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CN106434720A - 提高脑膜炎奈瑟菌fHBP蛋白表达的方法 - Google Patents

提高脑膜炎奈瑟菌fHBP蛋白表达的方法 Download PDF

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CN106434720A CN201610626742.4A CN201610626742A CN106434720A CN 106434720 A CN106434720 A CN 106434720A CN 201610626742 A CN201610626742 A CN 201610626742A CN 106434720 A CN106434720 A CN 106434720A
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Abstract

本发明涉及提高重组脑膜炎奈瑟菌fHBP蛋白表达的方法，属于基因工程技术领域。本发明通过分别更换流感嗜血杆菌P4外膜蛋白信号肽、大肠杆菌脂蛋白‑28信号肽和大肠杆菌主要外膜脂蛋白信号肽表达重组脑膜炎奈瑟菌fHBP，表达量与带原始信号肽的脑膜炎奈瑟菌fHBP相比分别提高了2.68±0.32、1.94±0.17和2.91±0.25倍，解决了fHBP蛋白表达量低的问题，为重组脑膜炎奈瑟菌fHBP蛋白的工艺研发及疫苗应用奠定了基础。

Description

提高脑膜炎奈瑟菌fHBP蛋白表达的方法
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，涉及优化信号肽以提高重组脑膜炎奈瑟菌fHBP蛋白表达的方法。
背景技术
脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitidis，Nm)是一种致病性革兰氏阴性菌，主要引起儿童细菌性脑脊髓膜炎和败血症，是严重威胁人类健康的病原体，致病性脑膜炎球菌主要有A、B、C、Y、W135五个血清群，其中A、C、Y、W135群以荚膜多糖为抗原研制出了有效的疫苗来预防相应血清型脑膜炎奈瑟菌所引发的脑膜炎，但是由于B型脑膜炎球菌荚膜多糖和人神经细胞的粘附分子同源，免疫原性很低，不适合用于疫苗的制备，因此，B群脑膜炎奈瑟菌的非荚膜多糖抗原疫苗研制也就成为了关注的重点。
目前有一些候选抗原如外膜囊泡、外膜蛋白比较受到关注，其中外膜脂蛋白2086(LP2086)又称H因子结合蛋白(Factor H-binding Protein,fHBP)，是一个分子量为28KD的保守蛋白，表达于所有脑膜炎奈瑟菌表面且能够产生杀菌抗体而成为了最有希望的抗原。H因子(fH)是补体替代途径的关键调节子，它在因子I介导的C3b裂解为灭活片段iC3b过程中发挥辅助因子作用，也促进替代途径c3转化酶C3bBb的衰变。fH通过和fHBP结合可下调补体的激活性以逃避补体介导的杀伤作用。通过fH与细菌表面结合这个重要机制，病原体在未经免疫的人血清或血液中存活并逃避先天性宿主防御。在疫苗中加入fHBP成分也许可以收到双重的功效，它不仅可以诱发杀菌的抗体，还可以通过阻断fH结合到细菌表面来提高细菌对宿主杀伤作用的敏感性。Novartis公司以fHBP、NadA和PorA免疫原组成的4CmenB疫苗于2013年11月被欧盟批准用于2个月以上的人群使用，Pfizer公司由两种fHBP变体型组成的B群脑膜炎疫苗于2014年10月通过美国FDA批准用于10至25岁人群。但由于脑膜炎球菌仅表达微量的fHBP蛋白，通过在大肠杆菌中以重组蛋白的形式表达fHBP能够在一定程度上增加其表达量，然而重组蛋白形式的fHBP的表达量依然较低，不能获得足够的蛋白满足后续研发需求，所以提高其表达效率以满足研究和生产的需要的关键。
发明内容
鉴于目前技术存在的上述不足，本发明提供提高重组脑膜炎奈瑟菌fHBP蛋白表达的方法，本发明通过分别更换了P4外膜蛋白(Haemophilus influenza P4protein，P4)信号肽、脂蛋白-28(lipoprotein-28，LP)信号肽和主要外膜脂蛋白信号肽(major outermembrane lipoprotein，MLP)的重组B群脑膜炎奈瑟菌fHBP，表达量较带原始信号肽的B群脑膜炎奈瑟菌fHBP相比分别提高了2.68+0.32、1.94+0.17和2.91+0.25倍，较好解决了fHBP蛋白表达量低的问题，为重组B群脑膜炎奈瑟菌fHBP蛋白的工艺研发及疫苗应用奠定了基础。
此外，令人惊讶地，我们发现了用主要外膜脂蛋白信号肽替换原始信号肽比目前可用的最佳的外源信号肽P4外膜蛋白信号肽取得了更好的效果。
本发明的采用如下技术方案：
优化信号肽提高重组B群脑膜炎奈瑟菌fHBP蛋白表达的方法，包括以下步骤：
带不同外源信号肽fHBP表达质粒的构建；
基于不同外源信号肽对fHBP蛋白表达的影响。
作为本发明的优选技术方案，所述质粒构建的步骤包括：
提取29315株B群脑膜炎球菌基因组，以其为模板，采用引物w468、w469PCR扩增fHBP目的基因；
通过NdeI/EcoRI核酸内切酶对目的基因及pET-30a质粒进行双酶切，并连接获得带自身信号肽的pET30-rBfHBP质粒，测序验证目的基因正确性；
以pET30-rBfHBP质粒为模板，采用引物w482、w488扩增出的目的基因，再次以引物w483、w488进行PCR扩增获得5’端带有P4信号肽序列的fHBP目的基因。
作为本发明的优选技术方案，所述质粒构建的步骤还包括：
以pET30-rBfHBP质粒为模板，分别采用引物w484、w488及w485、w488经过两次PCR，获得5’端带有LP信号肽的fHBP目的基因；
以pET30-rBfHBP质粒为模板，采用w486、w488及w487、w488经过两次PCR扩增，获得带有MLP信号肽序列的fHBP目的基因；
将上述带不同信号肽的fHBP目的基因片段与pET-30a质粒采用NdeI/BamHI进行双酶切，并连接分别获得带P4、LP、MLP信号肽的fHBP原核表达质粒pET30a-P4SP-rBfHBP、pET30a-LPSP-rBfHBP、pET30a-MLPSP-rBfHBP，并测序验证其正确性。
作为本发明的优选技术方案，所述确定fHBP蛋白诱导表达条件的步骤包括：
将带自身信号肽的pET30-rBfHBP表达质粒转化BL21(DE3)感受态细胞，通过IPTG诱导表达来确定fHBP蛋白表达条件。确定表达条件为水平摇床中，以37℃，180rpm，细菌对数生长期OD600＝0.6时加入终浓度为0.1mM的IPTG诱导2h。
将带P4、LP、MLP三种外源信号肽的pET30a-P4SP-rBfHBP、pET30a-LPSP-rBfHBP、pET30a-MLPSP-rBfHBP表达质粒分别转化BL21(DE3)感受态细胞，挑取单克隆，以上述条件进行诱导表达筛选表达工程菌株，；
将表达不同外源信号肽的fHBP工程菌株分别各挑取三个克隆，利用相同条件再次进行诱导，SDS-PAGE电泳检测蛋白表达水平。
本发明的优化信号肽提高重组脑膜炎奈瑟菌fHBP蛋白表达的方法具有以下优点：1、在相同条件下，更换了P4外膜蛋白信号肽、脂蛋白-28信号肽和主要外膜脂蛋白信号肽的重组B群脑膜炎奈瑟菌fHBP表达量较带原始信号肽的B群脑膜炎奈瑟菌fHBP相比分别提高了2.68+0.32、1.94+0.17和2.68+0.32倍；2、提供了能够提高fHBP蛋白表达量的信号肽，为提高B群脑膜炎奈瑟菌fHBP表达的研究及应用提供了一种新的思路。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为带不同信号肽的fHBP蛋白诱导表达结果本发明中带不同信号肽fHBP蛋白的表达质粒转化BL21(DE3)感受态细胞，在OD600＝0.6时加入0.1mM终浓度的IPTG分别诱导2h的蛋白表达情况，泳道1：蛋白marker；泳道2、3：无IPTG及加入IPTG诱导后带自身信号肽fHBP蛋白表达情况；泳道4、5：无IPTG及加入IPTG诱导后带P4信号肽fHBP蛋白表达情况；泳道6、7：无IPTG及加入IPTG诱导后带LP信号肽fHBP蛋白表达情况；泳道8、9：无IPTG及加入IPTG诱导后带MLP信号肽fHBP蛋白表达情况。
图2为不同克隆的带不同信号肽fHBP蛋白表达结果本发明中将表达带外源信号肽工程菌株，分别挑取三个不同的克隆在OD600＝0.6时加入0.1mM终浓度的IPTG分别诱导2h蛋白表达情况，泳道1：带自身信号肽fHBP蛋白表达情况；泳道2-4：不同克隆的带P4信号肽fHBP蛋白表达结果；泳道5-7：不同克隆的带LP信号肽fHBP蛋白表达结果；泳道8-10：不同克隆的带MLP信号肽fHBP蛋白表达结果。
图3为带不同信号肽fHBP蛋白的相对表达量比较本发明中带不同外源信号肽的fHBP蛋白相对带自身信号肽fHBP蛋白表达量大小比较的图谱，其中带自身信号肽的fHBP蛋白相对表达量为1.00，带P4信号肽的fHBP蛋白相对表达量为2.68+0.32,带LP信号肽的fHBP蛋白相对表达量为1.94+0.17,带MLP信号肽的fHBP蛋白相对表达量为2.91+0.25。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
在本发明中，图1和图2为相同诱导条件下，带不同信号肽的fHBP表达量比较,图3为带不同信号肽的fHBP相对表达量。具体情况参照以下实施例。
本发明提供的不同信号肽对重组B群脑膜炎奈瑟菌fHBP蛋白表达的方法，包括以下步骤，
步骤S1：质粒构建，其中包括步骤S1a：采用Axygen试剂盒提取29315株B群脑膜炎球菌(购自中国医学细菌保藏管理中心)基因组，以B群脑膜炎球菌基因组为模板，采用引物w468、w469(表2)PCR扩增fHBP目的基因；步骤S1b：通过NdeI/EcoRI对目的基因及pET-30a进行双酶切，连接获得带自身信号肽的pET30-rBfHBP质粒并测序验证目的基因正确性；步骤S1c：以pET30-rBfHBP质粒为模板，采用引物w482、w488扩增出的目的基因，再次以引物w483、w488进行PCR扩增获得5’端带有P4信号肽序列的fHBP目的基因；
步骤S1d：以pET30-rBfHBP质粒为模板，分别采用引物w484、w488及w485、w488经过两次PCR获得5’端带有LP信号肽的fHBP目的基因，以pET30-rBfHBP质粒为模板，采用w486、w488及w487、w488经过两次PCR扩增获得带有MLP信号肽序列的fHBP目的基因；将带不同信号肽的fHBP目的基因片段与pET-30a采用NdeI/BamHI进行双酶切，连接获得带P4、LP、MLP信号肽的fHBP原核表达质粒pET30a-P4SP-rBfHBP、pET30a-LPSP-rBfHBP、pET30a-MLPSP-rBfHBP，并测序验证其正确性。
进一步为，将pET30a-rBfHBP、pET30a-P4SP-rBfHBP、pET30a-LPSP-rBfHBP、pET30a-MLPSP-rBfHBP四个表达载体转化至BL21(DE3)大肠杆菌感受态细胞进行重组蛋白的表达。
表1不同信号肽碱基序列
步骤S2：确定fHBP蛋白诱导表达条件：其中包括步骤S2a：将带自身信号肽的fHBP蛋白基因序列连接到载体pET-30a，其质粒转化进入BL21(DE3)感受态细胞进行表达来确定fHBP蛋白诱导表达条件。大肠杆菌在诱导前实时检测其OD值，分别取OD600值为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0的时间点加入1mM终浓度的IPTG进行诱导4h，SDS-PAGE电泳比较不同OD值时诱导蛋白的表达情况，确定最优诱导OD值。根据最优诱导OD值，调整IPTG浓度，按照终浓度为0.1、0.5、1.0、2.0、5.0进行诱导4h，SDS-PAGE电泳比较不同浓度IPTG对目的蛋白表达量的影响，确定最佳IPTG浓度。再根据最佳诱导OD值和IPTG浓度，分别诱导2h、4h、6h、8h，SDS-PAGE电泳比较不同诱导时间对目的蛋白表达量的影响，确定最适诱导时间
表2构建质粒引物序列
通过对带自身信号肽的fHBP蛋白进行表达条件的优化，在37℃，180rpm条件下获得最佳诱导条件为在细菌对数生长期(OD600＝0.6)加入终浓度为0.1mM的IPTG诱导2h获得最高表达量。但即使在最佳诱导条件下，带自身信号肽的fHBP蛋白表达量依然不是很高，成为后续蛋白纯化及疫苗研发实验的瓶颈。
步骤S4：基于不同外源信号肽对fHBP蛋白表达的影响，其中包括步骤S4a：将带P4、LP、MLP三种外源信号肽的fHBP蛋白表达质粒转化后，分别挑取克隆，鉴定无误后，进行诱导表达；步骤S4b：将三种带外源信号肽质粒转化的BL21感受体细胞，分别挑取三个不同的克隆，利用相同条件再次进行诱导，SDS-PAGE电泳检测蛋白表达水平。
具体为，将带P4、LP、MLP三种外源信号肽的fHBP蛋白表达质粒转化如BL21(DE3)后，分别挑取克隆，鉴定无误后，进行诱导表达。37℃、180rpm于LB培养基中培养至OD600＝0.6，加入0.1mM终浓度的IPTG继续37℃、180rpm诱导2h，SDS-PAGE电泳鉴定蛋白表达水平。使用BIO-RAD凝胶成像系统对目的蛋白进行相对定量，将带自身信号肽的fHBP的相对表达量定为1.00，则带P4信号肽fHBP的相对表达量为2.03，带LP信号肽fHBP的相对表达量为1.48，带MLP信号肽fHBP的相对表达量为2.06(图1)。这些结果表明，本实验的三种外源信号肽替换原信号肽都能够不同程度地增加fHBP蛋白的表达量，且增加蛋白表达量水平由高到低依次为：MLP信号肽、P4信号肽、LP信号肽。
由于P4信号肽与MLP信号肽对fHBP蛋白表达增加水平相差较小，为了进一步比较这两种信号肽的效果同时进一步验证结果的可靠性，三种带外源信号肽质粒转化的BL21(DE3)大肠杆菌分别挑取三个不同的克隆，利用相同条件再次进行诱导，SDS-PAGE电泳检测蛋白表达水平(图2)。使用BIO-RAD凝胶成像系统进行相对定量，将带自身信号肽的fHBP相对表达量定为1.00，则带P4信号肽三个克隆的fHBP相对表达量分别为2.59、2.72、2.36，带LP信号肽的三个克隆的fHBP相对表达量为1.77、2.09、1.95，带MLP信号肽的三个克隆的fHBP相对表达量为2.75、3.16、2.82(图3)。结果表明MLP信号肽增加fHBP蛋白表达程度最高。
在本发明中，fHBP蛋白作为脑膜炎球菌疫苗的重要抗原而备受关注，但是fHBP蛋白表达于脑膜炎球菌膜表面，由于空间位置有限，表达具有饱和性，因此限制了抗原的产量，难以纯化获得足够量的蛋白作为疫苗抗原。因此在大肠杆菌中表达重组蛋白成了一个可行的策略，重组蛋白表达量的高低直接关系到后续疫苗的研发乃至最终的经济效益及社会效益。在大肠杆菌表达的重组蛋白产量较脑膜炎球菌自身表达的蛋白有了极大的提高，但是相比其他重组蛋白，fHBP重组蛋白的表达量还是很低，给后续的纯化带来一定难度，因此需要通过其他策略来增加其表达量。改造信号肽是一种有效增加重组蛋白表达量的方式，采用外源信号肽替换fHBP自身信号肽，在重组蛋白表达过程中引导蛋白加工分泌，从而获得具有生物活性的重组蛋白。辉瑞公司通过将B群脑膜炎球菌fHBP蛋白自身信号肽替换为流感嗜血杆菌P4信号肽后，fHBP蛋白表达量有所提高。为了将fHBP蛋白自身信号肽替换为外源信号肽，一般将外源信号肽碱基序列添加在正向引物的5’端，但是本实验中需要添加的信号肽碱基序列长约60bp，若直接将其添加至引物5’端给引物的合成及PCR带来一定难度，因此采用了两轮PCR扩增，每轮PCR扩增使正向引物带上部分信号肽序列，最终获得带完整外源信号肽的fHBP基因。将B群fHBP蛋白自身信号肽替换为大肠杆菌主要膜蛋白(MLP)信号肽及脂蛋白(LP-28)信号肽后，与fHBP自身信号肽进行比较，均增加了蛋白的表达量，同时替换为MLP信号肽后fHBP的表达量比替换为P4信号肽表达量还略高(表3)，这表明MLP很可能是另一个能够增加fHBP表达量且能运用于研发的信号肽。
表3不同信号肽氨基酸序列及其对fHBP蛋白表达的影响
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本领域技术的技术人员在本发明公开的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

Claims (9)

1.一种提高脑膜炎奈瑟菌fHBP蛋白表达的方法，所述方法包括用分别选自流感嗜血杆菌P4外膜蛋白P4信号肽、大肠杆菌脂蛋白-28LP信号肽和大肠杆菌主要外膜脂蛋白MLP信号肽序列的信号肽替换脑膜炎奈瑟菌fHBP基因的原始信号肽，从而形成重组脑膜炎奈瑟菌fHBP基因，其中优选地，用大肠杆菌主要外膜脂蛋白MLP信号肽序列替换脑膜炎奈瑟菌fHBP基因的原始信号肽。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述P4信号肽包含如SEQ ID NO:2所示的序列，LP信号肽包含如SEQ ID NO:3所示的序列，并且MLP信号肽序列包含如SEQ ID NO:4所示的序列。
3.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中将所述重组脑膜炎奈瑟菌fHBP基因分别用PCR方式引入P4信号肽、LP信号肽、MLP信号肽，并构建表达质粒，优选pET30a，从而形成重组表达质粒。
4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中将所述重组表达质粒导入表达宿主，优选大肠杆菌，更优选大肠杆菌BL21(DE3)菌株中。
5.根据权利要求4所述的方法，其中将表达工程菌株接种至LB培养基中培养至OD600＝0.6，加入0.1mM终浓度的IPTG，于37℃、180rpm诱导2h。
6.一种提高脑膜炎奈瑟菌fHBP蛋白表达的方法，所述方法包括：
提取29315株B群脑膜炎球菌基因组，以B群脑膜炎球菌基因组为模板，采用引物w468、w469以PCR扩增fHBP目的基因；
通过NdeI/EcoRI对fHBP目的基因及pET-30a进行双酶切，纯化后T4连接酶连接，获得带自身信号肽的pET30-rBfHBP质粒并测序验证构建的重组质粒；
以pET30-rBfHBP质粒为模板，采用引物w482、w488扩增目的基因，再次以引物w483、w488进行PCR扩增，获得5’端带有P4信号肽序列的fHBP目的基因；
以pET30-rBfHBP质粒为模板，分别采用引物w484、w488及w485、w488经过两次PCR获得5’端带有LP信号肽的fHBP目的基因；
以pET30-rBfHBP质粒为模板，采用w486、w488及w487、w488经过两次PCR扩增获得带有MLP信号肽序列的fHBP目的基因。
7.根据权利要求6所述的方法，所述方法进一步包括将带不同信号肽的fHBP目的基因片段与pET-30a采用NdeI/BamHI进行双酶切，并分别连接获得带P4、LP、MLP信号肽的fHBP原核表达质粒pET30a-P4SP-rBfHBP、pET30a-LPSP-rBfHBP、pET30a-MLPSP-rBfHBP，并测序验证其正确性。
8.根据权利要求7所述的方法，所述方法进一步包括将带自身信号肽、P4、LP、MLP信号肽的fHBP原核表达质粒分别转化BL21(DE3)感受态细胞中，得到转化细胞，并筛选表达工程菌株。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述方法包括于LB培养基中培养工程菌株至OD600＝0.6，加入0.1mM终浓度的IPTG，于37℃、180rpm诱导2h。
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