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CN105548433B - 液相色谱串联质谱法同时检测牛奶中多种非蛋白含氮化合物含量的方法 - Google Patents

液相色谱串联质谱法同时检测牛奶中多种非蛋白含氮化合物含量的方法 Download PDF

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CN105548433B CN201510960324.4A CN201510960324A CN105548433B CN 105548433 B CN105548433 B CN 105548433B CN 201510960324 A CN201510960324 A CN 201510960324A CN 105548433 B CN105548433 B CN 105548433B
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Abstract

本发明公开了一种液相色谱串联质谱法同时检测牛奶中多种非蛋白含氮化合物含量的方法，该方法包括：向待测样品中加入蛋白沉淀剂，涡旋，离心，向上清液中加入除脂剂，涡旋，离心，弃除脂剂层，将下清液浓缩后用氨水乙腈溶解、涡旋，过HLB固相萃取柱，收集洗脱液，浓缩，用体积比为1:9的0.15％甲酸水溶液(含5mM乙酸铵)‑乙腈混合液溶解，过滤，得待测液；配制标准混合工作溶液系列；将标准混合工作溶液系列和待测液在液相色谱串联质谱条件下分别进样，制作标准曲线，根据标准曲线计算待测液中相应非蛋白含氮化合物含量。本发明能用于同时检测地昔尼尔、双氰胺、缩二脲、环丙氨嗪和三聚氰胺中至少两种的含量，准确度高，灵敏性强。

Description

液相色谱串联质谱法同时检测牛奶中多种非蛋白含氮化合物 含量的方法
技术领域
本发明涉及一种乳制品中非蛋白含氮化合物含量的检测方法，具体涉及液相色谱串联质谱法同时检测牛奶中多种非蛋白含氮化合物含量的方法。
背景技术
乳制品是人类最古老的天然饮料之一，由于其营养丰富、容易消化吸收、物美价廉、食用方便，因此也被称为“白色血液”。乳制品中最受人青睐的当属牛奶和牛奶制品了。伴随着对牛奶营养价值的认可度不断提高，人们对其消费需求也不断增长，对其质量要求也越来越高。
牛奶含氮量一直是判定牛奶质量的一个重要指标，以凯氏定氮法为代表的测定方法可以实现对样品中粗蛋白含量的测定。但该方法只能测出含氮量而无法区分氮的来源，使得非蛋白氮掺假无法得到有效控制，不合格产品特别是掺假乳制品严重危害了人体健康，其中以三鹿的三聚氰胺事件最为突出，2012年新西兰乳品巨头恒天然也在其产品中检测发现部分奶制品中存在双氰胺残留。
目前已经发现的非蛋白含氮化合物通常具有相对无味，无色和食之无味等特点，食品生产者通常不会故意使用高毒性的化合物来进行掺假，然而，如三聚氰胺事件，即使是相对无毒的化学物质也可能会导致不可预见的对健康造成无法挽回的负面影响。因此一些国家和地区对食品中非蛋白含氮化合物的使用情况进行了明确规定：美国和欧盟规定畜产品中环丙氨嗪最高残留量为0.05mg/kg，2002年我国农业部《动物性食品中兽药残留最高限量》中规定环丙氨嗪在禽产品中最高残留限量为0.05mg/kg，在羊肌肉、脂肪、肝、肾中的最高残留限量0.3mg/kg。2011年规定乳制品中三聚氰胺的限量要求：婴幼儿配方乳粉1mg/kg，液态奶(包括原料乳)、奶粉、其他配方乳粉2.5mg/kg，含乳15％以上的其他食品2.5mg/kg。
在三聚氰胺事件和双氰胺被发现后，研究人员对其三聚氰胺、双氰胺及其类似物的测定方法展开系列的研究，分别开发了使用分光光度法，红外光谱法，气相色谱-质谱法，高效液相色谱法和液相色谱-串联质谱法的检测技术对其进行测定，我国制定系列检测标准(例如：GB 29704-2013，GB/T 22388-2008，SN/T 3032-2011)，实现对其检测技术的标准化。但这些检测所涉及的化合物数目相对比较单一。
随着人们食品安全意识的提高，按照传统的分析方法和思维，需要较长的检测周期，较多的人力和物力，检测成本高，不能满足目前化合物种类不断增加，分析通量不断提高的需求。同时也容易出现在发生突发事件后再被动应对展开检测的情况发生(例如三聚氰胺事件)。因此残留的检测范围需要从单一检测发展为多种化合物的同时定性与定量分析。
发明内容
本发明提供了一种液相色谱串联质谱法同时检测牛奶中多种非蛋白含氮化合物含量的方法，该方法解决了现有技术对非蛋白含氮化合物检出数目单一的问题。
液相色谱串联质谱法同时检测牛奶中多种非蛋白含氮化合物含量的方法，包括以下步骤：
(1)向待测样品中加入蛋白沉淀剂，涡旋，离心，取上清液；
(2)向所述上清液中加入除脂剂，涡旋，离心，弃除脂剂层，将下清液浓缩后用氨水乙腈溶解、涡旋，得待净化液；
(3)将所述待净化液过HLB固相萃取柱，收集洗脱液并将其浓缩后用体积比为1:9的0.15％甲酸水溶液-乙腈混合液溶解、定容，微孔滤膜过滤，得待测液；
所述0.15％甲酸水溶液中含有3～10mM乙酸铵；
(4)配制含有地昔尼尔、双氰胺、缩二脲、环丙氨嗪和三聚氰胺至少两种非蛋白含氮化合物的标准混合溶液，将标准混合溶液进行梯度稀释，获得标准混合工作溶液系列；
(5)将所述标准混合工作溶液系列和所述待测液在预设的液相色谱串联质谱条件下分别进样，根据标准混合工作溶液系列的检测结果制作标准曲线，再根据标准曲线和待测液的检测结果计算待测液中相应非蛋白含氮化合物的含量；
其中，液相色谱条件为：
色谱柱：Waters XBridge HILIC，4.6mm×150mm，3.5μm；
流动相A：0.15％甲酸水溶液，含3～10mM乙酸铵；
流动相B：乙腈；
流速：0.4mL/min；
进样量：10μL；
柱温：40℃；
梯度洗脱程序：①0min：10％A，90％B；
②3.0min：50％A，50％B；
③8.0min：50％A，50％B；
④9.0min：10％A，90％B；
⑤20.0min：10％A，90％B；
质谱条件为：
离子源：电喷雾离子源；
扫描方式：正离子扫描；
监测方式：多反应监测；
电喷雾电压：3500V；
离子源温度：250℃；
干燥气温度：高纯氮气，250℃；
干燥气流量：高纯氮气，16L/min；
雾化气压力：高纯氮气，275.8kPa；
鞘气温度：高纯氮气，350℃；
鞘气流量：高纯氮气，10L/min；
质谱参数为：
⑥地昔尼尔：定量离子对为191.1/150.0，碰撞能量为21；定性离子对为191.1/109.1，碰撞能量为31；
⑦双氰胺：定量离子对为85.1/68.1，碰撞能量为20；定性离子对为85.1/43.1，碰撞能量为22；
⑧缩二脲：定量离子对为104.2/61.0，碰撞能量为9；定性离子对为104.2/44.1，碰撞能量为37；
⑨环丙氨嗪：定量离子对为167.2/85.1，碰撞能量为20；定性离子对为167.2/125.1，碰撞能量为18；
⑩三聚氰胺：定量离子对为127.1/85.1，碰撞能量为19；定性离子对为127.1/68.1，碰撞能量为36。
本发明能用于检测地昔尼尔、双氰胺、缩二脲、环丙氨嗪和三聚氰胺中至少两种非蛋白含氮化合物的含量，并且以S/N等于10计，对牛奶样品中各非蛋白含氮化合物的测定定量限可达：地昔尼尔0.5μg/kg，双氰胺2.5μg/kg，缩二脲20μg/kg，环丙氨嗪5μg/kg，三聚氰胺15μg/kg，准确度高，灵敏性强。
本发明经蛋白沉淀、脱脂后，采用氨水乙腈配合HLB固相萃取进行净化。与乙腈相比，采用氨水乙腈不仅能提高待净化液在HLB固相萃取柱上的洗脱效率，还能提高回收率。而与QuEChERS净化技术以及其他固相萃取柱(如MCX、C18)相比，采用HLB固相萃取柱进行净化时，对五种非蛋白含氮化合物的回收率均能达到80％以上。
本发明在综合考察乙腈，甲醇，0.15％甲酸水溶液，0.15％甲酸水溶液(含3～10mM乙酸铵)为定容溶液和流动相时的分离、谱峰峰形和强度等情况时发现，流动相为乙腈和0.15％甲酸水溶液(梯度洗脱)时，谱峰的峰形和强度最好，加入乙酸铵后可进一步明显提高各化合物的信号强度(其中地昔尼尔的信号强度提高近50倍)。研究发现，地昔尼尔谱峰峰形受到外界因素的影响较大，当定容溶液与流动相初始溶液一致时，地昔尼尔谱峰峰形较好，二者不一致则会出现“分叉”峰。因此步骤(3)中采用的定容溶液与流动相初始溶液相一致。
作为进一步优选，所述三聚氰胺-15N3内标物的添加量为50～200ng；更优选为100ng。
作为进一步优选，所述三聚氰胺-15N3内标物的质谱参数为：定性离子对为130.2/87.1，碰撞能量为19。
作为优选，步骤(1)中，所述蛋白沉淀剂为乙腈。与常规的三氯乙酸和甲醇相比，采用乙腈作为蛋白沉淀剂时，既便于对后续的下清液进行快速浓缩，提高目标检测物的信号响应程度，又能对待测样品中的蛋白质实现较为彻底的沉淀，避免蛋白质残留影响检测结果。
作为进一步优选，乙腈与待测样品的混合体积比为(15～20)：1。
作为优选，步骤(2)中，所述除脂剂为正己烷。在涡旋过程中，大量脂类会被萃取入正己烷层中，在不影响回收率的同时，大大降低了杂质背景的干扰。
使用乙腈饱和的正己烷进行脱脂处理，可以进一步提高检测回收率。
作为进一步优选，正己烷与所述上清液的混合体积比为(1～1.5)：2。
作为优选，步骤(2)中，将所述下清液浓缩后用3～10％氨水乙腈溶解；更优选为5％氨水乙腈。采用上述体积分数的氨水乙腈溶液溶解再过HLB固相萃取柱时，可以实现完全洗脱，且碱性不会太强，既避免影响各化合物的稳定性，也节约试剂。
作为优选，步骤(3)中，所述0.15％甲酸水溶液中乙酸铵的浓度为5mM。乙酸铵的终浓度为5mM时，各化合物的信号强度最大。
作为优选，步骤(3)中，所述微孔滤膜的孔径为0.22μm。
在步骤(3)过柱前，一般先向HLB固相萃取柱中加入适量的氨水乙腈进行活化，使用的氨水乙腈与溶解下清液浓缩物的氨水乙腈相同。
作为优选，步骤(3)中，将所述待净化液过HLB固相萃取柱，收集一次洗脱液；再向盛装待净化液的容器中加入与待净化液等体积的洗脱溶液(即5％氨水乙腈)，洗涤、过HLB固相萃取柱，收集二次洗脱液；合并一次洗脱液和二次洗脱液，浓缩。如此避免容器内壁残留的待净化液影响最终的检测准确度和回收率。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
(1)本发明的检测方法能用于检测地昔尼尔、双氰胺、缩二脲、环丙氨嗪和三聚氰胺中至少两种非蛋白含氮化合物的含量，并且以S/N等于10计，牛奶样品中各非蛋白含氮化合物的测定定量限可达：地昔尼尔0.5μg/kg，双氰胺2.5μg/kg，缩二脲20μg/kg，环丙氨嗪5μg/kg，三聚氰胺15μg/kg，准确度高，灵敏性强。
(2)本发明采用氨水乙腈配合HLB固相萃取柱进行净化，用氨水乙腈不仅能提高待净化液在HLB固相萃取柱上的洗脱效率，还能提高回收率，而HLB固相萃取柱对五种非蛋白含氮化合物的回收率均能达到80％以上；
(3)本发明采用液相色谱-串联质谱法测定，采用内标和外标稀释法定量，线性关系良好，相关系数大于0.995；总体回收率达到78.5％～101.8％；相对标准偏差在1.3％～12.3％，检测准确度高，重现性、实用性好；利用内标法与外标法同时定量，进一步提高了检测方法的准确率；
(4)本发明采用乙腈和0.15％甲酸水溶液(含3～10mM乙酸铵)作为流动相，得到的谱峰峰形和信号强度最好，加入乙酸铵后可进一步明显提高各化合物的信号强度(其中地昔尼尔的信号强度提高近50倍)；
(5)本发明采用的定容溶液与流动相初始溶液相一致，如此避免地昔尼尔谱峰峰形出现“分叉”峰；
(6)本发明的检测方法简便快捷，消耗资源小，检测成本低，所提及的前处理过程、采用的有机溶剂以及测定所用仪器均可与现有检测方法进行很好的互补，适用于对乳制品中多种非蛋白含氮化合物进行同时测定的要求，可以为维护食品安全和保障我国乳制品质量提供有力的技术保障。
附图说明
图1为五种非蛋白含氮化合物的MRM总离子流图；
其中，intensity/cps表示信号的响应强度(cps)，T/min表示保留时间(分钟)，峰①为地昔尼尔、峰②为双氰胺、峰③为缩二脲、峰④为环丙氨嗪、峰⑤为三聚氰胺；
图2为采用体积比为1:9的0.15％甲酸水溶液(含5mM乙酸铵)-乙腈混合液作为定容溶液和流动相初始溶液时制备的基质溶液中各化合物的分离出峰、谱峰峰形和信号强度情况；
图3为采用体积比为1:9的0.15％甲酸水溶液-乙腈混合液作为定容溶液和流动相初始溶液时制备的基质溶液中各化合物的分离出峰、谱峰峰形和信号强度情况；
图4为采用体积比为1:9的0.15％甲酸水溶液-乙腈混合液作为定容溶液、采用体积比为1:9的0.15％甲酸水溶液(含5mM乙酸铵)-乙腈混合液作为流动相初始溶液时制备的基质溶液中各化合物的分离出峰、谱峰峰形和信号强度情况；
其中，横坐标“Counts vs.Acquisition time(min)”表示保留时间(分钟)，纵坐标表示信号强度。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明的技术方案作进一步的详细说明。
本发明中五种非蛋白含氮化合物的基本信息如表1所示：
表1五种非蛋白含氮化合物的基本信息
实施例1
液相色谱串联质谱法同时检测牛奶中多种非蛋白含氮化合物含量的方法，包括以下步骤：
(1)待测样品前处理：
吸取牛奶样品1.00g(精确到0.01g)于50mL具塞离心试管中，加入100ng三聚氰胺-15N3内标物，再加入乙腈至20mL，涡旋，超声，高速离心，取上清液10mL，加入7mL正己烷，涡旋，去除上层正己烷相，下清液浓缩至近干后加入3mL体积分数为5％的氨水乙腈溶液(以下简称5％氨水乙腈)进行溶解、涡旋，得待净化液；
向HLB固相萃取柱加入5mL的5％氨水乙腈进行活化，活化后将待净化液过HLB固相萃取柱，收集一次洗脱液，再向盛装待净化液的容器中加入与待净化液等体积的洗脱溶液(即5％氨水乙腈)，洗涤、过HLB固相萃取柱，收集二次洗脱液；合并一次洗脱液和二次洗脱液，减压浓缩至近干，用体积比为1:9的0.15％甲酸水溶液(含5mM乙酸铵)-乙腈混合液溶解定容至2mL，过0.22μm微孔滤膜，得待测液；
(2)制备标准混合工作溶液系列：
先分别称取地昔尼尔、双氰胺、缩二脲、环丙氨嗪和三聚氰胺标准品10mg，用乙腈分别溶解定容至10mL，得到1.0mg/mL的标准储备液；
再分别移取各标准储备液100μL，用乙腈定容至10mL，制成10μg/mL的标准混合溶液；
最后用体积比为1:9的0.15％甲酸水溶液(含5mM乙酸铵)-乙腈混合液进行梯度稀释，获得0ng/mL、62.5ng/mL、125ng/mL、250ng/mL、500ng/mL为标准混合工作储备溶液系列；
取不含有地昔尼尔、双氰胺、缩二脲、环丙氨嗪和三聚氰胺的空白脱脂牛奶(或全脂牛奶)，采用步骤(1)和(2)处理，得到空白基质溶液；
取标准混合工作储备溶液系列各0.1mL，各加入0.4mL空白基质溶液，得到浓度为0，12.5，25.0，50.0，100ng/mL(相应质量浓度为0μg/kg、50μg/kg、100μg/kg、200μg/kg、400μg/kg)的标准混合工作溶液系列(供正离子采集模式下使用)；
(3)制备标准曲线：
将标准混合工作溶液系列在预设的液相色谱串联质谱条件下分别进样，以质量浓度X(μg/kg)为横坐标，峰面积的比值Y为纵坐标，绘制5点标准工作曲线(如表2和表3)；
表2脱脂牛奶中残留量测定的离子对、线性方程、相关系数
表3全脂牛奶中残留量测定的离子对、线性方程、相关系数
由表2和表3可见，在所考察的线性范围内，各标准曲线的线性相关系数均较高，均能准确表征各化合物的质量浓度x(μg/kg)与峰面积的比值Y之间的对应关系。
(4)测定目标非蛋白含氮化合物的含量：
将待测液在预设的液相色谱串联质谱条件下进样，根据检测结果用标准工作曲线对待测液中相应非蛋白含氮化合物进行定量。
待测液中相应非蛋白含氮化合物应在仪器检测的线性范围内。假如一次检测完成时获得的待测液离子液体浓度超出了原标准曲线的考察范围，此时应重新配制系列浓度的标准溶液，重新绘制标准曲线，再次检测。
步骤(3)和(4)中，五种非蛋白含氮化合物以及内标物的质谱参数如表4所示。
表4五种非蛋白含氮化合物以及内标物的质谱参数
注：带“*”为定量离子对。
步骤(3)和(4)中，液相色谱串联质谱条件如表5所示：
表5液相色谱串联质谱的仪器条件参数
在上述液相色谱串联质谱条件下，判断待测液中是否存在相应的被测物，需要满足如下条件：①待测液中出现的质量色谱峰保留时间与标准混合工作溶液一致，允许偏差小于±2.5％；②色谱峰所对应的化合物的质谱定性离子对(参见表4)的相对离子丰度与浓度相当的标准混合工作溶液一致，相对离子丰度偏差不超过表5的规定；满足以上两个条件则可确定待测液中含有相应的非蛋白含氮化合物。
向不含上述五种非蛋白含氮化合物的空白脱脂牛奶中各添加50μg/kg的地昔尼尔、双氰胺、缩二脲、环丙氨嗪和三聚氰胺，通过步骤(1)和步骤(2)处理，得基质溶液，获取五种非蛋白含氮化合物的MRM总离子流图，如图1所示。
从图1可见，五种非蛋白含氮化合物的色谱峰出峰时间与表4中列出的保留时间相一致，表明基质溶液不影响各化合物的出峰时间。
实施例2定量限试验
根据牛奶(以及全脂牛奶)中各添加50μg/kg的地昔尼尔、双氰胺、缩二脲、环丙氨嗪和三聚氰胺时的信号响应强度及信噪比，以S/N等于10计算，添加地昔尼尔、双氰胺、缩二脲、环丙氨嗪和三聚氰胺中五种非蛋白含氮化合物，最终确定非蛋白含氮化合物的测定定量限，检测结果见表6。
表6本发明检测方法对各非蛋白含氮化合物的检测定量限
由表6可见，本发明的检测方法对三聚氰胺的检测定量限远低于国内外最低限量标准(50μg/kg)，同时对其他四种非蛋白含氮化合物也具备较低的检测定量限，表明本发明的检测方法具有较强的灵敏度和准确性，能够很好地满足痕量检测要求。
实施例3回收率试验
向不含上述五种非蛋白含氮化合物的空白脱脂牛奶(以及全脂牛奶)中分别添加已知量的地昔尼尔、双氰胺、缩二脲、环丙氨嗪和三聚氰胺，并按照实施例1的方法对空白脱脂牛奶(以及全脂牛奶)作前处理，根据实施例1的标准曲线，采用实施例1的液相色谱串联质谱条件检测待测液中各非蛋白含氮化合物的含量，进行回收率试验。
回收率(％)＝(回收量-样品中含量)/加标量×100％；
每次试验平行重复六次，回收率试验结果如表7所示。
表7样品中五种非蛋白含氮化合物添加回收率和精密度(n＝6)
由表7可见，五种非蛋白含氮化合物的总体回收率在78.5～101.8％之间，相对标准偏差在1.3％～12.3％，表明本发明的检测方法对于检测乳制品中五种非蛋白含氮化合物具有良好的准确性，重现性、实用性。
实施例4
制备分别含有12.5ng/mL的地昔尼尔、双氰胺、缩二脲、环丙氨嗪和三聚氰胺的混合溶液，并按照实施例1的方法对混合溶液作前处理，检测净化后待测液中各非蛋白含氮化合物的含量，计算回收率。
同时设置以下对比例：
对比例1：采用乙腈作为蛋白沉淀剂，检测正己烷脱脂处理完成时，下清液中各非蛋白含氮化合物的含量，计算回收率；
对比例2：采用乙腈作为蛋白沉淀剂，采用QuEChERS技术净化，检测净化后待测液中各非蛋白含氮化合物的含量，计算回收率；
对比例3：采用甲醇作为蛋白沉淀剂，采用QuEChERS技术净化，检测净化后待测液中各非蛋白含氮化合物的含量，计算回收率；
对比例4：采用MCX固相萃取柱净化，检测净化后待测液中各非蛋白含氮化合物的含量，计算回收率；
对比例5：采用C18固相萃取柱净化，检测净化后待测液中各非蛋白含氮化合物的含量，计算回收率；
对比例6：下清液浓缩至近干后采用乙腈溶解，采用HLB固相萃取柱净化，检测净化后待测液中各非蛋白含氮化合物的含量，计算回收率。
计算结果见表8。
表8实施例4和对比例1～6的回收率比较
由表8可见，对比例1的回收率均在93.1～101.8％，表明正己烷不仅能够有效脱脂，而且基本不影响回收率(即目标化合物未流失)。
对比例2和对比例3的回收率基本一致，表明采用甲醇还是乙腈作蛋白沉淀剂对回收率基本无影响；但对比例2和对比例3的回收率均低于对比例6和实施例4，表明QuEChERS净化技术对五种非蛋白含氮化合物的回收率较差，且QuEChERS净化技术对双氰胺和地昔尼尔虽能达到70％，但对其他三种化合物的回收率却低于50％。
从对比例4的结果看出，MCX固相萃取净化对地昔尼尔，环丙氨嗪，三聚氰胺3个化合物的回收率60-80％，其他两个化合物回收率不是很理想，仅有30％左右。
对比例5的回收率虽优于对比例4，且五种化合物的回收率均较高，但仍旧低于对比例6。
实施例4采用氨水乙腈替代对比例6中的乙腈，进一步提高了回收率。
实施例5
在体积比为1:9的0.15％甲酸水溶液(含5mM乙酸铵)-乙腈混合液各加入地昔尼尔、双氰胺、缩二脲、环丙氨嗪和三聚氰胺至终浓度为12.5ng/mL，采用乙腈和0.15％甲酸水溶液(含5mM乙酸铵)作为流动相(流动相初始溶液与定容溶液相同[即0.15％甲酸水溶液(含5mM乙酸铵)-乙腈的体积比为1:9]，采用实施例1步骤(4)的方法作液相色谱串联质谱，考察各化合物的分离出峰、谱峰峰形和信号强度等情况(见图2)。
同时设置下列对比例：
对比例7：在体积比为1:9的0.15％甲酸水溶液-乙腈混合液中添加地昔尼尔、双氰胺、缩二脲、环丙氨嗪和三聚氰胺至终浓度为12.5ng/mL，且采用乙腈和0.15％甲酸水溶液作为流动相，流动相初始溶液与定容溶液相同(见图3)；
对比例8：在体积比为1:9的0.15％甲酸水溶液-乙腈混合液中添加地昔尼尔、双氰胺、缩二脲、环丙氨嗪和三聚氰胺至终浓度为12.5ng/mL，采用乙腈和0.15％甲酸水溶液(含5mM乙酸铵)作为流动相(流动相初始溶液为体积比为1:9的0.15％甲酸水溶液(含5mM乙酸铵)-乙腈混合液)(见图4)。
由图2和图3可见，与对比例7相比，在实施例5的定容溶液和流动相中加入5mM乙酸铵可明显提高各化合物的信号强度，其中地昔尼尔强度提高近50倍。
由图2和图4可见，对比例8由于定容溶液与流动相初始溶液不一致，导致地昔尼尔谱峰峰形出现“分叉”峰；而实施例5由于定容溶液与流动相初始溶液一致，谱峰峰形较好。
0.15％甲酸水溶液中，乙酸铵的添加浓度在3～10mM内时，各化合物的分离出峰、谱峰峰形和信号强度等情况基本相同。

Claims (10)

1.液相色谱串联质谱法同时检测牛奶中多种非蛋白含氮化合物含量的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)向待测样品中加入蛋白沉淀剂，涡旋，离心，取上清液；
(2)向所述上清液中加入除脂剂，涡旋，离心，弃除脂剂层，将下清液浓缩后用氨水乙腈溶解、涡旋，得待净化液；
(3)将所述待净化液过HLB固相萃取柱，收集洗脱液并将其浓缩后用体积比为1:9的0.15％甲酸水溶液-乙腈混合液溶解、定容，微孔滤膜过滤，得待测液；
所述0.15％甲酸水溶液中含有3～10mM乙酸铵；
(4)配制含有地昔尼尔、双氰胺、缩二脲、环丙氨嗪和三聚氰胺中至少四种非蛋白含氮化合物的标准混合溶液，将标准混合溶液进行梯度稀释，获得标准混合工作溶液系列；
(5)将所述标准混合工作溶液系列和所述待测液在预设的液相色谱串联质谱条件下分别进样，根据标准混合工作溶液系列的检测结果制作标准曲线，再根据标准曲线和待测液的检测结果计算待测液中相应非蛋白含氮化合物的含量；
其中，液相色谱条件为：
色谱柱：Waters XBridge HILIC，4.6mm×150mm，3.5μm；
流动相A：0.15％甲酸水溶液，含3～10mM乙酸铵；
流动相B：乙腈；
流速：0.4mL/min；
进样量：10μL；
柱温：40℃；
梯度洗脱程序：①0min：10％A，90％B；
②3.0min：50％A，50％B；
③8.0min：50％A，50％B；
④9.0min：10％A，90％B；
⑤20.0min：10％A，90％B；
质谱条件为：
离子源：电喷雾离子源；
扫描方式：正离子扫描；
监测方式：多反应监测；
电喷雾电压：3500V；
离子源温度：250℃；
干燥气温度：高纯氮气，250℃；
干燥气流量：高纯氮气，16L/min；
雾化气压力：高纯氮气，275.8kPa；
鞘气温度：高纯氮气，350℃；
鞘气流量：高纯氮气，10L/min；
质谱参数为：
⑥地昔尼尔：定量离子对为191.1/150.0，碰撞能量为21V；定性离子对为191.1/109.1，碰撞能量为31V；
⑦双氰胺：定量离子对为85.1/68.1，碰撞能量为20V；定性离子对为85.1/43.1，碰撞能量为22V；
⑧缩二脲：定量离子对为104.2/61.0，碰撞能量为9V；定性离子对为104.2/44.1，碰撞能量为37V；
⑨环丙氨嗪：定量离子对为167.2/85.1，碰撞能量为20V；定性离子对为167.2/125.1，碰撞能量为18V；
⑩三聚氰胺：定量离子对为127.1/85.1，碰撞能量为19V；定性离子对为127.1/68.1，碰撞能量为36V。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，先向所述待测样品中添加三聚氰胺-15N3内标物，再添加蛋白沉淀剂。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述三聚氰胺-15N3内标物的添加量为50～200ng。
4.如权利要求2或3所述的方法，其特征在于，所述三聚氰胺-15N3内标物的质谱参数为：离子对为130.2/87.1，碰撞能量为19V。
5.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述蛋白沉淀剂为乙腈。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，乙腈与待测样品的混合体积比为(15～20)：1。
7.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述除脂剂为正己烷。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，正己烷与所述上清液的混合体积比为(1～1.5)：2。
9.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，将所述下清液浓缩后用3～10％氨水乙腈溶解。
10.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述0.15％甲酸水溶液中乙酸铵的浓度为5mM。
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