用。
术语“多肽”是指由单链D-氨基酸或L-氨基酸构成的化合物或通过肽键接合的D-氨基酸和L-氨基酸的混合物。
术语“抗体”在本文中以广义使用并且包括多克隆和单克隆抗体。除了完整的免疫球蛋白分子之外，术语“抗体”还包括那些免疫球蛋白分子的片段或聚合物，以及免疫球蛋白分子或其片段的人形式或人源化形式。可以使用本文所述的体外测定或通过类似方法测试抗体的所需活性，在此之后根据已知的临床测试方法测试它们的体内治疗和/或预防活性。有五种主要的人免疫球蛋白类别：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且这些类别中的几种类别可以进一步分为“亚类”(同种型)，例如IgG-1、IgG-2、IgG-3、和IgG-4；IgA-1和IgA-2。本领域技术人员将认识到小鼠的可比较类别。对应于不同类别的免疫球蛋白的重链恒定结构域分别被称为α、δ、ε、γ和μ。
如本文所用的术语“单克隆抗体”是指从基本上同质的抗体群体获得的抗体，即，在该群体内的各个抗体是相同的，除了可能存在于抗体分子的小子集中的可能的天然存在的突变。本文中的单克隆抗体具体包括“嵌合”抗体，以及此类抗体的片段，其中重链和/或轻链的一部分与源于特定物种或属于特定抗体类或亚类的抗体中的相应序列等同或同源，而链的其余部分与源于其它物种或属于其它抗体类或亚类的抗体中的相应序列等同或同源，只要其表现出所需的拮抗活性。
可以使用任何产生单克隆抗体的工序来制备所公开的单克隆抗体。例如，所公开的单克隆抗体可以使用杂交瘤方法制备，所述杂交瘤方法是例如由Kohler和Milstein，Nature，256：495(1975)描述的杂交瘤方法。在杂交瘤方法中，小鼠或其他合适的宿主动物通常用免疫剂免疫以引发产生或能够产生将特异性结合免疫剂的抗体的淋巴细胞。或者，淋巴细胞可以在体外免疫。
单克隆抗体也可以通过重组DNA方法制备。编码所公开的单克隆抗体的DNA可被容易地分离并使用常规工序(例如，通过使用能够特异性结合编码鼠类抗体的重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)进行测序。也可以使用噬菌体展示技术产生和筛选抗体或活性抗体片段的文库，例如如在Burton等人的美国专利第5,804,440号和Barbas等人的美国专利第6,096,441号中所述。
体外方法也适用于制备单价抗体。消化抗体以产生其片段，特别是Fab片段，可以使用本领域已知的常规技术来完成。例如，可以使用木瓜蛋白酶执行消化。木瓜蛋白酶消化的示例描述于1994年12月22日公布的WO 94/29348和美国专利第4,342,566号中。抗体的木瓜蛋白酶消化通常产生两个相同的抗原结合片段，称为Fab片段，每个片段均具有单一抗原结合位点，和残余的Fc片段。胃蛋白酶处理产生片段，所述片段具有两个抗原结合位点并且仍然能够交联抗原。
如本文所用，术语“抗体或其抗原结合片段”或“抗体或其片段”包括具有双重或多重抗原或表位特异性的嵌合抗体和杂合抗体，以及片段，诸如F(ab′)2、Fab′、Fab、Fv、sFv、scFv等，包括杂交片段。因此，提供了保留结合其特异性抗原的能力的抗体片段。例如，保持结合活性的抗体片段被包括在术语“抗体或其抗原结合片段”的含义内。此类抗体和片段可以通过本领域已知的技术制备，并且可以根据实施例中阐述的方法和用于产生抗体和筛选抗体的特异性和活性的一般方法来筛选特异性和活性(参见Harlow和Lane.Antibodies，ALaboratory Manual.Cold Spring Harbor Publications，New York，(1988))。
“抗体或其抗原结合片段”的含义中还包括抗体片段和抗原结合蛋白(单链抗体)的缀合物。“抗体或其抗原结合片段”的含义中还包括免疫球蛋白单可变结构域，例如纳米抗体。
片段，无论是否附接至其他序列，也都可以包括特定区域或特定氨基酸残基的插入、缺失、取代或其他选定修饰，前提条件是与未修饰的抗体或抗体片段相比，抗体或抗体片段的活性没有显著改变或受损。这些修饰可以提供一些额外的特性，诸如去除/添加能够进行二硫键键合的氨基酸、延长其生物寿命、改变其分泌特征等。在任何情况下，抗体或抗体片段必须具有生物活性，诸如与其同源抗原特异性结合。抗体或抗体片段的功能或活性区域可以通过以下方式来鉴定：诱变蛋白质的特定区域，之后表达并测试所表达的多肽。此类方法对本领域技术人员来说是显而易见的，并且可包括编码抗体或抗体片段的核酸的位点特异性诱变。(Zoller，M.J.Curr.Opin.Biotechnol.3：348-354，1992)。
如本文所用，术语“抗体”还可指人抗体和/或人源化抗体。许多非人类抗体(例如，来源于小鼠、大鼠或兔的抗体)在人类中具有天然抗原性，并且因此当施用于人类时会引起非期望的免疫应答。因此，在所述方法中使用人抗体或人源化抗体可减少施用于人的抗体引起非期望的免疫应答的机会。
如本文所用的术语“核酸”是指由核苷酸(例如脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)构成的聚合物。
如本文所用，术语“核糖核酸”和“RNA”是指由核糖核苷酸构成的聚合物。
如本文所用的术语“脱氧核糖核酸”和“DNA”是指由脱氧核糖核苷酸构成的聚合物。
术语“多核苷酸”是指由核苷酸单体构成的单链聚合物或双链聚合物。
组合物和方法
在一些方面中，本文公开了一种组合物，所述组合物包含：特异性结合共刺激分子的抗体、配体或其抗原结合片段；以及包含编码该共刺激分子的mRNA的纳米粒子。
在一些方面中，本文公开了一种组合物，所述组合物包含：特异性结合共刺激分子的抗体或其抗原结合片段；以及包含编码该共刺激分子的mRNA的纳米粒子。
在一些实施方案中，编码共刺激分子的mRNA被纳米粒子包封。
在一些实施方案中，纳米粒子包含磷脂或糖脂。在一些实施方案中，纳米粒子包含磷脂。在一些实施方案中，纳米粒子包含糖脂。在一些实施方案中，磷脂选自由PL1至PL18组成的组。在一些实施方案中，磷脂是PL1。在一些实施方案中，糖脂选自由GL1至GL16组成的组。在一些实施方案中，糖脂是GL4。
在一些实施方案中，共刺激分子选自ICOS、CD28、CD27、HVEM、LIGHT、CD40L、4-1BB、OX40、DR3、GITR、CD30、SLAM、CD2、CD226、半乳凝素9、TIM1、LFA1、B7-H2、B7-1、B7-2、CD70、LIGHT、HVEM、CD40、4-1BBL、OX40L、TL1A、GITRL、CD30L、SLAM、CD48、CD58、CD155、CD112、CD80、CD86、ICOSL、TIM3、TIM4、ICAM1或LFA3。
在一些实施方案中，共刺激分子包括OX40。在一些实施方案中，共刺激分子包括4-1BB(CD137)。在一些实施方案中，共刺激分子包括CD30。在一些实施方案中，共刺激分子包括CD2。在一些实施方案中，共刺激分子包括B7-H2。在一些实施方案中，共刺激分子包括B7-1。在一些实施方案中，共刺激分子包括B7-2。在一些实施方案中，共刺激分子包括CD70。在一些实施方案中，共刺激分子包括CD40。在一些实施方案中，共刺激分子包括4-1BBL。在一些实施方案中，共刺激分子包括OX40L。
共刺激分子的序列包括例如(对于人类序列)：ICOS(NCBI参考序列：NM_012092.3)、CD28(NCBI参考序列：NM_006139.4)、CD27(NCBI参考序列：NM_001242.4)、HVEM(NCBI参考序列：NM_003820.3)、LIGHT(NCBI参考序列：NM_003807.4)、CD40L(NCBI参考序列：NM_000074.2)、4-1BB(NCBI参考序列：NM_001561.5)、OX40(NCBI参考序列：NM_003327.4)、DR3(NCBI参考序列：NM_148965.1)、GITR(NCBI参考序列：NM_004195.3)、CD30(GenBank：M83554.1)、SLAM(NCBI参考序列：NM_003037.4)、CD2(NCBI参考序列：NM_001328609.1)、CD226(NCBI参考序列：NM_006566.3)、半乳凝素-9(GenBank：AB040130.2)、TIM1(GenBank：U02082.1)、B7-H2(NCBI参考序列：NM_015259.5)、B7-1(NCBI参考序列：NM_005191.4)，B7-2(NCBI参考序列：NM_175862.5)，CD70(NCBI参考序列：NM_001252.5)、CD40(NCBI参考序列：NM_001250.5)、4-1BBL(NCBI参考序列：NM_003811.4)、OX40L(NCBI参考序列：NM_003326.5)、TL1A(NCBI参考序列：NM_005118.4)、GITRL(GenBank：AY358868.1)、CD30L(NCBI参考序列：NM_001244.3)、SLAM(GenBank：U33017.1)、CD48(NCBI参考序列：NM_001778.4)、CD58(NCBI参考序列：NM_001779.3)、CD155(NCBI参考序列：NM_006505.5)、CD112(NCBI参考序列：NM_001042724.2)、TIM3(GenBank：AF450242.1)、TIM4(NCBI参考序列：NM_138379.3)、ICAM1(NCBI参考序列：NM_000201.3)。
在一些实施方案中，特异性结合共刺激分子的抗体或其抗原结合片段是BMS986178。在一些实施方案中，特异性结合共刺激分子的抗体或其抗原结合片段是GSK3174998。在一些实施方案中，特异性结合共刺激分子的抗体或其抗原结合片段是PF-04518600。在一些实施方案中，特异性结合共刺激分子的抗体或其抗原结合片段是MOXR0916。在一些实施方案中，特异性结合共刺激分子的抗体或其抗原结合片段是PF-04518600。在一些实施方案中，特异性结合共刺激分子的抗体或其抗原结合片段是MEDI6383。在一些实施方案中，特异性结合共刺激分子的抗体或其抗原结合片段是MEDI0562。在一些实施方案中，特异性结合共刺激分子的抗体或其抗原结合片段是INCAGN01949。在一些实施方案中，特异性结合共刺激分子的抗体或其抗原结合片段是InVivoPlus抗小鼠OX40(克隆OX-86)(公司：BioXcell，目录：BP0031)。
特异性结合共刺激分子的其他抗体或其抗原结合片段可包括例如：对于小鼠，InVivoPlus抗小鼠4-1BB(CD137)(克隆LOB12.3)(公司：BioXcell，目录：BP0169)、InVivoPlus抗小鼠CD40(克隆FGK4.5/FGK45)(公司：BioXcell，目录：BP0016-2)；对于人，抗人OX40、BMS 986178、GSK3174998、PF-04518600、MOXR0916、PF-04518600、MEDI6383、MEDI0562、INCAGN01949；抗人4-1BB、乌托鲁单抗(Utomilumab)、乌瑞芦单抗(Urelumab)；抗人CD40、CP-870893、APX005M、ADC-1013、JNJ-64457107、SEA-CD40、RO7009789。
在一些实施方案中，编码共刺激分子的mRNA包含异源5′非翻译区(5′UTR)。在一些实施方案中，编码共刺激分子的mRNA包含异源3′非翻译区(3′UTR)。
在一些实施方案中，本文所公开的核酸(例如，编码共刺激分子的mRNA)包含至少一种化学修饰的核苷酸。在一些实施方案中，至少一种化学修饰的核苷酸包含化学修饰的核碱基、化学修饰的核糖、化学修饰的磷酸二酯键、或它们的组合。
在一个实施方案中，至少一种化学修饰的核苷酸是化学修饰的核碱基。
在一个实施方案中，化学修饰的核碱基选自5-甲酰胞苷(5fC)、5-甲基胞苷(5meC)、5-甲氧基胞苷(5moC)、5-羟基胞苷(5hoC)、5-羟基甲基胞苷(5hmC)、5-甲酰尿苷(5fU)、5-甲基尿苷(5-meU)、5-甲氧基尿苷(5moU)、5-羧甲基酯尿苷(5camU)、假尿苷(Ψ)、N1-甲基假尿苷(me1Ψ)、N6-甲基腺苷(me6A)、或噻吩鸟苷(thG)。
在一些实施方案中，化学修饰的核碱基是5-甲氧基尿苷(5moU)。在一些实施方案中，化学修饰的核碱基是假尿苷(Ψ)。在一些实施方案中，化学修饰的核碱基是N1-甲基假尿苷(me1Ψ)。
这些修饰的核碱基的结构如下所示：
Figure BPA0000313711090000251
在一个实施方案中，至少一种化学修饰的核苷酸是化学修饰的核糖。
在一个实施方案中，化学修饰的核糖选自2′-O-甲基(2′-O-Me)、2′-氟(2′-F)、2′-脱氧-2′-氟-β-D-阿拉伯-核酸(2′F-ANA)、4′-S、4′-SFANA、2′-叠氮基、UNA、2′-O-甲氧基-乙基(2′-O-ME)、2′-O-烯丙基、2′-O-乙胺、2′-O-氰乙基、锁核酸(LAN)、亚甲基-cLAN、N-MeO-氨基BNA、或N-MeO-氨基氧基BNA。在一个实施方案中，化学修饰的核糖是2′-O-甲基(2′-O-Me)。在一个实施方案中，化学修饰的核糖是2′-氟(2′-F)。
这些修饰的核糖的结构如下所示：
Figure BPA0000313711090000261
在一个实施方案中，至少一种化学修饰的核苷酸是化学修饰的磷酸二酯键。
在一个实施方案中，化学修饰的磷酸二酯键选自硫代磷酸酯(phosphorothioate，PS)、硼酸磷酸酯、二硫代磷酸酯(phosphodithioate，PS2)、3′，5′-酰胺、N3′-氨基磷酸酯(NP)、磷酸二酯(PO)、或2′，5′-磷酸二酯(2′，5′-PO)。在一个实施方案中，化学修饰的磷酸二酯键是硫代磷酸酯。
这些修饰的磷酸二酯键的结构如下所示：
Figure BPA0000313711090000271
在一些实施方案中，组合物还包含免疫治疗剂。在一些实施方案中，免疫治疗剂选自抗PDL1抗体、抗PD1抗体、抗CTLA4抗体、或它们的组合。
在一些方面中，本文公开了一种药物组合物，所述药物组合物包含药学上可接受的载体和有效量的特异性结合共刺激分子的抗体、配体或其抗原结合片段，以及包含编码该共刺激分子的mRNA的纳米粒子。
在一些方面中，本文公开了一种药物组合物，所述药物组合物包含药学上可接受的载体和有效量的特异性结合共刺激分子的抗体或其抗原结合片段，以及包含编码该共刺激分子的mRNA的纳米粒子。
在一些方面中，本文公开了一种治疗癌症的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的特异性结合共刺激分子的抗体、配体或其抗原结合片段；以及包含编码共刺激分子的mRNA的纳米粒子。
在一些方面中，本文公开了一种治疗癌症的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的特异性结合共刺激分子的抗体或其抗原结合片段；以及包含编码共刺激分子的mRNA的纳米粒子。
在一些实施方案中，编码共刺激分子的mRNA被纳米粒子包封。
所使用的纳米粒子可以是可用于递送核酸的任何纳米粒子。在一些实施方案中，纳米粒子包括类脂纳米粒子。参见例如WO WO/2016/187531A1、WO/2017/176974、WO/2019/027999，或Li，B等人，An Orthogonal array optimization of lipid-likenanoparticles for mRNA delivery in vivo.Nano Lett.2015，15，8099-8107；这些文献以引入方式并入本文。在一些实施方案中，纳米粒子(或递送剂)可包含脂质双层或脂质体。在一些实施方案中，纳米粒子可包含聚合物，例如可生物降解的聚合物。聚合物可包括例如生物稳定和生物可降解的聚合物，诸如微晶纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、聚环氧烷诸如聚环氧乙烷(PEG)、聚酐、聚(酯酐)、聚羟基酸例如聚丙交酯(PLA)、聚乙交酯(PGA)、聚(丙交酯-共聚-乙交酯)(PLGA)、聚-3-羟基丁酸酯(PHB)及其共聚物、聚-4-羟基丁酸酯(P4HB)及其共聚物、聚己内酯及其共聚物、以及它们的组合。
在一些实施方案中，共刺激分子选自ICOS、CD28、CD27、HVEM、LIGHT、CD40L、4-1BB、OX40、DR3、GITR、CD30、SLAM、CD2、CD226、半乳凝素9、TIM1、LFA1、B7-H2、B7-1、B7-2、CD70、LIGHT、HVEM、CD40、4-1BBL、OX40L、TL1A、GITRL、CD30L、SLAM、CD48、CD58、CD155、CD112、CD80、CD86、ICOSL、TIM3、TIM4、ICAM1或LFA3。在一些实施方案中，共刺激分子包括OX40。在一些实施方案中，共刺激分子包括4-1BB(CD137)。
在一些实施方案中，编码共刺激分子的mRNA是分离的。在一些实施方案中，编码共刺激分子的mRNA是重组的。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段是分离的。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段是重组的。在一些实施方案中，所述抗体是单克隆抗体。
在一些实施方案中，癌症包括黑素瘤、结直肠癌、肺癌、结肠癌或淋巴瘤。在一些实施方案中，癌症包括结直肠癌或黑素瘤。在一些实施方案中，所述癌症是结直肠癌。在一些实施方案中，癌症是黑素瘤。在一些实施方案中，本文的组合物用于治疗局部肿瘤和转移性肿瘤两者。
在一些实施方案中，本文所述的组合物和方法可用于治疗或预防癌症的转移或复发。在一些实施方案中，本文所述的组合物和方法可用于预防切除的实体瘤的复发。在一些实施方案中，本文所述的组合物和方法可用于预防切除的实体瘤的转移。
在一个方面中，本文所述的方法用于治疗癌症，例如黑素瘤、肺癌(包括肺腺癌、基底细胞癌、鳞状细胞癌、大细胞癌、细支气管肺泡癌、支气管癌、非小细胞癌、小细胞癌、间皮瘤)；乳腺癌(包括腺管癌、小叶癌、炎性乳腺癌、透明细胞癌、粘液癌、浆膜腔乳腺癌)；结直肠癌(结肠癌、直肠癌、结直肠腺癌)；肛门癌；胰腺癌(包括胰脏腺癌、胰岛细胞癌、神经内分泌肿瘤)；前列腺癌；前列腺腺癌；卵巢癌(卵巢上皮癌或表面上皮间质肿瘤，包括浆液性肿瘤、子宫内膜样肿瘤和粘液性囊腺癌、性索间质肿瘤)；肝和胆管癌(包括肝细胞癌、胆管癌、血管瘤)；食管癌(包括食管腺癌和鳞状细胞癌)；口腔和口咽部鳞状上皮细胞癌；唾液腺腺样囊性癌；膀胱癌；膀胱肿瘤；子宫肿瘤(包括子宫内膜腺癌、眼部癌、子宫乳头状浆液性癌、子宫透明细胞癌、子宫肉瘤、平滑肌肉瘤、混合苗勒管肿瘤)；神经胶质瘤、胶质母细胞瘤、髓母细胞瘤和其他脑肿瘤；肾癌(包括肾细胞癌、透明细胞癌、威尔姆氏瘤)；头颈癌(包括鳞状细胞瘤)；胃癌(胃癌、胃腺癌、胃肠道间质瘤)；睾丸癌；生殖细胞肿瘤；神经内分泌肿瘤；宫颈癌；胃肠道、乳腺和其他器官的类癌；印戒细胞癌；间叶肿瘤，包括肉瘤、纤维肉瘤、血管瘤、血管瘤病、血管外皮细胞瘤、假性血管瘤样间质增生、肌纤维母细胞瘤、纤维瘤病、炎性肌纤维母细胞瘤、脂肪瘤、血管脂肪瘤、颗粒细胞瘤、神经纤维瘤、神经鞘瘤、血管肉瘤、脂肪肉瘤、横纹肌肉瘤、骨肉瘤、平滑肌瘤、平滑肌肉瘤、皮肤癌(包括黑素瘤)、宫颈癌、视网膜母细胞瘤、头颈癌、胰腺癌、脑癌、甲状腺癌、睾丸癌、肾癌、膀胱癌、软组织癌、肾上腺癌、尿道癌、阴茎癌、粘液肉瘤、软骨肉瘤、骨肉瘤、脊索瘤、恶性纤维组织细胞瘤、淋巴管肉瘤、间皮瘤、鳞状细胞癌；表皮样癌、恶性皮肤附件肿瘤、腺癌、肝癌、肝细胞癌、肾细胞癌、肾上腺样瘤、胆管上皮癌、移行细胞癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎细胞癌、间变性神经胶质瘤；多形性胶质母细胞瘤、神经母细胞瘤、髓母细胞瘤、恶性脑膜瘤、恶性神经鞘瘤、神经纤维肉瘤、甲状旁腺癌、甲状腺髓样癌、支气管类癌、嗜铬细胞瘤、胰岛细胞癌、恶性类癌瘤、恶性副神经节瘤、黑素瘤、默克尔细胞瘤、乳腺叶状囊肉瘤、涎腺癌、胸腺癌和阴道癌等。
在一些实施方案中，本文所述的组合物和方法可用于治疗或预防癌症。在一些情况下，癌症是循环癌细胞(循环肿瘤细胞)。在一些情况下，癌症是转移性癌细胞。
在一些实施方案中，受试者是哺乳动物。在一些实施方案中，哺乳动物是人。
在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段和纳米粒子通过肌内注射或全身地施用。
在一些实施方案中，所述方法还包括施用另外的治疗剂。在一些实施方案中，所述另外的治疗剂包括另外的免疫治疗剂。在一些实施方案中，免疫治疗剂选自抗PDL1抗体、抗PD1抗体、抗CTLA4抗体、或它们的组合。
在一个实施方案中，免疫治疗剂是抗PDL1抗体。在一个实施方案中，抗PDL1抗体选自阿特珠单抗(atezolizumab)、德瓦鲁单抗(durvalumab)或阿维鲁单抗(avelumab)。在一个实施方案中，抗PDL1抗体是阿维鲁单抗(MPDL3280A)(Roche)。在一个实施方案中，抗PDL1抗体是德瓦鲁单抗(MEDI4736)。在一个实施方案中，抗PDL1抗体是阿维鲁单抗(MS0010718C)。
在一个实施方案中，免疫治疗剂是程序性死亡蛋白1(PD-1)抑制剂或程序性死亡蛋白配体1或2抑制剂。PD-1抑制剂是本领域中已知的，并且包括例如纳武单抗(nivolumab)(BMS)、派姆单抗(pembrolizumab)(Merck)、匹地利珠单抗(pidilizumab)(CureTech/Teva)、AMP-244(Amplimmune/GSK)、BMS-936559(BMS)、和MEDI4736(Roche/Genentech)。
在一个实施方案中，免疫治疗剂是抗PD1抗体。在一个实施方案中，抗PD1抗体是纳武单抗。在一个实施方案中，抗PD1抗体是派姆单抗。
在一个实施方案中，免疫治疗剂是抗CTLA4抗体。在一个实施方案中，抗CTLA4抗体是伊匹单抗(ipilimumab)。
在一些实施方案中，另外的治疗剂是抗肿瘤药剂。例如，抗肿瘤剂可以选自由以下组成的组：醋酸阿比特龙、阿比特龙酸盐(甲氨蝶呤)、白蛋白结合型紫杉醇(紫杉醇白蛋白稳定的纳米粒子制剂)、ABVD、ABVE、ABVE-PC、AC、AC-T、维布妥昔单抗(本妥昔单抗)、ADE、恩美曲妥珠单抗、阿霉素(盐酸多柔比星)、Adrucil(氟尿嘧啶)、阿法替尼二马来酸盐、癌伏妥(依维莫司)、Akynzeo(奈妥吡坦和盐酸帕洛诺司琼)、艾特乐(咪喹莫特)、阿地白介素、阿仑单抗(Alemtuzumab)、爱宁达(培美曲塞二钠)、阿乐喜(盐酸帕洛诺司琼)、Ambochlorin(苯丁酸氮芥)、Amboclorin(苯丁酸氮芥)、氨基酮戊酸、阿那曲唑、阿瑞匹坦、阿可达(帕米膦酸二钠)、瑞宁得(阿那曲唑)、阿诺新(依西美坦)、Arranon(奈拉滨)、三氧化二砷、Arzerra(奥法木单抗)、天门冬酰胺酶、菊基腐病菌、白藜芦醇、安维汀(贝伐单抗)、阿西替尼、阿扎胞苷、BEACOPP、Becenum(卡莫司汀)、Beleodaq(贝利司他)、贝利司他、盐酸苯达莫司汀、BEP、贝伐单抗、贝沙罗汀、百克沙(托西莫单抗和碘I 131托西莫单抗)、比卡鲁胺、BiCNU(卡莫司汀)、博莱霉素、博纳吐单抗(Blinatumomab)、Blincyto(博纳吐单抗)、硼替佐米、Bosulif(博舒替尼)、博舒替尼、维布妥昔单抗(Brentuximab Vedotin)、白消安、Busulfex(白消安)、卡巴他赛、卡博替尼-S-苹果酸盐、CAF、Campath(阿仑单抗)、Camptosar(盐酸伊立替康)、卡培他滨、CAPOX、卡铂、卡铂-紫杉醇、卡非佐米、Carmubris(卡莫司汀)、卡莫司汀、卡莫司汀植入物、康士得(比卡鲁胺)、CeeNU(洛莫司汀)、色瑞替尼、柔红霉素(盐酸柔红霉素)、Cervarix(重组HPV二价疫苗)、西妥昔单抗(Cetuximab)、苯丁酸氮芥、苯丁酸氮芥-泼尼松、CHOP、顺铂、Clafen(环磷酰胺)、氯法拉滨、Clofarex(氯法拉滨)、Clolar(氯法拉滨)、CMF、Cometriq(卡博替尼-S-苹果酸盐)、COPP、COPP-ABV、Cosmegen(更生霉素)、克唑替尼、CVP、环磷酰胺、Cyfos(异环磷酰胺)、Cyramza(雷莫芦单抗(Ramucirumab))、阿糖胞苷、阿糖胞苷、脂质体、Cytosar-U(阿糖胞苷)、Cytoxan(环磷酰胺)、达拉菲尼、达卡巴嗪、达克金(地西他滨)、更生霉素、达沙替尼、盐酸柔红霉素、地西他滨、地加瑞克(Degarelix)、地尼白介素、地诺单抗(Denosumab)、DepoCyt(阿糖胞苷脂质体)、DepoFoam(阿糖胞苷脂质体)、盐酸右雷佐生、地努图希单抗(Dinutuximab)、多西他赛、Doxil(盐酸多柔比星脂质体)、盐酸多柔比星、盐酸多柔比星脂质体、Dox-SL(盐酸多柔比星脂质体)、DTIC-Dome(达卡巴嗪)、Efudex(氟尿嘧啶)、Elitek(拉布立酶)、Ellence(盐酸表柔比星)、Eloxatin(奥沙利铂)、伊屈波帕(Eltrombopag Olamine)、Emend(阿瑞匹坦)、恩杂鲁胺、盐酸表柔比星、EPOCH、Erbitux(西妥昔单抗)、甲磺酸艾日布林、Erivedge(维莫德吉)、盐酸厄洛替尼、Erwinaze(菊基腐病菌天冬酰胺酶)、依托泊苷(磷酸依托泊苷)、依托泊苷、磷酸依托泊苷、Evacet(盐酸多柔比星脂质体)、依维莫司、Evista(盐酸雷洛昔芬)、依西美坦、Fareston(托瑞米芬)、Farydak(帕比司他)、Faslodex(氟维司群)、FEC、Femara(来曲唑)、非格司亭、Fludara(磷酸氟达拉滨)、磷酸氟达拉滨、Fluoroplex(氟尿嘧啶)、氟尿嘧啶、Folex(甲氨蝶呤)、FolexPFS(甲氨蝶呤)、FOLFIRI、FOLFIRI-贝伐单抗、FOLFIRI-西妥昔单抗、FOLFIRINOX、FOLFOX、Folotyn(普拉曲沙)、FU-LV、氟维司群、Gardasil(重组HPV四价疫苗)、Gardasil 9(重组HPV九价疫苗)、Gazyva(阿托珠单抗(Obinutuzumab))、吉非替尼、盐酸吉西他滨、吉西他滨-顺铂、吉西他滨-奥沙利铂、吉妥珠单抗奥唑米星、Gemzar(盐酸吉西他滨)、Gilotrif(阿法替尼二马来酸盐)、Gleevec(甲磺酸伊马替尼)、Gliadel(卡莫司汀植入物)、Gliadel wafer(卡莫司汀植入物)、羧肽酶、醋酸戈舍瑞林、Halaven(甲磺酸艾日布林)、Herceptin(曲妥珠单抗)、HPV二价疫苗、重组HPV九价疫苗、重组HPV四价疫苗、重组和美新(盐酸拓扑替康)、Hyper-CVAD、Ibrance(帕博西尼)、替伊莫单抗(Ibritumomab Tiuxetan)、依鲁替尼、ICE、Iclusig(盐酸帕纳替尼)、伊达比星(盐酸伊达比星)、盐酸伊达比星、艾代拉里斯(Idelalisib)、Ifex(异环磷酰胺)、异环磷酰胺、Ifosfamidum(异环磷酰胺)、甲磺酸伊马替尼、Imbruvica(依鲁替尼)、咪喹莫特、Inlyta(阿西替尼)、干扰素α-2b，重组IntronA(重组干扰素α-2b)，碘I 131托西莫单抗和托西莫单抗、伊匹单抗，Iressa(吉非替尼)、盐酸伊立替康、Istodax(罗米地辛)、伊沙匹隆、Ixempra(伊沙匹隆)、Jakafi(磷酸鲁索替尼)、Jevtana(卡巴他赛)、Kadcyla(曲妥珠单抗-恩坦辛)、Keoxifene(盐酸雷洛昔芬)、Kepivance(帕利夫明)、Keytruda(派姆单抗)、Kyprolis(卡非佐米)、醋酸兰瑞肽、二甲苯磺酸拉帕替尼、来那度胺、甲磺酸乐伐替尼、Lenvima(甲磺酸乐伐替尼)、来曲唑、亚叶酸钙、Leukeran(苯丁酸氮芥)、醋酸亮丙瑞林、Levulan(氨基酮戊酸)、Linfolizin(苯丁酸氮芥)、LipoDox(盐酸多柔比星脂质体)、脂质体阿糖胞苷、洛莫司汀、利普安(醋酸亮丙瑞林)、利普安长效注射剂(醋酸亮丙瑞林)、利普安长效注射剂-Ped(醋酸亮丙瑞林)、利普安长效注射剂-3个月(醋酸亮丙瑞林)、利普安长效注射剂-4个月(醋酸亮丙瑞林)、Lynparza(奥拉帕尼)、Marqibo(硫酸长春新碱脂质体)、Matulane(盐酸丙卡巴肼)、盐酸氮芥、Megace(醋酸甲地孕酮)、醋酸甲地孕酮、Mekinist(曲美替尼)、巯基嘌呤、美司那、Mesnex(美司那)、Methazolastone(替莫唑胺)、甲氨蝶呤、甲氨蝶呤LPF(甲氨蝶呤)、Mexate(甲氨蝶呤)、Mexate-AQ(甲氨蝶呤)、丝裂霉素C、盐酸米托蒽醌、Mitozytrex(丝裂霉素C)、MOPP、Mozobil(普乐沙福)、Mustargen(盐酸氮芥)、突变霉素(丝裂霉素C)、马勒兰(白消安)、Mylosar(阿扎胞苷)、Mylotarg(吉妥珠单抗奥唑米星)、纳米粒子紫杉醇(紫杉醇白蛋白稳定化的纳米粒子制剂)、诺维本(酒石酸长春瑞滨)、奈拉滨、Neosar(环磷酰胺)、奈妥吡坦和盐酸帕洛诺司琼、优保津(非格司亭)、Nexavar(甲苯磺酸索拉非尼)、尼洛替尼、纳武单抗(Nivolumab)、诺瓦得士(枸橼酸他莫昔芬)、Nplate(罗米司亭)、阿托珠单抗(Obinutuzumab)、Odomzo(索尼德吉)、OEPA、奥法木单抗(Ofatumumab)、OFF、奥拉帕尼、高三尖杉酯碱(OmacetaxineMepesuccinate)、Oncaspar(培门冬酶)、盐酸昂丹司琼、Ontak(地尼白介素)、Opdivo(纳武单抗)、OPPA、奥沙利铂、紫杉醇、紫杉醇白蛋白稳定化的纳米粒子制剂、PAD、帕博昔布、帕利夫明、盐酸帕洛诺司琼、盐酸帕洛诺司琼和奈妥吡坦、帕米膦酸二钠、帕尼单抗(Panitumumab)、帕比司他、Paraplat(卡铂)、Paraplatin(卡铂)、盐酸帕唑帕尼、培加帕加司(Pegaspargase)、聚乙二醇干扰素α-2b、PEG-Intron(聚乙二醇干扰素α-2b)、派姆单抗、培美曲塞二钠、Perjeta(帕妥珠单抗)、帕妥珠单抗、Platinol(顺铂)、Platinol-AQ(顺铂)、普乐沙福、泊马度胺、Pomalyst(泊马度胺)、盐酸帕纳替尼、普拉曲沙、泼尼松、盐酸丙卡巴肼、Proleukin(阿地白介素)、Prolia(地诺单抗)、Promacta(伊屈波帕)、Provenge(西普鲁塞-T)、Purinethol(巯基嘌呤)、Purixan(巯基嘌呤)、二氯化镭223、盐酸雷洛昔芬、雷莫芦单抗、拉布立酶、R-CHOP、R-CVP、重组人乳头瘤病毒(HPV)二价疫苗、重组人乳头瘤病毒(HPV)九价疫苗、重组人乳头瘤病毒(HPV)四价疫苗、重组干扰素α-2b、瑞戈非尼、R-EPOCH、Revlimid(来那度胺)、Rheumatrex(甲氨蝶呤)、Rituxan(利妥昔单抗)、利妥昔单抗、罗米地辛、罗米司亭、红比霉素(盐酸柔红霉素)、磷酸鲁索替尼、无菌滑石粉气雾剂(滑石)、司妥昔单抗(Siltuximab)、西普鲁塞-T、索马杜林长效注射剂(醋酸兰瑞肽)、索尼德吉、甲苯磺酸索拉非尼、Sprycel(达沙替尼)、STANFORD V、无菌滑石粉(滑石)、Steritalc(滑石)、Stivarga(瑞戈非尼)、舒尼替尼苹果酸盐、Sutent(舒尼替尼苹果酸盐)、Sylatron(聚乙二醇干扰素α-2b)、Sylvant(司妥昔单抗)、Synovir(沙利度胺)、Synribo(高三尖杉酯碱)、TAC、Tafinlar(达拉菲尼)、滑石、枸橼酸他莫昔芬、Tarabine PFS(阿糖胞苷)、Tarceva(盐酸厄洛替尼)、Targretin(蓓萨罗丁)、Tasigna(尼洛替尼)、Taxol(紫杉醇)、Taxotere(多西他赛)、Temodar(替莫唑胺)、替莫唑胺、替西罗莫司、沙利度胺、Thalomid(沙利度胺)、噻替哌、Toposar(依托泊苷)、盐酸拓扑替康、托瑞米芬、Torisel(替西罗莫司)、托西莫单抗和碘I 131托西莫单抗、Totect(盐酸右雷佐生)、TPF、曲美替尼、曲妥珠单抗、Treanda(盐酸苯达莫司汀)、Trisenox(三氧化二砷)、Tykerb(二甲苯磺酸拉帕替尼)、Unituxin(地努图希单抗)、凡德他尼、VAMP、Vectibix(帕尼单抗)、VeIP、Velban(硫酸长春碱)、Velcade(硼替佐米)、Velsar(硫酸长春碱)、维莫非尼、VePesid(依托泊苷)、Viadur(醋酸亮丙瑞林)、Vidaza(阿扎胞苷)、硫酸长春碱、Vincasar PFS(硫酸长春新碱)、硫酸长春新碱、硫酸长春新碱脂质体、酒石酸长春瑞滨、VIP、维莫德吉、Voraxaze(羧肽酶)、伏立诺他、Votrient(盐酸帕唑帕尼)、Wellcovorin(亚叶酸钙)、Xalkori(克唑替尼)、Xeloda(卡培他滨)、XELIRI、XELOX、Xgeva(地诺单抗)、Xofigo(二氯化镭223)、Xtandi(恩杂鲁胺)、Yervoy(伊匹单抗)、Zaltrap(阿柏西普)、Zelboraf(维莫非尼)、Zevalin(替伊莫单抗)、Zinecard(盐酸右雷佐生)、阿柏西普、Zofran(盐酸昂丹司琼)、Zoladex(醋酸戈舍瑞林)、唑来膦酸、Zolinza(伏立诺他)、Zometa(唑来膦酸)、Zydelig(艾代拉里斯)、Zykadia(色瑞替尼)、和Zytiga(醋酸阿比特龙)。
在一些实施方案中，共刺激分子是ICOS。在一些实施方案中，共刺激分子是CD28。在一些实施方案中，共刺激分子是CD27。在一些实施方案中，共刺激分子是HVEM。在一些实施方案中，共刺激分子是LIGHT。在一些实施方案中，共刺激分子是CD40L。在一些实施方案中，共刺激分子是4-1BB。在一些实施方案中，共刺激分子是DR3。在一些实施方案中，共刺激分子是GITR。在一些实施方案中，共刺激分子是CD30。在一些实施方案中，共刺激分子是SLAM。在一些实施方案中，共刺激分子是CD2。在一些实施方案中，共刺激分子是CD226。在一些实施方案中，共刺激分子是半乳凝素9。在一些实施方案中，共刺激分子是TIM1。在一些实施方案中，共刺激分子是LFA1。在一些实施方案中，共刺激分子是B7-H2。在一些实施方案中，共刺激分子是B7-1。在一些实施方案中，共刺激分子是B7-2。在一些实施方案中，共刺激分子是CD70。在一些实施方案中，共刺激分子是LIGHT。在一些实施方案中，共刺激分子是HVEM。在一些实施方案中，共刺激分子是CD40。在一些实施方案中，共刺激分子是4-1BBL。在一些实施方案中，共刺激分子是OX40L。在一些实施方案中，共刺激分子是TL1A。在一些实施方案中，共刺激分子是GITRL。在一些实施方案中，共刺激分子是CD30L。在一些实施方案中，共刺激分子是SLAM。在一些实施方案中，共刺激分子是CD48。在一些实施方案中，共刺激分子是CD58。在一些实施方案中，共刺激分子是CD155。在一些实施方案中，共刺激分子是CD112。在一些实施方案中，共刺激分子是CD80。在一些实施方案中，共刺激分子是CD86。在一些实施方案中，共刺激分子是ICOSL。在一些实施方案中，共刺激分子是TIM3。在一些实施方案中，共刺激分子是TIM4。在一些实施方案中，共刺激分子是ICAM1。在一些实施方案中，共刺激分子是LFA3。
在一些实施方案中，共刺激分子是OX40。在一些实施方式中，OX40共刺激分子包含mRNA序列SEQ ID NO：1。在一些实施方式中，OX40共刺激分子包含mRNA序列SEQ ID NO：2。在一些实施方式中，OX40共刺激分子包含mRNA序列SEQ ID NO：5。在一些实施方案中，共刺激分子是OX40。在一些实施方案中，OX40共刺激分子包含mRNA序列SEQ ID NO：6。
在一些实施方案中，OX40共刺激分子包含与SEQ ID NO：1至少60％(例如，至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％)同一的核酸序列或其变体或片段。在一些实施方案中，OX40共刺激分子包含与SEQ ID NO：2至少60％(例如，至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％)同一的核酸序列或其变体或片段。在一些实施方案中，OX40共刺激分子包含与SEQ ID NO：5至少60％(例如，至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％)同一的核酸序列或其变体或片段。在一些实施方案中，OX40共刺激分子包含与SEQ ID NO：6至少60％(例如，至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％)同一的核酸序列或其变体或片段。
在一些实施方案中，共刺激分子由与选自以下的共刺激分子的序列至少60％(例如，至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％)同一的核酸序列或其变体或片段编码：ICOS、CD28、CD27、HVEM、LIGHT、CD40L、4-1BB、OX40、DR3、GITR、CD30、SLAM、CD2、CD226、半乳凝素9、TIM1、LFA1、B7-H2、B7-1、B7-2、CD70、LIGHT、HVEM、CD40、4-1BBL、OX40L、TL1A、GITRL、CD30L、SLAM、CD48、CD58、CD155、CD112、CD80、CD86、ICOSL、TIM3、TIM4、ICAM1、LFA3。
在一些实施方案中，编码共刺激分子的mRNA包含经修饰的5′非翻译区(5′UTR)。在一些实施方案中，编码共刺激分子的mRNA包含经修饰的3′非翻译区(3′UTR)。例如，经修饰的序列可包括插入、缺失或核苷酸取代。
在一些实施方案中，编码共刺激分子的mRNA包含含有mRNA序列SEQ ID NO：3的异源5′非翻译区(5′UTR)。在一些实施方案中，编码共刺激分子的mRNA包含含有mRNA序列SEQID NO：4的异源3′非翻译区(3′UTR)。在一些实施方案中，编码共刺激分子的mRNA包含含有与SEQ ID NO：3至少60％(例如，至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％)同一的核酸序列或其变体或片段的异源5′非翻译区(5′UTR)。在一些实施方案中，编码共刺激分子的mRNA包含含有与SEQ ID NO：4至少60％(例如，至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％)同一的核酸序列或其变体或片段的异源3’非翻译区(3’UTR)。
在一些方面中，本文公开了一种刺激T细胞的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的组合物，所述组合物包含：特异性结合共刺激分子的抗体、配体或其抗原结合片段；以及包含编码该共刺激分子的mRNA的纳米粒子。
在一些方面中，本文公开了一种刺激T细胞的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的组合物，所述组合物包含：特异性结合共刺激分子的抗体或其抗原结合片段；以及包含编码该共刺激分子的mRNA的纳米粒子。
在一些实施方案中，特异性结合共刺激分子的抗原结合片段包含OX40配体或其结合OX40的功能片段。在一些实施方案中，OX40配体由与SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：14至少60％(例如，至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％)同一的核酸序列编码。
在一些实施方案中，特异性结合共刺激分子的抗原结合片段包含ICOS配体或其结合ICOS的功能片段。在一些实施方案中，ICOS配体由与SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：16至少60％(例如，至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％)同一的核酸序列编码。
在一些实施方案中，特异性结合共刺激分子的抗原结合片段包含CD137配体或其结合CD137的功能片段。在一些实施方案中，CD137配体由与SEQ ID NO：19或SEQ ID NO：20至少60％(例如，至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％)同一的核酸序列编码。在一些实施方案中，受试者是哺乳动物。在一些实施方案中，哺乳动物是人。在一些实施方案中，T细胞包括CD4+T细胞、CD8+T细胞、或它们的组合。在一些实施方案中，T细胞包括CD8+T细胞。CD8+T细胞也被称为细胞毒性T细胞，并且可以起到杀伤特异性识别的细胞(例如，肿瘤细胞)的作用。
在一些实施方案中，同时(同时或紧接其后)施用特异性结合共刺激分子的抗体或其抗原结合片段和包含编码该共刺激分子的mRNA的纳米粒子。在一些实施方案中，顺序地施用特异性结合共刺激分子的抗体或其抗原结合片段和包含编码共刺激分子的mRNA的纳米粒子。
本文还公开了治疗诸如炎症疾患(包括自身免疫病)或淋巴增生性疾病的疾病或病症的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的特异性结合共刺激分子的抗体、配体或其抗原结合片段；以及包含编码该共刺激分子的mRNA的纳米粒子。
本文还公开了治疗诸如炎症疾患(包括自身免疫病)或淋巴增生性疾病的疾病或病症的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的特异性结合共刺激分子的抗体或其抗原结合片段；以及包含编码该共刺激分子的mRNA的纳米粒子。
在一个实施方案中，本文提供了一种治疗受试者的炎症疾患，包括自身免疫疾病的方法。所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的本文所提供的化合物、化合物的组合、或组合物、或其药学上可接受的形式，或本文所提供的药物组合物。自身免疫性疾病的示例包括但不限于急性播散性脑脊髓炎(acute disseminated encephalomyelitis，ADEM)、艾迪生病、抗磷脂抗体综合征(APS)、再生障碍性贫血、自身免疫性肝炎、自身免疫性皮肤病、乳糜泻、克罗恩病、糖尿病(1型)、古德帕斯丘综合征(Goodpasture′s syndrome)、格雷夫斯氏病(Crohn′s disease)、吉兰-巴雷综合征(Guillain-Barré syndrome，GBS)、桥本病、红斑狼疮、多发性硬化症、重症肌无力、眼阵挛性肌阵挛综合征(opsoclonusmyoclonus syndrome，OMS)、视神经炎、沃德氏甲状腺炎、天疱疮(oemphigus)、多发性关节炎、原发性胆汁性肝硬化、银屑病、类风湿性关节炎、赖特综合征、多发性大动脉炎、颞动脉炎(也称为“巨细胞动脉炎”)、温抗体型自身免疫性溶血性贫血、韦格纳肉芽肿、普秃(如炎性脱发)、恰加斯病、慢性疲劳综合征、自主神经障碍、子宫内膜异位症、化脓性汗腺炎、间质性膀胱炎、神经肌强直、结节病、硬皮病、溃疡性结肠炎、白癜风和外阴痛。其他疾患包括骨吸收障碍和血栓形成。
炎症有多种形式，并且包括但不限于急性、粘连性、萎缩性、卡他性、慢性、肝硬化性(cirrhotic)、弥漫性、播散性、渗出性、纤维蛋白性、纤维性、局灶性、肉芽肿性、增生性、肥厚性、间质性、转移性、坏死性、闭塞性、实质性、可塑性、多产性、增殖性、假膜性、化脓性(purulent)、硬化性、浆液性浆液纤维蛋白性、浆液性、单纯性、特异性、亚急性、化脓性(suppurative)、毒性、创伤性和/或溃疡性炎症。
示例性炎性病症包括但不限于与痤疮相关的炎症、贫血(例如，再生障碍性贫血、溶血性自身免疫性贫血)、哮喘、动脉炎(例如，多动脉炎、颞动脉炎、结节性动脉周围炎、多发性大动脉炎)、关节炎(例如，结晶性关节炎、骨关节炎、银屑病性关节炎、痛风发作、痛风性关节炎、反应性关节炎、类风湿性关节炎和赖特关节炎)、强直性脊柱炎、淀粉样变性、肌萎缩侧索硬化、自身免疫性疾病、过敏或过敏反应、动脉粥样硬化、支气管炎、滑囊炎、慢性前列腺炎、结膜炎、恰加斯病、慢性阻塞性肺病、皮肌炎(cermatomyositis)、憩室炎、糖尿病(例如，I型糖尿病、2型糖尿病)、皮肤病症(例如，银屑病、湿疹、烧伤、皮炎、瘙痒(发痒))、子宫内膜异位、吉兰-巴雷综合征、感染、缺血性心脏病、川崎氏病(kawasaki disease)、肾小球肾炎、牙龈炎、超敏反应、头痛(例如，偏头痛、紧张性头痛)、肠梗阻(例如，术后肠梗阻和脓毒症期间的肠梗阻)、特发性血小板减少性紫癜、间质性膀胱炎(疼痛性膀胱综合征)、胃肠道障碍(例如，选自消化性溃疡、局限性肠炎、憩室炎、胃肠道出血、嗜酸性胃肠道障碍(例如，嗜酸性食道炎、嗜酸性胃炎、嗜酸性胃肠炎、嗜酸性结肠炎)、胃炎、腹泻、胃食管返流疾病(GORD，或其同义词GERD)、炎性肠病(IBD)(例如，克罗恩病、溃疡性结肠炎、胶原性结肠炎、淋巴细胞性结肠炎、局部缺血性结肠炎、改道性结肠炎(diversion colitis)、白塞氏综合征(Behcet′s syndrome)、未确定型结肠炎)以及炎性肠综合征(inflammatorybowelsyndrome，IBS))、狼疮、多发性硬化、硬斑病、重症肌无力、心肌缺血、肾病综合征、寻常天疱疮、恶性贫血(pernicious aneaemia)、消化性溃疡、多发性肌炎、原发性胆汁性肝硬变、与脑障碍相关的神经炎症(例如，帕金森氏病、亨廷顿舞蹈病(Huntington′s disease)以及阿尔茨海默氏症(Alzheimer′s disease))、前列腺炎、与颅放射性损伤相关的慢性炎症、盆腔炎性疾病、风湿性多肌痛、再灌注损伤、局限性肠炎、风湿热、系统性红斑狼疮、硬皮病、硬化症(scierodoma)、结节病、脊柱关节病、干燥综合征、甲状腺炎、移植排斥、肌腱炎、外伤或损伤(例如，冻疮、化学刺激物、毒素、疤痕、烧伤、身体损伤)、血管炎、白癜风以及韦格纳氏肉芽肿。在某些实施方案中，炎性疾患选自关节炎(例如，类风湿性关节炎)、炎性肠病、炎性肠综合征、哮喘、银屑病、子宫内膜异位症、间质性膀胱炎和前列腺炎。在某些实施方案中，炎性病症是急性炎性病症(例如，例如由感染引起的炎症)。在某些实施方案中，炎性病症是慢性炎性病症(例如，由哮喘、关节炎和炎性肠病引起的病症)。该化合物还可用于治疗与外伤和非炎性肌痛相关的炎症。
免疫疾患，诸如自身免疫疾患包括但不限于关节炎(包括类风湿性关节炎、脊柱关节病、痛风性关节炎、退行性关节病例如骨关节炎、系统性红斑狼疮、干燥综合征、强直性脊柱炎、未分化脊柱炎、白塞氏病、溶血性自身免疫性贫血、多发性硬化、肌萎缩侧索硬化、淀粉样变性、急性肩痛、银屑病和幼年关节炎)、哮喘、动脉粥样硬化、骨质疏松症、支气管炎、肌腱炎、滑囊炎、皮肤病症(例如，银屑病、湿疹、烧伤、皮炎、瘙痒(发痒))、遗尿、嗜酸性粒细胞疾病、胃肠道疾病(例如，选自消化性溃疡、区域性肠炎、憩室炎、胃肠道出血、嗜酸性胃肠道障碍(例如，嗜酸性食道炎、嗜酸性胃炎、嗜酸性胃肠炎、嗜酸性结肠炎)、胃炎、腹泻、胃食管返流疾病(GORD，或其同义词GERD)、炎症性肠病(IBD)(例如，克罗恩病、溃疡性结肠炎、胶原性结肠炎、淋巴细胞性结肠炎、缺血性结肠炎、改道性结肠炎、白塞氏综合征、不确定性结肠炎)和炎性肠综合征(IBS))、复发性多软骨炎(例如，萎缩性多软骨炎和全身性多软骨软化(systemic polychondromalacia))，以及通过胃动力药改善的疾患(例如，肠梗阻、术后肠梗阻和脓毒症期间的肠梗阻；胃食管反流疾病(GORD，或其同义词GERD)；嗜酸性食管炎、胃轻瘫诸如糖尿病性胃轻瘫；食物不耐受和食物过敏以及其他功能性肠道疾患，诸如非溃疡性消化不良(NUD)和非心源性胸痛(NCCP，包括肋软骨炎))。
实施例
下面叙述了以下实施例以说明根据所公开主题的组合物、方法和结果。这些实施例并不旨在包括本文所公开的主题的所有方面，而是为了说明代表性方法和结果。这些实施例并不旨在排除对本领域技术人员显而易见的本发明的等同物和变体。
实施例1.纳米粒子(NP)-OX40 mRNA诱导增加的OX40表达水平
在EG.7-OVA细胞中表征OX40表达。与对照组相比，纳米粒子(NP)-OX40 mRNA诱导了高得多的OX40表达(图1)。5′UTR和3′UTR修饰广泛适用于编码细胞因子和免疫检查点调节剂(诸如ICOS、4-1BB、GITR、CD40等)的mRNA。纳米粒子是用脂质、DOPE、胆固醇、DMG-PEG和mRNA配制的(参见Li，B等人，An Orthogonal array optimization of lipid-likenanoparticles for mRNA delivery in vivo.Nano Lett.2015，15，8099-8107)。
实施例2.NP/OX40 mRNA+抗OX40抗体的联合疗法改善了B16黑素瘤肿瘤模型中的肿瘤疗法。
建立了B16黑素瘤小鼠肿瘤模型(Triplett，TA等人，Reversal of IDO-mediatedcancerimmunopression by systemic kynurenine depletion with atreatment enzyme，Nat Biotechnol.2018年9月；36(8)：758-764)。将小鼠用PBS、NP+抗OX40抗体(InVivoPlus抗小鼠OX40(克隆OX-86)(公司：BioXcell，目录：BP0031))或NP/OX40mRNA+抗OX40抗体处理。在该小鼠肿瘤模型中，这些mRNA及其相关抗体的组合显著改善了肿瘤疗法(图2A)并延长了总存活期(图2B)。
实施例3.NP/OX40 mRNA+抗OX40抗体的联合疗法改善了CT26肿瘤模型中的肿瘤疗法。
建立CT26小鼠肿瘤模型(Malvicini，M等人，Tumor MicroenvironmentRemodeling by 4-Methylumbelliferone Boosts the Antitumor Effect of CombinedImmunotherapy in Murine Colorectal Carcinoma，Molecular Therapy.第23卷第9期，1444-1455，2015年9月)。用PBS、纳米粒子(NP)+抗OX40抗体、纳米粒子(NP)/OX40mRNA+抗OX40抗体和纳米粒子(NP)/OX40 mRNA+抗OX40抗体一起处理小鼠。纳米粒子(NP)/OX40mRNA+抗OX40抗体(注射间隔：6小时)；并且纳米粒子(NP)/OX40 mRNA+抗OX40抗体一起(注射间隔：0小时)。所使用的OX40抗体是InVivoPlus抗小鼠OX40(克隆OX-86)(公司：BioXcell，目录：BP0031))。在该小鼠肿瘤模型中，这些mRNA及其相关抗体的组合显著延长了总存活期并且改善了肿瘤疗法。
实施例4.包含编码共刺激分子的mRNA的纳米粒子。
癌症免疫疗法采用多种方法来刺激抗肿瘤免疫应答，所述多种方法包括癌症疫苗、基于细胞的疗法、免疫检查点阻断剂、单克隆抗体、基于mRNA的免疫疗法和其他纳米粒子介导的免疫疗法。具体地，免疫检查点抑制剂的使用通过靶向T细胞共抑制途径(诸如PD-1和CTLA-4)而导致了提高的癌症患者的总存活率。尽管这些抗体在临床中经常使用，但是经历有意义的肿瘤反应的患者的百分比仅为约25％。因此，迫切需要为癌症治疗开发新的免疫疗法策略。
最近，研究人员在T细胞上发现了一系列用于癌症免疫疗法的共刺激分子。共刺激分子的配体与其在T细胞表面上的共刺激受体的相互作用激活了克隆T细胞的扩增和分化，从而提高了对几种人类癌症的抗肿瘤效率。CD137(也称为4-1BB)和OX40(也称为CD134)是T细胞共刺激受体，并且为CD8T细胞和CD4T细胞提供激活信号。CD137在T细胞增殖和细胞因子分泌中起重要作用。最近，已经在临床试验中研究了两种抗CD137抗体(乌瑞芦单抗和乌托鲁单抗)。OX40参与刺激CD8+T细胞以产生抗肿瘤免疫应答。抗OX40抗体增强各种癌症类型中的T细胞分化、细胞溶解功能和抗肿瘤免疫。几种激动性抗OX40抗体目前正处于临床试验中。尽管共刺激信号对于刺激T细胞至关重要，但是它们在肿瘤微环境中的表达不足，这阻碍了免疫治疗效应。因此，将共刺激受体mRNA递送到肿瘤浸润性T细胞中并结合使用针对该受体的激动性抗体可以直接激活T细胞并改善癌症免疫疗法(图4A)。
为了将共刺激受体mRNA递送到T细胞中，使用了磷脂和糖脂，因为它们是细胞膜的天然组分。基于磷脂和糖脂的化学结构，设计并合成了磷脂和糖脂模拟材料的文库(图4B至图4D)。这些化合物被配制成磷脂衍生的和糖脂衍生的纳米粒子以用于mRNA递送。一种磷脂衍生的纳米粒子PL1在体外和体内均有效地将mRNA递送至T细胞。接下来，在多种肿瘤模型中使用PL1纳米粒子结合抗CD137或抗OX40抗体来将共刺激受体CD137或OX40 mRNA递送至肿瘤浸润性T细胞。此外，这种治疗方法显著提高了抗PD-1+抗CTLA-4抗体的免疫治疗效应。这个实施例提供了一种新的和急需的生物材料来递送共刺激受体mRNA，以激活T细胞并增强抗肿瘤免疫力。
实施例5.用于mRNA递送的磷脂衍生物和糖脂衍生物(PL和GL)的设计和合成。
仿生化合物磷脂和糖脂由仿生头(磷酸根头或糖头)、可电离的氨基核和多个疏水尾构成(图11)。这些磷脂衍生物和糖脂衍生物(PL和GL)是根据先前报道的工序合成的。参见例如WO/2019/027999。图4B示出了PL1和GL1的代表性合成路线。按照该合成路线，合成PL1-18材料和GL1-16材料(图4C)，将所述材料通过1H核磁共振(NMR)和质谱(MS)表征(图4C)。接下来，用萤火虫荧光素酶mRNA(FLuc mRNA)配制PL纳米粒子和GL纳米粒子，并根据大小、表面电荷和mRNA包封效率对所述PL纳米粒子和GL纳米粒子进行表征(图12A至图12C)。然后，在E.G7细胞(T淋巴细胞细胞系)中研究PL1-18纳米粒子和GL1-16纳米粒子的mRNA递送效率，发现PL1纳米粒子显示出最高的FLuc mRNA递送效率(图5A)。此外，PL1将GFP mRNA递送至约94％的E.G7细胞，证明了其作为T细胞递送运载体的功能(图5C)。使用内吞抑制剂进一步研究了PL1纳米粒子的内吞途径，所述内吞抑制剂包括用于巨胞饮作用的5-(N-甲基-N-异丙基)阿米洛利(EIPA)、用于网格蛋白介导的内吞作用的盐酸氯丙嗪(CPZ)、和用于小窝介导的内吞作用的甲基-β-环糊精(MβCD)。用EIPA、CPZ和MβCD处理分别显著抑制了50％、56％和39％的PL1纳米粒子的细胞摄取(图13)，表明PL1纳米粒子通过多种内吞途径被内化。将T细胞共刺激受体CD137 mRNA和OX40 mRNA也递送到E.G7细胞中。图5B示出了PL1-OX40纳米粒子的冷冻-TEM图像。流式细胞术结果显示PL1-CD137(27.8％)和PL1-OX40(47.4％)都分别显著增加了CD137和OX40的细胞表面表达(图5D和图5E)。下一项研究是关于在鼠类黑素瘤模型(在C57BL/6小鼠中皮下生长的B16F10黑素瘤细胞)中的肿瘤浸润性淋巴细胞中PL1-GFP的瘤内(i.t.)递送(图5F)。使用PL1-GFP处理时，在肿瘤浸润性CD4+T细胞和CD8+T细胞(图5G)以及巨噬细胞和树突细胞(DC)(图14A至图14C)中观察到了GFP表达增加。基于这些结果，PL1纳米粒子被选择用于体内递送CD137和OX40 mRNA。
实施例6.使用PL1-CD137 mRNA+抗CD137抗体治疗时肿瘤生长的消退。
在B16F10细胞黑素瘤小鼠模型中，每隔一天将PL1-CD137与抗CD137抗体联合进行瘤内注射，共注射六次剂量。PL1-CD137+抗CD137的施用显著降低了肿瘤生长速率(接种18天时比对照少5倍)(图6A和图15A)。与PBS和PL1(空纳米粒子)+抗CD137抗体相比，该治疗还显著增加了总体存活时间(图6B)。在A20淋巴瘤肿瘤模型中进行类似的实验。与PBS和PL-1+抗CD137抗体相比，用PL1-CD137+抗CD137抗体处理导致肿瘤生长速率(接种18天)降低了2倍(图6C和图15B)。然而，比较PL1-CD137+抗CD137抗体与PL-1+抗CD137抗体治疗，没有观察到总体存活时间的显著延长(图6D)。因此，在两种肿瘤模型中，共刺激受体CD137 mRNA的PL1纳米粒子递送在一定程度上改善了使用抗CD137抗体的免疫疗法的结果，其中与A20淋巴瘤模型相比，在B16F10黑素瘤模型中获得了更好的结果。
实施例7.用PL1-OX40 mRNA+抗OX40抗体处理时肿瘤生长的消退。
还探讨了共刺激受体OX40递送在B16F10黑素瘤肿瘤模型中的治疗效应。与用PBS和PL1+抗OX40抗体处理相比，PL1-OX40+抗OX40抗体治疗(瘤内)显著减少了肿瘤生长并延长了存活期(图7A、图7B和图16A)。接下来，在BABL/c小鼠中建立CT26小鼠肿瘤模型。在用PL1-OX40+抗OX40抗体治疗后观察到了显著的治疗效应(图7C、图7D和图16B)。
接下来，在A20B细胞淋巴瘤模型中评估PL1-OX40+抗OX40抗体治疗的治疗效应。小鼠接受了PBS、PL1-OX40、PL1+抗OX40抗体或PL1-OX40+抗OX40抗体的瘤内注射。监测肿瘤生长60天(图8A和图8B)。与对照相比，用PL1-OX40+抗OX40抗体处理显著减少了肿瘤生长(图8C)并延长了存活时长(图8D)。重要的是，用PL1-OX40+抗OX40抗体治疗的10只小鼠中有6只小鼠(60％)表现出完全应答(图8D)并且对A20肿瘤细胞的再攻击具有抗性(图8E)。这些结果表明，在三种不同的小鼠模型中，递送共刺激OX40 mRNA的PL1纳米粒子可增强抗OX40抗体疗法的免疫治疗效应。
肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)在抗肿瘤免疫中起重要作用。在A20B细胞淋巴瘤模型中探索了至肿瘤内T细胞的mRNA递送。PL1-OX40治疗后OX40在肿瘤浸润性CD8+T细胞上的表达显著增加(图8F)，但是OX40在浸润性CD4+T细胞或巨噬细胞上的表达变化很小(图17A)。OX40在浸润性树突细胞(DC)上的表达也显著增加(图17A)。还检查了细胞因子和趋化因子的水平。与对照组相比，PL1-OX40治疗后血浆IFN-γ水平显著增加，使用PL1-OX40治疗时趋化因子配体12(CCL12)、中性粒细胞趋化因子(CXCL1)和巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)的水平也增加了2倍至10倍(图17B)。
还检查了A20B细胞淋巴瘤肿瘤中的浸润性T细胞群。使用与图6A中描述的相同的投配策略，在最后一次治疗后24小时分析免疫细胞群(图8G)。观察到CD8+T细胞显著增加，但与PL1+抗OX40抗体相比，使用PL1-OX40+抗OX40抗体治疗时CD4+T细胞、巨噬细胞或树突细胞的水平没有变化(图8H)。有趣的是，与施用对照抗体相比，使用抗CD8抗体或抗CD4抗体的T细胞耗竭显著损害了联合治疗的功效(图18)。在六次剂量治疗后，小鼠血浆中IFN-γ、CCL12、M-CSF和CXCL1的细胞因子水平在不同组中是相似的(图19)。
实施例8.增强PL1-OX40 mRNA+抗OX40抗体的抗肿瘤功效。
尽管PL1-OX40+抗OX40抗体治疗显著降低了B16F10肿瘤生长并延长了存活期(图7A和图7B)，但完全根除肿瘤负荷是基于免疫治疗的重要目标。为了提高PL1-OX40+抗OX40抗体疗法的抗肿瘤效应，将OX40 mRNA从其野生型形式(OX40(WT)修饰至假尿苷(ψ)修饰(OX40(ψ))，并将抗OX40抗体剂量从8μg增加至40μg。与PBS和PL1+抗OX40治疗相比，用PL1-OX40(ψ)+抗OX40抗体(40μg)治疗B16F10荷瘤小鼠显著减少了肿瘤生长并延长了存活期(图9A至图9D)。在第35天，五只小鼠表现出大小＜500mm3的肿瘤，并执行手术以从这些小鼠取出肿瘤。两只小鼠保持无肿瘤超过50天，这两只小鼠与具有再攻击的B16F10肿瘤细胞的对照小鼠相比显示出延迟的肿瘤生长(图9E)。
在另一种治疗方案中，将使用抗PD-1+抗CTLA-4免疫检查点抑制剂抗体的疗法添加到使用PL1-OX40(ψ)+抗OX40抗体(40μg)的治疗中(图9F)。与使用PBS或抗PD-1+抗CTLA-4抗体的治疗相比，PL1-OX40(ψ)+抗OX40与抗PD-1+抗CTLA-4抗体治疗的组合显著抑制了肿瘤生长并延长了存活期(图9G至图9I)。在第45天，六只小鼠没有肿瘤，一只小鼠具有小肿瘤(约50mm3)。存活的小鼠对再攻击的B16F10肿瘤细胞具有抗性(图9J)，其中一只小鼠的原发肿瘤在第58天重新生长并满足早期去除标准。其余5只小鼠保持两侧均无肿瘤。这些结果表明，PL1-OX40+抗OX40抗体的治疗方案改善了对抗PD-1+抗CTLA-4抗体疗法的应答。
然后，使用B16F10肺转移小鼠模型，通过全身施用抗PD-1+抗CTLA-4抗体和PL1-OX40(ψ)+抗OX40抗体(100μg)来评定该治疗方案的治疗功效(图10A)。结果显示，与抗PD-1+抗CTLA-4抗体和PBS治疗相比，该治疗方案显著降低了小鼠肺中的肿瘤转移(图10B至图10C、图20A至图20B)。与抗PD-1+抗CTLA-4抗体治疗相比，在具有PL1-OX40(ψ)+抗OX40抗体以及抗PD-1+抗CTLA-4抗体的组中观察到了小鼠肺中CD8+T细胞和CD4+T细胞的显著增加(图10D至图10E)。此外，在具有PL1-OX40(ψ)+抗OX40抗体以及抗PD-1+抗CTLA-4抗体的组中，肺中Foxp3+CD4+细胞(Treg细胞)的数量减少(图10F)。这些结果表明，治疗方案的全身施用在肺转移小鼠模型中表现出强抗肿瘤活性。
激动剂抗体可以被具有相似功能的部分(例如内源性配体)替代。例如，OX40共刺激受体可以与OX40配体相互作用。OX40配体的编码序列如SEQ ID NO：13所示。
实施例9.讨论。
基于T细胞的癌症免疫疗法是一个快速发展的领域。最近，已经开发出纳米技术来改进T细胞疗法，所述纳米技术是诸如离体工程化的T细胞和T细胞的体内调节。尽管取得了这些重大进展，仍然存在以下重大挑战：在体内刺激原代T细胞的抗肿瘤免疫力。
在这项研究中，为了探索用于将mRNA递送至T细胞中的纳米粒子，设计并合成了磷脂衍生物和糖脂衍生物(PL和GL)的文库。这些材料用于配制用于mRNA递送的仿生纳米粒子。PL1纳米粒子不仅在体外将共刺激受体mRNA递送至T细胞系，而且还能够将共刺激受体mRNA递送至肿瘤内的T细胞，这为调节T细胞功能提供了有用的递送工具。
最近，已经开发出具有增强抗肿瘤T细胞免疫力的能力的特异于共刺激受体的不可知抗体(mAb)来用于癌症治疗。例如，抗OX40抗体能够激活T细胞并使其能够去除肿瘤细胞。然而，OX40的低表达阻碍了许多肿瘤模型(例如B16F10)中的抗OX40抗体免疫疗法效应。在这项研究中，使用PL1纳米粒子将OX40 mRNA递送至肿瘤浸润性T细胞中，这增加了OX40的表达并从而提高了抗OX40抗体的抗肿瘤有效性。在多种肿瘤模型中，与单独的抗体相比，使用PL1-OX40和抗OX40抗体的联合治疗表现出显著的抗肿瘤活性。为了进一步增强PL1-OX40和抗OX40抗体的抗肿瘤活性，向治疗方案中加入了抗PD-1+抗CTLA-4抗体。这种治疗方法在B16F10肿瘤模型中产生了约50％的完全应答。值得注意的是，这些小鼠对使用B16F10肿瘤细胞的再攻击具有抗性。这种结果表明这种治疗方案有效地诱导了体内抗肿瘤免疫力。
此外，这种治疗策略与多种施用途径兼容。例如，使用PL1-OX40和抗OX40抗体的联合治疗不仅通过局部施用至肿瘤中，而且还通过抗OX40抗体的全身施用表现出了显著的抗肿瘤活性(图21A至图21D)。更重要的是，抗PD-1+抗CTLA-4抗体与PL1-OX40(ψ)+抗OX40抗体的全身施用显著减少了肺转移模型中的肿瘤转移。这些结果证明了这种治疗方案在不同治疗情况下的广泛适用性。
实施例10.磷脂衍生物和糖脂衍生物(PL和GL)的化学合成
根据先前报道的方法合成磷脂和糖脂化合物及其类似物。参见例如WO/2019/027999。用于PL1至PL18和GL1至GL16的一般方法是向化合物i或类似物(0.5毫摩尔)的CH2Cl2(2mL)溶液中加入过量的三氟乙酸(1mL)。将混合物在室温搅拌2小时并用薄层色谱法监测。在反应完成时，蒸发溶剂以得到油状中间体。将中间体溶解在10mL无水四氢呋喃中，之后加入三乙胺(0.2mL)。将所得混合物在室温下搅拌30分钟。在加入醛(3毫摩尔)和NaBH(OAc)3(3毫摩尔)后，将反应混合物在室温下搅拌24小时。在去除溶剂后，通过柱色谱法，使用CombiFlash Rf系统和RediSep Gold Resolution硅胶柱(Teledyne Isco)以及从100％CH2Cl2至70％CH2Cl2(超滤，CH2Cl2/MeOH/NH4OH＝按体积计75/22/3)的梯度洗脱(CH2Cl2和超滤)纯化反应混合物，以得到对应的产物。
PL1，产率34％。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ＝4.86-4.80(3H，m)，4.16-4.08(6H，m)，2.53-2.50(2H，t，J＝8)，2.42-2.37(8H，m)，2.31-2.28(6H，t，J＝8)，1.83-1.80(2H，m)，1.63-1.51(21H，m)，1.37-1.28(54H，m)，0.90-0.87(18H，t，J＝8)。MS(m/z)：[M+H]+C61H122N2O10P的计算值是1073.88，实测值是1073.88。
PL2，产率64％。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ＝4.13-4.08(2H，m)，3.79(3H，s)，3.76(3H，s)，2.53-2.50(2H，t，J＝8)，2.42-2.37(9H，m)，1.85-1.78(2H，m)，1.62-1.57(2H，m)，1.45-1.43(6H，m)，1.27(54H，s)，0.91-0.87(9H，t，J＝8)。MS(m/z)：[M+H]+C44H94N2O4P的计算值是745.70，实测值是745.69。
PL3，产率50％。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ＝4.86-4.80(3H，m)，4.08-4.03(2H，m)，2.54-2.51(2H，t，J＝8)，2.46-2.38(9H，m)，1.83-1.80(2H，m)，1.62-1.60(2H，m)，1.45(8H，m)，1.35-1.34(12H，m)，1.28(49H，s)，0.91-0.88(9H，t，J＝8)。MS(m/z)：[M+H]+C48H102N2O4P的计算值是801.76，实测值是801.76。
PL4，产率48％。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ＝4.16-4.07(6H，m)，2.54-2.50(2H，t，J＝8)，2.43-2.37(9H，m)，1.84-1.80(2H，m)，1.59-1.56(2H，m)，1.45(6H，m)，1.38-1.28(49H，m)，0.91-0.88(9H，t，J＝8)。MS(m/z)：[M+H]+C40H86N2O4P的计算值是689.63，实测值是689.63。
PL5，产率40％.1H NMR(400MHz，CDCl3)δ＝4.14-4.07(6H，m)，2.54-2.50(2H，t，J＝8)，2.43-2.37(8H，m)，1.84-1.80(2H，m)，1.59-1.56(2H，m)，1.45(6H，m)，1.37-1.28(55H，m)，0.91-0.88(9H，t，J＝8)。MS(m/z)：[M+H]+C43H92N2O4P的计算值是731.68，实测值是731.68。
PL6，产率48％。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ＝4.16-4.07(6H，m)，3.72-3.69(2H，m)，2.54-2.50(2H，t，J＝8)，2.44-2.38(8H，m)，1.86-1.79(2H，m)，1.72-1.69(2H，m)，1.44(6H，m)，1.37-1.34(6H，m)，1.27(54H，s)，0.91-0.88(9H，t，J＝8)。MS(m/z)：[M+H]+C46H98N2O4P的计算值是773.73，实测值是773.73。。
PL7，产率41％。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ＝4.16-4.07(6H，m)，3.72-3.69(2H，m)，2.54-2.50(2H，t，J＝8)，2.44-2.38(8H，m)，1.86-1.79(2H，m)，1.72-1.69(2H，m)，1.44(6H，m)，1.37-1.34(6H，m)，1.27(54H，s)，0.91-0.88(9H，t，J＝8)。MS(m/z)：[M+H]+C49H104N2O4P的计算值是815.77，实测值是815.77.
PL8，产率26％。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ＝4.14-4.08(6H，m)，3.24-3.22(2H，m)，2.80-2.77(1H，t，J＝8)，2.54-2.50(2H，t，J＝8)，2.46-2.32(14H，m)，2.22(3H，s)，1.83-1.80(2H，m)，1.65-1.60(6H，m)，1.44(5H，m)，1.37-1.28(50H，m)，0.91-0.88(9H，t，J＝8)。MS(m/z)：[M+H]+C44H95N3O4P的计算值是760.71，实测值是760.71。
PL9，产率24％。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ＝4.16-4.07(6H，m)，2.80-2.76(2H，t，J＝8)，2.74-2.70(4H，m)，2.61-2.58(2H，m)，2.53-2.44(8H，m)，2.31(3H，s)，1.87-1.81(4H，m)，1.69-1.66(2H，m)，1.56(4H，m)，1.44(2H，m)，1.37-1.27(54H，m)，0.91-0.87(9H，t，J＝8)。MS(m/z)：[M+H]+C47H101N3O4P的计算值是802.75，实测值是802.75。
PL10，产率41％。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ＝4.12-4.06(6H，m)，2.51-2.50(2H，t，J＝4)，2.43-2.32(14H，m)，2.22(3H，s)，1.83-1.79(2H，m)，1.62-1.60(2H，m)，1.43(6H，m)，1.37-1.27(62H，m)，0.91-0.87(9H，t，J＝8)。MS(m/z)：[M+H]+C50H107N3O4P的计算值是844.80，实测值是844.80。
PL11，产率33％。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ＝4.15-4.06(6H，m)，2.53-2.50(2H，t，J＝4)，2.44-2.40(9H，m)，2.37-2.32(5H，m)，2.22(3H，s)，1.83-1.79(2H，m)，1.71-1.68(1H，m)，1.64-1.60(4H，m)，1.43(6H，m)，1.37-1.27(66H，m)，0.91-0.87(9H，t，J＝8)。MS(m/z)：[M+H]+C53H113N3O4P的计算值是886.85，实测值是886.85。
PL12，产率32％。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ＝4.15-4.06(6H，m)，2.52-2.31(22H，m)，1.84-1.77(2H，m)，1.65-1.60(4H，m)，1.42-1.41(6H，m)，1.37-1.27(49H，m)，0.91-0.87(9H，t，J＝8)。MS(m/z)：[M+H]+C47H100N4O4P的计算值是815.75，实测值是815.75。
PL13，产率30％。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ＝4.16-4.06(6H，m)，2.52-2.32(22H，m)，1.82-1.79(2H，m)，1.66-1.60(4H，m)，1.42-1.41(6H，m)，1.37-1.27(55H，m)，0.91-0.87(9H，t，J＝8)。MS(m/z)：[M+H]+C50H106N4O4P的计算值是857.80，实测值是857.79。
PL14，产率36％。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ＝4.16-4.07(6H，m)，2.53-2.32(22H，m)，1.83-1.80(2H，m)，1.66-1.61(4H，m)，1.42(6H，m)，1.37-1.28(61H，m)，0.91-0.88(9H，t，J＝8)。MS(m/z)：[M+H]+C53H112N4O4P的计算值是899.84，实测值是899.84。
PL15，产率21％。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ＝4.13-4.08(6H，m)，2.53-2.33(24H，m)，1.85-1.80(4H，m)，1.66-1.63(5H，m)，1.42(9H，m)，1.38-1.28(72H，m)，0.91-0.88(9H，t，J＝8)。MS(m/z)：[M+H]+C56H118N4O4P的计算值是941.89，实测值是941.89。
PL16，产率23％。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ＝5.69-5.63(3H，m)，5.57-5.51(3H，m)，4.65-4.63(6H，d，J＝8)，4.16-4.08(6H，m)，2.55-2.40(10H，m)，2.34-2.30(6H，m)，2.14-2.09(6H，m)，1.85-1.80(2H，m)，1.65-1.62(9H，m)，1.42(9H，m)，1.38-1.31(62H，m)，0.92-0.89(9H，t，J＝8)。MS(m/z)：[M+H]+C64H122N2O10P的计算值是1109.87，实测值是1109.89。
PL17，产率23％。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ＝5.41-5.28(12H，m)，4.15-4.06(6H，d，J＝8)，3.15-3.03(2H，m)，2.97-2.89(7H，m)，2.78-2.75(7H，m)，2.07-2.00(22H，m)，1.62-1.55(5H，m)，1.35-1.29(51H，m)，0.90-0.86(9H，t，J＝8)。MS(m/z)：[M+H]+C64H122N2O4P的计算值是1013.91，实测值是1013.91。
PL18，产率24％。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ＝4.22-4.10(7H，m)，2.43-2.39(11H，m)，2.34-2.30(2H，t，J＝8)，2.04-2.01(2H，t，J＝8)，1.67-1.63(4H，m)，1.38-1.28(71H，m)，0.91-0.88(9H，t，J＝8)。MS(m/z)：[M+H]+C52H107N2O6P的计算值是887.79，实测值是887.79。
GL1，产率26％。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ＝4.17-4.11(2H，m)，2.70-2.57(11H，m)，2.33-2.29(2H，t，J＝8)，1.78(2H，s)，1.69-1.62(3H，m)，1.54-1.48(8H，m)，1.28(59H，s)，0.92-0.88(9H，t，J＝8)。MS(m/z)：[M+H]+C50H95N2O10的计算值是883.70；实测值是883.70。
GL2，产率35％。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ＝5.40(1H，m)，5.24-5.19(1H，m)，5.04-5.00(1H，m)，4.48-4.46(1H，d，J＝8)，4.17(2H，m)，3.91(2H，m)，3.54-3.51(1H，m)，2.40-2.38(12H，m)，2.16(3H，s)，2.06(6H，s)，1.99(4H，s)，1.74(2H，m)，1.73-1.70(2H，m)，1.57(6H，m)，1.27(52H，s)，0.89(9H，t，J＝8)。MS(m/z)：[M+H]+C53H101N2O10的计算值是925.75，实测值是925.74。
GL3，产率64％。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ＝5.41-5.40(1H，m)，5.32-5.20(1H，m)，5.04-5.01(1H，m)，4.48-4.46(1H，d，J＝8)，4.22-4.13(2H，m)，3.94-3.90(2H，m)，3.54-3.52(1H，m)，2.46-2.37(12H，m)，2.16(3H，s)，2.06(6H，s)，2.00(4H，s)，1.73-1.72(2H，m)，1.58-1.56(2H，m)，1.42(6H，m)，1.28(55H，s)，0.89(9H，t，J＝8)。MS(m/z)：[M+H]+C56H107N2O10的计算值是967.79，实测值是967.79。
GL4，产率35％。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ＝5.39(1H，m)，5.19-5.15(1H，m)，5.03-5.01(1H，m)，4.47-4.45(1H，m)，4.15-4.14(2H，m)，3.93-3.92(2H，m)，3.53-3.51(1H，m)，2.84-2.74(6H，m)，2.64-2.59(4H，m)，2.55-2.51(2H，m)，2.10(3H，s)，2.05(6H，s)，1.98(6H，s)，1.83-1.78(4H，m)，1.58(4H，m)，1.46(2H，m)，1.26(63H，s)，0.89-0.88(9H，t，J＝4)。MS(m/z)：[M+H]+C59H113N2O10的计算值是1009.84，实测值是1009.84。
GL5，产率35％。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ＝5.41-5.40(1H，m)，5.22-5.19(1H，m)，5.04(1H，m)，4.48-4.46(1H，d，J＝8)，4.17(2H，m)，3.91(2H，m)，3.54-3.52(1H，m)，2.84-2.51(15H，m)，2.10(3H，s)，2.16(3H，s)，2.07(5H，s)，2.00(4H，s)，1.73-1.72(2H，m)，1.62-1.60(4H，s)，1.43-1.42(6H，m)，1.26(53H，s)，0.89-0.88(9H，t，J＝8)。MS(m/z)：[M+H]+C60H116N3O10的计算值是1038.87，实测值是1038.86。
GL6，产率35％。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ＝5.41-5.40(1H，m)，5.24-5.21(1H，m)，5.04＝5.01(1H，m)，4.48-4.46(1H，d，J＝8)，4.22-4.12(2H，m)，3.95-3.89(2H，m)，3.56-3.50(1H，m)，2.84-2.33(22H，m)，2.16(3H，s)，2.07-2.06(1H，s)，2.00(3H，s)，1.73-1.63(6H，m)，1.42(6H，m)，1.27(53H，s)，0.91-0.88(9H，t，J＝8)。MS(m/z)：[M+H]+C63H121N4O10的计算值是1093.91，实测值是1093.91。
GL7，产率30％。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ＝5.24-5.19(1H，m)，5.13-5.08(1H，m)，5.02-4.98(1H，m)，4.52-4.50(1H，d，J＝8)，4.32-4.27(1H，m)，4.16-4.13(1H，m)，3.94-3.89(1H，m)，3.72-3.69(1H，m)，3.56-3.50(1H，m)，3.37-3.34(1H，m)，2.46-2.35(15H，m)，2.23(3H，s)，2.10-2.02(11H，m)，1.72-1.60(8H，m)，1.45-1.28(64H，s)，0.91-0.88(12H，t，J＝8)。MS(m/z)：[M+H]+C60H116N3O10的计算值是1038，87，实测值是1038.87。
GL8，产率65％。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ＝5.24-5.19(1H，m)，5.12-5.08(1H，m)，5.01-4.97(1H，m)，4.51-4.49(1H，d，J＝8)，4.31-4.27(1H，m)，4.16-4.13(1H，m)，3.92-3.88(1H，m)，3.70-3.69(3H，m)，3.55-3.50(1H，m)，2.47-2.34(25H，m)，2.10(3H，s)，2.05-2.02(9H，m)，1.70(10H，m)，1.50(10H，m)，1.27(55H，s)，0.91-0.88(9H，t，J＝8)。MS(m/z)：[M+H]+C63H121N4O10的计算值是1093，91，实测值是1093.91。
GL9，产率49％。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ＝5.69-5.63(1H，m)，5.57-5.51(3H，m)，5.24-5.19(1H，m)，5.12-5.08(1H，m)，5.02-4.97(1H，m)，4.64-4.63(6H，d，J＝4)，4.52-4.50(1H，d，J＝8)，4.31-4.27(1H，m)，4.17-4.11(1H，m)，3.94-3.88(1H，m)，3.73-3.69(1H，m)，3.54-3.51(1H，m)，2.47-2.30(18H，m)，2.14-2.02(17H，m)，1.65-1.62(11H，m)，1.40-1.31(55H，m)，0.92-0.88(9H，t，J＝8)。MS(m/z)：[M+H]+C74H131N2O16的计算值是1303.95，实测值是1303.94。
GL10，产率33％。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ＝5.64-5.63(2H，m)，5.57-5.51(2H，m)，5.24-5.19(1H，m)，5.13-5.08(1H，m)，5.02-4.97(1H，m)，4.64-4.63(4H，d，J＝4)，4.52-4.50(1H，d，J＝8)，4.31-4.27(1H，m)，4.17-4.13(1H，m)，3.95-3.89(1H，m)，3.72-3.70(2H，m)，3.58-3.52(2H，m)，2.55-2.38(9H，m)，2.34-2.30(5H，m)，2.22(2H，m)，2.16-2.02(16H，m)，1.79-1.60(9H，m)，1.46-1.27(32H，m)，0.92-0.88(6H，t，J＝8)。MS(m/z)：[M+H]+C57H101N2O14的计算值是1037.73，实测值是1037.73。
GL11，产率20％。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ＝5.25-5.20(1H，m)，5.14-5.08(1H，m)，5.02-4.97(1H，m)，4.55-4.53(1H，d，J＝8)，4.32-4.28(1H，m)，4.17-4.13(1H，m)，4.08-4.05(6H，t，J＝8)，3.93-3.88(1H，m)，3.75-3.71(1H，s)，3.57-3.53(1H，m)，2.80-2.76(6H，t，J＝8)，2.47-2.43(10H，m)，2.11(3H，s)，2.07(3H，s)，2.04(3H，s)，2.02(3H，s)，1.67-1.60(12H，m)，1.32-1.28(54H，m)，0.92-0.88(9H，t，J＝8)。MS(m/z)：[M+H]+C65H119N2O16的计算值是1183.86，实测值是1183.85。
GL12，产率63％。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ＝5.24-5.19(1H，m)，5.12-5.08(1H，m)，5.02-4.97(1H，m)，4.52-4.50(1H，d，J＝8)，4.31-4.26(1H，m)，4.16-4.12(1H，m)，3.94-3.89(1H，m)，3.71-3.68(2H，t，J＝8)，3.58-3.52(1H，m)，2.44-2.33(12H，t，J＝8)，2.21(3H，s)，2.10(3H，s)，2.06(3H，s)，2.04(3H，s)，2.02(3H，s)，1.75-1.63(6H，m)，1.44(4H，m)，1.27(37H，m)，0.91-0.87(6H，t，J＝8)。MS(m/z)：[M+H]+C45H85N2O10的计算值是813.62，实测值是813.62。
GL13，产率44％。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ＝5.42(1H，m)，5.24-5.19(1H，m)，5.13-5.09(1H，m)，4.52-4.50(1H，m)，4.21-4.17(1H，m)，4.07-3.87(3H，m)，3.53-3.47(1H，m)，2.52-2.39(10H，m)，1.77-1.66(4H，m)，1.50-1.42(5H，m)，1.27-1.13(89H，m)，0.91-0.87(9H，t，J＝8)。MS(m/z)：[M+H]+C68H131N2O10的计算值是1135.98，实测值是1135.98。
GL14，产率37％。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ＝5.43-5.24(4H，m)，5.09-5.04(1H，t，J＝8)，4.89-4.82(2H，m)，4.53-4.47(2H，m)，4.29-4.22(3H，m)，4.07-3.96(4H，m)，3.90-3.87(1H，m)，3.72-3.67(4H，m)，3.53-3.50(1H，m)，2.48-2.37(10H，m)，2.16-2.01(27H，m)，1.73-1.69(3H，m)，1.45-1.41(6H，m)，1.27(45H，s)，0.91-0.87(9H，t，J＝8)。MS(m/z)：[M+H]+C68H123N2O18的计算值是1255.88，实测值是1255.88。
GL15，产率48％。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ＝5.36-5.35(1H，d，J＝4)，5.22-5.18(1H，t，J＝8)，5.14-5.10(1H，m)，4.98-4.95(1H，m)，4.91-4.87(1H，m)，4.50-4.45(3H，m)，4.15-4.07(3H，m)，3.88-3.78(4H，m)，3.62-3.58(1H，m)，3.52-3.47(1H，m)，2.39-2.37(1H，m)，2.16(3H，s)，2.13(3H，s)，2.07-2.04(12H，m)，1.97(3H，s)，1.71-1.68(3H，m)，1.55-1.53(2H，m)，1.41(6H，m)，1.27(51H，m)，0.91-0.87(9H，t，J＝8)。MS(m/z)：[M+H]+C68H123N2O18的计算值是1255.88，实测值是1255.88。
GL16，产率55％。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ＝5.34-5.30(1H，m)，5.24-5.23(1H，m)，4.99(1H，m)，4.35-4.28(2H，m)，4.14-4.10(1H，m)，3.75-3.71(1H，t，J＝8)，3.45-3.41(1H，t，J＝8)，2.41(12H，m)，2.12-2.05(9H，m)，1.70(3H，m)，1.58(3H，m)，1.42(6H，m)，1.27(52H，s)，0.91-0.87(9H，t，J＝8)。MS(m/z)：[M+H]+C53H103N2O8的计算值是895.77，实测值是895.77。
序列
RNA序列
人OX40 mRNA(具有5′UTR和3′UTR)(SEQ ID NO：1)
Figure BPA0000313711090000581
小鼠OX40 mRNA(具有5′UTR和3′UTR)(SEQ ID NO：2)
Figure BPA0000313711090000582
Figure BPA0000313711090000591
异源5′UTR/3′UTR
5’UTR：
Figure BPA0000313711090000592
人OX40编码序列(SEQ ID NO：5)
Figure BPA0000313711090000593
小鼠OX40编码序列(SEQ ID NO：6)
Figure BPA0000313711090000601
DNA序列
人OX40 mRNA(具有5′UTR和3′UTR)(SEQ ID NO：7)
Figure BPA0000313711090000602
Figure BPA0000313711090000611
小鼠OX40 mRNA(具有5′UTR和3′UTR)(SEQ ID NO：8)
Figure BPA0000313711090000612
异源5′UTR/3′UTR
5’UTR：
Figure BPA0000313711090000613
人OX40编码序列(SEQ ID NO：11)
Figure BPA0000313711090000621
小鼠OX40编码序列(SEQ ID NO：12)
Figure BPA0000313711090000622
小鼠OX40配体的编码序列(SEQ ID NO：13)。
Figure BPA0000313711090000631
人OX40配体的编码序列(SEQ ID：14)
Figure BPA0000313711090000632
小鼠ICOS的编码序列(SEQ ID NO：15)
Figure BPA0000313711090000633
Figure BPA0000313711090000641
人ICOS的编码序列(SEQ ID NO：16)
Figure BPA0000313711090000642
小鼠CD137(4-1BB)的编码序列(SEQ ID NO：17)
Figure BPA0000313711090000643
Figure BPA0000313711090000651
人CD137(4-1BB)的编码序列(SEQ ID NO：18)
Figure BPA0000313711090000652
小鼠CD137配体(4-1BBL)的编码序列(SEQ ID NO：19)
Figure BPA0000313711090000653
Figure BPA0000313711090000661
人CD137配体(4-1BBL)的编码序列(SEQ ID NO：20)
Figure BPA0000313711090000662
小鼠GITR的编码序列(SEQ ID NO：21)
Figure BPA0000313711090000663
Figure BPA0000313711090000671
人GITR的编码序列(SEQ ID NO：22)
Figure BPA0000313711090000672
除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语均具有与公开的发明所属领域的技术人员通常所理解的含义相同的含义。本文所引用的出版物以及引用所述出版物所涉及到的材料明确地以引用的方式并入。
本领域的一般技术人员将会理解，可以对本发明的优选实施方案做出各种变化和修改，并且可以在不脱离本发明的精神的情况下做出这些变化和修改。因此，随附权利要求书意欲涵盖在本发明的真实精神和范围内的所有这些等同变化。
Figure IPA0000313711000000011
Figure IPA0000313711000000021
Figure IPA0000313711000000031
Figure IPA0000313711000000041
Figure IPA0000313711000000051
Figure IPA0000313711000000061
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Figure IPA0000313711000000111
Figure IPA0000313711000000121

Claims (39)

1.一种组合物，所述组合物包含：
特异性结合共刺激分子的抗体、配体或其抗原结合片段；以及
包含编码所述共刺激分子的mRNA的纳米粒子。
2.如权利要求1所述的组合物，其中编码所述共刺激分子的所述mRNA被所述纳米粒子包封。
3.如权利要求1或2所述的组合物，其中所述纳米粒子包含磷脂或糖脂。
4.如权利要求3所述的组合物，其中所述磷脂选自由PL1至PL18组成的组。
5.如权利要求4所述的组合物，其中所述磷脂是PL1。
6.如权利要求3所述的组合物，其中所述糖脂选自由GL1至GL16组成的组。
7.如权利要求6所述的组合物，其中所述糖脂是GL4。
8.如权利要求1至7中任一项所述的组合物，其中所述共刺激分子选自ICOS、CD28、CD27、HVEM、LIGHT、CD40L、4-1BB、OX40、DR3、GITR、CD30、SLAM、CD2、CD226、半乳凝素9、TIM1、LFA1、B7-H2、B7-1、B7-2、CD70、LIGHT、HVEM、CD40、4-1BBL、OX40L、TL1A、GITRL、CD30L、SLAM、CD48、CD58、CD155、CD112、CD80、CD86、ICOSL、TIM3、TIM4、ICAM1或LFA3。
9.如权利要求8所述的组合物，其中所述共刺激分子包括OX40或4-1BB。
10.如权利要求1至9中任一项所述的组合物，其中编码所述共刺激分子的所述mRNA包含异源5′非翻译区(5′UTR)。
11.如权利要求1至9中任一项所述的组合物，其中编码所述共刺激分子的所述mRNA包含异源3′非翻译区(3′UTR)。
12.如权利要求1至11中任一项所述的组合物，其中所述mRNA包含化学修饰的核碱基。
13.如权利要求12所述的组合物，其中所述化学修饰的核碱基是假尿苷。
14.如权利要求1至13中任一项所述的组合物，所述组合物还包含免疫治疗剂。
15.如权利要求14所述的组合物，其中所述免疫治疗剂选自抗PDL1抗体、抗PD1抗体、抗CTLA4抗体、或它们的组合。
16.一种药物组合物，所述药物组合物包含药学上可接受的载体和有效量的如权利要求1至15中任一项所述的组合物。
17.一种刺激T细胞的方法，所述方法包括给受试者施用有效量的如权利要求1至15中任一项所述的组合物或如权利要求16所述的药物组合物。
18.如权利要求17所述的方法，其中所述受试者是哺乳动物。
19.如权利要求18所述的方法，其中所述哺乳动物是人。
20.一种治疗癌症的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的特异性结合共刺激分子的抗体、配体或其抗原结合片段，以及包含编码所述共刺激分子的mRNA的纳米粒子。
21.如权利要求20所述的方法，其中编码所述共刺激分子的所述mRNA被所述纳米粒子包封。
22.如权利要求20或21所述的方法，其中所述纳米粒子包括磷脂或糖脂。
23.如权利要求22所述的方法，其中所述磷脂选自由PL1至PL18组成的组。
24.如权利要求23所述的方法，其中所述磷脂是PL1。
25.如权利要求22所述的组合物，其中所述糖脂选自由GL1至GL16组成的组。
26.如权利要求25所述的组合物，其中所述糖脂是GL4。
27.如权利要求20至26中任一项所述的方法，其中所述共刺激分子选自ICOS、CD28、CD27、HVEM、LIGHT、CD40L、4-1BB、OX40、DR3、GITR、CD30、SLAM、CD2、CD226、半乳凝素9、TIM1、LFA1、B7-H2、B7-1、B7-2、CD70、LIGHT、HVEM、CD40、4-1BBL、OX40L、TL1A、GITRL、CD30L、SLAM、CD48、CD58、CD155、CD112、CD80、CD86、ICOSL、TIM3、TIM4、ICAM1或LFA3。
28.如权利要求27所述的方法，其中所述共刺激分子包括OX40或4-1BB。
29.如权利要求20至28中任一项所述的方法，其中编码所述共刺激分子的所述mRNA包含异源5′非翻译区(5′UTR)。
30.如权利要求20至29中任一项所述的方法，其中编码所述共刺激分子的所述mRNA包含异源3′非翻译区(3′UTR)。
31.如权利要求20至30中任一项所述的方法，其中所述化学修饰的核碱基是假尿苷。
32.如权利要求20至31中任一项所述的方法，其中所述癌症包括黑素瘤、结直肠癌、肺癌、结肠癌或淋巴瘤。
33.如权利要求20至32中任一项所述的方法，其中所述受试者是哺乳动物。
34.如权利要求33所述的方法，其中所述哺乳动物是人。
35.如权利要求20至34中任一项所述的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段和所述纳米粒子通过肌内注射或全身地施用。
36.如权利要求20至35所述的方法，所述方法还包括施用另外的治疗剂。
37.如权利要求36所述的方法，其中所述另外的治疗剂包括另外的免疫治疗剂。
38.如权利要求37所述的方法，其中所述另外的免疫治疗剂选自抗PDL1抗体、抗PD1抗体、抗CTLA4抗体、或它们的组合。
39.如权利要求20至38中任一项所述的方法，其中同时施用特异性结合共刺激分子的所述抗体或其抗原结合片段和包含编码所述共刺激分子的mRNA的所述纳米粒子。
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