CN105652018A - 一种c-肽定量测定试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种C-肽定量测定试剂盒，该C-肽定量测定试剂盒包括抗C-肽抗体包被的磁性微粒、吖啶酯标记的抗C-肽抗体、样本稀释液、C-肽标准品、反应清洗液、预激发液、激发液，主要是用于糖尿病的检测。本发明采用磁性分离技术与免疫反应结合，通过采用吖啶酯或吖啶磺酰胺或吖啶磺酰胺衍生物作为标记物，提供一种高灵敏度、高特异性、操作方便、线性范围广、分析快速的C-肽定量检测试剂盒。检测样本既可以是血清，也可以是尿液，检测结果准确可靠,且该C-肽定量检测试剂盒保存年限久，可保存一年之久。
Description
技术领域
本发明属于糖尿病的辅助诊断技术领域，具体涉及人体血清或尿液中C-肽定量测定的试剂盒。
背景技术
糖尿病是由于胰岛素分泌缺陷或胰岛素作用障碍所致的以高血糖为特征的代谢性疾病。C-肽是胰岛β细胞的分泌产物，它与胰岛素有一个共同的前体——胰岛素原。一个分子的胰岛素原经酶切后，裂解成一个分子的胰岛素和一个分子的C-肽。在使用胰岛素治疗的糖尿病病人中，胰岛素的测定会受到外源性胰岛素和外周循环抗体的干扰。但进行胰岛素治疗的病人所检测到的胰岛素抗体对C-肽没有显著干扰。C-肽从人体产生后，不被肝细胞所摄取，主要在肾脏代谢并从肾脏排出体外。C-肽无生物活性，也不与细胞膜上的受体结合，且不被降解C-肽的测定方法是比胰岛素本身更为可靠的指示胰岛素分泌水平的方法。另外，对于应用外源性胰岛素的测定，由于C-肽与胰岛素抗体无交叉反应，不受胰岛素抗体干扰，外源性胰岛素又不含C-肽，故C-肽测定显得更为重要，从而了解胰岛β细胞功能情况，对于指导治疗有积极作用。
目前临床上用于测定C-肽的方法主要有放射免疫分析、酶联免疫分析、时间分辨荧光免疫分析和化学发光免疫分析等。放射免疫分析受方法本身工作原理的限制，其灵敏度及抗干扰能力差，存在放射线辐射和污染等问题，已基本上退出市场。而酶联免疫分析受方法学的限制，特异性和灵敏性有待提高，一般作为初筛，现阶段还不能作为定性、定量手段。时间分辨荧光免疫分析进行超微量分析的时候，会受到激发光的杂散光影响，进而导致灵敏度受到限制。化学发光免疫分析较其它分析方法高灵敏度、高特异性、操作方便、线性范围广、分析快，是现阶段的主流分析方法。而找到一种新的、能替代化学发光免疫分析的技术方法也是至关重要的。
发明内容
本发明采用磁性分离技术与免疫反应结合，通过采用吖啶酯或吖啶磺酰胺或磺酰胺衍生物作为标记物，提供一种高灵敏度、高特异性、操作方便、线性范围广、分析快速的C-肽定量检测试剂盒。检测样本既可以是离体血清，也可以是离体尿液，检测结果准确可靠，且该C-肽定量测定试剂盒在制备过程中添加有防腐剂，使得该试剂盒保存年限久。
本发明提供的利用化学发光磁性微粒免疫检测技术，通过双抗体夹心法定量检测人血清或尿液中C-肽含量的试剂盒，能快速检测血清或尿液中C-肽含量，且检测结果具有很高的灵敏度和特异性。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案如下：
一种C-肽定量测定试剂盒，其特征在于：包括抗C-肽抗体包被的磁性微粒、吖啶酯标记的抗C-肽抗体；
所述抗C-肽抗体包被的磁性微粒包括带有羧基或对甲苯磺酰基的磁性微粒、抗C-肽抗体、包被缓冲液、保存液、封闭液；
所述吖啶酯标记的抗C-肽抗体由标记物、抗C-肽抗体、标记缓冲液、保存液制备而成；所述标记物为吖啶酯或吖啶磺酰胺或吖啶磺酰胺衍生物中的任意一种。
优选地，所述带有羧基的抗C-肽抗体包被的磁性微粒还包括活化剂和偶联剂，所述带有羧基的抗C-肽抗体包被的磁性微粒的制备方法如下：
1)配制所述包被缓冲液、封闭液、保存液、活化剂、偶联剂；
2)抗C-肽抗体预处理：取所述抗C-肽抗体用超滤离心管进行离心，弃掉滤液，往浓缩的抗体中加入包被缓冲液，继续离心，重复4-6次，然后将离心管倒置离心，浓缩收集抗体备用；
3)制备抗C-肽抗体包被的磁性微粒：取所述带有羧基的磁性微粒用包被缓冲液清洗4-6次，磁分离去除上清液，加入活化剂和偶联剂，用漩涡混合器充分混匀悬浮磁性微粒，反应30-40min；再用包被缓冲液清洗4-6次，磁分离架上去除上清液，添加步骤2)预处理过的抗C-肽抗体，添加包被缓冲液，在25℃下，用漩涡混合器旋转包被15-20小时；反应完成后用包被缓冲液清洗4-6次，磁分离去除上清液，加入封闭液，在25℃下，用漩涡混合器旋转包被4-5小时，最后用保存液清洗4-6次，用保存液稀释后，2-8℃保存。
优选地，所述带有甲苯磺酰基的抗C-肽抗体包被的磁性微粒还包括催化剂，所述带有甲苯磺酰基的抗C-肽抗体包被的磁性微粒的制备方法如下：
1)配制所述包被缓冲液、封闭液、保存液、催化剂；
2)抗C-肽抗体预处理：取所述抗C-肽抗体用超滤离心管进行离心，弃掉滤液，往浓缩的抗体中加入包被缓冲液，继续离心，重复4-6次，然后将离心管倒置离心，浓缩收集抗体备用；
3)制备抗C-肽抗体包被的磁性微粒：取所述带有对甲苯磺酰基的磁性微粒用包被缓冲液清洗4-6次，磁分离去除上清液，加入催化剂，用漩涡混合器充分混匀悬浮磁性微粒，反应30-40min；再用包被缓冲液清洗4-6次，磁分离去除上清液，添加步骤2)预处理过的抗C-肽抗体，添加包被缓冲液，在25℃下，用漩涡混合器旋转包被15-20小时；反应完成后用包被缓冲液清洗4-6次，磁分离去除上清液，加入封闭液，在25℃下，用漩涡混合器旋转包被4-5小时，最后用保存液清洗4-6次，用保存液稀释后，2-8℃保存。
优选地，所述吖啶酯标记的抗C-肽抗体的制备方法如下：
1)配制所述标记缓冲液、保存液；
2)抗C-肽抗体预处理：取所述抗C-肽抗体用超滤离心管进行离心，弃掉滤液，往浓缩的抗体中加入标记缓冲液，继续离心，重复4-6次，然后将离心管倒置离心，浓缩收集抗体备用；
3)制备吖啶酯标记的抗C-肽抗体：将所述标记物加入步骤2)预处理的抗体中，添加标记缓冲液，避光37℃震荡反应16小时，反应完成后，用快速高效蛋白纯化系统纯化，去除未结合的标记物，收集标记的抗体，用保存液稀释后，2-8℃保存。优选地，所述C-肽定量测定试剂盒还包括样本稀释液、反应清洗液、预激发液、激发液、C-肽标准品。
优选地，所述样本稀释液为添加有表面活性剂和防腐剂的Tris缓冲液或MES缓冲液或磷酸缓冲液。
优选地，所述反应清洗液为添加有表面活性剂和防腐剂、浓度为0.01M磷酸盐缓冲液组成。
优选地，所述预激发液为浓度为13-14g/L过氧化氢和浓度为3-4g/L硝酸组成的水溶液。
优选地，所述激发液为氢氧化钠水溶液。
优选地，所述C-肽标准品的制备方法如下：
(1)配制标准品稀释液；
(2)制备所述C-肽标准品：用标准品稀释液溶解C-肽抗原，配制目标浓度为60ng/mL的C-肽抗原高浓度原液，采用C-肽标准品进行标示，测出其实际浓度值，根据实际浓度值，用标准品稀释液稀释配制不同浓度C-肽标准品，配制好的C-肽标准品分装到西林瓶中，每瓶1mL，冻干后，2-8℃保存。
本发明的有益技术效果如下：
本发明采用磁性分离技术与免疫反应结合，通过采用吖啶酯或吖啶磺酰胺或吖啶磺酰胺衍生物作为标记物，提供一种高灵敏度、高特异性、操作方便、线性范围广、分析快速的C-肽定量测定试剂盒。检测样本既可以是血清，也可以是尿液，检测结果准确可靠，且该C-肽定量测定试剂盒在制备过程中添加防腐剂，使得该试剂盒保存年限久，可保存一年之久。
具体实施方式
下面对本发明作进一步说明：
本发明的C-肽定量测定试剂盒包括抗C-肽抗体包被的磁性微粒(M试剂)、吖啶酯标记的抗C-肽抗体(R试剂)、样本稀释液、C-肽标准品、反应清洗液、预激发液、激发液。
实施例一
该实施例中所述抗C-肽抗体包被的磁性微粒(M试剂)表面带有羧基，其抗C-肽抗体为单克隆抗体，磁性微粒粒径为1.5μm。
所述抗C-肽抗体包被的磁性微粒的制备方法如下：
(1)溶液的配制：
包被缓冲液：0.05M2-(N-吗啡啉)乙磺酸(MES)缓冲液，其中所述包被缓冲液pH＝5.5；
活化剂：100mL包被缓冲液添加1g二氯化乙烯(EDC)；
偶联剂：100mL包被缓冲液添加2gN-羟基丁二酰亚胺(NHS)；
封闭液：100mL包被缓冲液添加5g牛血清蛋白(BSA)；
保存液：由浓度为25mMTris-HCl溶液或MES溶液或者3-(N-吗啉)丙磺酸溶液(MOPS)、浓度为0.15MNaCl溶液、质量百分比为0.5％BSA、质量百分比为2％海藻糖或者蔗糖、质量百分比为1％叠氮钠、质量百分比为0.05％Tween-20或TritonX-100组成，其中所述保存液pH＝7.3。
(2)抗C-肽抗体包被的磁性微粒制备过程：
取1mg抗C-肽抗体，用30K或50K的超滤离心管在8000-10000r/min下离心3-5min，弃掉滤液及滤液中含有的叠氮钠或一级胺，然后将浓缩的抗C-肽抗体加入包被缓冲液，继续离心，重复4-6次，将离心管倒置离心1-2min收集超滤过的抗体备用；取40-100mg带羧基的磁性微粒用包被缓冲液清洗4-6次，磁分离去除上清液，加入160μL活化剂和250μL偶联剂，用漩涡混合器充分混匀悬浮的磁性微粒，反应30-40min，再用包被缓冲液清洗4-6次，磁分离去除上清液，加入预处理过的抗体，添加包被缓冲液至总体积为1mL，在25℃下，用漩涡混合器旋转包被15-20小时，反应完成后用包被缓冲液清洗4-6次，磁分离去除上清液，加入1mL封闭液，在25℃下，用漩涡混合器旋转包被4-5小时，最后用保存液清洗4-6次，用保存液稀释至300-1200μg/mL，2-8℃保存。
所述吖啶酯标记的抗C-肽抗体(R试剂)其抗C-肽抗体为单克隆抗体，标记物为吖啶酯或吖啶磺酰胺或吖啶磺酰胺衍生物中的任意一种。
所述吖啶酯标记的抗C-肽抗体的制备方法如下：
(1)溶液的配制：
标记缓冲液：配制0.05M磷酸缓冲液，pH＝6.9
保存液：由浓度为25mMTris-HCl缓冲液或MES缓冲液或者MOPS缓冲液、浓度为0.15MNaCl溶液、质量百分比为0.5％BSA、质量百分比为0.5％海藻糖或者蔗糖、质量百分比为0.1％叠氮钠、质量百分比为0.05％Tween-20或TritonX-100，其中保存液pH＝7.3。
(2)吖啶酯标记的抗C-肽抗体制备过程：
取1mg抗C-肽抗体，用30K或50K的超滤离心管在8000-10000r/min下离心3-5min，弃掉滤液，加入标记缓冲液，继续离心，重复4-6次，将离心管倒置在8000-10000r/min离心1min收集超滤过的抗体备用。
取0.01-0.1mg吖啶酯或吖啶磺酰胺或吖啶磺酰胺衍生物加入超滤过的抗体中，其中标记物在使用前需要用DMSO溶液或DMF溶液溶解，添加标记缓冲液至总体积为0.5mL，37℃避光震荡反应16小时，反应完成后，用快速高效蛋白纯化系统纯化，去除未结合的标记物，收集标记抗体，用保存液稀释至0.1-0.9μg/mL，2-8℃保存。
所述C-肽标准品的制备过程如下：
(1)溶液的配制：
标准品稀释液：由25mMTris-HCl溶液或磷酸缓冲液、0.15MNaCl溶液、质量百分比为0.5％BSA、质量百分比为0.05％叠氮钠、质量百分比为0.05％Tween-20组成，其中所述标准品稀释液pH＝7.4。
(2)C-肽标准品制备过程：
用标准品稀释液溶解C-肽抗原，配制目标浓度为60ng/mL的C-肽抗原高浓度原液，采用C-肽标准品进行标示，测出其实际浓度值，根据实际浓度值，用标准品稀释液稀释配制不同浓度C-肽标准品，配制好的C-肽标准品分装到西林瓶中，每瓶1mL，冻干后，2-8℃保存。
所述样本稀释液为添加有表面活性剂和防腐剂的Tris缓冲液或MES缓冲液或磷酸缓冲液。样本稀释液的配方如下：由浓度为25mMTris-HCl缓冲液或MES缓冲液或磷酸缓冲液、浓度为0.15MNaCl溶液、质量百分比为0.05％叠氮钠、质量百分比0.05％Tween-20组成，其中所述样本稀释液pH＝7.4。
所述反应清洗液为添加有表面活性剂和防腐剂的0.01M磷酸盐缓冲液,反应清洗液pH为7.2-7.4。
所述预激发液由浓度为13g/L过氧化氢和浓度为3g/L硝酸组成的混合液制备而成。
所述激发液为氢氧化钠水溶液，氢氧化钠浓度为0.3mol/L。
实施例二
该实施例中所述抗C-肽抗体包被的磁性微粒(M试剂)表面带有羧基，其抗C-肽抗体为单克隆抗体，磁性微粒粒径为3μm。
所述抗C-肽抗体包被的磁性微粒的制备方法如下：
(1)溶液的配制：
包被缓冲液：0.1M2-(N-吗啡啉)乙磺酸(MES)缓冲液，其中所述包被缓冲液pH＝4.5；
活化剂：100mL包被缓冲液添加2g二氯化乙烯(EDC)；
偶联剂：100mL包被缓冲液添加1gN-羟基丁二酰亚胺(NHS)；
封闭液：100mL包被缓冲液添加10g牛血清蛋白(BSA)；
保存液：由浓度为50mMTris-HCl溶液或MES溶液或者3-(N-吗啉)丙磺酸溶液(MOPS)、浓度为0.2MNaCl溶液、质量百分比为5％BSA、质量百分比为0.5％海藻糖或者蔗糖、质量百分比为0.05％叠氮钠、体积百分比为1％Tween-20或TritonX-100组成，其中所述保存液pH＝6.9。
(2)抗C-肽抗体包被的磁性微粒制备过程：
取1mg抗C-肽抗体，用30K或50K的超滤离心管在8000-10000r/min下离心3-5min，弃掉滤液及滤液中含有的叠氮钠或一级胺，然后将浓缩的抗C-肽抗体加入包被缓冲液，继续离心，重复4-6次，将离心管倒置离心1-2min收集超滤过的抗体备用；取40-100mg带羧基的磁性微粒用包被缓冲液清洗4-6次，磁分离去除上清液，加入400μL活化剂和100μL偶联剂，用漩涡混合器充分混匀悬浮的磁性微粒，反应30-40min，再用包被缓冲液清洗4-6次，磁分离去除上清液，加入预处理过的抗体，添加包被缓冲液至总体积为1mL，在25℃下，用漩涡混合器旋转包被15-20小时，反应完成后用包被缓冲液清洗4-6次，磁分离去除上清液，加入3mL封闭液，在25℃下，用漩涡混合器旋转包被4-5小时，最后用保存液清洗4-6次，用保存液稀释至300-1200μg/mL，2-8℃保存。
所述吖啶酯标记的抗C-肽抗体(R试剂)其抗C-肽抗体为单克隆抗体，标记物为吖啶酯或吖啶磺酰胺或吖啶磺酰胺衍生物中的任意一种。
所述吖啶酯标记的抗C-肽抗体的制备方法如下：
(1)溶液的配制：
标记缓冲液：配制0.2M磷酸缓冲液，pH＝5.9
保存液：由浓度为50mMTris-HCl缓冲液或MES缓冲液或者MOPS缓冲液、浓度为0.2MNaCl溶液、质量百分比为5％BSA、质量百分比为2％海藻糖或者蔗糖、质量百分比为0.05％叠氮钠、体积百分比为1％Tween-20或TritonX-100，其中保存液pH＝6.9。
(2)吖啶酯标记的抗C-肽抗体制备过程：
取1mg抗C-肽抗体，用30K或50K的超滤离心管在8000-10000r/min下离心3-5min，弃掉滤液，加入标记缓冲液，继续离心，重复4-6次，将离心管倒置在8000-10000r/min离心1min收集超滤过的抗体备用。
取0.01-0.1mg吖啶酯或吖啶磺酰胺或吖啶磺酰胺衍生物加入超滤过的抗体中，其中标记物在使用前需要用DMSO溶液或DMF溶液溶解，添加标记缓冲液至总体积为0.5mL，37℃避光震荡反应16小时，反应完成后，用快速高效蛋白纯化系统纯化，去除未结合的吖啶酯或吖啶磺酰胺及其衍生物，收集标记抗体，用保存液稀释至0.1-0.9μg/mL，2-8℃保存。
所述C-肽标准品的制备过程如下：
(1)溶液的配制：
标准品稀释液：由50mMTris-HCl溶液或磷酸缓冲液、0.2MNaCl溶液、质量百分比为5％BSA、质量百分比为1％叠氮钠、体积百分比为1％Tween-20组成，其中所述标准品稀释液pH＝7.1。
(2)C-肽标准品制备过程：
用标准品稀释液溶解C-肽抗原，配制目标浓度为60ng/mL的C-肽抗原高浓度原液，采用C-肽标准品进行标示，测出其实际浓度值，根据实际浓度值，用标准品稀释液稀释配制不同浓度C-肽标准品，配制好的C-肽标准品分装到西林瓶中，每瓶1mL，冻干后，2-8℃保存。
所述样本稀释液为添加有表面活性剂和防腐剂的Tris缓冲液或MES缓冲液或磷酸缓冲液。样本稀释液的配方如下：由浓度为50mMTris-HCl缓冲液或MES缓冲液或磷酸缓冲液、浓度为0.2MNaCl溶液、质量百分比为1％叠氮钠、体积百分比1％Tween-20组成，其中所述样本稀释液pH＝7.1。
所述反应清洗液为添加有表面活性剂和防腐剂的0.01M磷酸盐缓冲液,反应清洗液pH为7.2-7.4。
所述预激发液由浓度为14g/L过氧化氢和浓度为4g/L硝酸组成的混合液制备而成。
所述激发液为氢氧化钠水溶液，氢氧化钠浓度为0.5mol/L。
实施例三
该实施例中所述抗C-肽抗体包被的磁性微粒(M试剂)表面带有羧基，其抗C-肽抗体为单克隆抗体，磁性微粒粒径为2μm。
所述抗C-肽抗体包被的磁性微粒的制备方法如下：
(1)溶液的配制：
包被缓冲液：0.75M2-(N-吗啡啉)乙磺酸(MES)缓冲液，其中所述包被缓冲液pH＝4.5；
活化剂：100mL包被缓冲液添加1.5g二氯化乙烯(EDC)；
偶联剂：100mL包被缓冲液添加1.5gN-羟基丁二酰亚胺(NHS)；
封闭液：100mL包被缓冲液添加8g牛血清蛋白(BSA)；
保存液：由浓度为35mMTris-HCl溶液或MES溶液或者3-(N-吗啉)丙磺酸溶液(MOPS)、浓度为0.18MNaCl溶液、质量百分比为3％BSA、质量百分比为1％海藻糖或者蔗糖、质量百分比为0.5％叠氮钠、体积百分比为0.2％Tween-20或TritonX-100组成，其中所述保存液pH＝7.1。
(2)抗C-肽抗体包被的磁性微粒制备过程：
取1mg抗C-肽抗体，用30K或50K的超滤离心管在8000-10000r/min下离心3-5min，弃掉滤液及滤液中含有的叠氮钠或一级胺，将浓缩的抗C-肽抗体加入包被缓冲液，继续离心，重复4-6次，将离心管倒置离心1-2min收集超滤过的抗体备用；取40-100mg带羧基的磁性微粒用包被缓冲液清洗4-6次，磁分离去除上清液，加入250μL活化剂和200μL偶联剂，用漩涡混合器充分混匀悬浮的磁性微粒，反应30-40min，再用包被缓冲液清洗4-6次，磁分离去除上清液，加入预处理过的抗体，添加包被缓冲液至总体积为1mL，在25℃下，用漩涡混合器旋转包被15-20小时，反应完成后用包被缓冲液清洗4-6次，磁分离去除上清液，加入2mL封闭液，在25℃下，用漩涡混合器旋转包被4-5小时，最后用保存液清洗4-6次，用保存液稀释至300-1200μg/mL，2-8℃保存。
所述吖啶酯标记的抗C-肽抗体(R试剂)其抗C-肽抗体为单克隆抗体，标记物为吖啶酯或吖啶磺酰胺或吖啶磺酰胺衍生物中的任意一种。
所述吖啶酯标记的抗C-肽抗体的制备方法如下：
(1)溶液的配制：
标记缓冲液：配制0.1M磷酸缓冲液，pH＝6.4；
保存液：由浓度为35mMTris-HCl缓冲液或MES缓冲液或者MOPS缓冲液、浓度为0.18MNaCl溶液、质量百分比为3％BSA、质量百分比为1％海藻糖或者蔗糖、质量百分比为0.5％叠氮钠、体积百分比为0.2％Tween-20或TritonX-100，其中保存液pH＝7.1。
(2)吖啶酯标记的抗C-肽抗体制备过程：
取1mg抗C-肽抗体，用30K或50K的超滤离心管在8000-10000r/min下离心3-5min，弃掉滤液，加入标记缓冲液，继续离心，重复4-6次，将离心管倒置在8000-10000r/min离心1min收集超滤过的抗体备用。
取0.01-0.1mg吖啶酯或吖啶磺酰胺或吖啶磺酰胺衍生物加入超滤过的抗体中，其中标记物在使用前需要用DMSO溶液或DMF溶液溶解，添加标记缓冲液至总体积为0.5mL，37℃避光震荡反应16小时，反应完成后，用快速高效蛋白纯化系统纯化，去除未结合的吖啶酯或吖啶磺酰胺及其衍生物，收集标记抗体，用保存液稀释至0.1-0.9μg/mL，2-8℃保存。
所述C-肽标准品的制备过程如下：
(1)溶液的配制：
标准品稀释液：由30mMTris-HCl溶液或磷酸缓冲液、0.18MNaCl溶液、质量百分比为3％BSA、质量百分比为0.5％叠氮钠、质量百分比为0.2％Tween-20组成，其中所述标准品稀释液pH＝7.2。
(2)C-肽标准品制备过程：
用标准品稀释液溶解C-肽抗原，配制目标浓度为60ng/mL的C-肽抗原高浓度原液，采用C-肽标准品进行标示，测出其实际浓度值，根据实际浓度值，用标准品稀释液稀释配制不同浓度C-肽标准品，配制好的C-肽标准品分装到西林瓶中，每瓶1mL，冻干后，2-8℃保存。
所述样本稀释液为添加有表面活性剂和防腐剂的Tris缓冲液或MES缓冲液或磷酸缓冲液。样本稀释液的配方如下：由浓度为30mMTris-HCl缓冲液或MES缓冲液或磷酸缓冲液、浓度为0.18MNaCl溶液、质量百分比0.5％叠氮钠、体积百分0.2％Tween-20组成，其中所述样本稀释液pH＝7.3。
所述反应清洗液为添加有表面活性剂和防腐剂的0.01M磷酸盐缓冲液,反应清洗液pH为7.2-7.4。
所述预激发液由浓度为13.5g/L过氧化氢和浓度为3.5g/L硝酸组成的混合液制备而成。
所述激发液为氢氧化钠水溶液，氢氧化钠浓度为0.4mol/L。
实施例四：
本实施例与实施例一的区别是所述C-肽抗体包被的磁性微粒的制备方法不同。
该实施例中所述C-肽抗体包被的磁性微粒表面带有对甲苯磺酰基，其中磁性微粒粒径为1.5μm，其制备方法如下：
(1)溶液的配制：
包被缓冲液：0.05M硼酸缓冲液，其中所述包被缓冲液pH＝9.5；
催化剂：1L包被缓冲液添加2M硫酸铵
封闭液：100mL包被缓冲液添加5gBSA；
保存液：由浓度为25mMTris-HCl缓冲液或MES缓冲液或者MOPS、浓度为0.15MNaCl溶液、质量百分比为0.5％BSA、质量百分比为2％海藻糖或者蔗糖、质量百分比为1％叠氮钠、体积百分比为0.05％Tween-20或TritonX-100组成，其中所述保存液pH＝7.3。
(2)C-肽抗体包被的磁性微粒制备过程：
取1mg抗C-肽抗体，用30K或50K的超滤离心管在8000-10000r/min下离心3-5min进行浓缩，弃掉滤液，加入包被缓冲液，继续离心，重复4-6次，将离心管倒置离心1min收集超滤过的抗体备用。
取40-100mg带有对甲苯磺酰基的磁性微粒用包被缓冲液清洗4-6次，磁分离去除上清液，加入预处理过的抗体，添加包被缓冲液至总体积为2mL，再加入2mL催化剂，在37℃下，用漩涡混合器旋转包被18-20小时，反应完成后再加入1mL封闭液，在37℃下，继续用漩涡混合器旋转包被5-7小时，最后用保存液清洗4-6次，用保存液稀释至300-1200μg/mL，2-8℃保存。
实施例五
本实施例与实施例二的区别是所述C-肽抗体包被的磁性微粒的制备方法不同。
该实施例中所述C-肽抗体包被的磁性微粒表面带有对甲苯磺酰基，其中磁性微粒粒径为3μm，其制备方法如下：
(1)溶液的配制：
包被缓冲液：0.1M硼酸缓冲液，其中所述包被缓冲液pH＝8.5；
催化剂：1L包被缓冲液添加4M硫酸铵
封闭液：100mL包被缓冲液添加10gBSA；
保存液：由浓度为50mMTris-HCl缓冲液或MES缓冲液或者MOPS、浓度为0.2MNaCl溶液、质量百分比为5％BSA、质量百分比为0.5％海藻糖或者蔗糖、质量百分比为0.05％叠氮钠、体积百分比为1％Tween-20或TritonX-100组成，其中所述保存液pH＝6.9。
(2)C-肽抗体包被的磁性微粒制备过程：
取1mg抗C-肽抗体，用30K或50K的超滤离心管在8000-10000r/min下离心3-5min进行浓缩，弃掉滤液，加入包被缓冲液，继续离心，重复4-6次，将离心管倒置离心1min收集超滤过的抗体备用。
取40-100mg带对甲苯磺酰基的磁性微粒用包被缓冲液清洗4-6次，磁分离去除上清液，加入预处理过的抗体，添加包被缓冲液至总体积为5mL，再加入5mL催化剂，在37℃下，用漩涡混合器旋转包被18-20小时，反应完成后再加入1mL封闭液，在37℃下，继续用漩涡混合器旋转包被5-7小时，最后用保存液清洗4-6次，用保存液稀释至300-1200μg/mL，2-8℃保存。
实施例六
本实施例与实施例三的区别是所述C-肽抗体包被的磁性微粒的制备方法不同。
该实施例中所述C-肽抗体包被的磁性微粒表面带有对甲苯磺酰基，其中磁性微粒粒径为2μm，其制备方法如下：
(1)溶液的配制：
包被缓冲液：0.075M硼酸缓冲液，其中所述包被缓冲液pH＝9.2；
催化剂：1L包被缓冲液添加3M硫酸铵
封闭液：100mL包被缓冲液添加8gBSA；
保存液：由浓度为35mMTris-HCl缓冲液或MES缓冲液或者MOPS、浓度为0.18MNaCl溶液、质量百分比为2％BSA、质量百分比为1％海藻糖或者蔗糖、质量百分比为0.5％叠氮钠、体积百分比为0.5％Tween-20或TritonX-100组成，其中所述保存液pH＝7.1。
(2)C-肽抗体包被的磁性微粒制备过程：
取1mg抗C-肽抗体，用30K或50K的超滤离心管在8000-10000r/min下离心3-5min进行浓缩，弃掉滤液，加入包被缓冲液，继续离心，重复4-6次，将离心管倒置离心1min收集超滤过的抗体备用。
取40-100mg带对甲苯磺酰基的磁性微粒用包被缓冲液清洗4-6次，磁分离去除上清液，加入预处理过的抗体，添加包被缓冲液至总体积为3mL，再加入4mL催化剂，在37℃下，用漩涡混合器旋转包被18-20小时，反应完成后再加入1mL封闭液，在37℃下，继续用漩涡混合器旋转包被5-7小时，最后用保存液清洗4-6次，用保存液稀释至300-1200μg/mL，2-8℃保存。
应用实施例
对采自237例健康人群空腹体检的离体血清样本进行检测，将检测结果的进行统计学分析，确定离体血清样本C-肽含量正常值范围为：0.79-5.10ng/mL。
离体尿液样本采自89例健康人群24小时尿液，将检测结果进行统计学分析，确定离体尿液样本中C-肽含量正常值范围为：24.0-208.2ng/mL。
离体样本的具体检测步骤如下：
1、加25μLC-肽校准品或离体样本至反应杯底部，检测离体样本前需用样本稀释液稀释10倍；
2、加50μLM试剂至反应杯底部，混匀震荡37℃反应15分钟；
3、反应完后，使用磁分离架，分离磁性微粒，去除上清液，加入200μL反应清洗液，清洗磁性微粒，反复清洗5次；
4、清洗后，去除上清液，加入100μLR试剂，混匀震荡37℃反应15分钟；
5、反应完后，使用磁分离架，分离磁性微粒，去除上清液，加入200μL反应清洗液，清洗磁性微粒，反复清洗5次；
6、清洗后，去除上清液，加入100μL预激发液，混匀磁性微粒，准备检测发光值；
7、加100μL激发液至反应杯中，迅速用准备好的发光检测仪进行检测，其中C-肽校准品需配制5个不同浓度的样品，并将每份标准品分别检测两次，根据对应发光值，绘制标准曲线。
综合以上离体样本C-肽浓度分布情况，本试剂盒C肽正常参考值范围如下：
对比实施例
C-肽定量测定试剂盒与罗氏C肽定量测定试剂盒的对比测试如下：
检测146例离体样本，样本类型为离体血清。其中，男性71例(48.6％)，女性75例(51.4％)；年龄分布在2个月-84岁；糖尿病患者49例(33.6％)，健康样本34例(23.3％)，其他病例63例(43.1％)。采用国家标准品的检测结果如下，低值异常样本25例(17.1％)，正常样本102例(69.9％)，高值异常样本19例(13.0％)。
经C-肽定量测定试剂盒与罗氏C肽定量测定试剂盒检测，146例离体样本用罗氏C肽定量测定试剂盒(电化学发光法)检测出异常样本44例，正常样本102例；用本发明试剂盒检测出异常样本41例，正常样本105例，两者不一致样本有5例。本发明试剂盒与国家标准品的检测结果相比，待考核试剂的异常符合率达90.9％，正常符合率达99.0％，总符合率达96.6％，Kappa值达0.917(P<0.001)，可见，本发明的试剂盒准确度高、灵敏度高、特异性好。从定量测定值分析，与对比试剂测值相比，相关系数为0.993(P<0.01)，线性回归方程为Y＝0.75+0.974X(P<0.001)，相关性良好。
本发明的C-肽定量测定试剂盒是通过磁性分离技术是以纳米或微粒级的磁性微粒为载体，利用结合于磁性微粒表面的蛋白质所提供的特异的亲和特性，在加磁场的定向控制下，通过亲和吸附、清洗、解吸操作，可以一步从复杂的生物体系中分离到目标物分子，具有磁性分离简单方便、亲和吸附高特异性及高敏感性等众多优点。化学发光免疫分析结合磁性分离技术，磁性分离法不需离心，当反应液中的抗原、抗体结合反应达到平衡后，只要将试管架放到磁板上，瞬间分离，简便快速、重复性好，可实现自动化分析。由于磁性微粒的直径一般是0.1-10μm，在液体中呈悬浮状态，近似液相反应，几千万颗微粒的表面积比等量的固相载体表面积大得多，可吸附更多的抗体，能加快免疫反应速度，缩短反应时间。
该C-肽定量测定试剂盒主要是用于糖尿病的分析及了解胰岛素B细胞的功能。无论是1型还是2型糖尿病患者，初病时均可通过该试剂盒检测胰岛素水平以判定胰岛素B细胞的功能，对指导治疗有积极效果。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本领域的技术人员在本发明所揭露的技术范围内，可不经过创造性劳动想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所限定的保护范围为准。
Claims (10)
1.一种C-肽定量测定试剂盒，其特征在于：包括抗C-肽抗体包被的磁性微粒、吖啶酯标记的抗C-肽抗体；
所述抗C-肽抗体包被的磁性微粒包括带有羧基或对甲苯磺酰基的磁性微粒、抗C-肽抗体、包被缓冲液、保存液、封闭液；
所述吖啶酯标记的抗C-肽抗体由标记物、抗C-肽抗体、标记缓冲液、保存液制备而成；所述标记物为吖啶酯或吖啶磺酰胺或吖啶磺酰胺衍生物中的任意一种。
2.根椐权利要求1所述的C-肽定量测定试剂盒，其特征在于：所述带有羧基的抗C-肽抗体包被的磁性微粒还包括活化剂和偶联剂，所述带有羧基的抗C-肽抗体包被的磁性微粒的制备方法如下：
1)配制所述包被缓冲液、封闭液、保存液、活化剂、偶联剂；
2)抗C-肽抗体预处理：取所述抗C-肽抗体用超滤离心管进行离心，弃掉滤液，往浓缩的抗体中加入包被缓冲液，继续离心，重复4-6次，然后将离心管倒置离心，浓缩收集抗体备用；
3)制备抗C-肽抗体包被的磁性微粒：取所述带有羧基的磁性微粒用包被缓冲液清洗4-6次，磁分离去除上清液，加入活化剂和偶联剂，用漩涡混合器充分混匀悬浮磁性微粒，反应30-40min；再用包被缓冲液清洗4-6次，磁分离架上去除上清液，添加步骤2)预处理过的抗C-肽抗体，添加包被缓冲液，在25℃下，用漩涡混合器旋转包被15-20小时；反应完成后用包被缓冲液清洗4-6次，磁分离去除上清液，加入封闭液，在25℃下，用漩涡混合器旋转包被4-5小时，最后用保存液清洗4-6次，用保存液稀释后，2-8℃保存。
3.根椐权利要求1所述的C-肽定量测定试剂盒，其特征在于：所述带有甲苯磺酰基的抗C-肽抗体包被的磁性微粒还包括催化剂，所述带有甲苯磺酰基的抗C-肽抗体包被的磁性微粒的制备方法如下：
1)配制所述包被缓冲液、封闭液、保存液、催化剂；
2)抗C-肽抗体预处理：取所述抗C-肽抗体用超滤离心管进行离心，弃掉滤液，往浓缩的抗体中加入包被缓冲液，继续离心，重复4-6次，然后将离心管倒置离心，浓缩收集抗体备用；
3)制备抗C-肽抗体包被的磁性微粒：取所述带有对甲苯磺酰基的磁性微粒用包被缓冲液清洗4-6次，磁分离去除上清液，加入催化剂，用漩涡混合器充分混匀悬浮磁性微粒，反应30-40min；再用包被缓冲液清洗4-6次，磁分离去除上清液，添加步骤2)预处理过的抗C-肽抗体，添加包被缓冲液，在25℃下，用漩涡混合器旋转包被15-20小时；反应完成后用包被缓冲液清洗4-6次，磁分离去除上清液，加入封闭液，在25℃下，用漩涡混合器旋转包被4-5小时，最后用保存液清洗4-6次，用保存液稀释后，2-8℃保存。
4.根椐权利要求1所述的C-肽定量测定试剂盒，其特征在于：所述吖啶酯标记的抗C-肽抗体的制备方法如下：
1)配制所述标记缓冲液、保存液；
2)抗C-肽抗体预处理：取所述抗C-肽抗体用超滤离心管进行离心，弃掉滤液，往浓缩的抗体中加入标记缓冲液，继续离心，重复4-6次，然后将离心管倒置离心，浓缩收集抗体备用；
3)制备吖啶酯标记的抗C-肽抗体：将所述标记物加入步骤2)预处理的抗体中，添加标记缓冲液，避光37℃震荡反应16小时，反应完成后，用快速高效蛋白纯化系统纯化，去除未结合的标记物，收集标记的抗体，用保存液稀释后，2-8℃保存。
5.根椐权利要求1所述的C-肽定量测定试剂盒，其特征在于：所述C-肽定量测定试剂盒还包括样本稀释液、反应清洗液、预激发液、激发液、C-肽标准品。
6.根椐权利要求5所述的C-肽定量测定试剂盒，其特征在于：所述样本稀释液为添加有表面活性剂和防腐剂的Tris缓冲液或MES缓冲液或磷酸缓冲液。
7.根椐权利要求5所述的C-肽定量测定试剂盒，其特征在于：所述反应清洗液为添加有表面活性剂和防腐剂、浓度为0.01M磷酸盐缓冲液组成。
8.根椐权利要求5所述的C-肽定量测定试剂盒，其特征在于：所述预激发液为浓度为13-14g/L过氧化氢和浓度为3-4g/L硝酸组成的水溶液。
9.根椐权利要求5所述的C-肽定量测定试剂盒，其特征在于：所述激发液为氢氧化钠水溶液。
10.根椐权利要求5所述的C-肽定量测定试剂盒，其特征在于：所述C-肽标准品的制备方法如下：
(1)配制标准品稀释液；
(2)制备C-肽标准品：用标准品稀释液溶解C-肽抗原，配制目标浓度为60ng/mL的C-肽抗原高浓度原液，采用C-肽标准品进行标示，测出其实际浓度值，根据实际浓度值，用标准品稀释液稀释配制不同浓度C-肽标准品，配制好的C-肽标准品分装到西林瓶中，每瓶1mL，冻干后，2-8℃保存。
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