CN104316679A - 超支化聚缩水甘油醚修饰纳米磁性微球在化学发光免疫分析中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了超支化聚缩水甘油醚修饰纳米磁性微球在化学发光免疫分析中的应用。本发明利用超支化聚缩水甘油醚修饰纳米磁性微球，制备获得表面亲水并富含官能团的纳米微球材料。在实际使用这种基于这种超支化聚缩水甘油醚磁性微球的化学发光诊断试剂时，发现试剂能够很好的抑制蛋白的非特异性吸附，抗体偶联量也较商品化的磁性微球高出2‐3倍。在项目的性能分析中发现基于此种磁性微球的诊断试剂可以大大增强抗原抗体之间的反应，与商品化磁性微球试剂做对比时发现，灵敏度提高4‐5倍，检测上限提高1.3倍，从而检测范围提高将近6.5倍。

Description

超支化聚缩水甘油醚修饰纳米磁性微球在化学发光免疫分析中的应用

技术领域

本发明属于生物检测试剂领域，涉及超支化聚缩水甘油醚修饰纳米磁性微球在化学发光免疫分析中的应用。

背景技术

化学发光免疫分析法是将高特异性的免疫反应分析技术，化学发光反应体系和高度灵敏的发光测定技术相结合，用于各种抗原、半抗原、抗体、酶、激素和药物等的检测分析技术。它是继放射免疫分析技术、酶联免疫分析技术、荧光免疫分析技术和时间分辨荧光免疫分析技术之后发展起来的一项最新免疫测定技术。

化学发光免疫分析包含两个部分，即免疫反应系统和化学发光系统。免疫反应系统利用免疫反应的高特异性原理，将待检测物从待检测样本复杂的物质构成中分离捕获出来并和特定的标记物结合；化学发光系统利用特定的过程使标记物参与到氧化还原反应中去，标记物被氧化剂氧化，形成一个激发态的中间体，激发态的中间体并不稳定，很快就发射出光子并回到基态。发射的光子被光信号计量装置接收后，通过光电效应转变为电信号进行后续数字处理。免疫反应系统构建了待测物质和标记物的关系，化学发光系统构建了标记物含量和电信号的关系，两者结合应用即可将待测物质的量转化为电信号从而被计算处理。

化学发光免疫分析方法由于其具有灵敏度高、特异性强、线性范围宽等优点，日益受到人们的青睐，在生命科学、临床医学以及环境、食品、药物等领域得到广泛应用。就化学发光免疫分析检测试剂本身性能而言，灵敏度和线性范围是其中最重要的两个性能参数。这是因为在实际应用中越来越多的需要检测低丰度分析物样品，发展高灵敏的化学发光免疫分析方法，是近年来免疫分析方法发展的重要方向。同时较宽的线性范围的检测结果将给临床检测提供一下帮助：①疾病的不同阶段(早期，中期，晚期)的准确定位，从而可以辅助医生制定更特异性、更针对性的治疗方案；②可以对治疗的结果进行及时分析，使得医护人员可以在早期发现问题并及时调整治疗方案，避免给患者带来更大的治疗风险和经济压力。

在实际的试剂盒开发过程中，最低检测限的优化和检测范围的拓宽往往是两个矛盾体。常规的优化最低检测限的方法一般都以牺牲检测上限为代价，比如：①通过调节纳米微球粒径来优化试剂盒的最低检测限，较小的粒径将在同等质量浓度下提供较大的抗体结合面积，从而有助于拓宽免疫分析的线性范围。较大的粒径将提高反应体系在低浓度被检出物条件下的性能，可以优化最低检测限，但是粒径的增大会带来固相载体总表面积的下降，导致结合在载体上的抗体量下降，从而影响检测上限；②通过相对减少抗体在固相载体上的包被量来优化最低检测限，但是和上一条类似的，抗体量的减少同样会牺牲检测上限；③通过增加样本加样量来增加体系中待分析物的相对含量从而优化最低检测限，但是待测物含量提升后，在高浓度样本的分析中检测上限必然表现下降。总之，若是要通过只优化一个条件，同时优化分析试剂在最低检测限和检测上限两个指标上的表现，常规的方法几乎是无能为力的。在实际开发过程中，传统的方案是从两个作用相反的变量上同时优化，取折衷的效果。因此这些优化工作必然会是非常消耗时间且起不到最佳效果的。

磁性微球作为化学发光免疫分析系统中关键的组分——固相载体，其本身的性质对于免疫分析的结果会起到举足轻重的影响。目前常用的商品化磁性微球是由聚苯乙烯外壳和超顺磁性磁流体内核构成，功能性的基团(比如：氨基、羧基等)通过共聚、接枝或者包裹的方法引入。这种方式的磁性微球有以下两个显著缺陷：第一，聚苯乙烯是一种非常疏水的材料，直接应用会不可避免的产生非特异性吸附的后果，这会导致样本中的杂质也吸附在微球表面，杂质的干扰不仅会增加反映的本底值，导致反应基线的波动，严重时甚至会造成假阳性或者假阴性的结果，直接影响到检测的可信度，形成误诊或者漏诊；第二，无论是上述何种方式引入的官能团，其密度都不能突破单层表面的最大理论密度，从而限制了抗体在其上的偶联量。

增强信号和降低噪音是优化化学发光免疫试剂的两个重要步骤，降低噪音主要是在固相载体上覆盖一层物质，这层物质在微球上占据绝大多数位点后，可以有效的降低非特异性吸附，但不能完全杜绝其发生。通常使用的物质为BSA蛋白，酪蛋白，明胶，但研究发现这类物质的效果并不理想，同时为了寻求最佳的实验条件，实验摸索也需要耗费巨大的人力和时间。增强信号主要集中在信号探针放大方面，这就要求纳米粒子可以尽可能多的负载标示物，甚至会用到例如生物素——链霉亲和素这种放大标记的工艺方法。

聚乙二醇(PEG)是在生物医药方向中使用非常广泛的一个亲水性物质，其生物相容性以及非免疫源性的特征使得在它在很多领域作为改性材料使用，例如抗体、蛋白、核苷酸、脂质体的修饰，聚合物和聚合物微球的表面改性等。在免疫分析中，纳米粒子表面的PEG可以有效的降低非特异性吸附，减少本底值，提高反应的灵敏度，降低假阳性和假阴性结果。但是线性的PEG聚合物由于其结构中只在聚合物端基部分有官能团，因此整个聚合物结构中只有一个或者两个活性位点可供于偶联，结合能力较弱，偶联效率不高，这点限制了其更广泛的应用。

与线性聚合物不同，超支化聚合物(支化程度至少大于等于2)在结构分支处包含较多的官能团。超支化聚合一般有较好的溶解性，溶解后粘度较低和流动性也较好，使用上简单方便。再者，超支化聚合物合成方法也比较简单，主要分成三种：第一，利用多官能团的单体缩聚制备；第二，在已经制备好的聚合物前驱体中进行接枝修饰，第三，利用环氧的开环反应来制备超支化的结构。

超支化聚缩水甘油醚是一种特殊的超支化聚合物，有着类似聚乙二醇的主链结构，在支链结构上富含羟基，这部分羟基一方面为化学偶联提供了大量结合位点，另一方面又给聚合物带来了良好的亲水性能。这些结构特点使超支化聚缩水甘油醚具有大量的末端官能团，拥有良好的生物相容性、高溶解性和高流变性。因此从增强信号和降低噪音这两个方面都提高试剂的性能，从使得其在生物试剂上有着卓越的应用价值。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供超支化聚缩水甘油醚修饰纳米磁性微球在化学发光免疫分析中的应用。

本发明的另一目的是提供一种含超支化聚缩水甘油醚修饰纳米磁性微球的试剂盒。

本发明的目的可通过如下技术方案实现：

超支化聚缩水甘油醚修饰纳米磁性微球在化学发光免疫分析中的应用。

超支化聚缩水甘油醚修饰纳米磁性微球在化学发光免疫分析中的应用，包括以下方法：超支化聚缩水甘油醚经修饰后通过氨基作用包被在纳米磁性微球表面形成超支化聚缩水甘油醚修饰纳米磁性微球，对超支化聚缩水甘油醚修饰纳米磁性微球的羧基进行活化后偶联能与待测分子特异性结合的探测分子，形成了超支化聚缩水甘油醚纳米磁性微球‐探测分子复合物固相载体，将超支化聚缩水甘油醚纳米磁性微球‐探测分子复合物固相载体和待测样本以及标记上发光物质的能与待测分子特异性结合的捕获分子混合反应后，形成了超支化聚缩水甘油醚纳米磁性微球‐探测分子复合物固相载体‐待测分子‐捕获分子‐发光物质的复合物，经清洗分离出复合物，向其中加入激发物，复合物中的发光物质受到激发产生化学发光，最后用化学发光检测仪检测发光强度计算待测样本中的目标分析物的浓度。

所述的超支化聚缩水甘油醚修饰纳米磁性微球在化学发光免疫分析中的应用，所述的纳米磁性微球大小为1μm～10μm。

所述的超支化聚缩水甘油醚修饰纳米磁性微球在化学发光免疫分析中的应用，所述的超支化聚缩水甘油醚由三羟甲基丙烷和缩水甘油聚合而成；所述的修饰为琥珀酰亚胺基碳酸酯修饰。

所述的超支化聚缩水甘油醚修饰纳米磁性微球在化学发光免疫分析中的应用，所述的探测分子和纳米磁性微球的偶联方式包括羧基偶联、氨基偶联、羟基偶联、醛基偶联、氯甲基偶联、巯基偶联等方式。

所述的超支化聚缩水甘油醚修饰纳米磁性微球在化学发光免疫分析中的应用，检测的待测物质可以是抗原、抗体、半抗体、半抗原、小分子化学物质、金属元素等；探测分子为能够与待测物质特异性结合的抗体、抗原、半抗原、半抗体、小分子等；捕获分子是能与待测分子或探测分子或两者复合物特异性结合的物质。

所述的超支化聚缩水甘油醚修饰纳米磁性微球在化学发光免疫分析中的应用，所述的发光物质选自包括N‐(4‐氨丁基)‐N‐乙基异鲁米诺，吖啶酯，吖啶磺酰胺，辣根过氧化物酶，碱性磷酸酶等。

所述的超支化聚缩水甘油醚修饰纳米磁性微球在化学发光免疫分析中的应用，所述的激发物选自含有0.1％‐1％过氧化氢的0.1mol/L‐1mol/L硝酸溶液、含有0.1％‐1％过氧化氢的0.1mol/L‐1mol/L硫酸溶液、含有0.1％‐1％过氧化氢的0.1mol/L‐1mol/L盐酸溶液、含有0.5％‐5％Tween‐20的0.1‐1mol/L氢氧化钠溶液、含有0.5％‐5％Tween‐80的0.1‐1mol/L氢氧化钠溶液、或含有0.5％‐5％TritonX‐100的0.1‐1mol/L氢氧化钠溶液。

一种化学发光免疫检测试剂盒，包括本发明所述的超支化聚缩水甘油醚修饰纳米磁性微球‐探测分子复合物、化学发光激发液系统，连接发光物质的捕获分子。

其中，所述的化学发光激发液系统包括激发液1和激发液2，激发液1选自含有0.1％‐1％过氧化氢的0.1mol/L‐1mol/L硝酸溶液、含有0.1％‐1％过氧化氢的0.1mol/L‐1mol/L硫酸溶液或者含有0.1％‐1％过氧化氢的0.1mol/L‐1mol/L盐酸溶液。激发液2选自含有0.5％‐5％Tween‐20的0.1‐1mol/L氢氧化钠溶液、含有0.5％‐5％Tween‐80的0.1‐1mol/L氢氧化钠溶液、含有0.5％‐5％TritonX‐100的0.1‐1mol/L氢氧化钠溶液；所述的化学发光激发液系统加样方法为先加入激发液1，间隔2s后，再加入激发液2。

一种制备所述试剂盒的方法，包括以下步骤：

1)超支化聚缩水甘油醚的制备：以三羟甲基丙烷作为反应的引发剂，采用CH₃OK对TMP的羟基进行部分去质子化，去质子化部分占总部分的10％，然后将缩水甘油缓慢滴加进入体系引发聚合，反应温度95～100℃，反应10～12小时；反应结束后产物溶解在甲醇中，通过强酸型阳离子交换树脂(AMBERJET^TM1500H Resin)中和；聚合物通过在丙酮中析出，甲醇中溶解，重复两次进行提纯，最后在75～85℃的真空中干燥13～16小时，得超支化聚缩水甘油醚；

2)超支化聚缩水甘油醚的修饰：将超支化聚缩水甘油醚在DMF溶液中用琥珀酰亚胺基碳酸酯(DSC)进行修饰得DSC修饰的超支化聚缩水甘油醚；

3)超支化聚缩水甘油醚对磁性微球的修饰：向氨基磁性微球溶液中滴加上一步制备的DSC修饰的超支化聚缩水甘油醚溶液，超支化聚缩水甘油醚进过DSC修饰后表面有大量的琥珀酰亚胺酯(NHS酯)，这部分活性酯可以与氨基磁性微球上的氨基反应，于摇床中反应0.5～1h后，再加入50mM的PB缓冲液，此时多余的NHS酯发生水解，最后使用50mM PBS溶液(pH＝7.5)清洗，清洗过程中使用磁性分离架分离磁性微球，清洗结束后，使用50mM PBS溶液(pH＝7.5)重悬，因此在磁性微球表面预留下大量羧基；

4)超支化聚缩水甘油醚修饰磁性微球偶联探测分子：对上一步制备的超支化聚缩水甘油醚修饰的磁性微球进行羧基活化，通常方法为加入1‐(3‐二甲氨基丙基)‐3‐乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)，其摩尔含量为羧基摩尔含量的1‐10倍，混合均匀后震荡反应30分钟，活化结束后离心使用50mM PBS溶液(pH＝7.5)清洗，将探测分子用100mM碳酸氢钠缓冲液(pH＝8.0)稀释到后，加入到磁性微球溶液中，置于200～220rpm 35～37℃摇床上反应2.5～3.5h，反应结束后使用,50mM PBS溶液(pH＝7.5)清洗悬浮磁性微球，制得超支化聚缩水甘油醚纳米磁性微球‐探测分子复合物固相载体；

5)发光物质的标记：捕获分子加入到50mM PBS缓冲液(pH＝8.0)中，加入0.3～1mmol/L的发光物质，混合，室温避光反应20～30min，使用10mM PBS缓冲液(pH＝6.5)透析除去未结合的发光物质，最后加入50％重蒸甘油，置于‐20℃保存；

6)配制激发液1和激发液2：激发液1为含有0.5％过氧化氢溶液的0.2M的硝酸溶液；激发液2为含有1％Tween‐20的0.5M氢氧化钠溶液。

一种制备上述试剂盒的方法，优选包括以下步骤：

超支化聚缩水甘油醚的制备：在配有机械搅拌和微量恒流泵的三口烧瓶中，加入0.24g三羟甲基丙烷(TMP)，作为反应的引发剂，采用3.7M CH₃OK(溶解于甲醇中)对TMP的羟基进行部分去质子化，去质子化部分占总部分的10％，多余甲醇通过加热蒸发除去。然后50mL的缩水甘油缓慢滴加进入体系引发聚合，注意缩水甘油的滴加速度，滴加过快可能会引起爆聚。反应温度95℃，反应12小时；

反应结束后产物溶解在甲醇中，通过强酸型阳离子交换树脂(AMBERJET^TM1500H Resin)中和。聚合物通过在丙酮中析出，甲醇中溶解，重复两次进行提纯。最后在80℃的真空中干燥15小时。得超支化聚缩水甘油醚；

超支化聚缩水甘油醚的修饰：将超支化聚缩水甘油醚溶解于二甲基甲酰胺(DMF)中，配制成10mg/mL的溶液，取1mL，加入20mg琥珀酰亚胺基碳酸酯(DSC)于常温下进行反应，得DSC修饰的超支化聚缩水甘油醚(DSC‐HPG)。

超支化聚缩水甘油醚对磁性微球的修饰：取5mg氨基磁性微球(粒径大小为1μm～10μm)，根据固含量5mg/ml进行换算，去除上清液保留固体物质。之后向磁性微球溶液中滴加500μL的DSC‐HPG溶液，于摇床中反应30min。反应结束后，向反应体系中加入1mL 50mMPBS溶液继续反应30min，将多余的NHS酯水解后，使用50mM PBS溶液(pH＝7.5)清洗三次，清洗过程中使用磁性分离架分离磁性微球，清洗结束后，使用1mL 50mM PBS溶液(pH＝7.5)重悬；

超支化聚缩水甘油醚修饰磁性微球偶联探测分子：对微球的羧基进行活化，活化结束后使用500μL 50mM PBS溶液(pH＝7.5)清洗磁性微球。将探测分子用100mM碳酸氢钠缓冲液(pH＝8.0)稀释到1mg/mL后，加入到磁性微球溶液中，置于220rpm 37℃摇床上反应3h。反应结束后使用400μL 50mM PBS溶液(pH＝7.5)清洗悬浮磁性微球，清洗三次，制得超支化聚缩水甘油醚磁性微球探测分子复合物；

发光物质的标记：捕获分子加入到50mM PBS缓冲液(pH＝8.0)中，加入0.5mmol/L的发光物质，混合，室温避光反应20min。使用10mM PBS缓冲液(pH＝6.5)透析除去未结合的发光物质，最后加入50％重蒸甘油，置于‐20℃保存；

配制激发液1和激发液2：激发液1为含有0.5％过氧化氢溶液的0.2M的硝酸溶液；激发液2为含有1％Tween‐20的0.5M氢氧化钠溶液。

有益效果：

本发明专利在化学发光免疫分析法中引入超支化聚缩水甘油醚磁性微球，利用超支化聚缩水甘油醚的高度亲水性和支化高官能团密度的特点，可同时提高化学发光免疫分析试剂在最低检测限和检测上限的表现。具体来说，超支化聚缩水甘油醚亲水性强，可以大大地降低在检测过程中因疏水作用而导致的非目标蛋白的非特异性吸附，能够较大程度的降低本底并减少噪声，从而能够优化试剂的最低检测限；支化高官能团密度的特点使得修饰了该分子的磁性微球作为固相载体在包被抗体时，能够提高包被量，从而拓宽检测范围。另外超支化聚缩水甘油醚的亲水性使得偶联在上面的抗体能够更好地保持其构象，从而提高了结合抗原的能力。

本发明专利利用超支化聚缩水甘油醚修饰纳米磁性微球，制备获得表面亲水并富含官能团的纳米微球材料。在实际使用这种基于这种超支化聚缩水甘油醚磁性微球的化学发光诊断试剂时，发现试剂能够很好的抑制蛋白的非特异性吸附，抗体偶联量也较商品化的磁性微球高出2‐3倍。在项目的性能分析中发现基于此种磁性微球的诊断试剂可以大大增强抗原抗体之间的反应，与商品化磁性微球试剂做对比时发现，灵敏度提高4‐5倍，检测上限提高1.3倍，从而检测范围提高将近6.5倍。对于试剂的线性相关性、重复性、回收率、稳定性等其它性能时，分析发现均可以达到国标或者行标的要求，试剂性能优越。

本试剂的发明可以很好解决目前诊断试剂中普遍存在的非特异性吸附的问题，对于一些线性要求很宽，灵敏度要求很高的项目，使用本试剂亦可以取得很好的效果，因此该诊断试剂具有更高的临床检验应用价值。

附图说明

图1本发明技术路线示意图

图2hGH检测系统与对比检测系统之间的线性相关图

图3基于超支化聚缩水甘油醚修饰磁性微球的hGH检测试剂标准曲线

图4基于普通羧基磁性微球的hGH检测试剂标准曲线

图5hGH检测试剂不同检验天数下的血清检测值

图6TPO-Ab检测系统和对比系统之间的线性相关图

图7基于超支化聚缩水甘油醚修饰磁性微球的TPO-Ab检测试剂标准曲线

图8基于商品化羧基磁性微球的TPO-Ab检测试剂标准曲线

图9TPO-Ab检测试剂不同检验天数下的血清检测值

具体实施方式

实施例1基于超支化聚缩水甘油醚修饰磁性微球诊断试剂的制备方法

超支化聚缩水甘油醚的制备

在配有机械搅拌和微量恒流泵的三口烧瓶中，加入0.24g三羟甲基丙烷(TMP)，作为反应的引发剂，采用3.7M CH₃OK(溶解于甲醇中)对TMP的羟基进行部分去质子化，去质子化部分占总部分的10％，多余甲醇通过加热蒸发除去。然后50mL的缩水甘油缓慢滴加进入体系引发聚合，注意缩水甘油的滴加速度，滴加过快可能会引起爆聚。反应温度95℃，反应12小时。

反应结束后产物溶解在甲醇中，通过强酸型阳离子交换树脂(AMBERJET^TM1500H Resin)中和。聚合物通过在丙酮中析出，甲醇中溶解，重复两次进行提纯。最后在80℃的真空中干燥15小时。超支化聚缩水甘油醚为无色粘稠液体。

超支化聚缩水甘油醚的修饰

将超支化聚缩水甘油醚溶解于二甲基甲酰胺(DMF)中，配制成10mg/mL的溶液，取1mL，加入20mg琥珀酰亚胺基碳酸酯(DSC)于常温下进行反应，得DSC修饰的超支化聚缩水甘油醚(DSC‐HPG)。

超支化聚缩水甘油醚对磁性微球的修饰

取5mg氨基磁性微球(粒径大小为1μm～10μm)，根据固含量5mg/ml进行换算，去除上清液保留固体物质。之后向磁性微球溶液中滴加500μL的DSC‐HPG溶液，于摇床中反应30min。反应结束后，向反应体系中加入1mL 50mM PBS溶液继续反应30min，将多余的NHS酯水解后，使用50mM PBS溶液(pH＝7.5)清洗三次，清洗过程中使用磁性分离架分离磁性微球，清洗结束后，使用1mL 50mM PBS溶液(pH＝7.5)重悬。

超支化聚缩水甘油醚修饰磁性微球偶联hGH抗体

对超支化聚缩水甘油醚修饰的磁性微球的羧基进行活化，通常方法为加入EDC，其摩尔含量为羧基摩尔含量的10倍，混合均匀后震荡反应30分钟，活化结束后离心使用500μL 50mMPBS溶液(pH＝7.5)清洗磁性微球。将hGH‐5802抗体(生产厂家Medixm AB货号100042)用100mM碳酸氢钠缓冲液(pH＝8.0)稀释到1mg/mL后，加入到磁性微球溶液中，置于220rpm37℃摇床上反应3h。反应结束后使用400μL 50mM PBS溶液(pH＝7.5)清洗悬浮磁性微球，清洗三次，制得超支化聚缩水甘油醚磁性微球‐5802复合物。

实施例2中作为对照试剂的商品化羧基磁性微球(生产厂家JSR诊断试剂，货号MS160/Carboxyl)与hGH抗体的偶联方法同上，仅使用商品化羧基磁性微球替代超支化聚缩水甘油醚修饰的磁性微球。

吖啶酯的标记

取hGH‐5801抗体(生产厂家Medixm AB货号100041)加入到50mM PBS缓冲液(pH＝8.0)中，加入0.5mmol/L的吖啶酯，混合，室温避光反应20min。使用10mM PBS缓冲液(pH＝6.5)透析除去未结合的吖啶酯，最后加入50％重蒸甘油，置于‐20℃保存。

化学发光激发液系统

配制激发液1和激发液2：激发液1为含有0.5％过氧化氢溶液的0.2M的硝酸溶液；激发液2为含有1％Tween‐20的0.5M氢氧化钠溶液。

实施例2超支化聚缩水甘油醚修饰磁性微球开发的诊断试剂在化学发光免疫分析中利用双抗夹心法在hGH项目上的验证

将超支化聚缩水甘油醚修饰磁性微球-hGH‐5802抗体复合物30μl、hGH‐5801抗体-吖啶酯复合物120μl，加入到100μl待分析样本中，反应15分钟。由于特异性的免疫反应形成超支化聚缩水甘油醚修饰磁性微球-hGH‐5802抗体-hGH-5801抗体-吖啶酯的免疫复合物，使用磁力分离架进行固液分离去除上清液，留取沉淀物。使用清洗液对复合物进行清洗，加入激发物1，间隔2s加入激发物2，激发物1中过氧化氢加成吖啶酯吖啶环的9位碳原子，在碱性条件下生成过氧负离子，分子内进攻羰基，离去基团，生成不稳定中间体1,2-二氧杂环丁烷酮，1,2-二氧杂环丁烷酮开环生成吖啶酮，同时释放光子。间隔0.5s开始测定产生的化学发光发光强度，光量子技术时间为0.5-3s。

标本检测相关性评估

分别使用Roche公司生产的人生长激素测定试剂盒(电化学发光法)和本发明所建hGH检测系统对40份浓度在0.01～32.49ng/mL范围的hGH待分析样本进行测定，然后计算本发明所建hGH检测系统与对比检测系统之间的线性相关性，并计算在5、10、15和20ng/mL检定点的预期偏差(Bx)和相对偏差(Bx/x)。

如图2所示，本发明所建系统与对比系统的线性回归方程为y＝0.9083x+0.4067，线性相关系数为r²＝0.9913(r＝0.9956)；如表1所示，本发明所建系统在5、10、15、20ng/mL4个检定点的预期偏差最高为1.43ng/mL，预期相对偏差最高为7.15％，表明本发明所建系统检测待分析样本可以获得与Roche检测系统基本一致的结果，检测准确度高，能够很好地满足临床应用需求。

表1预期偏差与相对偏差计算

检测范围的评估和对比

最低检测限

最低检测限、检测上限是检测试剂的一项重要参数，最低检测限低、检测上限高的检测试剂表示此产品检测性能高。本论文除对所建hGH检测试剂的最低检测限和检测上限进行评估外，还制备了基于商品化羧基微球的hGH检测试剂，并对二者的最低检测限和检测上限进行评估和比对。

采用本发明所建hGH检测试剂和对照试剂基于商品化羧基微球制备hGH检测试剂分别对人阴性血清样本重复测定20次，得到样本的发光强度，分别计算测得的发光强度的平均值和标准差(SD)，计算检测均值加两倍标准差。根据测定浓度和发光强度的拟合方程，计算出浓度值，此浓度即是检测系统最低检出限。结果如表2所示，以超支化聚缩水甘油醚磁性微球为固相载体的hGH检测系统，可以降低空白样本的发光强度，降低噪声，提高检测系统的最低检测限。

表2最低检测限评估

检测上限评估：

取hGH重组蛋白，用生理盐水稀释到0.01、0.02、0.05、0.5、5、15、25、35、45、65ng/mL10个浓度水平，使用本发明所建hGH检测试剂和对照试剂基于商品化羧基磁性微球制备hCG检测试剂对每个浓度水平重复测定4次，以理论浓度为x轴，检测发光值为y轴，绘制散点图。如图3所示，结果显示实施例1试剂在0～65ng/mL范围内单调梯度分布，当样本浓度超过45ng/mL，反应体系趋于饱和，检测进入平台期。而对照试剂在0～35ng/mL范围内单调梯度分布(如图4所示)，当样本浓度超出上述范围后，因抗原量过量，过量的抗原消耗过多的检测抗体而出现hook效应。由数据可知，本论文所建立方法的检测上限比对照组高1.3倍。文中所用基于超支化聚缩水甘油醚修饰磁性微球为固相载体的试剂标曲拟合方法为五参数拟合，公式为y＝Amin+(Amax-Amin)/(1+(x0/x)^h)^s

其中各参数为

Amin＝210.46098

Amax＝1.62E+06

x0＝45.02666

h＝7.65128

s＝0.1452

回收率测试

选择hGH浓度为15ng/mL的样本作为基础样本，均分为4份，每份体积为1mL。分析样本1中不添加hGH抗原；分析样本2中添加0.125mL 60ng/mL hGH抗原调整浓度到20ng/mL；分析样本3中添加0.286mL 60ng/mL hGH抗原调整浓度到25ng/mL；分析样本4中添加0.5mL 60ng/mL hGH抗原调整浓度到30ng/mL。使用本发明所建hGH检测系统测定上述分析样本中hGH浓度，每个样本重复测定3次，计算分析样本的回收率和比例系统误差。测定结果如表3所示，表明本发明所建系统在添加浓度5、10和15ng/mL时回收浓度分布为4.97、10.15和14.92ng/mL，回收率分别为99.40％，101.50％和99.47％，平均回收率为100.02％，比例系统误差为0.02％。表明本发明所建hGH检测系统，回收效果良好，检测准确度高，能满足实际使用要求。

表3回收率

重复性测试

采用本发明所建hGH检测系统分别对质控血清1(5ng/mL)和质控血清2(10ng/mL)进行重复性测定，每个质控血清重复测定20次，考察本发明所建系统的重复性。结果显示(见表4)，检测系统在5ng/mL质控点和10ng/mL质控点测量的变异系数分别为5.58％和2.50％。表明本发明所建系统检测精密度高，重复性好，能满足临床的使用要求。

表4重复性

稳定性评估

hGH测定试剂后，置于37℃恒温培养箱，每隔1d考察浓度分别为0.50、5.00和20.00ng/ml的中低高三个浓度的参考血清，每个样本重复测定3次，共计7天，计算每天检测结果的均值。结果如图5所示，本发明所建hGH检测试剂于37℃保存7天后，检测结果同第一天检测结果稍有降低，但最大相对偏差不低于15％，表明试剂稳定性好，可以进行长期保存。

实施例3

超支化聚缩水甘油醚修饰磁性微球开发的诊断试剂在化学发光免疫分析中利用间接法在TPO-Ab项目上的验证

按照实施例1的方法制备超支化聚缩水甘油醚修饰的纳米磁性微球-TPO抗原(生产厂家Hytest货号8RTPO)复合物，用于以下TPO-Ab的化学发光免疫分析。本实施例中作为对照试剂的商品化羧基磁性微球(生产厂家JSR诊断试剂，货号MS160/Carboxyl)与TPO抗原的偶联方法同实施例1，仅使用商品化羧基磁性微球替代超支化聚缩水甘油醚修饰的磁性微球。

将超支化聚缩水甘油醚修饰的纳米磁性微球-TPO抗原复合物加入到20μL待分析样本中，混匀，37℃温浴10min，超支化聚缩水甘油醚修饰的纳米磁性微球-TPO抗原复合物捕获待检测样本中的TPO-Ab到固相载体，清洗三次后，再加入吖啶酯标记TPO-Ab二抗(生产厂家北京博盛经纬科技有限公司，货号131108)，清洗去除待分析样本中无关抗体，吖啶酯标记TPO-Ab二抗结合在已经在磁性微球上的TPO-Ab；反应结束后使用400μL 50mM PBS溶液(pH＝7.5)对免疫复合物进行清洗，重复清洗3次，去除反应液并留存形成的免疫复合物，加入激发物1，间隔2s后加入激发物2，激发物中过氧化氢加成吖啶酯吖啶环的9位碳原子，在碱性条件下生成过氧负离子，分子内进攻羰基，离去基团离去，生成不稳定中间体1,2-二氧杂环丁烷酮，1,2-二氧杂环丁烷酮开环生成吖啶酮，同时释放光子。间隔0.5s-3s测定产生的化学发光强度。

标本检测相关性评估

分别使用Roche公司生产的甲状腺过氧化物酶抗体测定试剂盒(电化学发光法)和本发明所建TPO-Ab检测试剂对40份TPO-Ab浓度在15.36～461.90IU/mL的待分析样本进行测定，计算两者线性相关性以评价本发明所述方法和常规方法的线性可比性，并计算本发明所述方法在50、100、200和400IU/mL检定点的预期偏差和相对偏差。

如图6所示，本发明所建试剂与对比系统的线性回归方程为y＝0.9774x+3.5116，线性相关系数r²＝0.9824(r＝0.9912)；如表5所示，本发明所建试剂在50，100，200，400IU/mL 4个检定点的预期偏差最高为5.54IU/mL，相对偏差最高为4.76％，能够很好地满足应用需求。表明本发明所建试剂检测待分析样本可以获得与Roche检测系统基本一致的结果，检测准确度高，能够很好地满足临床应用需求。

表5预期偏差和相对偏差

检测范围的评估和对比

最低检测限的评估

采用本发明所建TPO-Ab检测试剂和对照试剂基于商品化羧基微球制备TPO-Ab检测试剂分别对人阴性血清样本重复测定20次，得到样本的发光强度，分别计算测得的发光强度的平均值和标准差(SD)，计算检测均值加两倍标准差。根据测定浓度和发光强度的拟合方程，计算出浓度值，此浓度即是检测系统最低检出限。结果如表6所示，以聚缩水甘油醚修饰磁性微球为固相载体的TPO-Ab检测系统，可以降低空白样本的发光强度，降低噪声，优化检测系统的最低检测限。

表6最低检测限评估

检测上限的预评估

取TPO-Ab校准品，用小牛血清稀释到4、8、16、30、60、120、240、480、600、1200IU/mL10个浓度水平，使用本发明所建TPO-Ab检测试剂和对照试剂基于商品化羧基微球制备TPO-Ab检测试剂对每个浓度水平重复测定4次，以理论浓度为x轴，检测发光值为y轴，绘制散点图。如图7所示，结果显示本发明所建试剂在0～1200IU/mL范围内单调梯度分布，当样本浓度超过600IU/mL，反应体系趋于饱和，检测进入平台期。另外对照试剂(如图8所示)在0～480IU/mL范围内呈单调梯度分布，当样本浓度超出上述范围后，消耗过多的检测抗体而出现hook效应。由数据可知，本论文所建立方法的检测上限比对照实验组高2.5倍。文中所用基于超支化聚缩水甘油醚磁性微球为固相载体的试剂标曲拟合方法为五参数拟合，公式为y＝Amin+(Amax-Amin)/(1+(x0/x)^h)^s

其中各参数为

Amin＝1764.48268

Amax＝582910.2428

x0＝604.20119

h＝52.55252

s＝0.01954

回收率测试

选择TPO-Ab浓度为200IU/mL的样本作为基础样本，均分为4份，每份体积为1mL。分析样本1中不添加TPO-Ab；分析样本2中添加TPO-Ab调整浓度到250IU/mL；分析样本3中添加TPO-Ab调整浓度到300IU/mL；分析样本4中添加TPO-Ab调整浓度到400IU/mL。使用本发明所述方法对上述分析样本进行TPO-Ab浓度测定，每个样本重复测定3次，计算分析样本的回收率和比例系统误差。结果显示(见表7)，本发明所述方法在加入浓度为50、100和200IU/mL时的回收浓度分别为48.98IU/mL、96.79IU/mL和205.35IU/mL，回收率分别为97.96％，96.79％和102.68％，平均回收率为99.14％，比例系统误差为0.86％。回收效果良好，检测准确度高，能满足临床使用要求。

表7回收率和比例系统误差

重复性测试

TPO-Ab检测试剂分别对质控血清1(100IU/mL)和质控血清2(300IU/mL)进行重复性测定，每个质控血清重复测定20次，考察文所建试剂的重复性。实验结果如下：结果显示(见表8)，检测试剂测定在100IU/mL质控点和300IU/mL质控点的测量变异系数分别为6.75％和2.60％。表明本发明所建试剂检测精密度高，重复性好，能满足临床的使用要求。

表8重复性

稳定性评估

TPO-Ab测定试剂后，置于37℃恒温培养箱，每隔1d考察浓度分别为50、200和400IU/mL的中低高三个浓度的参考血清，每个样本重复测定3次，共计7天，计算每天检测结果的均值。结果如图9所示，本发明所建TPO-Ab检测试剂于37℃保存7天后，检测结果同第一天检测结果稍有降低，但最大相对偏差不低于15％，表明试剂稳定性好，可以进行长期保存。

Claims (10)

1.超支化聚缩水甘油醚修饰纳米磁性微球在化学发光免疫分析中的应用。

2.根据权利要求1所述的超支化聚缩水甘油醚修饰纳米磁性微球在化学发光免疫分析中的应用，其特征在于包括以下方法：超支化聚缩水甘油醚经修饰后通过氨基作用包被在纳米磁性微球表面形成超支化聚缩水甘油醚修饰纳米磁性微球，对超支化聚缩水甘油醚修饰纳米磁性微球的羧基进行活化后偶联能与待测分子特异性结合的探测分子，形成了超支化聚缩水甘油醚纳米磁性微球-探测分子复合物固相载体，将超支化聚缩水甘油醚纳米磁性微球-探测分子复合物固相载体和待测样本以及标记上发光物质的能与待测分子特异性结合的捕获分子混合反应后，形成了超支化聚缩水甘油醚纳米磁性微球-探测分子复合物固相载体-待测分子-捕获分子-发光物质的复合物，经清洗分离出复合物，向其中加入激发物，复合物中的发光物质受到激发产生化学发光，最后用化学发光检测仪检测发光强度计算待测样本中的目标分析物的浓度。

3.根据权利要求1所述的超支化聚缩水甘油醚修饰纳米磁性微球在化学发光免疫分析中的应用，其特征在于所述的纳米磁性微球大小为1μm～10μm。

4.根据权利要求1所述的超支化聚缩水甘油醚修饰纳米磁性微球在化学发光免疫分析中的应用，其特征在于所述的超支化聚缩水甘油醚由三羟甲基丙烷和缩水甘油聚合而成；所述的修饰为琥珀酰亚胺基碳酸酯修饰。

5.根据权利要求1所述的超支化聚缩水甘油醚修饰纳米磁性微球在化学发光免疫分析中的应用，其特征在于检测的待测物质为抗原、抗体、半抗体、半抗原、小分子化学物质或金属元素；探测分子为能够与待测物质特异性结合的抗体、抗原、半抗原、半抗体或小分子；捕获分子是能与待测分子或探测分子或两者复合物特异性结合的物质。

6.根据权利要求1所述的超支化聚缩水甘油醚修饰纳米磁性微球在化学发光免疫分析中的应用，其特征在于所述的发光物质选自包括N‐(4‐氨丁基)‐N‐乙基异鲁米诺，吖啶酯，吖啶磺酰胺，辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶。

7.根据权利要求1所述的超支化聚缩水甘油醚修饰纳米磁性微球在化学发光免疫分析中的应用，其特征在于所述的激发物选自含有0.1％‐1％过氧化氢的0.1mol/L‐1mol/L硝酸溶液、含有0.1％‐1％过氧化氢的0.1mol/L‐1mol/L硫酸溶液、含有0.1％‐1％过氧化氢的0.1mol/L‐1mol/L盐酸溶液、含有0.5％‐5％Tween‐20的0.1‐1mol/L氢氧化钠溶液、含有0.5％‐5％Tween‐80的0.1‐1mol/L氢氧化钠溶液、或含有0.5％‐5％TritonX‐100的0.1‐1mol/L氢氧化钠溶液。

8.一种化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于包括权利要求2所述的超支化聚缩水甘油醚修饰纳米磁性微球‐探测分子复合物、化学发光激发液系统，连接发光物质的捕获分子。

9.根据权利要求8所述的化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于所述的化学发光激发液系统包括激发液1和激发液2，激发液1选自含有0.1％‐1％过氧化氢的0.1mol/L‐1mol/L硝酸溶液、含有0.1％‐1％过氧化氢的0.1mol/L‐1mol/L硫酸溶液或者含有0.1％‐1％过氧化氢的0.1mol/L‐1mol/L盐酸溶液；激发液2选自含有0.5％‐5％Tween‐20的0.1‐1mol/L氢氧化钠溶液、含有0.5％‐5％Tween‐80的0.1‐1mol/L氢氧化钠溶液、或含有0.5％‐5％TritonX‐100的0.1‐1mol/L氢氧化钠溶液；所述的化学发光激发液系统加样方法为先加入激发液1，间隔2s后，再加入激发液2。

10.一种制备权利要求8或9所述试剂盒的方法，包括以下步骤：

1)超支化聚缩水甘油醚的制备：以三羟甲基丙烷作为反应的引发剂，采用CH₃OK对TMP的羟基进行部分去质子化，去质子化部分占总部分的10％，然后将缩水甘油缓慢滴加进入体系引发聚合，反应温度95～100℃，反应10～12小时；反应结束后产物溶解在甲醇中，通过强酸型阳离子交换树脂中和；聚合物通过在丙酮中析出，甲醇中溶解，重复两次进行提纯，最后在75～85℃的真空中干燥13～16小时，得超支化聚缩水甘油醚；

2)超支化聚缩水甘油醚的修饰：将超支化聚缩水甘油醚用琥珀酰亚胺基碳酸酯进行修饰得DSC修饰的超支化聚缩水甘油醚；

3)超支化聚缩水甘油醚对磁性微球的修饰：向氨基磁性微球溶液中滴加上一步制备的DSC修饰的超支化聚缩水甘油醚溶液，于摇床中反应0.5～1h，反应结束后，向反应体系中加入50mM PBS溶液继续反应0.5～1h，将多余的NHS酯水解后，使用pH＝7.5的50mM PBS溶液清洗，清洗过程中使用磁性分离架分离磁性微球，清洗结束后，使用pH＝7.5的50mM PBS溶液重悬；

4)超支化聚缩水甘油醚修饰磁性微球偶联探测分子：对上一步制备的超支化聚缩水甘油醚修饰的磁性微球的羧基进行活化，活化结束后使用pH＝7.5的50mMPBS溶液清洗，将探测分子用pH＝8.0的100mM碳酸氢钠缓冲液稀释到后，加入到磁性微球溶液中，置于200～220rpm 35～37℃摇床上反应2.5～3.5h，反应结束后使用,pH＝7.5的50mM PBS溶液清洗悬浮磁性微球，制得超支化聚缩水甘油醚纳米磁性微球-探测分子复合物固相载体；

5)发光物质的标记：捕获分子加入到pH＝8.0的50mM PBS缓冲液中，加入0.3～1mmol/L的发光物质，混合，室温避光反应20～30min，使用pH＝6.5的10mM PBS缓冲液透析除去未结合的发光物质，最后加入50％重蒸甘油，置于-20℃保存；

6)配制激发液1和激发液2：激发液1为含有0.5％过氧化氢溶液的0.2M的硝酸溶液；激发液2为含有1％Tween‐20的0.5M氢氧化钠溶液。