CN109422811A - 抗cd47抗体及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及CD47的新型抗体和抗体片段以及含有所述抗体或其抗体片段的组合物。本发明还涉及编码所述抗体或其抗体片段的核酸及包含其的宿主细胞，以及相关用途。此外，本发明也涉及这些抗体和抗体片段的治疗和诊断用途。

Description

抗CD47抗体及其用途

本发明涉及特异性结合整联蛋白相关蛋白(IAP)，(也称为CD47)的新型抗体和抗体片段以及含有所述抗体或抗体片段的组合物。本发明还涉及编码所述抗体或其抗体片段的核酸及包含其的宿主细胞，以及相关用途。此外，本发明也涉及这些抗体和抗体片段的治疗和诊断用途。

背景技术

癌症免疫疗法是近年来生物科学领域的重头大戏，基于T细胞的CTLA4抗体、PD-1抗体、PD-L1抗体等的免疫检查点抑制剂疗法和CAR-T、TCR-T等细胞疗法皆是近年来大热的免疫疗法。这些无一例外是围绕如何恢复T细胞功能来进行，换句话说，主要围绕如何提高获得性免疫系统能力。但是以免疫检查点(checkpoint)为靶点，激活T细胞功能，从而提高获得性免疫系统能力来攻克癌症这一道路仍充满曲折。然而固有免疫系统在肿瘤免疫治疗中的作用，却长期没有得到发挥。事实上在整个肿瘤浸润区域，巨噬细胞在肿瘤组织约占50％，更重要的是巨噬细胞的数量同肿瘤的预后呈现反向联系，这进一步说明巨噬细胞在肿瘤中有很重要的作用。

巨噬细胞发挥吞噬效应需要两个信号同时起作用：一个是靶向细胞表面的“吃我”信号的激活，另一个是相同目标表面“别吃我”信号的失活。任何一个信号的缺少都不足以引发吞噬效应的发生。越来越多的证据表明，CD47是一类“别吃我”信号，它通过与巨噬细胞表面的信号调节蛋白α(Signal regulatory proteinα，SIRPα)相互结合抑制巨噬细胞的吞噬作用。肿瘤细胞也可以通过CD47的表达逃避巨噬细胞吞噬作用(例如参见EP2242512及其中引用的相关文献)。

CD47也被称为整联蛋白相关蛋白(IAP)，是免疫球蛋白超家族成员。CD47广泛的表达于细胞的表面，可与SIRPα、血小板反应蛋白(thrombospondin-1，TSP1)以及整合素相互作用，介导凋亡、增殖、免疫等一系列的反应。TSP1与细胞的增殖，生长和分化有关，CD47与TSP1的结合在调节细胞迁移，细胞增殖和凋亡以及促进血管生成和炎症反应中发挥重要作用。此外CD47是细胞表面一个重要的自我识别标记。CD47可以与巨噬细胞表面SIRPα结合，磷酸化其免疫受体酪氨酸抑制基序(ITIM)，随后招募SHP-1蛋白，产生一系列的级联反应抑制巨噬细胞的吞噬作用(例如参见US9382320及其中引用的相关文献)。

不同的研究表明，几乎所有的肿瘤细胞和组织都高表达CD47。肿瘤细胞表面高表达的CD47通过与巨噬细胞表面SIRPα结合，释放“不要吃我”的信号，导致肿瘤组织浸润区的巨噬细胞不但同肿瘤细胞和谐相处，而且还会通过促进肿瘤内血管增殖，抑制效应T细胞发挥作用，促进肿瘤细胞扩增和生长。

CD47在促进细胞增殖中的作用在很大程度上取决于细胞类型，因为CD47的活化和丧失可导致增强的增殖。使用TSP-1激活CD47可增加人U87和U373星形细胞瘤细胞的增殖，但不增加正常星形胶质细胞。此外，CD47阻断抗体抑制未刺激的星形细胞瘤细胞的增殖，但不抑制正常的星形胶质细胞。虽然确切的机制尚不清楚，CD47可能通过PI3K/Akt途径促进癌细胞增殖，但不能促进正常细胞的增殖(Sick E，Boukhari A，Deramaudt T，RondéP，Bucher B，AndréP，Gies JP，Takeda K.，Activation of CD47receptors causesproliferation of human astrocytoma but not normal astrocytes via an Akt-dependent pathway，Glia.2011Feb，59(2)：308-19：308-19)。

CD47连接导致许多正常和肿瘤细胞系通过凋亡或自噬的细胞死亡。CD47的激活诱导T细胞的快速凋亡。用单克隆抗体Ad22孵育的Jurkat细胞和外周血单核细胞(PBMC)在3小时内导致凋亡。然而，用其他抗CD47抗体培养后未观察到细胞凋亡。CD47的凋亡诱导功能似乎依赖于细胞外结构域上特异性表位的活化(Pettersen RD，Hestdal K，Olafsen MK，LieSO，Lindberg FP(June 1999)，CD47signals T cell death，J.Immunol.162(12)：7031-40.PMID 10358145)。

目前已经有报道了多个抗CD47抗体，例如美国专利US2015/0183874A1报道了衍生自B6H12的人IgG1型嵌合单克隆抗体和通过CDR移植产生的人源化B6H12抗体，其相比较于已知抗体具有更低的免疫原性。美国专利US 9045541报道了一种不显著引起血凝反应的抗CD47抗体，并且该抗体与己知抗体相比，在肿瘤模型中显著有效，例如提高巨噬细胞吞噬肿瘤细胞的能力。

现有技术中已知的绝大多数阻抗CD47与SIRPα结合的抗体在促进巨噬细胞的吞噬作用的同时，引起血红细胞的凝集，从而使得相应抗体的治疗效果大打折扣。

因此，在针对各种肿瘤和/或癌症的治疗中，仍然急需开发具有良好的靶点特异性、疗效优异(例如改善巨噬细胞的吞噬作用，抑制肿瘤生长、甚至使得肿瘤完全消失)，且副作用较小的抗CD47抗体。本发明满足了这方面的要求。

发明概述

本发明提供抗CD47抗体、与抗CD47抗体相关的组合物、试剂盒、方法和用途。

本发明的发明人令人惊讶地发现，本发明开发的抗体具有显著的抗肿瘤活性，能够显著抑制肿瘤的生长，甚至能使得肿瘤完全消失。

在一些实施方案中，本发明提供结合CD47或其片段(优选人CD47蛋白质)的抗CD47抗体或抗体片段(优选抗原结合片段)。

在一些实施方案中，本发明的抗CD47抗体或其抗原结合片段包含选自以下的一个至三个重链互补决定区HCDR或由所述序列组成：(i)HCDR1，其包含与选自SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、98和99的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或者100％同一性的氨基酸序列或由所述序列组成，(ii)HCDR2，其包含与选自SEQ ID NO：9、10、11、12、13、14、15、16、100和101的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或者100％同一性的氨基酸序列或由所述序列组成，(iii)HCDR3，其包含与选自SEQ ID NO：17、18、19、20、21、22、102和103的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或者100％同一性的氨基酸序列或由所述序列组成，和(iv)含有一处或多处不超过5个氨基酸的氨基酸取代(例如保守性取代)、缺失或插入的(i)、(ii)和(iii)的HCDR，包含所述修饰CDR的抗CD47抗体仍然具有结合CD47的能力。

在一些实施方案中，本发明的抗CD47抗体或其抗原结合片段包含选自以下的一个至三个轻链互补决定区LCDR或由所述序列组成：(i)LCDR1，其包含与SEQ ID NO：23或24的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或者100％同一性的氨基酸序列或由所述序列组成，(ii)LCDR2，其包含与SEQ ID NO：25或26的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或者100％同一性的氨基酸序列或由所述序列组成，(iii)LCDR3，其包含与SEQ ID NO：27、28、29或30所示的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或者100％同一性的氨基酸序列或由所述序列组成，和(iv)含有一处或多处不超过5个氨基酸的氨基酸取代(例如保守性取代)、缺失或插入的(i)、(ii)和(iii)的LCDR，包含所述修饰CDR的抗CD47抗体仍然具有结合CD47的能力。

在一些实施方案中，本发明的抗CD47抗体或其抗原结合片段包含A)选自以下的一个至三个重链互补决定区HCDR：(i)HCDR1，其包含与选自SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、98和99的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或者100％同一性的氨基酸序列或由所述序列组成，(ii)HCDR2，其包含与选自SEQ IDNO：9、10、11、12、13、14、15、16、100和101的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或者100％同一性的氨基酸序列或由所述序列组成，(iii)HCDR3，其包含与选自SEQ ID NO：17、18、19、20、21、22、102和103的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或者100％同一性的氨基酸序列或由所述序列组成，(iv)含有一处或多处不超过5个氨基酸的氨基酸取代(例如保守性取代)、缺失或插入的(i)、(ii)和(iii)的HCDR；和B)选自以下的一个至三个轻链互补决定区LCDR：(i)LCDR1，其包含与SEQ ID NO：23或24的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或者100％同一性的氨基酸序列或由所述序列组成，(ii)LCDR2，其包含与SEQ ID NO：25或26的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或者100％同一性的氨基酸序列或由所述序列组成，(iii)LCDR3，其包含与SEQ ID NO：27、28、29或30所示的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或者100％同一性的氨基酸序列或由所述序列组成，和(iv)含有一处或多处不超过5个氨基酸的氨基酸取代(例如保守性取代)、缺失或插入的(i)、(ii)和(iii)的LCDR，包含所述修饰CDR的抗CD47抗体仍然具有结合CD47的能力。

在一些实施方案中，本发明的抗CD47抗体或其抗原结合片段包含选自以下的一个至三个重链互补决定区HCDR：(i)HCDR1，其包含选自SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、98和99的氨基酸序列或由所述序列组成，(ii)HCDR2，其包含选自SEQ ID NO：9、10、11、12、13、14、15、16、100和101的氨基酸序列或由所述序列组成，(iii)HCDR3，其包含选自SEQ ID NO：17、18、19、20、21、22、102和103的氨基酸序列或由所述序列组成，和(iv)含有一处或多处不超过5个氨基酸的氨基酸取代(例如保守性取代)、缺失或插入的(i)、(ii)和(iii)的HCDR，包含所述修饰CDR的抗CD47抗体仍然具有结合CD47的能力。

在一些实施方案中，本发明的抗CD47抗体或其抗原结合片段包含选自以下的一个至三个轻链互补决定区LCDR：(i)LCDR1，其包含SEQ ID NO：23或24的氨基酸序列或由所述序列组成，(ii)LCDR2，其包含SEQ ID NO：25或26的氨基酸序列或由所述序列组成，(iii)LCDR3，其包含SEQ ID NO：27、28、29或30所示的氨基酸序列或由所述序列组成，和(iv)含有一处或多处不超过5个氨基酸的氨基酸取代(例如保守性取代)、缺失或插入的(i)、(ii)和(iii)的LCDR，包含所述修饰CDR的抗CD47抗体仍然具有结合CD47的能力。

在一些实施方案中，本发明的抗CD47抗体或其抗原结合片段包含A)选自以下的一个或者多个重链互补决定区HCDR：(i)HCDR1，其包含选自SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、98和99的氨基酸序列或由所述序列组成，(ii)HCDR2，其包含选自SEQ ID NO：9、10、11、12、13、14、15、16、100和101的氨基酸序列或由所述序列组成，(iii)HCDR3，其包含选自SEQ ID NO：17、18、19、20、21、22、102和103的氨基酸序列或由所述序列组成，(iv)含有一处或多处不超过5个氨基酸的氨基酸取代(例如保守性取代)、缺失或插入的(i)、(ii)和(iii)的HCDR；和B)选自以下的一个至三个轻链互补决定区LCDR：(i)LCDR1，其包含SEQ ID NO：23或24的氨基酸序列或由所述序列组成，(ii)LCDR2，其包含SEQ ID NO：25、26的氨基酸序列或由所述序列组成，(iii)LCDR3，其包含SEQ ID NO：27、28、29或30所示的氨基酸序列或由所述序列组成，(iv)含有一处或多处不超过5个氨基酸的氨基酸取代(例如保守性取代)、缺失或插入的(i)、(ii)和(iii)的LCDR，包含所述修饰CDR的抗CD47抗体仍然具有结合CD47的能力。

在一个优选的实施方案中，上述在CDR中的一处或多处氨基酸修饰包含不超过5、4、3、2、1或者0个氨基酸的氨基酸取代(例如保守性取代)、缺失或插入。

在一些实施方案中，本发明的抗CD47抗体或其抗原结合片段包含重链互补决定区HCDR1、HCDR2和HCDR3，其中HCDR1包含选自SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、98和99的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成；HCDR2包含选自SEQ ID NO：9、10、11、12、13、14、15、16、100和101的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成；HCDR3包含选自SEQ ID NO：17、18、19、20、21、22、102和103的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成。

在一些实施方案中，本发明的抗CD47抗体或其抗原结合片段包含轻链互补决定区LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中LCDR1包含选自SEQ ID NO：23或24所示的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成；LCDR2包含选自SEQ ID NO：25和26所示的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成；LCDR3包含选自SEQ ID NO：27、28、29和30所示的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成。

在一些实施方案中，本发明的抗CD47抗体或其抗原结合片段包含重链互补决定区HCDR1、HCDR2和HCDR3和轻链互补决定区LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中HCDR1包含选自SEQ IDNO：1、2、3、4、5、6、7、8、98和99的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成；HCDR2包含选自SEQID NO：9、10、11、12、13、14、15、16、100和101的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成；HCDR3包含选自SEQ ID NO：17、18、19、20、21、22、102和103的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成；LCDR1包含选自SEQ ID NO：23和24所示的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成；LCDR2包含选自SEQ ID NO：25和26所示的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成；LCDR3包含选自SEQ ID NO：27、28、29和30所示的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成。

在优选的实施方案中，本发明提供抗CD47抗体或其抗原结合片段，其包含重链互补决定区HCDR1、HCDR2和HCDR3和轻链互补决定区LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中HCDR1包含SEQID NO：98或99所示的氨基酸序列或由其组成，HCDR2包含SEQ ID NO：100或101所示的氨基酸序列或由其组成，且HCDR3包含SEQ ID NO：102或103所示的氨基酸序列或由其组成；其中LCDR1包含选自SEQ ID NO：23和24所示的氨基酸序列或由所述序列组成，LCDR2包含选自SEQ ID NO：25和26所示的氨基酸序列或由所述序列组成，LCDR3包含选自SEQ ID NO：27、28、29和30所示的氨基酸序列或由所述序列组成。

在优选的实施方案中，本发明提供抗CD47抗体或其抗原结合片段，其中HCDR1包含SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列或由其组成；HCDR2包含SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列或由其组成；HCDR3包含SEQ ID NO：17所示的氨基酸序列或由其组成；LCDR1包含SEQ ID NO：23所示的氨基酸序列或由其组成；LCDR2包含SEQ ID NO：25所示的氨基酸序列或由其组成；且LCDR3包含SEQ ID NO：27所示的氨基酸序列或由其组成。

在优选的实施方案中，本发明提供抗CD47抗体或其抗原结合片段，其中HCDR1包含SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列或由其组成；HCDR2包含SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列或由其组成；HCDR3包含SEQ ID NO：18所示的氨基酸序列或由其组成；LCDR1包含SEQ ID NO：23所示的氨基酸序列或由其组成；LCDR2包含SEQ ID NO：25所示的氨基酸序列或由其组成；且LCDR3包含SEQ ID NO：27所示的氨基酸序列或由其组成。

在优选的实施方案中，本发明提供抗CD47抗体或其抗原结合片段，其中HCDR1包含SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列或由其组成；HCDR2包含SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列或由其组成；HCDR3包含SEQ ID NO：17所示的氨基酸序列或由其组成；LCDR1包含SEQ ID NO：23所示的氨基酸序列或由其组成；LCDR2包含SEQ ID NO：25所示的氨基酸序列或由其组成；且LCDR3包含SEQ ID NO：27所示的氨基酸序列或由其组成。

在优选的实施方案中，本发明提供抗CD47抗体或其抗原结合片段，其中HCDR1包含SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列或由其组成；HCDR2包含SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列或由其组成；HCDR3包含SEQ ID NO：19所示的氨基酸序列或由其组成；LCDR1包含SEQ ID NO：23所示的氨基酸序列或由其组成；LCDR2包含SEQ ID NO：25所示的氨基酸序列或由其组成；且LCDR3包含SEQ ID NO：28所示的氨基酸序列或由其组成。

在优选的实施方案中，本发明提供抗CD47抗体或其抗原结合片段，其中HCDR1包含SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列或由其组成；HCDR2包含SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列或由其组成；HCDR3包含SEQ ID NO：19所示的氨基酸序列或由其组成；LCDR1包含SEQ ID NO：23所示的氨基酸序列或由其组成；LCDR2包含SEQ ID NO：25所示的氨基酸序列或由其组成；且LCDR3包含SEQ ID NO：28所示的氨基酸序列或由其组成。

在优选的实施方案中，本发明提供抗CD47抗体或其抗原结合片段，其中HCDR1包含SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列或由其组成；HCDR2包含SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列或由其组成；HCDR3包含SEQ ID NO：19所示的氨基酸序列或由其组成；LCDR1包含SEQ ID NO：23所示的氨基酸序列或由其组成；LCDR2包含SEQ ID NO：25所示的氨基酸序列或由其组成；且LCDR3包含SEQ ID NO：28所示的氨基酸序列或由其组成。

在优选的实施方案中，本发明提供抗CD47抗体或其抗原结合片段，其中HCDR1包含SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列或由其组成；HCDR2包含SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列或由其组成；HCDR3包含SEQ ID NO：20所示的氨基酸序列或由其组成；LCDR1包含SEQ ID NO：24所示的氨基酸序列或由其组成；LCDR2包含SEQ ID NO：26所示的氨基酸序列或由其组成；且LCDR3包含SEQ ID NO：29所示的氨基酸序列或由其组成。

在优选的实施方案中，本发明提供抗CD47抗体或其抗原结合片段，其中HCDR1包含SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列或由其组成；HCDR2包含SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列或由其组成；HCDR3包含SEQ ID NO：20所示的氨基酸序列或由其组成；LCDR1包含SEQ ID NO：24所示的氨基酸序列或由其组成；LCDR2包含SEQ ID NO：26所示的氨基酸序列或由其组成；且LCDR3包含SEQ ID NO：29所示的氨基酸序列或由其组成。

在优选的实施方案中，本发明提供抗CD47抗体或其抗原结合片段，其中HCDR1包含SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列或由其组成；HCDR2包含SEQ ID NO：15所示的氨基酸序列或由其组成；HCDR3包含SEQ ID NO：21所示的氨基酸序列或由其组成；LCDR1包含SEQ ID NO：24所示的氨基酸序列或由其组成；LCDR2包含SEQ ID NO：26所示的氨基酸序列或由其组成；且LCDR3包含SEQ ID NO：30所示的氨基酸序列或由其组成。

在优选的实施方案中，本发明提供抗CD47抗体或其抗原结合片段，其中HCDR1包含SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列或由其组成；HCDR2包含SEQ ID NO：16所示的氨基酸序列或由其组成；HCDR3包含SEQ ID NO：22所示的氨基酸序列或由其组成；LCDR1包含SEQ ID NO：24所示的氨基酸序列或由其组成；LCDR2包含SEQ ID NO：26所示的氨基酸序列或由其组成；且LCDR3包含SEQ ID NO：30所示的氨基酸序列或由其组成。

在一些实施方案中，本发明的抗CD47抗体或其抗原结合片段包含重链可变区HCVR，其包含与选自SEQ ID NO：44、45、46、47、48、49、50、51、52和53的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或者100％同一性的氨基酸序列或由所述序列组成。在一些实施方案中，抗CD47抗体的重链可变区HCVR包含与选自SEQ ID NO：44、45、46、47、48、49、50、51、52和53的氨基酸序列相比具有一个或多个取代(例如保守性取代)、插入或缺失的氨基酸序列，但是包含所述HCVR的抗CD47抗体具有结合CD47的能力。

在一些实施方案中，本发明的抗CD47抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区LCVR，其包含与SEQ ID NO：54、55、57和58所示的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或者100％同一性的氨基酸序列或由所述序列组成。在一些实施方案中，抗CD47抗体的轻链可变区LCVR包含与SEQ ID NO：54、55、57和58所示的氨基酸序列相比具有一个或多个取代(例如保守性取代)、插入或缺失的氨基酸序列，但是包含所述LCVR的抗CD47抗体具有结合CD47的能力。

在一些实施方案中，本发明的抗CD47抗体或其抗原结合片段包含重链可变区(HCVR)和轻链可变区(LCVR)，其中重链可变区HCVR包含与选自SEQ ID NO：44、45、46、47、48、49、50、51、52和53的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或者100％同一性的氨基酸序列或由所述序列组成；轻链可变区LCVR包含与SEQ ID NO：54、55、57和58所示的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或者100％同一性的氨基酸序列或由所述序列组成。

在优选的实施方案中，本发明提供抗CD47抗体或其抗原结合片段，其中重链可变区HCVR包含SEQ ID NO：44所示的氨基酸序列或由其组成；轻链可变区LCVR包含SEQ ID NO：54所示的氨基酸序列或由其组成。

在优选的实施方案中，本发明提供抗CD47抗体或其抗原结合片段，其中重链可变区HCVR包含SEQ ID NO：45所示的氨基酸序列或由其组成；轻链可变区LCVR包含SEQ ID NO：54所示的氨基酸序列或由其组成。

在优选的实施方案中，本发明提供抗CD47抗体或其抗原结合片段，其中重链可变区HCVR包含SEQ ID NO：46所示的氨基酸序列或由其组成；轻链可变区LCVR包含SEQ ID NO：54所示的氨基酸序列或由其组成。

在优选的实施方案中，本发明提供抗CD47抗体或其抗原结合片段，其中重链可变区HCVR包含SEQ ID NO：47所示的氨基酸序列或由其组成；轻链可变区LCVR包含SEQ ID NO：55所示的氨基酸序列或由其组成。

在优选的实施方案中，本发明提供抗CD47抗体或其抗原结合片段，其中重链可变区HCVR包含SEQ ID NO：48所示的氨基酸序列或由其组成；轻链可变区LCVR包含SEQ ID NO：55所示的氨基酸序列或由其组成。

在优选的实施方案中，本发明提供抗CD47抗体或其抗原结合片段，其中重链可变区HCVR包含SEQ ID NO：49所示的氨基酸序列或由其组成；轻链可变区LCVR包含SEQ ID NO：55所示的氨基酸序列或由其组成。

在优选的实施方案中，本发明提供抗CD47抗体或其抗原结合片段，其中重链可变区HCVR包含SEQ ID NO：50所示的氨基酸序列或由其组成；轻链可变区LCVR包含SEQ ID NO：57所示的氨基酸序列或由其组成。

在优选的实施方案中，本发明提供抗CD47抗体或其抗原结合片段，其中重链可变区HCVR包含SEQ ID NO：51所示的氨基酸序列或由其组成；轻链可变区LCVR包含SEQ ID NO：57所示的氨基酸序列或由其组成。

在优选的实施方案中，本发明提供抗CD47抗体或其抗原结合片段，其中重链可变区HCVR包含SEQ ID NO：52所示的氨基酸序列或由其组成；轻链可变区LCVR包含SEQ ID NO：58所示的氨基酸序列或由其组成。

在优选的实施方案中，本发明提供抗CD47抗体或其抗原结合片段，其中重链可变区HCVR包含SEQ ID NO：53所示的氨基酸序列或由其组成；轻链可变区LCVR包含SEQ ID NO：58所示的氨基酸序列或由其组成。

在一些实施方案中，本发明的抗CD47抗体或其抗原结合片段包含重链，其中重链包含与选自SEQ ID NO：74、76、77、78、80、81、82、84、85、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96和97的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或者100％同一性的氨基酸序列或由所述序列组成。在一些实施方案中，抗CD47抗体的重链包含与选自SEQ ID NO：74、76、77、78、80、81、82、84、85、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96和97的氨基酸序列相比具有一个或多个取代(例如保守性取代)、插入或缺失的氨基酸序列，但是包含所述重链的抗CD47抗体具有结合CD47的能力。

在一些实施方案中，本发明的抗CD47抗体或其抗原结合片段包含轻链，其中轻链包含与SEQ ID NO：75、79、83或86所示的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或者100％同一性的氨基酸序列或由所述序列组成。在一些实施方案中，抗CD47抗体的轻链包含与选自SEQ ID NO：75、79、83和86所示的氨基酸序列相比具有一个或多个取代(例如保守性取代)、插入或缺失的氨基酸序列，但是包含所述轻链的抗CD47抗体具有结合CD47的能力。

在一些实施方案中，本发明的抗CD47抗体或其抗原结合片段包含重链和轻链，其中重链包含与选自SEQ ID NO：74、76、77、78、80、81、82、84、85、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96和97的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或者100％同一性的氨基酸序列或由所述序列组成；轻链包含与SEQ ID NO：75、79、83、86所示的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性或者100％同一性的氨基酸序列或由所述序列组成。

在优选的实施方案中，本发明提供抗CD47抗体或其抗原结合片段，其中重链包含SEQ ID NO：74所示的氨基酸序列或由其组成；轻链包含SEQ ID NO：75所示的氨基酸序列或由其组成。

在优选的实施方案中，本发明提供抗CD47抗体或其抗原结合片段，其中重链包含SEQ ID NO：76所示的氨基酸序列或由其组成；轻链包含SEQ ID NO：75所示的氨基酸序列或由其组成。

在优选的实施方案中，本发明提供抗CD47抗体或其抗原结合片段，其中重链包含SEQ ID NO：77所示的氨基酸序列或由其组成；轻链包含SEQ ID NO：75所示的氨基酸序列或由其组成。

在优选的实施方案中，本发明提供抗CD47抗体或其抗原结合片段，其中重链包含SEQ ID NO：78所示的氨基酸序列或由其组成；轻链包含SEQ ID NO：79所示的氨基酸序列或由其组成。

在优选的实施方案中，本发明提供抗CD47抗体或其抗原结合片段，其中重链包含SEQ ID NO：80所示的氨基酸序列或由其组成；轻链包含SEQ ID NO：79所示的氨基酸序列或由其组成。

在优选的实施方案中，本发明提供抗CD47抗体或其抗原结合片段，其中重链包含SEQ ID NO：81所示的氨基酸序列或由其组成；轻链包含SEQ ID NO：79所示的氨基酸序列或由其组成。

在优选的实施方案中，本发明提供抗CD47抗体或其抗原结合片段，其中重链包含SEQ ID NO：82所示的氨基酸序列或由其组成；轻链包含SEQ ID NO：83所示的氨基酸序列或由其组成。

在优选的实施方案中，本发明提供抗CD47抗体或其抗原结合片段，其中重链包含SEQ ID NO：84所示的氨基酸序列或由其组成；轻链包含SEQ ID NO：83所示的氨基酸序列或由其组成。

在优选的实施方案中，本发明提供抗CD47抗体或其抗原结合片段，其中重链包含SEQ ID NO：85所示的氨基酸序列或由其组成；轻链包含SEQ ID NO：86所示的氨基酸序列或由其组成。

在优选的实施方案中，本发明提供抗CD47抗体或其抗原结合片段，其中重链包含SEQ ID NO：87所示的氨基酸序列或由其组成；轻链包含SEQ ID NO：86所示的氨基酸序列或由其组成。

在优选的实施方案中，本发明提供抗CD47抗体或其抗原结合片段，其中重链包含SEQ ID NO：88所示的氨基酸序列或由其组成；轻链包含SEQ ID NO：75所示的氨基酸序列或由其组成。

在优选的实施方案中，本发明提供抗CD47抗体或其抗原结合片段，其中重链包含SEQ ID NO：89所示的氨基酸序列或由其组成；轻链包含SEQ ID NO：75所示的氨基酸序列或由其组成。

在优选的实施方案中，本发明提供抗CD47抗体或其抗原结合片段，其中重链包含SEQ ID NO：90所示的氨基酸序列或由其组成；轻链包含SEQ ID NO：75所示的氨基酸序列或由其组成。

在优选的实施方案中，本发明提供抗CD47抗体或其抗原结合片段，其中重链包含SEQ ID NO：91所示的氨基酸序列或由其组成；轻链包含SEQ ID NO：79所示的氨基酸序列或由其组成。

在优选的实施方案中，本发明提供抗CD47抗体或其抗原结合片段，其中重链包含SEQ ID NO：92所示的氨基酸序列或由其组成；轻链包含SEQ ID NO：79所示的氨基酸序列或由其组成。

在优选的实施方案中，本发明提供抗CD47抗体或其抗原结合片段，其中重链包含SEQ ID NO：93所示的氨基酸序列或由其组成；轻链包含SEQ ID NO：79所示的氨基酸序列或由其组成。

在优选的实施方案中，本发明提供抗CD47抗体或其抗原结合片段，其中重链包含SEQ ID NO：94所示的氨基酸序列或由其组成；轻链包含SEQ ID NO：83所示的氨基酸序列或由其组成。

在优选的实施方案中，本发明提供抗CD47抗体或其抗原结合片段，其中重链包含SEQ ID NO：95所示的氨基酸序列或由其组成；轻链包含SEQ ID NO：83所示的氨基酸序列或由其组成。

在优选的实施方案中，本发明提供抗CD47抗体或其抗原结合片段，其中重链包含SEQ ID NO：96所示的氨基酸序列或由其组成；轻链包含SEQ ID NO：86所示的氨基酸序列或由其组成。

在优选的实施方案中，本发明提供抗CD47抗体或其抗原结合片段，其中重链包含SEQ ID NO：97所示的氨基酸序列或由其组成；轻链包含SEQ ID NO：86所示的氨基酸序列或由其组成。

在一些实施方案中，本发明的抗体还涵盖抗CD47抗体的氨基酸序列的变体、与上文所述的任何抗体竞争结合CD47的抗体、以及与上文所述的任何抗体结合CD47相同表位的抗体。

在一些实施方案中，抗CD47抗体是单克隆抗体。在一些实施方案中，抗CD47抗体是人源化的。在一些实施方案中，抗CD47抗体是人抗体。在一些实施方案中，至少部分的抗CD47抗体的框架序列是人共有框架序列。在一个实施方案中，本发明的抗CD47抗体还涵盖其抗体片段，优选地选自以下的抗体片段：Fab、Fab’-SH、Fv、scFv或(Fab’)₂片段。

在一些实施方案中，本发明的抗CD47抗体是阻断性抗体，阻断CD47与SIRPα的结合。

在一方面，本发明提供了编码以上任何抗CD47抗体或其片段的核酸。在一个实施方案中，提供包含所述核酸的载体。在一个实施方案中，载体是表达载体。在一个实施方案中，提供包含所述载体的宿主细胞。在一个实施方案中，宿主细胞是真核的。在另一个实施方案中，宿主细胞选自酵母细胞、哺乳动物细胞或适用于制备抗体或其抗原结合片段的其它细胞。在另一个实施方案中，宿主细胞是原核的。

在一个实施方案中，本发明提供制备抗CD47抗体或其片段(优选的抗原结合片段)的方法，其中所述方法包含在适于表达编码所述抗体或其片段(优选的抗原结合片段)的核酸的条件下培养所述宿主细胞，以及任选地分离所述抗体或其片段(优选地抗原结合片段)。在某个实施方案中，所述方法还包括从宿主细胞回收抗CD47抗体或其片段(优选地抗原结合片段)。

在一个实施方案中，本发明提供由本发明的方法制备的抗CD47抗体或其片段。

在一些实施方案中，本发明提供包含本文所述的任何抗CD47抗体或其片段(优选地其抗原结合片段)的组合物，优选地组合物为药物组合物。在一个实施方案中，所述组合物还包含药用载体。

在一方面中，本发明涉及在受试者中抑制CD47与SIRPα结合的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的本文的任何抗CD47抗体或其片段。本发明还涉及本文公开的任何抗CD47抗体或其片段制备用于在受试者中抑制CD47与SIRPα结合的组合物或药物的用途。

在一方面中，本发明涉及促进受试者的巨噬细胞发挥吞噬作用的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的本文任何的抗CD47抗体或其片段。本发明还涉及本文公开的任何抗CD47抗体或其片段制备用于促进受试者的巨噬细胞发挥吞噬作用的组合物或药物的用途。在一个实施方案中，本发明的抗CD47抗体相比较于对照，可以提高巨噬细胞的吞噬作用至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或100％以上。

在另一方面中，本发明涉及治疗受试者的与CD47相关的病症的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的本文的任何抗CD47抗体或其片段。本发明还涉及本文的任何抗CD47抗体或其片段制备用于在受试者中治疗与CD47相关的病症的药物的用途。

在一些实施方案中，与CD47相关的病症是各种血液病和实体瘤，包括但不限于急性骨髓性白血病(AML)，慢性骨髓性白血病，急性淋巴细胞白血病(ALL)，非霍奇金淋巴瘤(NHL)，多发性骨髓瘤(MM)、淋巴瘤、乳腺癌、胃癌、肺癌、食管癌、肠癌、卵巢癌、宫颈癌、肾癌、胰腺癌、膀胱癌、神经胶质瘤、黑素瘤和其他实体瘤。

在一方面中，本发明涉及以CD47为靶点的肿瘤免疫治疗方法，所述方法包括向受试者施用有效量的本文所述的任何抗CD47抗体或其片段。本发明还涉及本文公开的任何抗CD47抗体或其片段制备用于治疗肿瘤的药物中的用途。

在一方面中，本发明涉及治疗可以通过消除、抑制或降低CD47活性而被改善、减缓、抑制或预防的任何疾病或病症的方法。

在另一方面，本发明的方法还涉及通过联合疗法治疗肿瘤的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的本文所述的任何抗CD47抗体或其片段和一种或多种其它药物。在一些实施方案中，本文公开的方法还包括向受试者联合施用有效量的第二药物，其中本文公开的抗CD47抗体或其片段是第一药物。在一个实施方案中，第二药物是用于治疗相关疾病的化疗剂、放疗剂或者生物大分子药物。在一个实施方案中，该生物大分子药物例如是通过T细胞识别攻击肿瘤细胞的各种单克隆抗体药，例如利妥昔单抗、西妥昔单抗与曲妥珠单抗。如本文所用的表述“第二药物”并不意味着它是指第一药物之外的唯一药物。因此，第二药物不必是一种药物，而可以是构成或包含多于一种这类药物。

在一些实施方案中，受试者或个体是哺乳动物，优选地人。

在一些实施方案中，本发明提供的抗CD47抗体或其抗原结合片段可以有效促进巨噬细胞的吞噬作用。

在一个优选的实施方案中，与对照抗体相比，本发明提供的抗CD47抗体或其抗原结合片段令人惊讶地能够有效抑制肿瘤的生长。

在一个更优选的实施方案中，本发明提供的抗CD47抗体或其抗原结合片段能够完全消退肿瘤，这是完全出乎意料的，也是现有技术中从未报道过的。

在一方面中，本发明涉及检测样品中CD47蛋白的方法，所述方法包括(a)将样品与本文所述的任何抗CD47抗体或其片段接触；和(b)检测抗CD47抗体或其片段和CD47蛋白间的复合物的形成。在某些实施方案中，CD47是人CD47。在一个实施方案中，该检测方法可以是体外或体内方法。在一个实施方案中，抗CD47抗体被用于选择适合利用抗CD47抗体的治疗的受试者。在一个实施方案中，抗CD47抗体是被可检测地标记的。

在另一方面，本发明涉及确定癌症疗法的有效性的方法，包括测量在治疗前后来自受试者样品中的表达CD47的癌症细胞的数目的步骤，治疗后表达CD47的癌症细胞减少表明该疗法有效。

本发明还涵盖本文所述的任何实施方案的任意组合。本文所述的任何实施方案或其任何组合适用于本文所述的发明的任何和所有抗CD47抗体或其片段、方法和用途。

附图说明：

图1.流式细胞术测定的酵母中产生的IgG1形式的抗CD47抗体的细胞水平亲和力检测。

图2.流式细胞术测定的在酵母细胞中产生的IgG1形式的本发明的抗体对SIRPα与CHO细胞上表达的CD47的结合的阻断。

图3.流式细胞术测定的CHO细胞中产生的IgG4形式的本发明的抗体对SIRPα与CHO细胞上表达的CD47的结合的阻断。

图4.酵母细胞中产生的IgG1形式的本发明的抗体促进巨噬细胞吞噬肿瘤细胞的能力检测，包括酵母细胞中产生的IgG1形式的抗体亲和力成熟后抗体ADI-29336、ADI-29340、ADI-29341和ADI-29349。

图5.酵母细胞中产生的IgG1的本发明的抗体促进巨噬细胞吞噬肿瘤细胞的能力检测。

图6.CHO细胞中产生的IgG4形式的本发明的抗体促进巨噬细胞吞噬肿瘤细胞的能力检测。

图7.CHO细胞中产生的IgG4形式的本发明的抗体促进巨噬细胞吞噬肿瘤细胞的能力检测。包括ADI-29336、ADI-29340、ADI-29341和ADI-29349和ADI-29371。

图8：CHO细胞中产生的IgG4形式的本发明抗体ADI-26630在小鼠模型(NOD/SCIDRaji肿瘤模型)中的抗肿瘤活性研究。其中图8B是图8A的局部放大图。

图9：CHO细胞中产生的IgG4形式的本发明抗体ADI-26624在小鼠模型(NOD/SCIDRaji肿瘤模型)中的抗肿瘤活性研究。

图10：CHO细胞中产生的IgG4形式的本发明抗体ADI-26630，ADI29340和ADI29341在小鼠模型(NOD/SCID Raji肿瘤模型)中的抗肿瘤活性研究，剂量为0.5mg/kg。

图11：CHO细胞中产生的IgG4形式的本发明抗体ADI-26630，ADI29340和ADI29341在小鼠模型(NOD/SCID Raji肿瘤模型)中的抗肿瘤活性研究，剂量为5mg/kg。

图12：本发明抗CD47抗体促进红细胞凝集活性检测结果。

发明详述

1.1定义

在下文详细描述本发明前，应理解本发明不限于本文中描述的特定方法学、方案和试剂，因为这些可以变化。还应理解本文中使用的术语仅为了描述具体实施方案，而并不意图限制本发明的范围，其仅会由所附权利要求书限制。除非另外定义，本文中使用的所有技术和科学术语与本发明所属领域中普通技术人员通常的理解具有相同的含义。

为了解释本说明书，将使用以下定义，并且只要适当，以单数形式使用的术语也可以包括复数，并且反之亦然。要理解，本文所用的术语仅是为了描述具体的实施方案，并且不意欲是限制性的。

术语“约”在与数字数值联合使用时意为涵盖具有比指定数字数值小5％的下限和比指定数字数值大5％的上限的范围内的数字数值。

术语“保守取代”是指一个氨基酸经相同类别内的另一氨基酸取代，例如一个酸性氨基酸经另一酸性氨基酸取代，一个碱性氨基酸经另一碱性氨基酸取代，或一个中性氨基酸经另一中性氨基酸取代。示例性的取代如下表A所示：

表A

术语“抗体”在本文中以最广意义使用并且涵盖多种抗体结构物，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)和抗体片段，只要它们显示出所需的抗原结合活性即可。完整抗体通常将包含至少两条全长重链和两条全长轻链，但在某些情况下可包括较少的链，例如骆驼中天然存在的抗体可仅包含重链。

如本文所用的术语“抗原结合部分”指与靶抗原特异性结合的部分。该术语包括能够与靶抗原特异性结合的抗体以及其他天然分子(例如受体，配体)或合成分子(例如，DARPin)。在一个优选的实施方案中，本发明抗体的抗原结合部分是抗体片段。

术语“全长抗体”、“完好抗体”和“完整抗体”在本文中可互换地用来指一种抗体，所述抗体具有基本上与天然抗体结构相似的结构或具有含有如本文定义的Fc区的重链。

如本文所用，术语“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”指具有单一氨基酸组成的抗体分子的制备物，而不指其产生的方法。单克隆抗体或其抗原结合片段可以例如通过杂交瘤技术、重组技术、噬菌体展示技术、合成技术例如CDR嫁接、或此类或其它本领域已知的技术的组合来产生。

如本文所用，术语“结合”和“特异性结合”指抗体或抗原结合部分在体外测定法中，优选地在采用纯化的野生型抗原的生物光干涉测量(ForteBio)中与抗原表位结合。在某些实施方案中，在抗体或抗原结合部分优选地识别蛋白质和/或大分子的复杂混合物中其靶抗原时，将抗体或抗原结合部分称作特异性结合抗原。

取决于其重链恒定区的氨基酸序列，将抗体以“类”划分：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且这些类别中的几种可以进一步划分成亚类，如，IgG1、IgG2、IgG3和IgG4、IgA1以及IgA2。对应于不同抗体类的重链恒定区分别称作δ、ε、γ和μ。可以在全部五个抗体类中找到的轻链恒定区(CL)称作κ和λ。在全长轻链和重链内，通常可变区和恒定区由约12个或更多个氨基酸的“J”区连接，且重链还包括约10个以上氨基酸的“D”区。参见例如Fundamental Immunology，Ch.7(Paul，W.编辑，第二版，Raven Press，N.Y.(1989))(其为所有目的以其整体在此引作参考)。每一轻链/重链对的可变区通常形成抗原结合位点。

术语“可变区”或“可变结构域”是指参与抗体与抗原结合的抗体重或轻链的结构域。天然抗体的重链和轻链的可变结构域通常具有相似的结构，其中每个结构域包含四个保守的框架区(FR)和三个互补决定区。(参见，例如，Kindt等Kuby Immunology，6^th ed.，W.H.Freeman and Co.91页(2007))。单个VH或VL结构域可以足以给予抗原结合特异性。此外，可以使用来自与特定抗原结合的抗体的VH或VL结构域来分离结合所述抗原的抗体，以分别筛选互补VL或VH结构域的文库。参见，例如，Portolano等，J.Immunol.150：880-887(1993)；Clarkson等，Nature 352：624-628(1991)。

可变区通常表现出由三个高变区连接的相对保守的构架区(FR)的相同的一般结构，所述高变区也被称为互补决定区或CDR。通常通过构架区定位(align)来自每对的两条链的CDR，所述CDR使得可结合特异性表位。两条轻链和重链可变区从N-末端到C-末端通常包含结构域FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。

“抗体片段”是指不同于完整抗体的分子，其包含完整抗体的部分，所述部分结合完整抗体结合的抗原。

“亲和力”是指分子(例如抗体)的单一结合位点与其结合配偶体(例如抗原)之间全部非共价相互作用总和的强度。除非另有说明，在用于本文时，“结合亲和力”指反映结合对的成员(例如抗体与抗原)之间1∶1相互作用的内在结合亲和力。分子X对其配偶体Y的亲和力通常可用解离常数(Kd)来表述。亲和力可通过本领域知道的常用方法来测量，包括现有技术已知以及本文中所描述的那些。

当术语“竞争”用于竞争相同表位的抗原结合蛋白(例如中和抗原结合蛋白或中和抗体)的情况中时，意指在抗原结合蛋白之间竞争，其通过以下测定法来测定：在所述测定法中，待检测的抗原结合蛋白(例如抗体或其免疫学功能片段)防止或抑制(例如降低)参考抗原结合蛋白(例如配体或参考抗体)与共同抗原(例如CD47或其片段)的特异性结合。众多类型的竞争性结合测定可用于确定一种抗原结合蛋白是否与另一种竞争，这些测定例如：固相直接或间接放射免疫测定(RIA)、固相直接或间接酶免疫测定(EIA)、夹心竞争测定(参见例如Stahli等，1983，Methods in Enzymology 9：242-253)。通常所述测定法涉及使用结合荷有未标记的检测抗原结合蛋白及标记的参考抗原结合蛋白任一种的固态表面或细胞的纯化的抗原。通过测量在所测抗原结合蛋白存在下结合固态表面或细胞的标记的量来测量竞争性抑制。通常所测抗原结合蛋白过量存在。由竞争性测定(竞争抗原结合蛋白)鉴定的抗原结合蛋白包括：结合与参考抗原结合蛋白同一表位的抗原结合蛋白；和结合充分接近参考抗原结合蛋白的结合表位的邻近表位的抗原结合蛋白，所述两个表位在空间上互相妨碍发生结合。在本文实施例中提供关于用于测定竞争性结合的方法的其它详细资料。通常当竞争的抗原结合蛋白过量存在时，其将抑制(例如降低)至少40-45％、45-50％、50-55％、55-60％、60-65％、65-70％、70-75％或75％或更多参考抗原结合蛋白与共同抗原的特异性结合。在某些情况下，结合被抑制至少80-85％、85-90％、90-95％、95-97％或97％或更多。

“人抗体”指具有这样的氨基酸序列的抗体，所述氨基酸序列对应于这样抗体的氨基酸序列，所述抗体由人或人细胞生成或来源于非人来源，其利用人抗体库或其它人抗体编码序列。人抗体的这种定义明确排除包含非人抗原结合残基的人源化抗体。

“人共有框架”是指这样的框架，即在选择人免疫球蛋白VL或VH框架序列中，其代表最常出现的氨基酸残基。一般而言，对人免疫球蛋白VL或VH序列的选择是从可变结构域序列的亚型中选择。一般而言，该序列的亚型是如Kabat等，Sequences of Proteins ofImmunological Interest，第五版，NIH Publication 91-3242，Bethesda MD(1991)，1-3卷中的亚型。在一个实施方案中，对于VL，该亚型是如Kabat等(见上文)中的亚型κ I。在一个实施方案中，对于VH，该亚型是如Kabat等(见上文)中的亚型III。

“人源化”抗体是指包含来自非人HVR的氨基酸残基和来自人FR的氨基酸残基的嵌合抗体。在一些实施方案中，人源化抗体将包含基本上所有的至少一个、通常两个可变结构域，其中所有或基本上所有的HVR(例如，CDR)对应于非人抗体的那些，并且所有或基本上所有的FR对应于人抗体的那些。人源化抗体任选可以包含至少一部分的来源于人抗体的抗体恒定区。抗体(例如非人抗体)的“人源化形式”是指已经进行了人源化的抗体。

术语“双抗体(diabodies)”指具有两个抗原结合位点的抗体片段，所述片段在相同的多肽链(VH-VL)中包含与轻链可变结构域(VL)连接的重链可变结构域(VH)。通过使用因为太短而不能在相同链上的两个结构域之间配对的接头，迫使所述结构域与另一条链的互补结构域配对从而产生两个抗原结合位点。双抗体可以是二价的或双特异性的。双抗体更充分地描述于例如EP 404,097；WO 1993/01161；Hudson等，Nat.Med.9：129-134(2003)；和Hollinger等，美国国家科学院学报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)90：6444-6448(1993)中。三抗体和四抗体同样描述于Hudson等，Nat.Med.9：129-134(2003)中。

“效应子功能”指那些可归于抗体Fc区且随抗体同种型而变化的生物学活性。抗体效应子功能的实例包括：C1q结合和补体依赖性细胞毒性(CDC)；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体(例如B细胞受体)下调；和B细胞活化。

术语“有效量”、“治疗有效量”指本发明的抗体或抗原结合片段这样的量或剂量，其以单一或多次剂量施用患者后，在治疗的受试者中产生预期效果，这包括受试者病症的改善(例如，一个或多个症状的改善)和/或症状进展的延迟等。“有效量”、“治疗有效量”也可以指足够降低CD47信号的量(参见例如Yamauchi等，2013Blood，Jan 4.；Soto-Pantoja等，2013Expert Opin Ther Targets，17：89-103；Irandoust等，2013PLoS One，Epub Jan8；Chao等，2012Curr Opin Immunol，24：225-32；Theocharides等，2012J Exp Med，209(10)：1883-99)，例如为足够降低巨噬细胞中由CD47/SIRP α信号轴上的CD47/SIRP α相互作用生成的吞噬细胞抑制信号的抗体量，即本发明的抗体促进了巨噬细胞介导的对表达CD47的细胞的吞噬作用。

在一个实施方式中，相比较于对照，有效量的本发明CD47抗体可以促进/提高巨噬细胞的吞噬作用10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。

有效量可以由作为本领域技术人员的主治医师通过考虑以下多种因素来容易地确定：诸如哺乳动物的物种；它的大小、年龄和一般健康；涉及的具体疾病；疾病的程度或严重性；个体患者的应答；施用的具体抗体；施用模式；施用制剂的生物利用率特征；选择的给药方案；和任何伴随疗法的使用。

如上所述，在某些情况下，抗体及其靶抗原之间的相互作用会干扰靶标的功能。给药所需的量进一步取决于抗体对其特异抗原的结合亲和力，还取决于在接受给药的受试者中给予的抗体清除的速率。作为非限制性示例，本发明的抗体或抗体片段的治疗有效剂量的常见范围为从约0.1mg/kg体重至约100mg/kg体重。在一些实施方式中，以0.1mg/kg、0.5mg/kg、lmg/kg、2mg/kg、5mg/kg、10mg/kg、15mg/kg、20mg/kg、25mg/kg、30mg/kg、50mg/kg、75mg/kg、100mg/kg或更高的剂量将本发明的抗体给予受试者。常见的剂量频率范围是例如每天两次至每周一次、每两周一次，每三周一次，每一月一次、每二月一次、每三月一次、每半年一次。

本文所用术语“阻断”表示存在本发明的抗体时减少的CD47信号传递。CD47介导的信号传递阻断指本发明的CD47抗体存在时CD47信号传递水平低于CD47的对照水平(即不存在抗体时的CD47信号传递水平)，降低的幅度大于或等于5％、10％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、90％、95％、99％或100％0可使用多种标准技术测量CD47信号传递水平，如作为非限制性实施例，测量下游基因激活和/或响应CD47激活的荧光素酶报告试验。本领域技术人员应理解可使用多种试验测量CD47信号传递水平，包括例如市售可得的试剂盒。

术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”可交换地使用且是指其中引入外源核酸的细胞，包括这种细胞的后代。宿主细胞包括“转化体”和“转化的细胞”，其包括初级转化的细胞和来源于其的后代，而不考虑传代的数目。后代在核酸含量上可能与亲本细胞不完全相同，而是可以包含突变。本文中包括与在最初转化的细胞中筛选或选择的具有相同功能或生物学活性的突变体后代。

术语“细胞毒性剂”用在本发明中指抑制或防止细胞功能和/或引起细胞死亡或破坏的物质。

术语“载体”当在本文中使用时是指能够增殖与其相连的另一个核酸的核酸分子。该术语包括作为自我复制核酸结构的载体以及结合到已经引入其的宿主细胞的基因组中的载体。一些载体能够指导与其可操作相连的核酸的表达。这样的载体在本文中被称为“表达载体”。

“免疫缀合物”是与一个或多个异源分子(包括但不限于细胞毒性剂)缀合的抗体。

“个体”或“受试者”包括哺乳动物。哺乳动物包括但不限于，家养动物(例如，牛，羊，猫，狗和马)，灵长类动物(例如，人和非人灵长类动物如猴)，兔，以及啮齿类动物(例如，小鼠和大鼠)。在一些实施方案中，个体或受试者是人。

“分离的”抗体是这样的抗体，其已经与其天然环境的组分分离。在一些实施方案中，将抗体纯化至超过95％或99％纯度，如通过例如电泳(例如，SDS-PAGE，等电聚焦(IEF)，毛细管电泳)或层析(例如，离子交换或反相HPLC)确定的。对于用于评估抗体纯度的方法的综述，参见，例如，Flatman等，J.Chromatogr.B848：79-87(2007)。

“分离的”核酸是指这样的核酸分子，其已经与其天然环境的组分分离。分离的核酸包括包含在通常包含该核酸分子的细胞中的核酸分子，但是该核酸分子存在于染色体外或在不同于其天然染色体位置的染色体位置处。

“分离的编码抗CD47抗体或其抗原结合片段的核酸”是指一个或多个核酸分子，其编码抗体重和轻链(或其抗原结合片段)，包括在单一载体或分开的载体中的这样的核酸分子，以及存在于宿主细胞中的一个或多个位置处的这样的核酸分子。

相对于参比多肽序列的“百分比(％)氨基酸序列同一性”定义为在将所述序列进行比对(并在必要时导入空位)以获取最大百分比序列同一性，且不将任何保守取代视为序列同一性的部分之后，候选序列中的氨基酸残基与参比多肽序列中的相同氨基酸残基的百分比。可使用本领域各种方法进行序列比对以便测定百分比氨基酸序列同一性，例如，使用公众可得到的计算机软件如BLAST、BLAST-2、ALIGN或MEGALIGN(DNASTAR)软件。本领域技术人员可以决定测量比对的适宜参数，包括对所比较的序列全长获得最大比对所需的任何算法。

当在本申请中提到序列同一性的百分比时，若未另外特别指出，这些百分比相对于较长序列的全长计算。相对于较长序列的全长计算适用于核酸序列和多肽序列两者。

术语“血红细胞”和“红细胞”是同义词并可互换使用。

术语“凝集”表示细胞结块，而术语“血凝反应”表示特定的一类细胞(即血红细胞)结块。因此，血凝反应是凝集的一种类型。

1.2本发明的抗CD47抗体

除非另外说明，术语“整联蛋白相关蛋白(IAP)”、“CD47”当用于本文中时是指来自任何脊椎动物来源(包括哺乳动物如灵长类动物(例如人)和啮齿类动物(例如，小鼠和大鼠))的任何天然CD47，除非另有说明。该术语涵盖“全长”未加工的CD47以及由细胞内加工产生的任何形式的CD47或其任何片段。该术语还包括天然存在的CD47的变体，例如，剪接变体或等位变体。

术语“抗CD47抗体”、“抗CD47”、“CD47抗体”或“结合CD47的抗体”是指这样的抗体，所述抗体能够以足够的亲合力结合CD47蛋白或其片段以致所述抗体可以用作靶向CD47中的诊断剂和/或治疗剂。在一个实施方案中，抗CD47抗体与不相关的、非CD47蛋白结合的程度低于所述抗体与CD47结合的约10％，如例如通过放射性免疫测定(RIA)测量的。在一些实施方案中，本文提供的抗CD47的抗体的解离常数(Kd)≤1μM，≤100nM，≤10nM，≤1nM，≤0.1nM，≤0.01nM，或≤0.001nM(例如10^-8M以下，例如10^-8M至10^-13M，例如10^-9M至10^-13M)。

在一些实施方案中，本发明的抗CD47抗体或其抗原结合片段包含取代、插入或缺失。在优选的实施方案中，取代、插入或缺失发生在CDR外的区域(例如在FR中)。任选地，本发明的抗CD47抗体包括对轻链可变区、重链可变区、轻链或重链的翻译后修饰。

本发明提供的CD47抗体表现出抑制活性，例如抑制CD47的表达(如抑制细胞表面CD47的表达)、活性和/或信号传递，或干扰CD47和SIRP α之间的相互作用。本发明提供的CD47抗体在结合CD47(如人CD47)或与其相互作用后完全或部分地降低或调节CD47的表达或活性。在抗体与人CD47多肽和/或肽之间相互作用后，CD47生物学功能的降低或调节是完全、显著或部分的。当与不存在同本文所述的抗体相互作用(如结合)时CD47的表达或活性水平相比，存在抗体时CD47的表达或活性水平降低了至少95％(例如降低了96％、97％、98％、99％或100％)时，所述抗体被认为能够完全抑制CD47的表达或活性。与不存在同本文所述的CD47抗体结合时CD47的表达或活性水平相比，存在CD47抗体时CD47的表达或活性水平降低了至少50％(例如降低了55％、60％、75％、80％、85％或90％)，此时所述CD47抗体被认为能够显著抑制CD47的表达或活性。与不存在同本文所述的抗体相互作用(如结合)时CD47的表达或活性水平相比，存在抗体时CD47的表达或活性水平降低了少于95％(例如降低了10％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、75％、80％、85％或90％)，此时所述抗体被认为能够部分抑制CD47的表达或活性。

在某些实施方案中，可在本文中所提供抗体的Fc区中引入一个或多个氨基酸修饰，以此产生Fc区变体。Fc区变体可包含在一或多个氨基酸位置处包含氨基酸修饰(例如取代)的人Fc区序列(例如人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4Fc区)。

在某些实施方案中，可能需要产生经半胱氨酸工程改造的抗体，例如“硫代MAb”，其中抗体的一或多个残基经半胱氨酸残基取代。

在某些实施方案中，本文中所提供的抗体可进一步经修饰为含有本领域中已知且轻易获得的其他非蛋白质部分。适合抗体衍生作用的部分包括，但不限于，水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性实例包括，但不限于，聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇共聚物、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1，3-二烷、聚-1，3，6-三烷、乙烯/马来酸酐共聚物、聚氨基酸(均聚物或无规共聚物)、及葡聚糖或聚(n-乙烯基吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚环氧丙烷/氧化乙烯共聚物、聚氧乙基化多元醇(例如甘油)、聚乙烯醇、及其混合物。

在一些实施方案中，本发明涵盖抗CD47抗体的片段。抗体片段的实例包括但不限于Fv、Fab、Fab′、Fab’-SH，F(ab’)₂、双抗体、线性抗体、单链抗体分子(例如scFv)；和由抗体片段形成的多特异性抗体。木瓜蛋白酶消化抗体产生两个相同的抗原结合片段，称为“Fab”片段，各自具有单一抗原结合位点，和残留的“Fc”片段，其名称反映了它易于结晶的能力。胃蛋白酶处理产生F(ab’)₂片段，其具有两个抗原结合位点并且仍然能够交联抗原。

在一些实施方案中，本发明的抗CD47抗体是人源化抗体。用于使抗体人源化的不同方法是技术人员已知的，如由Almagro&Fransson综述的，其内容通过提述完整并入本文(Almagro JC和Fransson J(2008)Frontiers inBioscience13：1619-1633)。Almagro&Fransson区分理性办法和经验办法。理性办法的特征在于生成少数工程化抗体变体并评估其结合或任何其它感兴趣的特性。如果设计的变体不产生预期的结果，那么启动新一轮的设计和结合评估。理性办法包括CDR嫁接、表面重建(Resurfacing)、超人源化(Superhumanization)和人字符串内容优化(Human StringContent Optimization)。相比之下，经验办法基于生成大的人源化变体库并使用富集技术或高通量筛选选出最佳克隆。因而，经验办法依赖于能够对大量抗体变体进行搜索的可靠的选择和/或筛选系统。体外展示技术，如噬菌体展示和核糖体展示满足这些要求并且是技术人员公知的。经验办法包括FR库、导向选择(Guided selection)、框架改组(Framework-shuffling)和Humaneering。

在一些实施方案中，本发明的抗CD47抗体是人抗体。可使用本领域中已知的各种技术来制备人抗体。人抗体一般描述于van Dijk和van de Winkel，Curr.Opin.Pharmacol5：368-74(2001)以及Lonberg，Curr.Opin.Immunol 20：450-459(2008)。

可通过在组合文库中筛选具有所需活性的抗体来分离本发明抗体。举例来说，本领域中已知多种用于产生噬菌体展示文库并且在这些文库中筛选具有所需结合特征的抗体的方法。这些方法于例如Hoogenboom等人，Methods in Molecular Biology 178：1-37(O′Brien等人编，人Press，Totowa，NJ，2001)中评述，并且进一步于例如McCafferty等人，Nature348：552-554；Clackso等人，Nature 352：624-628(1991)；Marks等人，J.Mol.Biol.222：581-597(1992)；Marks及Bradbury，Methods in Molecular Biology248：161-175(Lo编，Human Press，Totowa，NJ，2003)；Sidhu等人，J.Mol.Biol.338(2)：299-310(2004)；Lee等人，J.Mol.Biol340(5)：1073-1093(2004)；Fellouse，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101(34)：12467-12472(2004)；以及Lee等人，J.Immunol.Methods284(1-2)：119-132(2004)中描述。

适用于本发明的“抗体及其抗原结合片段”包括但不限于多克隆、单克隆、单价、双特异性、异缀合物、多特异性、重组、异源、异源杂合、嵌合、人源化(特别是嫁接有CDR的)、去免疫的、或人的抗体、Fab片段、Fab′片段、F(ab′)₂片段、由Fab表达库产生的片段、Fd、Fv、二硫化物连接的Fv(dsFv)、单链抗体(例如scFv)、双抗体或四抗体(Holliger P.等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90(14)，6444-6448)、纳米抗体(nanobody)(也称为单域抗体)、抗独特型(抗Id)抗体(包括例如针对本发明抗体的抗Id抗体)和上述任一种的表位结合片段。

在一些实施方案中，本发明的抗体可以是单特异性的、双特异性或多特异性的。多特异性单抗可以对一种靶多肽的不同表位是特异性的或可以含有对超过一种靶多肽特异性的抗原结合域。参见例如，Tutt等(1991)J.Immunol.147：60-69。抗CD47单抗可以与另一种功能性分子(例如另一种肽或蛋白质)连接或共表达。例如抗体或其片段可以功能性与一或多种其它分子，如另一种抗体或抗体片段连接(例如通过化学偶联、遗传融合、非共价联合或以其它方式)以产生具有第二或更多结合特异性的双特异性或多特异性抗体。

在一些实施方案中，本发明的抗体结合人CD47蛋白。

1.3本发明的核酸以及包含其的宿主细胞

在一方面，本发明提供了编码以上任何抗CD47抗体或其片段的核酸。所述核酸可以编码包含抗体的轻链可变区和/或重链可变区的氨基酸序列，或包含抗体的轻链和/或重链的氨基酸序列。

在一个实施方案中，提供包含所述核酸的一个或多个载体。在一个实施方案中，载体是表达载体。

在一个实施方案中，提供包含所述载体的宿主细胞。用于克隆或表达编码抗体的载体的适当宿主细胞包括本文描述的原核或真核细胞。例如，抗体可在细菌中产生，特别当不需要糖基化和Fc效应子功能时。对于抗体片段和多肽在细菌中的表达，见，例如，美国专利号5,648,237，5,789,199和5,840,523，还见Charlton，Methods in Molecular Biology，卷248(B.K.C.Lo，编辑，Humana Press，Totowa，NJ，2003)，第245-254页，其描述抗体片段在大肠杆菌中的表达)。在表达后，抗体可以从可溶级分中的细菌细胞糊状物分离，并且可以进一步纯化。

在一个实施方案中，宿主细胞是真核的。在另一个实施方案中，宿主细胞选自酵母细胞、哺乳动物细胞或适用于制备抗体或其抗原结合片段的其它细胞。例如，真核微生物诸如丝状真菌或酵母是关于编码抗体的载体的合适克隆或表达宿主，包括真菌和酵母菌株，其糖基化途径已经进行“人源化”，导致产生具有部分或完全人糖基化模式的抗体。参见Gerngross，Nat.Biotech.22：1409-1414(2004)，和Li等，Nat.Biotech.24：210-215(2006)。适于表达糖基化抗体的宿主细胞也衍生自多细胞生物体(无脊椎动物和脊椎动物)。也可以将脊椎动物细胞用作宿主。例如，可以使用被改造以适合于悬浮生长的哺乳动物细胞系。有用哺乳动物宿主细胞系的其它实例是用SV40转化的猴肾CV1系(COS-7)；人胚肾系(293或293细胞，如例如Graham等，J.Gen Virol.36：59(1977)中所描述的)等。其它有用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，包括DHFR-CHO细胞(Urlaub等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：216(1980))；以及骨髓瘤细胞系如Y0，NS0和Sp2/0。关于适合产生抗体的某些哺乳动物宿主细胞系的综述见例如Yazaki和Wu，Methods in MolecularBiology，卷248(B.K.C.Lo，ed.，Humana Press，Totowa，NJ)，第255-268页(2003)。

在一个实施方案中，提供了制备抗CD47抗体的方法，其中所述方法包括，在适合抗体表达的条件下，培养包含编码所述抗体的核酸的宿主细胞，如上文所提供的，和任选地从所述宿主细胞(或宿主细胞培养基)回收所述抗体。为了重组产生抗CD47抗体，分离编码抗体(例如上文所描述的抗体)的核酸，并插入一个或多个载体，用于在宿主细胞中进一步克隆和/或表达。此类核酸易于使用常规规程分离和测序(例如通过使用能够与编码抗体重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针进行)。

1.4药物组合物和药物制剂

本发明还提供了包括一种或多种结合CD47或其免疫活性片段的单克隆抗体的药物组合物。应理解，本发明提供的抗CD47抗体或药物组合物可以整合至制剂中合适的运载体、赋形剂和其他试剂以联合给药，从而提供改善的转移、递送、耐受等。

术语“药物组合物”指这样的制剂，其以允许包含在其中的活性成分的生物学活性有效的形式存在，并且不包含对施用所述制剂的受试者具有不可接受的毒性的另外的成分。

术语“药用载体”指与治疗剂一起施用的稀释剂、佐剂(例如弗氏佐剂(完全和不完全的))、赋形剂或媒介物。

用于本文时，“治疗”指减缓、中断、阻滞、缓解、停止、降低、或逆转已存在的症状、病症、病况或疾病的进展或严重性，以及避免相关疾病的复发。

在一些实施方案中，本发明还涵盖与治疗性模块，如细胞毒性剂或免疫抑制剂缀合的抗CD47单克隆抗体(“免疫缀合物”)。细胞毒性剂包括任何对细胞有害的药剂。适合于形成免疫缀合物的细胞毒性剂(例如化疗剂)的例子是本领域中已知的，参见例如WO05/103081。例如，细胞毒性剂包括但不限于：放射性同位素(例如，At²¹¹，I¹³¹，I¹²⁵，Y⁹⁰，Re¹⁸⁶，Re¹⁸⁸，Sm¹⁵³，Bi²¹²，p³²，pb²¹²和Lu的放射性同位素)；化疗剂或药物(例如，甲氨蝶呤(methotrexate)，阿霉素(adriamicin)，长春花生物碱(vinca alkaloids)(长春新碱(vincristine)，长春碱(vinblastine)，依托泊苷(etoposide))，多柔比星(doxorubicin)，美法仑(melphalan)，丝裂霉素(mitomycin)C，苯丁酸氮芥(chlorambucil)，柔红霉素(daunorubicin)或其它嵌入剂)；生长抑制剂；酶及其片段如核酸水解酶；抗生素；毒素如小分子毒素或细菌、真菌、植物或动物起源的酶促活性毒素，包括其片段和/或变体；和已知的各种抗肿瘤或抗癌剂。

本发明还包括包含抗CD47抗体的组合物(包括药物组合物或药物制剂)和包含编码抗CD47抗体的多核苷酸的组合物。在某些实施方案中，组合物包含一种或多种结合CD47的抗体或一种或多种编码一种或多种结合CD47的抗体的多核苷酸。这些组合物还可以包含合适的药用载体，如本领域中已知的药用赋形剂，包括缓冲剂。

本发明的药物组合物可包括本发明的抗体和药用载体。这些药物组合物可包括于试剂盒中，如诊断试剂盒。

适用于本发明的药用载体可以是无菌液体，如水和油，包括那些具有石油、动物、植物或合成起源的，如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。当静脉内施用药物组合物时，水是优选的载体。还可以将盐水溶液和水性右旋糖以及甘油溶液用作液体载体，特别是用于可注射溶液。合适的药用赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、甘油单硬脂酸酯、滑石、氯化钠、干燥的脱脂乳、甘油、丙烯、二醇、水、乙醇等。对于赋形剂的使用及其用途，亦参见“Handbook of PharmaceuticalExcipients”，第五版，R.C.Rowe，P.J.Seskey和S.C.Owen，PharmaceuticalPress，London，Chicago。若期望的话，所述组合物还可以含有少量的润湿剂或乳化剂，或pH缓冲剂。这些组合物可以采用溶液、悬浮液、乳剂、片剂、丸剂、胶囊剂、粉末、持续释放配制剂等的形式。口服配制剂可以包含标准载体，如药用级甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精。

可以通过将具有所需纯度的本发明的抗CD47抗体与一种或多种任选的药用载体(Remington’s Pharmaceutical Sciences，第16版，Osol，A.编(1980))混合来制备包含本文所述的抗CD47抗体的药物制剂，优选地以冻干制剂或水溶液的形式。

示例性的冻干抗体制剂描述于美国专利号6,267,958。水性抗体制剂包括美国专利号6,171,586和WO2006/044908中所述的那些，后一种制剂包括组氨酸-乙酸盐缓冲剂。

本发明的药物组合物或制剂还可以包含超过一种活性成分，所述活性成分是被治疗的特定适应证所需的，优选具有不会不利地影响彼此的互补活性的那些活性成分。例如，理想的是还提供他汀类物质。所述活性成分以对于目的用途有效的量合适地组合存在。

可制备持续释放制剂。持续释放制剂的合适实例包括含有抗体的固体疏水聚合物的半渗透基质，所述基质呈成形物品，例如薄膜或微囊形式。

1.5抗体的治疗方法和用途

在一方面中，本发明涉及在受试者中抑制、拮抗CD47与SIRPα结合的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的本文所述的任何抗CD47抗体或其片段。在另一方面中，本发明涉及促进受试者的吞噬细胞的吞噬作用的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的本文所述的任何抗CD47抗体或其片段。在一方面中，本发明涉及治疗以CD47为治疗靶点的相关疾病的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的本文所述的任何抗CD47抗体或其片段。在一方面中，本发明涉及可以通过消除、抑制或降低CD47与SIRPα的结合而改善、减缓、抑制或预防的任何疾病或病症的方法。在另一方面，本发明通过向有需要的受试者施用本发明的抗CD47抗体或其片段而提供治疗受试者癌症或者肿瘤的方法、缓解受试者癌症或者肿瘤症状的方法、避免受试者肿瘤或者癌症复发的方法。

在一方面，本发明提供的抗CD47抗体及其抗原结合片段和包含其的药物组合物可以用作治疗剂，用于诊断、预后、监控、治疗、缓和和/或预防受试者中异常CD47的表达、活性和/或信号传递相关的疾病和病症。通过使用标准方法鉴定受试者中存在异常CD47的表达、活性和/或信号传递相关的疾病和病症时，可以给药本发明公开的抗CD47抗体及其抗原结合片段和包含其的药物组合物。

在其他方面，本发明提供抗CD47抗体在生产或制备药物中的用途，所述药物用于治疗上文提及的相关疾病或病症。

在某些实施方案中，本文所述的方法和用途还包括向所述个体施用有效量的至少一种另外的治疗剂，例如化疗剂、放疗剂或者生物大分子药物。在一个实施方案中，该生物大分子药物例如是通过T细胞识别攻击肿瘤细胞的各种单克隆抗体药，例如利妥昔单抗、西妥昔单抗与曲妥珠单抗。

上述联合疗法包括组合给药(其中两种以上治疗剂被包含在相同或分开的制剂中)和分别给药，其中，本发明的抗CD47抗体的给药可以发生在另外的治疗剂和/或佐剂的给药前、同时和/或之后。

本发明的抗体(以及任何另外的治疗剂)可以通过任何合适的方法给药，包括肠胃外给药，肺内给药和鼻内给药，并且，如果局部治疗需要，病灶内给药。肠胃外输注包括肌肉内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下给药。在一定程度上根据用药是短期或长期性而定，可通过任何适合途径，例如通过注射，例如静脉内或皮下注射用药。本文中涵盖各种用药时程，包括但不限于，单次给药或在多个时间点多次给药、推注给药及脉冲输注。

为了预防或治疗疾病，本发明的抗体的合适剂量(当单独或与一种或多种其他另外的治疗剂组合使用时)将取决于待治疗疾病的类型、抗体的类型、疾病的严重性和进程、所述抗体是以预防目的施用还是以治疗目的施用、以前的治疗、患者的临床病史和对所述抗体的应答，和主治医师的判断力。所述抗体以一次治疗或经过一系列治疗合适地施用于患者。

在另一方面，本发明的抗体可以用于体内或者体外检测与CD47相关的疾病的治疗的进程，例如，通过测量表达CD47的细胞(例如癌症细胞)的数目的增加或者减少，可以确定是否某种特定的旨在治疗疾病、缓解症状的疗法是否有效。

多数CD47抗体被报道引起人红细胞的血凝反应。血凝反应是同型相互作用的一个示例，其中使用二价CD47结合实体处理后引起两个表达CD47的细胞聚合或凝集。例如，作为一种全IgG或F(ab’)₂，CD47抗体MABL被报道能够引起红细胞的血凝反应，且仅当MABL变为scFv或二价scFv时该作用减弱(参见例如Uno S、KinoshitaY、Azuma Y等，Antitumoractivity of a monoclonal antibody against CD47in xenograft models of humanleukemia，Oncol Rep 2007；17：1189-94；Kikuchi Y、Uno S、Yoshimura Y等，A bivalentsingle-chain Fv fragment against CD47induces apoptosis for leukemic cells，Biochem Biophys Res Commun 2004；315：912-8)。其他已知的CD47抗体(包括B6H12、BRC126和CC2C6)也会引起RBC的血凝反应。因此，细胞的凝集是使用现有的全IgG抗体治疗性地靶向CD47的主要限制。

鉴于现有技术中公开的大部分阻断CD47与SIPRα相互作用以促进吞噬作用的抗体会引起显著的细胞凝集问题，目前仍然迫切需要获得不仅能够有效促进巨噬细胞的吞噬作用而且不导致细胞凝集的新的抗CD47抗体。本申请公开的抗体满足了这方面的需求，其不仅可以有效促进吞噬作用，甚至具有优异的抗肿瘤生长和使肿瘤消失的作用，而且同时本申请公开的抗CD47抗体在治疗的同时并不显著引起细胞的凝集作用，因而同时具有显著降低的副作用。

本领域的技术人员可以通过常规实验对凝集水平进行定量，例如RBC的血凝反应。例如，本领域的技术人员可在本发明的CD47抗体存在的条件下进行血凝反应试验，其后测量RBC斑点的面积以确定血凝反应的水平，如下文实施例中所述。在一些情况下，对存在本发明CD47抗体时的RBC斑点面积与不存在本发明CD47抗体时(即零血凝反应条件下)的RBC斑点面积，以及存在其他已知CD47抗体时的RBC斑点面积进行了比较。在这种方式下，相对于基线对照对血凝反应进行定量。RBC斑点的面积越大表明血凝反应的水平越高。或者，也可使用RBC斑点的密度分析对血凝反应进行定量。

1.6用于诊断和检测的方法和组合物

在某些实施方案中，本文中提供的任何抗CD47抗体或其抗原结合片段可以用于检测CD47在生物样品中的存在。术语“检测”用于本文中时，包括定量或定性检测。在某些实施方案中，生物样品是血、血清或生物来源的其他液体样品。在某些实施方案中，生物样品包含细胞或组织。

在某些实施方案中，提供标记的抗CD47抗体。标记包括但不限于，被直接检测的标记或部分(如荧光标记、发色团标记、电子致密标记、化学发光标记和放射性标记)，以及被间接检测的部分，如酶或配体，例如，通过酶促反应或分子相互作用。示例性标记包括但不限于，放射性同位素32P、14C、1251、3H和131I，荧光团如稀土螯合物或荧光素及其衍生物，罗丹明及其衍生物，丹酰(dansyl)，伞形酮(umbelliferone)，荧光素酶(luceriferase)，例如，萤火虫荧光素酶和细菌荧光素酶(美国专利号4,737,456)，荧光素，2，3-二氢酞嗪二酮，辣根过氧化物酶(HR)，碱性磷酸酶，β-半乳糖苷酶，葡糖淀粉酶，溶解酶，糖类氧化酶，例如，葡萄糖氧化酶，半乳糖氧化酶，和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，杂环氧化酶如尿酸酶和黄嘌呤氧化酶，加上利用过氧化氢氧化染料前体的酶如HR，乳过氧化物酶，或微过氧化物酶(microperoxidase)，生物素/亲和素，自旋标记，噬菌体标记，稳定的自由基，等等。

以下实施例进一步说明本发明，然而，应理解实施例以说明而非限定的方式来描述，并且本领域技术人员可以进行多种修改。

1.7本发明示例性抗CD47抗体的序列

本发明抗体的重链、轻链的全长氨基酸序列

ADI26624-IgG4

HC氨基酸序列(SEQ ID NO：74)

QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSYYWSWIRQPPGKGLEWIGYIYYSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARGKSAFDPWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG

LC氨基酸序列(SEQ ID NO：75)

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ADI29336-IgG4

HC氨基酸序列(SEQ ID NO：76)

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LC氨基酸序列(SEQ ID NO：75)

DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGISRWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQADLHPPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

ADI29340-IgG4

HC氨基酸序列(SEQ ID NO：77)

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LC氨基酸序列(SEQ ID NO：75)

DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGISRWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQADLHPPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

ADI26630-IgG4

HC氨基酸序列(SEQ ID NO：78)

QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSYYWSWIRQPPGKGLEWIGYIYYSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARGKTGSAAWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG

LC氨基酸序列(SEQ ID NO：79)

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ADI29341-IgG4

HC氨基酸序列(SEQ ID NO：80)

QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSIEHYYWSWIRQPPGKGLEWIGYIYYSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARGKTGSAAWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG

LC氨基酸序列(SEQ ID NO：79)

DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGISRWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTVSFPITFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

ADI 29349-IgG4

HC氨基酸序列(SEQ ID NO：81)

QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSIDHYYWSWIRQPPGKGLEWIGYIYYSGSTEYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARGKTGSAAWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG

LC氨基酸序列(SEQ ID NO：79)

DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGISRWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTVSFPITFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

ADI 26591-IgG4

HC氨基酸序列(SEQ ID NO：82)

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LC氨基酸序列(SEQ ID NO：83)

DIQLTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYGASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQKNPFPPTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

ADI 29371-IgG4

HC氨基酸序列(SEQ ID NO：84)

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFGNYAMSWVRQAPGKGLEWVSMISGGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKTPIYYGFDLWGRGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG

LC氨基酸序列(SEQ ID NO：83)

DIQLTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYGASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQKNPFPPTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

ADI 30793-IgG4

HC氨基酸序列(SEQ ID NO：85)

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFDSYAMTWVRQAPGKGLEWVSVISGSGGKTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKTHLYYGFDLWGRGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG

LC氨基酸序列(SEQ ID NO：86)

DIQLTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYGASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQKNPFPPFFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

ADI 30794-IgG4

HC氨基酸序列(SEQ ID NO：87)

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFGNYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGKTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKTAIYYGFDLWGRGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG

LC氨基酸序列(SEQ ID NO：86)

DIQLTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYGASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQKNPFPPFFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

ADI26624-IgG1

HC氨基酸序列(SEQ ID NO：88)

QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSYYWSWIRQPPGKGLEWIGYIYYSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARGKSAFDPWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG

LC氨基酸序列(SEQ ID NO：75)

DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGISRWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQADLHPPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

ADI29336-IgG1

HC氨基酸序列(SEQ ID NO：89)

QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISNYYWSWIRQPPGKGLEWIGTIYYSGSTRYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARGKSAFNPWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG

LC氨基酸序列(SEQ ID NO：75)

DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGISRWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQADLHPPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

ADI29340-IgG1

HC氨基酸序列(SEQ ID NO：90)

QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSIDYYYWSWIRQPPGKGLEWIGYIYYSGSTGYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARGKSAFDPWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG

LC氨基酸序列(SEQ ID NO：75)

DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGISRWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQADLHPPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

ADI26630-IgG1

HC氨基酸序列(SEQ ID NO：91)

QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSYYWSWIRQPPGKGLEWIGYIYYSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARGKTGSAAWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG

LC氨基酸序列(SEQ ID NO：79)

DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGISRWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTVSFPITFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

ADI29341-IgG1

HC氨基酸序列(SEQ ID NO：92)

QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSIEHYYWSWIRQPPGKGLEWIGYIYYSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARGKTGSAAWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG

LC氨基酸序列(SEQ ID NO：79)

DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGISRWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTVSFPITFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

ADI 29349-IgG1

HC氨基酸序列(SEQ ID NO：93)

QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSIDHYYWSWIRQPPGKGLEWIGYIYYSGSTEYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARGKTGSAAWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG

LC氨基酸序列(SEQ ID NO：79)

DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGISRWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTVSFPITFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

ADI 26591-IgG1

HC氨基酸序列(SEQ ID NO：94)

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKTPIYYGFDLWGRGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG

LC氨基酸序列(SEQ ID NO：83)

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ADI 29371-IgG1

HC氨基酸序列(SEQ ID NO：95)

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFGNYAMSWVRQAPGKGLEWVSMISGGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKTPIYYGFDLWGRGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG

LC氨基酸序列(SEQ ID NO：83)

DIQLTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYGASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQKNPFPPTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

ADI 30793-IgG1

HC氨基酸序列(SEQ ID NO：96)

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFDSYAMTWVRQAPGKGLEWVSVISGSGGKTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKTHLYYGFDLWGRGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG

LC氨基酸序列(SEQ ID NO：86)

DIQLTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYGASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQKNPFPPFFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

ADI 30794-IgG1

HC氨基酸序列(SEQ ID NO：97)

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFGNYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGKTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKTAIYYGFDLWGRGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG

LC氨基酸序列(SEQ ID NO：86)

DIQLTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYGASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQKNPFPPFFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

CD47蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO：56)

MWPLVAALLLGSACCGSAQLLFNKTKSVEFTFCNDTVVIPCFVTNMEAQNTTEVYVKWKFKGRDIYTFDGALNKSTVPTDFSSAKIEVSQLLKGDASLKMDKSDAVSHTGNYTCEVTELTREGETIIELKYRVVSWFSPNENILIVIFPIFAILLFWGQFGIKTLKYRSGGMDEKTIALLVAGLVITVIVIVGAILFVPGEYSLKNATGLGLIVTSTGILILLHYYVFSTAIGLTSFVIAILVIQVIAYILAVVGLSLCIAACIPMHGPLLISGLSILALAQLLGLVYMKFVE

关于附图中出现的阴性对照的序列如下：

IgG1 HC：

MGWSLILLFLVAVATRVLSEVRLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYAMGWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTTSRDDSKNALYLQMNSLRAEDTAVYYCARGGPGWYAADVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG

IgG1 LC

MDFQVQIISFLLISASVIMSRGDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQADLPAFAFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

IgG4 HC：

MGWSLILLFLVAVATRVLSEVRLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYAMGWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTTSRDDSKNALYLQMNSLRAEDTAVYYCARGGPGWYAADVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK

IgG4 LC：

MDFQVQIISFLLISASVIMSRGDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQADLPAFAFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

当实验抗体使用IgG 1型时，阴性对照采用IgG 1；当实验抗体使用IgG 4型时，阴性对照采用IgG 4。

实施例

实施例1.抗CD47抗体以及对照抗体的生产和纯化

本发明示例的10个抗体(ADI-26624、ADI-29336、ADI-29340、ADI-26630、ADI-29341、ADI-29349、ADI-26591、ADI-29371、ADI-30793、ADI-30794)的CDR区、轻链可变区和重链可变区、轻链和重链的氨基酸序列，以及对应的核苷酸序列在本申请的“序列表”部分列出。另外，上述本发明示例抗体的轻链恒定区、重链恒定区、轻链可变区和重链可变区的序列编号如表1所示。

在酵母以及CHO-S细胞中表达并且纯化本发明的抗体。

酵母中的表达和纯化：

基于酵母的抗体展示(yeast-based antibody presentation)文库(Adimab)，按照现有的方法(WO2009036379；WO 2010105256；W02012009568)进行扩增，其中每个库的多样性达到1×10⁹。简言之，前两轮的筛选使用Muktebyi公司的MACS系统进行磁性激活细胞分选。首先，将文库的酵母细胞(～1×10¹⁰细胞/文库)分别在FACS洗涤缓冲液中(磷酸盐缓冲液，含有0.1％牛血清蛋白)室温孵化15分钟，缓冲液中含有100nM生物素标记的CD47抗原(Acro Biosystems，目录号CD7-H5227-1mg)。使用50ml预冷的FACS洗涤缓冲液洗一次，再用40ml相同洗涤缓冲液重悬细胞，并加入500μl链霉素微珠(Muktebyi LS)于4℃孵化15分钟。1000rpm离心5min弃去上清后用5ml FACS洗涤缓冲液重悬细胞，将细胞溶液加到MuktebyiLS柱中。加样完成后，用FACS洗涤缓冲液洗柱3次，每次3ml。从磁性区域取下Muktebyi LS柱，用5ml生长培养基洗脱，收集洗脱的酵母细胞并在37℃过夜生长。

使用流式细胞仪进行下一轮的分选：将经过MACS系统筛选获得的大约1×10⁸的酵母细胞用FACS缓冲液洗三次，于含有低浓度生物素(100-1nM)标记的CD47抗原中室温下培养。弃去培养液，细胞用FACS洗涤缓冲液洗两次之后，将细胞与LC-FITC(SouthernBiotech)(1∶100稀释)混合，并与SA-633(Molec ular Probes)(1∶500稀释)或SA-PE(Sigma)(1∶50稀释)试剂混合，4℃下培养15分钟。用预冷的FACS洗涤缓冲液洗脱两次，并重悬于0.4ml缓冲液中，将细胞转移到带滤器的分离管中。使用FACS ARIA(BD Biosciences)分选细胞。

将通过筛选获得的表达抗CD47抗体的酵母细胞在30℃下震荡诱导48小时以表达抗CD47的抗体。诱导结束之后，1300rpm离心10min去除酵母细胞，收获上清液。使用ProteinA对上清液中的抗CD47抗体进行纯化，pH2.0醋酸溶液洗脱，收获抗CD47抗体，抗体纯度＞95％。使用木瓜蛋白酶消化并用KappaSelect(GE生命医疗集团)进行纯化可获得相应的Fab片段。

CHO-S细胞中的表达和纯化：

根据制造商的说明书，使用试剂盒(Invitrogen)产生表达抗体的CHO-S细胞系。首先将抗体分子重链和轻链的DNA序列插入到同一个pCHO1.0质粒中，其中重链在轻链的上游。之后采用化学转染法和电转染法将构建的pCHO1.0质粒转入CHO细胞系，转染48小时之后利用ForteBio检测抗体产量以判断转染效率。转染后的细胞经过两轮加压筛选得到高表达抗体的细胞池(pool)。之后扩增细胞池，大量表达抗体，并收集细胞上清用Protein A纯化上清液，使抗体的纯度＞95％。获得以下10个示例抗体。

表1.本发明示例抗体的轻链恒定区、重链恒定区、轻链可变区和重链可变区的氨基酸序列编号。

抗体名称	VH	VL	HC	LC
					ADI-26624	44	54	74/88	75
ADI-29336	45	54	76/89	75
					ADI-29340	46	54	77/90	75
ADI-26630	47	55	78/91	79
					ADI-29341	48	55	80/92	79
ADI-29349	49	55	81/93	79
					ADI-26591	50	57	82/94	83
ADI-29371	51	57	84/95	83
					ADI-30793	52	58	85/96	86
ADI-30794	53	58	87/97	86

在293HEK细胞中表达并且纯化实施例中使用的下述对照抗体：

对照抗体
	Hu5F9
AB6.12

Hu5F9是在293HEK细胞中瞬时表达的人CD47抗体，其序列与美国专利US2015/0183874 A1中的抗体“5F9”的序列相同。AB6.12是在293HEK细胞中瞬时表达的人源化CD47抗体，其序列与美国专利US 9045541中的抗体“AB6.12”的序列相同。美国专利US 9045541公开的抗体“AB6.12”是将不导致细胞出现显著的凝集反应的CD47抗体。

对于293HEK细胞中抗体的瞬时表达，使用载体pV120。首先将抗体的重链和轻链克隆到单独的pV120载体中。使用化学转染的方法将带有抗体分子重链和轻链的pV120载体转入293HEK细胞中。采用的化学转染试剂为PEI(购自Polysciences)，按照生产产商提供的方案瞬时转染培养的293HEK。首先在超净工作台中准备质粒DNA和转染试剂，将F17培养基(Gibco)(体积为转染体积的1/5)各一半加入50ml离心管中，一份加入已过滤的质粒(130μg/100ml)，另一半加入已过滤的PEI(1g/L，Polysciences)(质量比(质粒∶PEI)＝1∶3)，混匀5min，将二者轻柔混匀20次，静置15-30min，不要超过30min。将DNA/PEI混合物轻柔倒入293HEK细胞并混匀，在37℃，8％CO₂的条件下培养细胞7天，每48小时流加新鲜培养基。7天后或者连续培养至细胞活力≤60％时，13000rpm离心20min。取上清液，用Protein A纯化上清液，使抗体的纯度＞95％。

实施例2：本发明抗CD47抗体的亲和力测定

采用生物光干涉测量(ForteBio)测定法测定本发明上述10个示例抗体(为了排除Fc片段可能存在的影响，单价实验时使用Fab片段)结合人CD47(hCD47)的平衡解离常数(KD)。

ForteBio亲和力测定按照现有的方法(Estep，P等人，High throughput solutionBased measurement of antibody-antigen affinity and epitope binning.MAbs，2013.5(2)：p.270-8)进行。简言之，传感器在分析缓冲液中线下平衡30分钟，然后线上检测60秒建立基线，在线加载如上所述获得的经纯化的抗体至AHQ传感器(ForteBio)上进行ForteBio亲和测量。再将具有加载的抗体的传感器暴露于100nM的CD47抗原中作用5分钟，之后将传感器转移至分析缓冲液解离5分钟用于解离速率测量。使用1∶1结合模型进行动力学的分析。

在如以上测定法所述进行的实验中，ADI-26624，ADI-26630、ADI-26591、ADI-29336、ADI-29340、ADI-29341、ADI-29349、ADI-29371、ADI-30793、和ADI-30794亲和力如表3所示。

表3：通过生物光干涉测量IgG1形式的本发明抗体的结合

可见，本发明上述10个示例抗体均显示极高的亲和力，与本领域已知、公认的优异CD47抗体Hu5F9具有相当的亲和力。

实施例3：本发明抗CD47抗体与人CD47的结合

在基于流式细胞术的测定法中测量本发明的上述10个示例抗体与人CD47的结合。

通过转染携带克隆至MCS的人CD47 cDNA(Sino Biological)的pCHO1.0载体(Invitrogen)，产生过表达人CD47的CHO细胞(CHO-hCD47细胞)。将CHO-hCD47细胞(0.2×10⁶个细胞)与不同浓度的实验抗体((本发明的上述10个示例抗体以及Hu5F9)最高浓度为900nM，三倍稀释，总共测试了11个浓度)在含0.1％牛血清白蛋白(BSA)的PBS中，冰上孵育30分钟。然后将细胞洗涤至少两次，并与二抗(PE标记的羊抗人IgG抗体，SouthernBiotech，终浓度为5μg/ml)在含0.1％BSA的PBS中，冰上(避光)孵育30分钟。将细胞洗涤至少两次并通过流式细胞术进行分析。在Accuri C6系统(BD Biosciences)上进行流式细胞术，并根据其MFI用GraphPad拟合浓度依赖的曲线。

ADI-26630、ADI-26624和ADI-26591(IgG1形式，在酵母中表达)结合CHO细胞上过表达的hCD47(SEQ ID NO：56)，EC50值分别为3.77nM、2.254nM和3.895nM，与对照抗体Hu5F9与CHO细胞上过表达的hCD47的结合能力相一致(对照抗体Hu5F9的EC50值为3.726nM)(参见图1)。

在如以上测试法所述进行的实验中，酵母中产生的IgG1形式的ADI-29336、ADI-29340、ADI-29341、ADI-29349、ADI-29371、ADI-30793、和ADI-30794结合CHO细胞上过表达的hCD47，EC50值分别为6.725nM、3.529nM、3.344nM、3.13nM、2.132nM、2.921nM和3.697nM，与对照抗体Hu5F9与CHO细胞上过表达的CD47的结合能力基本一致(EC50值为3.726)。

CHO细胞中产生的IgG4形式的抗体ADI-29336、ADI-29340、ADI-29341、ADI-29349和ADI-29371结合CHO细胞上过表达的hCD47，EC50值分别为2.475nM、2.194nM、1.892nM、2.043nM和2.31nM，其在细胞水平与hCD47的亲和力能力均高于对照抗体Hu5F9(EC50值为3.726)。

实施例4.本发明抗CD47抗体对人CD47配体SIRP α与CD47相互作用的阻断

通过流式细胞术测量本发明的上述10个示例抗体阻断人CD47与SIRP α结合的能力。

将如前文实施例3所述制备的0.2×10⁶个表达人CD47的CHO细胞与实验抗体((ADI-26624、ADI-26630、ADI-29336、ADI-29340、ADI-29341、ADI-29349和Hu5F9)，最高浓度为900nM，三倍稀释，总共测试了11个浓度)及200nM标记小鼠Fc的SIRP α蛋白(AcroBiosystems)在含0.1％BSA的PBS中，在冰上共孵育30分钟。然后将细胞洗涤3次，随后使用山羊抗鼠IgG-APC二抗(Biolegend)在含0.1％BSA的PBS中冰上(避光)孵育30分钟。洗涤细胞3次。在Accuri C6系统(BD Biosciences)上进行流式细胞术，并且在C6软件上计算MFI。

酵母细胞中产生的IgG1形式的ADI-26624、ADI-29336、ADI-29340、ADI-29371、ADI-26630、ADI-29341和ADI-29349阻断人SIRPα-APC与CD47的结合的能力与对照抗体AB6.12的能力相一致。

具体而言，ADI-26624、ADI-29336、ADI-29340阻断人SIRPα-APC与CD47的结合的能力的IC50分别为11.2nM、8.548nM、5.081nM。ADI-26630、ADI-29341、ADI-29349阻断人SIRPα-APC与CD47的结合的能力的IC50分别为2.986nM、2.476nM、3.097nM。对照抗体AB6.12阻断人SIRPα-APC与CD47的结合的能力的IC50为3.385nM。(参见图2)。

CHO细胞中产生的IgG4形式的抗体ADI-26624、ADI-26630、ADI-29336、ADI-29340、ADI-29341和ADI-29349阻断人SIRPα-APC与CD47的结合的能力均略高于对照抗体AB6.12和Hu5F9。

具体而言，ADI-26624、ADI-29336、ADI-29340阻断人SIRPα-APC与CD47结合的能力的IC50分别为1.043nM、1.389nM、1.223nM。ADI-26630、ADI-29341、ADI-29349阻断人SIRPα-APC与CD47的结合的能力的IC50分别为1.123nM、0.6042nM、0.7355nM。对照抗体AB6.12和Hu5F9阻断人SIRPα-APC与CD47的结合的能力的IC50分别为1.768nM和1.843nM。(参见图3)。

实施例5.本发明抗CD47抗体促进巨噬细胞吞噬肿瘤细胞的能力检测

在基于流式细胞术的测定法中测量本发明的抗体(ADI-26624、ADI-29336、ADI-29340、ADI-26630、ADI-29341、ADI-29349、ADI-29371、ADI-30793和ADI-30794)促进巨噬细胞吞噬肿瘤细胞的能力。

密度梯度离心取自捐赠者的新鲜血液，得到外周血单核细胞(PBMC)。从分离的PBMC中按照试剂(EasySep^TM Human CD14 Positive Selection Kit，Steam cell)说明书纯化得到CD14阳性的单核细胞，加入10ng/mL粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF，R&DSystems)贴壁培养连续7天；其中在第5天加入20ng/mL干扰素-γ(IFN-γ，AcroBiosystem)刺激1小时，随后再加入100ng/mL脂多糖(LPS，Sigma)刺激48小时，将单核细胞诱导为巨噬细胞。将靶肿瘤细胞CCRF-CEM(购自ATCC)按照CellTraceTM CFSE试剂盒的说明，进行荧光标记。将标记好的肿瘤细胞与上述已经完成分化的巨噬细胞按照4∶1的比例共培养，同时加入不同浓度的实验抗体在37℃孵育3小时。然后将细胞洗涤至少两次，加入别藻青蛋白(allophycocyanin，APC)标记的CD14抗体(购自BD)，在含0.1％BSA的PBS中冰上(避光)孵育30分钟。将细胞洗涤至少两次并通过流式细胞术进行分析。被吞噬的细胞群体为活细胞中CD14阳性并且荧光染料CFSE(carboxyfluorescein diacetate，succinimidyl ester，羧基荧光素双乙酸盐，琥珀酰亚胺酯)也为阳性的细胞群体。

酵母细胞中产生的IgG1形式的ADI-29336、ADI-29340、ADI-29341、ADI-29349、ADI-30793、和ADI-30794都具有很强的的促进巨噬细胞吞噬肿瘤细胞的能力，其中ADI-29340促进巨噬细胞吞噬肿瘤细胞的能力比对照抗体Hu5F9和AB6.12的能力强；ADI-30793和ADI-30794促进巨噬细胞吞噬肿瘤细胞的能力与对照抗体AB6.12的能力相当(参见附图4和图5)。

CHO细胞中产生的IgG4形式的ADI-26624和ADI-26630能够有效促进巨噬细胞吞噬肿瘤细胞，ADI-26624和ADI-26630促进巨噬细胞吞噬肿瘤细胞的能力与对照抗体Hu5F9的能力相一致(参见附图6)。

CHO细胞中产生的IgG4形式的ADI-29336、ADI-29340、ADI-29341、ADI-29349和ADI-29371都具有很强的促进巨噬细胞吞噬肿瘤细胞的能力。从结果中可以看出ADI-29336、ADI-29340、ADI-29341和ADI-29349促进巨噬细胞吞噬肿瘤细胞的能力显著高于对照抗体Hu5F9的能力；ADI-29371促进巨噬细胞吞噬肿瘤细胞的能力与对照抗体Hu5F9的能力相当(参见附图7)。

实施例6.本发明抗CD47抗体的抗肿瘤活性

在NOD/SCID小鼠模型中研究本发明的CD47抗体(ADI-26624、ADI-26630、ADI-29340和ADI29341)的抗肿瘤功效。

方法如下：

人伯基特氏淋巴瘤Raji细胞(ATCC#CCL-86)购自ATCC，并严格按照ATCC要求进行常规传代培养用于后续体内实验。离心收集细胞，在无菌PBS中重悬细胞并调整细胞密度为10⁷个/ml。取0.1ml细胞悬液与Matrigel基质胶1∶1混合接种至NOD/SCID小鼠(北京维通利华实验动物技术有限公司)右侧皮下。在整个研究期间每周测量两次肿瘤和体重，当肿瘤达到端点时或当小鼠具有＞20％体重减轻时，使小鼠安乐死。接种后10天，将符合实验要求的小鼠随机分组，每组8只。采用游标卡尺测量小鼠肿瘤体积，计算公式为：每组的(宽度)2×长度/2，每组小鼠肿瘤体积最大值为110mm³。

首先，申请人先研究了本发明ADI-26624、ADI-26630抗体抑制肿瘤的功效。

将上述方法中获得的小鼠随机分组并给予不同处理：即腹腔注射1mg/kg或5mg/kg的PBS、IgG对照抗体(IgG4)、Benchmark(Hu5F9)、本发明抗体ADI-26630和ADI-26624，施用频率为两天一次，连续注射2周。具体分组和施用方式如下：

实验结束时，采用下述公式计算肿瘤生长抑制率：

TGI％＝100％×((Tvol_PBS处理后-Tvol_{抗体处理后})/(Tvol_PBS处理后-Tvol_PBS处理前))，

其中Tvol_PBS处理后是空白对照PBS组实验结束后的肿瘤体积，Tvol_{抗体处理后}是抗体组(IgG、Hu5F9以及本发明抗体)实验结束后的肿瘤体积，Tvol_PBS处理前是空白对照PBS组初始肿瘤体积。

实验结果见图8、图9及下表6，可见本申请在CHO细胞中表达的IgG4形式的抗CD47单克隆抗体ADI-26624和ADI-26630与IgG对照(equitech-Bio)及对照抗体Hu5F9相比，显著抑制肿瘤的生长。

ADI-26630 1mg/kg、ADI-26630 5mg/kg、ADI-26624 1mg/kg、ADI-26624 5mg/kg组肿瘤生长抑制率分别为100％、104％、79％、94％。其中ADI-26630 5mg/kg组的8只小鼠中，有5只肿瘤完全消失；ADI-26630 1mg/kg组的8只小鼠中，有2只肿瘤完全消失，肿瘤完全消失只数均高于同剂量的对照组抗体Hu5F9(分别为5mg/kg组2只，1mg/kg组1只)(表6)。本研究中所有组小鼠在接种后32天，小鼠体重均无明显变化。

由此可见，本发明的抗体有很好的肿瘤治疗效果，且效果好于对照组Hu5F9抗体。

表6：在CHO细胞中表达的IgG4形式本发明的抗体抗肿瘤活性研究中小鼠肿瘤大小和生长抑制率统计表。

接下来发明人继续检测了抗体ADI-29340和ADI29341对肿瘤的抑制作用。

将上述方法中获得的小鼠随机分组并给予不同处理，即腹腔注射0.5mg/kg或5mg/kg的PBS、IgG对照抗体(IgG4)、本发明抗体ADI-26630，ADI-29340和ADI29341，两天一次，连续注射2周。具体分组和施用方式如下：

实验结束时，采用上述公式计算肿瘤生长抑制率，并发现在CHO细胞中表达的IgG4形式的抗CD47单克隆抗体ADI-26630、ADI-29340和ADI-29341可以显著抑制肿瘤的生长(表7、图10及图11)。

ADI-26630 0.5mg/kg、ADI-26630 5mg/kg、ADI-29340 0.5mg/kg、ADI-29340 5mg/kg、ADI-29341 0.5mg/kg、ADI-29341 5mg/kg组肿瘤生长抑制率分别为99％、110％、103％、109％、104％、109％。其中ADI-29340 0.5mg/kg组的8只小鼠中，有5只肿瘤完全消失；ADI-29341 0.5mg/kg组的8只小鼠中，有4只肿瘤完全消失；ADI-26630和ADI-293405mg/kg组的8只小鼠肿瘤均完全消失(表7)。本研究中所有组小鼠在接种后30天，小鼠体重均无明显变化。

由此可见，本发明的抗体有很好的肿瘤治疗效果。

表7：在CHO细胞中表达的IgG4形式本发明的抗体抗肿瘤活性研究中小鼠肿瘤大小和生长抑制率统计表。

实施例7.本发明的抗CD47抗体促进红细胞凝集活性检测

现有技术已知大多数的抗CD47抗体具有促进红细胞凝集的副作用，因而其治疗应用受到限制。为此，发明人进一步研究了本申请中公开的抗体的红细胞凝集作用。

检测方法如下：

采集新鲜人类血液，用PBS洗三次后制备成10％人类红细胞悬液，将人类红细胞与实验抗体(最高浓度为60ug/ml，三倍稀释，总共11个点)在37℃孵育2-6小时，该反应在96孔圆底板中进行。反应结束后拍照并判断结果。结果判定标准为如果红细胞沉于孔底，平铺呈网状，则发生了红细胞凝集反应(请参见图12中Hu5F9的结果)，如果红细胞未发生凝集反应，则红细胞将呈点状沉于孔底(请参见图12中的对照)。

在如以上测定法所述进行的实验中，血凝反应结果如图12所示。由图12可见，ADI26630，ADI29340和ADI29341的红细胞凝集活性很弱，其促进红细胞凝集的活性明显低于对照组Hu5F9，与对照组AB6.12相当。可见，本申请公开的抗体具有显著降低的血细胞凝集作用，因此在临床治疗中具有显著降低的副作用，可以广泛应用于多种癌症的治疗中。

Claims (23)

1.一种分离的抗CD47单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含A)选自以下的一个至三个重链互补决定区HCDR：(i)HCDR1，其包含与选自SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、98和99的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列或由所述序列组成，(ii)HCDR2，其包含与选自SEQ ID NO:9、10、11、12、13、14、15、16、100和101的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列或由所述序列组成，(iii)HCDR3，其包含与选自SEQ ID NO:17、18、19、20、21、22、102和103的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列或由所述序列组成，和(iv)含有一处或多处不超过5个氨基酸的氨基酸取代、缺失或插入的(i)、(ii)和(iii)的HCDR；和B)选自以下的一个至三个轻链互补决定区LCDR:(i)LCDR1，其包含与SEQ ID NO:23或24的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列或由所述序列组成，(ii)LCDR2，其包含与SEQ IDNO:25或26的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列或由所述序列组成，(iii)LCDR3包含与SEQ ID NO:27、28、29或30所示的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列或由所述序列组成，和(iv)含有一处或多处不超过5个氨基酸的氨基酸取代、缺失或插入的(i)、(ii)和(iii)的LCDR。

2.权利要求1所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区(HCVR)，其中所述重链可变区HCVR包含与选自SEQ ID NO:44、45、46、47、48、49、50、51、52和53的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列或由所述序列组成。

3.权利要求1或2所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含轻链可变区(LCVR)，其中所述轻链可变区LCVR包含与SEQ ID NO:54、55、57和58的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列或由所述序列组成。

4.权利要求1-3中任一项所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含重链，其中所述重链包含与选自SEQ ID NO:74、76、77、78、80、81、82、84、85、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96和97的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列或由所述序列组成。

5.权利要求1-4中任一项所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含轻链，其中所述轻链包含与SEQ ID NO:75、79、83、86的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列或由所述序列组成。

6.权利要求1至5中任一项的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体是人源化抗体或人抗体。

7.权利要求1至6中任一项的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述抗原结合片段选自Fab、Fab’-SH、Fv、scFv或(Fab’)₂片段。

8.权利要求1至7中任一项的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含框架序列，其中框架序列的至少一部分是人共有框架序列。

9.抗CD47单克隆抗体或其抗原结合片段，其与权利要求1至8中任一项所述的抗体竞争结合CD47，或者拮抗、阻断权利要求1至8中任一项所述的抗体与CD47结合。

10.分离的核酸，其编码权利要求1至9中任一项的分离的抗CD47单克隆抗体或其抗原结合片段。

11.包含权利要求10的核酸的载体，优选地所述载体是表达载体。

12.包含权利要求11的载体的宿主细胞，优选地，所述宿主细胞是原核细胞或真核细胞；更优选所述宿主细胞选自酵母细胞、哺乳动物细胞或适用于制备抗体或其抗原结合片段的其它细胞。

13.制备抗CD47单克隆抗体或其抗原结合片段的方法，包括在适于表达编码权利要求1至9中任一项的抗CD47单克隆抗体或其抗原结合片段的核酸的条件下培养权利要求12的宿主细胞，任选地分离所述单克隆抗体或其抗原结合片段，任选地所述方法还包括从所述宿主细胞回收所述抗CD47单克隆抗体或其抗原结合片段。

14.由权利要求13所述的方法制备的抗CD47单克隆抗体或其抗原结合片段。

15.药物组合物，其包含权利要求1至9和14中任一项的抗CD47抗体或其抗原结合片段，以及任选地药用载体。

16.一种促进受试者巨噬细胞的吞噬作用的方法，包括向所述受试者施用有效量的权利要求1至9和14中任一项的抗CD47单克隆抗体或其抗原结合片段或有效量的权利要求15的药物组合物。

17.一种治疗癌症或者肿瘤的方法，包括向所述受试者施用有效量的权利要求1至9和14中任一项的抗CD47单克隆抗体或其抗原结合片段或有效量的权利要求15的药物组合物。

18.一种缓解癌症或者肿瘤的症状的方法，包括向有需要的受试者施用有效量的权利要求1至9和14中任一项的抗CD47单克隆抗体或其抗原结合片段或有效量的权利要求15的药物组合物。

19.权利要求16-18中任一项的方法，其中受试者是人。

20.权利要求17或18的方法，其中所述癌症或者肿瘤是各种血液肿瘤和实体瘤，例如急性骨髓性白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML)、急性淋巴细胞白血病(ALL)、慢性淋巴细跑性白血病(CLL)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、多发性骨髓瘤(MM)、淋巴瘤、乳腺癌、头颈癌、胃癌、肺癌、食管癌、肠癌、卵巢癌、宫颈癌、肝癌、肾癌、胰腺癌、膀胱癌、结直肠癌、神经胶质瘤、黑素瘤和其他实体瘤。

21.权利要求16至18中任一项的方法，还包括向所述受试者施用有效量的一种或者多种其他药物，优选地，所述其他药物例如是通过T细胞识别攻击肿瘤细胞的各种单克隆抗体药，例如利妥昔单抗、西妥昔单抗与曲妥珠单抗。

22.检测样品中CD47蛋白存在的方法，包括

(a)将所述样品与权利要求1-9和14中任一项的抗体或其抗原结合片段相接触；和

(b)检测所述抗体或其抗原结合片段和所述CD47蛋白之间复合物的形成。

23.一种确定癌症疗法的有效性的方法，包括测量在治疗前后来自受试者样品中的表达CD47的癌症细胞的数目，治疗后表达CD47的癌症细胞减少表明该疗法有效。