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CN105483177A - 一种肠膜明串珠菌的水不溶性胞外多糖的制备方法 - Google Patents

一种肠膜明串珠菌的水不溶性胞外多糖的制备方法 Download PDF

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CN105483177A
CN105483177A CN201510971582.2A CN201510971582A CN105483177A CN 105483177 A CN105483177 A CN 105483177A CN 201510971582 A CN201510971582 A CN 201510971582A CN 105483177 A CN105483177 A CN 105483177A
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Abstract

本发明公开了一种肠膜明串珠菌的水不溶性胞外多糖的制备方法。所述制备方法包括以下步骤：1)将肠膜明串珠菌(Leuconostoc？mesenteroides)BD3749接种于番茄汁蔗糖培养基中，发酵培养获得发酵液；2)将步骤1)所得发酵液冷冻干燥后，取粉末用碱液浸提，取上清，调节上清pH值至7，取沉淀，冷冻干燥即得。该制备方法所用番茄汁蔗糖培养基主要原料为番茄，其来源广、成本低、天然安全，在降低物料成本的同时，提高了食品安全性，发酵菌种为肠膜明串珠菌单一菌种，上述组合有利于产品品质的标准化与工业大规模生产的成本控制，其应用前景十分广阔。

Description

一种肠膜明串珠菌的水不溶性胞外多糖的制备方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种肠膜明串珠菌的水不溶性胞外多糖的制备方法。
背景技术
水不溶性葡聚糖(Insolubleglucan，IG)是一类不溶于水、以葡萄糖为单一组分聚合而成的一种糖类多聚物，这类理化性质特殊的碳水化合物不但来源广泛，在植物、真菌以及细菌的代谢产物中均有报道，而且种类繁多。目前报道较多的IG有dextran、curdlan和cellulose三种，从结构特点来看，已报道的这些IG的分支仅由α-(1,2)、α-(1,3)或α-(1,4)糖苷键中的一种将支链与主链连接起来，极少涉及2种或以上糖苷键的分支结构。因此，新构型IG的筛选与发现不仅为IG家族增添了新的成员，而且极大地推动了IG结构有关研究的前沿领域。
此外，目前IG的获得都来自合成培养基，此类培养基成分多样，配方复杂，配制过程繁琐具有潜在食品安全风险，再者，制备的成本相对较高、IG的来源相对有限，上述问题很大程度上限制了IG的开发和利用。
发明内容
本发明为了解决目前水不溶性葡聚糖的制备使用的是成分多样，配方复杂的合成培养基存在的成本较高，培养基配制繁琐，存在食品安全风险等问题，提供了一种肠膜明串珠菌的水不溶性胞外多糖的制备方法。该制备方法所用番茄汁蔗糖培养基安全纯天然，配制简单，原料来源广泛，成本低。
本发明人发现保藏号为CGMCCNo.100064的肠膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)BD3749在番茄汁蔗糖培养基中振荡培养后的发酵液经冷冻干燥，碱液浸提，离心得到的上清液，再经酸液调节pH至7，离心取沉淀，冷冻干燥可获得具有特殊结构的水不溶性胞外多糖，从而完成了本发明。
为解决上述技术问题，本发明采取的技术方案是：一种肠膜明串珠菌的水不溶性胞外多糖的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
1)将肠膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)BD3749接种于番茄汁蔗糖培养基中，发酵培养获得发酵液；
2)将步骤1)所得发酵液冷冻干燥后，取粉末用碱液浸提，取上清，调节上清pH值至7，取沉淀，冷冻干燥即得。
本发明制备方法步骤1)为：将肠膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)BD3749接种于番茄汁蔗糖培养基中，发酵培养获得发酵液。
本发明步骤1)肠膜明串珠菌BD3749已于2014年11月26日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101。该菌株的建议的分类命名为：肠膜明串珠菌Leuconostocmesenteroides，该菌株的保藏编号为：CGMCCNo.10064，所保藏的培养物名称为：BD3749。
其中，本发明所述肠膜明串珠菌BD3749的制备方法为常规的，较佳地还包括该肠膜明串珠菌BD3749活化获得肠膜明串珠菌种子的步骤。所述肠膜明串珠菌种子为常规方法获得，较佳地为包括以下步骤的方法：将肠膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)(所述肠膜明串珠菌的保藏编号为CGMCCNo.10064)的冻干粉用少量无菌蒸馏水溶解，用接种环取一环划线于含5％蔗糖的M17固体培养基(购买自OXOIDCo.，英国)，30℃好氧培养48h取出，用接种环挑取单菌落放入10mL含5％蔗糖的M17液体培养基(购买自OXOIDCo.，英国)，运用涡旋振荡器将菌落均匀分散于液体培养基内，30℃，180rpm振荡培养24h取出，以2％(v/v)接种量接种于含5％蔗糖的M17液体培养基(购买自OXOIDCo.，英国)，30℃，180rpm振荡培养24h后，将培养物15,000rpm离心10分钟，弃去上清，菌体用无菌蒸馏水洗涤2次后，用原培养体积的无菌蒸馏水悬浮，得到发酵用的种子。所述肠膜明串珠菌BD3749的冻干粉由以下方法制备：挑取2个菌落，接种于300mL的10％(w/w)的脱脂乳溶液里30℃培养4h，-80℃预冻过夜，-20℃冷冻干燥。
本发明步骤1)所述的番茄汁蔗糖培养基配制方法为本领域常规，较佳地由包括以下步骤的方法制备：番茄榨汁，将所得榨汁过滤后煮沸，离心取上清液，加入蔗糖加热溶解后冷却，调节pH值，灭菌后冷却即得。其中，所述过滤的方法为常规的，较佳地为利用80～120目纱布过滤取汁；所述煮沸的时间为常规的，较佳地为1～10分钟(min)，更佳地为3～8分钟，最佳地为5分钟；所述离心为常规的，离心的速度较佳地为4,000～12,000g，更佳地为6,000～10,000g，最佳地为8,000g，离心的时间较佳地为8～12分钟，更佳地为9～11分钟，最佳地为10分钟；所述蔗糖的加入量较佳地为5～30％，更佳地为10～20％，最佳地为10％；所述灭菌为常规的，灭菌的温度较佳地为110～135℃，更佳地为115～125℃，最佳地为121℃，灭菌的时间较佳地为10～30分钟，更佳地为15～25分钟，最佳地为20分钟；所述pH值的调节方法为本领域常规的调节方法，较佳地为加入食品级碱调节pH值，所述食品级碱为本领域常规，较佳地是：Na2CO3、NaHCO3和NaOH中的一种或多种；所述pH值为常规的，较佳地为5～8，更佳地为6～7，最佳地为7。
本发明步骤1)所述的发酵培养为常规的，所述发酵菌种的接种量较佳地为1％～5％，更佳地为2％～4％，最佳地为3％，所述百分比为体积百分比。所述的发酵培养较佳地为振荡发酵培养，所述振荡的速度较佳地为100～300rpm，更佳地为150～250rpm，最佳地为200rpm；发酵培养的温度较佳地为15℃～37℃，更佳地为25～33℃，最佳地为30℃；发酵培养的时间较佳地为24～96小时(h)，更佳地为48～84小时，最佳地为72小时。
本发明制备方法步骤2)为：将步骤1)所得发酵液冷冻干燥后，取粉末用碱液浸提，取上清，调节上清pH值至7，取沉淀，冷冻干燥即得。
本发明步骤2)所述冷冻干燥为本领域常规的冻干技术，只要达到去除水分，获得固形物的目的即可。所述碱液为常规的，较佳地为NaOH溶液，所述NaOH溶液的浓度为1～5M，较佳地为2～4M，更佳地为3M。所述浸提为常规的，所述浸提时冻干粉末与碱液的比例为1g：1mL～1g：5mL，较佳地为1g：2mL～1g：4mL，更佳地为1g：3mL。所述上清为常规方法取得，较佳地为离心，所述离心为常规的，离心的速度较佳地为8,000～15,000g，更佳地为10,000～12,000g，离心的时间较佳地为5～15分钟，更佳地为8～12分钟。所述pH使用的常规方法调节，较佳地为用酸液调节，所述酸液为常规的，较佳地为HCl溶液，所述HCl溶液浓度为1～3M，较佳地为1.5～2.5M，更佳地为2M。所述沉淀的取得为常规方法，较佳地为离心，离心条件优选方案同离心取得所述上清的优选方案。
由上述制备方法得到的肠膜明串珠菌的水不溶性胞外多糖为一种同时拥有α-(1,3)和α-(1,4)糖苷键的水不溶性葡聚糖，呈白色粉末状。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：
1、本发明解决了当前水不溶性多糖(尤其是水不溶性葡聚糖)来源狭隘的现状，为水不溶性多糖的来源提供了另一种的选择；
2、采用本发明制备的水不溶性多糖具有罕见的两种支链连接键并存的形态，是一种结构新颖的多糖，根据结构越复杂的多糖功能也相对较多的理论，因此，具有一定的开发意义。
3、常规多糖的制备步骤中往往涉及了去蛋白的步骤(如SAVAGE法去蛋白)，但本发明制备方法中发酵液不调节pH直接冷冻干燥，酸性发酵液被逐步冻干失水时，pH不断下降，造成局部过酸，导致发酵液中的游离蛋白迅速变性，这部分蛋白在碱液浸提时被离心除去，从而达到了去蛋白的目的。
4、肠膜明串珠菌属于乳酸菌范畴，所以与其他来源菌株产生的不溶性多糖相比，肠膜明串珠菌的多糖具有更高的食品安全性。本发明制备所得的胞外多糖可以作为功能性添加剂替代其他来源的水不溶性多糖应用于食品、制药和相关领域中，其应用前景十分广阔。
5、目前IG的制备都依赖于合成培养基，而运用番茄汁蔗糖培养基制备IG的研究尚未报道过，本发明首次将番茄汁蔗糖培养基作为一种天然的发酵培养基应用于IG的制备，因而其产物具有更高的食品安全性。
6、本发明所述用于制备IG的主要原料为番茄，其来源广、成本低，发酵菌种为肠膜明串珠菌单一菌种，上述组合有利于产品品质的标准化与工业大规模生产的成本控制。
生物材料保藏信息
本发明的肠膜明串珠菌BD3749，已于2014年11月26日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101，保藏编号为：CGMCCNo.10064，培养物名称是BD3749，分类命名是肠膜明串珠菌Leuconostocmesenteroides。
附图说明
图1显示肠膜明串珠菌BD3749水不溶性胞外多糖的单糖组成测定结果。
图2显示肠膜明串珠菌BD3749水不溶性胞外多糖的红外光谱测定结果。
图3显示肠膜明串珠菌BD3749水不溶性胞外多糖的核磁共振测定结果。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
本发明中所述的“室温”是指进行试验的操作间的温度，一般为15～25℃，实施例中所使用的试剂若未加说明，均为分析纯试剂，购买自国药集团。
实施例1肠膜明串珠菌水不溶性胞外多糖的制备和产量
1、材料与方法
种子(发酵菌种)的制备：将肠膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)(所述肠膜明串珠菌的保藏编号为CGMCCNo.10064)的冻干粉用少量无菌蒸馏水溶解，用接种环取一环划线于含5％蔗糖的M17固体培养基(购买自OXOIDCo.，英国)，30℃好氧培养48h取出，用接种环挑取单菌落放入10mL含5％蔗糖的M17液体培养基(购买自OXOIDCo.，英国)，运用涡旋振荡器将菌落均匀分散于液体培养基内，30℃，180rpm振荡培养24h取出，以2％(v/v)接种量接种于含5％蔗糖的M17液体培养基(购买自OXOIDCo.，英国)，30℃，180rpm振荡培养24h后，将培养物15,000rpm离心10分钟，弃去上清，菌体用无菌蒸馏水洗涤2次后，用原培养体积的无菌蒸馏水悬浮，得到发酵用的种子即肠膜明串珠菌种子液。所述肠膜明串珠菌BD3749的冻干粉由以下方法制备：挑取2个菌落，接种于300mL的10％(w/w)的脱脂乳溶液里30℃培养4h，-80℃预冻过夜，-20℃冷冻干燥。
番茄汁蔗糖培养基的制备：成熟番茄清洗，去皮，榨汁机压榨，100目纱布过滤取汁，煮沸5min，8000g离心10min取上清，加入质量百分比为10％的蔗糖加热溶解后冷却至室温，以Na2CO3调节pH至7，121℃灭菌20min，冷却至室温，即得无菌的番茄汁蔗糖培养基。
2、肠膜明串珠菌水不溶性胞外多糖的制备
将所得的肠膜明串珠菌种子液按3％(v/v)的接种量接种于蔗糖质量百分比为10％，pH为7的番茄汁蔗糖培养基中，30℃，200rpm振荡发酵培养72小时获得发酵液，将发酵液冻干(即冷冻干燥)后，将冻干粉末与3M的NaOH溶液以1g：3mL的比例混合室温浸提2h，15,000rpm离心5min，取上清，用2M的HCl溶液调节pH至7，15,000rpm离心5min取沉淀，冷冻干燥即得水不溶性胞外多糖A。
3、肠膜明串珠菌水不溶性胞外多糖的产量
经称重与计算，得BD3749水不溶性胞外多糖A的产量为9.2g/L。
实施例2肠膜明串珠菌水不溶性胞外多糖的制备和产量
1、材料与方法
种子(发酵菌种)的制备：同实施例1。
番茄汁蔗糖培养基的制备：成熟番茄清洗，去皮，榨汁机压榨，120目纱布过滤取汁，煮沸10min，4000g离心12min取上清，加入质量百分比为30％的蔗糖加热溶解后冷却至室温，以NaHCO3调节pH至8，135℃灭菌10min，冷却至室温，即得无菌的番茄汁蔗糖培养基。
2、肠膜明串珠菌水不溶性胞外多糖的制备
将所得的肠膜明串珠菌种子液按5％(v/v)的接种量接种于蔗糖质量百分比为30％，pH为8的番茄汁蔗糖培养基中，15℃，300rpm振荡发酵培养24小时获得发酵液，将发酵液冻干后，将冻干粉末与5M的NaOH溶液以1g：1mL的比例混合室温浸提2h，8,000rpm离心15min，取上清，用3M的HCl溶液调节pH至7，8,000rpm离心15min取沉淀，冷冻干燥即得水不溶性胞外多糖B。
3、肠膜明串珠菌水不溶性胞外多糖的产量
经称重与计算，得BD3749水不溶性胞外多糖B的产量为5.49g/L。
实施例3肠膜明串珠菌水不溶性胞外多糖的制备和产量
1、材料与方法
种子(发酵菌种)的制备：同实施例1。
番茄汁蔗糖培养基的制备：成熟番茄清洗，去皮，榨汁机压榨，80目纱布过滤取汁，煮沸1min，12000g离心8min取上清，加入质量百分比含量为5％蔗糖加热溶解后冷却至室温，以NaOH调节pH至5，110℃灭菌30min，冷却至室温，即得无菌的番茄汁蔗糖培养基。
2、肠膜明串珠菌水不溶性胞外多糖的制备
将所得的肠膜明串珠菌种子液按1％(v/v)的接种量接种于蔗糖质量百分比为5％，pH为5的番茄汁蔗糖培养基中，37℃，100rpm振荡发酵培养96小时获得发酵液，将发酵液冻干后，将冻干粉末与1M的NaOH溶液以1g：5mL的比例混合室温浸提2h，10,000rpm离心12min，取上清，用1M的HCl溶液调节pH至7，10,000rpm离心12min取沉淀，冷冻干燥即得水不溶性胞外多糖C。
3、肠膜明串珠菌水不溶性胞外多糖的产量
经称重与计算，得BD3749水不溶性胞外多糖C的产量为3.79g/L。
实施例4肠膜明串珠菌水不溶性胞外多糖的制备和产量
1、材料与方法
种子(发酵菌种)的制备：同实施例1。
番茄汁蔗糖培养基的制备：成熟番茄清洗，去皮，榨汁机压榨，100目纱布过滤取汁，煮沸8min，10000g离心9min取上清，加入质量百分比含量为20％的蔗糖加热溶解后冷却至室温，以Na2CO3和NaHCO3调节pH至6，115℃灭菌25min，冷却至室温，即得无菌的番茄汁蔗糖培养基。
2、肠膜明串珠菌水不溶性胞外多糖的制备
将所得的肠膜明串珠菌种子液按2％(v/v)的接种量接种于蔗糖质量百分比为20％，pH为6的番茄汁蔗糖培养基中，25℃，250rpm振荡发酵培养48小时获得发酵液，将发酵液冻干后，将冻干粉末与2M的NaOH溶液以1g：4mL的比例混合室温浸提2h，12,000rpm离心8min，取上清，用1.5M的HCl溶液调节pH至7，12,000rpm离心8min取沉淀，冷冻干燥即得水不溶性胞外多糖D。
3、肠膜明串珠菌水不溶性胞外多糖的产量
经称重与计算，得BD3749水不溶性胞外多糖D的产量为6.01g/L。
实施例5肠膜明串珠菌水不溶性胞外多糖的制备和产量
1、材料与方法
种子(发酵菌种)的制备：同实施例1。
番茄汁蔗糖培养基的制备：成熟番茄清洗，去皮，榨汁机压榨，80目纱布过滤取汁，煮沸3min，6000g离心11min取上清，加入质量百分比含量为15％的蔗糖加热溶解后冷却至室温，以Na2CO3、NaHCO3和NaOH调节pH至6.5，125℃灭菌15min，冷却至室温，即得无菌的番茄汁蔗糖培养基。
2、肠膜明串珠菌水不溶性胞外多糖的制备
将所得的肠膜明串珠菌种子液按4％(v/v)的接种量接种于蔗糖质量百分比为15％，pH为6.5的番茄汁蔗糖培养基中，33℃、150rpm振荡发酵培养84小时获得发酵液，将发酵液冻干后，将冻干粉末与4M的NaOH溶液以1g：2mL的比例混合室温浸提2h，14,000rpm离心7min，取上清，用2.5M的HCl溶液调节pH至7，14,000rpm离心7min取沉淀，冷冻干燥即得水不溶性胞外多糖E。
3、肠膜明串珠菌水不溶性胞外多糖的产量
经称重与计算，得BD3749水不溶性胞外多糖E的产量为7.88g/L。
实施例6肠膜明串珠菌水不溶性胞外多糖的单糖组成测定
取上述方法制备的胞外多糖A，以高效阴离子色谱法测定多糖的单糖组成。
(1)多糖水解
称取3mg胞外多糖A与2mL4moL/LTFA(三氟乙酸，购自Sigma-AldrichCo.LLC，美国)充分混合，充N2封管，110℃烘箱中水解20h；冷却后打开盖，加200μL甲醇后用N2吹干，如此重复加甲醇并用N2吹3次，去除TFA，将其残渣用水溶解定容至5mL，用0.45μm微孔膜过滤后供进样分析。
(2)色谱条件
色谱柱：CarboPacPA203mmi.d.×150mm；
流动相：A，H2O；B，250mmol/LNaOH；C，1mol/LCH3COONa；
三元梯度洗脱：流速：0.5mL/min；积分脉冲安培检测器；
Au工作电极：Ag/AgCl参比电极，
进样体积：20μL；柱温：30℃。
肠膜明串珠菌BD3749水不溶性胞外多糖A的糖基组成的色谱分析结果见图1，该多糖在5.875min有单一吸收峰，且该吸收峰的保留时间与葡萄糖标品保留时间一致。
结论：肠膜明串珠菌BD3749水不溶性胞外多糖是由葡萄糖单一糖基组成，是一种葡聚糖。
实施例7肠膜明串珠菌水不溶性胞外多糖的结构判定
(1)傅里叶红外光谱(FTIR)测定
将上述方法制备的水不溶性胞外多糖A与溴化钾粉末充分混合后，压制成片状，应用傅里叶红外光谱仪(Nicolet6700,ThermoFisher公司，美国)进行傅里叶红外光谱(FTIR)测定。
结果如图2所示，919cm-1处的吸收峰证明该多糖的碳骨架由α-糖苷组成，1004cm-1处的吸收峰表明该多糖中存在大量α-(1,6)糖苷键，1102cm-1处为葡萄糖残基中C－O键振动的吸收峰，1147cm-1处的吸收峰是糖苷键桥上C－O－C的伸缩振动的结果。3281cm-1处的强宽峰为分子间及分子内羟基吸收峰，2922cm-1为C－H键伸缩振动的吸收峰，1645cm-1处的吸收峰是结合水所致。
结论：BD3749水不溶性胞外多糖主要以α-(1,6)糖苷键构成。
(2)核磁共振(NMR)测定
将上述方法制备的水不溶性胞外多糖A按5mg/mL的浓度完全溶解于1M氘代氢氧化钠溶液中，并应用核磁共振波谱仪(AvanceIII400MHz,Bruker公司，德国)进行核磁共振(NMR)测定。
图3中，A为NMR-1H谱，显示样品的7个质子的化学位移分别为4.945(H-1)，3.970(H-6)，3.887(H-5)，3.787(H-6’)，3.705(H-3)，3.554(H-2)，3.477(H-4)pm，5.223和5.315ppm处的吸收峰分别为糖苷键振动的结果，图3中，B为NMR-13C谱，显示样品在101.252(C-1)，77.245(C-3)，74.843(C-2)，73.449(C-5)，72.850(C-4)和68.554(C-6)ppm处有共振。
结论：FTIR与1H、13C谱的数据结合分析表明，BD3749水不溶性胞外多糖为一种主链由α-(1,6)糖苷键连接而成，支链由α-(1,3)和α-(1,4)糖苷键连接而成的葡聚糖。
实施例8明串珠菌水不溶性胞外多糖的连接键比例的测定
将实施例1～5中制备的BD3749水不溶性多糖进行1H-NMR的检测，通过比较色谱图(如图3A)上H-1(α-(1,6))，α-(1,3)和α-(1,4)吸收峰处的积分面积来确定各连接键的摩尔比关系，各样品的测定结果如表1所示。
表1α-(1,6)，α-(1,3)和α-(1,4)之间的摩尔比关系
从表1可以看出，BD3749水不溶性多糖中各连接键的摩尔比例为α-(1,6)：α-(1,3)：α-(1,4)＝1：0.2～0.3：0.3～0.4。
对比实施例1
将实施例2中的接种量，合成培养基pH，培养温度，发酵时间，发酵振荡的速度、蔗糖浓度以及浸提时的碱液浓度逐一进行调整，获得了以下一组不同方法制备的水不溶性胞外多糖，各组产量如表2所示。
表2不同方法制备所得水不溶性胞外多糖产量
从表2所示的结果中可以得出，将本发明所述胞外多糖的制备方法中接种量，合成培养基pH，培养温度，发酵时间，发酵振荡的速度、蔗糖浓度以及浸提时的碱液浓度调整到本发明保护范围之外的时候，所得胞外多糖的产量显著降低。以上所有原料和试剂均市售可得。
应理解，在阅读了本发明的上述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (7)

1.一种肠膜明串珠菌的水不溶性胞外多糖的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
1)将肠膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)BD3749接种于番茄汁蔗糖培养基中，发酵培养获得发酵液；
2)将步骤1)所得发酵液冷冻干燥后，取粉末用碱液浸提，取上清，调节上清pH值至7，取沉淀，冷冻干燥即得。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤1)所述的肠膜明串珠菌的制备方法还包括肠膜明串珠菌BD3749活化获得肠膜明串珠菌种子的步骤。
3.如权利要求1所述制备方法，其特征在于，步骤1)所述的番茄汁蔗糖培养基由包括以下步骤的方法制备：番茄榨汁，将所得榨汁过滤后煮沸，离心取上清液，加入蔗糖加热溶解后冷却，调节pH值，灭菌后冷却即得。其中，所述过滤的方法较佳地为利用80～120目纱布过滤取汁；所述煮沸的时间较佳地为1～10分钟，更佳地为3～8分钟，最佳地为5分钟；所述离心的速度较佳地为4,000～12,000g，更佳地为6,000～10,000g，最佳地为8,000g，离心的时间较佳地为8～12分钟，更佳地为9～11分钟，最佳地为10分钟；所述蔗糖的加入量较佳地为5～30％，更佳地为10～20％，最佳地为10％；所述灭菌的温度较佳地为110～135℃，更佳地为115～125℃，最佳地为121℃，所述灭菌的时间较佳地为10～30分钟，更佳地为15～25分钟，最佳地为20分钟；所述pH值的调节方法较佳地为加入食品级碱调节pH值，所述食品级碱较佳地是：Na2CO3、NaHCO3和NaOH中的一种或多种；所述pH值较佳地为5～8，更佳地为6～7，最佳地为7。
4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤1)所述的肠膜明串珠菌的接种量为1～5％，较佳地为2～4％，更佳地为3％，所述百分比为体积百分比。
5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤1)所述发酵培养为振荡培养，振荡的速度较佳地为100～300rpm，更佳地为150～250rpm，最佳地为200rpm；或者，所述的发酵培养的发酵温度为15～37℃，较佳地为25℃～33℃，更佳地为30℃；或者，发酵时间为24～96小时，较佳地为48～84小时，更佳地为72小时。
6.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤2)所述碱液为NaOH溶液，所述NaOH溶液的浓度为1～5M，较佳地为2～4M，更佳地为3M；和/或，步骤2)所述浸提时冻干粉末与碱液的比例为1g：1mL～1g：5mL，较佳地为1g：2mL～1g：4mL，更佳地为1g：3mL。
7.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤2)所述上清为离心取得，离心的速度较佳地为8,000～15,000g，更佳地为10,000～12,000g，离心的时间较佳地为5～15分钟，更佳地为8～10分钟；和/或，步骤2)所述pH为用酸液调节，所述酸液较佳地为HCl溶液，所述HCl溶液浓度为1～3M，较佳地为1.5～2.5M，更佳地为2M。
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