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CN109295127A - 一种具有氧压力排除效应的α-葡聚糖及其制备方法与应用 - Google Patents

一种具有氧压力排除效应的α-葡聚糖及其制备方法与应用 Download PDF

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CN109295127A CN201811287672.XA CN201811287672A CN109295127A CN 109295127 A CN109295127 A CN 109295127A CN 201811287672 A CN201811287672 A CN 201811287672A CN 109295127 A CN109295127 A CN 109295127A
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Abstract

本发明提供了一种具有氧压力排除效应的α‑葡聚糖及其制备方法与应用，所述α‑葡聚糖由α‑(1,6)糖苷键连接而成的主链，及α‑(1,4)、α‑(1,3)糖苷键连接而成的支链组成，糖苷键α‑(1,6)、α‑(1,4)、α‑(1,3)的摩尔比例为1：0.45～0.5：0.4～0.45，其相对分子质量为1.0x105～5.0x106Da。该α‑葡聚糖由肠膜明串珠菌CGMCC10064发酵生成。本发明α‑葡聚糖在水溶液中表现出良好的溶解氧排除效果，能够显著地降低液体环境中的溶解氧水平，从而缓解益生菌的氧压力。该葡聚糖来源于公认安全的肠膜明串珠菌肠膜亚种，有望在益生菌及相关的食品行业中得到广泛应用。

Description

一种具有氧压力排除效应的α-葡聚糖及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种具有氧压力排除效应的α-葡聚糖及其制备方法与应用。
背景技术
葡聚糖是指以葡萄糖为单糖组成的同型多糖，葡萄糖单元之间以糖苷键连接。葡聚糖具有较高的分子量，主要由D-葡萄吡喃糖以α-(1,6)键连接，支链点有α-(1,2)、α-(1,3)、α-(1,4)连接的。根据溶解水的性质，可分为可溶性和不溶性。根据糖苷键的类型又可分为α-葡聚糖和β-葡聚糖。α-葡聚糖是由肠膜明串珠菌利用蔗糖发酵产生的多糖类物质，主链由α-D吡喃葡萄糖通过α-(1,6)糖苷键构成。随着微生物种类及培养条件的变化，得到的α-葡聚糖的结构大小及组成会有差异。
α-葡聚糖在食品医疗工业中有广泛的应用价值。例如，右旋糖苷因其良好的特性而被用作临床上的代血浆。但到目前为止，还没有发现一种具有氧压力排除效应的α-葡聚糖。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种具有氧压力排除效应的α-葡聚糖及其制备方法与应用，得到的α-葡聚糖在水溶液中表现出良好的溶解氧排除效果，能够显著地降低液体环境中的溶解氧水平，从而缓解益生菌的氧压力。
具体的，一方面，本发明提供了一种具有氧压力排除效应的α-葡聚糖，所述α-葡聚糖由α-(1,6)糖苷键连接而成的主链，及α-(1,4)、α-(1,3)糖苷键连接而成的支链组成，糖苷键α-(1,6)、α-(1,4)、α-(1,3)的摩尔比例为1：0.45～0.5：0.4～0.45，其相对分子质量为1.0x105～5.0x106Da。
具体优选的，所述α-葡聚糖由肠膜明串珠菌CGMCC10064发酵生成。所述α-葡聚糖来源于公认安全的肠膜明串珠菌肠膜亚种，有望在益生菌及相关的食品行业中得到广泛应用。
第二方面，本发明还提供了所述具有氧压力排除效应的α-葡聚糖的制备方法，该方法包括以下步骤：
(1)将肠膜明串珠菌CGMCC10064接种到TYC培养基中，28～32℃下发酵培养后，得到发酵液；
(2)将步骤(1)的发酵液稀释后离心，取上清液，经透析袋透析后加入无水乙醇离心，收集沉淀物并溶于水后，真空冷冻干燥，即得。
其中，步骤(1)中，将肠膜明串珠菌CGMCC10064冻干粉活化获得肠膜明串珠菌CGMCC10064种子液进行接种。
优选的，步骤(1)中，肠膜明串珠菌CGMCC10064的接种量为1.0x107～1.0x108cfu/mL。
优选的，步骤(1)中，TYC培养基的配方组成为：胰蛋白胨1.2～1.8％、酵母提取物0.3～0.6％、蔗糖4～6％、Na2HPO4·12H2O 0.1～0.3％、乙酸钠1～3％、氯化钠0.05～0.15％、碳酸氢钠0.1～0.3％、硫酸钠0.005～0.015％、L-胱氨酸0.01～0.03％，余量为水。
优选的，步骤(1)中，所述发酵培养为振荡培养，振荡的速度为150～200rpm，时间为36～72h。
其中，步骤(2)中，离心的速度为12000～18000g，时间为8～12min。
优选的，步骤(2)中，透析袋的截留分子量为1.0x104～1.5x104Da。
第三方面，本发明还提供了上述具有氧压力排除效应的α-葡聚糖在制备益生菌生长促进剂中的应用。所述α-葡聚糖能显著地降低液体环境中的溶解氧水平，从而缓解益生菌的氧压力，促进了益生菌的生长。
本发明的有益效果为：
本发明从肠膜明串珠菌的发酵液中获得大量α-葡聚糖，得到的α-葡聚糖在水溶液中表现出良好的溶解氧排除效果，能够显著地降低液体环境中的溶解氧水平，从而缓解益生菌的氧压力。该葡聚糖来源于公认安全的肠膜明串珠菌肠膜亚种，有望在益生菌及相关的食品行业中得到广泛应用。
生物材料保藏信息：
本发明提供的肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)BD3749，已于2014年11月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101，分类命名为：肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)，该菌株的保藏编号为：CGMCC No.10064。
附图说明
图1为本发明α-葡聚糖的单糖组成色谱测定结果；
图2为本发明α-葡聚糖的核磁共振氢谱图；
图3为本发明α-葡聚糖的溶解氧排除效应结果。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明进行详细的解释说明。
实施例1
一种具有氧压力排除效应的α-葡聚糖的制备方法，该方法包括以下步骤：
(1)将肠膜明串珠菌CGMCC10064按3％(v/v)的接种量接种到TYC培养基中，30℃下振荡发酵培养48h，振荡的速度为180rpm，得到发酵液；
其中，肠膜明串珠菌CGMCC10064种子液的制备方法如下：将肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)CGMCC10064的冻干粉用少量无菌蒸馏水溶解，用接种环取一环划线于含5％蔗糖的MRS固体培养基(购买自OXOID，英国)，30℃好氧培养48h取出，用接种环挑取单菌落放入10mL含5％蔗糖的MRS液体培养基(购买自OXOID，英国)，运用涡旋振荡器将菌落均匀分散于液体培养基内，30℃，180rpm振荡培养24h取出，以3％(v/v)接种量接种于含5％蔗糖的MRS液体培养基(购买自OXOID，英国)，30℃，180rpm振荡培养24h后，将培养物15000rpm离心10min，弃去上清，菌体用无菌蒸馏水洗涤2次后，用原培养体积的无菌蒸馏水悬浮，得到发酵用的种子(亦称肠膜明串珠菌种子液)，种子液中的菌浓度为0.5x109fu/mL。所述肠膜明串珠菌CGMCC10064的冻干粉由以下方法制备：挑取2个菌落，接种于300ml的10％(w/w)的脱脂乳溶液里30℃培养4h，-80℃预冻过夜，-20℃冷冻干燥。
TYC合成培养基(胰蛋白胨1.5％、酵母提取物0.5％、蔗糖5％、Na2HPO4·12H2O0.2％、乙酸钠2％、氯化钠0.1％、碳酸氢钠0.2％、硫酸钠0.01％、L-胱氨酸0.02％，所述百分比为质量百分比(Wade et al.,1986)，其制备方法为：将胰蛋白胨15g、酵母提取物5g、蔗糖50g、Na2HPO4·12H2O 2g、乙酸钠20g、氯化钠1g、碳酸氢钠2g、硫酸钠0.1g、L-胱氨酸0.2g与1L蒸馏水混匀，充分溶解后，灭菌即得所需蔗糖浓度的合成培养基。
(2)将步骤(1)的发酵液用4倍体积于发酵液体积的无菌水稀释，15000g离心10min，取上清液，经透析袋(截留分子量14000Da)透析过夜后，将透析袋的溶液中加入3倍体积于上清液体积的无水乙醇，冷藏条件下(4℃)静置过夜，15000g离心10min，收集沉淀物并溶于水后，真空冷冻干燥，即得。经称重与计算，所得α-葡聚糖的产量为16.8g/L。
使用高效液相色谱图测定所得α-葡聚糖单糖组成，测定结果如图1所示。从图1可以看出，所得α-葡聚糖只由一种类型的单糖组成。并使用核磁共振测定α-葡聚糖的糖苷键组成，测定结果如图2所示。
实施例2
一种具有氧压力排除效应的α-葡聚糖的制备方法，该方法包括以下步骤：
(1)将肠膜明串珠菌CGMCC10064按2％(v/v)的接种量接种到TYC培养基中，28℃下振荡发酵培养72h，振荡的速度为200rpm，得到发酵液；
其中，肠膜明串珠菌CGMCC10064种子液的制备方法如下：将肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)CGMCC10064的冻干粉用少量无菌蒸馏水溶解，用接种环取一环划线于含4％蔗糖的MRS固体培养基(购买自OXOID，英国)，30℃好氧培养48h取出，用接种环挑取单菌落放入10mL含4％蔗糖的MRS液体培养基(购买自OXOID，英国)，运用涡旋振荡器将菌落均匀分散于液体培养基内，28℃，200rpm振荡培养24h取出，以2％(v/v)接种量接种于含4％蔗糖的MRS液体培养基(购买自OXOID，英国)，28℃，200rpm振荡培养24h后，将培养物15000rpm离心10min，弃去上清，菌体用无菌蒸馏水洗涤2次后，用原培养体积的无菌蒸馏水悬浮，得到发酵用的种子(亦称肠膜明串珠菌种子液)，种子液中的菌浓度为0.5x109cfu/mL。所述肠膜明串珠菌CGMCC10064的冻干粉由以下方法制备：挑取2个菌落，接种于300ml的10％(w/w)的脱脂乳溶液里30℃培养4h，-80℃预冻过夜，-20℃冷冻干燥。
TYC合成培养基(胰蛋白胨1.8％、酵母提取物0.3％、蔗糖4％、Na2HPO4·12H2O0.1％、乙酸钠1％、氯化钠0.05％、碳酸氢钠0.1％、硫酸钠0.005％、L-胱氨酸0.01％，所述百分比为质量百分比(Wade et al.,1986)，其制备方法为：将胰蛋白胨18g、酵母提取物3g、蔗糖40g、Na2HPO4·12H2O 1g、乙酸钠10g、氯化钠0.5g、碳酸氢钠1g、硫酸钠0.05g、L-胱氨酸0.1g与1L蒸馏水混匀，充分溶解后，灭菌即得所需蔗糖浓度的合成培养基。
(2)将步骤(1)的发酵液用4倍体积于发酵液体积的无菌水稀释，15000g离心10min，取上清液，经透析袋(截留分子量10000Da)透析过夜后，将透析袋的溶液中加入3倍体积于上清液体积的无水乙醇，冷藏条件下(4℃)静置过夜，12000g离心10min，收集沉淀物并溶于水后，真空冷冻干燥，即得。经称重与计算，所得α-葡聚糖的产量为16.5g/L。
实施例3
一种具有氧压力排除效应的α-葡聚糖的制备方法，该方法包括以下步骤：
(1)将肠膜明串珠菌CGMCC10064按2％(v/v)的接种量接种到TYC培养基中，32℃下振荡发酵培养72h，振荡的速度为150rpm，得到发酵液；
其中，肠膜明串珠菌CGMCC10064种子液的制备方法如下：将肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)CGMCC10064的冻干粉用少量无菌蒸馏水溶解，用接种环取一环划线于含6％蔗糖的MRS固体培养基(购买自OXOID，英国)，32℃好氧培养48h取出，用接种环挑取单菌落放入10mL含6％蔗糖的MRS液体培养基(购买自OXOID，英国)，运用涡旋振荡器将菌落均匀分散于液体培养基内，32℃，150rpm振荡培养24h取出，以2％(v/v)接种量接种于含6％蔗糖的MRS液体培养基(购买自OXOID，英国)，32℃，150rpm振荡培养24h后，将培养物15000rpm离心10min，弃去上清，菌体用无菌蒸馏水洗涤2次后，用原培养体积的无菌蒸馏水悬浮，得到发酵用的种子(亦称肠膜明串珠菌种子液)，种子液中的菌浓度为0.5x1010cfu/mL。所述肠膜明串珠菌CGMCC10064的冻干粉由以下方法制备：挑取2个菌落，接种于300ml的10％(w/w)的脱脂乳溶液里30℃培养4h，-80℃预冻过夜，-20℃冷冻干燥。
TYC合成培养基(胰蛋白胨1.2％、酵母提取物0.6％、蔗糖6％、Na2HPO4·12H2O0.3％、乙酸钠3％、氯化钠0.15％、碳酸氢钠0.3％、硫酸钠0.015％、L-胱氨酸0.03％，所述百分比为质量百分比(Wade et al.,1986)，其制备方法为：将胰蛋白胨12g、酵母提取物6g、蔗糖60g、Na2HPO4·12H2O 3g、乙酸钠30g、氯化钠1.5g、碳酸氢钠3g、硫酸钠0.15g、L-胱氨酸0.3g与1L蒸馏水混匀，充分溶解后，灭菌即得所需蔗糖浓度的合成培养基。
(2)将步骤(1)的发酵液用4倍体积于发酵液体积的无菌水稀释，12000g离心12min，取上清液，经透析袋(截留分子量15000Da)透析过夜后，将透析袋的溶液中加入3倍体积于上清液体积的无水乙醇，冷藏条件下(4℃)静置过夜，12000g离心12min，收集沉淀物并溶于水后，真空冷冻干燥，即得。经称重与计算，所得α-葡聚糖的产量为16.3g/L。
实施例4
一种具有氧压力排除效应的α-葡聚糖的制备方法，该方法包括以下步骤：
(1)将肠膜明串珠菌CGMCC10064按3％(v/v)的接种量接种到TYC培养基中，30℃下振荡发酵培养36h，振荡的速度为180rpm，得到发酵液；
其中，肠膜明串珠菌CGMCC10064种子液的制备方法如下：将肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)CGMCC10064的冻干粉用少量无菌蒸馏水溶解，用接种环取一环划线于含5％蔗糖的MRS固体培养基(购买自OXOID，英国)，30℃好氧培养48h取出，用接种环挑取单菌落放入10mL含5％蔗糖的MRS液体培养基(购买自OXOID，英国)，运用涡旋振荡器将菌落均匀分散于液体培养基内，30℃，180rpm振荡培养24h取出，以3％(v/v)接种量接种于含5％蔗糖的MRS液体培养基(购买自OXOID，英国)，30℃，180rpm振荡培养24h后，将培养物15000rpm离心10min，弃去上清，菌体用无菌蒸馏水洗涤2次后，用原培养体积的无菌蒸馏水悬浮，得到发酵用的种子(亦称肠膜明串珠菌种子液)，种子液中的菌浓度为0.5x1010cfu/mL。所述肠膜明串珠菌CGMCC10064的冻干粉由以下方法制备：挑取2个菌落，接种于300ml的10％(w/w)的脱脂乳溶液里30℃培养4h，-80℃预冻过夜，-20℃冷冻干燥。
TYC合成培养基(胰蛋白胨1.8％、酵母提取物0.5％、蔗糖5％、Na2HPO4·12H2O0.2％、乙酸钠2％、氯化钠0.1％、碳酸氢钠0.2％、硫酸钠0.01％、L-胱氨酸0.02％，所述百分比为质量百分比(Wade et al.,1986)，其制备方法为：将胰蛋白胨18g、酵母提取物5g、蔗糖50g、Na2HPO4·12H2O 2g、乙酸钠20g、氯化钠1g、碳酸氢钠2g、硫酸钠0.1g、L-胱氨酸0.2g与1L蒸馏水混匀，充分溶解后，灭菌即得所需蔗糖浓度的合成培养基。
(2)将步骤(1)的发酵液用4倍体积于发酵液体积的无菌水稀释，18000g离心8min，取上清液，经透析袋(截留分子量14000Da)透析过夜后，将透析袋的溶液中加入3倍体积于上清液体积的无水乙醇，冷藏条件下(4℃)静置过夜，18000g离心8min，收集沉淀物并溶于水后，真空冷冻干燥，即得。经称重与计算，所得α-葡聚糖的产量为16.5g/L。
实施例5
一种具有氧压力排除效应的α-葡聚糖的制备方法，该方法包括以下步骤：
(1)将肠膜明串珠菌CGMCC10064按3％(v/v)的接种量接种到TYC培养基中，28℃下振荡发酵培养48h，振荡的速度为200rpm，得到发酵液；
其中，肠膜明串珠菌CGMCC10064种子液的制备方法如下：将肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)CGMCC10064的冻干粉用少量无菌蒸馏水溶解，用接种环取一环划线于含5％蔗糖的MRS固体培养基(购买自OXOID，英国)，28℃好氧培养48h取出，用接种环挑取单菌落放入10mL含5％蔗糖的MRS液体培养基(购买自OXOID，英国)，运用涡旋振荡器将菌落均匀分散于液体培养基内，28℃，180rpm振荡培养24h取出，以2％(v/v)接种量接种于含5％蔗糖的MRS液体培养基(购买自OXOID，英国)，30℃，180rpm振荡培养24h后，将培养物15000rpm离心10min，弃去上清，菌体用无菌蒸馏水洗涤2次后，用原培养体积的无菌蒸馏水悬浮，得到发酵用的种子(亦称肠膜明串珠菌种子液)，种子液中的菌浓度为0.5x1010cfu/mL。所述肠膜明串珠菌CGMCC10064的冻干粉由以下方法制备：挑取2个菌落，接种于300ml的10％(w/w)的脱脂乳溶液里30℃培养4h，-80℃预冻过夜，-20℃冷冻干燥。
TYC合成培养基(胰蛋白胨1.5％、酵母提取物0.5％、蔗糖5％、Na2HPO4·12H2O0.2％、乙酸钠2％、氯化钠0.1％、碳酸氢钠0.2％、硫酸钠0.01％、L-胱氨酸0.02％，所述百分比为质量百分比(Wade et al.,1986)，其制备方法为：将胰蛋白胨15g、酵母提取物5g、蔗糖50g、Na2HPO4·12H2O 2g、乙酸钠20g、氯化钠1g、碳酸氢钠2g、硫酸钠0.1g、L-胱氨酸0.2g与1L蒸馏水混匀，充分溶解后，灭菌即得所需蔗糖浓度的合成培养基。
(2)将步骤(1)的发酵液用4倍体积于发酵液体积的无菌水稀释，15000g离心8min，取上清液，经透析袋(截留分子量15000Da)透析过夜后，将透析袋的溶液中加入3倍体积于上清液体积的无水乙醇，冷藏条件下(4℃)静置过夜，15000g离心8min，收集沉淀物并溶于水后，真空冷冻干燥，即得。经称重与计算，所得α-葡聚糖的产量为16.4g/L。
效果实施例1α-葡聚糖糖苷键比例的测定
将实施例1～5制备的α-葡聚糖进行1H-NMR的检测(如图2所示)，通过比较色谱图上的α-(1,6)，α-(1,3)，α-(1,4)吸收峰处的积分面积来确定α-葡聚糖中糖苷键的摩尔比关系，并根据分子排阻色谱法方法测定α-葡聚糖的相对分子质量。各样品的测定结果如表1所示。
表1
α-葡聚糖样品 α-(1,6) α-(1,3) α-(1,4) 相对分子质量Da
实施例1 1 0.48 0.41 1.0x10<sup>5</sup>～5.0x10<sup>6</sup>
实施例2 1 0.46 0.43 2.0x10<sup>5</sup>～5.0x10<sup>6</sup>
实施例3 1 0.45 0.45 1.0x10<sup>5</sup>～5.0x106
实施例4 1 0.46 0.44 1.0x10<sup>5</sup>～5.0x10<sup>6</sup>
实施例5 1 0.47 0.43 1.0x10<sup>5</sup>～2.0x10<sup>6</sup>
从表1可以看出，α-葡聚糖中糖苷键α-(1,6)，α-(1,3)，α-(1,4)的摩尔比例为1:0.45～0.5:0.4～0.45，α-葡聚糖的相对分子质量为1.0x105～5.0x106Da。
效果实施例2α-葡聚糖对水溶液中溶解氧的排除效应
将上述实施例1所得的α-葡聚糖按照终浓度0、0.5、1、2、4、8g/L溶解于无菌蒸馏水中，搅拌至充分溶解后即制得系列浓度梯度的α-葡聚糖水溶液。室温下静置2h后，使用溶解氧电极对α-葡聚糖水溶液中的溶解氧含量进行测定，获得不同浓度α-葡聚糖溶液中的溶解氧含量，根据测定结果绘制溶解氧含量(mg/L)与α-葡聚糖浓度之间的关系曲线，结果如附图3所示。从图3可以看出，随着α-葡聚糖浓度的增加，溶液中的溶解氧含量是逐渐下降的，由此可以看出，α-葡聚糖具有很好的溶解氧排除效果。
效果实施例2α-葡聚糖在液体培养基中的氧压力释放效果
将上述实施例1所得的α-葡聚糖经0.22μm滤膜过滤除菌后，以5g/L的终浓度加入到上述TYC培养基中(同时设置不加α-葡聚糖的对照组)。
按照实施例1步骤(1)制备方法，制备受试菌肠膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)CGMCC10064和ATCC10830a的种子液，按5％(v/v)的接种量接种到上述TYC培养基中(含α-葡聚糖组和对照组)，30℃、180rpm振荡培养48h后取样，经梯度稀释后以平板计数法进行计数，同时测定pH值。结果如表2所示。
表2
从表2可以看出，将α-葡聚糖以一定浓度加入到培养基中，即能显著降低液体培养基中的溶解氧含量，有效地解除氧压力，从而降低了发酵液的pH，促进了氧敏感性微生物在有氧条件下的生长。
效果实施例3α-葡聚糖对益生菌(乳杆菌)的生长促进作用
以植物乳杆菌(Lb.plantarum)ST-III为例
(1)首先进行菌种活化，将冷冻保存的Lb.plantarum ST-III菌种接种于MRS液体培养基中，在37℃下培养18-22h，如此传代培养2-3次得到活化的菌种；所述的MRS液体培养基组成如下：10g蛋白胨、10g牛肉膏、5g酵母浸粉、20g葡萄糖、2g磷酸氢二钾、5g乙酸钠、2g柠檬酸三钠、1g吐温80、200mg硫酸镁、54mg硫酸锰与1000mL蒸馏水，调节pH至6.5，121℃灭菌15min。
(2)对步骤(1)得到的培养物，通过离心收集菌体，经蒸馏水清洗三次后进行分装，分装以后的菌体沉淀经冻干后保存。离心之前取少量样品通过平板倾注的方法进行细胞计数(计数结果用于调整两种发酵菌种的接种数量及比例)。
(3)在TYC培养基中测试经分离纯化的α-葡聚糖对于益生菌ST-III生长的促进作用。合成培养基TYC(胰蛋白胨1.5％、酵母提取物0.5％、蔗糖5％、Na2HPO4·12H2O 0.2％、乙酸钠2％、氯化钠0.1％、碳酸氢钠0.2％、硫酸钠0.01％、L-胱氨酸0.02％，所述百分比为质量百分比(Wade et al.,1986)的制备：将胰蛋白胨15g、酵母提取物5g、蔗糖50g、Na2HPO4·12H2O 2g、乙酸钠20g、氯化钠1g、碳酸氢钠2g、硫酸钠0.1g、L-胱氨酸0.2g与1L蒸馏水混匀，充分溶解后，灭菌即得所需的TYC合成培养基。
(4)将获得的α-葡聚糖产物经0.22μm滤膜过滤除菌后，以5g/L的终浓度加入到上述TYC培养基中(同时设置不加α-葡聚糖的对照组)。
(5)取步骤(1)中制备的种子液按5％(v/v)的接种量接种到上述TYC培养基中(含α-葡聚糖组和对照组)，30℃、180rpm振荡培养48h后取样，经梯度稀释后以平板计数法进行计数，同时测定pH值。结果如表3所示。
表3
组别 pH LogCFU/mL(ST-III)
对照组 5.48±0.02 7.60±0.07
实验组 4.95±0.03 8.55±0.10
从表3可以看出，将α-葡聚糖以一定浓度加入到培养基中，即能显著降低液体培养基中的溶解氧含量，有效地解除氧压力，从而降低了发酵液的pH，促进了Lb.plantarum ST-III在有氧条件下的生长。
效果实施例4α-葡聚糖对益生菌(双歧杆菌)的生长促进作用
以长双歧杆菌(B.longum subsp.longum)NCC2705为例，
(1)首先进行菌种活化，将冷冻保存的B.longum NCC2705菌种接种于TPY液体培养基中，在37℃下培养18-22h，如此传代培养2-3次得到活化的菌种；所述TPY液体培养基配方：水解酪蛋白10g、植物胨5g、酵母粉2g、葡萄糖5g、磷酸氢二钾(K2HPO4·7H2O)2g、氯化镁(MgCl2·6H2O)0.5g、硫酸锌(ZnSO4·7H2O)0.25g、氯化钙(CaCl2)0.15g、氯化铁(FeCl3)0.1mg、半胱氨酸-盐酸0.5g溶解于1000mL蒸馏水中，加入1mL吐温-80后调节pH至6.5，121℃灭菌15min。
(2)对步骤(1)得到的培养物，通过离心收集菌体，经蒸馏水清洗三次后进行分装，分装以后的菌体沉淀经冻干后保存。离心之前取少量样品通过平板倾注的方法进行细胞计数(计数结果用于调整两种发酵菌种的接种数量及比例)。
(3)在TYC培养基中测试纯化的α-葡聚糖对于双歧杆菌NCC2705生长的促进作用。合成培养基TYC(胰蛋白胨1.5％、酵母提取物0.5％、蔗糖5％、Na2HPO4·12H2O 0.2％、乙酸钠2％、氯化钠0.1％、碳酸氢钠0.2％、硫酸钠0.01％、L-胱氨酸0.02％，所述百分比为质量百分比(Wade et al.,1986)的制备：将胰蛋白胨15g、酵母提取物5g、蔗糖50g、Na2HPO4·12H2O 2g、乙酸钠20g、氯化钠1g、碳酸氢钠2g、硫酸钠0.1g、L-胱氨酸0.2g与1L蒸馏水混匀，充分溶解后，灭菌即得所需的TYC合成培养基。
(4)将获得的α-葡聚糖产物经0.22μm滤膜过滤除菌后，以5g/L的终浓度加入到上述TYC培养基中(同时设置不加α-葡聚糖的对照组)。
(5)取步骤(1)中制备的种子液按5％(v/v)的接种量接种到上述TYC培养基中(含α-葡聚糖组和对照组)，30℃、180rpm振荡培养48h后取样，经梯度稀释后以平板计数法进行计数，同时测定pH值。结果如表4所示。
表4
从表4可以看出，将α-葡聚糖以一定浓度加入到培养基中，即能显著降低液体培养基中的溶解氧含量，有效地解除氧压力，从而降低了发酵液的pH，促进了B.longum NCC2705在有氧条件下的生长。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明实质内容上所作的任何修改、等同替换和简单改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种具有氧压力排除效应的α-葡聚糖，其特征在于，所述α-葡聚糖由α-(1,6)糖苷键连接而成的主链，及α-(1,4)、α-(1,3)糖苷键连接而成的支链组成，糖苷键α-(1,6)、α-(1,4)、α-(1,3)的摩尔比例为1：0.45～0.5：0.4～0.45，其相对分子质量为1.0x105～5.0x106Da。
2.根据权利要求1所述的具有氧压力排除效应的α-葡聚糖，其特征在于，所述α-葡聚糖由肠膜明串珠菌CGMCC10064发酵生成。
3.一种制备权利要求1所述的具有氧压力排除效应的α-葡聚糖的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
(1)将肠膜明串珠菌CGMCC10064接种到TYC培养基中，28～32℃下发酵培养后，得到发酵液；
(2)将步骤(1)的发酵液稀释后离心，取上清液，经透析袋透析后加入无水乙醇离心，收集沉淀物并溶于水后，真空冷冻干燥，即得。
4.根据权利要求3所述的具有氧压力排除效应的α-葡聚糖的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，将肠膜明串珠菌CGMCC10064冻干粉活化获得肠膜明串珠菌CGMCC10064种子液进行接种。
5.根据权利要求3所述的具有氧压力排除效应的α-葡聚糖的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，肠膜明串珠菌CGMCC10064的接种量为1.0x107～1.0x108cfu/mL。
6.根据权利要求3所述的具有氧压力排除效应的α-葡聚糖的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，TYC培养基的配方组成为：胰蛋白胨1.2～1.8％、酵母提取物0.3～0.6％、蔗糖4～6％、Na2HPO4·12H2O 0.1～0.3％、乙酸钠1～3％、氯化钠0.05～0.15％、碳酸氢钠0.1～0.3％、硫酸钠0.005～0.015％、L-胱氨酸0.01～0.03％，余量为水。
7.根据权利要求3所述的具有氧压力排除效应的α-葡聚糖的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述发酵培养为振荡培养，振荡的速度为150～200rpm，时间为36～72h。
8.根据权利要求3所述的具有氧压力排除效应的α-葡聚糖的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，离心的速度为12000～18000g，时间为8～12min。
9.根据权利要求3所述的具有氧压力排除效应的α-葡聚糖的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，透析袋的截留分子量为1.0x104～1.5x104Da。
10.权利要求1所述的具有氧压力排除效应的α-葡聚糖在制备益生菌生长促进剂中的应用。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114686544A (zh) * 2020-12-30 2022-07-01 广东省科学院生物工程研究所 利用三水相体系自发调控水解生成特定分子量的α-葡聚糖的方法及其应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105349477A (zh) * 2015-12-21 2016-02-24 光明乳业股份有限公司 一种肠膜明串珠菌及其制备方法和应用
CN105440153A (zh) * 2015-12-21 2016-03-30 光明乳业股份有限公司 一种肠膜明串珠菌的水不溶性胞外多糖及其制备方法
CN105483177A (zh) * 2015-12-21 2016-04-13 光明乳业股份有限公司 一种肠膜明串珠菌的水不溶性胞外多糖的制备方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105349477A (zh) * 2015-12-21 2016-02-24 光明乳业股份有限公司 一种肠膜明串珠菌及其制备方法和应用
CN105440153A (zh) * 2015-12-21 2016-03-30 光明乳业股份有限公司 一种肠膜明串珠菌的水不溶性胞外多糖及其制备方法
CN105483177A (zh) * 2015-12-21 2016-04-13 光明乳业股份有限公司 一种肠膜明串珠菌的水不溶性胞外多糖的制备方法

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114686544A (zh) * 2020-12-30 2022-07-01 广东省科学院生物工程研究所 利用三水相体系自发调控水解生成特定分子量的α-葡聚糖的方法及其应用

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