CN102978231A

CN102978231A - 一种重组人表皮生长因子工程菌的构建和筛选方法

Info

Publication number: CN102978231A
Application number: CN2012102722164A
Authority: CN
Inventors: 郑春阳; 王磊; 王巍; 徐彬
Original assignee: TIANJIN QIANGWEITE BIO-TECH Co Ltd
Current assignee: TIANJIN QIANGWEITE BIO-TECH Co Ltd
Priority date: 2012-08-02
Filing date: 2012-08-02
Publication date: 2013-03-20

Abstract

本发明提供了一种重组人表皮生长因子(hEGF)工程菌的构建和筛选方法。主要步骤为：一、由PCR技术获得卡那霉素抗性基因，由化学合成方式获得大肠杆菌cspA基因功能元件；二、对编码SUMO蛋白和hEGF的基因序列，分别进行优化，然后由化学合成获得大量表达的融合蛋白基因序列OPT-SUMO-hEGF；三、将前两步所得片段连入pET21质粒，得到pET-Kan-cspA-SE质粒；四、以上述质粒为模板，构建转座体；五、将转座体转入大肠杆菌Origami 2(DE3)；六、筛选出融合蛋白SUMO-hEGF表达量高的菌株。本发明得到的菌株基因组稳定，表达的hEGF可溶率高，适合大规模工业化生产。

Description

一种重组人表皮生长因子工程菌的构建和筛选方法

技术领域

本发明属于生物工程领域，具体涉及一种高效胞内可溶表达重组人表皮生长因子(以下简称为h EGF)工程菌的构建和筛选方法。

背景技术

人表皮生长因子(Human epidermal growth factor，hEGF)是含有53个氨基酸残基的单链多肽，分子量为6216道尔顿；hEGF序列包含6个半胱氨酸残基，可以形成三对分子内二硫键，这些二硫键稳定了hEGF的构象，对其发挥生物学功能起到了重要作用。

在体内，hEGF诱导上皮发展，促进血管生成，抑制胃酸分泌。在体外，hEGF是成纤维细胞，上皮细胞和内皮细胞的促细胞分裂剂，可以促进表皮细胞的集落形成。目前，hEGF在医疗和化妆品行业具有广泛的应用。

hEGF广泛存在于人的体液中，早期主要从尿液中提取(Starkey，R.H.et al.，Science，189，800-802，1975)，由于hEGF在体液中的含量很小，直接提取成本很高，目前主要通过基因工程菌表达纯化，常用的方法包括分泌表达和胞内表达。hEGF的分泌表达，虽然表达量较高，但是hEGF的同质性和完整性受到影响，使得下游的纯化步骤复杂化。而在胞内表达时，现有做法是把hEGF基因以质粒的形式引入大肠杆菌胞内，但在发酵条件下，菌株的质粒丢失现象较为明显，严重影响了hEGF的得率(Wong，DK-H et al.，J.Ind.Microbiol.Biot.，21，31-36，1998)。如果能把hEGF基因直接引入大肠杆菌的基因组，那么它的丢失几率会大大降低，但在此之前没有这方面的报道。

此外，在胞内表达hEGF时，由于大肠杆菌的胞内为还原性环境，不利于hEGF分子内三对二硫键的形成，所得的hEGF均以包涵体的形式存在，为了获得有活性的hEGF，需要经历一个复杂的变复性过程，影响hEGF的产率。

有研究表明，利用Origami(DE3)宿主菌和SUMO标签表达融合蛋白可解决原蛋白可溶率低的问题(Su，Z.etal.，Protein Pept.Lett.，13，785-792，2006)。在此之前没有把SUMO标签应用到hEGF表达上的报道。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有重组表皮生长因子胞内表达可溶率低和发酵培养中的质粒丢失问题，提供一种高效、稳定、高可溶性表达hEGF工程菌的构建和筛选方法。

本发明的hEGF工程菌构建过程如下：

一、通过PCR技术获得包含卡那霉素抗性基因，通过化学合成方法获得大肠杆菌cspA基因功能元件；

二、对编码SUMO蛋白的基因和编码hEGF的基因序列，按照大肠杆菌的密码子偏好性，进行密码子优化，获得适合在大肠杆菌中大量表达的序列OPT-SUMO-hEGF；

三、将第一步和第二步所得的片段连入pET21质粒中，得到pET-Kan-cspA-SE质粒；

四、以pET-Kan-cspA-SE质粒为模板，构建转座体；

五、将转座体转入大肠杆菌Origami 2(DE3)；

六、筛选出高表达SUMO-hEGF的菌株；

其中步骤二中根据大肠杆菌偏爱密码子设计的大量表达重组hEGF的优化序列OPT-SUMO-hEGF如序列表中SEQ ID NO：3所示。

本发明的重组hEGF工程菌同已有文献报道的重组hEGF工程菌相比，具有以下优点：(1)本发明采用转座反应，将编码hEGF的基因整合于大肠杆菌的基因组中，由于没有使用质粒，从根源上避免了发酵条件中由于质粒丢失而导致的产量下降的问题，极大的提高了工程菌的稳定性；(2)本发明采用大肠杆菌抗冻基因cspA的功能元件，低温诱导表达hEGF，显著的提高了hEGF表达的可溶率；此外，低温诱导有利于保证hEGF的同质性，从一定程度上简化了后续的纯化操作。综上所述，按本发明所述方法得到的菌株基因组稳定、表达的人表皮生长因子可溶率高，适合大规模工业化生产。

附图说明

图1为cspA基因功能元件排列顺序图

图2为pET-kan-cspA-SE质粒物理图谱

图3为高可溶表达菌株SE-26摇瓶培养后表达SUMO-hEGF的结果。图中1道为诱导前的样品，2道为低温诱导48小时后的全菌蛋白，3道为低温诱导48小时后超声破碎菌体并离心后的上清。

具体实施方式

本发明的重组hEGF工程菌构建具体过程如下：

1.包含卡那霉素抗性基因和cspA基因功能元件的构建

1.1卡那霉素抗性基因片段的获得

1.1.1设计引物，序列如下：

引物Kan-1：5′-ggcaaattagatctcttttctacggggtctgacg-3′(SEQID NO：1)

引物Kan-2：5′-aatttgcccatatgcgatttcggcctattggtta-3′(SEQID NO：2)

1.1.2PCR反应获得卡那霉素抗性基因片段

PCR反应使用的DNA聚合酶Vent购自NEB公司，pET42a质粒购自默克密理博公司，PCR反应体系如下：

PCR反应的条件为：变性：94℃，30秒；退火：56℃，30秒；延伸：72℃，1分20秒；循环数：30

1.2cspA基因功能元件的获得

cspA基因功能元件的序列如序列表中SEQ ID NO：3所示。各功能元件的排列顺序如图1所示。该序列由生工生物工程(上海)有限公司合成。

2.编码SUMO-hEGF基因片段的获得

对编码酵母SUMO蛋白的基因和编码hEGF的基因序列，按照大肠杆菌的密码子偏好性，进行密码子优化，获得了适合在大肠杆菌中大量表达的序列OPT-SUMO-hEGF如序列表中SEQ ID NO：4所示。该序列由生工生物工程(上海)有限公司合成。

3.pET-Kan-cspA-SE质粒的获得

3.1pET-Kan质粒的获得

3.1.1pET21质粒的双酶切

pET21质粒购自默克密理博公司，Bgl II和Nde I内切酶购自NEB公司，双酶切体系如下：

37℃酶切3小时。

3.1.2卡那霉素抗性基因片段的双酶切

卡那霉素抗性基因片段的双酶切体系如下：

37℃酶切3小时。

3.1.3pET-Kan质粒的获得

将3.1.1和3.1.2步获得的双酶切产物用T4DNA连接酶(购自NEB公司)连接，连接体系如下：

25℃连接2个小时。

连接产物转化大肠杆菌，筛选卡那霉素抗性克隆，选择测序正确的菌株培养，以获得大量的pET-Kan质粒。

3.2pET-Kan-c.spA质粒的获得

3.2.1pET-Kan质粒的双酶切

Xho I和Nde I内切酶购自NEB公司，pET-Kan的双酶切体系如下：

37℃酶切3小时。

3.2.2cspA基因功能元件的双酶切

37℃酶切3小时。

3.2.3pET-Kan-cspA质粒的获得

将3.2.1和3.2.2步获得的双酶切产物用T4DNA连接酶(购自NEB公司)连接，连接体系如下：

25℃连接2个小时。

连接产物转化大肠杆菌，筛选卡那霉素抗性克隆，选择测序正确的菌株培养，以获得大量的pET-Kan-cspA质粒。

3.3pET-Kan-cspA-SE质粒的获得

3.3.1pET-Kan-cspA质粒的酶切

pET-Kan-cspA质粒的酶切分为两步，首先经BamH I酶切，酶切产物回收后经Hind III酶切，其中BamH I和Hind III均购自NEB公司。

pET-Kan-cspA质粒的BamH I酶切体系如下：

37℃酶切2小时。

pET-Kan-cspA质粒的BamH I酶切产物的Hind III酶切体系如下：

37℃酶切2小时。

3.3.2OPT-SUMO-hEGF片段的酶切

OPT-SUMO-hEGF片段的酶切分为两步，首先经BamH I酶切，酶切产物回收后经Hind III酶切。OPT-SUMO-hEGF片段的BamH I酶切体系如下：

37℃酶切2小时。

OPT-SUMO-hEGF片段的BamH I酶切产物的Hind III酶切体系如下：

37℃酶切2小时。

3.3.3pET-Kan-cspA-SE质粒的获得：

将3.3.1和3.3.2步获得的双酶切产物用T4 DNA连接酶(购自NEB公司)连接，连接体系如下：

25℃连接2个小时。

连接产物转化大肠杆菌，筛选卡那霉素抗性克隆，选择测序正确的菌株培养，以获得大量的pET-Kan-cspA-SE质粒，如图2所示。

4.包含Kan-CspA-SE序列的转座体的构建

4.1ME-Kan-CspA-SE片段的获得

4.1.1设计引物，序列如下：

M-1：5′-ctgtctcttatacacatctcttttctacggggtctgacg-3′(SEQID NO：5)

M-2：5′-ctgtctcttatacacatctcaggccctttcgtctcgcgc-3′(SEQID NO：6)

4.1.2以pET-Kan-cspA-SE质粒为模板，利用PCR扩增得到带有ME序列的ME-Kan-CspA-SE片段，PCR反应体系如下：

PCR反应的条件为：变性：94℃，30秒；退火：56℃，30秒；延伸：72℃，2分30秒；循环数：30

4.2转座体的构建

将4.1步获得的ME-Kan-cspA-SE片段同转座子酶(本公司自己生产)混合，得到转座体，具体反应体系如下：

25℃反应1个小时。

5.高表达SUMO-hEGF的大肠杆菌的获得，将转座体转入Origami 2(DE3)中

转化中使用的Origami 2(DE3)感受态细胞购自默克密理博公司，具体步骤如下：将第4步中所得的包含Kan-cspA-SE片段的转座子体同Origami 2(DE3)感受态细胞混合，冰水浴30分钟，42℃热激90秒，加入适量LB培养基，37℃培养1小时，涂布平板，筛选抗卡那霉素的克隆。

6.高表达SUMO-hEGF的Origami 2(DE3)菌株的获得

挑取第5步所得的具有卡那霉素抗性的克隆，进行试表达，通过SDS-PAGE检测SUMO-hEGF的表达情况，筛选高表达SUMO-hEGF的菌株。试表达的方法如下：

挑取具有卡那霉素抗性的克隆，在含有50mg/L卡那霉素的培养基中，37℃培养至OD₆₀₀＝0.8，将培养温度降至15℃，并加入IPTG至终浓度1mM进行诱导表达。分别取诱导表达0小时、8小时、16小时、24小时、48小时的菌液，离心收集菌体，超声破碎后经SDS-PAGE检测SUMO-hEGF的表达结果。

共计筛选了100个菌落，获得了高可溶表达SUMO-hEGF的SE-26菌株，该菌株摇瓶表达SUMO-hEGF的结果如图3所示，表达的SUMO-hEGF占全部蛋白的40％，其中SUMO-hEGF的可溶率约为50％。在发酵条件下，经过优化后培养的SE-26菌株表达SUMO-hEGF的产量为102mg/L，可溶率超过60％。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种重组人表皮生长因子(hEGF)工程菌的构建和筛选方法，其特征在于重组hEGF工程菌的构建和筛选方法按以下步骤进行：一、通过PCR技术获得卡那霉素抗性基因，通过化学合成方式获得大肠杆菌cspA基因功能元件；二、对编码SUMO蛋白的基因和编码hEGF的基因序列，按照大肠杆菌的密码子偏好性，进行密码子优化，然后进行化学合成获得适合在大肠杆菌中大量表达的序列OPT-SUMO-hEGF；三、将第一步和第二步所得的片段连入pET21质粒中，得到pET-Kan-cspA-SE质粒；四、以pET-Kan-cspA-SE质粒为模板，构建转座体；五、将转座体转入大肠杆菌Origami 2(DE3)；六、筛选出融合蛋白SUMO-hEGF表达量高的菌株。

2.根据权利要求1所述的重组hEGF工程菌的构建和筛选方法，其特征在于在适合的PCR反应条件下，获得卡那霉素抗性基因。

3.根据权利要求2所述的利用PCR方法获得卡那霉素抗性基因所用的初始质粒为pET42a。

4.根据权利要求2所述的利用PCR方法获得卡那霉素抗性基因所用的引物序列如下：

引物Kan-1：5′-ggcaaattagatctcttttctacggggtctgacg-3′(SEQID NO：1)

引物Kan-2：5′-aatttgcccatatgcgatttcggcctattggtta-3′(SEQID NO：2)。

5.根据权利要求1所述的重组hEGF工程菌的构建和筛选方法，其特征在于cspA基因功能元件的序列为：

ggcaaattca tatgaaggaa tggtgtggcc gattaatcat aaatatgaaa

aataattgtt gcatcacccg ccaatgcgtg gcttaatgca catcaaattg

tgagcggata acaatttgat gtgctagcgc atatccagtg tagtaaggca

agtcccttca agagttatcg ttgatacccc tcgtagtgca cattccttta

acgcttcaaa atctgtaaag cacgccatat cgccgaaagg cacacttaat

tattaagagg taatacacca tgaatcacaa agtgggatcc aagctttagg

taatctctgc ttaaaagcac agaatctaag atccctgcca tttggcgggg

atttttttat ttgttttcag gaaataaata atcgatcgcg taataaaatc

tattattatt tttgtgaaga ataaatttgg gtgcaatgag aatgcgcagg

ccctttcgtc tcgcgcctcg aggcagtct。

6.根据权利要求1所述的重组hEGF工程菌的构建和筛选方法，其特征在于选用pET21为初始质粒来构建pET-Kan-cspA-SE质粒。

7.根据权利要求6所述的选用pET21为初始质粒构建pET-Kan-cspA-SE质粒，该结构构建需要以下步骤：通过双酶切和连接，把卡那霉素抗性基因片段插入pET21质粒构建pET-Kan质粒；通过双酶切和连接，把cspA基因片段插入pET-Kan质粒构建pET-Kan-cspA质粒；通过两步酶切和连接，把OPT-SUMO-hEGF序列插入pET-Kan-cspA质粒构建pET-Kan-cspA-SE质粒。

8.根据权利要求7所述的构建pET-Kan-cspA-SE质粒的步骤中，根据大肠杆菌偏爱密码子设计的表达高的重组hEGF的优化序列OPT-SUMO-hEGF为：

ggcaaattgg atccatgcac caccaccacc accacggtat gtctgactct

gaagttaacc aggaagcgaa accggaagtt aaaccggaag ttaaaccgga

aacccacatc aacctgaaag tttctgacgg ttcttctgaa atcttcttca

aaatcaaaaa aaccaccccg ctgcgtcgtc tgatggaagc gttcgcgaaa

cgtcagggta aagaaatgga ctctctgcgt ttcctgtacg acggtatccg

tatccaggcg gaccagaccc cggaagacct ggacatggaa gacaacgaca

tcatcgaagc gcaccgtgaa cagatcggtg gtaactctga ctctgaatgc

ccgctgtctc acgacggtta ctgcctgcac gacggtgttt gcatgtacat

cgaagcgctg gacaaatacg cgtgcaactg cgttgttggt tacatcggtg

aacgttgcca gtaccgtgac ctgaaatggt gggaactgcg ttaaaagctt

gcagtctt。

9.根据权利要求1所述的重组hEGF工程菌的构建和筛选方法，其特征在于以pET-Kan-cspA-SE质粒为模板，合成ME-Kan-cspA-SE片段，然后将ME-Kan-cspA-SE片段和转座酶混合构建转座体。

10.根据权利要求9所述的构建转座体步骤，其特征在于在适合的PCR反应条件下，合成ME-Kan-cspA-SE片段。

11.根据权利要求10所述的利用PCR方法合成ME-Kan-cspA-SE片段所用的引物序列如下：

引物M-1：5′-ctgtctcttatacacatctcttttctacggggtctgacg-3′(SEQ ID NO：5)

引物M-2：5′-ctgtctcttatacacatctcaggccctttcgtctcgcgc-3′(SEQ ID NO：6)。

12.根据权利要求1所述的重组hEGF工程菌的构建和筛选方法，其特征在于转化获得高表达SUMO-hEGF大肠杆菌的方法如下：将转座体同Origami 2(DE3)感受态细胞混合，先进行冰水浴，然后热激，再加入适量LB培养基短暂培养，涂布平板，筛选抗卡那霉素的克隆。

13.根据权利要求1所述的重组hEGF工程菌的构建和筛选方法，其特征在于筛选高表达SUMO-hEGF大肠杆菌的方法如下：挑取具有卡那霉素抗性的克隆，在含有卡那霉素的培养基中培养，然后将培养温度降低，并加入诱导剂进行诱导表达。分时段提取诱导表达的菌液，离心收集菌体，超声破碎后检测SUMO-hEGF的表达结果，表达量高的菌株即可用做生产用菌株。