CN106893724B - 具有抗原增效作用和肿瘤治疗作用的寡核苷酸 - Google Patents

Abstract

本发明提供了两种单链脱氧寡核苷酸，它们具有抗原增效作用和肿瘤治疗作用。它们可以和抗原或疫苗联合应用来提高抗原或疫苗的免疫效力，表现抗感染和抗肿瘤的作用。它们可以单独应用或和其它抗肿瘤制剂联合应用治疗肿瘤。

Description

具有抗原增效作用和肿瘤治疗作用的寡核苷酸

技术领域：

本发明涉及两种寡核苷酸以及其增效抗原和治疗肿瘤的用途。

背景技术

T淋巴细胞激活是激发个体对抗原发生高效免疫应答和抗肿瘤免疫应答的关键条件。T淋巴细胞激活需要获得两个激活信号。第一激活信号来自T淋巴细胞通过T细胞抗原受体(T cell antigen receptor，TCR)识别抗原提呈细胞(antigen-presenting cell，APC)或靶细胞表面的抗原肽-MHC复合物。第二激活信号来自T淋巴细胞通过CD28分子识别、结合APC或靶细胞表面的B7分子(包括CD80和CD86)。第二激活信号也称为共刺激信号(costimulatory signals)。仅获得第一激活信号的T淋巴细胞不能充分激活，甚至会进入免疫耐受状态。只有获得第一和第二激活信号后，T淋巴细胞才能被充分激活而行使功能[Sharma P.et al.Science.2015Apr 3；348(6230)：56-61；Greenwald RJ，et al.Annu RevImmunol.2005；23：515-48]。

T淋巴细胞在激活过程中也激活抑制信号通路，该抑制信号通路的激活可抑制T淋巴细胞的激活因而抑制其行使功能[Sharma P.et al.Science.2015Apr 3；348(6230)：56-61；Greenwald RJ，et al.Annu Rev Immunol.2005；23：515-48]。细胞毒性T淋巴细胞抗原4(Cytotoxic T-Lymphocyte Antigen 4，CTLA-4，也称CD152，是一种介导该抑制信号通路的蛋白质。CTLA-4表达在激活的T淋巴细胞(包括CD4⁺T淋巴细胞和CD8⁺T淋巴细胞)的表面，能和CD28竞争结合APC或靶细胞表面的B7分子(CD80和CD86)。和转导激活信号的CD28不同，CTLA-4在识别结合B7分子后，在T淋巴细胞转导激活抑制信号(负调节信号)(T.L.Walunaset al.，Immunity 1，405-413(1994)。

干扰、减弱、封闭CTLA-4和B7分子的相互作用可使T细胞处于持续充分的激活状态，会在个体产生两种效能：1、增强个体对抗原的免疫应答；2、增强对肿瘤细胞的内源性免疫应答(endogenous immune responses)。因为具有第一种效能，干扰、减弱、封闭CTLA-4和B7分子的相互作用能增强抗原的免疫效力，因此具有干扰、减弱、封闭CTLA-4和B7分子的相互作用的制剂可被用来增强抗原的效力而具有疫苗佐剂的功能。因为具有第二种效能，干扰、减弱、封闭CTLA-4和B7分子的相互作用能增强个体抗肿瘤细胞免疫反应，因此具有干扰、减弱、封闭CTLA-4和B7分子相互作用的制剂可成为一种治疗肿瘤的药物[Sharma P.etal.Science.2015Apr 3；348(6230)：56-61；R.J.Greenwald RJ，et al.Annu RevImmunol.2005；23：515-48]。

CTLA-4抗体是可以干扰、减弱、封闭CTLA-4和B7分子的相互作用的制剂，它可以识别、结合CTLA-4而抑制T淋巴细胞激活抑制信号的转导，进而使T细胞处于持续充分的激活状态。CTLA-4抗体能增强个体对肿瘤细胞的免疫应答，已成为治疗肿瘤的药物。

临床前实验证明，用CTLA-4抗体可治疗多种肿瘤，包括乳腺癌[Hurwitz A.A.，etal.Proc Natl Acad Sci U S A.1998Aug 18；95(17)：10067-71]、黑色素瘤[van ElsasA.，et al.J Exp Med.1999Aug2；190(3)：355-66]和前列腺癌[Waitz R，et al，Oncoimmunology.2012Jul 1；1(4)：544-546]。临床实验表明，CTLA-4抗体(Ipilimumab)对肿瘤有治疗作用[Leach DR，et al.Science.1996Mar22；271(5256)：1734-6]，涉及的肿瘤包括黑色素瘤[Hodi FS.et al.，N Engl J Med.2010Aug19；363(8)：711-23]、肾细胞癌[Yang JC et al.，J Immunother.2007Nov-Dec；30(8)：825-30]、前列腺癌[van denEertwegh AJ.et al.，Lancet Oncol.2012May；13(5)：509-17]、膀胱癌[Carthon B.C.etal.，Clin Cancer Res.2010May 15；16(10)：2861-71]、卵巢癌[Hodi FS.，et al.，ProcNatl Acad Sci U S A.2008Feb 26；105(8)：3005-10]和非何杰金淋巴瘤[Ansell SM.，etal.Clin Cancer Res.2009Oct 15；15(20)：6446-53]。2011年，一种抗CTLA-4抗体(Ipilimumab)被美国食品药品管理局(US Food and Drug Administration，FDA)批准治疗黑色素瘤[Sharma P，et al.Nat Rev Cancer.2011Oct24；11(11)：805-12；Pardoll DM，NatRev Cancer.2012Mar 22；12(4)：252-64]。

临床前实验表明，CTLA-4抗体可以在个体增强抗原的免疫效力，涉及的抗原有经照射处理的表达粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor，GM-CSF)的乳腺癌细胞[Hurwitz AA，et al.Proc Natl Acad Sci US A.1998Aug 18；95(17)：10067-71]、经照射处理的表达GM-CSF的黑色素瘤细胞[vanElsas A，et al.J Exp Med.1999Aug 2；190(3)：355-66]、转染GM-CSF基因的同种异体前列腺癌细胞[van den Eertwegh AJ，et al.，Lancet Oncol.2012May；13(5)：509-17]和黑色素瘤特异性gp100多肽抗原[Hodi，F.S.et al.N Engl J Med.2010Aug 19；363(8)：711-23]。

发明内容：

1、本发明提供了两种寡核苷酸，具有如序列表<400>1和<400>2所示的序列，它们可通过干扰CTLA-4mRNA而抑制CTLA-4的表达，进而干扰、减弱、封闭CTLA-4和B7分子的相互作用，使T细胞激活的抑制信号受到抑制，结果是增强个体对抗原的免疫应答、增强个体的抗微生物和抗肿瘤免疫反应。

2、这两种寡核苷酸可以经过各种化学修饰或改构。

3、这两种寡核苷酸可被用作微生物抗原和肿瘤抗原的佐剂，具有抗感染和抗肿瘤作用。

4、这两种寡核苷酸可被用于肿瘤治疗。

5、这两种寡核苷酸可以和其它的佐剂联合应用来增强个体对微生物抗原和肿瘤抗原的免疫应答。

6、这两种寡核苷酸可以和其它抗肿瘤制剂和肿瘤治疗细胞联合应用来治疗肿瘤。

发明中的术语：

除非特别强调，本发明中的术语具有可以被本发明所属领域内技术人员所理解的通常意义。若出现含义上的冲突，应遵从本发明中的解释、界定或说明。

“寡核苷酸”：寡核苷酸是由多个核苷酸组成的分子，其核苷酸的数量可以是几个或几十个。核苷酸(nucleotide)是核酸、也是寡核苷酸的基本组成单位。核苷酸由核苷(nucleoside)和磷酸组成。核苷由戊糖(pentose)和碱基(base)组成。戊糖包括核糖和脱氧核糖。戊糖分子和碱基连接形成核苷(nucleoside)。核苷由磷酸基团连接形成核苷酸。核苷酸通过磷酸二酯键连接形成寡核苷酸。组成核苷的碱基包括嘧啶和嘌呤。嘧啶包括胸腺嘧啶(thymine，缩写为T或t)和胞嘧啶(cytosine，缩写为C或c)。嘌呤包括腺嘌呤(adenine，缩写为A或a)和鸟嘌呤(guanine，缩写为G或g)。寡核苷酸中的碱基可以是稀有碱基。稀有碱基包括但不限于5-羟甲基胞嘧啶、7-甲基鸟嘌呤和5-羟甲基胞嘧啶。寡核苷酸可以是单链、双链、环形或具有环形结构的分子。在本发明中，寡核苷酸(Oligonucleotide，ODN)可以用它的英文缩写ODN来代替。寡核苷酸中的核苷酸排列序顺序构成其一级结构，这种顺序也称核苷酸序列。核苷酸序列可用碱基顺序代表，因此，核苷酸的序列也称为碱基序列。脱氧寡核苷酸的序列可用碱基的英文缩写表示，T或t代表胸腺嘧啶，C或c代表胞嘧啶，A或a代表腺嘌呤，G或g代表鸟嘌呤。

“化学修饰”：与自然的DNA相比，本发明提供的寡核苷酸可被化学修饰(chemicalmodification)。寡核苷酸的化学修饰是通过引入或除去任何化学基因而使其共价结构发生改变的现象或方法。寡核苷酸的化学修饰部位可发生在磷酸二酯键、核糖和碱基。寡核苷酸的化学修饰可发生在5’端或3’端，可在合成时或合成后进行。本发明涉及的化学修饰包括但不限于对寡核苷酸骨架的修饰，如硫代修饰(核苷酸间磷酸二酯键中磷酸的非桥性氧原子被硫原子取代)和取代修饰(包括烷基、芳香基或其它任何化学基团的取代)。寡核苷酸的化学修饰还包括碱基替代和碱基修饰，替代的碱基可以是稀有碱基或各种碱基的衍生物。寡核苷酸的化学修饰还包括在其5’端和/或3’端连接一或多个核苷酸和/或其它任何化学基团。

“UTR”：是指mRNA分子的非翻译区(untranslated region，UTR)，位于mRNA分子多肽编码区的两端，位于5’端的被称为5’端UTR，位于3’端的被称为3’端UTR。

“免疫应答”：免疫应答(immune response)和免疫反应具有相似的意义。免疫应答是个体的免疫细胞包括B淋巴细胞、T淋巴细胞、NK细胞、γδT细胞、NKT细胞、树突细胞、巨噬细胞和粒细胞等对抗原或其它刺激[如病原体相关的模式分子(pathogen associatedmolecular pattern，PAMP)和损伤相关的模式分子(damage associated molecularpattern，DAMP)做出的反应。免疫应答的结果是选择性破坏或清除入侵的病原微生物或内生的肿瘤细胞。免疫应答包括固有免疫应答和适应性免疫应答。适应性免疫应答括细胞免疫应答和体液免疫应答。由采用微生物抗原制成的疫苗所激发的免疫应答可以使被免疫的个体获得抵抗微生物感染的能力。由采用肿瘤抗原制成的疫苗所激发的免疫应答可在被免疫的个体发生肿瘤治疗作用。促进对个体对微生物的免疫应答可发生抗感染作用。促进个体对肿瘤细胞的免疫应答可发生抗肿瘤作用。

“淋巴细胞”：琳巴细胞(lymphocyte)指在血液、淋巴液和淋巴组织中存在的没有吞噬能力的单个核白细胞，包括B淋巴细胞(也称B细胞)和T淋巴细胞(也称T细胞)。T细胞可被分为表面表达CD4分子的T细胞(CD4⁺T细胞)和为表面表达CD8分子的T细胞(CD8⁺T细胞)。

“CTLA4”：CTLA-4(T lymphocyte-associated antigen 4)[Rudd C.E.，etal.Immunol Rev.2009May；229(1)：12-26]，也称为CD152或CTLA-4抗原(CTLA-4antigen)，是一种可诱导的膜蛋白，表达在激活的CD4⁺T细胞和CD8⁺T细胞的表面。CTLA-4结合在抗原提呈细胞表面的B7分子。B7分子即是CTLA-4的配体，也是T细胞表面CD28的配体。同CD28相比，CTLA-4对B7的亲和力更高，它可和CD28竞争结合B7，因而减弱CD28依赖性共刺激信号(T细胞激活的第一信号)。CTLA-4也介导对MHC-TCR通路信号(T细胞激活的第二信号)的直接抑制[Nirschl CJ.，et al.Clin Cancer Res.2013Sep15；19(18)：4917-24]。活化T细胞可上调表达CTLA-4，CTLA-4与B7结合后可传导抑制信号抑制T细胞激活。在肿瘤微环境中，CTLA-4介导的T细胞激活抑制可削弱个体的抗肿瘤免疫反应。阻断CTLA-4的功能可增强个体的抗肿瘤活性，产生肿瘤治疗作用[Leach DR.，et al.Science.1996Mar22；271(5256)：1734-6]。阻断CTLA-4的功能可增强个体对抗原或疫苗的免疫应答[van Elsas A.，et al.J ExpMed.1999Aug 2；190(3)：355-66]。

“T细胞受体”：T细胞受体(T cell receptor，TCR)是表达在T细胞表面的抗原受体，为异二聚体跨膜蛋白。TCR由可变(V)区和恒定(C)区组成。V区是TCR识别抗原表位的结构域。TCR不能直接识别抗原表位，只能识别抗原递呈细胞或靶细胞表面的抗原肽-MHC(主要组织相容复合体)分子复合物。

“MHC分子”：MHC分子是主要组织相容复合体(major histocompatibiltiycomplex，MHC)基因编码的蛋白类分子。MHC分子包括MHC I类分子和MHC II类分子。

“CD28”：CD28是表达在T细胞表面的蛋白，可识别抗原呈递细胞表面的B7分子。在识别B7分子后，CD28向T细胞提供共刺激信号(co-stimulatory signals)。

“B7分子”：B7分子是主要表达在抗原提呈细胞特别是树突细胞表面的蛋白分子，包括B7.1(CD80)和B7.2(CD86)两种，除淋巴瘤细胞外，肿瘤细胞多不表达B7分子[Sharma，J.P.Allison.Science 348，56，2015]。

“共刺激分子”：共刺激分子(co-stimulaorymolecules)是表达在抗原提呈细胞(antigen presenting cells，APC)或肿瘤细胞表面的蛋白类分子，在免疫应答的过程中提供激活CD4+T淋巴细胞和CD8+T淋巴细胞的第二激活信号。

“T淋巴细胞的激活”：T淋巴细胞的激活需要来两个信号。第一信号通过其TCR识别APC或靶细胞(可被CD8+T细胞杀伤的细胞)表面的抗原肽-MHC分子复合物获得；第二信号，也称共刺激信号，通过其CD28分子识别APC或靶细胞表面的B7分子获得。在双信号的作用下，T细胞启动激活信号转导通路，进而增殖、分化行使功能。仅有第一信号而无第二激活信号可使T细胞进入不应答状态。T淋巴细胞激活后发生T淋巴细胞反应。

“T淋巴细胞反应”：T淋巴细胞反应(T lymphocyte response)和“T淋巴细胞活性”(T lymphocyte activity)或“T淋巴细胞行使的功能”在本发明中是可以互换的术语。T淋巴细胞反应包括T淋巴细胞增生和/或分化成辅助性T淋巴细胞(Th)、细胞毒性T淋巴细胞(Tc)或调节性T淋巴细胞(Treg)，也包括由Th向B淋巴细胞提供信号辅助其产生抗体、由Tc杀伤靶细胞和释放可溶性因子如细胞因子来调节其它免疫细胞的功能。Th是CD4⁺T细胞，Tc是CD8⁺T细胞。在激活后，CD4⁺T细胞辅助B细胞产生抗体，辅助CD8⁺T细胞杀伤靶细胞如病毒感染细胞和肿瘤细胞。在激活后，CD8⁺T细胞可杀伤病毒感染细胞和肿瘤细胞。促进、维持T细胞激活会增强个体对微生物抗原的免疫应答而产生抗感染作用，也会促进个体免疫细胞对肿瘤细胞的免疫应答产生肿瘤治疗作用。

“个体”：在本发明中的个体(subject或individual)指人和非人类的脊椎动物。

“靶细胞”：靶细胞(Target cell)指个体可被免疫细胞攻击、杀伤或作用的细胞，可以是肿瘤细胞、病毒感染细胞，也可以指被本发明提供的寡核苷酸作用的细胞。

“CTLA-4抗体”：是能特异结合CTLA4的抗体，可以封闭CTLA-4转导的抑制信号，使T淋巴细胞被肿瘤抗原充分激活，能延长肿瘤患者的生存期。Ipilimumab是一种完全人源化的IgG1CTLA-4单克隆抗体[Lipson EJ.，et al.Clin Cancer Res.2011Nov 15；17(22)：6958-62]，在2011被美国FDA批准为治疗晚期黑色素瘤的药物[Sharma P.etal.Science.2015Apr 3；348(6230)：56-61]。Tremelimumab是另一种人源化的IgG2CTLA-4单克隆抗体[Ribas A.，et al.Oncologist.2007Jul；12(7)：873-83]。在临床试验中，Tremelimumab被用于治疗肝细胞癌[Sangro B.，et al.J Hepatol.2013Jul；59(1)：81-8]、胃癌和食管癌[Ralph C.et al.Clin Cancer Res.2010Mar 1；16(5)：1662-72]。CTLA-4的抗体属免疫卡点分子抑制物。

“免疫卡点分子”：免疫卡点分子(immune checkpoint molecules)是表达在免疫细胞上的蛋白分子，在识别其配体后启动抑制性信号通路因而抑制免疫细胞的激活。免疫卡点分子包括但不限于CTLA-4分子、PD-1分子、PD-L1/2分子、淋巴细胞激活基因3(lymphocyte-activation gene 3，LAG-3)、TIM-3(T cell immunoglobul in and mucindomain-containing 3)、TIGIT(T cell immunoreceptor with immunoglobulin and ITIMdomains)和BTLA(B and T lymphocyte attenuator)。封闭免疫卡点(immune checkpointblockade)是指抑制免疫卡点分子在免疫细胞转递抑制信号的功能而促进、维持T细胞激活的方法。封闭免疫卡点增强个体对微生物抗原的免疫应答表现抗感染作用，也可促进个体免疫细胞的抗肿瘤活性表现肿瘤治疗作用[Melero I，et al.Nat Rev Cancer.2015Aug；15(8)：457-72]。

“肿瘤”：本发明中的“肿瘤”即现代医学定义的肿瘤，可以分为良性肿瘤和恶性肿瘤。肿瘤(tumor)和癌症(cancer)可以互换使用，具有相同的含义。肿瘤包括实体瘤、软组织肉瘤和髓样或淋巴样系统肿瘤。本发明提供的寡核苷酸可增强个体对肿瘤抗原的免疫应答产生抗肿瘤作用，涉及的肿瘤包括但不限于：食道癌、胆囊癌、膀胱癌、乳腺癌、结肠癌、结直肠癌、肾上腺皮质肿瘤、肾癌、肝癌、肺癌、卵巢癌、子宫颈癌、子宫癌、阴道癌、胰腺癌、直肠癌、前列腺癌、胃癌、皮肤癌、黑色素瘤、脑肿瘤、胶质瘤、骨肿瘤、肉瘤、阴茎癌、视网膜母细胞瘤、白血病、淋巴瘤和骨髓瘤。

“治疗”：包括应用本发明提供的寡核苷酸来阻止或延缓疾病(如肿瘤)的症状和并发症的出现。治疗也可以是预防性。对肿瘤的治疗也指在个体控制肿瘤的进展，延长肿瘤患者的生存期，改善生活质量，减轻症状，使肿瘤缩小甚至消除，使肿瘤转移受到遏制。在本发明中“肿瘤治疗”和“抗肿瘤作用”或“治疗肿瘤”有相同的含义。抗肿瘤作用包括对肿瘤的治疗，也包括对肿瘤发生、复发和转移的预防。

“抗原”：是能被B细胞受体或T细胞受体识别而激发个体适应性免疫应答(adaptive immune response)的物质或分子。抗原可以来自个体的外部，如微生物抗原；也可来自个体的内部，如肿瘤抗原。微生物抗原是微生物上可被B细胞受体或T细胞受体识别而激发个体适应性免疫应答(adaptive immune response)的物质或分子。采用微生物抗原制备成的疫苗在给个体应用后能使其获得对该病原体的免疫力，使其在再次接触到同样或相似病原体时受到保护。采用肿瘤抗原制成的疫苗在给个体应用后能激发其对肿瘤细胞的适应性免疫应答进而产生肿瘤治疗作用。抗原可以从微生物或肿瘤细胞提取、也可以采用重组DNA技术生产或其它方法合成。

“疫苗”：疫苗(vaccine)是用减毒或杀死的病原生物或其组份为抗原制成的用于人工主动免疫的生物制品。抗原和佐剂是疫苗的主要成分。接种疫苗的目的是使个体获得对病原体的免疫力进而使其再接触到相应的病原体时受到保护。本发明提供的寡核苷酸可以和人用疫苗联合应用增强其免疫效力，这些疫苗包括但不限于可预防下述传染性疾病的疫苗[Stanley A.Plotkin，Walter A.Orenstein，Paul A.Offit，Vaccines，SixthEdition，An imprint of Elsevier Inc.2013，ISBN-13：9781455700905]：白喉、破伤风、黄热病、百日咳、流感嗜血杆菌b感染、脊髓灰质炎、麻疹、腮腺炎、风疹、斑疹伤寒、狂犬病、轮状病毒感染、甲型肝炎、乙型肝炎、戊型肝炎、流感、结核、疟疾、霍乱、水痘、流行性乙型脑炎、森林脑炎、霍乱、莱姆病、肺炎球菌感染、脑膜炎球菌感染、伤寒、天花、炭疽、埃博拉病毒感染、绿猴病毒(Marburg viruses，MARV)感染和委内瑞拉马脑炎病毒(Venezuelan equineencephalitis virus，VEEV)感染。本发明涉及的疫苗也包括肿瘤疫苗。肿瘤抗原和佐剂是肿瘤疫苗的主要成分。肿瘤疫苗可治疗或预防肿瘤。肿瘤疫苗中的抗原可以是肿瘤抗原、提呈肿瘤抗原的细胞、表达肿瘤抗原的细胞或肿瘤细胞裂解物。本发明提供的寡核苷酸可以和肿瘤疫苗联合应用增强其预防和/或治疗肿瘤的效力，这类疫苗包括但不限于：子宫颈癌预防的人乳头瘤病毒疫苗、用于治疗前列腺癌的Provenge疫苗、用各种肿瘤抗原制成的疫苗、用各种肿瘤细胞制成的疫苗和用肿瘤细胞裂解物制成的疫苗。本发明提供的寡核苷酸可以和动物用疫苗联合应用增强其免疫效力，这些疫苗包括但不限于可预防下述传染性疾病的疫苗：猪口蹄疫、猪蓝耳病(猪繁殖与呼吸综合征)、猪瘟、猪伪狂犬病、猪圆环病毒感染、猪细小病毒感染、猪链球菌、猪传染性胃肠炎、猪气喘病、副猪嗜血杆菌感染、猪丹毒、猪肺疫、猪萎缩性鼻炎、猪传染性胃肠炎、猪乙脑、猪流感、猪布鲁氏病、仔猪腹泻、猪副流感病毒感染、猪流感、猪肺炎支原体感染、仔猪水肿病、猪霍乱沙门氏菌、猪流行性腹泻、猪肺疫；牛气肿疽、牛炭疽、牛流行热、牛巴氏杆菌病、牛布鲁菌感染、牛破伤风、牛魏氏梭菌感染、牛肉毒梭菌感染、牛口蹄疫、牛副伤寒、牛痘、牛腹泻；羊快疫、羊猝疽、羊肠毒血症、羔羊痢疾、羊黑疫(传染性坏死性肝炎)、山羊痘病、羊破伤风、羊炭疽病、羔羊大肠杆菌病、羊流产衣原体感染、羊口疮、羊传染性胸膜肺炎、羊布氏杆菌病、羊肉毒梭菌中毒症、羊痘、羊链球苗病、羊狂犬病、羊口蹄疫、羊口疮病、羊蓝舌病；马传染性贫血、马流感；猪马牛羊犬脑炎；鸡新城疫、鸡传染性法氏囊炎、鸡马立克病、禽流感、禽霍乱病、鸡痘、鸡染性支气管炎、鸡病毒性肝炎、鸡减蛋综合征；鸭流感、鸭疫里默氏杆菌苗、鸭瘟、鸭传染性浆膜炎、鸭大肠杆菌病；小鹅瘟、鹅副黏病毒病、鹅流感；狂犬病、犬温热、犬细小病毒病、犬钩端螺旋体病、犬传染性肝炎、犬传染性支气管炎、犬副流感病、犬脑炎和犬窝咳疫苗。

“肿瘤抗原”：本发明提供的寡核苷酸可以和肿瘤抗原联合应用促进个体对肿瘤抗原的免疫应答。在本发明中，肿瘤抗原(Tumor antigen)，肿瘤细胞抗原(tumor cellantigen)和肿瘤相关抗原(tumor associated antigen，TAA)可以交换应用，有相同的含义。肿瘤抗原能激发抗肿瘤免疫应答，针对肿瘤抗原的免疫应答产生肿瘤治疗作用。瘤抗原包括但不限于：BAGE(B melanoma antigen)、GAGE(G antigen12B/C/D/E)、MAGE(melanomaantigen-encoding gene)、NY-ESO-1；CEA(carcinoembryonic antigen)、gp100(glycoprotein 100)、Melan-A(melanoma antigen recognized by T cells 1)、PSA(prostate-specific antigen)、酪氨酸酶、HER2(human epidermal growth factorreceptor 2，hTERT(telomerase transcriptase)、p53、survivin、β-catenin-m、HSP70-2/m(heat shock-related 70kDa protein 2mutated)、KRAS、GM2(ganglioside GM2)、MUC1(mucin-1)、乙型肝炎病毒基因编码抗原、丙型肝炎病毒基因编码的抗原、人乳头瘤病毒基因编码抗原(如L1蛋白、E6蛋白和E7蛋白)和EB病毒基因编码的抗原(Epstein Barr Viruspeptides)[Zielinski C，et al.Nat Rev Clin Oncol.2014Sep；11(9)：509-24；Adams JL，et al.Nat Rev Drug Discov.2015Sep；14(9)：603-22]。肿瘤抗原还包括经灭活处理全肿瘤细胞和肿瘤细胞裂解物。肿瘤抗原可以是因基因突变而表达的新抗原(neo-antigen)，也可以是B细胞肿瘤的独特型抗原和自肿瘤细胞提取的热休克蛋白肿瘤细胞肽复合物[Suot，R&Srivastava，P(1995)Science 269：1585-1588；Tamura，Y.et al.(1997)Science 278：117-120]。

“肿瘤疫苗”本发明提供的寡核苷酸可以和肿瘤疫苗联合应用增强其肿瘤治疗的效力。肿瘤疫苗是指能诱生个体产生抗肿瘤适应性免疫应答的生物制品。本发明涉及的肿瘤疫苗包括采用肿瘤抗原、肿瘤细胞裂解物、肿瘤细胞和提呈肿瘤抗原的细胞以一定的剂型制成的疫苗。这类疫苗包括但不限于下述[[Zielinski C，et al.Nat Rev ClinOncol.2014Sep；11(9)：509-24]：治疗前列腺癌的肿瘤疫苗，采用的肿瘤抗原包括前列腺酸性磷酸酶(用于sipuleucel-T)、

和PSA；治疗乳腺癌的的肿瘤疫苗，采用的肿瘤抗原包括HER2来源的多肽、MUC1和WT1(Wilms tumour protein)抗原；治疗肺癌的肿瘤疫苗，采用的肿瘤抗原包括MUC1、melanoma-associated antigen-3(MAGE-A3)多肽、telomerasereverse transcriptase和EGF；治疗黑色素瘤的疫苗，采用的抗原包括β-catenin、gp100、MAGE-A3、MART1(melanoma antigen recognized by T cells 1)、NY-ESO-1和survivin；治疗胰腺癌疫苗的肿瘤疫苗，采用的肿瘤抗原包括端粒酶肽、同种异体肿瘤细胞和突变RAS合成肽；治疗结直肠癌的的肿瘤疫苗，采用的肿瘤抗原包括癌胚抗原(carcinoembryonicantigen，CEA)、MUC1和全肿瘤细胞；治疗肾细胞癌的肿瘤疫苗，采用的肿瘤抗原包括肿瘤细胞RNA；血液肿瘤治疗用疫苗，采用的肿瘤抗原包括WT1、MAGE、MUC1、PRAME(preferentiallyexpressed antigen of melanoma)和独特型抗原。

“肿瘤细胞裂解物”肿瘤细胞裂解物可通过破碎肿瘤细胞获得，含各种肿瘤抗原。破碎肿瘤细胞的方法包括但不限于反复冻融、超声处理和机械破碎。本发明提供的寡核苷酸可以和肿瘤细胞裂解物联合应用促进个体的抗肿瘤免疫反应。原发肿瘤、继发或转移肿瘤细胞都可被用来制备肿瘤细胞裂解物。将原发肿瘤和继发或转移肿瘤细胞在体外培养，可获得肿瘤细胞系(tumor cell line)细胞，这些肿瘤细胞系细胞也可以被用来制备肿瘤细胞裂解物。用于制备肿瘤细胞裂解物的肿瘤细胞可以是自体、同种异体的或异种的。

“佐剂”本发明提供的寡核苷酸可以和一种或多种佐剂联合使用来增强微生物抗原和肿瘤抗原的免疫效力。佐剂(adjuvant)是在疫苗中和抗原一起应用的物质，具有下述活性(1)减少疫苗的接种次数；(2)延长疫苗的免疫持续期；(3)通过激动固有免疫应答促进体液免疫应答和细胞免疫应答；(4)扩展抗原诱导的交叉保护免疫应答；(5)增强弱免疫应答个体如老龄个体或免疫缺陷个体对抗原的免疫应答；(6)减少抗原的用量。可以和本发明提供的寡核苷酸联合应用的佐剂[Stanley A.Plotkin，Walter A.Orenstein，PaulA.Offit，Vaccines，Sixth Edition，An imprint of Elsevier Inc.2013，ISBN-13：9781455700905]包括但不限于：铝盐佐剂(由氢氧化铝或磷酸铝为主要成分的疫苗佐剂)、AS04佐剂(吸附MPL的磷酸铝佐剂(MPL是经化学减毒的革兰氏阴性菌脂多糖)、MF59佐剂(一种油包水型乳化剂，其中的油相是角鲨烯)、AS03佐剂(一种采用角鲨烯为油相的水包油佐剂)、AF03佐剂(一种采用角鲨烯为油相的水包油型乳化剂)、Montanide ISA 51佐剂(以矿物油为油相的油包水乳化剂)、弗氏佐剂、弗氏不完全佐剂、病毒小体佐剂(virosomeadjuvant)、N-氧化聚乙烯对二氮己环衍生物(polyoxidonium)佐剂、Toll样受体激动剂、病原体相关模式分子及其模拟物、损伤相关模式分子及其模拟物、环二核苷酸及其模拟物、GM-CSF(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor)、IL-12、油性乳化剂(AS02，AS03，AF03，MF59和Montanide^TM ISA-51)、白油佐剂、Montanide^TM ISA-206佐剂、QS21、polylactide co-glycolide、病毒(Adenovirus，vaccinia，fowlpox)载体佐剂、卡介苗(BCG，bacillus Calmette-Guérin)、包括poly(I：C)在内的双链RNA及其类似物、包括MPL在内的类脂A类似物、鞭毛蛋白、包括Imiquimod和R848在内的Imidazoquinolines、CpGODN、包括QS21在內的皂素、包括TDB在内的C-type lectin ligands、包括α-galactosylceramide在内的CD1d配体、AS01(MPL，QS21，liposomes)、AS02(MPL，QS21，乳化剂)、AS15(MPL，QS21，CpG ODN，脂质体)、GLA-SE(GLA，emulsion)、IC31(CpG ODN，阳离子多肽)、CAF01(TDB，阳离子脂质体)和ISCOMs(皂素，磷脂)[Reed SG，et al.Nat Med.2013Dec；19(12)：1597-608；Melero I，et al.Nat Rev Clin Oncol.2014Sep；11(9)：509-24]。

“病原体相关的模式分子”：本本发明提供的寡核苷酸可以和病原体相关的模式分子(pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)及其类似物联合应用来增强微生物抗原和肿瘤抗原的免疫效果来发挥抗感染或抗肿瘤作用。PAMPs是微生物的各种保守成分，如细菌和真菌细胞壁成分和病毒核酸。固有免疫细胞通过模式识别受体(pattern-recognition receptors，PRRs)识别PAMPs而被激活。PRR包括Toll-like receptors(TLRs)、nucleotide-binding oligomerization domain(Nod)-，leucine-rich repeat-containing receptors(NLRs)、RIG-I-like receptors(RLRs)、C-type lectin receptors(CLRs)和AIM-2like receptors；也包括细胞内识别核酸的细胞内核酸感受器(intracellular sensors of nucleic acids)、OAS蛋白和cGAS[Iwasaki A et al.NatImmunol.2015Apr；16(4)：343-53]。

“Toll样受体激动剂”：本发明提供的寡核苷酸可以和一种或多种Toll样受体(Toll-like receptors，TLRs)激动剂联合应用来增强微生物抗原和肿瘤抗原的免疫效果，表现抗感染或抗肿瘤活性。能和本发明提供的寡核苷酸联合应用的TLR激动剂包括但不限于：包括Imiquimod和imidazoquinolines在内的TLR7和TLR8激动剂；包括852A在内的TLR7激动剂；包括VTX-2337在内的TLR8激动剂；包括IMO-2055、CPG7909、MGN1703和其它CpG ODN(含CpG脱氧寡核苷酸)在内的TLR9激动剂；包括卡介苗(BCG)在内的TLR2/TLR4激动剂；包括OM-174、monophosphoryl lipid A、aminoalkyl glucosamine phosphates和其它类脂A(lipid A)类似物在内的TLR4激动剂；包括病毒核酸、细菌核酸在内的TLR9激动剂；包括细菌鞭毛蛋白在内的TLR5激动剂、包括酵母多糖在内的TLR2/TLR6激动剂；包括聚肌苷酸胞嘧啶核苷酸(poly IC)、病毒双链RNA或其模拟物在内的TLR3激动剂和包括病毒单链RNA或其模拟物的TLR7/TLR8激动剂[Adams JL et al Nat Rev Drug Discov.2015Sep；14(9)：603-22]。

“损伤相关的模式分子”：本发明提供的寡核苷酸可以和损伤相关的模式分子(damage-associated molecular patterns，DAMPs)来增强微生物抗原和肿瘤抗原的免疫效果。DAMPs是由损伤细胞释放的、能激发固有免疫应答自身细胞成分。DAMPs能通过PRR激发机体的固有免疫应答。这些DAMP包括但不限于：热休克蛋白、HMGB1(high-mobilitygroup box 1)、hyaluronan片段、glycans、glycoconjugates、ATP，(Adenosine 5’-triphosphate)、腺苷酸、尿酸、S100蛋白、heparin sulfate、Galectins、细胞核DNA、N-formylated peptides、Antimicrobial peptides、线粒体DNA和calreticulin[Krysko DVet al.Nat Rev Cancer.2012Dec；12(12)：860-75；Pouwels SD et al.MucosalImmunol.2014Mar；7(2)：215-26]。

“环二核苷酸”本本发明提供的寡核苷酸可以和环二核苷酸及其模拟物联合应用来增强微生物抗原和肿瘤抗原的免疫效果。环二核苷酸(Cyclic dinucleotides，CDNs)[Cell，2013 154(5)，962-970]可来源于细菌，也可在哺乳动物细胞内合成。细菌CDNs包括但不限于环二鸟苷酸(cyclic di-GMP，cdG)、环二腺苷酸(cyclic di-AMP，cdA)和环腺苷酸-鸟苷酸(cyclic AMP-GMP，cAMP-GMP)。细菌CDN是一类PAMP，可激动固有免疫应答。在哺乳动物细胞中也可出现CDN，如环鸟苷酸-腺苷酸(cyclic guanosine monophosphate-adenosine monophosphate，cGAMP)[Wu J et al.Science.2013Feb 15；339(6121)：826-3]。

“抗肿瘤制剂”：抗肿瘤制剂(anti-tumor agent)是应用于个体后可治疗肿瘤的制剂，这些制剂包括但不限于肿瘤疫苗、免疫卡点抑制物、共刺激受体激活剂、化疗药物、放疗制剂、激素抑制物或激素、细胞因子、肿瘤治疗用抗体、小分子激酶抑制剂、PARP抑制物、血管生成抑制剂和溶瘤病毒等。

“免疫卡点抑制物”：免疫卡点抑制物(immune checkpoint inhibitor)是能抑制免疫卡点分子功能的物质[Melero I et al.Nat Rev Cancer.2015Aug；15(8)：457-72]。抑制免疫卡点分子的功能使免疫细胞激活的信号得以突显，因而使免疫细胞处于持续的激活状态。处于持续激活状态的CD4⁺T细胞会辅助B细胞产生抗体，也辅助CD8⁺T细胞杀伤靶细胞如病毒感染细胞和肿瘤细胞。处于持续激活状态的CD8⁺T细胞能杀伤病毒感染细胞和肿瘤细胞。因此，维持T细胞激活状态的制剂如免疫加点抑制物会提高抗原或疫苗在个体的免疫效力，也会在癌症患者(个体)发生肿瘤治疗作用。本发明提供的寡核苷酸可以和免疫卡点抑制剂联合应用治疗肿瘤和提高抗原或疫苗的免疫效力。免疫卡点抑制剂抑制的免疫卡点分子包括但不限于CTLA4、PD1、LAG3(Lymphocyte activation gene 3)、2B4(CD244)、BTLA(B and T lymphocyte attenuator)、TIM3(T cell membrane protein 3)和A2aR(adenosine A2a receptor)[Pardoll DM.Nat Rev Cancer.2012Mar 22；12(4)：252-64]。能抑制免疫卡点功能的抗体属免疫卡点抑制物，包括但不限于CTLA-4抗体、CD-1抗体和CD-L抗体。

“PD-1”：PD-1(Programmed cell death protein-1)，也称CD279，是表达在激活的T细胞、激活的B细胞、NK细胞和单核细胞上的膜蛋白[Chen L.Nat Rev Immunol.2004May；4(5)：336-47]。PD-1可诱导效应性T细胞耗竭和无能。PD-1结合APC上的B7家族配体PD-L1(programmed death ligand-1，B7-H1)和PD-L2(programmed death ligand-2，B7-DC)[ItoA.Biomed Res Int.2015；2015：605478]启动免疫细胞激活抑制信号的转导。

“PD1抗体”：PD-1的抗体(Anti-PD-1Antibodies)是PD1分子的单克隆抗体，具有抑制PD-1介导的免疫细胞负调节信号转导的功能，为免疫卡点抑制物。2014年，两种PD-1抗体(pembrolizumab和nivolumab)被美国FDA批准用于肿瘤治疗。Nivolumab是全人源化IgG4单克隆抗体，可结合并抑制PD-1的功能[Topalian SL et al.Curr Opin Immunol.2012Apr；24(2)：207-12]，被用于治疗黑色素瘤、非小细胞性肺癌、卵巢癌和肾癌[Ito A etal.Biomed Res Int.2015；2015：605478]。Pidilizumab(CT-011)是人源化IgG-1κ单克隆抗体，可结合并抑制PD-1的功能，被用于治疗弥散性大B细胞淋巴瘤和滤泡淋巴瘤。此外，PD-1的抗体还包括Pembrolizumab(MK-3475)，它是可结合并抑制PD-1功能的IgG-4κ单克隆抗体[Ito A et al.Biomed Res Int.2015；2015：605478]。

“PD-L1”：PD-L是PD1分子的配体，包括PD-L1(programmed death ligand-1，B7-H1)和PD-L2(programmed death ligand-2)。PD-L1也称B7-H1。PD-L2也称B7-DC。PD-L1和PD-L2在结合PD-1分子后可激动免疫细胞激活抑制信号的转导。PD-L1和PD-L2可表达在多种肿瘤细胞的表面，其表达水平的升高可提示肿瘤患者的不良预后[Ito A et al.BiomedRes Int.2015；2015：605478]。

“抗-PD-L抗体”：是识别、结合PD-L1或PD-L2的抗体。在结合PD-L后可阻断其结合免疫细胞表面的PD-1，因而阻断免疫细胞激活抑制信号的转导，维持免疫细胞的激活状态，进而增强个体对抗原或肿瘤细胞的免疫应答。多种抗-PD-L1抗体(Anti-PD-L1Antibodies)表现了肿瘤治疗作用，这些抗体包括但不限于BMS-936559、MPDL3280A、MEDI4736和MSB0010718[Ito A，et al.Biomed Res Int.2015；2015：605478]。BMS-936559是全人源化IgG4抗PD-L1单克隆抗体，被用于治疗黑色素瘤、非小细胞肺癌、卵巢癌和肾癌。MPDL3280A是人源化IgG-1κ抗PD-L1单克隆抗体，被用于治疗黑色素瘤和膀胱癌。MEDI4736是人源化IgG-1κ单克隆抗体，可延长荷瘤个体的生存期。MSB0010718是人源化IgG1PD-L1单克隆抗体[Ito A，et al.Biomed Res Int.2015；2015：605478]。

“PD-1-PD-L1/2途径”：是指肿瘤细胞通过其表达的PD-L1/2作用于免疫细胞表达的PD-1诱导免疫细胞激活抑制信号的转导，因而抑制免疫细胞激活的途径。肿瘤细胞可利用PD-1-PD-L1/2途径逃逸免疫细胞的攻击[Zou W.，Chen L.Nature ReviewsImmunology.2008；8(6)：467-477]。阻断该途径可增强个体免疫细胞的抗肿瘤活性[Topalian S.L.，et al.Current Opinion in Immunology.2012；24(2)：207-212]。

“共刺激受体激活剂”：本发明提供的寡核苷酸可以和共受体激活剂联合应用增强个体对疫苗或抗原的免疫应答，增强个体的抗肿瘤免疫反应。共刺激受体是表达在免疫细胞表面的受体，在受到激活剂激活后介导免疫细胞激活信号的转导，因而促进个体对抗原或疫苗的免疫反应、增强个体的抗肿瘤免疫活性。共刺激受体激活剂是通过结合共刺激受体后激活免疫细胞的制剂。共刺激受体激活性单克隆抗体(Co-stimulatory receptoractivating monoclonal antibody)是共刺激受体激活剂，可增强抗原或疫苗的效力、增强个体的抗肿瘤免疫应答。这类激活性单克隆抗体靶向的共刺激受体(Co-stimulatoryreceptor)包括但不限于CD137(41BB)、OX40、CD40、GITR、ICOS和CD27(Glucocorticoid-induced tumour necrosis factor receptor family-related protein)[Melero I etal.Nat Rev Cancer.2015Aug；15(8)：457-72；Sanmamed MF et al.Semin Oncol.2015Aug；42(4)：640-55]。

“化疗药物”本发明提供的寡核苷酸可以和化疗药物联合应用治疗肿瘤。化疗药物是可以通过抑制、杀伤肿瘤细胞而治疗肿瘤的化学药物。本发明所指的化学药物包括但不限于烷化剂类、抗代谢类、抗微管制剂类、拓扑异构酶抑制剂类和细胞毒性抗生素类药物。烷化剂类药物包括氮芥类、亚硝基脲类、四嗪类、氮杂环丙烷类、顺铂及其衍生物类和非经典烷化剂类。氮芥(nitrogen mustards)类药物包括mechlorethamine、环磷酰胺、chlorambucil、ifosfamide和busulfan。亚硝基脲类包括N-Nitroso-N-methylurea、carmustine、lomustine、semustine、fotemustine和streptozotocin。四嗪(tetrazines)类药物包括氮烯唑胺(dacarbazine)、mitozolomide和temozolomide。氮杂环丙烷(aziridines)类药物包括thiotepa、mytomycin和diaziquone。顺铂及其衍生物类包括顺铂(cisplatin)、卡铂(carboplatin)和奥沙利铂(oxaliplatin)。非经典烷化剂类包括甲基苄肼(procarbazine)和hexamethylmelamine。抗代谢类包括抗叶酸类、氟尿嘧啶类、脱氧核苷类似物和巯嘌呤类药物。抗叶酸类包括甲氨喋呤(methotrexate)和pemetrexed。氟尿嘧啶类药物包括5-氟脲嘧啶(5-fluorouracil)。脱氧核苷类似物药物包括cytarabine、吉西他滨(gemcitabine)、decitabine、vidaza、fludarabine、nelarabine、cladribine、clofarabine和pentostatin。巯嘌呤类(thiopurines)药物包括thioguanine和mercaptopurine。抗微管制剂药物包括长春花生物碱类、紫杉烷类和足叶草毒素类。长春花生物碱(vinca alkaloids)类包括长春新碱(vincristine)、长春碱(vinblastine)、长春瑞宾(vinorelbine)、vindesine和vinflunine。紫杉烷类(Taxanes)包括紫杉醇(paclitaxel)和多烯紫杉醇(Docetaxel)。足叶草毒素(Podophyllotoxin)类包括依托泊苷(etoposide)和teniposide。拓扑异构酶抑制剂(topoisomerase inhibitors)包括topoisomerase I抑制剂和topoisomerase II抑制剂。拓扑异构酶I抑制剂包括irinotecan和topotecan。拓扑异构酶II抑制剂包括topoisomerase II poisons和催化抑制物。topoisomerase IIpoisons包括etoposide、doxorubicin、mitoxantrone和teniposide。催化抑制物包括novobiocin、merbarone和aclarubicin。细胞毒性抗生素包括阿霉素、daunorubicin、表柔比星(epirubicin)、idarubicin、pirarubicin、aclarubicin、mitoxantrone、gactinomycin、博来霉素(bleomycin)、plicamycin和mitomycin。

“放疗制剂”：放疗制剂是可以产生射线的物质。采用放疗制剂治疗肿瘤的方法被称为化疗。本发明提供的寡核苷酸可以和放疗联合应用治疗肿瘤。用于放疗的物质是产生α、β、γ射线的放射性同位素。用于放疗的射线也可由机器产生，这类机器包括x射线治疗机或加速器。

“激素抑制物或激素”：本发明提供的寡核苷酸可以和用于肿瘤治疗的激素抑制物或激素联合应用治疗肿瘤，这类抑制物包括但不限于激素合成抑制剂、激素受体拮抗剂和补充用激素。激素合成抑制剂包括芳香化酶抑制剂和促性腺激素释放激素(gonadotropin-releasing hormone，GnRH)类似物。芳香化酶抑制剂包括Letrozole，anastrozole和Aminoglutethimide。GnRH类似物包括Leuprolide和gosereli。激素受体拮抗剂包括选择性雌激素受体调节剂和雄激素受体拮抗剂。选择性雌激素受体调节剂包括Tamoxifen、Raloxifene、Toremifene和fulvestrant。雄激素受体拮抗剂包括Flutamide和bicalutamide。补充用激素是采用补充激素(Hormone supplementation)治疗肿瘤的方法，采用的激素包括孕激素、雄激素、雌激素、孕酮样药物、睾丸酮样药物、雌激素激动剂和生长激素抑制素类似物。孕酮样药物包括megestrol acetate和medroxyprogesteroneacetate。睾丸酮样药物包括Fluoxymesterone。雌激素拮抗剂包括diethylstilbestrol，Estrace和Polyestradiol phosphate。生长激素抑制素类似物包括Octreotide。

“细胞因子”：本发明提供的寡核苷酸可和细胞因子联合应用治疗肿瘤、增强疫苗的免疫效果。这些细胞因子包括但不限于：白细胞介素(IL)-2、血小板生成素(IL-11)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞-单核细胞集落刺激因子(GM-CSF)和干扰素α。

“肿瘤治疗用抗体”本发明提供的寡核苷酸可和肿瘤治疗用抗体(tumortherapeutic antibodies)联合应用治疗肿瘤。肿瘤治疗用抗体是在给患肿瘤个体应用后能延长其生存期的抗体，这些抗体靶向的分子包括但不限于CD20、ErbB2、表皮细胞生长因子受体、包括CTLA-4和PD-1在内的免疫卡点分子、血管内皮细胞生长因子受体、CD30、CD52和CD33。所涉及到的肿瘤治疗抗体这些抗体包括但不限于靶向CD20的Tositumomab(Bexxar)、Rituximab(Rituxan)和Ofatumumab(Arzerra；Genmab)；靶向ErbB2的Trastuzumab(Herceptin)；靶向表皮细胞生长因子受体的Panitumumab(Vectibix)和Cetuximab(Erbitux)；靶向PD-1的人源化抗体；靶向CTLA-4的人源化抗体；靶向血管内皮细胞生长因子受体的Bevacizumab(Avastin)；靶向CD30的Brentuximab(vedotin)；靶向CD52的Alemtuzumab(Campath)和靶向CD33的Gemtuzumab ozogamicin(Mylotarg；Wyeth)[ScottAM et al.Nat Rev Cancer.2012Mar22；12(4)：278-87]。

“小分子激酶抑制物”：本发明提供的寡核苷酸可和小分子激酶抑制物(small-molecule kinase inhibitors)联合应用治疗肿瘤。小分子激酶抑制物为一类能通过抑制蛋白激酶活性发挥肿瘤治疗作用的小分子化合物，包括但不限于下述：靶向Bcr-Abl的Imatinib；靶向EGFR/ErbB2的Afatinib；靶向VEGFR1/VEGFR2/VEGFR3/PDGFRB/c-KIT的Axitinib；靶向BcrAbl/SRC的Bosutinib；靶向ALK/Met的Crizotinib；靶向ErbB1的Erlotinib；靶向Syk的Fostamatinib；靶向EGFR的Gefitinib；靶向BTK的Ibrutinib；靶向ErbB1/ErbB2的Lapatinib；靶向VEGFR2/VEGFR2的Lenvatinib；靶向Bcr-Abl的Nilotinib；靶向VEGFR2/PDGFR/c-kit的Pazopanib；靶向JAK的Ruxolitinib；靶向突变BRAF的vemurafenib(Zelboraf)和dabrafenib(Tafinlar)和靶向MEK的trametinib(Mekinist)。小分子蛋白激酶抑制物还包括所有的通过抑制下述蛋白激酶来治疗肿瘤的小分子化合物：Bcr-Ab、EGFR/ErbB2、VEGFR1/VEGFR2/VEGFR3/PDGFRB/c-KIT、BcrAb1/SRC、ALK/Met、ErbB1、Syk、EGFR、BTK、ErbB1/ErbB2、VEGFR2/VEGFR2、Bcr-Abl、VEGFR2/PDGFR/c-kit、JAK、BRAF和MEK[Adams JL et al Nat Rev Drug Discov.2015Sep；14(9)：603-22]。

“多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶抑制物”：本发明提供的寡核苷酸可和多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶抑制物(poly ADP ribose polymerase，PARP)联合应用治疗肿瘤。多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶抑制物，简称PARP抑制物，是可通过抑制PARP活性治疗肿瘤的制剂。PARP抑制物包括但不限于：治疗乳腺癌和肺鳞状细胞癌的Iniparib；治疗乳腺癌的Talazoparib(BMN-673)；治疗乳腺癌、结肠癌、卵巢癌和晚期前列腺癌的Olaparib；治疗乳腺和卵巢癌的Rucaparib；治疗转移性黑色素瘤和乳腺癌的Veliparib和治疗非小细胞肺癌的CEP 9722[Nature Reviews Clinical Oncology 12，27-41，2015]。

“血管生成抑制剂”：本发明提供的寡核苷酸可和血管生成抑制剂联合应用治疗肿瘤。血管生成抑制剂是可以通过抑制血管生成治疗肿瘤的制剂[Albini A et al.Nat RevClin Oncol.2012Sep；9(9)：498-509]，包括但不限于：包括阿瓦斯丁(Avastin或bevacizumab)在内血管内皮生长因子(VEGF)的人源化单克隆抗体；包括恩度(ENDOSTAR)在内的血管内皮抑制素和包括pegaptinib在内的抗血管内皮细胞生长因子的核酸适体(aptamer)。

“溶瘤病毒”：本发明提供的寡核苷酸可和溶瘤病毒联合应用治疗肿瘤。溶瘤病毒是可以通过裂解肿瘤细胞治疗肿瘤的病毒，包括但不限于新城疫病毒、单纯疱疹病毒、腺病毒、痘病毒、克萨病毒、呼吸道肠道病毒、麻疹病毒，脊髓灰质炎病毒、滤泡性口炎病毒、塞尼卡谷病毒、细小病毒和逆转录病毒[Kaufman HL et al.Nat Rev Drug Discov.2015Sep 1；14(9)：642-62]。

“肿瘤治疗用细胞”：本发明提供的寡核苷酸可以和肿瘤治疗用细胞联合应用治疗肿瘤。肿瘤治疗用细胞是应用于个体后能行使抗肿瘤效应的细胞，这些细胞包括但不限于肿瘤细胞、树突细胞、T淋巴细胞和NK细胞。

“肿瘤细胞”：本发明提供的寡核苷酸可以和肿瘤细胞联合应用治疗肿瘤。肿瘤细胞在个体能激发抗肿瘤免疫应答，可被用作肿瘤疫苗。这类肿瘤细胞包括但不限于自体肿瘤细胞、同种异体肿瘤细胞和肿瘤细胞系细胞，也包括转染细胞因子(如GM-CSF和IL-2)编码基因和/或共刺激分子(如B7)编码基因的肿瘤细胞(Hurwitz，A.et al.(1998)Proc.Natl.Acad.Sci U.S.A.1998；95：10067-10071)。

“树突细胞”：本发明提供的寡核苷酸可以和自体树突细胞(Dendritic cells，DC)联合应用来治疗肿瘤。可提呈肿瘤抗原的树突细胞被应用于个体后可激发抗肿瘤免疫应答，这种细胞也可被用作树突细胞疫苗。肿瘤治疗用树突细胞包括但不限于装载单一的肿瘤抗原(蛋白抗原或抗原肽，如前列腺酸性磷酸酶)的树突细胞、装载肿瘤细胞裂解物的树突细胞、装载肿瘤细胞RNA的树突细胞和装载自体肿瘤细胞洗脱肽的树突细胞[Nestle，F.et al.(1998)Nature Medicine 4：328-332；Palucka K et al.Nat RevCancer.2012Mar 22；12(4)：265-77]。肿瘤治疗用树突细胞也包括基因转染树突细胞。用于转染树突细胞的基因包括但不限于肿瘤抗原编码基因、细胞因子(如IL-2，GM-CSF)编码基因和共刺激分子编码基因。肿瘤治疗用树突细胞也包括树突细胞和肿瘤细胞融合细胞(Kugler，A.et al.(2000)Nature Medicine6：332-336)。

“肿瘤治疗用T细胞”：本发明提供的寡核苷酸可以和肿瘤治疗用T细胞联合应用治疗肿瘤。肿瘤治疗用T细胞是被用于肿瘤治疗的自体T细胞，包括肿瘤浸润T细胞和经遗传改造的T细胞(Genetically engineered T cells)。经遗传改造的T细胞组装有可识别肿瘤抗原的嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor，CAR)，表达该类受体的T细胞被称为CAR-T。肿瘤浸润的T细胞和经遗传改造的T细胞可在体外用IL-2扩增后被回输到肿瘤患者体内[Kershaw MH et al.Nat Rev Cancer.2013Aug；13(8)：525-41]。

“肿瘤治疗用天然杀伤细胞”：本发明提供的寡核苷酸可以和肿瘤治疗用天然杀伤细胞[Natural killer(NK)cells]联合应用治疗肿瘤。肿瘤治疗用天然杀伤细胞也称肿瘤治疗用NK细胞。这种NK细胞可以从个体的外周血或脐带血分离，也可从造血细胞前体细胞、胚胎干细胞或多能干细胞诱导生成。分离或诱导生成的NK细胞可在体外用IL-2和IL-15扩增后回输给个体[Childs RW，et al.Nat Rev Drug Discov.2015Jul；14(7)：487-98]。

“抗感染”：本发明提供的寡核苷酸单独应用或作为疫苗佐剂应用可发挥抗感染作用。抗感染和对微生物感染产生治疗或预防作用是可以互换的术语。单独应用本发明提供的寡核苷酸产生的抗感染作用尤其适合于尚无有效疫苗的微生物引起的感染，如HIV和HCV；也适合抗原性易发生变化的病原体如HIV、HCV流感病毒和疟原虫。因为具有增强T细胞介导的免疫应答的功效，本发明提供的寡核苷酸可被用于致病性病毒、致病性细菌、致病性真菌和致病性寄生虫感染的治疗，也可被用作致病性病毒、致病性细菌、致病性真菌和致病性寄生虫疫苗的佐剂。

“致病性病毒”：本发明提供的寡核苷酸单独应用或作为疫苗佐剂应用发挥抗致病性病毒(pathogenic viruses)感染的作用。这些致病性病毒包括hepatitis(A，B，or C)，herpes virus(e.g.，VZV，HSV-1，HAV-6，HSV-II，and CMV，Epstein Barr virus)，adenovirus，influenza virus，flaviviruses，echovirus，rhinovirus，coxsackie virus，cornovirus，respiratory syncytial virus，mumps virus，rotavirus，measles virus，rubella virus，parvovirus，vaccinia virus，HTLV virus，dengue virus，papillomavirus，molluscum virus，poliovirus，rabies virus，JC virus和arboviralencephalitis virus。

“致病性细菌”：本发明提供的寡核苷酸单独应用或作为疫苗佐剂应用发挥抗致病性细菌(pathogenic bacteria)感染的作用。这些致病性细菌包括chlamydia，rickettsialbacteria，mycobacteria，staphylococci，streptococci，pneumonococci，meningococciand conococci，klebsiella，proteus，serratia，pseudomonas，legionella，diphtheria，salmonella，bacilli，cholera，tetanus，botulism，anthrax，plague，leptospirosis和Lymes disease bacteria。

“致病性真菌”：本发明提供的寡核苷酸单独应用或作为疫苗佐剂应用发挥抗致病性真菌(pathogenic fungi)感染的作用。这些致病性真菌包括Candida，Cryptococcusneoformans，Aspergillus，Genus Mucorales，Sporothrix schenkii，Blastomycesdermatitidis，Paracoccidioides brasiliensis，Coccidioides immitis和Histoplasmacapsulatum。

“致病寄生虫”：本发明提供的寡核苷酸单独应用或作为疫苗佐剂应用发挥抗致病寄生虫(pathogenic parasites)的作用。这些致病性寄生虫(pathogenic parasires)包括Entamoeba histolytica，Balantidium coli，Naegleria fowleri，Acanthamoeba sp.，Giardia lambia，Cryptosporidium sp.，Pneumocystis carinii，Plasmodium vivax，Babesia microti，Trypanosoma brucei，Trypanosoma cruzi，Leishmania donovani，Toxoplasma gondi和Nippostrongylus brasiliensis。

“药物组合物”：本发明提供的寡核苷酸药物可与药物学上可接受的载体(pharmaceutically acceptable carrier)组成药物组合物(pharmaceuticalcompositions)，该药物组合物可以包含本发明所提供的寡核苷酸。该组合物中的寡核苷酸的使用剂量为有效剂量(Effective Dosages)。该组合物可和抗原、疫苗、佐剂和具有肿瘤治疗作用的制剂或细胞联合应。该药物组合物可被制成一定的剂型，这些剂型包括但不限于溶液、乳化液、脂质体和冻干粉等。

“药物学可接受的载体”：本发明提供的寡核苷酸药物可与药物学上可接受的载体(pharmaceutically acceptable carrier)组成药物组合物(pharmaceuticalcompositions)。药物学可接受的载体(pharmaceutically acceptable carrier)是指一种或多种固体或液体的填充剂、稀释剂或包封物质。这类载体适合将本发明提供的寡核苷酸应用于个体。该载体可以是有机的、无机的，天然的或合成的。药物学可接受的载体可以是药学可接受的溶剂(水溶液和非水溶液)、分散剂、悬浊剂、乳化剂、粉剂、稀释剂、脂质体、抗菌剂、抗真菌剂、等渗制剂、延缓吸收制剂、冻干保护剂和其他的适合本发明中的核苷酸增强疫苗或抗原的免疫效力，产生治疗肿瘤作用的制剂。水溶液包括单不限于水、生理盐水、PBS缓冲液、平衡盐溶液和葡萄糖溶液。溶剂或分散剂可包括水、乙醇、多元醇(如甘油、丙二醇、聚乙二醇等，也包括由这些溶剂或分散剂组成的混合物。为了维持药物组合物的流动性可应用包括卵磷脂在内的脂类。为了使药物组合物处于理想的颗粒状态可以应用表面活性剂。为了有合适的渗透压，可在药物组合物中添加糖、包括甘露醇和山梨醇在内的多元醇和氯化钠等。为了延长作用时间，可在药物组合物中加入缓释剂如硬脂酸盐和明胶。乳化剂可包括水包油乳化剂、油包水乳化剂或水包油包水乳化剂。药物学可接受的载体也包括药学可接受的抗氧化剂(pharmaceutically-acceptable antioxidants)，这些抗氧化剂包括：水溶性抗氧化剂，如ascorbic acid，cysteine hydrochloride，sodium bisulfate，sodiummetabisulfite和sodium sulfite等；油溶性抗氧化剂，如ascorbyl palmitate，butylatedhydroxyanisole(BHA)，butylated hydroxytoluene(BHT)，lecithin，propyl gallate和alpha-tocopherol等；金属螯合剂，如枸橼酸、ethylenediamine tetraacetic acid(EDTA)、sorbitol、tartaric acid和phosphoric acid。

“有效剂量”：本发明所提供的寡核苷酸的有效剂量(Effective Dosages)包括“增强抗原免疫效力有效剂量”和“肿瘤治疗有效剂量”。增强抗原免疫效力有效剂量是给个体应用后能显著增强抗原或疫苗免疫效力的寡核苷酸剂量，也指在给予个体后可产生理想的预防或治疗传染性疾病或肿瘤的寡核苷酸剂量。肿瘤治疗有效剂量是给个体应用后能产生肿瘤治疗作用的寡核苷酸的剂量。剂量的多少决定于本领域技术熟练人员应知的标准，还要参考其他因素，这些因素包括并不限于个体的大小和健康情况和疾病的严重程度。本发明提供的寡核苷酸可单次或多次应用于个体，每次的剂量范围可在1μg到1000mg的范围。为了达到理想的效果，本领域技术熟练人员可以对此寡核苷酸的剂量作调整，其剂量范围可以是前述范围的10倍到1000倍。在给个体应用时，本发明提供的寡核苷酸可采用剂量单位。每一单位包含定量的可产生预防或治疗作用寡核苷酸和所需的药学可接受的组合物。剂量单位界定的依据是寡核苷酸产生治疗作用的特有活性特征和个体在接受该寡合甘酸治疗时对该寡核苷酸的敏感性。如果需要，以剂量单位应用的寡核苷酸每天可以按一定的时间间隔应用2次、3次、4次、5次或多次。本发明提供的寡核苷酸可以按个体单位体重(hostbody weight)应用，剂量范围是0.0001到100mg/kg，应用的间隔可以是每两周一次或每月一次或每3到6个月一次或其它适合产生预防、治疗作用的时间间隔。在和抗原或疫苗联合应用时，该寡核苷酸的剂量可以是1-1000μg/ml。有效剂量包括治疗有效剂量(therapeutically effective dose)和预防有效剂量(prophylactically-effectivedose)。

“给药途径”：本发明提供的寡核苷酸在单独应用或和其它制剂如抗原、佐剂和抗肿瘤制剂联合应用时可采用肠外、外用或吸入的给药途径。肠外给药途径包括经静脉、腹膜、鞘内、肌肉、皮下、皮内、局部、瘤旁淋巴结、肿瘤组织直接注射和淋巴结内注射。外用给药途径包括经皮肤、口、眼、耳和鼻。吸入可经鼻粘膜和肺。

“治疗装置”含本发明提供的寡核苷酸的药物组合物可用本领域技术熟练人员应知的治疗装置应用于个体。治疗装置包括但不限于无针注射装置、植入装置、仓室装置(modules)、植入性微输液泵(implantable micro-infusion pump)、输液泵和渗透药物递送系统(osmotic drug delivery system)。

“递送载体”：本发明中的寡核苷酸可经递送载体应用。递送载体包括但不限于：类固醇(如胆固醇)、络和物、乳化物、免疫刺激复合物(ISCOMs)、脂质(如阳离子脂质和阴离子脂质)、脂质体、细菌载体(如沙门氏菌、大肠杆菌、分枝杆菌志贺(氏)杆菌、乳酸杆菌)、病毒载体(如牛痘苗、腺病毒、单纯疱疹病毒)、病毒小体、病毒样颗粒、微球、核酸疫苗、高分子材料(如羧甲基纤维素、脱乙酰壳多糖)和环状多聚物。递送载体也可以是特异性受体的配体或细胞的靶向分子。

附图说明：

图-1：采用Bac-to-Bac系统表达的PCV2b衣壳蛋白的检定

图-2：寡核苷酸(A1，A2)对重组蛋白抗原再刺激诱导的CD4⁺T细胞激活的影响

图-3寡核苷酸(A1，A2)对抗原再刺激诱导的小鼠脾细胞CTLA-4mRNA表达的影响

图-4：寡核苷酸(A1，A2)对抗原再刺激诱导的CD4+T细胞CTLA-4表达的影响

图-5：采用大肠杆菌表达的PCV2b衣壳蛋白的检定

图-6寡核苷酸(A1和A2)对重组蛋白抗原再激活小鼠抗原提呈细胞CD80的影响

图-7寡核苷酸(A1和A2)对重组蛋白抗原再激活小鼠抗原提呈细胞CD86的影响

图-8寡核苷酸(A1和A2)对圆环病毒疫苗免疫效力的增强作用

图-9寡核苷酸(A1和A2)对乙型肝炎疫苗免疫效力的增强作用

图-10寡核苷酸(A1和A2)对狂犬疫苗免疫效力的增强作用

图-11寡核苷酸(A1和A2)对流感病毒疫苗免疫效力的增强作用

图-12GL261细胞胶质瘤肿瘤细胞裂解物的检定

图-13寡核苷酸(A1，A2)对黑色素瘤的治疗作用

具体实施方法：

实施例1寡核苷酸(A1，A2)的设计及合成：

根据人和小鼠CTLA-4mRNA 3’UTR的序列，设计了两种单链脱氧寡核苷酸，这两种寡核苷酸分别被命名为A1和A2，具有如序列表<400>1和<400>2所示的序列。

A1的序列是5’ttctttgggc tgtgccattc cctaa 3’(序列表<400>1)。

A2的序列是5’tttcatggaa aatattgagt taaaa 3’(序列表<400>2)。

A1和A2的序列和CTLA-4mRNA 3’UTR的序列互补。

A1和A2由宝生物工程(大连)有限公司(Takara Bio)合成，其骨架为全硫代修饰。

在应用时，A1和A2用无菌PBS或其它溶媒溶解，并经无热源处理，-20℃冻存。

含A1和A2溶液中的内毒素应用鲎变形细胞溶解法检测。

溶液中的A1和A2的含量采用分光光度计(260nm波长)确定，也可采用琼脂糖凝胶(3％)电泳估算(根据已知含量单链脱氧寡核苷酸标准品估算)。

实施例2寡核苷酸(A1，A2)对重组蛋白抗原再刺激导的CD4+T细胞激活的影响：

采用重组蛋白抗原疫苗免疫小鼠，在免疫后取小鼠脾细胞做抗原回忆反应(recall)实验，在细胞培养体系中加入抗原和寡核苷酸(A1)或寡核苷酸(A2)。培养24小时后，用流式细胞仪检测CD4⁺T细胞表面CD69分子的表达来判定A1或A2对CTLA-4功能的抑制作用。CD69是一种细胞膜糖蛋白分子，参与T细胞增生的诱导。在静息的CD4⁺T细胞表面，CD69表达的水平很低。在受到抗原激活(TCR stimulation)后，表达在CD4⁺T细胞表面的CD69迅速上调，其表达在16-24达到高峰，然后下降。CD69分子是CD4⁺T细胞早期激活的标志物(early markers)。在CD4⁺T细胞激活的早期激活，CTLA-4抑制CD4⁺T细胞表面CD69的表达[Chambers CA.et al.Annu Rev Immunol.2001；19：565-94]。

2.1免疫小鼠

2.1.1材料

2.1.1.1小鼠

ICR小鼠(吉林大学医学部动物室)，雌性，体重为17-18克。

2.1.1.2抗原

采用Bac-to-Bac系统表达的PCV2b衣壳蛋白(简称P蛋白)，此蛋白能组装成类病毒颗粒(virus like particls，VLP)。

经SDS-PAGE检测，P蛋白呈现为分子量为28KD的区带。在电镜下(4万倍放大)，P蛋白已组装成大小约为17nM的类病毒颗粒(virus like particles，VLPs，见图-1。

2.1.1.3佐剂

ISA 35乳化剂(Seppic)

2.1.2疫苗的配制

将P蛋白用PBS稀释为60μg/ml，将此P蛋白溶液和ISA 35乳化剂按1∶1(体积∶体积)混合制成疫苗，此疫苗被命名为P-ISA 35。100μl P-ISA 35中含3μg P蛋白。

2.1.3.小鼠免疫

于第0天对ICR小鼠进行初次免疫，方法是注射100μl P-ISA 35，注射部位是右后肢肌肉，单点注射。于第14天对ICR小鼠进行加强免疫，方法是注射100μl P-ISA 35，注射部位是右后肢肌肉，单点注射。

2.2.寡核苷酸(A1，A2)对P蛋白再激活诱导的P-ISA 35免疫小鼠CD4⁺T细胞激活的影响

2.2.1试剂

RPIM 1640培养基和胎牛血清(FBS)购自Gibco公司。FITC标记的抗鼠CD4抗体和PE标记的抗鼠CD69抗体购自BD公司。

P蛋白(简称P，见2.1.1.2)。

寡核苷酸(A1)[5’ttctttgggc tgtgccattc cctaa 3’(序列表<400>1)]和寡核苷酸(A2)[5’tttcatggaa aatattgagt taaaa 3’(序列表<400>2]，如实施例1所述。

2.2.2.器材和仪器

24培养板孔板、平皿、毛玻璃片、300目滤网、小镊子、细胞计数板、滴管、加样器。CO2细胞培养孵箱(日本SANYO公司)、细胞培养倒置显微镜(日本Olympus公司)、离心机(德国Biofuge Fresco)、ACEA NovoCyte流式细胞仪(美国艾森公司)。

2.2.3.实验

在用P-ISA 35加强免疫后第48天处死P-ISA 35免疫小鼠，于75％乙醇内浸泡2min，无菌取脾，将脾放入含有5mL冰浴10％FBS 1640培养基的平皿中。用毛玻璃片将脾研磨成单个细胞。用300目尼龙网过滤，收取脾细胞单细胞悬液。用红细胞裂解液ACK(0.155mol/L NH4Cl，0.01mol/L KHCO3，0.1mol/L EDTA，pH 7.4)去除其中的红细胞。用10％FBS 1640(8mL)，离心洗涤(1,200rpm 5min)，弃上清。用10％FBS 1640悬起去红细胞的脾细胞悬液。计数细胞，用10％FBS 1640调细胞浓度为5×10⁶个/ml。将细胞加入24孔培养板，每孔1ml，则每孔细胞个数为5×10⁶个。加入P蛋白(终浓度10μg/ml)，或加入P蛋白(终浓度10μg/ml)和A1(终浓度5μg/ml)，或加入P蛋白(终浓度10μg/ml)和A2(终浓度5μg/ml)。培养24小时后，收取细胞。用加样器轻吹细胞，置于1.5ml EP管中，2000rpm，离心5min。弃上清，将细胞弹匀，加入1ml PBS清洗细胞，2000rpm，离心2min。用40μl PBS重悬细胞，分别置于2个1.5EP管中，20μl/管。加FITC标记的抗鼠CD4荧光抗体，PE标记的抗鼠CD69荧光抗体。冰上，避光孵育30min。加入1ml PBS清洗细胞，2000rpm，离心2min。用200μl PBS重悬，用300目滤网过滤后，用流式细胞仪检测。

2.2.4.结果

A1或A2处理可使CD4+T淋巴细胞的CD69分子表达明显提高(图-2)，提示A1或A2可通过抑制CTLA的功能维持促进CD4+T淋巴细胞的激活，具有这一活性的A1或A2可被用于个体来增强其对微生物抗原(疫苗)、肿瘤抗原(疫苗)的免疫应答，也可被用于个体来增强其抗肿瘤反应。

实施例3寡核苷酸(A1，A2)对抗原再刺激诱导的小鼠脾细胞CTLA-4mRNA表达的抑制作用：

采用如实施例2所述P蛋白按实施例2所述免疫ICR小鼠，在免疫后取小鼠脾细胞用P蛋白做回忆反应(recall)实验，在细胞培养体系中加入寡核苷酸A1或寡核苷酸A2。培养24小时后，收取细胞，提取mRNA，做逆转录和聚合酶链式反应(PCR)，检测CTLA-4mRNA的表达。静息的T细胞几乎不表达CTLA-4mRNA，在受到激活后T细胞表达的CTLA-4mRNA水平迅速升高[Brunet JF，et al.Nature.1987Jul16-22；328(6127)：267-70]，导致T细胞表面出现更多的CTLA。

3.1材料

P蛋白(简称P，见2.1.1.2)。

寡核苷酸(A1)[5’ttctttgggc tgtgccattc cctaa 3’(序列表<400>1)]和寡核苷酸(A2)[5’tttcatggaa aatattgagt taaaa 3’(序列表<400>2]，如实施例1所述。

RPIM 1640培养基和胎牛血清(FBS)购自Gibco公司。

TRIzol试剂购自美国Invitrogen公司。EasyScript First-Strand cDNASynthesis SuperMix、Top Green qPCR SuperMix(TransStartTM)试剂盒购自全式金(Transgen)公司；

GAPDH特异性引物(用于扩增GAPDH特异性cDNA，GAPDH为管家基因)，上游引物的序列是：5’-ATCACCATCTTCCAGGAGCGA-3’，下游引物的序列是5’-TCTCGTGGTTCACACCCATCA-3’。

CTLA4特异性引物(用于扩增CTLA4特异性cDNA)，上游引物的序列为：5’-CCCAGTCTTCTCTGAAGCCATA-3’，下游引物的序列为：5’-TCTCTGTGAATGTCGTGGCA-3’。

GAPDH特异性引物和CTLA4特异性引物均由宝生物工程(大连)有限公司(TakaraBio)合成。

3.2小鼠

为P-ISA 35免疫ICR小鼠(见2.1.3)。

3.3.主要实验器材和仪器

24孔培养板、平皿、毛玻璃片、300目滤网、小镊子、细胞计数板、滴管、加样器。CO₂细胞培养孵箱(日本SANYO公司)、细胞培养倒置显微镜(日本Olympus公司)、离心机(德国Biofuge Fresco)、荧光定量PCR仪(美国Applied Biosystems，型号：ABI Prism 7300)。

3.4实验

牺牲P-ISA 35加强免疫ICR小鼠，于75％乙醇内浸泡2min，无菌取脾，将脾放入含有5mL冰浴10％FBS 1640培养基的平皿中。用毛玻璃片将脾研磨成单个细胞。用300目尼龙网过滤，收取脾细胞单细胞悬液。用红细胞裂解液ACK(0.155mol/L NH4Cl，0.01mol/LKHCO3，0.1mol/L EDTA，pH 7.4)去除其中的红细胞。用10％FBS 1640(8mL)，离心洗涤(1,200rpm 5min)，弃上清。用10％FBS 1640悬起去红细胞的脾细胞悬液。计数细胞，用10％FBS1640调细胞浓度为5×10⁶个/ml。将细胞加入24孔培养板，每孔1ml，则每孔细胞个数为5×10⁶个。加入P蛋白(终浓度10μg/ml)，或加入P蛋白(终浓度10μg/ml)和A1(终浓度10μg/ml)，或加入P蛋白(终浓度10μg/ml)和A2(终浓度10μg/ml)。培养24小时后，收取细胞。用Trizol法提取总RNA。采用EasyScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix、Top GreenqPCR SuperMix(TransStartTM)试剂盒，以GAPDH特异性引物和CTLA4特异性引物做qPCR分别扩增GAPDH特异性cDNA和CTLA4特异性cDNA。上荧光定量PCR仪(ABI Pri sm 7300)做荧光定量PCR分析。

3.5.结果：

A1和A2抑制P蛋白再刺激诱导的小鼠免疫细胞CTLA-4mRNA的表达(图-3)和行使其功能。这说明，A1和A2可抑制CTLA-4mRNA的表达和抑制其行使其功能，因而促进、维持T细胞的激活。该结果说明，具抑制P蛋白再刺激诱导的小鼠免疫细胞CTLA-4mRNA的表达和行使其功能的A1或A2可被用于个体来增强其对微生物抗原(疫苗)、肿瘤抗原(疫苗)的免疫应答，也可被用于个体来增强其抗肿瘤反应。

实施例4寡核苷酸(A1，A2)对抗原再刺激诱导的CD4⁺T细胞CTLA-4表达的抑制作用：

采用如实施例2所述P蛋白按实施例2所述免疫ICR小鼠，在免疫后取小鼠脾细胞用P蛋白做回忆反应(recall)实验，在细胞培养体系中加入寡核苷酸A1或寡核苷酸A2。培养48小时后，收取细胞，用荧光标记CTLA-4抗体染细胞做流式分析。CTLA-4是对T细胞有负调节作用的膜信号分子。在TCR激活(T cell receptor activation)(识别抗原肽的激活)后，T细胞迅速表达CTLA-4[Sakaguchi S，et al.Science.2011Apr 29；332(6029)：542-3]。CD4⁺和CD8⁺T细胞表达CTLA-4。和CD8⁺T细胞相比，CD4⁺T细胞可表达更高水平的CTLA-4。抑制CTLA-4表达可促进、维持T细胞激活增生。在这种情况下，CD4⁺T细胞比CD8+T细胞激活增生的更明显[Chan DV，et al.Genes Immun.2014Jan；15(1)：25-32]。

4.1材料

P蛋白(简称P，见2.1.1.2)。

寡核苷酸(A1)[5’ttctttgggc tgtgccattc cctaa 3’(序列表<400>1)]和寡核苷酸(A2)[5’tttcatggaa aatattgagt taaaa 3’(序列表<400>2]，如实施例1所述。

RPIM 1640培养基和胎牛血清(FBS)购自Gibco公司。

FITC标记的抗鼠CD4抗体和PE标记的抗鼠CTLA4抗体购自BD公司。

4.2小鼠

为P-ISA 35免疫ICR小鼠(见2.1.3)。

4.3.主要实验器材

24孔培养板、平皿、毛玻璃片、300目滤网、小镊子、细胞计数板、滴管、加样器。CO2细胞培养孵箱(日本SANYO公司)、细胞培养倒置显微镜(日本Olympus公司)、离心机(德国Biofuge Fresco)、ACEA NovoCyte流式细胞仪(美国艾森公司)。

4.4实验

牺牲P-ISA 35加强免疫ICR小鼠，按3.4所述的方法获得小鼠脾细胞悬液。计数细胞，用10％FBS 1640培养基调细胞浓度为5×10⁶个/ml。将细胞加入24孔培养板，每孔1ml。加入P蛋白(终浓度10μg/ml)，或加入P蛋白(终浓度10μg/ml)和A1(终浓度10μg/ml)，或加入P蛋白(终浓度10μg/ml)和A2(终浓度10μg/ml)。培养48小时后，收取细胞。用加样器轻吹细胞，置于1.5ml EP管中，2000rpm，离心5min。弃上清，将细胞弹匀，加入1ml PBS清洗细胞，2000rpm，离心2min。用40μl PBS重悬细胞，分别置于2个1.5EP管中，20μl/管。加FITC标记的抗鼠CD4荧光抗体，加PE标记的抗鼠CTLA4荧光抗体，冰上，避光孵育30min。加入1ml PBS清洗细胞，2000rpm，离心2min。用200μl PBS重悬，用300目滤网过滤后，用流式细胞仪检测。

4.5结果

A1能抑制P蛋白再刺激诱导的小鼠CD4⁺T细胞表达CTLA4(图-4)。这说明，A1可抑制CTLA-4的表达，因而促进、维持T细胞的激活；具有这一活性的A1可被用于个体来增强其对微生物抗原(疫苗)、肿瘤抗原(疫苗)的免疫应答，也可被用于个体来增强其抗肿瘤反应。

实施例5寡核苷酸(A1和A2)对重组蛋白抗原再刺激小鼠抗原提呈细胞CD80和CD86的影响：

抗原激活的T细胞表达CTLA-4，这种CTLA-4分子能结合抗原提呈细胞表面的CD80或CD86分子并将其内化，使抗原提呈细胞缺少这两种共刺激分子。缺少共刺激分子的抗原提呈细胞不能通过结合CD28向T细胞提供第二激活信号，因此限制T细胞的激活[SakaguchiS et al.Science.2011Apr29；332(6029)：542-3]。调节性T细胞(Treg)表达的CTLA-4也能和抗原提呈细胞表面的CD80或CD86分子结合并将其内化，因而使T细胞处于免疫耐受状态[Sansom DM.Science.2015Jul 24；349(6246)：377-8]。因此，A1和A2使抗原提呈细胞表面的CD80或CD86减少是CTLA-4表达受到抑制的一种反应。

5.1免疫小鼠

5.1.1材料

5.1.1.1小鼠

ICR小鼠(吉林大学医学部动物室)，雌性，体重为17-18克。

5.1.1.2抗原

采用大肠杆菌表达的PCV2b衣壳蛋白(简称D蛋白)，此蛋白能组装成类病毒颗粒(virus like particls，VLP)。

在SDS-PAGE检测，D蛋白(D)被显示为分子量为28KD的区带，在电镜下观察(4万倍放大)，D蛋白形成典型的大小约为17nM的VLP，见图-5。

5.1.1.3佐剂

ISA 35乳化剂(Seppic)

5.1.2疫苗的配制

将D蛋白用PBS稀释为100μg/ml，将此D蛋白溶液和ISA 35乳化剂按1∶1(体积∶体积)混合制成疫苗，此疫苗被命名为D-ISA 35。100μl D-ISA 35中含5μg D蛋白。

5.1.3小鼠免疫

于第0天对ICR小鼠进行初次免疫，方法是注射100μl D-ISA 35，注射部位是右后肢肌肉，单点注射。于第14天按初次免疫的抗原和方法对ICR小鼠进行加强免疫。

5.2寡核苷酸(A1，A2)对D蛋白再激活抗原提呈细胞表达的CD80和CD86的影响

5.2.1试剂

RPIM 1640培养基和胎牛血清(FBS)购自Gibco公司。FITC标记的抗鼠CD4抗体，PE标记的抗鼠CD80抗体和PE标记的抗鼠86抗体均购自BD公司。

D蛋白(见5.1.1.2)，也用D表示。

寡核苷酸(A1)[5’ttctttgggc tgtgccattc cctaa 3’(序列表<400>1)]和寡核苷酸(A2)[5’tttcatggaa aatattgagt taaaa 3’(序列表<400>2]，如实施例1所述。

5.2.2.器材和仪器

24孔培养板、平皿、毛玻璃片、300目滤网、小镊子、细胞计数板、滴管、加样器。CO2细胞培养孵箱(日本SANYO公司)、细胞培养倒置显微镜(日本Olympus公司)、离心机(德国Biofuge Fresco)、ACEA NovoCyte流式细胞仪(美国艾森公司)。

5.2.3.实验

在加强免疫后第48天牺牲D-ISA 35免疫小鼠，按3.4所述的方法获得小鼠脾细胞悬液。计数细胞，用10％FBS 1640调细胞浓度为5×10⁶个/ml。将细胞加入24孔培养板，每孔1ml。加入D蛋白(终浓度10μg/ml)，或加入D蛋白(终浓度10μg/ml)和A1(终浓度5μg/ml)，或加入D蛋白(终浓度5μg/ml)和A2(终浓度5μg/ml)。培养24小时后，收取细胞。用加样器轻吹细胞，置于1.5ml EP管中，2000rpm，离心5min。弃上清，将细胞弹匀，加入1ml PBS清洗细胞，2000rpm，离心2min。用40μl PBS重悬细胞，分别置于2个1.5EP管中，20μl/管。加FITC标记的抗鼠CD11c抗体，PE标记的抗鼠CD80抗体或PE标记的抗鼠CD86抗体。冰上，避光孵育30min。加入1ml PBS清洗细胞，2000rpm，离心2min。用200μl PBS重悬，用300目滤网过滤后，用流式细胞仪检测。

5.2.4.结果

A1或A2处理可使CD11c细胞CD80(图-6)和CD86(图-7)增多。这说明，应用A1或A2可通过抑制CTLA使抗原提呈细胞表面的共刺激分子增多，因而通过提供第二激活信号促进微生物抗原和肿瘤抗原激活T淋巴细胞。具有这一活性的A1或A2可被用于个体来增强其对微生物抗原(疫苗)、肿瘤抗原(疫苗)的免疫应答，也可被用于个体来增强其抗肿瘤反应。

实施例6寡核苷酸(A1和A2)对重组蛋白疫苗(圆环病毒疫苗)免疫效力的增强作用：

6.1免疫小鼠及采集血清

6.1.1材料

6.1.1.1小鼠

ICR小鼠(吉林大学医学部动物室)，雌性，体重为17-18克。

6.1.1.2抗原

D蛋白(D)，如实施例5中5.1.2所述。

6.1.1.3佐剂

ISA 35乳化剂(Seppic)

6.1.1.4寡核苷酸

寡核苷酸(A1)[5’ttctttgggc tgtgccattc cctaa 3’(序列表<400>1)]和寡核苷酸(A2)[5’tttcatggaa aatattgagt taaaa 3’(序列表<400>2]，如实施例1所述。

6.1.2疫苗的配制

将D蛋白的浓度用D蛋白组装液调节为600μg/ml，将此D蛋白溶液和ISA 35乳化剂按1∶1(体积∶体积)混合制成疫苗，此疫苗被命名为D-ISA 35。100μl D-ISA 35中含30μg D蛋白。分别配制含A1和A2的D-ISA 35，分别被称为D-ISA 35A1和D-ISA 35A2。每100μl D-ISA 35A1或D-ISA 35A2中的D蛋白为30μg，A1和A2均为5μg。

6.1.3免疫前采血

在初次免疫前一天采集待免疫小鼠血清。小鼠尾静脉采血，采血量≥100μl。将采集的全血(1.5mlEP管中)室温放置30分钟。11000rpm离心15分钟，收集血清，分装，-20℃保存。

6.1.4小鼠免疫

于第0天对ICR小鼠进行初次免疫，方法是注射100μl D-ISA 35或D-ISA 35A1或D-ISA 35A2，注射部位是右后肢肌肉，单点注射。于第14天对ICR小鼠进行加强免疫，方法同初次免疫。

6.1.5.免疫后采血

在二次免疫后7天和14天，采集免疫小鼠血清。方法如免疫前采血(6.1.3)。

6.2.小鼠血清特异性抗体检测

采用ELISA方法检测小鼠血清中的圆环病毒(PCV2b)特异性抗体。

6.2.1材料

6.2.1.1灭活圆环病毒(PCV2b)(天津瑞普生物技术股份有限公司，TCID50/ml＝7.0)。

6.2.1.2试验器材

酶标条(组合式酶标板)，0.5mlEP管，1.5mlEP管，加样器头，移液器，多道移液器，平皿(直径9cm)，刻度玻璃瓶。

6.2.1.3试剂

碳酸钠(国药集团化学试剂有限公司)，NaCl(国药集团化学试剂有限公司)，KCl(北京化工厂)，Na₂HPO₄·12H₂O(国药集团化学试剂有限公司)，KH₂PO₄(天津市永大化学试剂开发中心)，吐温20(天津市光复精细化工研究所)，脱脂奶粉(Biotopped)，柠檬酸(国药集团化学试剂有限公司)，OPD(上海三浦化工有限公司)，30％H2O2(北京化工厂)，浓硫酸(北京化工厂)和戊二醛(天津市福晨化学试剂厂)。

6.2.1.4液体

包被液(25％戊二醛PBS)，PBS(7.3mol/L NaCl，3mmol/L KCl，10mmol/L Na₂HPO₄·12H₂O和17.6mmol/L KH₂PO4水溶液)，洗涤液(0.05％吐温20的PBS)，封闭液(5％脱脂奶粉的洗涤液)，0.1Mol/L柠檬酸水溶液，0.2Mol/L Na₂HPO₄.12H₂O水溶液，10×甲乙液[0.1Mol/L柠檬酸水溶液(体积)：0.2Mol/L Na₂HPO₄.12H₂O水溶液(体积)＝94.5∶100]，底物缓冲液[含OPD(1μg/ml)和0.045％H2O2的甲乙液]和终止液(20％浓硫酸)。

6.2.2实验

用灭活PCV2b在包被液中包被酶标条，100μl/孔，4℃过夜。甩干液体，用封闭液于37℃封闭2小时，200μl/孔。加待测血清，37℃，1小时。甩干液体，加洗涤液(300μl/孔)，室温3min，甩干液体，重复洗涤两次。加HRP标记二抗(羊抗小鼠)IgG(用洗涤液做1∶5000稀释)。100μl/孔，37℃ 1小时。甩干液体，用洗涤液洗涤，300μl/孔，室温3min，甩干液体，重复洗涤两次。加入底物液，100μl/孔，室温避光(包锡纸)显色15min。加终止液(稀硫酸2mmol/L，50μl/孔。用酶标仪(波长549nm)检测。

6.2.3结果

A1或A2可增强重组蛋白疫苗(圆环病毒疫苗)的免疫效力(图-8)。这说明A1或A2可被用于个体来增强其对微生物抗原(疫苗)的免疫应答而成为一种新型微生物抗原或微生物疫苗的佐剂。

实施例7寡核苷酸(A1和A2)对乙型肝炎疫苗免疫效力的增强作用：

7.1免疫小鼠及采集血清

7.1.1材料

7.1.1.1小鼠

Balb/c小鼠，雌性，体重为17-18g，购自北京维通利华实验动物有限公司。

7.1.1.2疫苗

采用铝佐剂配制的乙型肝炎表面抗原(HBsAg)疫苗(沃森生物技术有限公司)，简称HBsAg疫苗或HBsAg。

7.1.1.3寡核苷酸

寡核苷酸(A1)[5’ttctttgggc tgtgccattc cctaa 3’(序列表<400>1)]和寡核苷酸(A2)[5’tttcatggaa aatattgagt taaaa 3’(序列表<400>2]，如实施例1所述。

7.1.1.4含寡核苷酸疫苗的配制

在HBsAg疫苗中加入A1或A2配成含寡核苷酸HBsAg疫苗，分别被命名为HBsAg-A1和HBsAg-A2。每100μl HBsAg-A1和HBsAg-A2中的HBsAg为1μg，A1和A2均为5μg。

7.2.免疫前采血

在初次免疫前一天采集待免疫小鼠血清。方法如实施例6的6.1.3所述。

7.3.小鼠免疫

于第0天对Balb/c小鼠进行初次免疫，方法是注射100μl HBsAg疫苗或HBsAg-A1或HBsAg-A2。注射部位是右后肢肌肉，单点注射。于第14天对Balb/c小鼠进行加强免疫，方法同初次免疫。

7.4.免疫后采血

在二次免疫后7天和14天，采集免疫小鼠血清。方法如实施例6的6.1.3所述。

7.5.免疫小鼠血清特异性抗体检测

采用ELISA方法检测小鼠血清中的乙型肝炎表面抗原(HBsAg)特异性抗体。

7.5.1材料

7.5.1.1重组乙型肝炎表面抗原(HBsAg)(沃森生物技术有限公司)，简称HBsAg。

7.5.1.2试验器材

同实施例6。

7.5.1.3试剂

同实施例6。

7.5.1.4液体

同实施例6。

7.5.2试验方法

用HBsAg在包被液中包被酶标条，100μl/孔(每孔HBsAg为0.1μg)，4℃过夜。余下操作步骤同实施例6。

7.5.3结果

A1或A2可增强重组蛋白疫苗(乙型肝炎病毒疫苗)的免疫效力(图-9)。这说明，A1或A2可被用于个体来增强其对微生物抗原(疫苗)的免疫应答而成为一种新型微生物抗原或微生物疫苗的佐剂。

实施例8寡核苷酸(A1和A2)对狂犬疫苗免疫效力的增强作用：

8.1免疫小鼠及采集血清

8.1.1材料

8.1.1.1小鼠

ICR/c小鼠，体重18-22克，来自吉林大学医学部动物室。

8.1.1.2疫苗

狂犬疫苗(长春生物制品研究所)。

8.1.1.3寡核苷酸

寡核苷酸(A1)[5’ttctttgggc tgtgccattc cctaa 3’(序列表<400>1)]和寡核苷酸(A2)[5’tttcatggaa aatattgagt taaaa 3’(序列表<400>2]，如实施例1所述。

8.1.1.4含寡核苷酸狂犬疫苗的配制

在狂犬疫苗中加入A1或A2配成含寡核苷酸狂犬疫苗，分别被命名为狂犬疫苗-A1和狂犬疫苗-A2。每500μl含寡核苷酸疫苗含A1和A2 10μg。

8.1.2免疫前采血

在初次免疫前两天采集待免疫小鼠血清，方法如实施例6的6.1.3所述。

8.1.3.免疫小鼠

于第0天、3天、7天、14天、28天经小鼠腹腔注射0.5ml疫苗(狂犬疫苗或狂犬疫苗-A1或狂犬疫苗-A2)，每组8只小鼠，雌雄各半。

8.1.5免疫前采血

于第35天采集免疫小鼠血清，方法如实施例6的6.1.3所述。

8.2血清狂犬病毒中和抗体检测

采用快速狂犬疫苗荧光灶抑制实验(RFFIT)方法检小鼠血清中狂犬疫病毒中和抗体。

8.3.结果

A1或A2可增强灭活病毒疫苗(狂犬疫苗)的免疫效力(图-10)。这说明，应A1或A2可被用于个体来增强其对微生物抗原(疫苗)的免疫应答而成为一种新型微生物抗原或微生物疫苗的佐剂。

实施例9寡核苷酸(A1和A2)对流感病毒疫苗免疫效力的增强作用：

9.1免疫小鼠及采集血清

9.1.1材料

9.1.1.1小鼠

Balb/c小鼠(吉林大学实验动物中心)。雌性，体重为18克左右。

9.1.1.2疫苗

禽流感病毒H5亚型二价灭活疫苗(H5N1，Re-1株+Re-4株)(哈尔滨维科生物技术开发公司)，此疫苗被简称为H5疫苗。

9.1.1.3寡核苷酸

寡核苷酸(A1)[5’ttctttgggc tgtgccattc cctaa 3’(序列表<400>1)]和寡核苷酸(A2)[5’tttcatggaa aatattgagt taaaa 3’(序列表<400>2]，如实施例1所述。

9.1.1.4含寡核苷酸疫苗

在H5疫苗中加入A1或A2配成含寡核苷酸H5疫苗，分别被命名为H5疫苗-A1和H5疫苗-A2。每100μl H5疫苗-A1和H5疫苗-A2中的A1和A2均为10μg。

9.2.免疫及采血

免疫两次，初次免疫后22天加强免疫一次。采用后腿肌肉注射，注射疫苗的体积为100μl。在初次免疫的-2和29天经尾静脉采血，50μl/只。采集的血液在37℃环境放置30分钟，4℃放置3小时后使其血清充分析出，4000r/m离心10分钟，吸出血清，1∶400倍稀释后用于ELISA检测。

9.3.免疫小鼠血清特异性抗体检测

采用ELISA方法检测小鼠血清中的流感病毒特异性抗体。用提取自禽流感病毒H5亚型二价灭活疫苗的抗原作为包被抗原(见下述)用包被液(Na2CO31.59g，NaHCO3 2.93g，pH 9.6，定容至1L)1∶2稀释，用100μl/孔包被酶标板，密封，4℃过夜；用洗涤液(含0.05％Tween-20的PBS)洗涤酶标板，300μl/孔，洗3次；加入封闭液(含5％FBS的PBS)，200μl/孔，37℃ 2小时；用PBS稀释小鼠血清(1∶400稀释)，将稀释血清加入酶标板，100μl/孔加入，37℃放置1小时；用洗涤液洗涤3次，然后加辣根过氧化酶标记羊抗小鼠二抗(用封闭液1∶1000稀释)，100μl/孔，37℃放置1小时；用洗涤液洗涤3次，加入即配即用底物液(10mL中柠檬酸0.01M，Na2HPO4 0.02M，超纯水9mL，30％H2O2 15μl，OPD 4mg)，100μL/孔，室温避光显色20分钟；加入终止液(20％硫酸)，50μl/孔；于A492测各孔的OD值。

注：从禽流感病毒H5亚型二价灭活疫苗提取包被抗原。此疫苗采用的是油包水型佐剂，冷冻以及高速离心都可以使其破乳、分层。将此疫苗于-70℃/室温冻融2次，11000r/m离心20分钟，分离下层水相，室温融化后11000r/m离心，可见清晰分层，上层为白色乳糜状(油相)，下层清澈透明(水相)。用Bradford方法检测，上层不含蛋白，下层含有蛋白。下层水相即为含H5流感病毒抗原的包被液。

9.4.结果

A1或A2可增强病毒疫苗(流感病毒疫苗)的免疫效力(图-11)。这说明，A1或A2可被用于个体来增强其对微生物抗原(疫苗)的免疫应答而成为一种新型微生物抗原或微生物疫苗的佐剂。

实施例10、寡核苷酸(A1，A2)对胶质瘤细胞裂解物疫苗的增效作用：

10.1材料

10.1.1小鼠

C57BL/6小鼠，购自北京维通利华实验动物有限公司。

10.1.2 GL261细胞

GL261细胞是C57BL/6小鼠来源的胶质瘤细胞，来自北京军事研究院野战血研所

10.1.3佐剂

ISA 35乳化剂(Seppic，Cedex，Paris，France)

10.1.4寡核苷酸

寡核苷酸(A1)[5’ttctttgggc tgtgccattc cctaa 3’(序列表<400>1)]和寡核苷酸(A2)[5’tttcatggaa aatattgagt taaaa 3’(序列表<400>2]，如实施例1所述。

10.2.GL261细胞胶质瘤肿瘤细胞裂解物的制备

采用含10％(v/v)胎牛血清，100IU青霉素/ml和100IU的链霉素/ml的RPIM 1640培养基(Gibco)，在37℃，5％CO₂条件下培养培养GL261细胞。将1ml生长状态良好的GL261细胞(1×10⁷/ml)接种于健康C57BL/6小鼠的腹腔。待小鼠腹部膨隆后，处死小鼠，置于75％乙醇浸泡2-3min消毒。在超净台中打开小鼠腹腔，可见形成的GL261细胞实体瘤(图-12)。按无菌操作取出GL261细胞实体瘤组织。将其在取无菌平皿中用手术剪成组织小块，用生理盐水反复冲洗去除肿瘤组织和残留的血液。将洗净的组织块在组织研磨器中反复研磨，收集研磨液。将研磨液置于液氮和室温反复冻融5次。2000rmp离心10min后收集上清。此上清为GL261细胞胶质瘤肿瘤细胞裂解物(GTL)。用Bradford法对GTL进行蛋白含量测定。用SDS-PAGE对GTL做进一步的分析(图-12)。将CTL置-80℃冰箱保存。

10.3GTL疫苗及含寡核苷酸GTL疫苗的制备

用PBS将GTL的蛋白浓度调节为4mg/ml。将此GTL和ISA 35乳化剂按1∶1(体积∶体积)混合制成疫苗，此疫苗被命名为GTL疫苗。在GTL疫苗中加入A1或A2配制的含A1或A2的GTL疫苗，这两种疫苗分别被称为GTL-A1疫苗和GTL-21-A2疫苗，其中A1和A2的浓度均为10μg/100μl。

10.4小鼠免疫

于第0天和第14天在小鼠小鼠前肢左右腋窝下分别注射100μl GTL疫苗或GTL-A1疫苗或GTL-21-A2疫苗。

10.5接种胶质瘤细胞

在第21天，注射1×10⁴GL261细胞到小鼠颅内，注射体积为2μl，使小鼠发生胶质瘤，方法如文献(Prins RM，et al.Cancer Res.2003Dec 1；63(23)：8487-91)所述。自接种肿瘤后开始观察并记录小鼠的生存期，在小鼠死亡后做尸解确认小鼠颅内发生了胶质瘤。

10.6结果(见表-1)

表-1、寡核苷酸(A1，A2)对胶质瘤肿瘤细胞裂解物疫苗的增效作用

结果表明，A1或A2可增强胶质瘤肿瘤细胞裂解物(肿瘤抗原疫苗)的免疫效力(表-1)，是荷瘤小鼠的生存期延长(p＜0.05)。这说明，A1或A2可被用于个体来增强其对肿瘤抗原(疫苗)的免疫应答而成为一种新型肿瘤疫苗的佐剂。

实施例11、寡核苷酸(A1，A2)对肺癌细胞裂解物疫苗的增效作用：

11.1材料

11.1.1小鼠

C57BL/6雄性小鼠(北京维通利华实验动物技术有限公司)，6周龄。

11.1.2Lewis肺癌细胞

Lewis肺癌(Lewis lung carcinoma，LLC)细胞(源自美国ATCC)。在37℃，5％CO₂的条件下培养。使用的培养基为含10％(v/v)灭活的胎牛血清，100IU青霉素/ml和100IU的链霉素/ml的IMDM培养基。

11.1.3佐剂

ISA 35乳化剂(Seppic，Cedex，Paris，France)。

11.1.4寡核苷酸

寡核苷酸(A1)[5’ttctttgggc tgtgccattc cctaa 3’(序列表<400>1)]和寡核苷酸(A2)[5’tttcatggaa aatattgagt taaaa 3’(序列表<400>2]，如实施例1所述。

11.2.Lewis肺癌细胞(LLC)细胞裂解物的制备

将体外传代培养的LLC细胞(1×10⁶/0.1ml)接种于C57BL/6J雄性小鼠背部皮下长成实体肿瘤。牺牲小鼠，取出肿瘤，按实施例10所述的方法制备、鉴定和保存LLC细胞裂解物(LTL)。每100μl LTL由2×10⁶LLC细胞制成。

11.3LTL疫苗及含寡核苷酸LTL疫苗的制备

将制备的GTL和ISA 35乳化剂按1∶1(体积∶体积)混合制成疫苗，此疫苗被命名为LTL疫苗。在LTL疫苗中加入A1或A2配制的含A1或A2的LTL疫苗，这两种疫苗分别被称为LTL-A1疫苗和LTL-A2疫苗，其中A1和A2的浓度均为10μg/100μl。

11.4小鼠免疫

于第0天和第14天在6周龄C57BL/6J雄性小鼠，右侧背部皮下注射100μl LTL疫苗或LTL-A1疫苗或LTL-A2疫苗。每组8只小鼠。

11.5接种Lewis肺癌(LLC)细胞

于第21天，小鼠左侧背部皮下注射100μl LLC细胞悬液。LLC细胞悬液的制备方法是：将体外传代培养的LLC细胞(1×10⁷/100μl)接种于C57BL/6J雄性小鼠背部皮下长成实体肿瘤。牺牲小鼠，按无菌操作方法取出肿瘤组织，将其用0.25％胰蛋白酶-0.04％EDTA消化30min，制成单细胞悬液。在PBS中调细胞浓度为每1×10⁶/100μl。在接种肿瘤后的第18天牺牲小鼠，剖出瘤块，称其重量。

11.6结果(见表-2)

表-2、寡核苷酸(A1，A2)对Lewis肺癌细胞裂解物疫苗的增效作用

   

结果表明，A1或A2可增强肺癌肿瘤细胞裂解物(肿瘤抗原疫苗)的免疫效力(表-2)，使肿瘤缩小(p＜0.05)。这说明，A1或A2可被用于个体来增强其对肿瘤抗原(疫苗)的免疫应答而成为一种新型肿瘤疫苗的佐剂。

实施例12寡核苷酸(A1，A2)对黑色素瘤的治疗作用：

12.1材料

12.1.1小鼠

C57BL/6雌性小鼠(北京维通利华实验动物技术有限公司)，18-22g。

12.1.2B16细胞

B16细胞是C57BL/6小鼠来源的黑色素瘤细胞(源自美国ATCC)。在37℃，5％CO₂的条件下培养。使用的培养基为含10％胎牛血清，100IU青霉素/ml和100IU的链霉素/ml的RPMI1640培养基(GIBCO)。

12.1.3寡核苷酸

寡核苷酸(A1)[5’ttctttgggc tgtgccattc cctaa 3’(序列表<400>1)]和寡核苷酸(A2)[5’tttcatggaa aatattgagt taaaa 3’(序列表<400>2]，如实施例1所述。

12.2主要实验器材和仪器

100ml细胞培养瓶、1ml注射器、细胞计数板。CO₂细胞培养孵箱(日本SANYO公司)、细胞培养倒置显微镜(日本Olympus公司)、离心机(德国Biofuge Fresco)。

12.3实验

将体外培养的B16细胞于第0天接种于小鼠左后肢背侧皮下，注射体积为200μl，其中含1X10⁶B16细胞。于接种B16细胞后的第10天开始给小鼠注射A1，然后每个两天再注射一次，共注射6次(图-13)。注射部位为左后肢接种肿瘤淋巴结引流区皮下。每次的注射体积为100μl，其中含25μg A1。对照组小鼠按同样的程序注射PBS。观察并记录小鼠的生存时间。

12.4结果

单独应用A1可在小鼠发挥抗黑色素瘤的作用(图-13)，使荷瘤小鼠生存期延长。这说明，A1或A2可被用于个体来治疗包括黑色素瘤在内的肿瘤而成为一种新型的抗肿瘤制剂。

Claims (9)

1.如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示序列的骨架经全硫代修饰的单链脱氧寡核苷酸。

2.权利要求1所述的单链脱氧寡核苷酸在制备增强圆环病毒疫苗免疫效力的药物中的应用。

3.权利要求1所述的单链脱氧寡核苷酸在制备增强乙型肝炎病毒疫苗免疫效力的药物中的应用。

4.权利要求1所述的单链脱氧寡核苷酸在制备增强狂犬病毒疫苗免疫效力的药物中的应用。

5.权利要求1所述的单链脱氧寡核苷酸在制备增强流感病毒疫苗免疫效力的药物中的应用。

6.权利要求1所述的单链脱氧寡核苷酸在制备增强脑胶质瘤肿瘤抗原疫苗免疫效力的药物中的应用。

7.权利要求1所述的单链脱氧寡核苷酸在制备增强肺癌肿瘤抗原疫苗免疫效力的药物中的应用。

8.权利要求1所述的单链脱氧寡核苷酸在制备治疗黑色素瘤的药物中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，所述的药物还包括药物学可接受的载体。

Images