CN102174194B - 从发酵液中提取γ-聚二氨基丁酸和聚赖氨酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种从发酵液中提取γ-聚二氨基丁酸和聚赖氨酸的方法，发酵液经预处理、树脂吸附及解析、脱色、浓缩和干燥步骤后别进行干燥处理，分别得到聚赖氨酸和聚二氨基丁酸成品。本发明采用的原料、仪器取材容易，成本低；提取纯化工艺简单、可行；最终产品收率高，纯度高。并且利于环保，适合工业化大生产使用。
Description
技术领域
本发明属分离工程技术领域，具体涉及一种从发酵液中提取γ-聚二氨基丁酸和聚赖氨酸的方法。
背景技术
γ-聚二氨基丁酸由L-2，4-二氨基丁酸的γ-氨基和α-羧基聚合而成的均聚物。目前研究结果显示，γ-聚二氨基丁酸在热稳定性、水溶性等方面具有与聚赖氨酸类似的性质，值得注意的是，γ-聚二氨基丁酸具有极强的酵母抑制能力，并具有一定的抑制G+菌、G-菌与霉菌活力，是一种潜在的优良生物防腐剂。其单体二氨基丁酸(2，4-diaminobutyricacid，英文缩写DABA)，也称2，4-丁二氨酸，是一种次生非蛋白质氨基酸，属于四碳化合物，其结构式为(NH2)CH2CH2CH(NH2)COOH，属于碱性氨基酸。它广泛存在于动物、植物和微生物体内，具有独特的生理功能。其作为药物合成的前体则具有更广阔的应用前景。目前国内外还没有有关γ-聚二氨基丁酸生产提取的报道。
聚赖氨酸 聚二氨基丁酸
聚赖氨酸(ε-PL)是L-赖氨酸的同型聚合物，它由α-羧基与ε-氨基形成肽键连接而成，一般ε-PL由20-40个L-赖氨酸残基所构成。ε-PL是一种抗菌谱广(包括革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、酵母菌、霉菌均具有良好的抑制作用)、生物安全性高(ε-PL可降解为人体必须氨基酸L-赖氨酸)、热稳定性强(120℃加热20min仍保持抗菌活性)、pH适用范围宽的新型营养型食品防腐剂。ε-PL生产过程中生产效率低、产物浓度低、产物分离难等问题，困扰着ε-PL的工业化生产。目前ε-PL的研究主要处于实验室研究而阶段，仅有日本Chisso公司实现了ε-PL的规模化生产，国内南京轩凯生物科技有限公司、浙江银象生物工程有限公司和郑州拜纳佛生物工程股份有限公司仅有少量生产。
本课题组在筛选具有聚赖氨酸能力的菌株时发现一株能同时生产聚赖氨酸及聚二氨基丁酸的菌株Streptomyces albulus PD-1(CCTCC NO：M2011043)。目前该菌株保藏于武汉中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，地址：武汉武汉大学，邮编：430072，登记入册的编号是CCTCC NO：M2011043，保藏日期是：2011年2月22日，详见中国专利2011100499868。由于两种产物都具有优良的物化性能以及广阔的应用前景，因此对两种产物的分离纯化具有十分重要的意义。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种从发酵液中提取γ-聚二氨基丁酸和聚赖氨酸的方法。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
本发明所述的发酵液，是利用小白链霉菌(Streptomyces albulus PD-1，CCTCC NO：M2011043)，发酵得到。
发酵液的制备方法，具体可参见中国专利2011100499868。即将菌株CCTCC NO：M2011043接种于含有碳源、氮源、无机盐和水的无菌发酵培养基中，在合适生长的条件下进行好氧培养。
其中，所述发酵培养基包含如下组分：碳源20～100g/L，氮源2～40g/L，无机盐0.1～20g/L，其余为水，pH6.0～7.0。所述的碳源为葡萄糖、木糖、果糖、乳酸、甘油和纤维素水解糖液中的一种或多种；氮源为牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、玉米浆、豆饼粉、棉籽饼粉、尿素、(NH4)2SO4和NH4Cl中的一种或多种；无机盐为钾盐、钴盐、钠盐、磷酸盐、磷酸二氢盐和盐酸盐中的一种或多种。
其中，所述的合适生长的条件是：培养温度为28～37℃，培养时间为48～150小时，其中，当发酵液pH值降低至4.0～4.5时，维持pH值在4.0～4.5直至发酵结束。
通过上述发酵方法一般会制得聚赖氨酸含量为30g/L左右，聚二氨基丁酸含量为12g/L左右的发酵液。
从上述发酵液中提取γ-聚二氨基丁酸和聚赖氨酸的方法，包括如下步骤：
1)发酵液预处理：加酸调节发酵液pH值至2.0～6.0，50～110℃保温10～30分钟，冷却至室温，经过滤得到滤液，加碱调节滤液pH值至6.0～10.0，得到预处理液；
2)树脂吸附及解析：将预处理液泵入离子交换树脂吸附柱中，直至树脂吸附饱和；然后用去离子水洗杂；再用盐酸或冰醋酸水溶液进行解析，分别收集具有不同保留时间的聚赖氨酸解析液和聚二氨基丁酸解析液；
3)脱色：将收集的聚赖氨酸解析液和聚二氨基丁酸解析液分别进行活性炭脱色，分别过滤收集脱色液；
4)浓缩：将步骤3)得到的聚赖氨酸脱色液浓缩至聚赖氨酸重量百分含量为15％～30％；将步骤3)的得到的聚二氨基丁酸脱色液浓缩至聚二氨基丁酸重量百分含量为8％～20％；
5)干燥：将步骤4)得到的聚赖氨酸浓缩液和聚二氨基丁酸浓缩液分别进行干燥处理，得到聚赖氨酸和聚二氨基丁酸成品。
步骤1)中，所述的过滤可采用板框过滤。
步骤2)中，所述的离子交换树脂吸附柱装填的树脂为弱酸性阳离子交换树脂(例如：110，112，122，151)或大孔强酸型离子交换树脂(例如：D001，D011，D031)中的一种，吸附柱高径比为2～30∶1。吸附流速为0.2～15BV/h，优选1～5BV/h；洗杂流速为1～20BV/h，优选2～10BV/h；去离子水总用量为1～10倍柱体积，优选3～8倍柱体积；解析流速为0.1～10BV/h，优选0.2～3BV/h。
步骤2)中，所述的盐酸浓度为0.2～4mol/L，所述的冰醋酸水溶液浓度为0.2～3mol/L。
步骤2)中，解析过程，利用特异性检测方法跟踪检测聚赖氨酸和聚二氨基丁酸在解析液中的浓度，从而分别收集聚赖氨酸和聚二氨基丁酸，所述的特异性检测方法为Itzhaki法或凝胶渗透色谱法。具体的检测方法如下：
Itzhaki法：
取2mL解析液与2mL 10mmol/L的甲基橙混合，振荡，充分反应30min，8000r/min条件下离心10min，取上清液适当稀释，以磷酸缓冲液为空白样，在465nm下测其吸光度A465，通过标准曲线算出解析液中聚赖氨酸或聚二氨基丁酸含量。【Itzhaki R F.Colorimetric Method for Estimating Polylysine and Polyargine.Analytical Biochemistry[J]1972，50：569～574.】
高效液相色谱法：
使用GPC同时测定聚赖氨酸或聚二氨基丁酸的含量和分子量。色谱条件：T SK-gelG3000PWXL色谱柱(7.8mm×300mm)；流动相为0.2mol/L Na2SO4(乙酸调pH至4.0)；检测波长210nm；柱温35℃；进样量20μl，流速0.5ml/min。【周俊 徐虹 王军等.北里孢菌PL 6-3产聚赖氨酸的分离纯化和结构表征[J].化工学报，2006，57(8)：1957-1961.】
步骤3)中，活性炭的加入量为解析液重量的0.5～5.0％。
步骤3)中，活性炭脱色过程温度为60～100℃，搅拌脱色时间为5～120分钟，然后冷却至室温，过滤。
步骤4)中，所述的浓缩采用冷冻浓缩或蒸发浓缩。
步骤5)中，所述干燥为喷雾干燥或减压冷冻干燥。
通过上述提取方法，所得γ-聚二氨基丁酸产品的收率不低于80％，纯度不低于96％；聚赖氨酸产品的收率不低于85％，纯度不低于95％。
本发明所得产品的特性：γ-聚二氨基丁酸在热稳定性、水溶性等方面具有与聚赖氨酸类似的性质，另外，聚二氨基丁酸具有极强的酵母抑制能力，并具有一定的抑制G+菌、G-菌与霉菌活力，是一种潜在的优良生物防腐剂。与另一产品聚赖氨酸复配能够达到其它防腐剂无可比拟的效果。
本发明制备的γ-聚二氨基丁酸及聚赖氨酸还可用作生物高分子材料、微囊技术材料、药物载体、生物芯片和高分子吸水材料等。
有益效果：本发明的提取工艺是运用树脂分离的方法从发酵液中提取精制γ-聚二氨基丁酸和聚赖氨酸。本发明采用的原料、仪器取材容易，成本低；提取纯化工艺简单、可行；最终产品收率高，纯度高。
附图说明
图1为发酵液液相图。
图2为通过本发明方法最终得到的聚赖氨酸液相图。
图3为通过本发明方法最终得到的聚二氨基丁酸液相图。
其中，1号峰为聚赖氨酸，2号峰为聚二氨基丁酸。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例1：5L罐游离发酵S.albulus PD-1生产聚赖氨酸及聚二氨基丁酸
斜面培养基：葡萄糖10g/L，牛肉膏5g/L，K2HPO4 1g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，琼脂20g/L，pH 7.0。
种子培养基：葡萄糖10g/L，牛肉膏5g/L，酵母膏5g/L，K2HPO4 1g/L，MgSO4·7H2O0.5g/L，利用6mol/LNaOH溶液调pH 7.0
发酵培养基：葡萄糖50g/L，酵母膏5g/L，(NH4)2SO4 5g/L，Na2HPO4·12H2O 1.58g/L，K2HPO4·7H2O 0.82g/L，MgSO4·7H2O 0.1g/L，利用6mol/L NaOH溶液调pH 7.0。
将小白链霉菌S.albulus PD-1(CCTCC NO：M2011043)在种子培养基、28℃、200r/min的摇床条件下培养24h，将300mL种子液按10％(v/v)的种子量接种于预装有2.7L灭菌后的发酵培养基的发酵罐中进行游离培养，培养条件：28℃，400r/min，通气量3L/min，发酵液的pH值随着发酵的进行逐渐下降，当pH值降至4.2左右时，开启pH自动控制装置，利用10％(v/v)的氨水控制发酵液pH值在4.0-4.2之间，发酵150h，聚赖氨酸浓度达32.25g/L，聚二氨基丁酸浓度达13.32g/L。
以下实施例所使用的发酵液都是用本实施的方法发酵得到。
实施例2：
在酸化罐中，用3mol/L盐酸调节发酵液pH值为2.0，然后加热至60℃，保温20分钟，将酸化液冷却至室温，经板框过滤，复滤后得清滤液。用6mol/L氢氧化钠溶液调清滤液pH值为9.0，得到预处理液。
将预处理液泵入高径比为20∶1的弱酸型阳离子交换树脂(110)吸附柱中进行吸附，吸附过程控制流速为4mL/min(约2BV/h)，直到树脂吸附达饱和状态。用去离子水洗涤饱和树脂，控制流速为6mL/min(约3BV/h)，洗涤体积为3个柱体积。用预先配制的3mol/L盐酸进行解析，控制流速为1mL/min(约0.5BV/h)，在不同保留时间下，接合Itzhaki法或高效液相色谱法分别收集聚二氨基丁酸及聚赖氨酸以获得解析液。向含有聚二氨基丁酸的解析液中加入4.0％(w/w)的活性炭，向含有聚赖氨酸的解析液中加入4.0％(w/w)的活性炭，分别加热升温至60℃，搅拌脱色10分钟，然后冷却至室温，过滤得脱色液。
将聚赖氨酸脱色液和聚二氨基丁酸脱色液分别压入冷冻浓缩装置进行循环浓缩，浓缩至聚二氨基丁酸含量在15％(w/w)时停止浓缩，聚赖氨酸含量在25％(w/w)时停止浓缩。
将浓缩液分别经喷雾干燥即得聚二氨基丁酸和聚赖氨酸纯品。所得聚二氨基丁酸收率为82％，纯度为96.8％；聚赖氨酸收率为86％，纯度为96.3％。
实施例3：
在酸化罐中，用2mol/L盐酸调发酵液pH值为5.0，然后加热此酸化液至100℃，保温10分钟，将酸化液冷却至室温，经板框过滤，复滤后得清滤液。加入6mol/L氢氧化钠至清滤液中，调清滤液pH值为7.2得预处理液。
将预处理液泵入大孔强酸型离子交换树脂(D001)吸附柱(高径比为10∶1)中进行吸附，吸附过程应控制流速为4mL/min(约4BV/h)，直到树脂吸附达饱和状态。用5倍柱体积的去离子水在流速5mL/min(约5BV/h)的条件下洗涤饱和树脂。用预先配制的1mol/L醋酸水溶液进行解析，控制解析速度1mL/min(约1BV/h)，在不同保留时间下，接合Itzhaki法或高效液相色谱法分别收集聚二氨基丁酸及聚赖氨酸以获得解析液。向含有聚二氨基丁酸的解析液中加入2.0％(w/w)的活性炭，向含有聚赖氨酸的解析液中加入2.0％(w/w)的活性炭，分别加热升温至100℃，搅拌脱色60分钟，然后冷却至室温，过滤得脱色液。
将聚赖氨酸脱色液和聚二氨基丁酸脱色液分别压入蒸发浓缩装置进行循环浓缩，浓缩至聚二氨基丁酸含量在10％(w/w)时停止浓缩，聚赖氨酸含量在20％(w/w)时停止浓缩。
将浓缩液分别经冷冻干燥即得聚二氨基丁酸和聚赖氨酸纯品。所得聚二氨基丁酸回收率为85％，纯度为96.5％；聚赖氨酸回收率为88％，纯度为96.8％。
本发明方法中使用的离子交换树脂经过本领域技术人员公知的酸洗、碱洗和酸洗的过程，可重复使用。
采用高效液相色谱法对发酵液及分离纯化得到的聚赖氨酸及聚二氨基丁酸进行检测检测结果如图1～3所示。
Claims (9)
1.从发酵液中提取γ-聚二氨基丁酸和聚赖氨酸的方法，其特征在于它包括如下步骤：
1)发酵液预处理：加酸调节发酵液pH值至2.0～6.0，50～110℃保温10～30分钟，冷却至室温，经过滤得到滤液，加碱调节滤液pH值至6.0～10.0，得到预处理液；
2)树脂吸附及解析：将预处理液泵入离子交换树脂吸附柱中，直至树脂吸附饱和；然后用去离子水洗杂；再用盐酸或冰醋酸水溶液进行解析，分别收集具有不同保留时间的聚赖氨酸解析液和聚二氨基丁酸解析液；
3)脱色：将收集的聚赖氨酸解析液和聚二氨基丁酸解析液分别进行活性炭脱色，分别过滤收集脱色液；
4)浓缩：将步骤3)得到的聚赖氨酸脱色液浓缩至聚赖氨酸重量百分含量为15％～30％；将步骤3)的得到的聚二氨基丁酸脱色液浓缩至聚二氨基丁酸重量百分含量为8％～20％；
5)干燥：将步骤4)得到的聚赖氨酸浓缩液和聚二氨基丁酸浓缩液分别进行干燥处理，得到聚赖氨酸和聚二氨基丁酸成品；
步骤2)中，所述的离子交换树脂吸附柱装填的树脂为弱酸性阳离子交换树脂或大孔强酸型离子交换树脂。
2.根据权利要求1所述的从发酵液中提取γ-聚二氨基丁酸和聚赖氨酸的方法，其特征在于步骤2)中，所述的离子交换树脂吸附柱高径比为2～30∶1。
3.根据权利要求1所述的从发酵液中提取γ-聚二氨基丁酸和聚赖氨酸的方法，其特征在于步骤2)中，吸附流速为0.2～15BV/h；洗杂流速为2～20BV/h，去离子水总用量为1～10倍柱体积；解析流速为0.1～10BV/h。
4.根据权利要求1所述的从发酵液中提取γ-聚二氨基丁酸和聚赖氨酸的方法，其特征在于步骤2)中，所述的盐酸浓度为0.2～4mol/L，所述的冰醋酸水溶液浓度为0.2～3mol/L。
5.根据权利要求1所述的从发酵液中提取γ-聚二氨基丁酸和聚赖氨酸的方法，其特征在于：所述步骤2)中，解析过程，利用特异性检测方法跟踪检测聚赖氨酸和聚二氨基丁酸在解析液中的浓度，所述的特异性检测方法为Itzhaki法或高效液相色谱法。
6.根据权利要求1所述的从发酵液中提取γ-聚二氨基丁酸和聚赖氨酸的方法，其特征在于步骤3)中，活性炭的加入量为解析液重量的0.5～5.0％。
7.根据权利要求1所述的从发酵液中提取γ-聚二氨基丁酸和聚赖氨酸的方法，其特征在于步骤3)中，活性炭脱色过程温度为60～100℃，搅拌脱色时间为5～120分钟，然后冷却至室温，过滤。
8.根据权利要求1所述的从发酵液中提取γ-聚二氨基丁酸和聚赖氨酸的方法，其特征在于步骤4)中，所述的浓缩采用冷冻浓缩或蒸发浓缩。
9.根据权利要求1所述的从发酵液中提取γ-聚二氨基丁酸和聚赖氨酸的方法，其特征在于步骤5)中，所述干燥为喷雾干燥或减压冷冻干燥。
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