CN105021737B - 一种同时检测乳制品中双氰胺和三聚氰胺含量的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种同时检测乳制品中双氰胺和三聚氰胺含量的方法，所述方法包括如下步骤：（1）标准溶液制备；（2）待测样品处理：将待测样品溶解于水中，经除蛋白质→除脂类→净化→过滤处理后得到待测液；（3）采用高效液相色谱‑串联质谱法进行检测。本发明所述的方法能够同时对乳制品中的双氰胺和三聚氰胺进行定量定性分析，具有准确、灵敏、回收率高等特点。

Description

一种同时检测乳制品中双氰胺和三聚氰胺含量的方法

技术领域

本发明属于化学分析技术领域，进一步属于食品安全检测领域，具体涉及一种同时检测乳制品中双氰胺和三聚氰胺含量的方法。

背景技术

目前，食品中非蛋白含氮物质的检测尚未引起足够重视，尤其是乳制品中的非蛋白氮的残留、掺假等问题严重影响了乳制品企业乃至整个行业的生存发展，危害人体健康，影响人们的正常生活。2013年1月25日，美国《华尔街日报》报道，新西兰乳品巨头恒天然集团出产的部分牛奶和奶粉中，检测出少量的有毒化学物质双氰胺(dicyandiamide，简称DCD)。一方面，新西兰声称含有少量双氰胺残留物的食品对人体无害；另—方面，又下令禁售含有双氰胺的奶类制品。全球60%的奶制品企业和乳品供应商采用新西兰奶源，新西兰乳制品占到中国全进口婴幼儿食品的40%左右。在国内“三鹿奶粉事件”发生后国人对国产婴幼儿奶粉信心全失的情况下，无论涉事各方面如何解释双氰胺的低毒性甚至是无毒性，此次事件无疑引发了中国民众对奶制品新一轮的恐慌且再次引起人们对乳制品安全问题的关注。

对健康的影响不能以有关方面解释的“毒不死”为标准。至于双氰胺能否致癌、致畸、致突变、过敏，以及损害人体器官，很少有实验数据。对健康而言，“没有实验数据”的时候，就更应该采取保守谨慎的态度。而且在奶制品行业信誉低下、食品安全极度敏感的社会现实面前，制定双氰胺的残留检测安全标准是不得不做的事情。

双氰胺是一种重要的化工产品中间体，别名二氰二胺、二聚氨基氰（是氰胺的二聚体，也是胍的氰基衍生物），其病理实验数据显示：小鼠经口LD₅₀>4000 mg/kg，家兔经口LD₅₀>3000 mg/kg，即如果给一批1kg的小鼠喂养双氰胺超过4000 mg就会导致半数小鼠中毒死亡。尽管双氰胺的毒性虽小，但大量或长期接触对人体的危害是不可忽视的。特别对于婴幼儿来说，各个脏器尚未发育完全，肝脏的代谢功能、肾脏排泄系统均未完善，体内的物质代谢与成人不同，毒性反应也有差异，有毒物质的长期累积势必对其脏器势有一定的损害，而且毒物的三致“致畸、致癌、致突变”性质的确定是一个长期的体内过程，那么婴幼儿在成长过程中就必须杜绝有毒有害物质的摄入。

目前，我国现已有GB/T 22388—2008原料乳及乳制品中三聚氰胺检测方法标准，但尚未建立婴幼儿奶粉中双氰胺残留量检测标准，针对同时检测婴幼儿奶粉中三聚氰胺和双氰胺的文献报道也极少。因此，建立一种快速准确并能同时检测乳制品中三聚氰胺和双氰胺残留量的方法迫在眉睫，可为准确客观评价乳制品中双氰胺和三聚氰胺含量提供技术手段；对乳制品安全性的评价及保护人们的身体健康具有重要意义。

发明内容

本发明目的在于提供一种同时检测乳制品中双氰胺和三聚氰胺含量的方法。该目的是这样实现的：所述的一种同时检测乳制品中双氰胺和三聚氰胺含量的方法包括如下步骤：

（1）标准溶液制备：先分别制备双氰胺和三聚氰胺标准储备液；再将两种储备液混合稀释为标准混合溶液；最后将标准混合溶液进行梯度稀释，得到标准混合工作溶液系列；

（2）待测样品处理：将待测样品溶解于水中，加入蛋白质沉淀剂，涡旋、离心得到上清液，加入除脂剂后涡旋、离心，弃除脂剂层，在清液中加入净化包，涡旋、离心得上清液，最后经微孔滤膜过滤，得到待测液；

（3）采用高效液相色谱-串联质谱法进行检测，将步骤（1）所述的标准混合工作溶液系列和步骤（2）所述的待测液分别进样，先制作标准曲线，根据标准曲线和所述待测液的进样结果来计算双氰胺和三聚氰胺的含量；其中：

色谱条件为：

色谱柱：C₁₈，150mm×2.1mm×5μm；

流速：0.2 mL/min；

柱温：25℃；

进样量：5 μL；

流动相A：10mmol/L乙酸铵水溶液用乙酸调节pH至3.0，流动相B：乙腈；梯度洗脱，洗脱程序为洗脱程序如表1所示。

表1高效液相色谱梯度洗脱条件

质谱条件为：

电喷雾电离源（ESI）；

扫描方式：正离子扫描；

检测方式：多反应监测（MRM）；

电喷雾电压：500 V；

干燥气温度：325℃；

干燥气流量：6L/min；

鞘气温度：380℃；

鞘气流量：10 L/min；

毛细管电压：3500 V；

质谱参数如表2所示。

表2 质谱参数

名称	[M+H]+离子峰	锥孔电压（V）	定量离子（碰撞能量）	定性离子（碰撞能量）
					双氰胺	85.2	23	68.1（17）	43.1（13）
三聚氰胺	127.1	97	85.1（18）	68.1（34）

由于乳制品中双氰胺和三聚氰胺的含量较低，特别是双氰胺有时仅为痕量，传统方法很难检测出来，本发明采用的高效液相色谱-串联质谱的方法克服了传统检测方法的不足，满足了食品中微量双氰胺和三聚氰胺的检测要求，且具有专属性强、灵敏度高的特点。

附图说明

图1为Agela Venusil AS-T C₁₈总离子流图；

图中，2.323为双氰胺离子峰，8.458为三聚氰胺离子峰。

图2为三聚氰胺定量离子85.1的离子图；

图3为三聚氰胺定性离子68.1的离子图；

图4为双氰胺定量离子68.1的离子图；

图5为双氰胺定性离子43.1的离子图；

图6为某品牌幼儿配方奶粉的总离子流图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明作进一步说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换，均落入本发明保护范围。

本发明所述的一种同时检测乳制品中双氰胺和三聚氰胺含量的方法包括如下步骤：

（1）标准溶液制备：先分别制备双氰胺和三聚氰胺标准储备液；再将两种储备液混合稀释为标准混合溶液；最后将标准混合溶液进行梯度稀释，得到标准混合工作溶液系列。

作为本发明的一种优选，所述标准溶液的制备方法为：准确称取双氰胺和三聚氰胺标准品各25.0mg，用甲醇分别溶解定容至25.0mL，得到1000 μg/mL的标准储备液；移取所述标准储备液各1.0mL混合，用去离子定容至100mL，制成10 μg/mL的标准混合溶液；最后用阴性乳制品基质溶液进行梯度稀释，得到标准混合工作溶液系列。标准混合工作溶液系列双氰胺的质量浓度为1～209 ng/mL，三聚氰胺的质量浓度为2～420 ng/mL。

（2）待测样品处理：将待测样品溶解于水中，加入蛋白质沉淀剂，涡旋、离心得到上清液，加入除脂剂后涡旋、离心，弃除脂剂层，在清液中加入净化包，涡旋、离心得上清液，最后经微孔滤膜过滤，得到待测液；

由于乳制品，特别是奶粉成分复杂，蛋白质和脂类蛋白质和脂肪类含量较高，因此在奶粉的前处理过程中，非常重要就是除去蛋白质和脂类。现常用的除去蛋白质的方法为选择某种蛋白质沉淀剂使蛋白质沉淀，然后离心、过滤除去。常用的蛋白质沉淀剂包括三氯乙酸溶液、氨水乙腈及其水溶液、乙腈。通过试验，比较三种沉淀剂的沉淀效果，结果显示：应用三氯乙酸提取后要运用固相萃取小柱进行净化和浓缩，固相萃取小柱对双氰胺和三聚氰胺同时提取效果不好；用氨化乙腈溶液和乙腈同时提取奶粉中双氰胺和三聚氰胺简单方便，提取液可不用进行固相萃取。其中，5%氨化乙腈和乙腈进行提取的效果没有明显区别，乙腈略好一些，但因无需配制溶液，乙腈的使用更方便一些。

去除溶液中脂类物质的方法是使用除脂剂萃取脂类物质，再涡旋、离心分离。常用除脂剂包括正己烷和石油醚等，一般除脂1次即可，但为保证脂类物质去除完全且基质干扰较少，本发明优选使用正己烷除脂2次。

经过去除蛋白质和脂类物质后，为了进一步消除基质的干扰，使用净化包进行净化处理。常用的净化包为Agilent QuEChERs净化包和月旭Welchrom QuChERS-双氰胺净化管。但是，后者对双氰胺的净化效果较好，对三聚氰胺的净化效果较差，因此本发明优选Agilent QuEChERs净化包（25mg C₁₈和150mg MgSO₄）对提取液进行净化。

作为本发明的一种优选，所述微孔滤膜的孔径为0.2μm。

（3）采用高效液相色谱-串联质谱法进行检测，将步骤（1）所述的标准混合工作溶液系列和步骤（2）所述的待测液分别进样，先制作标准曲线，根据标准曲线和所述待测液的进样结果来计算双氰胺和三聚氰胺的含量；其中：

色谱条件为：

色谱柱：C₁₈，150mm×2.1mm×5μm；

流速：0.2 mL/min；

柱温：25℃；

进样量：5 μL；

流动相A：10mmol/L乙酸铵水溶液用乙酸调节pH至3.0，流动相B：乙腈；梯度洗脱，洗脱程序如表1所示。

质谱条件为：

电喷雾电离源（ESI）；

扫描方式：正离子扫描；

检测方式：多反应监测（MRM）；

电喷雾电压：500 V；

干燥气温度：325℃；

干燥气流量：6L/min；

鞘气温度：380℃；

鞘气流量：10 L/min；

毛细管电压：3500 V；

质谱参数如表2所示。

作为本发明的一种优选，色谱柱采用Agela Venusil AS-T C₁₈色谱柱。

检测后，乳制品中双氰胺和三聚氰胺的定性方法为：

在相同实验条件下，如果待测液中检出的色谱峰的保留时间与标准溶液中的某种组分峰的保留时间一致（表3，图1），并且所选择的两对子离子的质荷比一致，待测液的定性离子相对丰度与标准工作溶液进行比较时，相对偏差不超过表4规定的范围，则可判定样品中存在该组分。

表3双氰胺和三聚氰胺的保留时间和定性离子相对丰度

名称	保留时间（min）	丰度（%）
			双氰胺	2.323	56.5
三聚氰胺	8.458	50.3

表4 定性确定时相对离子丰度的最大允许偏差

相对离子丰度/%	＞50	＞20~50	＞10~20	≤10
					允许的相对偏差/%	±20	±25	±30	±50

检测后，乳制品中双氰胺和三聚氰胺的定量方法为：

根据标准溶液的标准混合工作溶液系列的检测结果，制作标准曲线，样品中双氰胺和三聚氰胺的质量分数用外标法定量，按公式（1）进行计算：

（1）

式中：X为样品中某种组分的质量分数，ng/g；c _i 为由标准曲线得出的样品中某种组分的质量浓度，ng/mL；c ₀为空白溶液某种组分的质量浓度，ng/mL；V为样品定容体积，mL；m为样品质量，g。

以两次平行测定的平均值为测定结果，结果精确至0.01 ng/g；两次平行测定结果之间的相对偏差不应大于10.0%。

另外，一般乳制品包括液体乳、乳粉和其他乳制品都可用本发明所述的方法同时检测双氰胺和三聚氰胺含量。

实施例1 待测样品检测

（1）仪器

液相色谱串联质谱仪：1290高效液相色谱仪（美国Agilent公司），Agilent 6460三重四级杆液相色谱-串联质谱仪，配有电喷雾离子源（美国Agilent公司）；分析天平（瑞士梅特勒；型号：AB204-S）；涡旋混匀器；离心机；具螺旋盖聚四氟乙烯离心管（50mL）。

（2）试剂与材料

甲醇（色谱纯，Dikma）；乙腈（色谱纯，Dikma）；乙酸（分析纯）；甲酸（分析纯）；超纯水(电阻率≥18.2MΩ·cm)；三氯乙酸（分析纯）；氨水（分析纯）。

色谱柱：Agela Venusil AS-T C18（150×2.1mm，5μm）； Agilent QuEChERs基质分散剂净化管；针筒和滤头；高纯氮气(纯度大于99.999%)。

待测样品：某品牌幼儿配方奶粉。

（3）标准溶液制备

双氰胺和三聚氰胺标准储备液的配制：准确称取标准品各25.0mg，用甲醇分别溶解定容至25.0mL，得到约1000μg/mL的标准储备液，于-18℃下冷冻保存。

标准混合工作溶液的配制：分别移取1000μg/mL标准储备液1.0mL混合，用去离子定容于100mL容量瓶中，制成浓度为10μg/mL的标准混合溶液，于4℃下保存。最后用阴性乳制品基质溶液进行梯度稀释，得到标准混合工作溶液系列。标准混合工作溶液系列中双氰胺的质量浓度分别为1.05、4.19、20.9、41.9、105、209ng/mL，三聚氰胺的质量浓度为2.10、8.41、42.0、84.1、210、420ng/mL。

（4）样品处理方法

称取1.0g奶粉，置于50 mL离心管中，先加入2mL去离子水，涡旋1min，超声5min，使奶粉充分溶解，再加入2mL乙腈，涡旋1min，然后再分3次加入2mL乙腈，每次加入后涡旋1min，使奶粉中蛋白质充分沉淀，10000 r/min离心10 min，将3次的上清液全部转移到另一支50 mL离心管中，加入正己烷10mL，涡旋1min，10000 r/min离心5min，弃去正己烷层，再次加入10mL正己烷重复上述除脂过程，然后取出清液2mL。

将2mL清液转移到10mL离心管，加入QuEChRS分散固相试剂包（25mg C₁₈和150mgMgSO₄），涡旋1min， 10000 r/min离心5 min，取上清液经0.2μm滤膜过滤至进样瓶中，待测定。

（4）高校液相色谱-串联质谱分析

高效液相色谱参考条件：色谱柱：Agela Venusil AS-T C₁₈（150×2.1mm，5μm）；流速：0.2 mL/min；柱温：25℃；进样量：5 μL；流动相A：10mmol乙酸铵水溶液用乙酸调节pH至3.0，流动相B：乙腈溶液；梯度洗脱条件见表1。

质谱条件：电喷雾电离源（ESI）；扫描方式：正离子扫描；检测方式：多反应监测（MRM）；电喷雾电压：500 V；干燥气温度：325℃；干燥气流量：6 L/min；鞘气温度：380℃；鞘气流量：10 L/min；毛细管电压：3500 V；质谱参数见表2。

（5）检测结果

根据标准混合溶液系列的测定结果（图1～5），以峰面积为纵坐标，质量浓度为横坐标，制作标准曲线，对校正数据进行线性回归，回归方程和相关系数见表5。根据线性关系，经过公式计算，得到某品牌幼儿配方奶粉的检测结果如表6所示。

表5 双氰胺和三聚氰胺的线性关系

名称	线性方程	线性范围（ng/mL）	相关系数
				双氰胺	A=909.235C+1339.07	1~209	0.9984
三聚氰胺	A=244.175C+1035.82	2~420	0.9992

注：线性方程中A为峰面积；C为各组分的质量浓度。

表6 样品检测结果

样品名称	双氰胺(ng/g)	三聚氰胺(ng/g)
			某品牌幼儿配方奶粉	-	20.75

根据表6可知：在某品牌幼儿配方奶粉中检测到含有三聚氰胺，其质量分数为20.75 ng/g，未检测出双氰胺。

实施例2 方法的重现性试验

采用加标法进行重现性试验。取阴性奶粉样品1.0 g，按实施例1的方法进行待测样品处理，分别加入标准品，使得双氰胺浓度为10.48 ng/mL，三聚氰胺浓度为用21.01 ng/mL，设置6个重复。在相同条件（色谱和质谱条件同实施例1）下测定双氰胺和三聚氰胺含量，连续测定3天，并计算其日内和日间的RSD%，结果如表6和表7所示。

表6 双氰胺的重现性结果（n=6）

表7三聚氰胺的重现性结果（n=6）

由表6可知，其中双氰胺3天的日内RSD分别为1.31%、2.74%和5.10%，日间RSD为4.33%；三聚氰胺3天的日内RSD分别为2.94%、3.69%和2.23%，日间RSD为3.07%，对比现有技术，该方法对两个物质均有较好的重现性。

实施例3 检测限试验

检出限定义为检测器产生的响应信号为噪声值3倍时所对应的浓度量；定量限定义为检测器产生的响应信号为噪声值10倍时所对应的浓度量，用3倍和10倍噪音值计算该方法的检出浓度和定量浓度，并通过计算公式（1），将浓度带入公式，定容体积10mL和样品量1g，换算得到样品的检出限和定量限，见表8。

表8 双氰胺和三聚氰胺的检出浓度、定量浓度、检出限和定量限

由表8可知，双氰胺定量限为25.7ng/g，三聚氰胺的定量限为7.10ng/g，该方法检出限和定量限低于国标GB/T 23888—2008中三聚氰胺的定量限10 ng/g，低于大量文献报道的双氰胺定量限50 ng/g，说明该方法有较好的灵敏度、较低的检测限，能够较好的满足痕量检测要求。

实施例4 回收率

在阴性奶粉样品中加入双氰胺，使得低质量浓度为4.19ng/mL、中等质量浓度为10.48g/mL、高质量浓度为20.98g/mL；再加入三聚氰胺，使得低质量浓度为8.41ng/mL、中等质量浓度为21.02g/mL、高质量浓度为42.03g/mL，进行回收率实验，每个质量浓度平行进行3次，得到双氰胺和三聚氰胺的回收率，见表9。

表9 双氰胺和三聚氰胺的回收率

由表9可知，双氰胺的回收率为84.75%～95.49%，优于文献报道的80.1%～88.2%和79%～83%，三聚氰胺回收率为96.13%%～100.63%，优于GB/T 223888—2008 标准回收率80%~110%，说明该方法的回收率较高。

实施例5 稳定性试验

在阴性样品中加入双氰胺标准物质使得浓度为10.48g/mL，加入三聚氰胺标准物质使得浓度为21.02 ng/mL，然后将处理好的样品放置0，6，12，24，48 h后进行检测，考察样品的稳定性，每个时间段测试3次求平均值，得到了双氰胺和三聚氰胺的稳定性实验结果，见表10。

表10 双氰胺和三聚氰胺稳定性实验结果

综上所述，本发明所述的方法可以同时测定双氰胺和三聚氰胺，该方法具有灵敏、准确、重现性好、回收率高等特点，能够满足婴幼儿奶粉中双氰胺和三聚氰胺含量检测的要求。

Claims (6)

1.一种同时检测乳制品中双氰胺和三聚氰胺含量的方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）标准溶液制备：先分别制备双氰胺和三聚氰胺标准储备液；再将两种储备液混合稀释为标准混合溶液；最后将标准混合溶液进行梯度稀释，得到标准混合工作溶液系列；

（2）待测样品处理：将待测样品溶解于水中，加入蛋白质沉淀剂乙腈或5%氨化乙腈，涡旋、离心得到上清液，加入除脂剂正己烷后涡旋、离心，弃除脂剂层，在清液中加入含25mgC₁₈、150mg MgSO₄的QuEChERs净化包，涡旋、离心得上清液，最后经孔径为0.2μm微孔滤膜过滤，得到待测液；

（3）采用高效液相色谱-串联质谱法进行检测，将步骤（1）所述的标准混合工作溶液系列和步骤（2）所述的待测液分别进样，先制作标准曲线，根据标准曲线和所述待测液的进样结果来计算双氰胺和三聚氰胺的含量；其中：

色谱条件为：

色谱柱：C₁₈，150mm×2.1mm×5μm；

流速：0.2mL/min；

柱温：25℃；

进样量：5μL；

流动相A：10mmol/L乙酸铵水溶液用乙酸调节pH至3.0，流动相B：乙腈；梯度洗脱，洗脱程序为：

质谱条件为：

电喷雾电离源ESI；

扫描方式：正离子扫描；

检测方式：多反应监测MRM；

电喷雾电压：500V；

干燥气温度：325℃；

干燥气流量：6L/min；

鞘气温度：380℃；

鞘气流量：10L/min；

毛细管电压：3500V；

质谱参数为：

。

2.根据权利要求1所述的一种同时检测乳制品中双氰胺和三聚氰胺含量的方法，其特征在于步骤（1）所述标准溶液制备的方法为：准确称取双氰胺和三聚氰胺标准品各25.0mg，用甲醇分别溶解定容至25.0mL，得到1000μg/mL的标准储备液；移取所述标准储备液各1.0mL混合，用去离子定容至100mL，制成10μg/mL的标准混合溶液；最后用阴性乳制品基质溶液进行梯度稀释，得到标准混合工作溶液系列。

3.根据权利要求1或2所述的一种同时检测乳制品中双氰胺和三聚氰胺含量的方法，其特征在于所述的标准混合工作溶液系列中双氰胺的质量浓度为1~209ng/mL，三聚氰胺的质量浓度为2~420ng/mL。

4.根据权利要求1所述的一种同时检测乳制品中双氰胺和三聚氰胺含量的方法，其特征在于所述蛋白质沉淀剂分1~4次加入。

5.根据权利要求1所述的一种同时检测乳制品中双氰胺和三聚氰胺含量的方法，其特征在于步骤（2）所述的除脂剂处理次数为1~2次。

6.根据权利要求1所述的一种同时检测乳制品中双氰胺和三聚氰胺含量的方法，其特征在于步骤（3）所述色谱柱为Venusil AS-T C₁₈色谱柱。