CN104928396B - 一种利用est‑ssr分子标记快速鉴定辣椒品种金椒纯度的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及分子标记领域，提供了一种利用EST‑SSR分子标记快速鉴定辣椒品种金椒纯度的方法，该方法采用专门设计的EST‑SSR引物，以金椒的叶片基因组DNA为模板进行扩增，通过对扩增结果的特异谱带对待检测金椒的品种纯度进行检测，采用这种方法可以在金椒植株生长的任何时期进行鉴定，能够将杂交种与母本自交种、父本自交种区分开来；对DNA质量要求不高且需要量少；成本较低、操作简单；重复性和稳定性较好；快速高效；准确性高，应用推广前景广阔，为开展辣椒制种和良种的及时销售提供科学依据。
Description
技术领域
本发明涉及分子标记领域，具体提供了一种利用EST-SSR分子标记快速鉴定辣椒品种金椒纯度的方法。
背景技术
辣椒，属于茄科，是一年或多年生草本植物。辣椒以其果实特有的辣味、色泽和营养成分已成为一种重要的世界性蔬菜。大量研究表明辣椒果实中含有的抗氧化类物质可以保护生物有机体免受氧化伤害和提高机体免疫力。另外，辣椒中辣椒素类物质能够加速能量和脂类的新陈代谢及降低癌症细胞的发生率。随着大众对辣椒营养成分和药用成分的充分认识，栽培面积逐年增加。
种子质量直接影响农产品质量和优良品种的增产潜力，开展作物种子纯度检测对保证种子质量具有重要意义。作物品种鉴定的常用方法主要包括种子形态鉴定、田间种植形态鉴定和同工酶电泳技术鉴定等。种子形态易受环境条件影响，鉴定结果准确性较差；田间种植形态鉴定存在周期较长，成本较高，工作量较大，并且表型易受栽培措施和环境条件的影响，严重影响品种鉴定的效率及准确性，越来越不能满足育种工作和生产经营的需要；利用同工酶技术鉴定作物品种纯度虽然准确、可靠，但同工酶标记具有组织和器官特异性，信息量非常有限，多态性不够丰富。随着辣椒新品种数量的不断增加，传统的鉴定方法难以有效区分遗传关系较近的杂交种。
分子标记技术能够从DNA水平上揭示子代与亲本间的遗传差异，不受环境条件和栽培措施的影响，无组织、器官及发育特异性，能够检测微小的变异，不受植株生长季节的限制，多态性丰富、稳定性高，可以大大缩短鉴定时间。DNA分子标记技术的迅速发展，使得从基因组水平上检测辣椒杂交种真伪和纯度成为可能。EST-SSR(expressed sequencetag-simple sequence repeat)标记，是根据EST序列中的简单串联重复序列开发的一种标记类型，是一类由几个核苷酸为重复单位组成的串联重复序列，根据串联重复单位数目的差异检测多态性。EST-SSR标记具有多态性丰富、共显性遗传、稳定性和重复性较好、对DNA质量要求不高、操作简单易行、不受环境因素影响等优点，与基因组SSR标记相比，EST-SSR标记不仅降低了开发成本、提高了开发效率，而且节省了开发时间，显著提高了其利用价值。近年来，随着辣椒全基因组测序的完成，辣椒丰富的EST序列资源为EST-SSR标记的开发提供了便利条件。如何利用该技术实现对辣椒品种纯度的鉴定成为亟待解决的问题之一。
发明内容
本发明的发明人针对上述现有技术的情况，提供了一种利用EST-SSR分子标记快速鉴定辣椒品种金椒纯度的方法，该方法采用专门设计的EST-SSR引物，以金椒的叶片基因组DNA为模板进行扩增，通过对扩增结果的特异谱带对待检测金椒的品种纯度进行检测，采用这种方法可以在金椒植株生长的任何时期进行鉴定，能够将杂交种与母本自交种、父本自交种区分开来；对DNA质量要求不高且需要量少；成本较低、操作简单；重复性和稳定性较好；快速高效；准确性高，应用推广前景广阔，为开展辣椒制种和良种的及时销售提供科学依据。
本发明所针对的辣椒品种为金椒，金椒是山东省华盛农业股份有限公司经多年研究选育出的中辣丰产干、鲜两用椒。该杂交组合苗期35-50天，定植至干椒采收90-120天。植株高90-100厘米，株幅70-80厘米左右；门椒着生节位10-13节；嫩茎和叶片上有明显的绒毛。果实羊角形，果长12-15厘米，果肩径2.1-2.3厘米左右，鲜椒单果重15-21g，干椒单果重2.5-3.1g。嫩果绿色，成熟果深红色、自然晾干速度快、商品果率高。干椒果皮内外红色均匀，干椒色价值高。本品种适宜全国各地辣椒主载产区，最适宜为内蒙古等嗜干椒地区。
为了对金椒进行品种纯度的鉴定，获得母本和父本的优良杂交品种，本发明的发明人首先提供了一对EST-SSR引物，命名为ClHS1，其正向序列为5’-AGTTTTAAGAGCAAGGAGGCTC-3’，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；反向序列为5’-ATCCAACCCAATCCCCAGTC-3’，其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，
在获得上述引物之后发明人利用其对待测品种金椒的杂交种及其亲本的叶片基因组DNA进行了扩增，具体过程如下：
(1)提取金椒杂交种及其亲本叶片基因组DNA；
(2)以第(1)步提取的基因组DNA为模板，用EST-SSR引物ClHS1进行PCR扩增：
PCR反应体系为20μL，其中包括10×PCR Buffer 2μL，0.4mM dNTPs，引物各10μM，1U Taq DNA聚合酶，模板100ng，无菌超纯水补齐至20μL；
扩增程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环；72℃终延伸10min；PCR产物保存于10℃；
发明人经过多次试验后发现，针对本发明的发明目的，以及专门设计的特异性引物，扩增程序中将退火温度设置为57℃时，扩增效果最好，最终检测的结果更加贴近与实际情况，故而将本发明的退火温度设定为57℃。
(3)扩增产物检测：5μL扩增产物与2μL上样缓冲液混合，之后经丙烯酰胺质量体积比为10％的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，160v恒定电压电泳1.5h，银染显色进行带型统计；
其中所采用的非变性聚丙烯酰胺凝胶中丙烯酰胺∶甲叉双丙烯酰胺的质量比为29∶1；
所采用的上样缓冲液选自10×甘油凝胶上样液；
(4)根据特异谱带的扩增结果鉴定“金椒”杂交种的纯度，判定标准为：
母本具有120bp、200bp、250bp、270bp特异谱带；父本具有120bp、200bp、250bp、260bp特异谱带；杂交种具有120bp、200bp、250bp、270bp、400bp、450bp特异谱带；
根据上述鉴定结果，可以换算金椒品种纯度(％)＝(1-n/N)×100％，其中N为待测辣椒种子数目，n为单独具有父本谱带特征或单独具有母本谱带特征或既不同于“金椒”谱带特征也不同于父母本谱带特征的植株数目。
利用上述方法，即可实现对金椒品种纯度的快速检测，能够不受栽培措施和环境条件的影响；无器官、组织及发育特异性：该方法在植株生长的任何时期均可进行鉴定；多态性丰富、共显性遗传：能够将杂交种与母本自交种、父本自交种区分开来；对DNA质量要求不高且需要量少；成本较低、操作简单：该方法在苗期即可进行鉴定，节省大量人力、物力和土地资源；重复性和稳定性较好；快速高效：7d之内即可完成种子纯度鉴定工作；准确性高：该方法从基因组水平上揭示子代与亲本间的遗传差异，克服了田间表型鉴定带来的误差；应用推广前景广阔：可以快速、准确检测“金椒”杂交种纯度，为开展辣椒制种和良种的及时销售提供科学依据。
附图说明
图1为本发明杂交种“金椒”种子检测特征引物的PCR电泳图谱，
其中，P1为“金椒”母本；F1为多组“金椒”F1杂交种；P2为“金椒”父本；M为分子量标准；
结果显示：“金椒”F1杂交种拥有来自父、母本的6条清晰条带，其中F1杂交种与父母本条带相比400bp处两条代更清晰，可作为特征带来做纯度区分；
图2为不同PCR退火温度对“金椒”商品种子样品的纯度检测结果的影响电泳图谱；
其中，M为分子量标准，P1为“金椒”母本；F1为“金椒”F1杂交种；P2为“金椒”父本，
结果显示，随着Tm值增大，PCR条带逐渐减少，且F1代杂交种400bp处特征带越明显；最终可以确定最佳退火温度在57℃；
图3为不同DNA模板量对“金椒”商品种子样品的纯度检测结果的影响电泳图谱，
其中，M为分子量标准，P1为“金椒”母本；F1为“金椒”F1杂交种；P2为“金椒”父本，
结果显示，DNA模板量从50ng至500ng均可用于“金椒”商品种子样品的纯度检测。
具体实施方式
以下实施例中进一步定义本发明，根据以上的描述和这些实施例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明作出各种改变和修改，以使其适用各种用途和条件。除特殊注明外，本发明所采用的均为本领域现有技术；下数实施例中的百分比除特殊注明外，均为重量百分比。
实施例1金椒品种叶片基因组DNA的获取
具体操作方法如下：
(1)将“金椒”亲本与F1种子放入铺有潮湿滤纸的培养皿中，光照强度2000lx，光照周期16h光/8h暗，28℃光照培养6d后取叶片；
其中所述的F1种子的获得过程如下：开花时将有花粉的母本植株拔掉后，母本植株与父本植株4：1，通过人工授粉，父本花粉授粉到母本上，最后收获母本上的F1代种子；
(2)每个离心管中放入一个辣椒幼叶，加入60-65℃预热的500μL提取缓冲液，放入钢珠4粒，于破碎机上将材料打碎，60-65℃水浴20-30min；
其中所述的提取缓冲液为2×CTAB提取液，其配比如下：
高温灭菌，冷却至室温，加2mL巯基乙醇，室温保存，
(3)上步获得的液体经10000rpm/min离心10min，取上清于另一离心管，加入等体积(500μL)苯酚：氯仿：异戊醇(体积比为25:24:1)混合液；
(4)上步混合液经10000rpm/min离心10min，取上清液于另一离心管中，加入等体积的氯仿：异戊醇(体积比为24:1)混合溶液；
(5)上步混合液经10000rpm/min离心10min，取上清溶液于另一离心管中，加入400μL异丙醇混匀；
(6)上步混合液经12000rpm/min离心15min，弃上清，固体物质用70％乙醇洗涤，晾干；
(7)向上述固体中加入200μL ddH2O回溶，加入1μLRNA酶37℃水浴30min，-20℃备用。
实施例2 PCR扩增
以上述获得的RNA酶解混合物为模板，利用ClSH1引物进行PCR扩增：
PCR反应体系为20μL，其中包括10×PCR Buffer 2μL，0.4mM dNTPs，引物各10μM，1U Taq DNA聚合酶，模板100ng，无菌超纯水补齐至20μL；
扩增程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环；72℃终延伸10min；PCR产物保存于10℃。
实施例3扩增产物检测
5μL扩增产物与2μL上样缓冲液混合，之后经丙烯酰胺质量体积比为10％的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，160v恒定电压电泳1.5h，银染显色进行带型统计；
所采用的上样缓冲液选自10×甘油凝胶上样液；
其中所述的10％的非变性聚丙烯酰胺凝胶配方(100mL)如下：
其中所采用的30％丙烯酰胺/甲叉双丙烯酰胺配置过程如下：
丙烯酰胺29g甲叉双丙烯酰胺1g蒸馏水定容至100mL 4℃避光保存，保质期一个月；
所采用的10╳TBE配置过程如下：
Tris Base 27g，硼酸13.75g，0.5M/L EDTA 10mL，蒸馏水定容至250mL，调pH至8.3；
所采用的10％过硫酸铵(APS)以过硫酸铵0.1g和蒸馏水1mL的比例现用现配。
电泳缓冲液为1×TBE，电泳结束后，凝胶显色采用银染方法，具体过程如下：
1.水洗：ddH2O水洗2次，每次1min；
2.染色：用1‰AgNO3浸泡，平行摇动10-15min；
3.水洗：倒掉显色液，ddH2O水洗2次，每次1min；
4.显影：在盘中加入显色液(每升显色液中含有16g氢氧化钠和8mL甲醛，余量为纯净水)，然后平行摇动直至显影清楚；
5.终止：用终止液(每升终止液中含有7.5g碳酸化钠，余量为纯净水)浸泡2min，后加入ddH2O水清洗1-2次；最后用相机照相保存。
实施例4鉴定“金椒”杂交种的纯度
根据特异谱带的电泳结果鉴定“金椒”杂交种的纯度，判定标准为：
母本具有120bp、200bp、250bp、270bp特异谱带；父本具有120bp、200bp、250bp、260bp特异谱带；杂交种具有120bp、200bp、250bp、270bp、400bp、450bp特异谱带；
根据上述鉴定结果，可以换算金椒品种纯度(％)＝(1-n/N)×100％，其中N为待测辣椒种子数目，n为单独具有父本谱带特征或单独具有母本谱带特征或既不同于“金椒”谱带特征也不同于父母本谱带特征的植株数目。
实验例
以2014年某农场生产的金椒种子为例，9月份收获F1代种子后马上将F1代种子萌发，大约四天后取幼嫩组织提取辣椒DNA，利用本发明上述的ClHS1分子标记进行纯度鉴定，一周后获得的种子纯度结果为99％；
利用常规鉴定方法即田间种植形态鉴定：等全部辣椒品种收获后，一起到海南加代鉴定纯度，生长周期为100天左右，且受到多种恶劣天气影响，需重复播种鉴定，最终鉴定纯度结果也为99％。具体比较如下表：
可见与常规鉴定方法相比较，利用该分子标记法鉴定金椒杂交种子纯度快速高效、操作简单、重复性和稳定性较好、成本较低。
Claims (2)
1.一种利用EST-SSR分子标记快速鉴定辣椒品种金椒纯度的方法,其特征在于：利用EST-SSR引物进行鉴定，所述的EST-SSR引物命名为ClHS1，其正向序列为5’-AGTTTTAAGAGCAAGGAGGCTC-3’，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；反向序列为5’-ATCCAACCCAATCCCCAGTC-3’，其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；
具体步骤如下：
(1)提取金椒杂交种及其亲本叶片基因组DNA；
(2)以第(1)步提取的基因组DNA为模板，用EST-SSR引物ClHS1进行PCR扩增：
PCR反应体系为20μL，其中包括10×PCR Buffer 2μL，0.4mM dNTPs，引物各10μM，1UTaq DNA聚合酶，模板100ng，无菌超纯水补齐至20μL；
扩增程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环；72℃终延伸10min；PCR产物保存于10℃；
(3)扩增产物检测：5μL扩增产物与2μL上样缓冲液混合，之后经丙烯酰胺质量体积比为10％的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，160v恒定电压电泳1.5h，银染显色进行带型统计；
其中所采用的非变性聚丙烯酰胺凝胶中丙烯酰胺∶甲叉双丙烯酰胺的质量比为29∶1；
(4)根据特异谱带的扩增结果鉴定“金椒”杂交种的纯度，判定标准为：
母本具有120bp、200bp、250bp、270bp特异谱带；父本具有120bp、200bp、250bp、260bp特异谱带；杂交种具有120bp、200bp、250bp、270bp、400bp、450bp特异谱带；
根据上述鉴定结果，可以换算金椒品种纯度＝(1-n/N)×100％，其中N为待测辣椒种子数目，n为单独具有父本谱带特征或单独具有母本谱带特征或既不同于“金椒”谱带特征也不同于父母本谱带特征的植株数目。
2.根据权利要求1所述的利用EST-SSR分子标记快速鉴定辣椒品种金椒纯度的方法,其特征在于：
步骤(3)中所采用的上样缓冲液选自10×甘油凝胶上样液。
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Denomination of invention: A method for rapid identification of purity of Pepper Variety golden pepper by EST-SSR molecular marker Effective date of registration: 20211224 Granted publication date: 20180413 Pledgee: Weifang Bank Co.,Ltd. Qingzhou Qicheng sub branch Pledgor: Huasheng Agricultural Group Co.,Ltd. Registration number: Y2021980016501 |