CN111569055A - 一种人用流感疫苗的生产方法及设备 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种人用流感疫苗的生产方法及设备，具体方法包括利用多级生物反应器微载体悬浮培养对MDCK细胞进行多次扩增，当MDCK细胞扩增到所需数量时接种人流感病毒，最后获得病毒液并进行病毒液的过滤浓缩、灭活、裂解和纯化操作，得人用流感疫苗。在所述多级生物反应器中，当上一级生物反应器中的细胞悬液转移到下一级生物反应器中后，再向上一级生物反应器中加入下一批次细胞悬液，从而使每级生物反应器不间断生产。本发明所述一种人用流感疫苗的生产方法及设备，可以实现人用流感疫苗的可控化和连续性生产，生产周期短，适合大规模工业化生产。
Description
技术领域
本发明涉及生物制药领域，具体涉及一种人用流感疫苗的生产方法及设备。
背景技术
流行性感冒是由流感病毒引起的一种发病率高、流行广泛、传播迅速的急性病毒性呼吸道传染病，至今仍无法完全加以控制。流行性感冒是人们日常生活中经常会遇到的疾病，大多数人在一生之中都至少得一次流感。当然大多数的流感危害性不大，但由于其传染源广泛且传播途径众多，流感仍是影响当代人类健康的主要杀手之一。导致流感发生的直接原因是感染流感病毒，所以预防病毒感染的最有效的方法是注射流感疫苗。流感的大范围爆发给人类带来沉重灾难，WHO认为降低流感危害的主要措施是注射流感疫苗。因此提高疫苗生产的自动化程度，缩短生产周期，降低生产成本，发明适合大规模工业化生产的流感疫苗制备具有非常重要的意义。
目前国内企业生产流感疫苗的主要方式仍是凭借传统的鸡胚制备流感疫苗，而这种传统的培养模式存在许多不足，其使用数量、操作人员数量、占地规模等存在诸多不利，鸡胚制备的疫苗中存在卵清蛋白，可能导致过敏反应，疫苗产品的质量也变得逐渐不能够满足人们对高质量疫苗的需要。
现代基因工程技术的发展，促进了细胞培养方式制药的快速进展，目前国外已经获得批准上市的MDCK细胞流感疫苗生产企业已有Solvay、Novartis、Med Immune3家企业，反应器规模50L-2500L范围，研究表明10L反应器中密度为106cells/mL细胞数量制备的疫苗产量相当于10000只鸡胚的产量。国内细胞生产流感疫苗目前还处于空白，因此采用细胞基质培养流感病毒应用于疫苗生产具有诸多优越性，疫苗质量得到极大提高。虽然一些公司的鸡胚源亚单位疫苗继续在生产，但已经开发出新型流感疫苗的制造平台。
MDCK细胞生产的疫苗比在鸡胚中生产的疫苗与人类有更高的同源性，细胞培养流感疫苗已在欧洲、北美等国家地区应用近10年，证实是安全有效的。
微载体悬浮培养实际是一种贴壁的细胞培养技术和悬浮培养技术的结合，在生物反应器中使用细胞吸附于无害的微载体颗粒中，在搅拌的作用下使微载体保持悬浮状态。但目前国内细胞悬浮培养技术发展相对滞后，国内疫苗生产企业仅少数利用生物反应器悬浮培养生产疫苗，反应器的规模与国外相比也有很大的差距。
发明内容
针对现有技术方案中的问题，本发明的目的是提供一种人用流感疫苗的生产方法及设备，该方法和设备可以实现人用流感疫苗的可控化和连续性生产，且生产周期短，适合大规模工业化生产，本发明的另一个目的是提供一种可工业化大规模地扩大培养悬浮细胞的方法。
为实现上述目的，本发明提供的技术方案为：
一种人用流感疫苗的生产方法及设备，包括以下步骤：
（1）MDCK细胞在多级生物反应器微载体上扩增：
取生长良好的MDCK细胞，胰酶溶液消化，加入细胞培养液终止消化后转移至一级生物反应器F微载体上，补充细胞培养液使一级生物反应器F中细胞密度为1-5×105cells/mL，开始搅拌；MDCK细胞在一级生物反应器F微载体上扩增培养完成后，停止搅拌并从该级生物反应器排出细胞培养液，用PBS溶液清洗微载体及其上的细胞，排出PBS溶液，加入胰酶溶液至完全淹没微载体，待细胞完全从微载体上消化脱落后，立即加入2-4倍胰酶溶液体积的细胞培养液终止消化，然后将细胞悬液输送至一个以上的次级生物反应器微载体上继续扩增培养；在不包含最后级的每一个次级生物反应器上的操作步骤为：从上一级生物反应器接收细胞悬液后，补充细胞培养液使MDCK细胞密度为1-5×105cells/mL后开始扩增培养并开始搅拌，待细胞密度达到培养目标时，停止搅拌并从该级生物反应器排出细胞培养液，用PBS溶液清洗微载体及其上的细胞，排出PBS溶液，加入胰酶溶液溶至完全淹没微载体，待细胞完全从微载体上消化脱落后，立即加入2-4倍胰酶溶液体积的细胞培养液终止消化，然后将细胞悬液输送至下一级生物反应器；
（2）人流感病毒的接种和繁殖：
当最后一级生物反应器从上一级反应器接收细胞悬液后，补充细胞培养液使MDCK细胞密度为1-5×105cells/mL后开始扩增培养并开始搅拌，待细胞密度达到培养目标时，停止搅拌并从该级生物反应器排出细胞培养液，用PBS溶液清洗微载体及其上的细胞，排出PBS溶液后将人流感病毒加入最后一级生物反应器中进行吸附，吸附温度33-37℃，吸附时间20-40min，吸附完成后加入与细胞培养液等体积的病毒培养液进行培养；
（3）多次收获病毒液：
（31）在最后一级生物反应器中，待90%以上MDCK细胞产生病变后，停止搅拌使微载体自然下沉，收集生物反应器内上清液，所述上清液即病毒液，收集完成后加入病毒培养液继续培养；
（32）培养18-30h后，停止搅拌使微载体自然下沉，收集生物反应器内病毒液，收集完成后加入病毒培养液继续培养；
（33）多次重复步骤（32），至微载体细胞脱落60%以上后终止；按照人用流感疫苗检测规程对获得的病毒液进行检测，检测指标中，病毒液的血凝滴度不低于1:160；
（4）将步骤（3）得到的病毒液进行过滤浓缩、灭活、裂解和纯化，得到流感疫苗。
进一步的，所述微载体密度为每升培养体积对应微载体5-40g。
进一步的，所述步骤（2）所述的人流感病毒为WHO提供的甲型和乙型流感病毒株。
进一步的，所述步骤（1）和（2）中细胞培养液的配制方法为：新生牛血清体积分数比为2-5%、3%L-谷氨酰胺体积分数比为1%，非必需氨基酸体积分数比为1%，剩余为MEM培养液，将上述成分混合后用碳酸氢钠溶液调节pH至7.4-8.2；所述步骤（1）和（2）中MDCK细胞扩增培养时的条件设定为:培养温度36-38℃，溶氧量30%-50%，搅拌速度40-80rpm。
进一步的，所述步骤（2）和（3）中病毒培养液的配制方法为：3%L-谷氨酰胺体积分数比为1%、非必需氨基酸体积分数比为1%，TPCK胰蛋白酶浓度为1μg/mL，剩余为MEM培养液，将上述成分混合后用碳酸氢钠溶液调pH至7.4-8.2；所述步骤（2）和（3）中病毒接种和繁殖的条件设定为：培养温度33-35℃，溶氧量30%-50% ，转速40-80rpm。
进一步的，在所述多级生物反应器中，当上一级生物反应器中的细胞悬液转移到下一级生物反应器后，再向上一级生物反应器中加入下一批次细胞悬液。
一种人用流感疫苗的生产方法及设备，包括一级生物反应器F和一个以上的次级生物反应器、细胞培养液罐A、病毒培养液罐B、过滤系统C、废液罐D、收液罐E、气体泵J、PBS储存罐K和多个液体传输系统，所述一级生物反应器F和一个以上的次级生物反应器的上方进液口与PBS储存罐K、细胞培养液罐A和病毒培养液罐B的出液口通过液体传输系统相连；所述一级生物反应器F和一个以上的次级生物反应器的下方出液口与废液罐D的进液口通过液体传输系统相连；在不包括最后级的每一级生物反应器的下方出液口还与其次级生物反应器的侧壁上的进液口通过液体传输系统相连，最后级生物反应器的下方出液口还与收液罐E的上方进液口通过液体传输系统相连；所述收液罐E的下方出液口与过滤系统C的进液口通过液体传输系统相连；所述液体传输系统上设有控制阀和压力传输口，所述压力传输口可与气体泵J通过软管连接。
进一步的，所述一级生物反应器F和一个以上的次级生物反应器具有控温、灭菌、搅拌、细胞密度监测等装置。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明通过多级生物反应器进行细胞换液、细胞消化和重悬、细胞悬液的转移等操作，实现了细胞可控化扩增，这样可以有效的防止细胞在增殖过程中的污染，提高产品质量，降低生产成本，另外通过多级生物反应器进行不同批次MDCK细胞的同时在线培养缩短了疫苗生产时间，提高了疫苗生产效率，对患者而言，流感大规模流行时，可快速生产出大量疫苗，对生产者而言，可降低成本，提高利润空间。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。
在附图中：图1为本发明的一种具体实施方式的系统框图，
图2为一种多级生物反应器的整体结构示意图。
附图标记： A-500L细胞培养液罐；B-1000L病毒培养液罐；C-过滤系统；D-废液罐；E-1000L收液罐；F-7.5L一级生物反应器；G-50L二级生物反应器；H-500L三级生物反应器；J-气体泵；K-PBS储存罐；L-液体传输系统1；M-液体传输系统2；N-控制阀；O-压力传输口。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别声名，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用的原料均为市售商品。
本发明中涉及到的百分号“%”，若未特别说明，是指质量百分比；但溶液的百分百，除另有规定外，是指100mL中含有的溶质的克数；液体之间的百分百，是指20℃时容量的比例。
一种人用流感疫苗的生产方法及设备，包括以下步骤：
（1）MDCK细胞在多级生物反应器微载体上扩增：
取生长良好的MDCK细胞，胰酶溶液消化，加入细胞培养液终止消化后转移至一级生物反应器F微载体上，补充细胞培养液使一级生物反应器F中细胞密度为1-5×105cells/mL，开始搅拌；MDCK细胞在一级生物反应器F微载体上扩增培养完成后，停止搅拌并从该级生物反应器排出细胞培养液，用PBS溶液清洗微载体及其上的细胞，排出PBS溶液，加入胰酶溶液至完全淹没微载体，待细胞完全从微载体上消化脱落后，立即加入2-4倍胰酶溶液体积的细胞培养液终止消化，然后将细胞悬液输送至一个以上的次级生物反应器微载体上继续扩增培养；在不包含最后级的每一个次级生物反应器上的操作步骤为：从上一级生物反应器接收细胞悬液后，补充细胞培养液使MDCK细胞密度为1-5×105cells/mL后开始扩增培养并开始搅拌，待细胞密度达到培养目标时，停止搅拌并从该级生物反应器排出细胞培养液，用PBS溶液清洗微载体及其上的细胞，排出PBS溶液，加入胰酶溶液溶至完全淹没微载体，待细胞完全从微载体上消化脱落后，立即加入2-4倍胰酶溶液体积的细胞培养液终止消化，然后将细胞悬液输送至下一级生物反应器；
MDCK细胞的增殖受到基质表面积的限制，影响疫苗的大规模生产，所述MDCK细胞培养过程通过多级生物反应器微载体悬浮培养可以解决MDCK细胞生长面积受限的问题，实现细胞高密度快速增长，且通过多级生物反应器逐级放大培养实现MDCK细胞可控和无菌的大规模生产。
（2）人流感病毒的接种和繁殖：
当最后一级生物反应器从上一级反应器接收细胞悬液后，补充细胞培养液使MDCK细胞密度为1-5×105cells/mL后开始扩增培养并开始搅拌，待细胞密度达到培养目标时，停止搅拌并从该级生物反应器排出细胞培养液，用PBS溶液清洗微载体及其上的细胞，排出PBS溶液后将人流感病毒加入最后一级生物反应器中进行吸附，吸附温度33-37℃，吸附时间20-40min，吸附完后加入与细胞培养液等体积的病毒培养液进行培养；
（3）多次收获病毒液：
（31）在最后一级生物反应器中，待90%以上MDCK细胞产生病变后，停止搅拌使微载体自然下沉，收集生物反应器内上清液，所述上清液即病毒液，收集完成后加入病毒培养液继续培养；
（32）培养18-30h后，停止搅拌使微载体自然下沉，收集生物反应器内病毒液，收集完成后加入病毒培养液继续培养；
（33）多次重复步骤（32），至微载体细胞脱落60%以上后终止；按照人用流感疫苗检测规程对获得的病毒液进行检测，检测指标中，病毒液中血凝滴度不低于1:160；
（4）将步骤（3）得到的病毒液进行过滤浓缩、灭活、裂解和纯化，得到流感疫苗。
所述步骤（4）的过滤浓缩操作步骤为：在过滤系统C中装备0.45μm PP（polypropylene，聚丙烯）材质滤芯和超滤部分，超滤部分包括多张并联的100KD超滤膜；病毒液首先经过滤系统C中的滤芯初滤，从而实现细胞残渣、颗粒杂质等物质与病毒颗粒进行初步分离，再经过100KD超滤膜进行超滤浓缩，调节超滤部分的卫生转子泵转速保证超滤部分的进液口压力≤2.0bar，回流口压力≤1.0bar，让过滤后的病毒液反复循环通过超滤部分，从而实现病毒液的浓缩和杂质的去除，收获浓缩后的病毒液；合并多次收获的浓缩后的病毒液。
所述步骤（4）的灭活操作步骤为：将浓缩后的病毒液，加入适宜浓度的β-丙内酯，混匀后置2-8℃环境中进行病毒的灭活，灭活过程前期需定期或持续混匀病毒液，灭活完成后在适宜温度下进行水解；
所述步骤（4）的裂解操作步骤为：灭活完成后加入适宜浓度的Triton X100（聚乙二醇辛基苯基醚）裂解剂在适宜条件下进行病毒的裂解；
所述步骤（4）的纯化操作步骤为：将裂解后的病毒液采用柱色谱方法，层析介质为Sepharose 6FF凝胶，上样量不超过柱体积的10%，以PBS溶液为流动相，经280nm波长紫外监测，收集相应的流感病毒峰。
进一步的，所述微载体密度为每升培养体积对应微载体5-40g。
进一步的，步骤（2）所述的流感病毒株为WHO（World Health Organization，世界卫生组织）提供的甲型和乙型流感病毒株。
进一步的，所述步骤（1）和（2）中细胞培养液的配制方法为：新生牛血清体积分数比为2-5%、3%L-谷氨酰胺体积分数比为1%，非必需氨基酸体积分数比为1%，剩余为MEM培养液（minimum essential medium，最低基本培养基），将上述成分混合后用碳酸氢钠溶液调pH至7.4-8.2；所述步骤（1）和（2）中MDCK细胞扩增培养时的条件设定为:培养温度36-38℃，溶氧量30%-50%，搅拌速度40-80rpm。
进一步的，所述步骤（2）和（3）中病毒培养液的配制方法为：3%L-谷氨酰胺体积分数比为1%、非必需氨基酸体积分数比为1%，TPCK（Tosyl phenylalanyl chloromethylketone，对甲苯苯丙氨酸氯甲基酮）胰蛋白酶浓度为1μg/mL，剩余为MEM培养液，将上述成分混合后用碳酸氢钠溶液调pH至7.4-8.2；所述步骤（2）和（3）中病毒接种和繁殖的条件设定为：培养温度33-35℃，溶氧量30%-50% ，转速40-80rpm。
进一步的，在所述多级生物反应器中，当上一级生物反应器中的细胞转移到下一级生物反应器后，即向下一级生物反应器中加入上一级细胞悬液。
一种人用流感疫苗的生产方法及设备，包括一级生物反应器F和一个以上的次级生物反应器、细胞培养液罐A、病毒培养液罐B、过滤系统C、废液罐D、收液罐E、气体泵J、PBS储存罐K和多个液体传输系统，如图2中的液体传输系统1 L和液体传输系统2 M，所述一级生物反应器F和一个以上的次级生物反应器的上方进液口与PBS储存罐K、细胞培养液罐A和病毒培养液罐B的出液口通过液体传输系统相连；所述一级生物反应器F和一个以上的次级生物反应器的下方出液口与废液罐D的进液口通过液体传输系统相连；在不包括最后级的每一级生物反应器的下方出液口还与其次级生物反应器的侧壁上的进液口通过液体传输系统相连，最后级生物反应器的下方出液口还与收液罐E的上方进液口通过液体传输系统相连；所述收液罐E的下方出液口与过滤系统C的进液口通过液体传输系统相连；所述液体传输系统上设有控制阀和压力传输口，如图2中的控制阀N和压力传输口O，所述压力传输口可与气体泵J通过软管连接，当液体传输系统上无物料传输时，压力传输口处于关闭状态，当需要液体传输系统实现物料传输时，将该液体传输系统上的压力传输口与气体泵J通过软管连接，通过控制相应控制阀以及气体泵J的连接方式，实现物料的无菌在线输送。
进一步的，所述一级生物反应器F和一个以上的次级生物反应器具有控温、灭菌、搅拌、细胞密度监测等装置。
以下为具体实施例：
实施例1甲型流感病毒疫苗的生产方法和设备
包括以下步骤：
（1）MDCK细胞在多级生物反应器微载体上扩大培养：
从液氮罐中取出一支或多支装有MDCK细胞的冻存管，用38℃水浴快速溶解MDCK细胞，将溶解后的MDCK细胞接种到T75方瓶中，再添加细胞培养液到T75方瓶中，在37℃环境中置培养，待细胞生长成致密单层后，按1:8的比例分瓶扩增培养。
微载体前处理：称取适宜的干燥的Cytodex1型微载体，按Cytodex1微载体∶PBS溶液=1g∶50mL的比例加入PBS溶液，在室温下浸泡膨胀3小时，并伴随着温和的搅拌，浸泡结束后停止搅拌，自然沉降11min后，用虹吸法弃去上清PBS溶液，再按照Cytodex1微载体∶PBS溶液=1g∶50mL的比例加入PBS溶液，温和的搅拌3min后，停止搅拌，自然沉降11min后，用虹吸法弃去上清PBS溶液。最后按Cytodex1微载体∶PBS溶液=1g∶50mL的比例加入PBS溶液制得Cytodex1型微载体溶液。将适量Cytodex1型微载体溶液通过生物反应器的进料口加入到生物反应器内，打开蒸汽阀，开启生物反应器内的搅拌装置，搅拌速度为40-80rpm，对Cytodex1型微载体在线进行高压纯蒸汽灭菌，121℃灭菌30min。灭菌完成后静置，待生物反应器内微载体温度降至37℃以下后，打开相应控制阀连接生物反应器与废液罐D，同时将气体泵J与相应液体传输系统的压力传输口连接，将生物反应器中的上清液泵入废液罐D中后，关闭相应控制阀阻断生物反应器与废液罐D的连接，同时阻断气体泵J与相应液体传输系统的连接。打开相应控制阀将生物反应器和500L细胞培养液罐A连接，同时将气体泵J与相应液体传输系统的压力传输口连接，将500L细胞培养液罐A中的细胞培养液通过气体泵J泵入生物反应器后，关闭相应控制阀阻断气体泵J与生物反应器和500L细胞培养液罐A的连接，同时阻断气体泵J与相应液体传输系统的连接。开启生物反应器内的搅拌装置，搅拌转速为60rpm，搅拌时间为5min；关闭生物反应器内的搅拌装置，自然沉降微载体15min，打开相应控制阀连接生物反应器与废液罐D，同时将气体泵J与相应液体传输系统的压力传输口连接，将生物反应器中的上清液泵入废液罐D中后，关闭相应控制阀阻断生物反应器与废液罐D的连接，同时阻断气体泵J与相应液体传输系统的连接。
取适量的生长良好的MDCK细胞用0.25%胰酶溶液消化，观察细胞面消化情况，待其成蜂窝拉丝状时倒掉0.25%胰酶消化液，加入细胞培养液终止消化，用吸管轻轻吹打细胞后计数，取含5×108个MDCK细胞的细胞悬液通过7.5L一级生物反应器F的进料口加入到7.5L生物反应器F中。打开相应控制阀使7.5L一级生物反应器F和500L细胞培养液罐A连接，同时将气体泵J与相应液体传输系统的压力传输口连接，将500L细胞培养液罐A中的细胞培养液通过气体泵J泵入7.5L一级生物反应器F，泵入的细胞培养液体积为4L，关闭相应控制阀阻断7.5L一级生物反应器F和500L细胞培养液罐A的连接，同时阻断气体泵J与相应液体传输系统的连接。打开7.5L生物反应器F中的搅拌装置，设定培养参数为：培养温度37℃、溶氧量50%、pH值7.4、转速60rpm。
培养过程中，于每天上午11：00进行如下操作：关闭7.5L一级生物反应器F内的搅拌装置，自然沉降15min，然后打开相应控制阀连接7.5L一级生物反应器F与废液罐D，同时将气体泵J与相应液体传输系统的压力传输口连接，将7.5L一级生物反应器F中的1L细胞培养液泵入废液罐D中后，关闭相应控制阀阻断7.5L一级生物反应器F与废液罐D的连接，同时阻断气体泵J与相应液体传输系统的连接。打开相应控制阀使7.5L一级生物反应器F和500L细胞培养液罐A连接，同时将气体泵J与相应液体传输系统的压力传输口连接，将500L细胞培养液罐A中的细胞培养液通过气体泵J泵入7.5L一级生物反应器F，泵入的细胞培养液体积为1L，关闭相应控制阀阻断7.5L一级生物反应器F和500L细胞培养液罐A的连接，同时阻断气体泵J与相应液体传输系统的连接。
通过7.5L一级生物反应器F内的细胞密度电极监测装置实时监测7.5L一级生物反应器F内的细胞密度，当悬浮培养的MDCK细胞浓度达到1×106cells/mL后，停止搅拌，自然沉降微载体15min，打开相应控制阀连接7.5L一级生物反应器F与废液罐D，同时将气体泵J与相应液体传输系统的压力传输口连接，将7.5L一级生物反应器F中的细胞培养液泵入废液罐D中后，关闭相应控制阀阻断7.5L一级生物反应器F与废液罐D的连接，同时阻断气体泵J与相应液体传输系统的连接。
（11）打开相应控制阀连通PBS储存罐K与7.5L一级生物反应器F，同时将气体泵J与相应液体传输系统的压力传输口连接，PBS储存罐K内的PBS溶液被泵入7.5L一级生物反应器F中，PBS溶液的转移体积为2L，关闭相应控制阀阻断PBS储存罐K与7.5L一级生物反应器F的连接，同时阻断气体泵J与相应液体传输系统的连接；打开7.5L一级生物反应器F的搅拌器，搅拌1min后关闭搅拌器，使微载体自然沉降，打开相应控制阀连接7.5L一级生物反应器F与废液罐D，同时将气体泵J与相应液体传输系统的压力传输口连接，将7.5L一级生物反应器F中的PBS溶液泵入废液罐D中后，关闭相应控制阀阻断7.5L一级生物反应器F与废液罐D的连接，同时阻断气体泵J与相应液体传输系统的连接。重复步骤（11）一次。
通过7.5L生物反应器F的进料口加入适量的0.25%胰酶溶液淹没微载体，开启搅拌装置，80rpm搅拌，同时打开相应控制阀使7.5L一级生物反应器F和500L细胞培养液罐A连接，同时将气体泵J与相应液体传输系统的压力传输口连接，待微载体上的细胞脱落下来后，将500L细胞培养液罐A中的细胞培养液通过气体泵J泵入7.5L一级生物反应器F，泵入的细胞培养液体积为3倍0.25%胰酶溶液体积，关闭相应控制阀阻断泵J与7.5L一级生物反应器F和500L细胞培养液罐A的连接，同时阻断气体泵J与相应液体传输系统的连接。
打开相应的控制阀使7.5L一级生物反应器F和50L二级生物反应器G连通，同时将气体泵J与相应液体传输系统的压力传输口连接，7.5L一级生物反应器F中的细胞悬液被泵入50L二级生物反应器G中，50L二级生物反应器G中微载体量为400g，关闭相应的控制阀阻断7.5L一级生物反应器F和50L二级生物反应器G连通，同时阻断气体泵J与相应液体传输系统的连接。打开相应控制阀使50L二级生物反应器G和500L细胞培养液罐A连接，同时将气体泵J与相应液体传输系统的压力传输口连接，将500L细胞培养液罐A中的细胞培养液通过气体泵J泵入50L二级生物反应器G，泵入的细胞培养液体积为400L，关闭相应控制阀阻断50L二级生物反应器G和500L细胞培养液罐A的连接，同时阻断气体泵J与相应液体传输系统的连接。打开50L二级生物反应器G中的搅拌装置，设定培养参数为：培养温度37℃、溶氧量50%、pH值7.4、转速60rpm。
培养过程中，于每天11：00进行如下操作：关闭50L二级生物反应器G内的搅拌装置，自然沉降15min，然后打开相应控制阀连接50L二级生物反应器G与废液罐D，同时将气体泵J与相应液体传输系统的压力传输口连接，将50L二级生物反应器G中的10L细胞培养液泵入废液罐D中后，关闭相应控制阀阻断50L二级生物反应器G与废液罐D的连接，同时阻断气体泵J与相应液体传输系统的连接。打开相应控制阀使50L二级生物反应器G和500L细胞培养液罐A连接，同时将气体泵J与相应液体传输系统的压力传输口连接，将500L细胞培养液罐A中的细胞培养液通过气体泵J泵入50L二级生物反应器G，泵入的细胞培养液体积为10L，关闭相应控制阀阻断50L二级生物反应器G和500L细胞培养液罐A的连接，同时阻断气体泵J与相应液体传输系统的连接。
通过50L二级生物反应器G内的细胞密度电极监测装置实时监测50L二级生物反应器G内的细胞密度，当悬浮培养的MDCK细胞浓度达到1×106cells/mL后，停止搅拌，自然沉降微载体15min，打开相应控制阀连接50L二级生物反应器G与废液罐D，同时将气体泵J与相应液体传输系统的压力传输口连接，将50L二级生物反应器G中的细胞培养液泵入废液罐D中后，关闭相应控制阀阻断50L二级生物反应器G与废液罐D的连接，同时阻断气体泵J与相应液体传输系统的连接。
（12）打开相应控制阀连通PBS储存罐K与50L二级生物反应器G，同时将气体泵J与相应液体传输系统的压力传输口连接，PBS储存罐K内的PBS溶液被泵入50L二级生物反应器G中，PBS溶液的转移体积为20L，关闭相应控制阀阻断PBS储存罐K与50L二级生物反应器G的连接，同时阻断气体泵J与相应液体传输系统的连接；打开50L二级生物反应器G的搅拌器，搅拌1min后关闭搅拌器，使微载体自然沉降，打开相应控制阀连接50L二级生物反应器G与废液罐D，同时将气体泵J与相应液体传输系统的压力传输口连接，将50L二级生物反应器G中的PBS溶液泵入废液罐D中后，关闭相应控制阀阻断50L二级生物反应器G 与废液罐D的连接，同时阻断气体泵J与相应液体传输系统的连接。重复步骤（12）一次。
通过50L二级生物反应器G的进料口加入适量的0.25%胰酶溶液淹没微载体，开启搅拌装置，80rpm搅拌，同时打开相应控制阀使50L二级生物反应器G和500L细胞培养液罐A连接，同时将气体泵J与相应液体传输系统的压力传输口连接，待微载体上的细胞脱落下来后，将500L细胞培养液罐A中的细胞培养液泵入50L二级生物反应器G，泵入的细胞培养液体积为3倍0.25%胰酶溶液体积，关闭相应控制阀阻断50L二级生物反应器G和500L细胞培养液罐A的连接，同时阻断气体泵J与相应液体传输系统的连接。
打开相应的控制阀使50L二级生物反应器G和500L三级生物反应器H连通，同时将气体泵J与相应液体传输系统的压力传输口连接，50L二级生物反应器G中的细胞悬液被泵入到500L三级生物反应器H中，500L三级生物反应器H中微载体量为4kg，关闭相应的控制阀阻断50L二级生物反应器G和500L三级生物反应器H连通，同时阻断气体泵J与相应液体传输系统的连接。打开相应控制阀使500L三级生物反应器H和500L细胞培养液罐A连接，同时将气体泵J与相应液体传输系统的压力传输口连接，将500L细胞培养液罐A中的细胞培养液通过气体泵J泵入500L三级生物反应器H，泵入的细胞培养液体积为400L，关闭相应控制阀阻断500L三级生物反应器H和500L细胞培养液罐A的连接，同时阻断气体泵J与相应液体传输系统的连接。打开500L三级生物反应器H中的搅拌装置，设定培养参数为：培养温度37℃、溶氧量50%、pH值7.4、转速60rpm。
培养过程中，于每天11：00进行如下操作：关闭500L三级生物反应器H内的搅拌装置，自然沉降15min，然后打开相应控制阀连接500L三级生物反应器H 与废液罐D，同时将气体泵J与相应液体传输系统的压力传输口连接，将500L三级生物反应器H中的100L细胞培养液泵入废液罐D中后，关闭相应控制阀阻断500L三级生物反应器H与废液罐D的连接，同时阻断气体泵J与相应液体传输系统的连接。打开相应控制阀使500L三级生物反应器H和500L细胞培养液罐A连接，同时将气体泵J与相应液体传输系统的压力传输口连接，将500L细胞培养液罐A中的细胞培养液通过气体泵J泵入500L三级生物反应器H，泵入的细胞培养液体积为100L，关闭相应控制阀阻断500L三级生物反应器H和500L细胞培养液罐A的连接，同时阻断气体泵J与相应液体传输系统的连接。
（2）甲型流感病毒的接种和培养：
通过500L三级生物反应器H内的细胞密度电极监测装置实时监测500L三级生物反应器H内的细胞密度，当悬浮培养的MDCK细胞浓度达到1×106cells/mL后，停止搅拌，自然沉降微载体15min，打开相应控制阀连接500L三级生物反应器H与废液罐D，同时将气体泵J与相应液体传输系统的压力传输口连接，将500L三级生物反应器H中的细胞培养液泵入废液罐D中后，关闭相应控制阀阻断500L三级生物反应器H与废液罐D的连接，同时阻断气体泵J与相应液体传输系统的连接。
（21）打开相应控制阀连通PBS储存罐K与500L三级生物反应器H，同时将气体泵J与相应液体传输系统的压力传输口连接，PBS储存罐K内的PBS溶液被泵入500L三级生物反应器H中，PBS溶液的转移体积为200L，关闭相应控制阀阻断PBS储存罐K与500L三级生物反应器H的连接，同时阻断气体泵J与相应液体传输系统的连接；打开500L三级生物反应器H的搅拌器，40rpm搅拌1min后关闭搅拌器，使微载体自然沉降，打开相应控制阀连接500L三级生物反应器H与废液罐D，同时将气体泵J与相应液体传输系统的压力传输口连接，将500L三级生物反应器H中的PBS溶液泵入废液罐D中后，关闭相应控制阀阻断500L三级生物反应器H与废液罐D的连接，同时阻断气体泵J与相应液体传输系统的连接。重复步骤（21）一次。
通过500L三级生物反应器H的进料口，按0.01MOI比例加入甲型流感病毒株，开启500L三级生物反应器H内的搅拌装置，搅拌速度40rpm，使甲型流感病毒在37℃条件下吸附30min。吸附完成后，打开相应控制阀使500L三级生物反应器H 和1000L病毒培养液灌B连通，同时将气体泵J与相应液体传输系统的压力传输口连接，将1000L病毒培养液灌B中的病毒培养液泵入500L三级生物反应器H中，泵入的病毒培养液体积为400L，关闭相应控制阀阻断500L三级生物反应器H 和1000L病毒培养液灌B的连通，同时阻断气体泵J与相应液体传输系统的连接。设定培养参数为：培养温度35℃、溶氧量40%、pH 7.5、转速40rpm。
（3）病毒培养液收获：
（31）甲型流感病毒在500L三级生物反应器H的微载体上培养48小时后，通过倒置显微镜观察MDCK细胞病变情况，当MDCK细胞病变达到90%后停止搅拌，自然沉降15min，打开相应控制阀使500L三级生物反应器H与1000L收液罐E连通，同时将气体泵J与相应液体传输系统的压力传输口连接， 500L三级生物反应器H中的病毒培养液被泵入1000L收液罐E中，即得病毒液，关闭相应控制阀阻断500L三级生物反应器H与1000L收液罐E的连通，同时阻断气体泵J与相应液体传输系统的连接，按照人用流感疫苗检测规程对获得的病毒液进行检测，其中血凝滴度不低于1:160；
（32）打开相应控制阀使500L三级生物反应器H 和1000L病毒培养液灌B连通，同时将气体泵J与相应液体传输系统的压力传输口连接，将1000L病毒培养液灌B中的病毒培养液泵入500L三级生物反应器H中，泵入的病毒培养液体积为400L，关闭相应控制阀阻断泵J与500L三级生物反应器H 和1000L病毒培养液灌B的连通，同时阻断气体泵J与相应液体传输系统的连接，设定培养参数为：培养温度35℃、溶氧量40%、pH 7.5、转速40rpm。培养18小时，停止生物反应器搅拌，自然沉降15min，打开相应控制阀使500L三级生物反应器H与1000L收液罐E连通，同时将气体泵J与相应液体传输系统的压力传输口连接，500L三级生物反应器H中的病毒培养液被泵入1000L收液罐E中，关闭相应控制阀阻断500L三级生物反应器H与1000L收液罐E的连通，同时阻断气体泵J与相应液体传输系统的连接，按照人用流感疫苗检测规程对获得的病毒液进行检测，其中血凝滴度不低于1:160。重复步骤（32）3次。
（4）病毒液的过滤浓缩：
打开相应控制阀使1000L收液灌E和超滤系统C连通，同时将气体泵J与相应液体传输系统的压力传输口连接，将1000L收液灌E中的病毒液泵入过滤系统C中，关闭相应控制阀阻断1000L收液灌E和超滤系统C连通，同时阻断气体泵J与相应液体传输系统的连接。病毒液在过滤系统C中首先经滤芯初滤，从而实现细胞残渣、颗粒杂质等物质与病毒颗粒进行初步分离，再经过过滤系统C的超滤部分的100KD超滤膜进行超滤浓缩，调节超滤部分中卫生转子泵转速保证超滤部分的进液口压力≤2.0bar，回流口压力≤1.0bar，让过滤后的病毒液反复循环通过过滤系统C的超滤部分中并联的多张100KD超滤膜，从而实现病毒液的浓缩和杂质的去除，病毒液浓缩到原集体的1/50后关闭超滤系统，收获浓缩后的病毒液，合并多次收获的浓缩后的病毒液。
（5）病毒液灭活、裂解：
将浓缩后的病毒液，按1/4000浓度比例加入β-丙内酯，混匀置4℃环境中24h进行病毒的灭活，灭活过程用振荡器间隔或持续震荡混匀液体，保证灭活彻底，灭活完成后放适宜温度进行水解，灭活到期后，每个病毒灭活容器应立即取样，采用9-11日龄的鸡胚分别进行病毒灭活验证试验，并进行细菌内毒素含量测定。灭活完成后加入适宜浓度的Triton X100裂解剂在适宜条件下进行病毒的裂解。
（6）病毒液纯化：
将裂解后的病毒液采用柱色谱方法，层析介质为Sepharose 6FF凝胶，上样量为柱体积的9%，以pH 7.2的PBS溶液为流动相，经280nm波长紫外监测，收集相应的流感病毒峰，即得甲型流感疫苗。纯化参数：上样流速1L/min，上样体积为10L，样品洗脱速度为1L/min，检测波长为280nm，洗脱液为0.01mol/L pH 7.2的PBS溶液。
以上为本发明的具体实施方式，其描述较为具体和详细，但不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (8)
1.一种人用流感疫苗的生产方法及设备，特征在于：包括以下步骤：
（1）MDCK细胞在多级生物反应器微载体上扩增：
取生长良好的MDCK细胞，胰酶溶液消化，加入细胞培养液终止消化后转移至一级生物反应器（F）微载体上，补充细胞培养液使一级生物反应器（F）中细胞密度为1-5×105cells/mL，开始搅拌；MDCK细胞在一级生物反应器（F）微载体上扩增培养完成后，停止搅拌并从该级生物反应器排出细胞培养液，用PBS溶液清洗微载体及其上的细胞，排出PBS溶液，加入胰酶溶液至完全淹没微载体，待细胞完全从微载体上消化脱落后，立即加入2-4倍胰酶溶液体积的细胞培养液终止消化，然后将细胞悬液输送至一个以上的次级生物反应器微载体上继续扩增培养；在不包含最后级的每一个次级生物反应器上的操作步骤为：从上一级生物反应器接收细胞悬液后，补充细胞培养液使MDCK细胞密度为1-5×105cells/mL后开始扩增培养并开始搅拌，待细胞密度达到培养目标时，停止搅拌并从该级生物反应器排出细胞培养液，用PBS溶液清洗微载体及其上的细胞，排出PBS溶液，加入胰酶溶液溶至完全淹没微载体，待细胞完全从微载体上消化脱落后，立即加入2-4倍胰酶溶液体积的细胞培养液终止消化，然后将细胞悬液输送至下一级生物反应器；
（2）人流感病毒的接种和繁殖：
当最后一级生物反应器从上一级反应器接收细胞悬液后，补充细胞培养液使MDCK细胞密度为1-5×105cells/mL后开始扩增培养并开始搅拌，待细胞密度达到培养目标时，停止搅拌并从该级生物反应器排出细胞培养液，用PBS溶液清洗微载体及其上的细胞，排出PBS溶液后将人流感病毒加入最后一级生物反应器中进行吸附，吸附温度33-37℃，吸附时间20-40min，吸附完成后加入与细胞培养液等体积的病毒培养液进行培养；
（3）多次收获病毒液：
（31）在最后一级生物反应器中，待90%以上MDCK细胞产生病变后，停止搅拌使微载体自然下沉，收集生物反应器内上清液，所述上清液即病毒液，收集完成后加入病毒培养液继续培养；
（32）培养18-30h后，停止搅拌使微载体自然下沉，收集生物反应器内病毒液，收集完成后加入病毒培养液继续培养；
（33）多次重复步骤（32），至微载体细胞脱落60%以上后终止；按照人用流感疫苗检测规程对获得的病毒液进行检测，检测指标中，病毒液的血凝滴度不低于1:160；
（4）将步骤（3）得到的病毒液进行过滤浓缩、灭活、裂解和纯化，得到流感疫苗。
2.根据权利要求1所述的一种人用流感疫苗的生产方法及设备，其特征在于：所述微载体密度为每升培养体积对应微载体5-40g。
3.根据权利要求1所述的一种人用流感疫苗的生产方法及设备，其特征在于：所述步骤（2）所述的人流感病毒为WHO提供的甲型和乙型流感病毒株。
4.根据权利要求1所述的一种人用流感疫苗的生产方法及设备，其特征在于：所述步骤（1）和（2）中细胞培养液的配制方法为：新生牛血清体积分数比为2-5%、3%L-谷氨酰胺体积分数比为1%，非必需氨基酸体积分数比为1%，剩余为MEM培养液，将上述成分混合后用碳酸氢钠溶液调节pH至7.4-8.2；所述步骤（1）和（2）中MDCK细胞扩增培养时的条件设定为:培养温度36-38℃，溶氧量30%-50%，搅拌速度40-80rpm。
5.根据权利要求1所述的一种人用流感疫苗的生产方法及设备，其特征在于：所述步骤（2）和（3）中病毒培养液的配制方法为：3%L-谷氨酰胺体积分数比为1%、非必需氨基酸体积分数比为1%，TPCK胰蛋白酶浓度为1μg/mL，剩余为MEM培养液，将上述成分混合后用碳酸氢钠溶液调pH至7.4-8.2；所述步骤（2）和（3）中病毒接种和繁殖的条件设定为：培养温度33-35℃，溶氧量30%-50% ，转速40-80rpm。
6.根据权利要求1所述的一种人用流感疫苗的生产方法及设备，其特征在于：在所述多级生物反应器中，当上一级生物反应器中的细胞转移到下一级生物反应器后，再向上一级生物反应器中加入下一批次细胞悬液。
7.一种人用流感疫苗的生产方法及设备，其特征在于：包括一级生物反应器（F）和一个以上的次级生物反应器、细胞培养液罐（A）、病毒培养液罐（B）、过滤系统（C）、废液罐（D）、收液罐（E）、气体泵（J）、PBS储存罐（K）和多个液体传输系统；所述一级生物反应器（F）和一个以上的次级生物反应器的上方进液口与PBS储存罐（K）、细胞培养液罐（A）和病毒培养液罐（B）的出液口通过液体传输系统相连；所述一级生物反应器（F）和一个以上的次级生物反应器的下方出液口与废液罐（D）的进液口通过液体传输系统相连；在不包括最后级的每一级生物反应器的下方出液口还与其次级生物反应器的侧壁上的进液口通过液体传输系统相连，最后级生物反应器的下方出液口还与收液罐（E）的上方进液口通过液体传输系统相连；所述收液罐（E）的下方出液口与过滤系统（C）的进液口通过液体传输系统相连；所述液体传输系统上设有控制阀和压力传输口，所述压力传输口可与气体泵（J）通过软管连接。
8.根据权利要求7所述的一种人用流感疫苗的生产方法及设备，其特征在于：所述一级生物反应器（F）和一个以上的次级生物反应器具有控温、灭菌、搅拌、细胞密度监测装置。
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