CN107541506A

CN107541506A - 一种新疆大蒜野生近缘种dna的提取方法

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Publication number: CN107541506A
Application number: CN201610461767.3A
Authority: CN
Inventors: 林辰壹; 马晓蓓; 叶远荣
Original assignee: Xinjiang Agricultural University
Current assignee: Xinjiang Agricultural University
Priority date: 2016-06-23
Filing date: 2016-06-23
Publication date: 2018-01-05
Anticipated expiration: 2036-06-23
Also published as: CN107541506B

Abstract

本发明属于生物技术领域，公开了一种新疆大蒜野生近缘种DNA的提取方法，主要步骤包括：采集原生境下成熟种子，自然干燥后达到种子安全含水量的同批次种子用于提取DNA；将种子置于研钵中迅速研磨成粉末加入提取液，并置于水浴锅中浸提，离心；取上清液加入氯仿‑异戊醇，离心；取上清液再次加入氯仿‑异戊醇，离心；取上清液加入预冷的异丙醇，沉淀，离心得到沉淀物；弃上清液，加入乙醇冲洗沉淀物，倒掉上清液，自然风干，加入双蒸水将沉淀物完全溶解，即得到DNA提取原液。本发明的新疆大蒜野生近缘种取材时达到了准确识别，工作安全且效率高。DNA提取操作过程成本低、迅速，有效降低含硫化合物及其他成分的干扰，从而获得高质量的种子基因组DNA。

Description

一种新疆大蒜野生近缘种DNA的提取方法

技术领域

本发明涉及植物分子生物学研究的技术领域，尤其涉及一种提取大蒜野生近缘种高质量的种子基因组DNA提取方法。

背景技术

葱属植物包括蒜、韭、葱、洋葱等栽培种，新疆地处中亚，其境内的天山山脉、阿尔泰山脉、昆仑山脉以及准噶尔盆地和塔里木盆地构成了该地区特殊的地形地貌，地理环境复杂多样，植物区系成分独特，种质资源有别于东北、华北、西南地区以及西北地区的其它省份，蕴藏着蒜、韭、葱、洋葱等野生近缘种，包括野葱、野蒜和野韭，其中野生分布的野蒜长久以来被当地牧民作为蔬菜、药用和观赏植物利用，国内仅分布于新疆的阿勒泰、布尔津、哈巴河、新源、巩留、塔城、裕民等地的山麓荒地或草原灌丛，是重要的大蒜野生近缘种植物，是大蒜种质创新的亲本材料。

目前，存在的主要问题是：①随着一些早期被人类驯化利用的葱属植物资源基因的丢失，遗传背景日趋狭窄，限制了现代农业生产的可持续发展，人们才意识到葱属种质资源亲缘关系分析的重要性。②为了增加栽培种类、挖掘优异基因，各国植物育种工作者将目光投向了野生大蒜植物种质资源特殊性状的挖掘。③为了掌握植物的遗传多样性、特殊的抗逆基因以及与栽培种之间密切的亲缘关系，ISSR、SSR、SRAP和SNP分子标记技术在大蒜野生近缘种研究中得到应用，这些分子标记应用的前提和基础是获得高质量基因组DNA。葱属种质资源采用新鲜叶片提取基因组DNA，而大蒜野生近缘种植物是新疆干旱半干旱环境下较为典型的类短命植物，展叶期处于3月，分布地积雪尚未完全融化，野外采集难度大，而且叶片生长期短且易枯萎，增加了新鲜幼嫩叶片的采集难度，同时，大蒜野生近缘种种子具有休眠现象当年也无法在实验室条件下播种后取材。④目前葱属植物基因组DNA提取方法有SDS法、CTAB法、改良SDS法和改良CTAB法等。由于大蒜野生近缘种植物含硫化合物、黄酮类化合物及多糖等物质含量较高，尤其是较高含量的巯基化合物以及次生代谢产物给DNA的提取和分离纯化带来了较大困难，上述几种方法提取的叶片基因组DNA含量和纯度低难以满足分子标记研究的实验要求，因此，构建一个相对简单、高效、快速和通用的大蒜野生近缘种植物基因组提取方法至关重要。到目前为止，现有技术中还没有专门针对大蒜野生近缘种种子基因组DNA提取方法的报道。

发明内容

为了解决现有新疆大蒜野生近缘种存在的技术问题，本发明的目的是提供一种简便实用的大蒜野生近缘种种子基因组DNA提取方法。

本发明所述的一种新疆大蒜野生近缘种DNA的提取方法，包括以下步骤：

（1）取原生境下成熟的种子0.5-1g，烘干至恒重后计算种子含水量，达到种子安全含水量的同批次的干种子用于提取DNA。

（2）将种子置于研钵中迅速研磨成粉末，转入离心管中加入65℃预热的SDS提取液700μL与20μL β-羟基乙醇混匀；

所述SDS提取液是按下述方法制得：

①58.4g NaCl加双蒸水制成200mL溶液即得5M NaCl；

②37.22g EDTA加双蒸水至200mL即得0.5M EDTA；

③12.11g Tris，4.2mL 纯盐酸加双蒸水至100mL即得1M Tris-HCl；

④SDS提取液：将配制好的上述①~③溶液配制SDS提取液，即SDS 2g，1M Tris-HCl10mL，0.5M EDTA 4mL，5M NaCl 28mL，PVP 1g，β-羟基乙醇2mL，最后加双蒸水至100mL即为实验用SDS提取液。

（3）将离心管置于65℃水浴锅中浸提1.5h，其间缓慢混匀10次至提取液与粉末完全融合，取出离心管，擦干离心管外壁水珠，8000r/min离心5min。

（4）取上清液600μL 至离心管中，加入600μL 氯仿-异戊醇，8000r/min离心20min。

（5）取上清液600μL 至离心管中，再次加入600μL 氯仿-异戊醇，8000r/min离心20min。

（6）取上清液500μL 至离心管中，加入-20℃预冷的异丙醇200μL ， -20℃沉淀30min，8000r/min离心5min得到沉淀物。

（7）弃上清液，在所得沉淀物中加入-20℃预冷的70％乙醇500μL ，冲洗沉淀物2次，缓慢倒掉上清液，自然风干40min，然后加入30μL 双蒸水将沉淀物完全溶解，即得到DNA提取原液，在-20℃冰箱中保存。

本发明还提供用于大蒜野生近缘种提取DNA的采收成熟种子技巧和安全含水量测定的方法和标准。

所述步骤（1）中原生境是指野生大蒜近缘种的野外分布的生长地。

所述步骤（1）中大蒜野生近缘种是指棱叶蒜，也称之为蓝花山蒜。

所述步骤（1）中种子安全含水量的范围为7.16~9.27％。

所述步骤（4）和所述步骤（5）中的氯仿-异戊醇是指将24mL氯仿和1mL异戊醇体积比混合而成。

本发明与现有葱属植物野生近缘种DNA提取方法相比具有以下优点：

（1）目前葱属植物DNA提取方法中最常用的是以叶片为材料的改良SDS法，大蒜野生近缘种植物展叶期处于3月，分布地积雪尚未完全融化，野外环境恶劣，采集难度大，而且叶片生长期短且易枯萎，肉眼不易识别，增加了采集大量的、新鲜幼嫩叶片的难度，相比而言，改良SDS法的种子提取法实验材料易获得，同时，相同重量下种子比干燥叶片体积小，减少了材料贮藏空间，此外野外采集种子时，野外环境条件风险降低，满足了采集人的安全需求，且野生近缘种易识别。

（2）用于提取DNA的种子，在一定安全含水量的范围之内，各物质含量和成分稳定。

（3）葱属植物野生近缘种植物干种子和SDS提取液之间的质量体积比为1-2：700~800（g/μL ），降低了含硫化合物、黄酮类、多糖等对提取DNA的干扰；在65℃水浴锅中浸提1.5h，在较高温度55-65℃条件下裂解植物细胞，使染色体离析，蛋白质变性，释放出核酸。

（4）本发明通过氯仿-异戊醇混合液对先后得到的上清液进行两次抽提，然后用预冷的70％乙醇对上清液中的DNA进行两次沉淀，能有效的去除种子中贮藏的含巯基（-SH）的蛋白质及含硫的次生代谢物。

（5）本发明中研样采用干磨的方式，不需要液氮，也能防止DNA降解，减少了制造与采集液氮这一环节，降低了成本。

（6）本发明的有益效果是：全程各环节把控取材时环境风险小，野生近缘种易识别，保证了取材准确，可以从野蒜种子中提取到高质量的适宜于PCR检测的种子基因组DNA，操作简单，成本低，耗时短，利于快速检测，工作安全且效率高。

附图说明

图1是用本方法提取的棱叶蒜种子基因组DNA的电泳图谱。

图2是用改良SDS法提取的棱叶蒜叶片基因组DNA的电泳图谱。

图3是本方法提取的棱叶蒜种子基因组DNA进行PCR扩展的电泳图谱。

图4是用改良SDS法提取的棱叶蒜叶片基因组DNA进行PCR扩展的电泳图谱。

图5是野外原生境下采集成熟果实和种子的图。

图6是野外原生境积雪环境下采集叶片的图。

具体实施方式

实施例 1 一种新疆大蒜野生近缘种种子基因组DNA的提取方法，参照王子峰的方法并稍加改动，包括以下步骤：

（1）8月上旬至中旬，天山天池原生境下（43°54′2.41″N，88°07′18″E；海拔1891m）以大蒜野生近缘种（棱叶蒜）种子为材料，物候期处于果实成熟期，当蒴果开裂，果皮呈枯黄色时，采集成熟的种子，放在牛皮纸袋（信封）中，带回实验室，室温下干燥7d。

（2）种子含水量测定：随机选取采集的种子，用电子天平进行称量，记为 W₁，然后把种子放于120℃的烘箱中，每隔 4h 取出后待温度下降至室温后进行称重，反复数次至烘干后种子重量保持恒定时记为 W₂，由此计算种子含水量（%）=（W₁－W₂）/ W₁×100%，经验证，棱叶蒜种子安全含水量平均值为8.328％，变异范围为7.16~9.27％。

（3）称取0.5-1g在安全含水量范围内的种子，在研钵中迅速磨成粉末转入离心管中。

（4）加入65℃预热SDS提取液700μL 与20μL β-羟基乙醇混匀。所述SDS提取液是按下述方法制得：

① 58.4g NaCl加双蒸水制成200mL溶液即得5M NaCl；

② 37.22g EDTA加双蒸水至200mL即得0.5M EDTA；

③ 12.11g Tris，4.2mL 纯盐酸加双蒸水至100mL即得1M Tris-HCl；

④ SDS提取液：将配制好的上述①~③溶液配制SDS提取液，即SDS 2g，1M Tris-HCl10mL，0.5M EDTA 4mL，5M NaCl 28mL，PVP 1g，β-羟基乙醇2mL，最后加双蒸水至100mL即为实验用SDS提取液。

（5）将离心管置于65℃水浴锅中浸提1.5h，其间缓慢混匀 10次至提取液与粉末完全融合，取出离心管，擦干离心管外壁水珠，8000r/min离心5min。

（6）取上清液600μL至离心管中，加入600μL氯仿-异戊醇，8000r/min离心20min。

（7）取上清液600μL至离心管中，再次加入600μL 氯仿-异戊醇，8000r/min离心20min。

（8）取上清液500μL至离心管中，加入-20℃预冷的异丙醇200μL，-20℃沉淀30min，8000r/min离心5min得到沉淀物。

（9）弃上清液，在所得沉淀物中加入-20℃预冷的70％乙醇500μL，冲洗沉淀物2次，缓慢倒掉上清液，自然风干40min，然后加入30μL 双蒸水将沉淀物完全溶解，即得到DNA提取原液，在-20℃冰箱中保存。

实施例2 种子含水量的测定

1、材料

随机选取采集的大小均匀、饱满、自然晾干的棱叶蒜种子约1000粒，用电子天平进行称量，记为 W₁，然后把种子放于120℃的烘箱中，每隔 4h 取出后待温度下降至室温后进行称重，反复数次至烘干后种子重量保持恒定时记为 W₂，由此计算种子含水量（%）=（W₁－W₂）/W₁×100%。每个处理重复5次，取其平均值。

2、结果分析

表1 为种子含水量

重复	1	2	3	4	5	平均
							干种子重（g）	0.485	0.5249	0.4550	0.5020	0.4955	0.4924
烘干重（g）	0.440	0.4801	0.4135	0.4643	0.4600	0.4515
							含水量（％）	9.27	8.53	9.12	7.56	7.16	8.328

由此表可以看出棱叶蒜种子千粒重为0.4924g，平均含水量为8.328％。

实施例3 一种大蒜野生近缘种叶片基因组DNA的提取方法，参照Shi C的方法，略有修改，包括以下步骤：

（1）以大蒜野生近缘种（棱叶蒜）干燥叶片为材料，在展叶期摘取新鲜的叶片，放入有硅胶的自封袋中，干燥15-30d。

（2）称取2g干燥完全的叶片，并在液氮条件下迅速研磨成粉，转入离心管中。

（3）向管中加入65℃预热的SDS提取缓冲液（同实施例1），加入20μL预冷的β-羟基乙醇，快速涡旋混匀。

（4）将离心管置于65℃水浴锅中，保温60min，期间缓慢混匀8次。

（5）取出离心管冷却至室温，擦干离心管外壁水珠，4℃、12000 r/min离心15min。

（6）取上清液600μL于离心管中，加入200μL预冷的醋酸钾溶液，冰浴（0℃）30min。

（7）4℃，12000 r/min离心15min，取上清液600μL，加入700μL预冷氯仿-异戊醇（同实施例1），轻柔倒管8min，4℃，12000 r/min离心15min。

（8）重复上一步骤。

（9）取上清液500μL，加入1000μL预冷乙醇，放入-20℃冰箱中30min。

（10）4℃，12000 r/min离心5min得到沉淀物，取出弃上清，用预冷的70％乙醇清洗沉淀物一次，弃上清。

（11）预冷乙醇清洗沉淀物两次，放入-20℃冰箱中5min，4℃，12000 r/min离心2min。

（12）弃上清液，自然风干30min，加入30μL 预冷的双蒸水将沉淀物完全溶解，即得到DNA提取原液，在-20℃冰箱中保存。

实施例4

实验结果DNA的质量检测

1、紫外分光光度法检测

用紫外分光光度计检测实施例1与例3提取的棱叶蒜DNA。纯DNA的OD₂₆₀/OD₂₈₀在1.8左右，高于1.9则可能有RNA污染或降解现象，低于1.6能存在蛋白质污染。

2、DNA样品的ISSR-PCR扩增电泳检测

引物为AGA GAG AGAGAG AGAGYC，PCR反应体系为：总体积15μL ，其中包括：1μL 引物（华大基因），1μL DNA模板，2μL 1×PCR Buffer （全式金生物技术有限公司），0.2μL Taq酶（全式金生物技术有限公司），0.3μL dNTPs（全式金生物技术有限公司），加双蒸水10.5μL补足至15μL 。

反应程序为 94 ℃，预变性 5 min；退火温度 60℃ ；35 个循环；72 ℃，延伸 7min；10℃，Pause。用2.0%琼脂糖凝胶下电泳，10 mg/L EB 染色10min，凝胶成像仪下拍照。

3、结果分析

表2为紫外分光光度法检测例1与例3 DNA样品的纯度和产量的比较。

由此可以看出，经叶片提取的DNA浓度在1.824-1.867之间，纯度较好，有RNA污染；经种子提取DNA浓度在1.801-1.900之间，也有RNA污染。由图3和图4 可以看出，两种不同取材部位提取的DNA均可用于ISSR-PCR扩增反应。

4、总结

葱属含有丰富的含硫化合物、黄酮类化合物及多糖等，利用SDS提取缓冲液提取DNA的原理为：利用高浓度SDS抽提缓冲液在较高温度55-65℃条件下裂解植物细胞，使染色体离析，蛋白质变性，释放出核酸，离心除去沉淀后，上清液中的DNA用氯仿-异戊醇抽提，反复抽提后用乙醇沉淀水相中的DNA。

在大蒜野生近缘种基因组 DNA 提取的体系优化过程中，发现以种子为材料经改良SDS 法提取基因组DNA的纯度高、杂质少，同样可以用于后期PCR扩增反应。与叶片为材料相比，以种子为材料提取的基因组DNA操作简单、成本低、耗时短，取材时环境风险小，野生近缘种易识别，保证了取材准确，工作安全且效率高。

Claims

1.一种新疆大蒜野生近缘种DNA的提取方法，其特征在于包括以下步骤：（1）取原生境下的成熟的种子0.5-1g，烘干至恒重，计算种子含水量，达到种子安全含水量的同批次干种子用于提取DNA。（2）将种子置于研钵中迅速研磨成粉末，转入离心管中加入65℃预热的SDS提取液700μL 与20μL β-羟基乙醇混匀；所述SDS提取液是按下述方法制得：

①58.4g NaCl加双蒸水制成200mL溶液即得5M NaCl；

②37.22g EDTA加双蒸水至200mL即得0.5M EDTA；

③12.11g Tris ，4.2mL HCl加双蒸水至100mL即得1M Tris-HCl；

④SDS提取液：SDS 2g，1M Tris 10mL，0.5M EDTA 4mL，5M NaCl 28mL，PVP 1g，β-羟基乙醇2mL，最后加双蒸水至100mL为SDS提取液。

（3）将离心管置于65℃水浴锅中浸提1.5h，其间缓慢混匀10次至提取液与粉末完全融合，取出离心管，擦干离心管外壁水珠，8000r/min离心5min。（4）取上清液600μL 至离心管中，加入600μL 氯仿-异戊醇，8000r/min离心20min。（5）取上清液600μL 至离心管中，再次加入600μL 氯仿-异戊醇，8000r/min离心20min。（6）取上清液500μL 至离心管中，加入-20℃预冷的异丙醇200μL ，-20℃沉淀30min，8000r/min离心5min得到沉淀物。（7）弃上清液，加入-20℃预冷的70％乙醇500μL 冲洗沉淀物2遍，缓慢倒掉乙醇，自然风干40min，然后加入30μL 双蒸水将沉淀物完全溶解，即得到DNA提取原液，在-20℃环境中保存。

2.根据权利要求1所述的一种新疆大蒜野生近缘种DNA的提取方法，其特征在于：采集原生境下的棱叶蒜干种子，并且达到安全含水量范围7.16~9.27％。

3.根据权利要求1所述的一种新疆大蒜野生近缘种DNA的提取方法，其特征在于：提取液为SDS提取液与20μL β-羟基乙醇混匀。

4.根据权利要求1所述一种新疆大蒜野生近缘种DNA的提取方法，其特征在于：SDS提取液的配制方法：①58.4g NaCl加双蒸水制成200mL溶液即得5M NaCl；

②37.22g EDTA加双蒸水至200mL即得0.5M EDTA；③12.11g Tris ，4.2mL HCl加双蒸水至100mL即得1M Tris-HCl；④SDS提取液：将配制好的上述①~③溶液配制SDS提取液，即SDS 2g，1M Tris-HCl 10mL，0.5M EDTA 4mL，5M NaCl 28mL，PVP 1g，β-羟基乙醇2mL，最后加双蒸水至100mL即为实验用SDS提取液。

5.根据权利要求1所述一种新疆大蒜野生近缘种DNA的提取方法，其特征在于：将离心管置于65℃水浴锅中浸提1.5h，其间混匀10次。

6.根据权利要求1所述一种新疆大蒜野生近缘种DNA的提取方法，其特征在于：氯仿：异戊醇体积比为24:1；

7.根据权利要求1所述一种新疆大蒜野生近缘种DNA的提取方法，其特征在于： -20℃预冷的异丙醇，-20℃沉淀30min。