KR20230163305A - Pd-l1 및 cd47에 대한 이중특이적 인간화 단일 도메인 항체 및 이의 용도 - Google Patents
Pd-l1 및 cd47에 대한 이중특이적 인간화 단일 도메인 항체 및 이의 용도 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 PD-L1 및 CD47에 대한 이중특이적 인간화 단일 도메인 항체 및 이의 용도에 관한 것으로, 구체적으로 면역관문 단백질(immune checkpoint protein)인 PD-L1 및 CD47에 이중특이적으로 결합하는 인간화 단일 도메인 항체를 제작하였고, 이의 in vitro 및 in vivo 효능을 확인하였으므로, 상기 이중특이적 인간화 단일 도메인 항체를 면역관문 억제제로 면역항암요법에 유용하게 이용할 수 있다.
Description
본 발명은 면역관문 단백질(immune checkpoint protein)인 PD-L1 및 CD47에 대한 이중특이적 인간화 단일 도메인 항체 및 이의 용도에 관한 것이다.
최근에 인체의 면역시스템을 이용해 새롭게 개발된 면역항암요법의 치료 효과가 입증되면서 기존의 화학치료제 및 표적치료제를 사용하였던 항암치료요법은 면역치료제를 이용하는 면역항암요법으로 변화하고 있다.
기본적으로 암환자의 면역세포는 암 항원에 대해 내성(tolerance)이 생겨서 암세포를 인식할 수는 있지만 기능적으로는 억제되어 있어서 암세포를 효과적으로 제거하지 못한다. 내성에 빠진 면역세포를 깨워서 활성화된 면역세포로 유도하여 암세포를 파괴하는 것이 면역치료의 핵심이다. 이러한 면역치료에는 IFN-γ, IL-2 등 사이토카인 치료제, 수지상세포를 이용한 암백신, T 세포를 이용한 세포치료제, 면역관문 단백질(immune checkpoint protein)을 차단하는 면역관문 억제제 (immune checkpoint inhibitor, ICI) 등이 있으며, 이러한 치료제를 통상적으로 면역항암제(immuno-oncology therapy)라고 부른다. 그 중에서도 국제적인 제약회사들이 경쟁적으로 개발하고 있는 면역항암제는 면역관문 억제제이다.
면역관문 단백질(immune checkpoint protein)은 세포막 단백질로서 면역세포의 분화, 증식, 활성을 억제한다. 구체적으로, 이 단백질은 대체로 활성화된 T 세포에서 발현되어서, T 세포의 증식, 사이토카인 분비, 세포독성을 감소시키고, T 세포의 과도한 활성을 억제하는 기능이 있기 때문에 co-inhibitory 분자라고도 불린다. 대표적으로 T 세포에는 co-inhibitory 수용체인 CTLA-4와 PD-1이 발현되어 있어서 각각의 리간드인 B7.1/2 및 PD-L1과의 결합을 통해 T 세포의 활성을 조절하게 된다. 한편, PD-L1은 암세포에서 발현되어 암 특이적인 T 세포를 비활성화시키고 세포사멸을 유도하여 T 세포의 면역공격으로부터 암세포를 보호해 주는 중요한 분자방패(molecular shield) 역할을 하고 있어서 암의 면역회피 기전이 되기도 한다. 또한, 암세포에 이소성(ectopic)으로 PD-L1이 발현된 암환자는 그렇지 않은 암환자에 비해 예후가 더 나쁜 것으로 보고되고 있다.
면역관문 억제제는 이러한 T 세포 억제에 관여하는 면역관문 단백질의 활성을 차단하여 T 세포를 활성화시켜 암세포를 공격하는 약제로서 대표적으로 CTLA-4, PD-1, PD-L1을 인식하는 항체를 사용한다. CTLA-4 억제제인 이피리무맙(ipilimumab (Yervoy))이 면역관문 억제제 중에서는 처음으로 전이 흑색종에 대한 2차 치료제로 2011년 FDA 승인을 획득하였다. 이후 2014년 PD-1 차단제인 니보루맙(nivolumab (Opdivo))과 펨브롤리주맙(pembrolizumab (Keytruda))이 전이 흑색종에 대해 각각 FDA 승인을 획득하였다. 이후 PD-L1에 대한 면역관문 억제제인 아테조리주맙(atezolizumab(Tecentriq))이 방광암에 대해서(2016년), 아베루맙(avelumab (Bavencio))이 피부암의 일종인 전이 머클세포암 치료에, 더바루맙(durvalumab (Imfinzi))이 방광암에 대해서 2017년에 FDA 승인을 획득하였다. 2018년에는 PD-1 저해제인 케미프리맙 (cemiplimab(Libtayo))가 피부편평상피암에 대해 FDA 승인을 얻었다. 현재 이들 약제는 치료 적응증을 확대하면서 점점 더 많은 암종의 치료에 대해 FDA 승인을 얻고 있다. 2019년 기준 6종의 PD-1/PD-L1 저해제는 총 18개 암종에 대해 FDA 승인을 얻었다. 이외에도 B7-H4, ICOS, HVEM, PDL-2, PVRIG 등 면역조절단백질 등이 새로운 타겟으로 전임상시험에 진입하고 있다. 대부분의 이러한 치료제들은 T 세포상에 발현되어 있는 타겟을 표적으로 하고 있다.
이렇게 T 세포 중심의 편향적인 타겟발굴 경향을 극복하기 위해 최근에는 대식세포, 수지상세포 등 myeloid 계열의 세포에서 발현되는 면역관문 단백질을 표적으로 하는 억제제들이 개발되고 있다. 이 중에 CSF1R, CD47, TLR7 등이 중요한 타겟으로 부상되고 있다.
T 세포의 활성을 억제시킴으로써 종양세포가 면역체계로부터 공격을 회피할수 있도록 하는 면역관문단백질의 하나인 PD-L1(Programmed Death-Ligand 1)은 림프계 및 비림프성 조직의 백혈구 및 비조혈(Nongematopoietic) 세포에서 주로 발현하며 대장암, 췌장암, 흑색종 및 자궁경부암 등 다양한 종양세포의 표면에서도 발현한다. 특히 활성화된 T 세포 표면에서 발현하는 PD-1(Programmed Death-1)과 상호작용하여 TCR-매개 T 세포 활성화(TCR mediated T-cell activation), 사이토카인 발현(Cytokine release) 및 T 세포의 증식(T-cell proliferation)을 억제함으로서 T 세포의 면역 반응을 부정적으로 조절한다.
1980년 인간 난소암에서 종양 항원으로 처음 동정된 CD47(Cluster of Differentiation 47)은 비-호지킨 림프종(NHL), 다발성 골수종(MM), 급성 림프모구성 백혈병(ALL), 급성 골수성 백혈병(AML), 만성 골수성 백혈병, 방광암 및 고형암을 비롯하여 다수의 인간 종양세포에서 발현된다.
CD47은 세포 표면에서 발현하여 SIRP 알파(SIRPa), 트롬보스폰딘-1(TSP1) 및 인테그린 단백질과 상호작용하여 세포의 사멸, 증식 및 면역반응에 관여한다. 특히 종양세포에서 발현되는 CD47은 대식세포(Macrophage) 표면에서 발현하는 SIRP 알파(SIRPa)와 상호작용하여 “나를 먹지 마” 신호를 보냄으로써 대식세포의 식세포 작용(Phagocytosis)으로부터 회피할 뿐만 아니라, 종양환경 내에서 혈관 증식 및 작동 T 세포(effector T-cell)의 역할을 억제하여 종양세포의 증식 및 성장을 촉진한다.
글로벌 제약사인 길리어드의 마그롤리맙(Magrolimab)은 CD47을 타겟으로 하는 항체치료제로 임상시험이 진행중에 있으며 최근 다국적 글로벌 제약사에서 CD47 항체치료제를 기반으로 한 이중항체 개발이 활발하게 이루어지고 있다.
한편, 비-인간 기원의 항체는 종종 면역원성이므로, 그 효과를 제한하고, 경우에 따라 위험한 알러지 반응을 유발할 우려가 있다. 이러한 외래 항체에 대한 면역 반응은 신체로부터 이의 제거를 촉진하고 표적화된 항원에 결합하는 능력을 억제함으로써 항체의 효과를 실질적으로 감소시킨다. 이러한 문제를 극복하기 위해, 비-인간 항체를 인간화하여 인간에 대한 면역원성을 감소시키면서, 모(parental) 비-인간 항체의 특이성과 친화도를 유지하는 것이 가능하다.
이에, 본 발명자들은 면역관문 단백질인 PD-L1과 CD47을 타겟으로 하는 면역관문 억제제로서 인간화된 항체를 개발함으로써, 본 출원에 이르게 되었다.
Pol Specenier (2016): Ipilimumab in melanoma, Expert Review of Anticancer Therapy.
DB Johnson, C Peng et al. Nivolumab in melanoma: latest evidence and clinical potential. Ther Adv Med Oncol 2015, Vol. 7(2) 97-106
Liu J, Wang L, Zhao F, Tseng S, Narayanan C, Shura L, et al. (2015) Pre-Clinical Development of a Humanized Anti-CD47 Antibody with Anti-Cancer Therapeutic Potential. PLoS ONE 10(9): e0137345.
C Vincke et al. General Strategy to Humanize a Camelid Single-domain Antibody and Identification of a Universal Humanized Nanobody Scaffold. The Journal of Biological Chemistry Vol. 284, NO. 5, 3273-3284, January 30, 2009.
본 발명의 목적은 면역관문 단백질(immune checkpoint protein)인 PD-L1 및 CD47에 대한 이중특이적 인간화 단일 도메인 항체 및 이의 용도를 제공하는 것이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 PD-L1에 특이적으로 결합하는 제1 인간화 단일 도메인 항체(제1 hsdAb) 또는 이의 항원-결합 단편; 및 CD47에 특이적으로 결합하는 제2 인간화 단일 도메인 항체(제2 hsdAb) 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는, PD-L1 및 CD47에 이중특이적으로 결합하는 이중특이적 항체를 제공한다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 제1 hsdAb 또는 이의 항원-결합 단편은 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 CDR1; 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 CDR2; 및 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 CDR3를 포함할 수 있다.
또한, 상기 제2 hsdAb 또는 이의 항원-결합 단편은 서열번호 9로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 CDR1; 서열번호 10으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 CDR2; 및 서열번호 11로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 CDR3를 포함할 수 있다.
또한, 상기 제1 hsdAb 또는 제2 hsdAb는 서열번호 16 서열과 적어도 95%의 서열 동일성을 가지는 중쇄 가변 도메인 프레임워크 서열을 포함할 수 있고, 서열번호 17 서열과 적어도 85%의 서열 동일성을 가지는 중쇄 가변 도메인 프레임워크 서열을 포함할 수 있다.
또한, 상기 제1 hsdAb 또는 제2 hsdAb는 서열번호 16 또는 17 서열과 100%의 서열 동일성을 가지는 중쇄 가변 도메인 프레임워크 서열을 포함할 수 있다. 구체적으로 상기 제1 hsdAb 또는 이의 항원-결합 단편 및/또는 제2 hsdAb 또는 이의 항원-결합 단편은 (1) 서열번호 19 및 23 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 FR1; (2) 서열번호 20 및 24 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 FR2; (3) 서열번호 21 및 25 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 FR3; 및 (4) 서열번호 22 및 26 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 FR4의 중쇄 가변 도메인 프레임워크 서열을 포함할 수 있고, 보다 구체적으로 상기 제1 hsdAb 또는 이의 항원-결합 단편은 서열번호 19로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 FR1; 서열번호 20으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 FR2; 서열번호 21로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 FR3; 및 서열번호 22로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 FR4의 중쇄 가변 도메인 프레임워크 서열을 포함하고, 상기 제2 hsdAb 또는 이의 항원-결합 단편은 서열번호 23으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 FR1; 서열번호 24로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 FR2; 서열번호 25로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 FR3; 및 서열번호 26으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 FR4의 중쇄 가변 도메인 프레임워크 서열을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 제1 hsdAb는 서열번호 16으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 hsdAb는 서열번호 17로 표시되는 아미노산 서열을 포함한다.
또한, 상기 제1 hsdAb 또는 이의 항원-결합 단편 및/또는 제2 hsdAb 또는 이의 항원-결합 단편은 1가, 2가, 3가, 4가, 또는 더 높은 가수일 수 있다. 또한, 상기 제1 hsdAb 또는 이의 항원-결합 단편 간 펩티드 링커를 통해 서로 융합될 수 있다. 또한, 상기 제2 hsdAb 또는 이의 항원-결합 단편 간 펩티드 링커를 통해 서로 융합될 수 있다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 제1 hsdAb 또는 이의 항원-결합 단편 및 제2 hsdAb 또는 이의 항원-결합 단편은 펩티드 링커를 통해 서로 융합될 수 있고, 일부 구현예에서 서열번호 15로 표시되는 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 제1 hsdAb 또는 이의 항원-결합 단편, 또는 제2 hsdAb 또는 이의 항원-결합 단편에 Fc 단편이 융합된 중쇄-단독 항체(HCAb)를 제공한다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 제1 hsdAb 또는 이의 항원-결합 단편 및/또는 제2 hsdAb 또는 이의 항원-결합 단편의 2개 이상의 카피를 포함하는, 이중특이적 및 다가(예컨대, 2가, 3가, 4가, 또는 더 높은 가수)이고, Fc 단편이 융합된 HCAb일 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 HCAb는 서열번호 18로 표시되는 아미노산 서열로 이루어질 수 있다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 Fc 단편에 sdAb가 펩티드 링커를 통해 융합될 수 있고, 상기 Fc 단편은 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4일 수 있다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 HCAb는 적어도 1개 이상의 아미노산 치환을 포함할 수 있고, 상기 적어도 1개 이상의 아미노산 치환이 보존적 치환일 수 있으며, 아미노산의 비-유전자 코딩 아미노산 또는 합성 아미노산으로의 치환일 수 있다.
본 발명의 일 양태에서, 면역조정제, 사이토카인, 세포독성제, 화학요법제, 진단제, 항바이러스제, 항미생물제 또는 약물이 접합될 수 있다. 이에, 본 발명은 면역조정제, 사이토카인, 세포독성제, 화학요법제, 진단제, 항바이러스제, 항미생물제 또는 약물에 접합된 상기 PD-L1 및 CD47에 이중특이적으로 결합하는 이중특이적 항체를 포함하는 항체 접합체를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 PD-L1 및 CD47에 이중특이적으로 결합하는 이중특이적 항체를 암호화하는, 핵산 분자를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 핵산 분자를 포함하는, 발현 벡터를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 제공한다.
또한, 본 발명은
(a) 이중특이적 항체가 발현되도록 하는 조건 하에 상기 숙주 세포를 배양하는 단계; 및
(b) 발현된 이중특이적 항체를 회수하는 단계
를 포함하는, PD-L1 및 CD47에 이중특이적으로 결합하는 이중특이적 항체를 생산하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 PD-L1 및 CD47에 이중특이적으로 결합하는 이중특이적 항체, 또는 상기 항체 접합체를 유효성분으로 함유하는, 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 앙태에서, 상기 암은 흑색종, 폐암, 간암, 교세포종, 난소암, 대장암, 두경부암, 방광암, 신장세포암, 위암, 유방암, 전이암, 전립선암, 췌장암, 비호지킨 림프종, 호지킨 림프종, 다발성 골수종, 백혈병, 림프종, 골수이형성증후군, 급성 림프모구성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 고립성 골수종 및 재생불량성 빈혈로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 약학적 조성물은 약학적으로 허용되는 담체를 더 포함할 수 있다.
본 발명에서는 면역관문 단백질(immune checkpoint protein)인 PD-L1 및 CD47에 이중특이적으로 결합하는 인간화 단일 도메인 항체를 제작하였고,이의 in vitro 및 in vivo 효능을 확인하였으므로, 상기 이중특이적 인간화 단일 도메인 항체를 면역관문 억제제로 면역항암요법에 유용하게 이용할 수 있다.
도 1a는 CHO-K1_PD-L1 세포주(PD-L1 항원의 발현을 유도한 CHO-K1 세포)와 본 발명의 일 실시예에 따라 제작한 항-PD-L1 HCAb(PDL1 Nb#01-IgG1)를 농도별로 반응하여 세포 표면에서 발현하는 PD-L1 항원에 대한 결합능 (EC50)을 확인한 도이다.
도 1b는 CHO-K1_PD-L1 세포주(PD-L1 항원의 발현을 유도한 CHO-K1 세포)와 PD-1 단백질의 결합 후 본 발명의 일 실시예에 따라 제작한 항-PD-L1 HCAb(PDL1 Nb#01-IgG1)가 PD-L1/PD-1 상호작용에 미치는 억제능(IC50)을 확인한 도이다.
도 2a는 CHO-K1_PD-L1 세포주(PD-L1 항원의 발현을 유도한 CHO-K1 세포)와 본 발명의 일 실시예에 따라 제작한 항-PD-L1 2가 HCAb(PP Nb-IgG4)를 농도별로 반응하여 세포 표면에서 발현하는 PD-L1 항원에 대한 결합능 (EC50)을 확인한 도이다.
도 2b는 CHO-K1_PD-L1 세포주(PD-L1 항원의 발현을 유도한 CHO-K1 세포)와 PD-1 단백질의 결합 후 본 발명의 일 실시예에 따라 제작한 항-PD-L1 2가 HCAb(PP Nb-IgG4)가 PD-L1/PD-1 상호작용에 미치는 억제능(IC50)을 확인한 도이다.
도 3a는 Expi-CHO_CD47 세포주(CD47 항원의 발현을 유도한 Expi-CHO 세포)와 본 발명의 일 실시예에 따라 제작한 항-CD47 HCAb(CD47 Nb-IgG4)를 농도별로 반응하여 세포 표면에서 발현하는 CD47 항원에 대한 결합능(EC50)을 확인한 도이다.
도 3b는 Expi-CHO_CD47 세포주(CD47 항원의 발현을 유도한 Expi-CHO 세포)와 SIRPalpha 단백질의 결합 후 본 발명의 일 실시예에 따라 제작한 항-CD47 HCAb(CD47 Nb-IgG4)가 CD47/SIRPalpha 상호작용에 미치는 억제능(IC50)을 확인한 도이다.
도 4a는 CHO-K1_PD-L1 세포주(PD-L1 항원의 발현을 유도한 CHO-K1 세포)와 본 발명의 일 실시예에 따라 제작한 항-PD-L1×CD47 HCAb(PPC Nb-IgG4)를 농도별로 반응하여 세포 표면에서 발현하는 PD-L1 항원에 대한 결합능(EC50)을 확인한 도이다.
도 4b는 Expi-CHO_CD47 세포주(CD47 항원의 발현을 유도한 Expi-CHO 세포)와 본 발명의 일 실시예에 따라 제작한 항-PD-L1×CD47 HCAb(PPC Nb-IgG4)를 농도별로 반응하여 세포 표면에서 발현하는 CD47 항원에 대한 결합능(EC50)을 확인한 도이다.
도 5a는 CHO-K1_PD-L1 세포주(PD-L1 항원의 발현을 유도한 CHO-K1 세포)와 PD-1 단백질의 결합 후 본 발명의 일 실시예에 따라 제작한 항-PD-L1×CD47 HCAb(PPC Nb-IgG4)가 PD-L1/PD-1 상호작용에 미치는 억제능(IC50)을 확인한 도이다.
도 5b는 Expi-CHO_CD47 세포주(CD47 항원의 발현을 유도한 Expi-CHO 세포)와 SIRPalpha 단백질의 결합 후 본 발명의 일 실시예에 따라 제작한 항-PD-L1×CD47 HCAb(PPC Nb-IgG4)가 CD47/SIRPalpha 상호작용에 미치는 억제능(IC50)을 확인한 도이다.
도 6a는 CHO-K1_PD-L1 세포주(PD-L1 항원의 발현을 유도한 CHO-K1 세포)와 본 발명의 일 실시예에 따라 제작한 인간화 항-PD-L1×CD47 HCAb(hPPC Nb-IgG4)를 농도별로 반응하여 세포 표면에서 발현하는 PD-L1 항원에 대한 결합능(EC50)을 확인한 도이다.
도 6b는 Expi-CHO_CD47 세포주(CD47 항원의 발현을 유도한 Expi-CHO 세포)와 본 발명의 일 실시예에 따라 제작한 인간화 항-PD-L1×CD47 HCAb(hPPC Nb-IgG4)를 농도별로 반응하여 세포 표면에서 발현하는 CD47 항원에 대한 결합능(EC50)을 확인한 도이다.
도 7a는 CHO-K1_PD-L1 세포주(PD-L1 항원의 발현을 유도한 CHO-K1 세포)와 PD-1 단백질의 결합 후 본 발명의 일 실시예에 따라 제작한 인간화 항-PD-L1×CD47 HCAb(hPPC Nb-IgG4)가 PD-L1/PD-1 상호작용에 미치는 억제능(IC50)을 확인한 도이다.
도 7b는 Expi-CHO_CD47 세포주(CD47 항원의 발현을 유도한 Expi-CHO 세포)와 SIRPalpha 단백질의 결합 후 본 발명의 일 실시예에 따라 제작한 인간화 항-PD-L1×CD47 HCAb(hPPC Nb-IgG4)가 CD47/SIRPalpha 상호작용에 미치는 억제능(IC50)을 확인한 도이다.
도 8은 PD-L1 단백질의 과발현을 유도한 CHO-K1 세포와 PD-1이 발현하는 Jurkat 세포를 이용하여 본 발명의 일 실시예에 따라 제작한 인간화 항-PD-L1×CD47 HCAb(hPPC Nb-IgG4)에 의한 세포 간 상호작용 방해를 통한 T 세포 활성을 확인한 도이다.
도 9a 및 도 9b는 본 발명의 일 실시예에 따라 제작한 인간화 항-PD-L1×CD47 HCAb(hPPC Nb-IgG4)의 혼합림프구반응에서의 CD4+ T 세포의 활성화 정도를 확인한 도이다.
도 10a 및 도 10b는 본 발명의 일 실시예에 따라 제작한 인간화 항-PD-L1×CD47 HCAb(hPPC Nb-IgG4)의 대식세포(macrophage)에 의한 식세포 작용(phagocytosis) 정도를 확인한 도이다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에 따라 제작한 인간화 항-PD-L1×CD47 HCAb(hPPC Nb-IgG4)의 인간 RBC(Red blood cell) 결합능을 확인한 도이다.
도 12는 본 발명의 일 실시예에 따라 제작한 인간화 항-PD-L1×CD47 HCAb(hPPC Nb-IgG4)의 적혈구응집반응(Hemagglutination)을 확인한 도이다.
도 13은 PD-L1 및 CD47 항원 발현 종양 형성 C57BL/6 마우스 모델에서 인간화 항-PD-L1×CD47 HCAb(hPPC Nb-IgG4)의 항종양 효과를 확인한 도이다.
도 14는 PD-L1 및 CD47 항원 발현 종양 형성 인간화 NSG 마우스 모델에서 인간화 항-PD-L1×CD47 HCAb(hPPC Nb-IgG4)의 항종양 효과를 확인한 도이다.
도 15a 및 도 15b는 인간 유방암 세포주 MDA-MB-231로 종양 형성을 유도한 인간화 NSG 마우스 모델에서 인간화 항-PD-L1×CD47 HCAb(hPPC Nb-IgG4)의 항종양 효과 및 생존율을 확인한 도이다.
도 1b는 CHO-K1_PD-L1 세포주(PD-L1 항원의 발현을 유도한 CHO-K1 세포)와 PD-1 단백질의 결합 후 본 발명의 일 실시예에 따라 제작한 항-PD-L1 HCAb(PDL1 Nb#01-IgG1)가 PD-L1/PD-1 상호작용에 미치는 억제능(IC50)을 확인한 도이다.
도 2a는 CHO-K1_PD-L1 세포주(PD-L1 항원의 발현을 유도한 CHO-K1 세포)와 본 발명의 일 실시예에 따라 제작한 항-PD-L1 2가 HCAb(PP Nb-IgG4)를 농도별로 반응하여 세포 표면에서 발현하는 PD-L1 항원에 대한 결합능 (EC50)을 확인한 도이다.
도 2b는 CHO-K1_PD-L1 세포주(PD-L1 항원의 발현을 유도한 CHO-K1 세포)와 PD-1 단백질의 결합 후 본 발명의 일 실시예에 따라 제작한 항-PD-L1 2가 HCAb(PP Nb-IgG4)가 PD-L1/PD-1 상호작용에 미치는 억제능(IC50)을 확인한 도이다.
도 3a는 Expi-CHO_CD47 세포주(CD47 항원의 발현을 유도한 Expi-CHO 세포)와 본 발명의 일 실시예에 따라 제작한 항-CD47 HCAb(CD47 Nb-IgG4)를 농도별로 반응하여 세포 표면에서 발현하는 CD47 항원에 대한 결합능(EC50)을 확인한 도이다.
도 3b는 Expi-CHO_CD47 세포주(CD47 항원의 발현을 유도한 Expi-CHO 세포)와 SIRPalpha 단백질의 결합 후 본 발명의 일 실시예에 따라 제작한 항-CD47 HCAb(CD47 Nb-IgG4)가 CD47/SIRPalpha 상호작용에 미치는 억제능(IC50)을 확인한 도이다.
도 4a는 CHO-K1_PD-L1 세포주(PD-L1 항원의 발현을 유도한 CHO-K1 세포)와 본 발명의 일 실시예에 따라 제작한 항-PD-L1×CD47 HCAb(PPC Nb-IgG4)를 농도별로 반응하여 세포 표면에서 발현하는 PD-L1 항원에 대한 결합능(EC50)을 확인한 도이다.
도 4b는 Expi-CHO_CD47 세포주(CD47 항원의 발현을 유도한 Expi-CHO 세포)와 본 발명의 일 실시예에 따라 제작한 항-PD-L1×CD47 HCAb(PPC Nb-IgG4)를 농도별로 반응하여 세포 표면에서 발현하는 CD47 항원에 대한 결합능(EC50)을 확인한 도이다.
도 5a는 CHO-K1_PD-L1 세포주(PD-L1 항원의 발현을 유도한 CHO-K1 세포)와 PD-1 단백질의 결합 후 본 발명의 일 실시예에 따라 제작한 항-PD-L1×CD47 HCAb(PPC Nb-IgG4)가 PD-L1/PD-1 상호작용에 미치는 억제능(IC50)을 확인한 도이다.
도 5b는 Expi-CHO_CD47 세포주(CD47 항원의 발현을 유도한 Expi-CHO 세포)와 SIRPalpha 단백질의 결합 후 본 발명의 일 실시예에 따라 제작한 항-PD-L1×CD47 HCAb(PPC Nb-IgG4)가 CD47/SIRPalpha 상호작용에 미치는 억제능(IC50)을 확인한 도이다.
도 6a는 CHO-K1_PD-L1 세포주(PD-L1 항원의 발현을 유도한 CHO-K1 세포)와 본 발명의 일 실시예에 따라 제작한 인간화 항-PD-L1×CD47 HCAb(hPPC Nb-IgG4)를 농도별로 반응하여 세포 표면에서 발현하는 PD-L1 항원에 대한 결합능(EC50)을 확인한 도이다.
도 6b는 Expi-CHO_CD47 세포주(CD47 항원의 발현을 유도한 Expi-CHO 세포)와 본 발명의 일 실시예에 따라 제작한 인간화 항-PD-L1×CD47 HCAb(hPPC Nb-IgG4)를 농도별로 반응하여 세포 표면에서 발현하는 CD47 항원에 대한 결합능(EC50)을 확인한 도이다.
도 7a는 CHO-K1_PD-L1 세포주(PD-L1 항원의 발현을 유도한 CHO-K1 세포)와 PD-1 단백질의 결합 후 본 발명의 일 실시예에 따라 제작한 인간화 항-PD-L1×CD47 HCAb(hPPC Nb-IgG4)가 PD-L1/PD-1 상호작용에 미치는 억제능(IC50)을 확인한 도이다.
도 7b는 Expi-CHO_CD47 세포주(CD47 항원의 발현을 유도한 Expi-CHO 세포)와 SIRPalpha 단백질의 결합 후 본 발명의 일 실시예에 따라 제작한 인간화 항-PD-L1×CD47 HCAb(hPPC Nb-IgG4)가 CD47/SIRPalpha 상호작용에 미치는 억제능(IC50)을 확인한 도이다.
도 8은 PD-L1 단백질의 과발현을 유도한 CHO-K1 세포와 PD-1이 발현하는 Jurkat 세포를 이용하여 본 발명의 일 실시예에 따라 제작한 인간화 항-PD-L1×CD47 HCAb(hPPC Nb-IgG4)에 의한 세포 간 상호작용 방해를 통한 T 세포 활성을 확인한 도이다.
도 9a 및 도 9b는 본 발명의 일 실시예에 따라 제작한 인간화 항-PD-L1×CD47 HCAb(hPPC Nb-IgG4)의 혼합림프구반응에서의 CD4+ T 세포의 활성화 정도를 확인한 도이다.
도 10a 및 도 10b는 본 발명의 일 실시예에 따라 제작한 인간화 항-PD-L1×CD47 HCAb(hPPC Nb-IgG4)의 대식세포(macrophage)에 의한 식세포 작용(phagocytosis) 정도를 확인한 도이다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에 따라 제작한 인간화 항-PD-L1×CD47 HCAb(hPPC Nb-IgG4)의 인간 RBC(Red blood cell) 결합능을 확인한 도이다.
도 12는 본 발명의 일 실시예에 따라 제작한 인간화 항-PD-L1×CD47 HCAb(hPPC Nb-IgG4)의 적혈구응집반응(Hemagglutination)을 확인한 도이다.
도 13은 PD-L1 및 CD47 항원 발현 종양 형성 C57BL/6 마우스 모델에서 인간화 항-PD-L1×CD47 HCAb(hPPC Nb-IgG4)의 항종양 효과를 확인한 도이다.
도 14는 PD-L1 및 CD47 항원 발현 종양 형성 인간화 NSG 마우스 모델에서 인간화 항-PD-L1×CD47 HCAb(hPPC Nb-IgG4)의 항종양 효과를 확인한 도이다.
도 15a 및 도 15b는 인간 유방암 세포주 MDA-MB-231로 종양 형성을 유도한 인간화 NSG 마우스 모델에서 인간화 항-PD-L1×CD47 HCAb(hPPC Nb-IgG4)의 항종양 효과 및 생존율을 확인한 도이다.
이하, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본 발명의 실시형태를 들어 상세히 설명한다. 본 발명의 실시형태는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 더욱 완전하게 설명하기 위해서 제공되는 것이다. 따라서 본 발명의 실시형태는 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 이하 설명하는 실시형태로 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서, 용어 "에피토프"는 항체에 특이적 결합을 할 수 있는 단백질 결정요인을 의미한다. 에피토프는 일반적으로 분자, 예컨대 아미노산 또는 당 측쇄의 화학적 활성 표면 그룹화로 이루어지고 일반적으로 특이적 3차원 구조 특징, 뿐만 아니라 특이적 전하 특징을 갖는다.
용어 "치료"는 본원에 개시된 장애 또는 질환, 예를 들어 질환의 증상 또는 합병증을 늦추거나, 중단시키거나, 중지시키거나, 제어하거나, 정지시키거나, 완화하거나 또는 개선하는 것, 또는 그의 진행을 역전시키는 것일 수 있지만, 반드시 모든 질환 또는 장애 증상의 완전한 제거를 나타내는 것은 아닌 모든 과정을 의미한다.
용어 "예방"은 질환 또는 장애, 예를 들어 질환의 예방적 치료, 또는 질환 또는 장애의 발병 또는 진행을 지연시키는 것을 의미한다.
용어 "개체" 또는 "대상체"는, 비제한적으로, 인간, 소과, 말, 고양이, 개, 설치류, 또는 영장류를 포함하는, 포유동물을 지칭한다. 일부 구현예에서, 개체는 인간이다.
용어 "항체"는 이의 가장 넓은 의미로 사용되고, 이들이 원하는 항원-결합 활성을 나타내는 한, 비제한적으로 단클론성 항체, 다클론성 항체, 다중특이적 항체 (예를 들면, 이중특이적 항체), 전장 항체 및 이의 항원-결합 단편을 포함하는, 다양한 항체 구조를 포괄한다. 용어 "항체"는 종래의 4-쇄 항체, 단일 도메인 항체, 및 이의 항원-결합 단편을 포함한다.
기본 4-쇄 항체 유닛은 2개의 동일한 경 (L) 쇄 및 2개의 동일한 중 (H) 쇄로 구성된 헤테로사량체성 당단백질이다. IgM 항체는 J 쇄로 불리는 추가의 폴리펩티드와 함께 기본 헤테로사량체 유닛들 중 5개로 이루어지고, 10개의 항원-결합 부위를 함유하는 반면, IgA 항체는 J 쇄와 조합으로 다가 집합체를 형성하기 위해 중합화할 수 있는 기본 4-쇄 유닛들 중 2-5개를 포함한다. IgG의 경우에, 4-쇄 유닛은 일반적으로 약 150,000 달톤이다. 각각의 L 쇄는 1개의 공유 디설파이드 결합에 의해 H 쇄에 연결되는 반면, 2개의 H 쇄는 H 쇄 아이소타입에 의존하여 하나 이상의 디설파이드 결합에 의해 서로에 연결된다. 각각의 H 및 L 쇄는 또한 규칙적으로 이격된 쇄간 디설파이드 브릿지를 갖는다. 각각의 H 쇄는 N-말단에서, α 및 γ 쇄의 각각에 대하여 가변 도메인 (VH) 이어서 3개의 불변 도메인 (CH) 그리고 μ 및 ε 아이소타입에 대하여 4개의 CH 도메인을 갖는다. 각각의 L 쇄는 N-말단에서, 이의 다른 단부에 가변 도메인 (VL) 이어서 불변 도메인을 갖는다. VL은 VH와 정렬되고 CL은 중쇄의 제1 불변 도메인 (CH1)과 정렬된다. VH 및 VL의 짝짓기는 단일 항원-결합 부위를 함께 형성한다. 임의의 척추동물 종으로부터 L 쇄는, 그들의 불변 도메인의 아미노산 서열에 기반하여, 카파 및 람다로 불리는, 2개의 분명히 구별되는 유형들 중 하나로 배정될 수 있다. 그들의 중쇄의 불변 도메인 (CH)의 아미노산 서열에 의존하여, 면역글로불린은 상이한 클래스 또는 아이소타입으로 배정될 수 있다. 면역글로불린의 5개의 클래스가 있다: α, δ, ε, γ 및 μ, 각각으로 지정된 중쇄를 갖는, IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM. γ 및 α 클래스는 CH 서열 및 기능에서 상대적으로 소수의 차이에 근거하여 서브클래스로 추가 분할되고, 예를 들면, 인간은 하기 서브클래스를 발현시킨다: IgG1, IgG2A, IgG2B, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2.
용어 "중쇄-단독 항체" 또는 "HCAb"는, 중쇄를 포함하지만 4-쇄 항체에서 일반적으로 발견된 경쇄가 부족한 기능성 항체를 지칭한다.
용어 "단일-도메인 항체", "나노바디" 또는 "sdAb"는 3개의 상보성 결정 영역 (CDR)를 갖는 단일 항원-결합 폴리펩티드를 지칭한다. sdAb 단독은 상응하는 CDR-함유 폴리펩티드와 짝짓기 없이 항원에 결합할 수 있다. 일부 경우에, 단일-도메인 항체는 낙타과 HCAb로부터 조작되고, 그들의 중쇄 가변 도메인은 "VHH" (중쇄 항체의 중쇄의 가변 도메인)으로서 본원에서 지칭된다. 기본 VHH는 N-말단부터 C-말단까지 하기 구조를 갖는다: FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4, 여기에서 FR1 내지 FR4는 프레임워크 영역 1 내지 4 각각을 지칭하고, CDR1 내지 CDR3은 상보성 결정 영역 1 내지 3을 지칭한다.
항체의 "가변 영역" 또는 "가변 도메인"은 항체의 중쇄 또는 경쇄의 아미노-말단 도메인을 지칭한다. 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인은 "VH" 및 "VL" 각각으로서 지칭될 수 있다. 이들 도메인은 일반적으로 (동일한 클래스의 다른 항체에 비하여) 항체의 최대 가변성 부분이고 항원 결합 부위를 함유한다. 낙타과 종으로부터 중쇄-단독 항체는 "VHH"로서 지칭되는 단일 중쇄 가변 영역을 갖는다.
용어 "가변"은 가변 도메인의 특정한 분절이 항체들 중 서열에서 광범위하게 상이하다는 사실을 지칭한다. V 도메인은 항원 결합을 매개하고 이의 특정 항원에 대하여 특정 항체의 특이성을 정의한다. 하지만, 가변성은 가변 도메인의 전체 범위에 걸쳐서 고르게 분포되지 않는다. 대신에, 중쇄 및 경쇄 가변 도메인 둘 모두에서 상보성 결정 영역 (CDR) 또는 초가변 영역 (HVR)로 불리는 3개의 분절에서 농축된다. 가변 도메인의 더욱 고도로 보존된 부분은 프레임워크 영역 (FR)로 불린다. 천연 중쇄 및 경쇄 각각의 가변 도메인은, 루프 연결을 형성하는, 3개의 CDR로 연결된, 베타-시트 구성을 주로 채택하는, 그리고 일부 경우에 베타-시트 구조의 일부를 형성하는, 4개의 FR 영역을 포함한다. 각각의 쇄에서 CDR는 FR 영역에 의해 아주 근접하여 함께 유지되고, 다른 쇄로부터 CDR는 항체의 항원 결합 부위의 형성에 기여한다 (Kabat, Elvin A., Sequence of Immunological Interest, Fifth Edition, National Institute of Health, Bethesda, Md. (1991)을 참고한다). 불변 도메인은 항원에 대한 항체의 결합에 직접적으로 관여되지 않지만, 다양한 이펙터 기능, 예컨대 항체-의존적 세포 독성에서 항체의 참여를 나타낸다.
용어 "불변 도메인"은, 항원-결합 부위를 함유하는, 면역글로불린의 다른 부분, 가변 도메인에 비하여 더 많은 보존된 아미노산 서열을 가지고 있는 면역글로불린 분자의 부분을 지칭한다. 불변 도메인은 중쇄의 CH1, CH2 및 CH3 도메인 (집합적으로, CH) 및 경쇄의 CHL (또는 CL) 도메인을 함유한다.
용어 "전장 항체", "온전한 항체", 또는 "전체의 항체"는, 항체 단편과 대조적으로, 이의 실질적으로 온전한 형태로 항체를 지칭하기 위해 호환적으로 사용된다. 특이적으로, 전장 4-쇄 항체는 Fc 영역을 포함하는 중쇄 및 경쇄를 가진 것들을 포함한다. 전장 중쇄-단독 항체는 중쇄 가변 도메인 (예컨대 VHH) 및 Fc 영역을 포함한다. 불변 도메인은 천연 서열 불변 도메인 (예를 들면, 인간 천연 서열 불변 도메인) 또는 이의 아미노산 서열 변이체일 수 있다. 일부 경우에, 온전한 항체는 하나 이상의 이펙터 기능을 가질 수 있다.
"항체 단편" 또는 "항원-결합 단편"은 온전한 항체의 한 부분, 바람직하게는 온전한 항체의 항원 결합 및/또는 가변 영역을 포함한다. 항체 단편의 예는 비제한적으로 Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv 단편; 디아바디; 선형 항체; 단일-쇄 항체 (scFv) 분자; 단일 도메인 항체 (예컨대 VHH), 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체를 포함한다. "Fv"는 완전 항원-인식 및 -결합 부위를 함유하는 최소 항체 단편이다. 이 단편은 치밀한, 비-공유 회합에서 1개의 중쇄 및 1개의 경쇄 가변 영역 도메인의 이량체로 이루어진다. "단일-쇄 Fv" 또한 약칭 "sFv" 또는 "scFv"는 단일 폴리펩티드 쇄에 연결된 VH 및 VL 항체 도메인을 포함하는 항체 단편이다. 바람직하게는, scFv 폴리펩티드는 scFv가 항원 결합을 위하여 원하는 구조를 형성할 수 있도록 하는 VH와 VL 도메인 사이의 폴리펩티드 링커를 추가로 포함한다. "디아바디"는 V 도메인의 쇄내가 아닌 쇄간 짝짓기가 달성되도록 VH와 VL 도메인 사이의 짧은 링커 (약 5-10개의 잔기)를 가진 sFv 단편을 작제하고, 그것에 의해 2가 단편, 즉, 2개의 항원-결합 부위를 갖는 단편을 초래함으로써 제조된 작은 항체 단편을 지칭한다. 이중특이적 디아바디는 2개의 항체의 VH 및 VL 도메인이 상이한 폴리펩티드 쇄에서 존재하는 2개의 "교차" sFv 단편의 헤테로이량체이다.
용어 "인간화된 항체"는 "키메라 항체"의 서브셋으로서 사용된다.
비-인간 (예를 들면, 라마 또는 낙타과) 항체의 "인간화된" 형태는 비-인간 면역글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 함유하는 키메라 항체이다. 일부 구현예에서, 인간화된 항체는 수령체의 (이하에서 정의된) CDR로부터의 잔기가 원하는 특이성, 친화성, 및/또는 수용력을 갖는 비-인간 종 (공여체 항체) 예컨대 마우스, 랫트, 토끼, 낙타, 라마, 알파카, 또는 비-인간 영장류의 CDR로부터의 잔기로 대체되는 인간 면역글로불린 (수령체 항체)이다.
일부 사례에서, 인간 면역글로불린의 프레임워크 ("FR") 잔기는 상응하는 비-인간 잔기로 대체된다. 또한, 인간화된 항체는 수령체 항체에서 또는 공여체 항체에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이들 변형은 항체 성능, 예컨대 결합 친화성을 추가로 개선하기 위해 실시될 수 있다.
용어 "초가변 영역", "HVR", 또는 "HV"는, 본원에서 사용된 경우 서열에서 초가변성이고/거나 구조적으로 정의된 루프를 형성하는 항체 가변 도메인의 영역을 지칭한다. 일반적으로, 단일 도메인 항체는 3개의 HVR (또는 CDR): HVR1 (또는 CDR1), HVR2 (또는 CDR2), 및 HVR3 (또는 CDR3)을 포함한다. HVR3 (또는 CDR3)은 3개의 HVR의 최고 다양성을 표시하고, 항체에 미세 특이성 부여에서 고유의 역할을 한다고 알려져 있다. 예를 들면, Hamers-Casterman et al., Nature 363:446-448 (1993); Sheriff et al., Nature Struct. Biol. 3:733-736 (1996)을 참고한다.
용어 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"은 카밧 시스템에 의해 정의된 바와 같이 초가변 영역을 지칭하는데 사용된다. Kabat, Elvin A., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)을 참고한다. 카밧 상보성 결정 영역 (CDR)는 서열 가변성에 근거하고 가장 흔하게 사용된다.
용어 "프레임워크" 또는 "FR" 잔기는 본원에서 정의된 바와 같이 HVR 잔기 이외의 가변-도메인 잔기이다.
용어 "특이적"은 항원의 특정 에피토프에 대하여 항원 결합 단백질 (예컨대 sdAb)의 선택적 인식을 지칭한다.
천연 항체는, 예를 들어, 단일특이적이다. 본원에서 사용된 바와 같이 용어 "다중특이적"은 항원 결합 단백질이 폴리에피토프 특이성을 갖는 (즉, 1개의 생물학적 분자에서 2개의, 3개의, 또는 초과의, 상이한 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있거나 2개의, 3개의, 또는 초과의, 상이한 생물학적 분자에서 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는) 것을 나타낸다. 본원에서 사용된 바와 같이 "이중특이적"은 항원 결합 단백질이 2개의 상이한 항원-결합 특이성을 갖는 것을 나타낸다.
본원에서 사용된 바와 같이 용어 "단일특이적"은 동일한 항원의 동일한 에피토프를 결합시키는 하나 이상의 결합 부위 각각을 갖는 항원 결합 단백질을 나타낸다.
용어 "가"는 항원 결합 단백질에서 결합 부위의 명시된 수의 존재를 나타낸다. 예를 들어, 용어 "2가" "3가", "4가", "5가" 및 "6가"는 항원 결합 단백질에서 2개의 결합 부위, 3개의 결합 부위, 4개의 결합 부위, 5개의 결합 부위, 및 6개의 결합 부위의 존재를 나타낸다.
"항체 이펙터 기능"은 항체의 Fc 영역 (천연 서열 Fc 영역 또는 아미노산 서열 변이체 Fc 영역)에 기인하는 그들 생물학적 활성을 지칭하고, 항체 아이소타입으로 다양하다. 항체 이펙터 기능의 예는 하기를 포함한다: C1q 결합 및 보체 의존적 세포독성; Fc 수용체 결합; 항체-의존적 세포-매개된 세포독성 (ADCC); 식균작용; 세포 표면 수용체 (예를 들면, B 세포 수용체)의 하향 조절; 및 B 세포 활성화. "보체 의존적 세포독성" 또는 "CDC"는 보체의 존재 하에서 표적 세포의 용해를 지칭한다. 고전적 보체 경로의 활성화는 보체 시스템의 제 1 성분 (C1q)의 그들의 동족 항원에 결합되는 (적당한 서브클래스의) 항체에 대한 결합에 의해 개시된다. "항체-의존적 세포-매개된 세포독성" 또는 ADCC는 특정한 세포독성 세포 (예를 들면, 자연 살해 (NK) 세포, 중성구 및 대식세포)에 존재하는 Fc 수용체 (FcR)에 결합되어 있는 분비된 Ig가 이들 세포독성 이펙터 세포를 항원-보유 표적 세포에 특이적으로 결합시키고 후속으로 표적 세포를 세포독소로 사멸시키는 세포독성의 한 형태를 지칭한다.
본원에서 용어 "Fc 영역" 또는 "단편 결정화가능 영역"은, 천연-서열 Fc 영역 및 변이체 Fc 영역을 포함하는, 면역글로불린 중쇄의 C-말단 영역을 정의하는데 사용된다. 본원에서 기재된 항체에서 사용하기 위한 적합한 천연-서열 Fc 영역은 인간 IgG1, IgG2 (IgG2A, IgG2B), IgG3 및 IgG4를 포함한다.
"결합 친화성"은 일반적으로 분자 (예를 들면, 항체)의 단일 결합 부위와 이의 결합 파트너 (예를 들면, 항원) 사이의 비-공유 상호작용의 총계의 강도를 지칭한다. 달리 명시되지 않는 한, 본원에서 사용된 바와 같이, "결합 친화성"은 결합 쌍의 구성원 사이의 1:1 상호작용을 반영하는 고유 결합 친화성을 지칭한다. 결합 친화성은 Kd, Koff, Kon, 또는 Ka로 표시될 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 평형 해리 상수 "KD" 또는 "Kd"는 특정 항체-항원 상호작용의 해리 상수를 지칭하고, 평형에서 항체 분자의 용액에 존재하는 모든 항체-결합 도메인의 이분의 일을 차지하는데 필요한 항원의 농도를 기재하고, M의 단위로 표현된다. KD의 측정은 모든 결합 제제가 용액내인 것을 전제한다. 해리 상수 (KD 또는 Kd)는 항원에 대한 항체의 친화성을 나타내는 지표로서 사용된다. 예를 들어, 쉬운 분석은 다양한 마커 제제들로 마킹된 항체를 이용하는 스캐차드(Scatchard) 방법에 의해, 뿐만 아니라 키트에 부착된 사용자의 매뉴얼 및 실험 작동 방법에 따른, 일반의약품, 측정 키트 이용에 의해 가능하다. 이들 방법을 사용하여 유래될 수 있는 KD 값은 M (Mols)의 단위로 표현된다.
펩티드, 폴리펩티드 또는 항체 서열에 대하여 "퍼센트 (%) 아미노산 서열 동일성" 및 "상동성"은, 최대 퍼센트 서열 동일성을 달성하기 위해, 필요하면, 서열 정렬 및 갭 도입 후, 그리고 서열 동일성의 일부로서 임의의 보존적 치환 고려 없이, 특이적 펩티드 또는 폴리펩티드 서열에서 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열에서 아미노산 잔기의 백분율로서 정의된다. 퍼센트 아미노산 서열 동일성의 결정 목적을 위한 정렬은 당업계에서 기술 내에 있는 다양한 방식으로, 예를 들어, 공공연하게 이용가능한 컴퓨터 소프트웨어 예컨대 BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 MEGALIGNTM (DNATAR) 소프트웨어를 사용하여 달성될 수 있다. 당업계에서 숙련가는, 비교될 서열의 전장에 걸쳐 최대 정렬을 달성하는데 필요한 임의의 알고리즘을 비롯하여 정렬 측정을 위한 적당한 파라미터를 결정할 수 있다.
본 발명은 (이후 "인간화 항-PD-L1×CD47 bsAb"로 지칭되는) PD-L1에 특이적으로 결합하는 제1 인간화 단일 도메인 항체(제1 hsdAb) 또는 이의 항원-결합 단편 (항-PD-L1 hsdAb); 및 CD47에 특이적으로 결합하는 제2 인간화 단일 도메인 항체(제2 hsdAb) 또는 이의 항원-결합 단편(항-CD47 hsdAb)을 포함하는, PD-L1 및 CD47에 이중특이적으로 결합하는 이중특이적 항체, 예컨대, 인간화 항-PD-L1×CD47 bsAb, 구체적으로 항-PD-L1 hsdAb 및 항-CD47 hsdAb가 융합된 이중특이적 인간화 단일 도메인 항체, 인간화 항-PD-L1×CD47 중쇄-단독 항체(HCAb) (예를 들면, 인간 면역글로불린 G (IgG)의 결정성 단편(Fc 단편)이 항-PD-L1 hsdAb 및/또는 항-CD47 hsdAb에 융합된 인간화 항-PD-L1×CD47 bsAb-Fc 융합 단백질), 그리고 이의 제조 및 용도에 관한 것이다.
이에, 본 발명은 인간화 항-PD-L1×CD47 bsAb를 포함하는 PD-L1 및 CD47에 이중특이적으로 결합하는 이중특이적 항체를 제공한다.
본 발명에서, 상기 인간화 항-PD-L1×CD47 bsAb를 포함하는 PD-L1 및 CD47에 이중특이적으로 결합하는 이중특이적 항체는 제1 항원 결합 부분으로 PD-L1에 특이적으로 결합하는 제1 인간화 단일 도메인 항체(제1 hsdAb) 또는 이의 항원-결합 단편(이하 "항-PD-L1 hsdAb"라 함); 및 제2 항원 결합 부분으로 CD47에 특이적으로 결합하는 제2 인간화 단일 도메인 항체(제2 hsdAb) 또는 이의 항원-결합 단편(이하 "항-CD47 hsdAb"라 함)이 융합된 인간화 항-PD-L1×CD47 bsAb일 수 있다.
본 발명에서, 상기 항-PD-L1 hsdAb는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 CDR1; 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 CDR2; 및 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 CDR3를 포함한다.
또한, 상기 항-CD47 hsdAb는 서열번호 9로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 CDR1; 서열번호 10으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 CDR2; 및 서열번호 11로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 CDR3를 포함한다.
상기 CDR 서열은 표 6 및 표 12에서 제공된다.
본 발명에서, 상기 인간화 항-PD-L1×CD47 bsAb는 인간 또는 인간화된 중쇄 도메인 프레임워크 영역을 포함한다. 상기 인간 또는 인간화된 중쇄 도메인 프레임워크는 인간 면역글로불린 프레임워크로부터 유도된 중쇄 가변 도메인(VH) 프레임워크의 아미노산 서열을 포함하는 프레임워크이다. 인간 면역글로불린 프레임워크로부터 유도된 중쇄 가변 도메인(VH) 프레임워크는 이의 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있거나 아미노산 서열 변화를 함유할 수 있다. 일부 실시형태에서, 아미노산 변화 수는 10개 이하, 9개 이하, 8개 이하, 7개 이하, 6개 이하, 5개 이하, 4개 이하, 3개 이하, 또는 2개 이하이다.
구체적으로, 서열번호 16 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 가지는 중쇄 가변 도메인 프레임워크 서열을 포함할 수 있다. 또는 서열번호 17 서열과 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 가지는 중쇄 가변 도메인 프레임워크 서열을 포함할 수 있다.
상기 서열번호 16 또는 서열번호 17의 서열과 100%의 서열 동일성을 가지는 중쇄 가변 도메인 프레임워크(FR) 서열은 표 1 내지 표 4에서 제공된다.
| No | FR1 | 서열번호 |
| 1 | EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS | 19 |
| 2 | EVQLVESGGGLVQPGGSLNLSCAVS | 23 |
| No | FR2 | 서열번호 |
| 1 | MSWVRQAPGKGLEWVSD | 20 |
| 2 | VGWARQVPGKGLERVSR | 24 |
| No | FR3 | 서열번호 |
| 1 | DYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLKPEDTAVYYC | 21 |
| 2 | EYLDAVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKTEDTAVYYC | 25 |
| No | FR4 | 서열번호 |
| 1 | RGQGTQVTVSS | 22 |
| 2 | WGQGTQVTVSS | 26 |
구체적으로, 상기 항-PD-L1 hsdAb는 하기 FR1, FR2, FR3 및 FR4를 포함할 수 있다:서열번호 19 및 23 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 FR1;
서열번호 20 및 24 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 FR2;
서열번호 21 및 25 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 FR3; 및
서열번호 22 및 26 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 FR4.
보다 구체적으로, 상기 항-PD-L1 hsdAb는 하기 FR1, FR2, FR3 및 FR4를 포함할 수 있다:
(1) 서열번호 19로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 FR1;
서열번호 20으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 FR2;
서열번호 21로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 FR3; 및
서열번호 22로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 FR4; 또는
(2) 서열번호 23으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 FR1;
서열번호 24로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 FR2;
서열번호 25로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 FR3; 및
서열번호 26으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 FR4.
보다 더 구체적으로, 상기 항-PD-L1 hsdAb는 하기 FR1, FR2, FR3 및 FR4를 포함할 수 있다:
서열번호 19로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 FR1;
서열번호 20으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 FR2;
서열번호 21로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 FR3; 및
서열번호 22로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 FR4.
또한, 상기 항-CD47 hsdAb는 하기 FR1, FR2, FR3 및 FR4를 포함할 수 있다:
서열번호 19 및 23 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 FR1;
서열번호 20 및 24 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 FR2;
서열번호 21 및 25 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 FR3; 및
서열번호 22 및 26 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 FR4.
보다 구체적으로, 상기 항-CD47 hsdAb는 하기 FR1, FR2, FR3 및 FR4를 포함할 수 있다:
(1) 서열번호 19로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 FR1;
서열번호 20으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 FR2;
서열번호 21로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 FR3; 및
서열번호 22로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 FR4; 또는
(2) 서열번호 23으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 FR1;
서열번호 24로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 FR2;
서열번호 25로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 FR3; 및
서열번호 26으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 FR4.
보다 더 구체적으로, 상기 항-CD47 hsdAb는 하기 FR1, FR2, FR3 및 FR4를 포함할 수 있다:
서열번호 23으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 FR1;
서열번호 24로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 FR2;
서열번호 25로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 FR3; 및
서열번호 26으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 FR4.
본 발명에서, 상기 항-PD-L1 hsdAb는 PD-L1의 에피토프에 결합하고, 항-CD47 hsdAb는 CD47의 에피토프에 결합한다.
또한, 상기 인간화 항-PD-L1×CD47 bsAb의 PD-L1 및 CD47 각각과 결합의 KD는 10-6 M 내지 10-12 M, 10-6 M 내지 10-11 M, 10-6 M 내지 10-10 M, 10-6 M 내지 10-9 M, 10-7 M 내지 10-9 M, 또는 10-8 M 내지 10-9 M일 수 있다.
또한, 상기 인간화 항-PD-L1×CD47 bsAb의 EC50은 FACS 분석에서 500 nM 미만일 수 있고, 구체적으로 0.01 nM 내지 500 nM, 0.01 nM 내지 400 nM, 0.01 nM 내지 300 nM, 0.01 nM 내지 200 nM, 0.01 nM 내지 100 nM, 0.01 내지 50 nM, 0.01 내지 10 nM, 0.1 nM 내지 500 nM, 0.1 nM 내지 400 nM, 0.1 nM 내지 300 nM, 0.1 nM 내지 200 nM, 0.1 nM 내지 100 nM, 0.1 내지 50 nM, 0.1 내지 10 nM, 1 nM 내지 500 nM, 1 nM 내지 400 nM, 1 nM 내지 300 nM, 1 nM 내지 200 nM, 1 nM 내지 100 nM, 1 내지 50 nM 또는 1 내지 10 nM일 수 있다.
본 발명에서, 상기 인간화 항-PD-L1×CD47 bsAb는 PD-L1 및 CD47 각각의 에피토프에 대하여 가수의 임의의 적합한 수를 가질 수 있다. 구체적으로, 인간화 항-PD-L1×CD47 bsAb는 PD-L1 및 CD47 각각에 대하여 2가, 3가, 4가, 5가, 6가, 또는 더 높은 가수일 수 있다. 예를 들면, P. Chames and D. Baty, Chapter 6. Bispecific Single Domain Antibodies, Springer-Verlag Berlin Heidelberg, 2011을 참고한다.
또한, 상기 인간화 항-PD-L1×CD47 bsAb는 항-PD-L1 hsdAb 및 항-CD47 hsdAb가 펩티드 결합을 통해 직접적으로 또는 펩티드 링커를 통해 간접적으로 융합될 수 있다. 상기 펩티드 링커의 길이, 가요성 정도 및/또는 다른 특성은, 하나 이상의 특정 항원 또는 에피토프에 대하여 비제한적으로 친화성, 특이성 또는 결합능을 포함하는, 특성에서 일부 영향을 미칠 수 있다. 예를 들어, 더 긴 펩티드 링커는 2개의 인접한 도메인이 서로를 입체적으로 방해하지 않는다는 것을 보장하도록 선택될 수 있다. 일부 구현예에서, 펩티드 링커는 인접한 도메인이 서로에 대하여 자유롭게 움직이도록 가요성 잔기 (예컨대 글리신 및 세린)을 포함한다. 예를 들어, 글리신-세린 더블릿은 적합한 펩티드 링커일 수 있다. 또한, 펩티드 링커는 임의의 적합한 길이일 수 있고, 예컨대 적어도 약 임의의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100개 또는 더 많은 아미노산 길이일 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 펩티드 링커는 서열번호 27 내지 서열번호 29 중 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 펩티드 링커일 수 있다.
또한, 상기 펩티드 링커는 자연 발생 서열, 또는 비-자연 발생 서열을 가질 수 있다.
일부 구현예에서, 상기 인간화 항-PD-L1×CD47 bsAb는 PD-L1에 대하여 2가, CD27에 대하여 1가일 수 있고, 2가의 항-PD-L1 hsdAb는 서열번호 16으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 1가의 항-PD-L1 hsdAb가 직접적으로 또는 또는 펩티드 링커를 통해 간접적으로 융합될 수 있다. 또한, 상기 인간화 항-PD-L1×CD47 bsAb는 서열번호 15로 표시되는 아미노산 서열로 이루어질 수 있다.
본 발명에 따른 단일 도메인 항체(sdAb)는 마우스, 랫트, 인간, 낙타, 라마, 칠성장어, 어류, 상어, 염소, 토끼, 및 소과를 비제한적으로 포함하는 임의의 종으로부터 유래될 수 있다. 또한 낙타과 이외 종으로부터의 자연 발생 sdAb 분자를 포함할 수 있다.
또한, sdAb는 경쇄가 결여된 중쇄 항체로서 공지된 자연 발생 단일 도메인 항원 결합 분자로부터 유래된다. 그와 같은 단일 도메인 분자는, 예를 들어 WO 94/04678 및 Hamers-Casterman, et al., (1993) Nature 363:446-448에서 개시된다. 경쇄가 자연적으로 결여된 중쇄 분자로부터 유래된 가변 도메인은 본원에서 VHH로서 공지되어 이것을 4개의 쇄 면역글로불린의 종래의 VH와 구별시킨다. 그와 같은 VHH 분자는 낙타과 종, 예를 들어, 낙타, 라마, 비쿠냐, 단봉 낙타, 알파카 및 과나코에서 생성된 항체로부터 유래될 수 있다. 낙타과 이외의 다른 종은 경쇄가 자연적으로 결여된 중쇄 분자를 생산할 수 있고, 그와 같은 VHH는 본원의 범위 내이다.
본 발명에 따른 인간화 단일 도메인 항체(hsdAb)는 인간화 항체로 전형적으로, 비-인간 항체는 인간화되어 인간에 대한 면역원성을 감소시키는 반면, 친계 비-인간 항체의 특이성 및 친화성을 유지시킨다. 일반적으로, 인간화된 항체는 HVR, 예를 들면, CDR (또는 이의 부분)이 비-인간 항체로부터 유래되고, FR (또는 이의 부분)이 인간 항체 서열로부터 유래되는 하나 이상의 가변 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 인간화 단일 도메인 항체는 비-인간 단일 도메인 항체로부터 유래된 CDR (예를 들면, 낙타과 종, 예컨대 라마로부터 유래된 CDR) 및 인간 항체 서열로부터 유래된 중쇄 FR을 포함한다. 또한, 일부 구현예에서, 인간화된 항체에 있어서 일부 FR 잔기는, 예를 들면, 항체 특이성 또는 친화성을 회복 또는 개선하기 위해, 비-인간 항체 (예를 들면, HVR 잔기가 유래되는 항체)로부터 상응하는 잔기로 치환된다.
본 발명에서, 상기 인간화 항-PD-L1×CD47 bsAb를 포함하는 PD-L1 및 CD47에 이중특이적으로 결합하는 이중특이적 항체는 인간화 항-PD-L1×CD47 HCAb 또는 이의 항원-결합 단편일 수 있다.
구체적으로, 인간화 항-PD-L1×CD47 HCAb는 본원에 기재된 인간화 항-PD-L1×CD47 bsAb가 하나 이상의 CH2 및/또는 CH3 도메인, 예를 들면 Fc 단편에 융합된 것일 수 있다. 또한, 본원에 기재된 항-PD-L1 hsdAb 및/또는 항-CD47 hsdAb에 하나 이상의 CH2 및/또는 CH3 도메인, 예를 들면 Fc 단편에 융합된 것일 수 있다.
상기 CH2 및/또는 CH3 도메인은 면역글로불린으로부터 유래된다. 상기 면역글로불린은 IgA, IgD, IgE, IgG 또는 IgM일 수 있고, 구체적으로 IgG 일 수 있다. 일부 구현예에서, 인간화 항-PD-L1×CD47 HCAb는 IgG, 예컨대, IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4의 Fc 단편을 포함할 수 있고, 상기 Fc 단편은 인간 Fc, 예컨대 인간 IgG1 (hIgG1) Fc, hIgG2 Fc, hIgG3 Fc 또는 hIgG4 Fc일 수 있다.
상기 인간화 항-PD-L1×CD47 HCAb는 단량체성 또는 다량체성일 수 있다. 또한, 다량체성일 경우, 예를 들면, 본원에서 기재된 항-PD-L1 hsdAb 및 항-CD47 hsdAb의 2개 이상의 카피를 포함하는, 이중특이적 및 다가 (예를 들면, 2가, 3가, 4가, 또는 더 높은 가수)일 수 있다.
본 발명에서, 상기 인간화 항-PD-L1×CD47 bsAb, 항-PD-L1 hsdAb 또는 항-CD47 hsdAb는 CH2 및/또는 CH3 도메인, 구체적으로 Fc 단편은 펩티드 링커를 통해 융합될 수 있다. 상기 펩티드 링커의 길이, 가요성 정도 및/또는 다른 특성은, 하나 이상의 특정 항원 또는 에피토프에 대하여 비제한적으로 친화성, 특이성 또는 결합능을 포함하는, 특성에서 일부 영향을 미칠 수 있다. 예를 들어, 더 긴 펩티드 링커는 2개의 인접한 도메인이 서로를 입체적으로 방해하지 않는다는 것을 보장하도록 선택될 수 있다. 일부 구현예에서, 펩티드 링커는 인접한 도메인이 서로에 대하여 자유롭게 움직이도록 가요성 잔기 (예컨대 글리신 및 세린)을 포함한다. 예를 들어, 글리신-세린 더블릿은 적합한 펩티드 링커일 수 있다. 또한, 펩티드 링커는 임의의 적합한 길이일 수 있고, 예컨대 적어도 약 임의의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100개 또는 더 많은 아미노산 길이일 수 있다.
또한, 상기 펩티드 링커는 자연 발생 서열, 또는 비-자연 발생 서열을 가질 수 있다. 예를 들어, 중쇄-단독 항체의 힌지 영역으로부터 유래된 서열이 링커로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 특허 WO 1996/34103를 참고한다. 일부 구현예에서, 상기 펩티드 링커는 hIgG1 힌지, hIgG2 힌지, hIgG3 힌지, hIgG4 힌지 또는 이들의 변이체일 수 있다. 또는 서열번호 30의 아미노산 서열로 이루어진 펩티드 링커일 수 있다.
본 발명에서, 상기 인간화 항-PD-L1×CD47 HCAb는 서열번호 18로 표시되는 아미노산 서열, 또는 상기 아미노산 서열에 적어도 80%(예컨대 적어도 임의의 80%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%) 서열 상동성을 갖는 이의 변이체를 포함할 수 있다.
본 발명에서, 상기 인간화 항-PD-L1×CD47 bsAb를 포함하는 PD-L1 및 CD47에 이중특이적으로 결합하는 이중특이적 항체는 항-PD-L1 hsdAb 및/또는 항-CD47 hsdAb의 C-말단이 CH1 및 Cκ 도메인의 N-말단에 융합된 이중특이적 Fab-유사 항체 단편(bispecific Fab-like antibody fragment, bsFab)일 수 있다.
상기 CH1 및 Cκ 도메인인은 면역글로불린으로부터 유래된다. 상기 면역글로불린은 IgA, IgD, IgE, IgG 또는 IgM일 수 있고, 구체적으로 IgG 일 수 있다. 상기 IgG는 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4일수 있고, 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4일 수 있다.
본 발명에 따른 bsFab 및 이의 제조 기술은 P. Chames and D. Baty, Chapter 6. Bispecific Single Domain Antibodies, Springer-Verlag Berlin Heidelberg, 2011을 참고한다.
본 발명에서, 상기 인간화 항-PD-L1×CD47 bsAb를 포함하는 PD-L1 및 CD47에 이중특이적으로 결합하는 이중특이적 항체는 아미노산 서열 변이체를 포함한다. 항체의 아미노산 서열 변이체는 항체를 인코딩하는 핵산 서열에의 적당한 변형 도입에 의해, 또는 펩티드 합성에 의해 제조될 수 있다. 그와 같은 변형은, 예를 들어, 항체의 아미노산 서열 내에서 잔기의 결실, 및/또는 삽입 및/또는 치환을 포함한다. 결실, 삽입, 및 치환의 임의의 조합은 최종 작제물에 이르도록 만들어질 수 있고, 단 최종 작제물은 원하는 특징, 예를 들면, 항원-결합을 보유한다. 일부 구현예에서, 치환, 삽입, 또는 결실은 그와 같은 변경이 항원을 결합시키는 항체의 능력을 실질적으로 감소시키지 않는 한 하나 이상의 초가변 영역(HVR) 내에서 발생할 수 있다. 예를 들어, 결합 친화성을 실질적으로 감소시키지 않는 보존적 변경은 HVR에서 실시될 수 있다. 그와 같은 변경은 HVR "핫스팟" 또는 CDR의 외부일 수 있다.
또한, 상기 아미노산 치환은 적어도 1개(예컨대, 임의의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개)의 아미노산 치환일 수 있다. 또한, 상기 적어도 1개의 아미노산 치환은 보존적 치환일 수 있고, 비-유전자 코딩 아미노산 또는 합성 아미노산으로의 치환일 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 아미노산 치환은 CDR 영역에 있을 수 있고, CDR1, CDR2 및/또는 CDR3에서 적어도 1개(예컨대, 임의의 1, 2, 3, 또는 4개)의 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 아미노산 치환은 FR 영역에 있을 수 있고, FR1, FR2, FR3 및/또는 FR4에서 적어도 1개(예컨대, 임의의 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개)의 아미노산 치환을 포함할 수 있다.
또한, 상기 아미노산 서열 삽입은 1개의 잔기부터 100개 이상의 잔기를 함유하는 폴리펩티드까지 길이 범위의 아미노- 및/또는 카복실-말단 융합, 뿐만 아니라 단일 또는 다중 아미노산 잔기의 서열내 삽입을 포함한다. 말단 삽입의 예는 N-말단 메티오닐 잔기를 가진 항체를 포함한다. 항체 분자의 다른 삽입 변이체는 항체의 혈청 반감기를 증가시키는 폴리펩티드 또는 (예를 들면, ADEPT의 경우) 효소에 대한 항체의 N- 또는 C-말단에의 융합을 포함할 수 있다.
또한, 하나 이상의 아미노산 변형은 본원에서 제공된 인간화 항-PD-L1×CD47 bsAb를 포함하는 PD-L1 및 CD47에 이중특이적으로 결합하는 이중특이적 항체 (예를 들면, 인간화 항-PD-L1×CD47 HCAb)의 Fc 영역에 도입되어, 그것에 의해 Fc 영역 변이체를 생성할 수 있다. Fc 영역 변이체는 하나 이상의 아미노산 위치에서 아미노산 변형 (예를 들면 치환)을 포함하는 인간 Fc 영역 서열 (예를 들면, 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 Fc)을 포함할 수 있다.
본 발명에서, 상기 인간화 항-PD-L1×CD47 bsAb를 포함하는 PD-L1 및 CD47에 이중특이적으로 결합하는 이중특이적 항체는 진단 모이어티 또는 생체적합성 조절제와 연결되거나, 그에 융합되거나, 그에 접합되거나 (예를 들어, 공유 또는 비-공유), 또는 달리 그와 회합될 수 있다. 예를 들어, 펩티드 또는 폴리펩티드(예를 들어, 생물독소, 바이오마커, 정제 태그 등), 단백질, 중합체, 핵산 분자, 소분자, 모방제, 합성 약물, 무기 분자, 유기 분자 또는 방사성동위원소가 접합 또는 회합될 수 있다.
또한, 상기 인간화 항-PD-L1×CD47 bsAb를 포함하는 PD-L1 및 CD47에 이중특이적으로 결합하는 이중특이적 항체는 생물학적 분자(예를 들어, 펩티드 또는 뉴클레오티드), 소분자, 형광단, 또는 방사성동위원소일 수 있는 진단제 또는 검출가능한 작용제, 마커 또는 리포터에 접합 또는 회합될 수 있다. 표지된 조정자는 PD-L1 및/또는 CD47과 관련된 질환, 예컨대 암의 발생 또는 진행을 모니터링하는데, 또는 본원에 개시된 항체를 포함하는 특정한 요법의 효능을 결정하거나 (즉 테라그노시스), 또는 향후의 치료 과정을 결정하는 임상 시험 절차의 일부로서 유용할 수 있다. 이러한 마커 또는 리포터는 또한 본원에 개시된 항체를 정제하는데 유용할 수 있다.
또한, 상기 인간화 항-PD-L1×CD47 bsAb를 포함하는 PD-L1 및 CD47에 이중특이적으로 결합하는 이중특이적 항체는 면역조정제, 사이토카인, 세포독성제, 화학요법제, 진단제, 항바이러스제, 항미생물제 또는 약물에 접합될 수 있다. 이에, 본 발명은 면역조정제, 사이토카인, 세포독성제, 화학요법제, 진단제, 항바이러스제, 항미생물제 또는 약물에 접합된 본 발명에 따른 인간화 항-PD-L1×CD47 bsAb를 포함하는 PD-L1 및 CD47에 이중특이적으로 결합하는 이중특이적 항체를 포함하는 항체 접합체을 제공한다.
또한, 본 발명은 본원에 개시된 인간화 항-PD-L1×CD47 bsAb를 포함하는 PD-L1 및 CD47에 이중특이적으로 결합하는 이중특이적 항체를 암호화하는 핵산 분자, 상기 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터, 상기 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 제공한다.
또한, 본 발명은 (a) 이중특이적 항체가 발현되도록 하는 조건 하에 상기 숙주 세포를 배양하는 단계; 및 (b) 발현된 이중특이적 항체를 회수하는 단계를 포함하는, 이중특이적 항체를 생산하는 방법을 제공한다.
본 발명에서, 본원에 개시된 인간화 항-PD-L1×CD47 bsAb를 포함하는 PD-L1 및 CD47에 이중특이적으로 결합하는 이중특이적 항체를 코딩하는 DNA는 통상적인 절차를 사용하여 (예를 들어, 항체 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용함으로써) 용이하게 단리되고 서열분석될 수 있다. 단리되고 서브클로닝된 하이브리도마 세포 (또는 파지 또는 효모 유래 콜로니)는 이러한 DNA의 바람직한 공급원으로서의 역할을 할 수 있다. 보다 특히, 단리된 DNA (변형될 수 있음)는 항체의 제조를 위해 불변 및 가변 영역 서열을 클로닝하는데 사용될 수 있다.
하나의 예시적인 방법은 선택된 세포로부터의 RNA의 추출, cDNA로의 전환, 및 항체 특이적 프라이머를 사용한 PCR에 의한 증폭을 수반한다. 적합한 프라이머는 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고, 본원에 예시된 바와 같이 많은 상업적 공급원으로부터 용이하게 이용가능하다. 조합 라이브러리의 스크리닝에 의해 단리된 재조합 인간 또는 비-인간 항체를 발현시키기 위해, 항체를 코딩하는 DNA를 재조합 발현 벡터 내로 클로닝하고, 포유동물 세포, 곤충 세포, 식물 세포, 효모, 및 박테리아를 포함한 숙주 세포 내에 도입된다. 일부 구현예에서, 달리 목적하는 구축물을 생산하지 않는 원숭이 COS 세포, NS0 세포, 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포 또는 골수종 세포 내로 조정자가 도입되어 그에 의해 발현된다.
본 발명에서, 상기 핵산 분자는 벡터 내에, 적절한 경우에 핵산의 발현을 제어하는 프로모터와 함께 존재한다. 상기 벡터는 그의 가장 일반적인 의미로 사용되고, 핵산이 예를 들어 원핵 및/또는 진핵 세포 내로 도입되고 적절한 경우에 게놈 내로 통합될 수 있게 하는, 핵산을 위한 임의의 중간 비히클을 포함한다. 이러한 종류의 벡터는 바람직하게는 세포 내에서 복제되고/거나 발현된다. 벡터는 플라스미드, 파지미드, 박테리오파지 또는 바이러스 게놈을 포함할 수 있다. 상기 플라스미드는 일반적으로 염색체 DNA와 독립적으로 복제할 수 있는 염색체외 유전 물질 구축물, 통상적으로 원형 DNA 듀플렉스에 관한 것이다.
관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지된 방법을 사용하여 항체 코딩 서열 및 적절한 전사 및 번역 제어 신호를 포함하는 발현 벡터를 구축할 수 있다. 이들 방법은, 예를 들어, 시험관내 재조합 DNA 기술, 합성 기술, 및 생체내 유전자 재조합을 포함한다.
본 발명에서, 상기 숙주 세포 또는 재조합 숙주 세포는 발현 벡터가 도입된 세포를 의미한다. 재조합 숙주 세포 및 숙주 세포는 특정한 대상 세포뿐만 아니라 이러한 세포의 자손도 의미한다. 돌연변이 또는 환경적 영향으로 인해 후속 세대에서 특정 변형이 발생할 수 있기 때문에, 이러한 자손은 사실상 모세포와 동일하지 않을 수 있지만, 여전히 본원에 사용된 용어 숙주 세포의 범주 내에 포함된다. 이러한 세포는 상기 기재된 바와 같은 벡터를 포함할 수 있다.
또한, 관련 기술분야에서 인식되는 분자 생물학 기술 및 현재의 단백질 발현 방법론을 사용하여, 본원에 개시된 항체의 실질적인 양이 생산될 수 있다. 보다 구체적으로, 이러한 항체를 코딩하는 핵산 분자는 다양한 유형의 숙주 세포를 포함한 널리 공지되고 상업적으로 입수가능한 단백질 생산 시스템 내로 통합되어, 전임상, 임상, 또는 상업적인 양의 목적하는 제약 제품을 제공할 수 있다. 일부 구현예에서, 항체를 코딩하는 핵산 분자는 선택된 숙주 세포 내로의 효율적인 통합 및 후속적인 항체의 높은 발현 수준을 제공하는 벡터 또는 발현 벡터 내로 조작된다.
바람직하게는 본원에 개시된 항체를 코딩하는 핵산 분자 및 이들 핵산 분자를 포함하는 벡터는 적합한 포유동물, 식물, 박테리아 또는 효모 숙주 세포의 형질감염에 사용될 수 있지만, 원핵 시스템이 또한 사용될 수 있다. 형질감염은 폴리뉴클레오티드를 숙주 세포 내로 도입하기 위한 임의의 공지된 방법에 의해 이루어질 수 있다. 이종 폴리뉴클레오티드를 포유동물 세포 내로 도입하는 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고, 덱스트란-매개 형질감염, 인산칼슘 침전, 폴리브렌-매개 형질감염, 원형질체 융합, 전기천공, 리포솜 내 폴리뉴클레오티드(들)의 캡슐화, 및 DNA의 핵 내로의 직접 미세주사를 포함한다. 또한, 핵산 분자를 바이러스 벡터에 의해 포유동물 세포 내로 도입할 수 있다. 포유동물 세포를 형질전환하는 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 식물 세포를 형질전환하는 방법이 또한 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고, 예를 들어, 아그로박테리움-매개 형질전환, 바이오리스틱 형질전환, 직접 주사, 전기천공, 및 바이러스 형질전환을 포함한다. 박테리아 및 효모 세포를 형질전환하는 방법이 또한 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다.
많은 상업적으로 입수가능한 다양한 숙주-발현 벡터 시스템이 본원에 개시된 항체를 발현시키는데 사용될 수 있다. 이러한 숙주-발현 시스템은 관심 코딩 서열이 발현되고 후속해서 정제될 수 있는 비히클을 나타낼 뿐만 아니라, 적절한 뉴클레오티드 코딩 서열로 형질전환되거나 형질감염된 경우에 본 발명의 분자를 계내 발현할 수 있는 세포를 나타낸다. 이러한 시스템은 조정자 코딩 서열을 함유하는 재조합 박테리오파지 DNA, 플라스미드 DNA 또는 코스미드 DNA 발현 벡터로 형질전환된 미생물, 예컨대 박테리아 (예를 들어, 이. 콜라이(E. coli), 비. 서브틸리스(B. subtilis), 스트렙토미세스(streptomyces)); 조정자 코딩 서열을 함유하는 재조합 효모 발현 벡터로 형질감염된 효모 (예를 들어, 사카로미세스(Saccharomyces), 피키아(Pichia)); 조정자 코딩 서열을 함유하는 재조합 바이러스 발현 벡터 (예를 들어, 바큘로바이러스)로 감염된 곤충 세포 시스템; 재조합 바이러스 발현 벡터 (예를 들어, 콜리플라워 모자이크 바이러스, CaMV; 담배 모자이크 바이러스, TMV)로 감염되거나 또는 조정자 코딩 서열을 함유하는 재조합 플라스미드 발현 벡터 (예를 들어, Ti 플라스미드)로 형질감염된 식물 세포 시스템 (예를 들어, 니코티아나(Nicotiana), 아라비돕시스(Arabidopsis), 좀개구리밥, 옥수수, 밀, 감자 등); 또는 포유동물 세포의 게놈으로부터 유래되거나 (예를 들어, 메탈로티오네인 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 (예를 들어, 아데노바이러스 후기 프로모터; 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터) 프로모터를 함유하는 재조합 발현 구축물을 보유하는 포유동물 세포 시스템 (예를 들어, COS, CHO, BHK, 293, 3T3 세포)을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
본원에 개시된 항체가 재조합 발현 또는 본원에 개시된 다른 기술 중 어느 하나에 의해 생산되었으면, 이는 면역글로불린의 정제에 대해 관련 기술분야에 공지된 임의의 방법에 의해, 또는 보다 일반적으로 단백질의 정제에 대한 임의의 다른 표준 기술에 의해 정제될 수 있다.
또한, 본 발명은 본원에 개시된 인간화 항-PD-L1×CD47 bsAb를 포함하는 PD-L1 및 CD47에 이중특이적으로 결합하는 이중특이적 항체, 또는 상기 이중특이적 항체를 포함하는 항체 접합체를 유효성분으로 함유하는, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 약학적으로 유효량의 본원에 개시된 본원에 개시된 인간화 항-PD-L1×CD47 bsAb를 포함하는 PD-L1 및 CD47에 이중특이적으로 결합하는 이중특이적 항체, 또는 상기 이중특이적 항체를 포함하는 항체 접합체를 포함하는 약학적 조성물을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 암의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 암의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 본원에 개시된 본원에 개시된 인간화 항-PD-L1×CD47 bsAb를 포함하는 PD-L1 및 CD47에 이중특이적으로 결합하는 이중특이적 항체, 또는 상기 이중특이적 항체를 포함하는 항체 접합체의 용도를 제공한다.
본 발명에서, 상기 암은 면역관문 단백질의 활성을 차단하여 T 세포를 활성화시키는 것이 필요한 암으로, 예컨대 흑색종, 폐암, 간암, 교세포종, 난소암, 대장암, 두경부암, 방광암, 신장세포암, 위암, 유방암, 전이암, 전립선암, 췌장암, 비호지킨 림프종, 호지킨 림프종, 다발성 골수종, 백혈병, 림프종, 골수이형성증후군, 급성 림프모구성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 고립성 골수종 및 재생불량성 빈혈로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서, 상기 본원에 개시된 인간화 항-PD-L1×CD47 bsAb를 포함하는 PD-L1 및 CD47에 이중특이적으로 결합하는 이중특이적 항체, 또는 상기 이중특이적 항체를 포함하는 항체 접합체에 대한 내용은 전술한 바와 동일하므로, 구체적은 설명은 상기 내용을 원용하고, 이하에서는 약학적 조성물 및 용도의 특유한 구성에 대해서만 설명하도록 한다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 본원에 기재된 1종 이상 (예를 들어, 2 또는 3종)의 본원에 개시된 인간화 항-PD-L1×CD47 bsAb를 포함하는 PD-L1 및 CD47에 이중특이적으로 결합하는 이중특이적 항체, 또는 상기 이중특이적 항체를 포함하는 항체 접합체를 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물을 개체, 구체적으로 암 환자에 투여함으로써, 암을 예방 또는 치료할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 약학적 조성물은 본원에 기재된 항체의 형태, 의도된 전달 방식, 및 수많은 다른 변수에 따라, 관련 기술분야에서 인식되는 기술을 사용하여 목적하는 바와 같이 제제화될 수 있다. 또한, 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고 투여를 용이하게 하거나 또는 전달을 위해 제약상 최적화된 제제로 활성 화합물을 가공하는 것을 보조하는 비교적 불활성 물질인 부형제 및 보조제를 포함하는 적합한 제약상 허용되는 담체를 함유하도록 제제화될 수 있다. 예를 들어, 비히클, 보조제, 및 희석제를 포함한 다양한 제약상 허용되는 담체는 수많은 상업적 공급원으로부터 용이하게 입수가능하다. 또한, 제약상 허용되는 보조 물질 분류, 예컨대 pH 조정제 및 완충제, 장성 조정제, 안정화제, 습윤제 등이 또한 입수가능하다. 특정의 비제한적 예시적인 담체는 염수, 완충 염수, 덱스트로스, 물, 글리세롤, 에탄올, 및 그의 조합을 포함한다.
또한, 본 발명에 따른 약학적 조성물은 경장, 비경구 또는 국소 투여를 위해 제제화될 수 있다. 사실상, 모든 3가지 유형의 제제를 동시에 사용하여 활성 성분의 전신 투여를 달성할 수 있다. 비경구 및 비-비경구 약물 전달을 위한 부형제 뿐만 아니라 제제가 관련 기술분야에 공지되어 있다. 비경구 투여에 적합한 제제는 수용성 형태의 활성 화합물, 예를 들어, 수용성 염의 수용액을 포함한다. 또한, 유성 주사 현탁액에 적절한 활성 화합물의 현탁액이 투여될 수 있다. 적합한 친지성 용매 또는 비히클은 지방 오일, 예를 들어, 참깨 오일, 또는 합성 지방산 에스테르, 예를 들어, 에틸 올레에이트 또는 트리글리세리드를 포함한다. 수성 주사 현탁액은 현탁액의 점도를 증가시키는 물질을 함유할 수 있고, 예를 들어, 소듐 카르복시메틸 셀룰로오스, 소르비톨, 및/또는 덱스트란을 포함한다. 임의로, 현탁액은 또한 안정화제를 함유할 수 있다. 또한 리포솜을 사용하여 세포로의 전달을 위해 작용제를 캡슐화할 수 있다.
경장 투여에 적합한 제제는 경질 또는 연질 젤라틴 캡슐, 환제, 코팅된 정제를 비롯한 정제, 엘릭시르, 현탁액, 시럽 또는 흡입제 및 그의 제어 방출 형태를 포함한다.
일반적으로, 본원에 개시된 항체는 이를 필요로 하는 대상체에게 경구, 정맥내, 동맥내, 피하, 비경구, 비강내, 근육내, 심장내, 뇌실내, 기관내, 협측, 직장, 복강내, 피내, 국소, 경피, 및 척추강내, 또는 달리 이식 또는 흡입에 의한 것을 포함하나 이에 제한되지는 않는 다양한 경로에 의해 생체내 투여될 수 있다. 투여의 적절한 제제 및 경로는 의도된 용도 및 치료 요법에 따라 선택될 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 암의 치료 또는 예방을 위한 약학적으로 유효량으로 투여된다. 상기 약학적으로 유효량은 의사 또는 다른 임상의에 의해 추구되는, 대상체에서 생물학적 또는 의학적 반응을 도출할 항체 또는 이를 포함하는 약학적 조성물의 양을 의미한다. 또한, 예방 및/또는 치료 효과를 갖는 요법의 양을 달성하기 위해 특정 빈도로 다중 용량의 항체 또는 이를 포함하는 약학적 조성물을 투여할 수 있다.
상기 약학적으로 유효량은 전형적으로 치료될 대상체의 체중, 그의 신체 상태, 치료될 상태의 광범위함, 및 치료될 대상체의 연령에 따라 좌우된다. 일반적으로, 본원에 개시된 항체는 용량당 약 10 ng/kg 체중 내지 약 100 mg/kg 체중 범위, 약 50 μg/kg 체중 내지 약 5 mg/kg 체중 범위, 약 100 μg/kg 체중 내지 약 10 mg/kg 체중 범위, 약 100 μg/kg 체중 내지 약 20 mg/kg 체중 범위, 0.5 mg/kg 체중 내지 약 20 mg/kg 체중 범위의 양으로 투여될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 항체는 적어도 약 100 μg/kg 체중, 적어도 약 250 μg/kg 체중, 적어도 약 750 μg/kg 체중, 적어도 약 3 mg/kg 체중, 적어도 약 5 mg/kg 체중, 또는 적어도 약 10 mg/kg 체중의 용량으로 투여될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명에 따른 약학적 조성물은 약 100 mg 내지 약 10,000 mg의 용량, 약 200 mg 내지 약 9,000 mg의 용량, 약 300 mg 내지 약 8,000 mg 용량, 약 400 mg 내지 7,000 mg 용량, 500 mg 내지 5,000 mg 용량으로 투여될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 통상적으로 환자에게 다수회 투여된다. 예시적인 치료 요법은 2주마다 1회, 1개월 1회, 또는 3 내지 6개월마다 1회 투여를 수반한다. 예를 들어, 환자는 사이클로서 4주마다, 예를 들어 28일마다 1회 항체를 (예를 들어, 정맥내 제제로서) 제공받을 수 있다. 투여 빈도는 환자에서의 항체의 약동학적 프로파일에 따라 조정될 수 있다. 예를 들어, 항체의 반감기는 2주 투여 빈도를 필요로 할 수 있다. 일부 방법에서, 상이한 결합 특이성을 갖는 2종 이상의 항체가 동시에 투여될 수 있고, 이러한 경우에 투여되는 각각의 항체의 투여량은 제시된 범위 내에 속한다.
투여량 및 빈도는 환자에서의 항체의 반감기에 따라 달라진다. 일반적으로, 인간 항체가 가장 긴 반감기를 나타내고, 그 다음으로 인간화 항체, 키메라 항체, 및 비인간 항체이다. 투여량 및 투여 빈도는 치료가 예방적인지 또는 치료적인지에 따라 달라질 수 있다.
치료 요법의 지속기간은 치료될 질환, 환자의 연령 및 상태, 환자의 질환의 병기 및 유형, 환자가 치료에 어떻게 반응하는지 등에 좌우된다. 임상의는 요법의 효과를 면밀하게 관찰하고 필요에 따라 임의의 조정을 행할 수 있다. 작용제가 조합되어 사용되는 경우에, 2종 이상의 치료제는 동시에 또는 임의의 순서로 순차적으로 투여되고, 즉 본원에 개시된 항체는 제 2 치료제를 투여하기 전에, 제 2 치료제와 공동으로, 또는 제 2 치료제의 투여에 후속하여 투여될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 면역 및 채혈
면역 항원으로 인간 PD-L1 단백질 또는 인간 CD47 단백질을 면역보조제(GERBU)와 혼합하여 1마리의 알파카에 3회에 걸쳐 근육주사를 통해 면역하였다. 3차에 걸쳐 면역을 진행하였고 마지막 면역 후 14일째 알파카로부터 혈액을 10 ㎖씩 채혈하여 ELISA를 통해 면역 반응을 분석하였다. 항체 생성 여부는 1 ㎍/㎖의 농도로 면역 항원을 코팅버퍼를 이용하여 96웰 마이크로플레이트에 분주하여 4℃에서 하룻밤 동안 코팅하였다. 96웰 마이크로플레이트는 PBST로 3회 세척 후, 비특이적 결합을 억제하기 위하여 5% 스킴 밀크(skim milk)를 상온에서 2시간 동안 처리하여 블로킹(blocking)하였다. 이후 PBST로 3회 세척 후, 면역 전(day 0), 면역 후 14일(day 14), 28일(day 28), 42일(day 42)에 확보한 혈청 시료를 단계별 희석 농도로 처리하였다. 이후 96웰 마이크로플레이트는 PBST로 5회 세척 후, goat anti-Llama IgG HRP 항체를 상온에서 1시간 동안 반응 하였고 TMB 반응으로 면역 항원에 결합 된 항체 여부를 확인하였다.
<실시예 2> 라이브러리 제작 및 평가
상기 <실시예 1>에서 확인한 면역 항원에 결합하는 단일 도메인 항체를 코딩하는 유전자 증폭을 통해 면역 라이브러리를 구축하였다. 라이브러리 구축을 위해 혈액으로부터 피콜(Ficoll)을 이용하여 말초혈액 단핵세포(PBMC)를 분리하였다. 분리된 말초혈액 단핵세포(PBMC)로부터 추출한 총 RNA(Total RNA)로부터 특이 프라이머(specific primer)를 이용하여 단일 도메인 항체를 코딩하는 유전자 단편을 증폭하였고, pComb3x vector에 클로닝하였다. 제작된 면역 라이브러리의 크기는 5.4×108이었다.
<실시예 3> 라이브러리 증폭
상기 <실시예 2>에서 제작한 면역 라이브러리를 XL1-blue 균주에 형질전환(transformation)하였다. 형질전환한 XL1-blue 균주는 2% 글루코스, 100 ㎍/㎖ 암피실린을 함유한 10 ㎖의 2x YT 배지에 첨가하여 37℃ 진탕교반기에서 배양하였다. OD600에서 흡광도가 0.5가 될 때까지 배양하고 M13K07 파아지(Invitrogen)를 1×1011 pfu/㎖가 되도록 첨가하였다. 이후 37℃에서 30분간 정치배양 후 37℃ 진탕교반기에서 200 rpm으로 30분 추가 배양하였다. 배양액은 상온, 4,000 rpm에서 15분간 원심분리하여 상등액을 제거하였다. 이후 100 ㎍/㎖ 암피실린, 50 ㎍/㎖ 카나마이신을 함유한 2x YT 배지 10 ㎖를 첨가하여 배양액의 펠렛을 재부유하고 30℃ 진탕배양기에서 250 rpm으로 하룻밤 동안 배양하였다. 이후 4℃, 4,000 rpm에서 30분간 원심분리하였다. 상등액은 PEG 침전법을 이용하여 침전하였고 4℃, 12,000 rpm에서 30분간 원심분리하였다. 펠렛은 PBS로 재부유하였으며 4℃, 13,000 rpm에서 5분간 원심분리 하여 상등액을 새로운 튜브에 옮겨 사용하기 전까지 4℃에서 보관하였다.
<실시예 4> 바이오패닝(bio-panning)
면역 항원에 특이적인 단일 도메인 항체를 선별하기 위해 96웰 마이크로플레이트에 5 ㎍/㎖의 농도로 코팅버퍼를 이용하여 면역 항원을 분주하였고 4℃에서 하룻밤 동안 코팅하였다. 단일 도메인 항체를 선별하기 위해 사용될 라이브러리(상기 <실시예 3>의 라이브러리)는 96-웰 마이크로플레이트에 분주하여 상온에서 30분간 반응하였다. 이후 새로운 웰에 라이브러리를 옮기고 상온에서 30분간 반응하는 작업을 4회 반복하였다. 이러한 작업은 마이크로플레이트 웰에 비특이적으로 결합하는 라이브러리를 감소시키기 위해 실시하였다. 라이브러리는 1.7 ㎖ 튜브에 옮기고 사용하기 전까지 4℃에서 보관하였다. 면역 항원이 코팅된 마이크로플레이트는 PBST로 5회 세척한 뒤 5% 스킴 밀크를 첨가하여 상온에서 2시간 동안 블로킹하였다. 이후 PBST로 5회 세척한 뒤 비특이적 결합률이 감소된 라이브러리를 바인딩 용액(2.5% 스킴 밀크, 0.5% tween 20)과 함께 5×1012 virions/well으로 분주하여 상온에서 30분간 반응하였다. 이후 세척 용액(PBS, 0.5% tween 20)으로 10회 세척 후 PBST로 3회 추가 세척하였다. 면역 항원에 특이적으로 결합된 단일 도메인 항체는 웰당 5 ㎍ 면역 항원을 첨가한 뒤 상온, 500 rpm으로 30분간 반응하여 선택적으로 용출시켰다. 용출된 파아지는 대수증식기의 XL-1 blue 세포에 감염시킨 뒤, 2x YT 한천 배지에 도말하였다. 두 번째 선별을 위한 패닝을 위해 위와 동일한 조건 하에서 반복하였다. 한천배지에 생성된 단일 파아지 클론은 각각 증폭하여 FACS를 이용하여 스크리닝하였다.
<실시예 5> 파아지 스크리닝
Expi-CHO 세포에서 면역 항원의 일시적 과발현을 유도하기 위해 면역 항원을 암호화하는 유전자를 pCMV6-GFP 벡터에 삽입하여 pCMV6-면역 항원-GFP 플라스미드를 구축하였다. Expi-CHO 세포는 DPBS로 세척한 뒤 상온, 1,200 rpm에서 3분간 원심분리하였다. 상등액을 제거하고 2% 스킴 밀크로 세포를 재부유하여 4℃에서 30분간 블로킹하였다. 세포는 상온, 1200 rpm에서 3분간 원심분리하여 상등액을 제거한 뒤 DPBS로 2회 세척하였고, 96 웰 마이크로플레이트에 3×105 cells/100 ㎕/well이 되도록 분주하였다. 각 웰에 단일클론 파아지를 첨가하여 4℃에서 1시간 동안 반응한 뒤 DPBS로 2회 세척하였다. 세포에 파아지를 특이적으로 결합하는 항체(M13 major coat protein Alexa Flour 647(Santacruz))를 분주하고 빛을 차단한 채로 4℃에서 30분간 반응한다. 세포는 DPBS로 2회 세척 후 새로운 DPBS로 재부유하여 Accuri C6(BD) 장비를 이용하여 FACS 분석하였다. FACS 시스템을 이용하여 스크리닝된 클론을 선별하고, 염기서열분석을 진행하였다.
<실시예 6> 인간 IgG Fc 도메인이 융합된 단일 도메인 항체의 발현 및 정제
<6-1> 인간 IgG Fc 도메인이 융합된 1가 단일 도메인 항체의 발현 및 정제
상기 <실시예 5>에서 선별한 클론은 TGEX-Fc(IgG1) 또는 TGEX-Fc(IgG4) 발현 벡터에 클로닝하였다. 인간 IgG Fc 도메인이 융합된 단일 도메인 항체의 발현을 위해 생존률 95~99%의 Expi-CHO 세포를 계수하여 7×106 세포를 25 ㎖의 배양배지(Expi-CHO expression medium (Gibco))에 첨가하였고, 8% CO2가 유지되는 37℃ 진탕 배양기에서 125 rpm으로 하룻밤 동안 배양하였다. 이후 80 ㎕의 ExpiFectamine™ CHO Reagent(Gibco, 100033021)와 920 ㎕의 OptiPRO™ medium 혼합액에 인간 IgG Fc 도메인이 융합된 단일 도메인 항체를 코딩하는 20 ㎍의 플라스미드 DNA와 1 ㎖의 OptiPRO™ medium 혼합액을 첨가하여 상온에서 5분간 반응한 뒤 배양된 세포에 첨가하였다. 세포는 8% CO2가 유지되는 진탕배양기에서 125 rpm으로 20시간 배양하였다. 이후 인간 IgG Fc 도메인이 융합된 단일 도메인 항체의 발현을 강화시키는 150 ㎕의 ExpiFectamineTM CHO enhancer(Gibco)와 6 ㎖의 ExpiCHO Feed(Gibco)를 넣고 5% CO2가 유지되는 32℃ 진탕배양기에서 125 rpm으로 5일간 배양하였다. 배양된 세포는 4℃에서 4,000 rpm으로 30분간 원심분리하였고, 상등액을 0.2 ㎛ 실린지 필터를 이용하여 필터링하였다. 이후 HiTrap protein G HP column(GE Healthcare)에 상등액을 로딩하고, PBS로 세척한 뒤 IgG elution buffer(Thermo)를 이용하여 인간 IgG Fc 도메인이 융합된 단일 도메인 항체를 column으로 부터 용리하였다. 용리된 시료는 1M Tris-HCl(pH 9.0)을 첨가하여 중화한 뒤 사용하기 전까지 4℃에서 보관하였다.
<6-2> 인간 IgG4 Fc 도메인이 융합된 2가 단일 도메인 항체의 발현 및 정제
상기 <실시예 5>에서 선별한 클론을 2개의 G2S 링커 (GGSGGS)를 이용하여 연결함으로써 2가 단일 도메인 항체를 제작하였다. 상기 2가 단일 도메인 항체를 코딩하는 뉴클레오타이드는 유전자 합성(마크로젠, 대한민국)을 통해 확보하였다. 인간 IgG4 Fc 도메인이 융합된 단일 도메인 항체의 발현 및 정제를 위해 합성된 유전자는 TGEX-Fc(IgG4) 발현벡터에 클로닝하였다. 이후, 상기 실시예 <6-1>에 기재된 방법과 동일한 방법으로 발현 및 정제하였다.
<실시예 7> 인간 IgG4 Fc 도메인이 융합된 이중특이적(bispecific) 단일 도메인 항체의 발현 및 정제
상기 <실시예 5>에서 선별한 클론 중 PD-L1과 CD47 항원 각각에 특이적으로 결합하는 단일 도메인 항체를 각 1종씩 선별하였다. 각 단일 도메인 항체를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 펩티드 링커를 이용하여 연결하였으며, PD-L1에 특이적으로 결합하는 단일 도메인 항체 2개와 CD47에 특이적으로 결합하는 단일 도메인 항체를 순서대로 연결하였다(항-PD-L1 sdAb×항-PD-L1 sdAb×항-CD47 sdAb). 이러한 3가 이중특이적 단일 도메인 항체를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 유전자 합성(마크로젠, 대한민국)을 통해 확보하였다. 인간 IgG4 Fc 도메인이 융합된 이중특이적 단일 도메인 항체의 발현 및 정제를 위해 합성된 유전자를 TGEX-Fc(IgG4) 발현벡터에 클로닝하였며, 상기 실시예 <6-1>에 기재된 방법과 동일한 방법으로 발현 및 정제하였다.
<실시예 8> 인간 IgG4 Fc 도메인이 융합된 이중특이적(bispecific) 인간화 단일 도메인 항체의 발현 및 정제
상기 <실시예 7>에서 제작한 3가 이중특이적 단일 도메인 항체의 인간화를 위해 인간 생식세포계열 VH segment DP-47(J Mol Biol. 1992 Oct 5;227(3):776-98)의 FR(frame region) 서열과 상동성(Identity) 비교를 진행하였다. 상기 <실시예 5>에서 선별한 클론 중 PD-L1과 CD47 항원 각각에 특이적으로 결합하는 단일 도메인 항체 각 1종(PDL1 Nb#01과 CD47 Nb#01)의 아미노산 서열 중 FR1(frame region) 서열 내 1번째 아미노산인 글루타민(Glutamine, Q)을 글루탐산(Gluramic acid, E)으로 치환하여 인간 항체인 DP-47과의 상동성이 향상된 3가 PD-L1 및 CD47 이중특이적 인간화 단일 도메인 항체를 제작하였다(인간화 항-PD-L1 sdAb×인간화 항-PD-L1 sdAb×인간화 항-CD47 sdAb). 아미노산의 치환은 Q5 Site directed mutagenesis kit(NEB)와 특이적으로 결합하는 프라이머를 이용하여 돌연변이를 유도하였으며, 상기 <실시예 6>에 기재된 동일한 방법으로 발현 및 정제하였다.
<실시예 9> FACS를 이용한 단일 도메인 항체와 면역 항원의 결합능 평가
상기 <실시예 6>, <실시예 7> 및 <실시예 8>에서 정제한 항-PD-L1 HCAb(PDL1 Nb#01-IgG1), 항-PD-L1 2가 HCAb(PP Nb-IgG4), 항-CD47 HCAb(CD47 Nb-IgG4), 항-PD-L1×CD47 3가 HCAb(PPC Nb-IgG4), 인간화 항-PD-L1×CD47 3가 HCAb(hPPC Nb-IgG4)와 면역 항원의 결합능을 FACS를 통해 확인하였다.
구체적으로, CHO-K1_PD-L1 세포주(PD-L1 항원이 과발현되는 CHO-K1 세포) 또는 Expi-CHO_CD47 세포주(CD47 항원이 과발현된 Expi-CHO 세포)는 DPBS로 세척한 뒤 상온, 1,200 rpm에서 3분간 원심분리하였다. 상등액을 제거하고 2% 스킴 밀크로 세포를 재부유하여 4℃에서 30분간 블로킹하였다. 세포는 상온, 1,200 rpm에서 3분간 원심분리하여 상등액을 제거한 뒤 DPBS로 2회 세척하였다. 이후 각 웰에 3×105 cells/100 ㎕/well로 세포를 분주한 뒤, 항-PD-L1 HCAb(PDL1 Nb#01-IgG1), 항-PD-L1 2가 HCAb(PP Nb-IgG4), 항-CD47 HCAb(CD47 Nb-IgG4), 항-PD-L1×CD47 3가 HCAb(PPC Nb-IgG4) 또는 인간화 항-PD-L1×CD47 3가 HCAb(hPPC Nb-IgG4)를 각각 농도별로 처리하였고, 음성대조군으로 isotype control 항체를 사용하였다. 세포는 4℃에서 1시간 동안 반응한 뒤, DPBS로 2회 세척하였다. 이후, 인간 Fc 도메인에 특이적으로 결합하는 항체(Anti-human IgG Fc APC 항체(Biolegend))를 처리하고 빛을 차단한 채로 4℃에서 30분간 반응하였다. 세포는 DPBS로 2회 세척 후 100 ㎕의 DPBS로 재부유하여 Accuri C6 (BD) 장비를 이용하여 FACS 분석하였다.
<실시예 10> FACS를 이용한 단일 도메인 항체의 면역 항원 상호작용에 대한 억제능 평가
상기 <실시예 6>, <실시예 7> 및 <실시예 8>에서 정제한 항-PD-L1 HCAb(PDL1 Nb#01-IgG1), 항-PD-L1 2가 HCAb(PP Nb-IgG4), 항-CD47 HCAb(CD47 Nb-IgG4), 항-PD-L1×CD47 3가 HCAb(PPC Nb-IgG4), 인간화 항-PD-L1×CD47 3가 HCAb(hPPC Nb-IgG4)가 PD-1/PD-L1 또는 CD47/SIRPalpha 상호작용에 미치는 억제능을 평가하였다.
구체적으로, PD-1/PD-L1 상호작용에 대한 항-PD-L1 HCAb(PDL1 Nb#01-IgG1), 항-PD-L1 2가 HCAb(PP Nb-IgG4), 항-PD-L1×CD47 3가 HCAb(PPC Nb-IgG4) 또는 인간화 항-PD-L1×CD47 3가 HCAb(hPPC Nb-IgG4)의 평가를 위해 CHO-K1_PD-L1 세포주(PD-L1 항원이 일정하게 발현하는 CHO-K1 세포)를 96 웰 마이크로플레이트에 웰당 2×105 cell에 분주하고, 10 ㎍/㎖의 인간 PD-1-His 단백질을 처리하였다. 이후 항-PD-L1 HCAb(PDL1 Nb#01-IgG1), 항-PD-L1 2가 HCAb(PP Nb-IgG4), 항-PD-L1×CD47 3가 HCAb(PPC Nb-IgG4) 또는 인간화 항-PD-L1×CD47 3가 HCAb(hPPC Nb-IgG4)를 각각 농도별로 처리하였으며, 음성대조군은 isotype control 항체를 처리하였다. 세포는 1시간 동안 4℃에서 반응하였으며 DPBS로 3회 세척 후, His 항원에 특이적으로 결합하는 항체(Goat anti-His APC)를 첨가하여 빛을 차단한 채로 4℃에서 30분간 반응 하였다. 세포는 DPBS로 3회 세척 후 100 ㎕의 DPBS로 재부유하였고, Accuri C6 (BD) 장비로 CHO-K1_PD-L1 세포(PD-L1 항원이 일정하게 발현하는 CHO-K1 세포)에 남아있는 PD-1-His 단백질 양을 확인함으로써 항-PD-L1 HCAb(PDL1 Nb#01-IgG1), 항-PD-L1 2가 HCAb(PP Nb-IgG4), 항-PD-L1×CD47 3가 HCAb(PPC Nb-IgG4) 또는 인간화 항-PD-L1×CD47 3가 HCAb(hPPC Nb-IgG4)가 PD-1/PD-L1 상호작용에 미치는 억제능을 평가하였다.
또한, 항-CD47 sdAb(CD47 Nb-IgG4), 항-PD-L1×CD47 3가 HCAb(PPC Nb-IgG4) 또는 인간화 항-PD-L1×CD47 3가 HCAb(hPPC Nb-IgG4)가 CD47/SIRPalpha 상호작용에 미치는 영향을 평가하기 위해 Expi-CHO_CD47 세포(CD47 항원이 일정하게 발현하는 Expi-CHO 세포)를 96웰 마이크로플레이트에 웰당 2×105 cell에 분주하고, 10 ㎍/㎖의 인간 SIRPalpha-His 단백질을 처리하였다. 이후 항-CD47 sdAb(CD47 Nb-IgG4), 항-PD-L1×CD47 3가 HCAb(PPC Nb-IgG4) 또는 인간화 항-PD-L1×CD47 3가 HCAb(hPPC Nb-IgG4) 각각 농도별로 처리하였으며, 음성대조군은 isotype control 항체를 처리하였다. 그 다음, 상기에 기재된 방법과 동일한 방법으로 Accuri C6 (BD) 장비로 Expi-CHO_CD47 세포에(CD47 항원이 일정하게 발현하는 Expi-CHO 세포) 남아있는 SIRPalpha-His 단백질 양을 확인함으로써 항-CD47 sdAb(CD47 Nb-IgG4), 항-PD-L1×CD47 HCAb(PPC Nb-IgG4) 또는 인간화 항-PD-L1×CD47 HCAb(hPPC Nb-IgG4)가 CD47/SIRPalpha 상호작용에 미치는 억제능을 평가하였다.
<실시예 11> 단일 도메인 항체의 면역 항원과의 친화도 평가
Octet RED 96e (ForteBio) 장비를 이용하여 상기 <실시예 6>, <실시예 7> 및 <실시예 8>에서 정제한 항-PD-L1 HCAb(PDL1 Nb#01-IgG1), 항-PD-L1 2가 HCAb(PP Nb-IgG4), 항-CD47 HCAb(CD47 Nb-IgG4), 항-PD-L1×CD47 3가 HCAb(PPC Nb-IgG4) 또는 인간화 항-PD-L1×CD47 3가 HCAb(hPPC Nb-IgG4)와 면역 항원 단백질의 친화도(Kd)를 측정하였다.
구체적으로, anti-human Fc가 코팅된 바이오센서팁(Fortebio)을 5 ㎍/㎖의 항-PD-L1 HCAb(PDL1 Nb#01-IgG1), 항-PD-L1 2가 HCAb(PP Nb-IgG4), 항-CD47 HCAb(CD47 Nb-IgG4), 항-CD47 HCAb(CD47 Nb-IgG4), 항-PD-L1×CD47 3가 HCAb(PPC Nb-IgG4) 또는 인간화 항-PD-L1×CD47 3가 HCAb(hPPC Nb-IgG4)가 각각 분주된 96-웰 마이크로플레이트(Greiner)에서 1.5 nm 수준으로 포화 결합 시켰다. PD-L1 및 CD47 항원은 10 ~ 400 nM로 1X kinetic buffer(ForteBio)를 이용하여 2배수로 단계별 희석하였으며 30℃, 1,000 rpm으로 교반하면서 반응하였다. 시료의 결합과 해리 반응은 각각 200, 400초 동안 분석하였다. 결과 데이터는 1:1 상호작용 모델(Global fitting) 방법을 이용하여 분석하였다.
또한, Octet RED 96e (ForteBio) 장비를 이용하여 상기 <실시예 8>에서 정제한 인간화 항-PD-L1×CD47 3가 HCAb(hPPC Nb-IgG4)와 종간 면역 항원 단백질의 친화도(Kd)를 측정하였다.
구체적으로 Anti-human Fc가 코팅된 바이오센서팁 (Fortebio)을 20 ㎍/㎖의 인간화 항-PD-L1×CD47 3가 HCAb(hPPC Nb-IgG4)가 분주된 96-웰 마이크로플레이트(Greiner)에서 1.5 nm 수준으로 포화 결합 시켰다. 인간(Human), 마우스(Mouse), 원숭이(Cynomolgus) PD-L1 또는 CD47 항원은 각각 12.5 ~ 200 nM로 1X kinetic buffer(ForteBio)를 이용하여 2배수로 단계별 희석하였으며 30℃, 1,000 rpm으로 교반하면서 반응하였다. 시료의 결합과 해리 반응은 각각 200, 400초 동안 분석하였다. 결과 데이터는 1:1 상호작용 모델(Global fitting) 방법을 이용하여 분석하였다.
<실시예 12> 인간화 단일 도메인 항체에 대한
in vitro
유효성 평가
T 세포 활성, 혼합림프구반응에서의 CD4+ T 세포의 활성화 정도 및 대식세포(macrophage)에 의한 식세포 작용(Phagocytosis)의 활성화 정도를 확인하여 상기 <실시예 8>에서 정제한 인간화 항-PD-L1×CD47 3가 HCAb(hPPC Nb-IgG4)의 in vitro 유효성을 평가하였다.
<12-1> 인간화 단일 도메인 항체의 T 세포 활성 평가
PD-L1 단백질의 과발현을 유도한 CHO-K1 세포와 PD-1이 발현하는 Jurkat 세포에서 상기 <실시예 8>에서 정제한 인간화 항-PD-L1×CD47 3가 HCAb(hPPC Nb-IgG4)이 상기 세포 간의 상호작용을 방해하여 Jurkat 세포로부터 발현되는 IL-2 농도를 측정하여 T 세포 활성 효능을 평가하였다.
구체적으로, PD-L1 단백질이 과발현 하는 CHO-K1 세포를 웰당 2×104 cell로 분주한 뒤 5% CO2가 유지되는 배양기에서 16시간 동안 배양하였다. 이후 배지를 제거하였고, 인간화 항-PD-L1×CD47 3가 HCAb(hPPC-Nb-IgG4)를 농도별로 처리하고 1시간 동안 반응하였다. Jurkat 세포는 5×105 cell/100 ul로 준비한 뒤 PHA를 0.5 mg/ml이 되도록 처리하였고, 인간화 항-PD-L1×CD47 3가 HCAb(hPPC-Nb-IgG4)가 처리된 CHO-K1 세포에 첨가하여 48시간 동안 반응하였다. 이후 상등액은 ELISA 방법을 통하여 IL-2 농도를 측정하여 인간화 항-PD-L1×CD47 3가 HCAb(hPPC-Nb-IgG4)의 T 세포 활성 효능을 평가하였다.
<12-2> 인간화 단일 도메인 항체의 혼합림프구반응에서의 CD4
+
T 세포의 활성화 평가
혼합림프구반응 분석(Mixed lymphocyte reaction(MLR) assay)을 수행하여 <실시예 8>에서 정제한 인간화 항-PD-L1×CD47 3가 HCAb(hPPC Nb-IgG4)의 혼합림프구반응에서의 CD4+ T 세포의 활성화를 평가하였다.
구체적으로, 공여자 A의 단핵구 유도 수지상 세포(Monocyte derived dendritic cell, MoDC)를 96-웰 플레이트(flat bottom)에 5x104 cells/well로 분주하고, MoDC를 분주한 웰에 공여자 B의 CD4+ T 세포를 4x105 cells/well로 분주하여 서로 섞이게 해준 다음 인간화 항-PD-L1×CD47 3가 HCAb (hPPC-Nb-IgG4)를 농도별로 처리하고 5% CO2가 유지되는 37℃ 배양기에서 5일간(120시간) 배양하였다. 이후 배양 3일째에 IL-2 생성을 측정하기 위한 상등액을 취하고, 동일한 웰에서 배양 5일째에 IFN-γ 생성을 측정하기 위한 상등액을 취한 후 ELISA 방법을 통하여 IL-2 및 IFN-γ 농도를 측정하였다.
혼합림프구반응 분석에 사용한 MoDC는 PD-L1을 발현하고, CD4+ T 세포는 PD-1을 발현한다. 항체에 의해 PD-L1 및 PD-1 간의 상호작용을 방해하면 억제된 T 세포의 활성이 활성화 될 수 있다. 이는 암세포에서 발현되는 PD-L1과 T 세포에서 발현되는 PD-1의 결합으로 면역활성이 억제되어 면역시스템에서부터 암세포가 생존하는 시스템을 억제하는 것과 같다. 이에, 혼합림프구반응 분석을 수행하고, T 세포 활성화의 지표인 IL-2 및 IFN-γ의 농도를 측정함으로써 인간화 항-PD-L1×CD47 3가 HCAb(hPPC Nb-IgG4)의 유효성을 평가하였다.
<12-3> 인간화 단일 도메인 항체의 대식세포에 의한 식세포 작용 활성화 평가
식세포 작용(Phagocytosis)은 항원의 특이적 결합과 IgG4 Fc 도메인에 의해 활성화 된다. 항원 특이적 결합은 표적세포(target cell)와 효과세포(effector cell) 사이의 물리적(세포간 거리), 화학적 (chemokine), 생물학적(cytokine) 환경에 영향을 받는다. PD-L1 및 CD47 항원 특이적 인간화 항체는 표적세포에서 발현하는 hPDL1과 hCD47에 특이적으로 결합하고, Fc region 결합부는 효과세포 표면의 Fc receptor와 결합함으로써, 표적세포와 효과세포의 결합을 촉진하여 대식세포에 의한 식세포 작용을 유도한다.
이에, 상기 <실시예 8>에서 정제한 인간화 항-PD-L1×CD47 3가 HCAb(hPPC Nb-IgG4)의 CD47 항원 특이적 결합으로 대식세포에 의한 식세포 작용의 활성화를 평가하였다.
구체적으로, 효과세포로 5×106 cell의 THP-1 세포를 100 파이 디쉬에 분주하여 5% CO2가 유지되는 배양기에서 24시간 동안 배양하였다. 이후 40 nM의 PMA로 24시간 동안 반응한 뒤 배지를 제거하였으며, 1 uM의 deep red dye로 염색하였다. 염색을 마친 후 배지로 교체한 뒤 48시간 동안 레스팅(resting)하였다. 트립신(Trypsin)으로 떼어낸 THP-1 세포는 표적세포로서 3 uM의 CFSE로 염색된 prey 세포(Raji 세포)와 8:1의 비율로 혼합한 뒤 인간화 항-PD-L1×CD47 3가 HCAb(hPPC Nb-IgG4)를 농도별로 처리하여 4시간 동안 공동배양(Co-culture)하였다. 이후 FACS를 이용하여 식세포 작용 정도를 평가하였다.
<12-4> 인간화 단일 도메인 항체의 PBMC 유래 대식세포에 의한 식세포 작용 활성화 평가
인간 PBMC에서 분리한 단핵구(monocyte)를 대식세포(macrophage)로 분화시켜 표적세포(Raji_PDL1)와의 공동배양을 통해 상기 <실시예 8>에서 정제한 인간화 항-PD-L1×CD47 3가 HCAb(hPPC Nb-IgG4)의 hPD-L1 및 hCD47 항원 특이적 결합으로 인간 단핵구 유래 대식세포에 의한 식세포 작용의 활성화를 평가하였다.
구체적으로, 전혈(Whole blood)에서 ficoll gradien를 통해 분리된 PBMC에서 CD14+ MACS kit을 이용하여 단핵구를 분리한 후, 2x106 cells/ml로 100 mm 디쉬에 M-CSF 50ng/ml를 처리하여 6일 동안 분화하였다. 분화가 끝난 대식세포는 효과세포로 5 uM의 CFSE로 염색하였고, 표적세포(Raji_PDL1)는 10 uM의 Deep Red dye로 염색하였다. 표적세포 기준 2x104 cells/well로 하고, 효과세포: 표적세포의 혼합비율은 8 : 1로 하여 공동배양하였다. 또한, 인간화 항-PD-L1×CD47 3가 HCAb(hPPC Nb-IgG4) 농도는 1000 nM 부터 1/5로 희석하여 15 point를 평가하였고, 4시간 동안 공동배양하였다. 공동배양 이후 FACS분석을 통해 Deep red의 APC, CFSE의 FITC의 발현을 확인하였고, CFSE 발현을 기준으로 하여 APC의 발현 세포군을 확인함으로써, 식세포 작용 정도를 평가하였다.
<실시예 13> 인간화 단일 도메인 항체에 대한
in vitro
안전성 평가
인간 RBC 결합(Human RBC binding) 및 적혈구응집반응(Hemagglutination)을를 확인하여 상기 <실시예 8>에서 정제한 인간화 항-PD-L1×CD47 3가 HCAb(hPPC Nb-IgG4)의 in vitro 안전성을 평가하였다.
<13-1> 인간화 단일 도메인 항체의 RBC 결합 평가
상기 <실시예 8>에서 정제한 인간화 항-PD-L1×CD47 3가 HCAb(hPPC Nb-IgG4)가 CD47 항원에 특이적으로 결합하여 발생하는 인간 RBC 결합을 평가하였다.
구체적으로, 인간 RBC(Red blood cell)와 인간화 항-PD-L1×CD47 3가 HCAb(hPPC Nb-IgG4)의 결합능을 확인하기 위해 RBC를 DPBS로 7회 세척한 뒤, DPBS로 12%(v/v)가 되도록 희석하였다. 96 well V bottom 플레이트에 50 ul의 인간화 항-PD-L1×CD47 3가 HCAb(hPPC Nb-IgG4)를 분주한 뒤 12%(v/v) RBC를 50 ul 첨가하여 4℃에서 1시간 동안 반응하였다. 세포는 DPBS로 세척 후 2차 항체로 항-인간 IgG4를 처리하고, 4℃에서 1시간 동안 반응하였다. 세포는 DPBS로 세척 후 FACS를 통해 RBC에 결합한 인간화 항-PD-L1×CD47 3가 HCAb(hPPC Nb-IgG4)의 정도를 평가하였다.
<13-2> 인간화 단일 도메인 항체에 의한 적혈구응집반응 평가
상기 <실시예 8>에서 정제한 인간화 항-PD-L1×CD47 3가 HCAb(hPPC Nb-IgG4)가 CD47 항원에 특이적으로 결합하여 발생하는 적혈구응집반응을 평가하였다.
구체적으로, 인간화 항-PD-L1×CD47 3가 HCAb(hPPC Nb-IgG4)의 적혈구응집반응을 평가하기 위해 RBC를 DPBS로 7회 세척한 뒤, DPBS로 6%(v/v)가 되도록 희석하였다. 96 well U bottom 플레이트에 50 ul의 2X 인간화 항-PD-L1×CD47 3가 HCAb(hPPC Nb-IgG4)를 분주한 뒤 6%(v/v) RBC를 50 ul 첨가하였다. 상온에서 1시간 동안 반응 후 육안으로 적혈구응집반응을 관찰하였다.
<실시예 14> 인간화 단일 도메인 항체의
in vivo
유효성 평가
인간 PD-L1과 인간 CD47을 발현하는 종양 세포주를 주입하여 종양을 형성한 C57BL/6 마우스 및 인간화된 NSG 마우스에서 상기 <실시예 8>에서 정제한 인간화 항-PD-L1×CD47 3가 HCAb(hPPC Nb-IgG4)의 항종양 효과를 확인하여 in vivo 유효성을 평가하였다.
<14-1> B16F10_PD-L1_CD47 종양을 이용한 C57BL/6 마우스 모델
6-8주령 된 C57BL/6 마우스에 인간 PD-L1과 인간 CD47의 과발현을 유도한 B16F10 세포주 8×105 cell/100 ul을 주입하였다. 종양 가로축(장축) × 세로축(단축)의 크기가 3 × 3 mm에 도달할 때까지 종양 형성을 유도하였다. 이후, 2일 간격으로 10 mpk의 인간화 항-PD-L1×CD47 3가 HCAb(hPPC Nb-IgG4)를 7회에 걸쳐 복강 투여 및 종양 크기를 측정하였다. 마지막 복강 투여 후 2일 간격으로 2주일간 종양 부피를 측정하였다. 종양 부피는 가로축(장축) × 세로축(단축) × 세로축(단축)/2로 측정하였다.
<14-2> Raji_PD-L1 종양을 이용한 인간화 NSG 마우스 모델
6-8주령 된 암컷 NSG 마우스에 인간 PBMC 2×107 cell/100 ul를 복강내 주사하여 인간화된 NSG 마우스를 제작하였다. 인간 PD-L1의 과발현을 유도한 인간 Raji(PD-L1) 림프종(lymphoma) 세포주 2×106 cell/100 ul을 주입하였다. 종양 가로축(장축) × 세로축(단축)의 크기가 3 × 3 mm에 도달할 때까지 종양 형성을 유도하였다. 이후, 주 3회 간격으로 10 mpk의 인간화 항-PD-L1×CD47 3가 HCAb(hPPC Nb-IgG4)를 복강 투여 및 종양 부피를 측정하였다. 마지막 복강 투여 후 종양 부피가 2000 mm3 일 때 실험을 종료하였다.
<14-3> MDA-MB-231 종양을 이용한 인간화 NSG 마우스 모델
6-8주령 된 암컷 NOD scid NSG 마우스에 인간 PBMC를 2×107 cell/100 ul 정맥주사하여 인간화된 NSG 마우스를 제작하였다. hCD45 및 mCD45의 발현을 확인한 후, 인간 유방암 세포주 MDA-MB-231 2×106 cell/100 ul을 우측 옆구리에 피하투여하였다. 종양 가로축(장축) × 세로축(단축)의 크기가 3 × 3 mm에 도달할 때까지 종양 형성을 유도하였다. 이후, 주 3회 간격으로 1, 5, 10 mpk의 인간화 항-PD-L1×CD47 3가 HCAb(hPPC Nb-IgG4)를 복강 투여 및 종양 부피를 측정하였다. 또한, 인간화된 NSG 마우스의 종양 부피가 100 mm3 일 때 개체 폐사 발생 기준으로 카플란-마이어 생존분석(Kaplan-meier estimator survival)을 수행하여 생존율을 예측하였다.
<실험예 1> 항-PD-L1 HCAb(PDL1 Nb#01-IgG1)의 제작 및
in vitro
특성 평가
<1-1> 항-PD-L1 HCAb(PDL1 Nb#01-IgG1) 제작
면역 항원으로 인간 PD-L1 항원을 이용하여 상기 <실시예 5>에 기재된 방법과 동일한 방법으로 PD-L1 항원에 특이적인 단일 도메인 항체 클론을 선별하여 염기서열분석을 진행하였다. 상기 선별한 항-PD-L1 sdAb(PDL1 Nb#01)의 아미노산 서열은 하기 [표 5] 및 [표 6]에 나타내었다.
또한, 상기 선별한 항-PD-L1 sdAb(PDL1 Nb#01)을 이용하여 실시예 <6-1>에 기재된 방법과 동일한 방법으로 인간 IgG1 Fc 도메인을 포함하는 PD-L1에 특이적인 1가 단일 도메인 항체를 발현 및 정제하였고, 정제된 1가 단일 도메인 항체는 항-PD-L1 HCAb(PDL1 Nb#01-IgG1)으로 명명하였다. 인간 IgG1 Fc 도메인을 포함하는 항-PD-L1 HCAb(PDL1 Nb#01-IgG1)의 아미노산 서열은 하기 [표 7]에 나타내었다.
또한, 상기 선별한 항-PD-L1 sdAb(PDL1 Nb#01) 클론을 이용하여 실시예 <6-2>에 기재된 방법과 동일한 방법으로 인간 IgG4 Fc를 포함하는 PD-L1에 특이적인 2가 단일 도메인 항체를 발현 및 정제하였고, 정제된 2가 단일 도메인 항체는 항-PD-L1 2가 HCAb(PP Nb-IgG4)로 명명하였다. 항-PD-L1 2가 HCAb(PP Nb-IgG4)에서 인간 IgG4 Fc 도메인을 제외한 항-PD-L1 2가 sdAb(PP Nb)의 아미노산 서열은 하기 [표 8]에 나타내었고, 인간 IgG4 Fc 도메인을 포함하는 항-PD-L1 2가 HCAb(PP Nb-IgG4)의 아미노산 서열은 하기 [표 9]에 나타내었다.
| 단일 도메인 항체 | 단일 도메인 항체 서열 | 서열번호 |
| 항-PD-L1 sdAb (PDL1 Nb#01) |
QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSFAMSWVRQAPGKGLEWVSDINTGGDSTDYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLKPEDTAVYYCAKGPKEMVHVYSQRGQGTQVTVSS | 1 |
| 단일 도메인 항체 | CDR1 | 서열번호 | CDR2 | 서열번호 | CDR3 | 서열번호 |
| 항-PD-L1 sdAb (PDL1 Nb#01) |
GFTFSSFA | 2 | INTGGDST | 3 | AKGPKEMVHVYSQ | 4 |
| 단일 도메인 항체 | 단일 도메인 항체 서열 + Human IgG1 Fc 서열 | 서열번호 |
| 항-PD-L1 HCAb (PDL1 Nb#01-IgG1) |
QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSFAMSWVRQAPGKGLEWVSDINTGGDSTDYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLKPEDTAVYYCAKGPKEMVHVYSQRGQGTQVTVSSGPGGPEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK | 5 |
| 단일 도메인 항체 | 단일 도메인 항체 서열 | 서열번호 |
| 항-PD-L1 2가 sdAb (PP Nb) |
QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSFAMSWVRQAPGKGLEWVSDINTGGDSTDYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLKPEDTAVYYCAKGPKEMVHVYSQRGQGTQVTVSSGGSGGSQVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSFAMSWVRQAPGKGLEWVSDINTGGDSTDYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLKPEDTAVYYCAKGPKEMVHVYSQRGQGTQVTVSS | 6 |
| 단일 도메인 항체 | 단일 도메인 항체 서열 + Human IgG4 Fc 서열 | 서열번호 |
| 항-PD-L1 2가 HCAb (PP Nb-IgG4) |
QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSFAMSWVRQAPGKGLEWVSDINTGGDSTDYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLKPEDTAVYYCAKGPKEMVHVYSQRGQGTQVTVSSGGSGGSQVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSFAMSWVRQAPGKGLEWVSDINTGGDSTDYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLKPEDTAVYYCAKGPKEMVHVYSQRGQGTQVTVSSGPGGPESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK | 7 |
<1-2> 항-PD-L1 HCAb(PDL1 Nb#01-IgG1) 및 항-PD-L1 2가 HCAb(PP Nb-IgG4)의 항원 결합능 및 PD-1/PD-L1 상호작용에 대한 억제능 평가
상기 <실시예 9>와 <실시예 10>에 기재된 방법과 동일하게 FACS를 이용하여 상기 <실험예 1>에서 정제한 항-PD-L1 HCAb(PDL1 Nb#01-IgG1) 및 항-PD-L1 2가 HCAb(PP Nb-IgG4)의 항원 결합능(도 1a 및 도 2a)과 PD-1/PD-L1 상호작용에 미치는 억제능(도 1b 및 도 2b)을 평가하였다.
그 결과, 도 1a 및 도 1b에 나타낸 바와 같이, 항-PD-L1 HCAb(PDL1 Nb#01-IgG1)는 CHO-K1_PD-L1 세포(PD-L1 항원이 일정하게 발현하는 CHO-K1 세포)에서 23.31 nM(EC50)의 항원 결합능이 확인되었고, PD-1/PD-L1 상호작용에 미치는 억제능은 4.60 nM(IC50)으로 확인되었다.
또한, 도 2a 및 도 2b에 나타낸 바와 같이, 항-PD-L1 2가 HCAb(PP Nb-IgG4)는 CHO-K1_PD-L1 세포(PD-L1 항원이 일정하게 발현하는 CHO-K1 세포)에서 1.93 nM(EC50)의 항원 결합능이 확인되었고, PD-1/PD-L1 상호작용에 미치는 억제능은 2.86 nM(IC50)으로 확인되었다.
<1-3> 항-PD-L1 HCAb(PDL1 Nb#01-IgG1) 및 항-PD-L1 2가 HCAb(PP Nb-IgG4)와 면역 항원과의 친화도 평가
상기 <실험예 1>에서 정제한 항-PD-L1 HCAb(PDL1 Nb#01-IgG1) 및 항-PD-L1 2가 HCAb(PP Nb-IgG4) 각각 PD-L1 항원과의 친화도를 상기 <실시예 10>에 기재된 방법과 동일한 방법으로 평가하였다.
그 결과, 표 10에 나타낸 바와 같이, 항-PD-L1 HCAb(PDL1 Nb#01-IgG1)는 PD-L1 항원과 7.08 nM의 항원 친화력을 확인하였고, 항-PD-L1 2가 HCAb(PP Nb-IgG4)는 PD-L1 항원과 4.58 nM의 항원 친화력을 확인하였다.
| 단일 도메인 항체 | Kd(M) | kon(1/Ms) | kdis(1/s) |
| 항-PD-L1 HCAb (PDL1 Nb#01-IgG1) |
7.08E-09 | 5.27E+05 | 3.73E-03 |
| 항-PD-L1 2가 HCAb (PP Nb-IgG4) |
4.58E-09 | 4.02E+05 | 1.84E-03 |
<실험예 2> 항-CD47 HCAb(CD47 Nb-IgG4) 제작 및
in vitro
특성 평가
<2-1> 항-CD47 HCAb(CD47 Nb-IgG4) 제작
면역 항원으로 인간 CD47 항원을 이용하여 상기 <실시예 5>에 기재된 방법과 동일한 방법으로 CD47 항원에 특이적인 단일 도메인 항체 클론을 선별하여 염기서열분석을 진행하였다. 상기 선별한 항-CD47 sdAb(CD47 Nb#01)의 아미노산 서열은 하기 [표 11] 및 [표 12]에 나타내었다.
또한, 상기 선별한 항-CD47 sdAb(CD47_Nb_#01)을 이용하여 실시예 <6-1>에 기재된 방법과 동일한 방법으로 인간 IgG4 Fc 도메인을 포함하는 CD47에 특이적인 단일 도메인 항체를 발현 및 정제하였고, 정제된 단일 도메인 항체는 항-CD47 HCAb(CD47 Nb-IgG4)로 명명하였다. 인간 IgG4 Fc 도메인을 포함하는 항-CD47 HCAb(CD47 Nb-IgG4)의 아미노산 서열은 하기 [표 13]에 나타내었다.
| 단일 도메인 항체 | 단일 도메인 항체 서열 | 서열번호 |
| 항-CD47 sdAb (CD47 Nb#01) |
QVQLVESGGGLVQPGGSLNLSCAVSGLTFFRKYAVGWARQVPGKGLERVSRIYSDRRIEYLDAVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKTEDTAVYYCATGLRVGLTGWDEYDYWGQGTQVTVSS | 8 |
| 단일 도메인 항체 | CDR1 | 서열번호 | CDR2 | 서열번호 | CDR3 | 서열번호 |
| 항-CD47 sdAb (CD47 Nb#01) |
GLTFFRKYA | 9 | IYSDRRI | 10 | ATGLRVGLTGWDEYDY | 11 |
| 단일 도메인 항체 | 단일 도메인 항체 서열 + Human IgG4 Fc 서열 | 서열번호 |
| 항-CD47 HCAb (CD47 Nb-IgG4) |
QVQLVESGGGLVQPGGSLNLSCAVSGLTFFRKYAVGWARQVPGKGLERVSRIYSDRRIEYLDAVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKTEDTAVYYCATGLRVGLTGWDEYDYWGQGTQVTVSSGPGGPESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK | 12 |
<2-2> 항-CD47 HCAb(CD47 Nb-IgG4)의 항원 결합능 및 CD47/SIRPalpha 상호작용에 대한 억제능 평가
상기 <실시예 9>와 <실시예 10>에 기재된 방법과 동일하게 FACS를 이용하여 상기 실험예 <2-1>에서 정제한 항-CD47 HCAb(CD47 Nb-IgG4)의 항원 결합능(도 3a)과 CD47/SIRPalpha 상호작용에 미치는 억제능(도 3b)을 평가하였다.
그 결과, 도 3a 및 도 3b에 나타낸 바와 같이, 항-CD47 HCAb(CD47 Nb-IgG4)는 Expi-CHO_CD47 세포(CD47 항원이 일정하게 발현하는 Expi-CHO 세포)에서 3.78 nM(EC50)의 항원 결합능이 확인되었고, CD47/SIRPalpha 상호작용에 미치는 억제능은 7.28 nM(IC50)으로 확인되었다.
<2-3> 항-CD47 HCAb(CD47 Nb-IgG4)와 면역 항원과의 친화도 평가
상기 <실험예 2-1>에서 정제한 항-CD47 HCAb(CD47 Nb-IgG4)와 CD47 항원과의 친화도를 상기 <실시예 11>에 기재된 방법과 동일한 방법으로 평가하였다.
그 결과, 표 14에 나타낸 바와 같이, 항-CD47 HCAb(CD47 Nb-IgG4)는 CD47 항원과 2.78 nM의 항원 친화력을 확인하였다.
| 단일 도메인 항체 | Kd(M) | kon(1/Ms) | kdis(1/s) |
| 항-CD47 HCAb (CD47 Nb-IgG4) |
2.78E-09 | 2.75E+05 | 7.65E-04 |
<실험예 3> 항-PD-L1×CD47 3가 HCAb(PPC Nb-IgG4) 제작 및
in vitro
특성 평가
<3-1> 항-PD-L1×CD47 3가 HCAb(PPC Nb-IgG4) 제작
인간 IgG4 Fc 도메인을 포함하며 면역 항원으로 PD-L1 및 CD47 항원에 이중 특이적인 단일 도메인 항체는 상기 실험예 <1-1>에서 선별한 클론을 이용하여 제작하였다. 상기 실험예 <1-1>에서 선별한 항-PD-L1 sdAb(PDL1 Nb#01)을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열과 상기 실험예 <2-1>에서 선별한 항-CD47 sdAb(CD47 Nb#01)을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 이용하여 상기 <실시예 7>에 기재된 방법과 동일한 방법으로 유전자를 합성하고 TGEX-Fc(IgG4) 발현 벡터에 클로닝한 후 발현 및 정제하였고, 정제한 단일 도메인 항체는 항-PD-L1×CD47 HCAb(PPC Nb-IgG4)로 명명하였다.
상기 항-PD-L1×CD47 3가 HCAb(PPC Nb-IgG4)에서 인간 IgG4 Fc 도메인을 제외한 PD-L1×CD47 3가 sdAb의 아미노산 서열은 하기 [표 15]에 나타내었고, 상기 인간 IgG4 Fc 도메인을 포함한 항-PD-L1×CD47 3가 HCAb(PPC Nb-IgG4)의 아미노산 서열은 하기 [표 16]에 나타내었다.
| 단일 도메인 항체 | 단일 도메인 항체 서열 | 서열번호 |
| 항-PD-L1×CD47 sdAb (PPC Nb) |
QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSFAMSWVRQAPGKGLEWVSDINTGGDSTDYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLKPEDTAVYYCAKGPKEMVHVYSQRGQGTQVTVSSGGSGGGPSQVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSFAMSWVRQAPGKGLEWVSDINTGGDSTDYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLKPEDTAVYYCAKGPKEMVHVYSQRGQGTQVTVSSGGSGGSGGSQVQLVESGGGLVQPGGSLNLSCAVSGLTFFRKYAVGWARQVPGKGLERVSRIYSDRRIEYLDAVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKTEDTAVYYCATGLRVGLTGWDEYDYWGQGTQVTVSS | 13 |
| 단일 도메인 항체 | 단일 도메인 항체 서열 + Human IgG4 Fc 서열 | 서열번호 |
| 항-PD-L1×CD47 3가 HCAb (PPC Nb-IgG4) |
QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSFAMSWVRQAPGKGLEWVSDINTGGDSTDYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLKPEDTAVYYCAKGPKEMVHVYSQRGQGTQVTVSSGGSGGGPSQVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSFAMSWVRQAPGKGLEWVSDINTGGDSTDYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLKPEDTAVYYCAKGPKEMVHVYSQRGQGTQVTVSSGGSGGSGGSQVQLVESGGGLVQPGGSLNLSCAVSGLTFFRKYAVGWARQVPGKGLERVSRIYSDRRIEYLDAVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKTEDTAVYYCATGLRVGLTGWDEYDYWGQGTQVTVSSGPGGPESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK | 14 |
<3-2> 항-PD-L1×CD47 3가 HCAb(PPC Nb-IgG4)의 면역 항원 결합능 평가
상기 <실시예 9>에 기재된 방법과 동일한 방법으로 FACS를 이용하여 상기 실험예 <3-1>에서 정제한 항-PD-L1×CD47 3가 HCAb(PPC Nb-IgG4)의 PD-L1 항원 및 CD47 항원 결합능을 확인하였다.
그 결과, 도 4a 및 도 4b에 나타낸 바와 같이, 항-PD-L1×CD47 3가 HCAb(PPC Nb-IgG4)는 CHO-K1_PD-L1 세포(PD-L1 항원이 일정하게 발현하는 CHO-K1 세포)에서 13.33 nM(EC50)의 항원 결합능이 확인되었고, Expi-CHO_CD47 세포(CD47 항원이 일정하게 발현하는 Expi-CHO 세포)에서 18.80 nM(EC50)의 항원 결합능이 나타났다.
<3-3> 항-PD-L1×CD47 3가 HCAb(PPC Nb-IgG4)의 PD-1/PD-L1 및 CD47/SIRPalpha 상호작용에 대한 억제능 평가
상기 <실시예 10>에 기재된 방법과 동일한 방법으로 FACS를 이용하여 상기 실험예 <3-1>에서 정제한 항-PD-L1×CD47 3가 HCAb(PPC Nb-IgG4)의 PD-1/PD-L1 및 CD47/SIRPalpha 상호작용에 대한 억제능을 평가하였다.
그 결과, 도 5a 및 도 5b에 나타낸 바와 같이, 항-PD-L1×CD47 3가 HCAb(PPC Nb-IgG4)는 PD-1/PD-L1 상호작용에 미치는 억제능이 9.15 nM(IC50)로 확인되었고, CD47/SIRPalpha 상호작용에 미치는 억제능은 22.44 nM(IC50)로 확인되었다.
<3-4> 항-PD-L1×CD47 3가 HCAb(PPC Nb-IgG4)와 면역 항원과의 친화도 평가
상기 실험예 <3-1>에서 정제한 항-PD-L1×CD47 3가 HCAb(PPC Nb-IgG4)와 PD-L1 항원 및 CD47 항원과의 친화도를 상기 <실시예 11>에 기재된 방법과 동일한 방법으로 평가하였다.
그 결과, 표 17에 나타낸 바와 같이, 항-PD-L1×CD47 3가 HCAb(PPC Nb-IgG4)는 PD-L1 항원에 대해 6.84 nM, CD47 항원에 대해 3.62 nM의 우수한 친화력을 확인하였다.
| 단일 도메인 항체 | Kd(M) | kon(1/Ms) | kdis(1/s) | |
| 항-PD-L1×CD47 3가 HCAb (PPC Nb-IgG4) |
PD-L1 | 6.84E-09 | 3.54E+05 | 2.42E-03 |
| CD47 | 3.62E-09 | 5.54E+05 | 2.01E-03 | |
<실험예 4> 인간화 항-PD-L1×CD47 3가 HCAb(hPPC Nb-IgG4) 제작 및
in vitro
특성 평가
<4-1> 인간화 항-PD-L1×CD47 3가 HCAb(hPPC Nb-IgG4) 제작
상기 <실험예 3>에서 제작한 항-PD-L1×CD47 3가 HCAb(PPC-Nb-IgG4)가 인간화된 인간화 항체는 상기 <실시예 7>에 기재된 방법과 동일한 방법으로 site directed mutagenesis를 통해 아미노산을 치환하여 제작하였고, 인간화 항-PD-L1×CD47 3가 HCAb(hPPC Nb-IgG4)로 명명하였다.
인간화 항-PD-L1×CD47 3가 HCAb(hPPC Nb-IgG4)는 인간 생식세포 계열 VH segment DP-47의 FR(frame region) 서열과 상동성을 비교하여 [표 18]에 나타내었다. 인간화 항-PD-L1×CD47 3가 HCAb(hPPC Nb-IgG4) 내 인간화 항-PD-L1 sdAb(hPDL1 Nb#01)의 FR1, 2, 3, 4 서열의 상동성은 평균 98.4%를 나타냈으며, 인간화 항-PD-L1×CD47 3가 HCAb(hPPC Nb-IgG4) 내 인간화 항-CD47 sdAb(hCD47 Nb#01)의 FR1, 2, 3, 4 서열의 상동성은 평균 89.6%로 확인하였다.
상기 인간화 항-PD-L1×CD47 3가 HCAb(hPPC Nb-IgG4)에서 인간 IgG4 Fc 도메인을 제외한 인간화 항-PD-L1×CD47 3가 sdAb(hPPC Nb)의 아미노산 서열, 인간화 항-PD-L1 sdAb 부위(hPDL1 Nb#01 및 인간화 항-CD47 sdAb 부위(hCD47 Nb#01)의 아미노산 서열은 하기 [표 19]에 나타내었고, 인간 IgG4 Fc 도메인을 포함하는 인간화 항-PD-L1×CD47 3가 HCAb(hPPC Nb-IgG4)의 아미노산 서열은 하기 [표 20]에 나타내었다.
| 단일 도메인 항체 | DP-47의 FR 서열과의 상동성 | ||||
| FR1(%) | FR2(%) | FR3(%) | FR4(%) | Average(%) | |
| hPDL1 Nb#01 | 96.0 | 100.0 | 97.4 | 100.0 | 98.4 |
| hCD47 Nb#01 | 96.0 | 87.5 | 83.8 | 90.9 | 89.6 |
| 단일 도메인 항체 | 단일 도메인 항체 서열 | 서열번호 |
| 인간화 항-PD-L1×CD47 3가 sdAb (hPPC Nb) |
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSFAMSWVRQAPGKGLEWVSDINTGGDSTDYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLKPEDTAVYYCAKGPKEMVHVYSQRGQGTQVTVSSGGSGGGPSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSFAMSWVRQAPGKGLEWVSDINTGGDSTDYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLKPEDTAVYYCAKGPKEMVHVYSQRGQGTQVTVSSGGSGGSGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLNLSCAVSGLTFFRKYAVGWARQVPGKGLERVSRIYSDRRIEYLDAVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKTEDTAVYYCATGLRVGLTGWDEYDYWGQGTQVTVSS | 15 |
| 인간화 항-PD-L1 sdAb (hPDL1 Nb#01) |
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSFAMSWVRQAPGKGLEWVSDINTGGDSTDYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLKPEDTAVYYCAKGPKEMVHVYSQRGQGTQVTVSS | 16 |
| 인간화 항-CD47 sdAb (hCD47 Nb#01) |
EVQLVESGGGLVQPGGSLNLSCAVSGLTFFRKYAVGWARQVPGKGLERVSRIYSDRRIEYLDAVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKTEDTAVYYCATGLRVGLTGWDEYDYWGQGTQVTVSS | 17 |
| 단일 도메인 항체 | 단일 도메인 항체 서열 + Human IgG4 Fc 서열 | 서열번호 |
| 인간화 항-PD-L1×CD47 3가 HCAb (hPPC Nb-IgG4) |
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSFAMSWVRQAPGKGLEWVSDINTGGDSTDYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLKPEDTAVYYCAKGPKEMVHVYSQRGQGTQVTVSSGGSGGGPSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSFAMSWVRQAPGKGLEWVSDINTGGDSTDYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLKPEDTAVYYCAKGPKEMVHVYSQRGQGTQVTVSSGGSGGSGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLNLSCAVSGLTFFRKYAVGWARQVPGKGLERVSRIYSDRRIEYLDAVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKTEDTAVYYCATGLRVGLTGWDEYDYWGQGTQVTVSSGPGGPESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK | 18 |
또한, 인간화 항-PD-L1×CD47 3가 HCAb(hPPC Nb-IgG4)와의 비교를 위해, 상기 상기 실험예 <1-3>에서 제작한 항-PD-L1 2가 HCAb(PP Nb-IgG4)가 인간화된 인간화 항체는 상기와 동일한 방법으로 site directed mutagenesis를 통해 아미노산을 치환하여 제작하였고, 인간화 항-PD-L1 2가 HCAb(hPP Nb-IgG4)로 명명하였다. 또한, 상기 <실험예 2>에서 제작한 항-CD47 HCAb(CD47 Nb-IgG4)가 인간화된 인간화 항체는 상기와 동일한 방법으로 site directed mutagenesis를 통해 아미노산을 치환하여 제작하였고, 인간화 항-CD47 HCAb(hCD47 Nb-IgG4)로 명명하였다. 이들의 아미노산 서열은 하기 [표 21]에 나타내었다.
| 단일 도메인 항체 | 단일 도메인 항체 서열 + Human IgG4 Fc 서열 | 서열번호 |
| 인간화 항-PD-L1 2가 HCAb (hPP Nb-IgG4) |
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSFAMSWVRQAPGKGLEWVSDINTGGDSTDYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLKPEDTAVYYCAKGPKEMVHVYSQRGQGTQVTVSSGGSGGGPSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSFAMSWVRQAPGKGLEWVSDINTGGDSTDYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLKPEDTAVYYCAKGPKEMVHVYSQRGQGTQVTVSSGPGGPESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK | 31 |
| 인간화 항-CD47 HCAb (hCD47 Nb-IgG4) |
EVQLVESGGGLVQPGGSLNLSCAVSGLTFFRKYAVGWARQVPGKGLERVSRIYSDRRIEYLDAVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKTEDTAVYYCATGLRVGLTGWDEYDYWGQGTQVTVSSGPGGPESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK | 32 |
<4-2> 인간화 항-PD-L1×CD47 3가 HCAb(hPPC Nb-IgG4)의 면역 항원 결합능 평가
상기 <실시예 9>에 기재된 방법과 동일한 방법으로 FACS를 이용하여 상기 실험예 <4-1>에서 정제한 인간화 항-PD-L1×CD47 3가 HCAb(hPPC Nb-IgG4)의 PD-L1 항원 및 CD47 항원 결합능을 확인하였다.
그 결과, 도 6a 및 6b에 나타낸 바와 같이, 인간화 항-PD-L1×CD47 3가 HCAb(hPPC Nb-IgG4)는 CHO-K1_PD-L1 세포(PD-L1 항원이 일정하게 발현하는 CHO-K1 세포)에서 11.48 nM(EC50)의 항원 결합능이 확인되었고, Expi-CHO_CD47 세포(CD47 항원이 일정하게 발현하는 Expi-CHO 세포)에서 22.68 nM(EC50)의 항원 결합능이 나타났다.
<4-3> 인간화 항-PD-L1×CD47 3가 HCAb(hPPC Nb-IgG4)의 PD-1/PD-L1 및 CD47/SIRPalpha 상호작용에 대한 억제능 평가
상기 <실시예 10>에 기재된 방법과 동일한 방법으로 FACS를 이용하여 상기 실험예 <4-1>에서 정제한 인간화 항-PD-L1×CD47 3가 HCAb(hPPC Nb-IgG4)의 PD-1/PD-L1 및 CD47/SIRPalpha 상호작용에 대한 억제능을 평가하였다.
그 결과, 도 7a 및 도 7b에 나타낸 바와 같이, 인간화 항-PD-L1×CD47 3가 HCAb(hPPC Nb-IgG4)는 PD-1/PD-L1 상호작용에 미치는 억제능이 6.83 nM(IC50)로 확인되었고, CD47/SIRPalpha 상호작용에 미치는 억제능은 33.04 nM(IC50)로 확인되었다.
<4-4> 인간화 항-PD-L1×CD47 3가 HCAb(hPPC Nb-IgG4)와 면역 항원과의 친화도 평가
상기 실험예 <4-1>에서 정제한 인간화 항-PD-L1×CD47 3가 HCAb(hPPC Nb-IgG4)와 PD-L1 항원 및 CD47 항원과의 친화도를 상기 <실시예 11>에 기재된 방법과 동일한 방법으로 평가하였다.
그 결과, 표 21에 나타낸 바와 같이, 인간화 항-PD-L1×CD47 3가 HCAb(hPPC Nb-IgG4)는 PD-L1 항원에 대해 6.77 nM, CD47 항원에 대해 3.34 nM의 우수한 친화력을 확인하였다.
| 단일 도메인 항체 | Kd(M) | kon(1/Ms) | kdis(1/s) | |
| 인간화 항-PD-L1×CD47 3가 HCAb (hPPC Nb-IgG4) |
PD-L1 | 6.77E-09 | 3.76E+05 | 2.54E-03 |
| CD47 | 3.34E-09 | 8.66E+05 | 2.89E-03 | |
<4-5> 인간화 항-PD-L1×CD47 3가 HCAb(hPPC Nb-IgG4)와 종간 면역 항원과의 친화도 평가
상기 실험예 <4-1>에서 정제한 인간화 항-PD-L1×CD47 3가 HCAb(hPPC Nb-IgG4)의 종간 PD-L1 항원 및 CD47 항원과의 친화도를 상기 <실시예 11>에 기재된 방법과 동일한 방법으로 평가하였다.
그 결과, 표 23에 나타낸 바와 같이, 인간화 항-PD-L1×CD47 3가 HCAb (hPPC-Nb-IgG4)는 인간 PD-L1과 인간 CD47 항원에 대해 각각 6.77 nM, 3.34 nM의 항원 친화력을 확인하였고, 원숭이 PD-L1과 원숭이 CD47 항원에 대해 각각 8.17 nM, 6.91 nM의 항원 친화력을 확인하였다. 마우스 PD-L1과 마우스 CD47 항원에 대해서는 항원 친화력이 확인되지 않았다.
| 단일 도메인 항체 | PD-L1 | CD47 | |||||
| Kd(M) | kon(1/Ms) | kdis(1/s) | Kd(M) | kon(1/Ms) | kdis(1/s) | ||
| 인간화 항- PD-L1×CD37 3가 HCAb (hPPC Nb-IgG4) |
Human | 6.77E-09 | 3.76E+05 | 2.54E-03 | 3.34E-09 | 8.66E+05 | 2.89E-03 |
| Cynomolgus | 8.17E-09 | 3.56E+05 | 2.90E-03 | 6.91E-09 | 2.34E+05 | 1.61E-03 | |
| Mouse | ND | ND | |||||
<실험예 5> 인간화 항-PD-L1×CD47 3가 HCAb(hPPC Nb-IgG4)의
in vitro
평가
<5-1> 인간화 항-PD-L1×CD47 3가 HCAb(hPPC Nb-IgG4)의 T 세포 활성 평가
상기 실시예 <12-1>에 기재된 방법과 동일한 방법으로 상기 실험예 <4-1>에서 정제한 인간화 항-PD-L1×CD47 3가 HCAb(hPPC Nb-IgG4)가 PD-L1을 발현하는 CHO-K1 세포와 PD-1을 발현한 jurkat 세포 간의 상호작용을 방해하여 jurkat 세포로부터 발현되는 IL-2 농도를 측정하여 인간화 항-PD-L1×CD47 3가 HCAb(hPPC Nb-IgG4)의 T 세포 활성을 평가하였다.
그 결과, 도 8에 나타낸 바와 같이, 인간화 항-PD-L1×CD47 3가 HCAb(hPPC Nb-IgG4)는 1.47 nM(IC50)의 효능을 나타내었다.
<5-2> 인간화 항-PD-L1×CD47 3가 HCAb(hPPC Nb-IgG4)의 혼합림프구반응에서의 CD4
+
T 세포의 활성화 평가
상기 실시예 <12-2>에 기재된 방법과 동일한 방법으로 혼합림프구반응 분석(Mixed lymphocyte reaction(MLR) assay)을 수행하여 상기 실험예 <4-1>에서 정제한 인간화 항-PD-L1×CD47 3가 HCAb(hPPC Nb-IgG4)의 혼합림프구반응에서의 CD4+ T 세포의 활성화를 평가하였다. 비교예로 상기 실험예 <4-1>에서 제작한 인간화 항-PD-L1 2가 HCAb(hPP Nb-IgG4), 인간화 항-CD47 HCAb(hCD47 Nb-IgG4) 및 이들의 혼합물(1 : 1 혼합)을 이용하였다.
그 결과, 도 9a 및 도 9b에 나타낸 바와 같이, 인간화 항-PD-L1×CD47 3가 HCAb(hPPC Nb-IgG4)는 CD4+ T 세포의 IL-2, IFN-gamma 생산에서 각각 0.08, 0.18 nM (Ec50)의 효능을 나타냈다. 또한, 인간화 항-PD-L1 2가 HCAb(hPP Nb-IgG4), 인간화 항-CD47 HCAb(hCD47 Nb-IgG4) 및 이들의 병용처리와 비교하여, 동등하거나 그 이상의 효능을 나타내는 것을 확인하였다.
<5-3> 인간화 항-PD-L1×CD47 3가 HCAb(hPPC Nb-IgG4)의 대식세포에 의한 식세포 작용 활성화 평가
상기 실시예 <12-3>에 기재된 방법과 동일한 방법으로 PMA에 의해 대식세포화 된 THP-1 세포를 이용하여 상기 실험예 <4-1>에서 정제한 인간화 항-PD-L1×CD47 3가 HCAb(hPPC Nb-IgG4)의 CD47 항원 발현 prey 세포(Raji 세포)에 대한 선택적 결합을 통한 대식세포에 의한 식세포 작용 정도를 평가하였다.
그 결과, 도 10a에서 나타낸 바와 같이, 인간화 항-PD-L1×CD47 3가 HCAb(hPPC Nb-IgG4) 처리군은 대조군에 비해 월등한 식세포 작용 효과를 나타내었다.
또한, 실시예 <12-4>에 기재된 방법과 동일한 방법으로 인간 PBMC에서 분리한 단핵구로부터 분화된 대식세포를 이용하여 상기 실험예 <4-1>에서 정제한 인간화 항-PD-L1×CD47 3가 HCAb(hPPC Nb-IgG4)의 PD-L1 및 CD47 항원 발현 prey 세포(Raji_PDL1)에 대한 선택적 결합을 통한 대식세포에 의한 식세포 작용 정도를 평가하였다. 비교예로 상기 실험예 <4-1>에서 제작한 인간화 항-PD-L1 2가 HCAb(hPP Nb-IgG4), 인간화 항-CD47 HCAb(hCD47 Nb-IgG4) 및 이들의 혼합물(1 : 1 혼합)을 이용하였다.
그 결과, 도 10b에 나타낸 바와 같이, 인간화 항-PD-L1×CD47 3가 HCAb(hPPC Nb-IgG4) 처리군은 인간화 항-PD-L1 2가 HCAb(hPP Nb-IgG4) 단독 처리군(0.522 pM), 인간화 항-CD47 HCAb(hCD47 Nb-IgG4) 단독 처리군(0.181 pM) 및 이들의 병용처리군(0.159 pM)에 비해 낮은 농도(0.005 pM)에서 식세포 작용을 효과적으로 유도하였다.
<실험예 6> 인간화 항-PD-L1×CD47 3가 HCAb(hPPC Nb-IgG4)의
in vitro
안전성 평가
<6-1> 인간화 항-PD-L1×CD47 3가 HCAb(hPPC Nb-IgG4)의 인간 RBC 결합 평가
상기 실시예 <13-1>에 기재된 방법과 동일한 방법으로 상기 실험예 <4-1>에서 정제한 인간화 항-PD-L1×CD47 3가 HCAb(hPPC Nb-IgG4)의 인간 RBC 결합능을 평가하였다.
그 결과, 도 11에 나타낸 바와 같이, 인간화 항-PD-L1×CD47 3가 HCAb(hPPC Nb-IgG4)는 양성대조군으로 사용한 CD47 단일클론항체와 달리 3 uM 농도에서 RBC 결합이 확인되지 않았다.
<6-2> 인간화 항-PD-L1×CD47 3가 HCAb(hPPC Nb-IgG4)의 적혈구응집반응 평가
상기 실시예 <13-2>에 기재된 방법과 동일한 방법으로 상기 실험예 <4-1>에서 정제한 인간화 항-PD-L1×CD47 3가 HCAb(hPPC Nb-IgG4)의 적혈구응집반응을 평가하였다.
그 결과, 도 12에 나타낸 바와 같이, 인간화 항-PD-L1×CD47 3가 HCAb(hPPC Nb-IgG4)는 양성대조군으로 사용한 CD47 단일클론항체와 달리 3 uM 농도에서 적혈구응집반응이 확인되지 않았다.
<실험예 7> 인간화 항-PD-L1×CD47 3가 HCAb(hPPC Nb-IgG4)의
in vivo
유효성 평가
상기 <실시예 14>에 기재된 방법과 동일한 방법으로 PD-L1과 CD47 항원을 발현하는 종양세포(B16F10 세포)를 주입하여 종양이 형성된 C57BL/6 마우스 모델, PD-L1과 CD47 항원을 발현하는 종양세포(Raji_PD-L1 세포)를 주입하여 종양이 형성된 인간화 NSG 마우스 모델 및 인간 유방암 세포주 MDA-MB-231를 주입하여 종양이 형성된 인간화 NSG 마우스 모델에서 상기 실험예 <4-1>에서 정제한 인간화 항-PD-L1×CD47 3가 HCAb(hPPC Nb-IgG4)의 항종양 효과를 확인하였다.
그 결과, 도 13에 나타낸 바와 같이, 종양이 형성된 C57BL/6 마우스 모델에서 인간화 항-PD-L1×CD47 3가 HCAb(hPPC Nb-IgG4)는 음성대조군(Isotype) 대비 약 73.61%의 항종양 효과가 나타났다.
또한, 도 14에 나타낸 바와 같이, 종양이 형성된 인간화 NSG 마우스 모델에서 인간화 항-PD-L1×CD47 3가 HCAb(hPPC Nb-IgG4)는 음성대조군(Isotype) 대비 약 73.41%의 항종양 효과가 나타났다.
또한, 도 15a 및 도 15b에 나타낸 바와 같이, 종양이 형성된 인간화 NSG 마우스 모델에서 인간화 항-PD-L1×CD47 3가 HCAb(hPPC Nb-IgG4)는 음성대조군(Isotype) 대비 약 81.98%의 항종양 효과가 나타났다. 또한, 10 mpk의 인간화 항-PD-L1×CD47 3가 HCAb(hPPC Nb-IgG4) 투여군의 예상 생존율은 음성대조군(Isotype) 대비 유의적인 차이를 나타냈다.
Claims (31)
- PD-L1에 특이적으로 결합하는 제1 인간화 단일 도메인 항체(제1 hsdAb) 또는 이의 항원-결합 단편; 및 CD47에 특이적으로 결합하는 제2 인간화 단일 도메인 항체(제2 hsdAb) 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는, PD-L1 및 CD47에 이중특이적으로 결합하는 이중특이적 항체.
- 제 1항에 있어서, 상기 제1 hsdAb 또는 이의 항원-결합 단편은 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 CDR1; 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 CDR2; 및 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 CDR3를 포함하는, PD-L1 및 CD47에 이중특이적으로 결합하는 이중특이적 항체.
- 제 1항에 있어서, 상기 제2 hsdAb 또는 이의 항원-결합 단편은 서열번호 9로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 CDR1; 서열번호 10으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 CDR2; 및 서열번호 11로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 CDR3를 포함하는, PD-L1 및 CD47에 이중특이적으로 결합하는 이중특이적 항체.
- 제 1항에 있어서, 상기 제1 hsdAb 또는 제2 hsdAb는 서열번호 16 서열과 적어도 95%의 서열 동일성을 가지는 중쇄 가변 도메인 프레임워크 서열을 포함하는, PD-L1 및 CD47에 이중특이적으로 결합하는 이중특이적 항체.
- 제 1항에 있어서, 상기 제1 hsdAb 또는 이의 항원-결합 단편, 또는 제2 hsdAb 또는 이의 항원-결합 단편은 서열번호 17 서열과 적어도 85%의 서열 동일성을 가지는 중쇄 가변 도메인 프레임워크 서열을 포함하는, PD-L1 및 CD47에 이중특이적으로 결합하는 이중특이적 항체.
- 제 1항에 있어서, 상기 제1 hsdAb 또는 이의 항원-결합 단편, 또는 제2 hsdAb 또는 이의 항원-결합 단편은 서열번호 16 또는 17 서열과 100%의 서열 동일성을 가지는 중쇄 가변 도메인 프레임워크 서열을 포함하는, PD-L1 및 CD47에 이중특이적으로 결합하는 이중특이적 항체.
- 제 6항에 있어서, 상기 제1 hsdAb 또는 이의 항원-결합 단편은 하기의 중쇄 가변 도메인 프레임워크 서열을 포함하는, PD-L1 및 CD47에 이중특이적으로 결합하는 이중특이적 항체:
(1) 서열번호 19 및 23 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 FR1;
(2) 서열번호 20 및 24 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 FR2;
(3) 서열번호 21 및 25 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 FR3; 및
(4) 서열번호 22 및 26 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 FR4.
- 제 7항에 있어서, 상기 제1 hsdAb 또는 이의 항원-결합 단편은 하기의 중쇄 가변 도메인 프레임워크 서열을 포함하는, PD-L1 및 CD47에 이중특이적으로 결합하는 이중특이적 항체:
서열번호 19로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 FR1;
서열번호 20으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 FR2;
서열번호 21로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 FR3; 및
서열번호 22로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 FR4.
- 제 6항에 있어서, 상기 제2 hsdAb 또는 이의 항원-결합 단편은 하기의 중쇄 가변 도메인 프레임워크 서열을 포함하는, PD-L1 및 CD47에 이중특이적으로 결합하는 이중특이적 항체:
(1) 서열번호 19 및 23 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 FR1;
(2) 서열번호 20 및 24 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 FR2;
(3) 서열번호 21 및 25 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 FR3; 및
(4) 서열번호 22 및 26 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 FR4.
- 제 9항에 있어서, 상기 제2 hsdAb 또는 이의 항원-결합 단편은 하기의 중쇄 가변 도메인 프레임워크 서열을 포함하는, PD-L1 및 CD47에 이중특이적으로 결합하는 이중특이적 항체:
서열번호 23으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 FR1;
서열번호 24로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 FR2;
서열번호 25로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 FR3; 및
서열번호 26으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 FR4.
- 제 1항에 있어서, 상기 제1 hsdAb는 서열번호 16으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진, PD-L1 및 CD47에 이중특이적으로 결합하는 이중특이적 항체.
- 제 7항에 있어서, 상기 제2 hsdAb는 서열번호 17로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진, PD-L1 및 CD47에 이중특이적으로 결합하는 이중특이적 항체.
- 제 1항에 있어서, 상기 제1 hsdAb 또는 이의 항원-결합 단편은 펩티드 링커를 통해 제2 hsdAb 또는 이의 항원-결합 단편과 서로 융합되는 것인, PD-L1 및 CD47에 이중특이적으로 결합하는 이중특이적 항체.
- 제 13항에 있어서, 상기 펩티드 링커를 통해 서로 융합되는 제1 hsdAb 및 제2 hsdAb는 서열번호 15로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진, PD-L1 및 CD47에 이중특이적으로 결합하는 이중특이적 항체.
- 제 1항에 있어서, 상기 제1 hsdAb 또는 이의 항원-결합 단편, 또는 제2 hsdAb 또는 이의 항원-결합 단편에 Fc 단편이 융합된 중쇄-단독 항체(HCAb)인, PD-L1 및 CD47에 이중특이적으로 결합하는 이중특이적 항체.
- 제 15항에 있어서, 상기 HCAb는 단량체성 또는 다량체성인, PD-L1 및 CD47에 이중특이적으로 결합하는 이중특이적 항체.
- 제 15항에 있어서, 상기 Fc 단편은 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4인, PD-L1 및 CD47에 이중특이적으로 결합하는 이중특이적 항체.
- 제 15항에 있어서, 상기 제1 hsdAb 또는 이의 항원-결합 단편 및 제2 hsdAb 또는 이의 항원-결합 단편이 펩티드 링커를 통해 Fc 단편에 융합되는, PD-L1 및 CD47에 이중특이적으로 결합하는 이중특이적 항체.
- 제 15항에 있어서, 상기 HCAb는 서열번호 18로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진, PD-L1 및 CD47에 이중특이적으로 결합하는 이중특이적 항체.
- 제 15항에 있어서, 적어도 1개 이상의 아미노산 치환을 포함하는, PD-L1 및 CD47에 이중특이적으로 결합하는 이중특이적 항체.
- 제 20항에 있어서, 적어도 1개 이상의 아미노산 치환이 보존적 치환인, PD-L1 및 CD47에 이중특이적으로 결합하는 이중특이적 항체.
- 제 21항에 있어서, 적어도 1개의 아미노산 치환이 아미노산의 비-유전자 코딩 아미노산 또는 합성 아미노산으로의 치환인, PD-L1 및 CD47에 이중특이적으로 결합하는 이중특이적 항체.
- 제 1항에 있어서, 면역조정제, 사이토카인, 세포독성제, 화학요법제, 진단제, 항바이러스제, 항미생물제 또는 약물에 접합된 PD-L1 및 CD47에 이중특이적으로 결합하는 이중특이적 항체.
- 면역조정제, 사이토카인, 세포독성제, 화학요법제, 진단제, 항바이러스제, 항미생물제 또는 약물에 접합된 제1항의 PD-L1 및 CD47에 이중특이적으로 결합하는 이중특이적 항체를 포함하는 항체 접합체.
- 제 1항의 PD-L1 및 CD47에 이중특이적으로 결합하는 이중특이적 항체를 암호화하는 핵산 분자.
- 제 25항의 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터.
- 제 26항의 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포.
- (a) 이중특이적 항체가 발현되도록 하는 조건 하에 제 26항의 숙주 세포를 배양하는 단계; 및
(b) 발현된 이중특이적 항체를 회수하는 단계
를 포함하는, PD-L1 및 CD47에 이중특이적으로 결합하는 이중특이적 항체를 생산하는 방법.
- 제 1항의 PD-L1 및 CD47에 이중특이적으로 결합하는 이중특이적 항체 또는 제 24항의 항체 접합체를 유효성분으로 함유하는, 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 제 29항에 있어서, 상기 암은 흑색종, 폐암, 간암, 교세포종, 난소암, 대장암, 두경부암, 방광암, 신장세포암, 위암, 유방암, 전이암, 전립선암, 췌장암, 비호지킨 림프종, 호지킨 림프종, 다발성 골수종, 백혈병, 림프종, 골수이형성증후군, 급성 림프모구성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 고립성 골수종 및 재생불량성 빈혈로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
- 제 29항에 있어서, 상기 약학적 조성물은 약학적으로 허용되는 담체를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
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