CN101148467A - 一种寡核苷酸及其治疗肺癌的用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及5’CGTCGTTCG3’的寡核苷酸及其功能性类似物及应用该寡核苷酸或其功能性类似物治疗肺癌的用途。

Description

一种寡核苷酸及其治疗肺癌的用途

技术领域：

这个发明提供了含5’CGTCGTTCG3’寡核苷酸或及其功能性类似物，以及应用该寡核苷酸或其功能性类似物治疗肺癌的用途。

背景技术

肺癌是严重威胁人类健康的恶性肿瘤。肺癌可被分为两种基本的类型：小细胞性肺癌(small cell lungcancer，SCLC)和非小细胞性肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)。小细胞性肺癌也被称为燕麦细胞癌(oat cell cancer)。小细胞性肺癌约占所有肺癌的20％，非小细胞性肺癌约占所有肺癌的80％。非小细胞性肺癌又可被分为腺癌(Adenocarcinoma)，鳞状细胞癌(Squamous cell type)和大细胞癌。腺癌约占所有肺癌的40％，鳞状细胞癌约占所有肺癌的30％，大细胞癌约占所有肺癌的10％。肺癌的治疗方法有手术治疗，放射治疗和化学药物治疗(化疗)和采用其它“抗肿瘤制剂”所进行的治疗(Harold Varmus.The New Era in Cancer Research，Science，2006，Vol，312：1162-1165)。

本发明提供了含5’CGTCGTTCG3’寡核苷酸或其功能性类似物，以及应用该寡核苷酸或其功能性类似物用于治疗肺癌的用途。本发明提供的含5’CGTCGTTCG 3’寡核苷酸或其功能性类似物含5’CGTCGTTCG3’序列。本发明提供的含5’CGTCGTTCG3’寡核苷酸或其功能性类似物可以含有1个，2个或2个以上的5’CGTCGTTCG3’序列。本发明提供的含5’CGTCGTTCG3’寡核苷酸或其功能性类似物可以刺激人外周血单个核细胞的增生，刺激人外周血单个核细胞产生抗病毒物质。本发明提供的含5’CGTCGTTCG3’寡核苷酸或其功能性类似物可以抑制肺癌细胞的生长。本发明提供的含5’CGTCGTTCG3’寡核苷酸或其功能性类似物可以通抑制肺癌细胞生长的方式治疗肺癌，也可通过增强免疫反应的方式发挥抗肺癌的作用。

发明内容

1、本发明提供了提供了含5’CGTCGTTCG3’寡核苷酸，该核苷酸可以被化学修饰，此修饰包括但不限于磷酸骨架修饰，如部分地或全部地磷硫酰或二硫代磷酸酯修饰。经化学修饰的该由本发明提供的寡核苷酸是相对应的寡核苷酸的功能性类似物。

2、本发明提供了应用含5’CGTCGTTCG3’寡核苷酸或其功能性类似物可用于治疗肺癌的用途。

3、本发明提供的含5’CGTCGTTCG3’寡核苷酸或其功能性类似物可增强免疫反应。

4、在应用本发明提供的含5’CGTCGTTCG3’寡核苷酸或其功能性类似物在治疗肺癌时，可将该寡核苷酸或其功能性类似物用药物性载体承载后应用。本发明提供的寡核苷酸或其功能性类似物可经肠道、非肠道(如皮下注射、肌肉注射和静脉注射等)、局部和呼吸道途径应用。

5、本发明提供的含5’CGTCGTTCG3’寡核苷酸或其功能性类似物作为主要成分可形成各种药物组合物或剂型。包含有效治疗剂量的该类寡核苷酸或其功能性类似物的这些药物组合物可被用于治疗肺癌的用途。

6、在治疗肺癌时，本发明提供的含5’CGTCGTTCG3’寡核苷酸或其功能性类似物可以单独应用，或自身组合应用，或和其它一种或几种抗肿瘤制剂联合应用。

7、在治疗肺癌时，本发明提供的含5’CGTCGTTCG3’寡核苷酸或其功能性类似物可由递送载体承载应用。

附图说明

图1描述了含5’CGTCGTTCG3’寡核苷酸对人外周血单个核细胞增生的刺激作用。

CpG2006(5’-tcg tcg ttt tgt cgt tttg tcg tt-3’)和CpG C 2216(5’-GGGGGACGATCGTCGGGGGG-3’)是两个对照ODN。

图2描述了含5’CGTCGTTCG3’寡核苷酸刺激人外周血单个核细胞产生抗病毒物质的作用。

CpG2006(5’-tcg tcg ttt tgt cgt tttg teg tt-3’)和CpG C 2216(5’-GGGGGACGATCGTCGGGGGG-3’)是两个对照ODN。

图3、描绘了含5’CGTCGTTCG3’寡核苷酸对肺癌细胞生长的抑制作用。

CpG2006(5’-tcg tcg ttt tgt cgt tttg tcg tt-3’)和CpG C 2216(5’-GGGGGACGATCGTCGGGGGG-3’)是两个对照ODN。

发明详细说明

除非特别强调，本发明中的术语具有可以被本发明所属领域内技术人员所理解的通常意义。若出现含义上的冲突，应遵从本详细说明的解释、界定或说明。

“寡核苷酸”：寡核苷酸是由糖(如脱氧核糖)，磷酸基团和碱基组成的单核苷酸连接而形成的分子，其中糖分子和碱基连接成核苷(nucleoside)，核苷由磷酸基团连接形成核苷酸(nucleotide)，形成核苷的碱基有嘧啶和嘌呤，嘧啶有胸腺嘧啶(thymine，缩写为T或t)和胞嘧啶(cytosine，缩写为C或c)，嘌呤有腺嘌呤(adenine，缩写为A或a)和鸟嘌呤(guanine，缩写为G或g)。在本发明中，寡核苷酸指的是寡脱氧核苷酸。寡核苷酸可由人工合成，也可以从细胞、细菌和病毒中获得。本发明提供的寡核苷酸是含5’CGTCGTTCG3’的寡核苷酸，其中的C是胞嘧啶或其衍生物，T是胸腺嘧啶或其衍生物，A是腺嘌呤或起衍生物，G是鸟嘌呤或其衍生物。本发明提供的含5’CGTCGTTCG 3’寡核苷酸包括但不限于具有下述序列和命名的寡核苷酸：

YW111   (SEQ ID NO：1)：5’-TCGTCGACGTCGTTCGTTCTC-3’(21bp)

YW112   (SEQ ID NO：2)：5′-TCGTCGTCGTTCGAT-3′(15bp)

YW211   (SEQ ID NO：3)：5′-TCGCGTCGTTCGCCCGTCGTTCGGTA-3′(26bp)

YW212   (SEQ ID NO：4)：5′-TCGTCGTCGTTCGCCCGTCGTTCGGTA-3′(27bp)

YW213   (SEQ ID NO：5)：5′-TCACGTCGTTCGCCCGTCGTTCGGTA-3′(26bp)

YW214   (SEQ ID NO：6)：5′-TCGTCGTCGTTCGACCCGTCGTTCGGTA-3′(28bp)

YW215   (SEQ ID NO：7)：5′-TCGTTCGTCGTTCGACCCGTCGTTCGGTA-3′(29bp)

YW216   (SEQ ID NO：8)：5′-TCGTCGTTCGTCGTTCGACCCGTCGTTCGGTA-3′(32bp)

YW311   (SEQ ID NO：9)：5′-TCGCGTCGTTCGCCCGTCGTTCGGTTCGCGTCGTTCGCTA-3′(40bp)

YW3112  (SEQ ID NO：10)：

5′-TCGCGTCGTTCGCTCCGTCGTTCGGTCGCGTCGTTCGCTCGGTCGTTCCGTA-3′(52bp)

YW3113(SEQ ID NO：11)：

5′-

TCGCGTCGTTCGCTCCGTCGTTCGGTCGCGTCGTTCGCTCGGTCGTTCCGTCGGTCGTTCCGTA

-3′(64bp)

“化学修饰”：与自然的DNA相比，本发明提供的含5’CGTCGTTCG3’寡核苷酸可以经各种化学修饰，修饰的部位可发生在核苷之间的磷酸二酯键，核糖单位或/和有机碱基(A、T、C、G)。在寡核苷酸的合成期间或合成后都可以进行修饰。在合成期间的化学修饰可以在寡核苷酸的内部或5`端进行修饰。合成后的寡核苷酸可以但不限于在活性基团(如5`或3`端的磷酸或羟基)进行化学修饰。专业人员可以知道这些化学修饰具体方式。本发明中的寡核苷酸可以有一个或多个化学修饰。和相同序列的自然形态的寡核苷酸相比，本发明中的寡核苷酸的化学修饰可以位于局部的磷酸二酯键或/和局部的核糖单位或/和局部的核苷碱基。本发明中的化学修饰包括寡核苷酸的骨架修饰。在这里，寡核苷酸的骨架修饰包括但不限于磷酸骨架修饰。磷酸骨架修饰可以是在核苷酸分子的一个稳定的磷酸骨架中，其中至少一个核苷酸间键合中的非桥性磷酸氧原子被硫原子取代。在本发明中的寡核苷酸中，核苷酸间键合中的非桥性磷酸氧原子可以部分或全部被硫原子取代。本发明中的寡核苷酸的骨架也可发生非离子DNA类似物，如烷基、芳香-碳磷酸盐化合物(带电荷的碳磷酸盐化合物氧原子被烷基、芳香基取代)修饰，再如磷酸二酯和烷基磷酸三酯中的氧原子部分被烷基化修饰。本发明的寡核苷酸可以是磷硫酰和磷酸二酯的嵌合体。在本发明的寡核苷酸中，化学修饰还包括碱基替代，如C-5丙炔嘧啶和7-deaza-7替代嘌呤替代。替代的嘌呤和嘧啶包括但不限于：腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、其它的自然的和非自然出现的碱基。在本发明的寡核苷酸中，化学修饰还包括碱基修饰。修饰的碱基在化学上不同于典型的自然中的碱基(如A、T、C、G。)，但具有它们基本的化学结构。本发明中的寡核苷酸还可以用胞嘧啶衍生物或胸腺嘧啶核苷衍生物修饰。这里胞嘧啶衍生物是指胞嘧啶样核苷(除外胞嘧啶)。胸腺嘧啶核苷衍生物是指胸腺嘧样核苷(不包括胸腺嘧啶)。另外，本发明中的寡核苷酸的修饰可以是在寡核苷酸的两个或一个末端连接连接一个二元醇，如四乙二醇或六乙二醇。本发明中的含5’CGTCGTTCG3’寡核苷酸经化学修饰可以产生出相应的含5’CGTCGTTCG3’寡核苷酸的功能性类似物。

“肿瘤”：本发明中的“肿瘤”即现代医学定义的肿瘤，可以分为非致癌性的良性肿瘤和致癌性的恶性肿瘤。癌症是恶性肿瘤。

“免疫反应”：免疫应答和免疫反应有相似的意义。免疫反应是免疫细胞如B细胞、T细胞、NK细胞、树突细胞和巨噬细胞等对抗原或其它刺激作出的反应。免疫应答包括天然免疫应答和获得性(特异性)免疫应答。获得性性免疫应答括细胞免疫应答和体液免疫应答。

“治疗肿瘤”：这里的治疗是指对发生肿瘤的个体采取的治疗性措施，用来控制疾病的进展，延长发生肿瘤个体的生存期，改善发生肿瘤个体的生存质量，减轻的疾病的症状，使癌肿缩小甚至消除。

″个体″：个体是指应用本发明寡核苷酸的人类个体和非人类脊椎动物个体。非人类脊椎动物包括非人类灵长类动物，畜牧动物和宠物动物。本发明提供的含5’CGTCGTTCG3’寡核苷酸或其功能类似物可在应用于个体后治疗肿瘤。

“药物学可接受的载体”：药物学可接受的载体是指一种或多种固体或液体的填充剂、稀释剂或包封物质，此载体适合将本发明中的寡核苷酸应用于个体。该载体可以是有机的、无机的、天然的或合成的。该载体包括各种溶液、稀释剂、溶剂、分散剂、脂质体、乳剂、糖衣、抗菌剂、抗真菌剂、等渗的和延缓吸收的试剂、和其他的适合本发明中的寡核苷酸应用的载体。药物学可接受的载体的选择决定于本发明中含5’CGTCGTTCG3’寡核苷酸或其功能类似物的应用方式。可注射用的载体包括水、生理盐水、平衡盐溶液、葡萄糖溶液、甘油等。对于固体混合物(如粉末、丸、片剂、胶囊形式)而言，常用的非毒性固体载体包括：具有药理学纯度的甘露醇、乳糖、淀粉和硬脂酸镁等。另外，作为生物学上中性的载体，应用的药理学组分中可以含有非毒性的辅助物质，包括湿化或乳化剂、防腐剂、PH缓冲试剂，醋酸钠和单月桂酸酯等。

“治疗有效剂量”：为了治疗肿瘤，给个体应用剂量是治疗有效剂量。该治疗有效剂量是指在治疗肿瘤的过程中，给予个体后可产生理想的预防或治疗效果的含5’CGTCGTTCG3’寡核苷酸或其功能类似物的剂量。本发明中的含5’CGTCGTTCG3’寡核苷酸或其功能类似物可以直接或放到药物学上可接受的载体中应用。这个“剂量”的多少决定于本领域技术熟练人员应知的标准技术，还要参考其他因素，包括并不限于个体的大小和健康情况和疾病的严重程度。本发明中的寡核苷酸可以用作单次治疗或多次治疗。本发明中的含5’CGTCGTTCG3’寡核苷酸或其功能类似物每次应用到个体的剂量范围从1μg到100mg。为了达到理想的治疗效果，本领域技术熟练人员可以对应用的剂量作调整，如主治医师在可靠的医疗判断的基础上，做出的剂量调整，其剂量范围可以是前述范围的10倍到1000倍。

“给药途径”：在应用时，本发明中的含5’CGTCGTTCG3’寡核苷酸或其功能类似物可以单独应用或按配方制作成药物组合物应用，经由各种合适的途径来达到理想的治疗效果。本发明中的含5’CGTCGTTCG3’寡核苷酸或其功能类似物的给药途径可以是肠内、肠外、外用或吸入途径。肠内给要途径包括经口、胃、结肠或直肠给药；肠外给药途径包括经静脉、腹膜、鞘内、肌肉、皮下、局部注射，经阴道、外用、鼻粘膜和肺吸入等。外用给药途径包括经皮肤、口腔、眼睛、耳和鼻子。

“药物组合物”：药物组合物指的是本发明中治疗有效剂量的含5’CGTCGTTCG3’寡核苷酸或其功能类似物与药物学上可接受的载体组成的混合物。药物组合物分可以包含一个或多个本发明中的含5’CGTCGTTCG3’寡核苷酸或其功能类似物。药物组合物可以但不限于是水溶液、盐溶液、颗粒、气溶胶、片剂、粉剂、糖衣片剂、胶囊剂、栓剂、糖浆剂、乳剂、悬胶液、乳膏、滴剂和其它合适的物质。药物组合物的应用方式可以是：经肠外、经口、经直肠、经阴道、经腹膜内、经局部(粉剂、软膏剂、凝胶剂、滴剂、透辟贴剂)、含服或口腔和鼻腔喷雾等。在各种情况下，药物组合物必须是无菌和稳定的。本发明的注射剂药物组合物包括药学上可接受的水溶液、非水溶液、分散剂、悬浊剂、乳剂或粉剂，注射前用无菌的注射用水或分散剂溶解。本发明中的含5’CGTCGTTCG3’寡核苷酸或其功能类似物可以用水相载体溶解，比如用pH 3.0到pH 8.0的等渗的缓冲液，pH值范围也可为pH3.5-pH 7.4，pH 3.5-pH 6.0，pH 3.5-pH 5.0。缓冲液包括：柠檬酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、醋酸盐缓冲液。口服的药物组合物可以和可食用的载体按配方制成粉剂、片剂、丸剂、糖锭剂、胶囊、液体、凝胶、糖浆、膏剂或悬浊剂等。常规的非毒性固体载体作为固体组分可以是药物学级别的甘露醇、乳糖、淀粉和硬脂酸镁等。口腔含化给药法的药学药学药物组合物可以是传统方式的片剂和锭剂。作为吸入法的药学药学药物组合物是喷雾剂，相关领域技术熟练人员可以选择使用压力囊、喷雾器或干粉。在一些情况下，为了延长本发明中含5’CGTCGTTCG3’寡核苷酸或其功能类似物的作用效果，药物组合物可被处理于合适的持续释放系统后应用。发明中的含5’CGTCGTTCG3，寡核苷酸或其功能类似物或药物组合物可以被处理成带有结晶的悬胶液或水分较少的非结晶物质，来稳定地延缓释放。注射用的本发明中含5’CGTCGTTCG3’寡核苷酸或其功能类似物的延缓释放可以通过用疏水物质(如，可接受的油性载体)溶解来实现。用于注射形式的药物组合物，可以是脂质体包裹的寡核苷酸或乳粒，或可生物降解的半透性聚合物，如多乳酸化合物、多正酯类或聚酐。

“抗肿瘤制剂”：抗肿瘤制剂是指在个体用于治疗肿瘤的制剂，包括化疗药物，非特异性免疫增强剂，表皮细胞生长因子受体(EGFR)-酪氨酸激酶(-TK)激活抑制剂，肿瘤细胞突变蛋白酪氨酸激酶抑制剂，肿瘤血管抑制剂，抗肿瘤抗体和肿瘤疫苗等。本发明中的含5’CGTCGTTCG3’寡核苷酸或其功能类似物可以单独应用，或几种联合应用，或应用药物可接受的载体，或和一种或几种其它的抗肿瘤制剂联合应用。本发明提供的含5’CGTCGTTCG3’寡核苷酸或其功能类似物可以和其它的抗肿瘤制剂同时应用，或按先后次序应用。

“化疗药物”；化疗药物是指用于肿瘤治疗的化学药物。本发明提供的含5’CGTCGTTCG3’寡核苷酸或其功能类似物可以和一种或多种化学药物联合应用治疗肿瘤。化疗药物包括但不限于氮芥、环磷酰胺、消瘤芥、盐酸氮芥，卡氮芥、环乙亚硝脲、噻替派、马利兰、顺铂，亚硝脲类，5-氟脲嘧啶、阿糖胞苷、甲氨喋呤、巯基嘌呤、6-巯基嘌呤，羟基脲，阿霉素，表阿霉素，柔红霉素，米托蒽醌，丝裂霉素，博采霉素，自力霉素，放线菌素D，长春新碱，长春花碱，长春花碱酰胺，三尖杉脂碱，喜树碱，鬼臼乙叉甙，美登素，榄香烯乳，三苯氧胺，肾上腺皮质激素，甲基苄肼，羟基甲基苄肼，左旋门冬酰胺酶，铂类(顺铂，卡铂，草酸铂)，氮烯咪胺，六甲嘧胺，泰索帝或培美曲赛(Alimta)，诺维本，希罗达，伊立替康，拓扑替康，草酸铂，多烯紫杉醇(Docetaxel)，联合应用的化疗药物如泰素(紫杉醇)+顺铂，泰素+卡铂、健择(盐酸吉西他滨)+顺铂，泰索帝(多西紫杉醇)+顺铂，泰素D、健择+顺铂，顺铂(Cisplatin)+长春瑞宾(vinorelbine)，吉西他滨(gemcitabine)+卡铂(Carboplatin)，紫杉醇(paclitaxel)+卡铂。本发明提供的含5’CGTCGTTCG3’寡核苷酸或其功能类似物可以和一种或两种或两种以上的化疗药物联合应用。

“非特异性免疫增强剂”是指能非特异增强个体抗肿瘤免疫反应的制剂，这些制剂包括单但不限于卡介苗(BCG)、α型干扰素(IFN-α)和白细胞间介素(IL-2)。

“表皮细胞生长因子受体(EGFR)-酪氨酸激酶(-TK)激活抑制剂”：肿瘤细胞如肺癌细胞表达的表皮细胞生长因子是受体酪氨酸激酶，抑制此激酶活性的制剂可以抑制包括肺癌细胞的生长。此类制剂包括但不限于吉非替尼或易瑞沙(Gefitinib，Iressa)和埃罗替尼(Erlotinib，Tarceva)(Bezjak，A.，eta1.J Clin Oncol 24：3831-3837 2006)。

“肿瘤细胞突变蛋白酪氨酸激酶抑制剂”是指抑制肿瘤细胞突变蛋白酪氨酸激酶活性的制剂。此类制剂包括但不限于甲磺酸伊马替尼(Gleevec或STI-571或Imatinib mesylate)。甲磺酸伊马替尼是突变蛋白质(Bcr-Abl)酪氨酸激酶磷酸化抑制剂(Rubin BP，Duensing A.Mechanisms of resistance to smallmolecule kinase inhibition in the treatment of solid tumors.Lab Invest.2006 Aug 21)。

“肿瘤血管抑制剂”是指通过抑制肿瘤血管形成而发挥抗肿瘤作用的制剂。这类制剂包括但不限于阿瓦斯丁(Avastin)和恩度(ENDOSTAR)。阿瓦斯丁是结合血管内皮生长因子(VEGF)的基因工程单克隆抗体(Gridelli C，et al.New antiangiogenetic agents and non-small cell lung cancer.Crit Rev OncolHematol.2006 Jul 12)。恩度是重组人血管内皮抑制素。

“抗肿瘤抗体”是指包括但不限于HERCEPTIN(Johnson BF，Janne PA.Rationale for a phaseII trialof pertuzumab，a HER-2 dimerization inhibitor，in patients with non-small cell lung cancer.ClinCancer Res.2006 Ju1 15；12(14 Pt 2)：4436s-4440s)等对肺癌细胞生长有治疗作用的抗体类药物。

“肿瘤疫苗”是指能诱生个体产生抗肿瘤特异性免疫应答的制剂。肿瘤疫苗中的肿瘤抗原是诱生肿瘤特异性免疫应答的核心物质，这些肿瘤抗原包括但不限于MUC1。

“递送载体”：本发明中的含5’CGTCGTTCG3’寡核苷酸或其功能类似物可以用递送载体递送应用。递送载体包括但不限于：类固醇(如胆固醇)、络和物、乳化物、免疫刺激复合物(ISCOMs)、脂质(如阳离子脂质和阴离子脂质)、脂质体、活的细菌载体(如沙门氏菌、大肠杆菌、分枝杆菌志贺(氏)杆菌、乳酸杆菌)和活的病毒载体(如牛痘苗、腺病毒、单纯疱疹病毒)、病毒小体、病毒样颗粒、微球、核酸疫苗、高分子材料(如羧甲基纤维素、脱乙酰壳多糖)、环状多聚物。递送载体也可以通过特异性受体识别靶细胞的靶向性配体分子。

具体实施方式

技术熟练人员可以了解到本发明提供的含5’CGTCGTTCG3’寡核苷酸或其功能类似物可以通过抑制肺癌细胞的生长而发挥治疗肺癌的作用，也可以通过刺激人的免疫细胞增殖和产生细胞因子而发挥抗肿瘤的作用。下面的非限定性的实施例将对本发明作出例证说明。

在实施例中，以人外周血分离人外周血单个核细胞作为免疫细胞的来源，其中的免疫细胞有T细胞、B细胞、天然杀伤细胞、树突状细胞、粒细胞和单核细胞等。

实施例中的含5’CGTCGTTCG3’寡核苷酸由上海生工生物技术有限公司合成，并经无热源处理。寡核苷酸中的内毒素应用鲎变形细胞溶解法检测(Associates of Cape Cod，Inc)。以下显示的是在实施例中应用的含5’CGTCGTTCG3’寡核苷酸序列和名称：

YW111  (SEQ ID NO：1)： 5’-TCGTCGACGTCGTTCGTTCTC-3’(21bp)

YW112  (SEQ ID NO：2)： 5′-TCGTCGTCGTTCGAT-3′(15bp)

YW211  (SEQ ID NO：3)：5′-TCGCGTCGTTCGCCCGTCGTTCGGTA-3′(26bp)

YW212  (SEQ ID NO：4)：5′-TCGTCGTCGTTCGCCCGTCGTTCGGTA-3′(27bp)

YW213  (SEQ ID NO：5)： 5′-TCACGTCGTTCGCCCGTCGTTCGGTA-3′(26bp)

YW214  (SEQ ID NO：6)： 5′-TCGTCGTCGTTCGACCCGTCGTTCGGTA-3′(28bp)

YW215  (SEQ ID NO：7)： 5′-TCGTTCGTCGTTCGACCCGTCGTTCGGTA-3′(29bp)

YW216  (SEQ I D NO：8)：5′-TCGTCGTTCGTCGTTCGACCCGTCGTTCGGTA-3′(32bp)

YW311  (SEQ ID NO：9)： 5′-TCGCGTCGTTCGCCCGTCGTTCGGTTCGCGTCGTTCGCTA-3′(40bp)

YW3112 (SEQ ID NO：10)：

5′-TCGCGTCGTTCGCTCCGTCGTTCGGTCGCGTCGTTCGCTCGGTCGTTCCGTA-3′(52bp)

YW3113(SEQ ID NO：11)：

5′-

TCGCGTCGTTCGCTCCGTCGTTCGGTCGCGTCGTTCGCTCGGTCGTTCCGTCGGTCGTTCCGTA

-3′(64bp)

实施例1、含5’CGTCGTTCG3’寡核苷酸刺激人外周血单个核细胞(PBMCs)增殖的作用

用Ficoll-Hypaque密度梯度离心法从人外周血分离正常人外周血单个核细胞(Ficoll试剂购自Pharmacia公司，血液样品由吉林省血液中心提供)。用台酚兰染色法确定人外周血单个核细胞的成活率为95％-99％。用[³H]胸腺嘧啶掺入法检测人外周血单个核细胞的增殖情况。简而述之，人外周血单个核细胞以6×10⁵/孔的密度接种到U型底96孔板，与各种含5’CGTCGTTCG3’寡核苷酸(3μg/ml)在37℃、5％CO2的细胞孵箱内培养48小时，之后加入[³H]腺嘧啶(New England Nuclear，Boston，MA)继续培养16小时。在玻璃纤维滤器上收获细胞，用闪烁计数器检测结果。用平均cpm±SD表示细胞增殖情况。每个样品设3复孔。

如图1的结果所示，含5’CGTCGTTCG3’寡核苷酸可显著刺激人外周血单个核细胞增殖。这证明含5’CGTCGTTCG3’寡核苷酸可以刺激免疫细胞增生，增强免疫功能，从而增强对肿瘤的免疫监视作用。

实施例2  含5’CGTCGTTCG3’寡核苷酸刺激人外周血单个核细胞(PBMCs)产生抗病毒物质的作用

用Ficoll-Hypaque密度梯度离心法从正常人外周血分离人外周血单个核细胞(Ficoll试剂购自Pharmacia公司，血液样品由吉林省血液中心提供)。由台酚兰染色法确定人外周血单个核细胞的成活率为95％-99％。

Vero E6细胞(非洲绿猴肾细胞系，源自Type Culture Collection，美国)用含10％(v/v)热灭活的胎牛血清和抗生素(100 IU of penicillin/ml and 100 IU of streptomycin/ml)的IMDM培养液在37℃、5％CO2的细胞孵箱内培养。采用Vero E6细胞病变法检测经CpG ODN处理人外周血单个核细胞培养上清的抗病毒活性。人外周血单个核细胞以6×10⁵/孔的密度接种到U型底96孔板，与各种含5’CGTCGTTCG3’寡核苷酸(3μg/ml)共孵育48小时，收集上清。将Vero E6细胞(3×10⁴/孔)接种到平底96孔板，设3个复孔，培养24小时。之后，和l00μl上述收集的上清(1∶80稀释)培养16小时，再加入10X TCID50(TCID50，半数组织感染剂量)的VSV病毒(水泡性口炎病毒)继续培养36小时。培养结束后，用0.5％的结晶紫染色。用多孔微量滴定板检测仪测定OD值(A578nm)，以OD值来表示病毒的细胞病变效应。

如图2所示，含5’CGTCGTTCG3’寡核苷酸可以刺激人外周血单个核细胞产生抗病毒物质。这证明含5’CGTCGTTCG3’寡核苷酸可以刺激以产生抗病毒物质特征的天然免疫反应。天然免疫反应可发挥抗肿瘤作用。这些抗病毒物质主要由细胞因子组成。

实施3  含5’CGTCGTTCG3’寡核苷酸抑制人肺癌细胞系细胞生长的作用

A549细胞(人肺癌细胞系细胞，源自 Type Culture Collection，美国)用含10％(v/v)热灭活的胎牛血清和抗生素(100 IU of penicillin/ml and 100 IU of streptomycin/ml)的IMDM培养液在37℃、5％CO2的细胞孵箱内培养。将A549细胞接种于96孔培养板，5000个/孔，设3个复孔，加入各种含5’CGTCGTTCG3’寡核苷酸(终浓度为6μg/ml)，在37℃、5％CO2的细胞孵箱内培养共孵育168小时。收集细胞，在显微镜下用计数板计数。用3复孔计数的平均值表示结果。

如图3所示，含5’CGTCGTTCG3’寡核苷酸抑制人肺癌细胞的生长。

序列表

<110>长春华普生物技术有限公司

<120>含5’CGTCGTTCG3’寡核苷酸及其用途

<160>11

<210>1

<211>21

<212>DNA

<213>人工合成

<400>1

TCGTCGACGT CGTTCGTTCT C          21

<210>2

<211>15

<212>DNA

<213>人工合成

<400>2

TCGTCGTCGT TCGAT                  15

<210>3

<211>26

<212>DNA

<213>人工合成

<400>3

TCGCGTCGTT CGCCCGTCGT TCGGTA      26

<210>4

<211>27

<212>DNA

<213>人工合成

<400>4

TCGTCGTCGT TCGCCCGTCG TTCGGTA      27

<210>5

<211>26

<212>DNA

<213>人工合成

<400>5

TCACGTCGTT CGCCCGTCGT TCGGTA       26

<210>6

<211>28

<212>DNA

<213>人工合成

<400>6

TCGTCGTCGT TCGACCCGTC GTTCGGTA     28

<210>7

<211>29

<212>DNA

<213>工合成

<400>7

TCGTTCGTCG TTCGACCCGT CGTTCGGTA    29

<210>8

<211>32

<212>DNA

<213>人工合成

<400>8

TCGTCGTTCG TCGTTCGACC CGTCGTTCGG TA                          32

<210>9

<211>40

<212>DNA

<213>人工合成

<400>9

TCGCGTCGTT CGCCCGTCGT TCGGTTCGCG TCGTTCGCTA                  40

<210>10

<211>52

<212>DNA

<213>人工合成

<400>10

TCGCGTCGTT CGCTCCGTCG TTCGGTCGCG TCGTTCGCTC GGTCGTTCCG TA    52

<210>11

<211>64

<212>DNA

<213>人工合成

<400>11

TCGCGTCGTT CGCTCCGTCG TTCGGTCGCG TCGTTCGCTC GGTCGTTCCG TCGGTCGTTC CGTA

64

Claims (19)

1.含5’CGTCGTTCG3’特定序列的寡核苷酸或其功能类似物。

2.权力要求1所述的寡核苷酸或其功能类似物可含有一个或多个5’CGTCGTTCG3’特定序列。

3.如权力要求1或2所述寡核苷酸或其功能类似物，其特定序列5’CGTCGTTCG3’的两个末端或两个特定序列5’CGTCGTTCG3’中间可以添加其他任意的由4种核苷酸(A、T、C、G)组成的核苷酸序列。

4.如权力要求1-3中任一所述的寡核苷酸或其功能类似物包括但不限于如下寡核苷酸序列，即序列表中SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ IDNO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11所代表的序列。

5.权力要求1-4任一所述的寡核苷酸或其功能类似物可以经化学修饰，化学修饰的部位可以是核苷间的磷酸二酯键和/或核糖和/或碱基。经化学修饰的权力要求1-4中任一所述的寡核苷酸被界定为相应寡核苷酸的功能性类似物。

6.权力要求1-5中任一所述的寡核苷酸或其功能类似物通过刺激免疫细胞增殖而使免疫功能增强的方法。

7.权力要求1-5中任一所述的寡核苷酸或其功能类似物通过刺激免疫细胞分泌细胞因子而使免疫功能增强的方法。

8.如权力要求6和权力要求7任一所述的方法，其中的免疫功能增强的作用可以抑制肿瘤生长。

9.权力要求1-5中任一所述的寡核苷酸或其功能类似物用于制备用于治疗肿瘤的制剂的用途。

10.权力要求1-5中任一所述的寡核苷酸或其功能类似物抑制肺癌细胞生长的方法。

11.权力要求1-5中任一所述的寡核苷酸或其功能类似物用于制备用于治疗肺癌的制剂的用途。

12.如权力要求8、10任一所述的方法或权力要求9、11任一所述的用途中，其中寡核苷酸或其功能类似物在给予荷瘤个体时可以单独应用或与药物学可接受的载体一起应用的方法。

13.如权力要求12中所述的方法，其中的寡核苷酸或其功能类似物可以作为药物组合物中的有效成分进行应用。

14.如权力要求12、13任一所述的方法，其中的寡核苷酸或其功能类似物在应用于个体时可经肠内、肠外、外用和吸入等给药途径施行。

15.如权力要求12、13、14任一所述的方法，其中的寡核苷酸或其功能类似物在给予个体时可以单独应用，或自身联合应用，或与一种或几种其它的抗肿瘤制剂联合应用。

16.权力要求15中所述的抗肿瘤制剂包括化疗药物、非特异性免疫增强剂、表皮细胞生长因子受体(EGFR)-酪氨酸激酶(-TK)激活抑制剂、肿瘤细胞突变蛋白酪氨酸激酶抑制剂、肿瘤血管抑制剂、抗肿瘤抗体、肿瘤疫苗和其它的免疫治疗制剂。

17.如权力要求12、13、14、15任一所述的方法，其中的寡核苷酸或其功能类似物在给予个体时可以和放射治疗联合应用。

18.如权力要求12、13、14、15、17任一所述的方法中，其中的寡核苷或其功能类似物在给予个体时可以单独应用或和递送载体联合应用。

19.如权力要求12、13、14、15、17、18任一所述的方法中，其中的寡核苷酸或其功能类似物的应用剂量为治疗有效剂量。

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