CN103323590B - 一种基于纤维膜捕集分离的定量检测装置及其检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种基于纤维膜捕集分离的定量检测装置及其检测方法，定量检测装置包括分离测试杯、反应杯、分析缓冲液和洗涤液；其中，分离测试杯由接收池、吸水杯和二者之间的微孔滤膜组成，反应杯底部固化有捕获试剂和标记试剂，捕获试剂固定于乳胶微球表面。检测方法包括：结合反应、分离、洗涤、检测。本发明既保持了免疫渗滤（IF）和免疫层析（IC）操作简便、检测快速的特点，又在检测精密性和灵敏度方面明显优于IF、IC，因此可以有效地实施定量的免疫检测和核酸杂交分析，用于定量检测蛋白质、核酸、小分子物质、微生物等物质。

Description

一种基于纤维膜捕集分离的定量检测装置及其检测方法

技术领域

本发明属于生物分析装置及其检测方法领域，特别涉及一种基于纤维膜捕集分离的定量检测装置及其检测方法。

背景技术

自60年代以来，以免疫分析和核酸分析为代表的生物分析技术一直广泛应用于临床诊断、药物监控、食品/环境监控、流行病学调查等各个领域，成为了人们生产、生活和科学实践不可缺少的检测工具。随着抗体/抗原制备技术的进步，以及各种高灵敏检测技术、核酸扩增技术的发展和检测设备自动化水平的提高，近年来，生物分析的发展逐渐向中心实验室检测和POCT检测（Point-of-Care Testing）两个方向分化。中心实验室检测一般需要经过检测申请、采样、标本传输、标本处理、设备及试剂准备、检测、数据处理、质控、结果确认、结果传输、结果解释等诸多环节，这些环节确保了大批量标本检测的有序性和准确性，但大大延长了检测周转时间（Turnaround Time），因此中心实验室检测难以很好地满足急诊、术前、血检、血筛以及毒品、食品检测等要求及时出具检测结果的检验需求，而POCT检测为这些应用提供了一很好的实现手段。

POCT又被称为Near patient testing，Easy-to-use testing，Bedside testing,Alternative sitetesting，Decentralized testing等，这些名称从不同角度反映了POCT检测的特点(Paul Yager,Gonzalo J.Domingo,and John Gerdes,Point-of-Care Diagnostics for Global Health,Annu.Rev.Biomed.Eng.2008.10:107-144)，即：可在病人身边实施并即时获得结果，操作简单，可分散进行；另外，POCT往往还具有试剂稳定、可随机测定、不需大型仪器、检测者不需特殊训练等特点。因此，POCT检测特别适用于县级医院、社区医院、初级实验室、急诊室、医师诊所、病人床旁以及各种需要现场检测的场所，如毒品检测，环境/食品安全检测，等。

以呈色微粒（胶体金或乳胶微球）为标记的免疫层析（Immunochromatography,IC）和免疫渗滤（Immuno-filtration Testing,IF）是目前应用最广的POCT检测模式。免疫层析以条状纤维膜（如：硝酸纤维素膜）或密集微柱状表面材料为免疫试剂载体，样本可通过毛细作用在层析条上泳动,样品中的待测物与层析条上针对待测物的抗体或抗原发生免疫反应；随着层析的进行，形成的免疫复合物被截留在层析材料的检测带区域，通过目测便可得到直观的检测结果。免疫渗滤试验也以纤维膜作为免疫试剂的载体，由于纤维膜的可滤过性，标记抗原-抗体（或标记抗体-抗原）预反应形成的免疫复合物在透过纤维膜的同时与纤维膜上固定的免疫试剂发生结合反应，从而在纤维膜上固定有免疫试剂的区域（往往呈斑点形状）形成色斑，从而也可直观地判定检测结果的阴阳性。

免疫层析与免疫渗滤的操作简单快速,分析结果清楚,易于判断,且无须仪器或只需简单仪器,因此,近年来这二类检测产品得到了广泛普及，成为目前最主要的POCT检测方式。但无论是免疫层析还是免疫渗滤，其结合反应均在固定有结合试剂的纤维膜上进行，尽管目前不同商家提供的膜材在均质性上已有了很大的改进（如：Pall公司的Vivid^TM170硝纤膜），但这些膜材在材质上仍难以达到定量检测所要求的高度均质性；另外，在制作检测单元时，膜-膜之间或膜与吸水材料的搭接密实程度也不可避免地存在差异，从而直接导致不同检测单元之间固相试剂活性、吸水材料吸水效率等方面的差异，影响了检测结果的精确性。对于免疫层析，不同检测之间标记试剂的溶解速率、扩散速率也会直接影响反应程度。这是以膜材为结合反应载体的免疫层析和免疫渗滤技术用于定量检测时精密性不高的主要原因，因此免疫层析和免疫渗滤多为定性检测或半定量检测。为解决这一问题，加拿大RAMP检测平台（Response Biomedical公司）采用预反应-层析二步骤检测模式（Harris,PC.Fong,WK.Cloney,L.Immunoassay employing two-step internal calibration reaction,US2005042668），这种方式缓解了纤维膜的不均一性导致的检测精密性问题，可以较好地实现待测物的定量检测，但其检测的精密度仍难以达到常规检测的同等水平(Alan H.B.Wu,Andrew Smith,Robert H.Christenson,MaryAnn M.Murakami,Fred S.Apple.Evaluation of a point-of-care assay for cardiacmarkers for patients suspected of acute myocardial infarction.Clinica Chimica Acta,2004,346,211–219)，而且其检测浓度范围也因荧光标记的内滤效应而仅1-2个数量级。

发明内容

本发明提供一种基于纤维膜捕集分离的定量及其检测方法专用装置，主要用于解决现有IF、IC技术定量检测精确度低的技术问题；该方法既保持了IF、IC操作简便、检测快速的特点，又在检测精密性和灵敏度方面明显优于IF、IC，因此可以有效地实施定量的免疫检测和核酸杂交分析。同时，对于待测物的检测浓度范围，也明显宽于IF、IC等常规POCT方法。

本发明的一种基于纤维膜捕集分离的定量检测装置，所述定量检测装置包括分离测试杯、反应杯、分析缓冲液和洗涤液；其中，分离测试杯由接收池、吸水杯和二者之间的微孔滤膜组成（接收池用以容纳结合反应后的反应溶液，吸水杯用以吸收接收池中的水溶液，滤膜呈交织的网状结构，用以捕集乳胶微球，通过洗涤使乳胶微球表面的复合物与游离标记试剂得以分离，该分离测试杯通用于所有待测物的检测），反应杯底部固化有捕获试剂和标记试剂，捕获试剂固定于乳胶微球表面。

所述吸水杯包括吸水柱芯和吸水杯空腔，吸水柱芯的直径与吸水杯空腔的直径一致，高度高于吸水杯空腔。填入后能充实整个空腔，以增加柱芯的稳固性，保证其吸水速度、吸水容量的一致性；但需要说明的是，即使柱芯在吸水速度、吸水容量存在一定差异，也并不明显影响本发明所述方法的检测准确性和精密性。

所述吸水柱芯为由纤维素或合成纤维制作的柱状棉芯（Filtrona Fibertec，PALL）或由层状吸水材料层叠、压制后切割成的柱状体；所述吸水柱芯高度为空腔高度的1.05-1.20倍。具体尺寸因吸水柱芯材质的硬度、弹性而定，其目的是使柱芯上的滤膜与接收池底部紧密贴合。

所述微孔滤膜被压制于接收池和吸水杯之间，紧贴于吸水柱芯之上。

所述微孔滤膜为玻璃纤维或聚酯或其他具有类似功能的纤维材料，要求其：A)呈半透明或透明，使埋于膜材内部的乳胶微球上的复合物所含的标记物能被激发光有效激发，且发射光也能有效透过滤膜而被光电倍增管采集；B)膜材孔径与所用乳胶微粒的粒径相匹配，使滤膜能有效捕集乳胶微球；C）膜材材质与所用标记物相匹配，使滤膜呈现尽可能小的背景信号。微孔滤膜的孔径分布为1-8微米。

所述乳胶微球直径与微孔滤膜孔径相匹配，乳胶微球表面含有活性官能团。

所述标记试剂为荧光标记物、上转换发光物质、化学发光物质、酶或放射性核素。

所述荧光标记物为Eu³⁺、Sm³⁺、Tb³⁺螯合物或包埋有Eu³⁺、Sm³⁺、Tb³⁺螯合物的荧光纳米微粒。

所述分析缓冲液含有酸碱缓冲组分、盐、表面活性剂和抗干扰剂，以便使结合反应处于最佳的溶液环境中，以降低不同标本基质对检测的影响，其所含的抗干扰成份可以降低检测干扰的发生几率；所述洗涤液为含有表面活性剂的缓冲溶液，用以洗涤滤膜网络的乳胶微粒，使乳胶微粒表面的复合物与游离标记试剂得以有效分离。

所述的分离测试杯和反应杯均可置于96孔板板架（如：深圳金灿华生产的96孔板板架），可方便地实施高通量检测。

本发明的一种基于纤维膜捕集分离的定量检测方法，包括：

（1）制作分离测试杯：由接收池、吸水杯和二者之间的微孔滤膜组成；

（2）制备捕获试剂和标记试剂；其中捕获试剂偶联于乳胶微球表面，捕获试剂和标记试剂被固化于反应杯的底部；

（3）将样品、分析缓冲液加入反应杯，溶解反应杯中固化的捕获试剂和标记试剂，使捕获试剂、标记试剂与样品之间发生结合反应，在微球表面形成复合物；

（4）将反应杯所含溶液加入分离测试杯，反应溶液透过微孔滤膜并渗入吸水杯中的吸水材料，乳胶微球及其表面复合物被网络于微孔滤膜中；

（6）加入洗涤液洗去滤膜中残留的标记试剂；

（6）将分离测试杯置于检测仪器，检测滤膜网络的复合物中标记物的信号强度，实现样品的定量测定。

上述检测方法可适用于所有基于特异性结合的免疫检测、核酸杂交分析和受体分析。

所述的分离测试杯是一种用于分离游离标记试剂与结合标记试剂的装置（见图1），通用于所有待测物的检测。分离测试杯为上宽下窄的柱状体，高约12mm,上部直径约9.2mm，下部直径约8mm；分离测试杯可稳固地嵌入96孔板板架。分离测试杯也可以是采用其他形状和大小但用于同一目的的器件。

所述的滤膜为半透明或透明状的复合微孔膜材。可根据所用乳胶微球粒径和标记物种类选择滤膜，使滤膜能有效捕集微球，并呈现尽可能低的本底信号。如使用1-5μm乳胶微球为捕获试剂载体和长寿命荧光稀土螯合物为标记物，Millipore公司的AP25系列、PALL公司的66系列含黏合树脂的复合玻纤滤膜在厚度、微球截留效果、检测信号本底等方面可较好地满足要求。

所述的结合试剂指包括捕获试剂、标记试剂在内的所有参与特异性结合反应的试剂。

所述的捕获试剂是连接于乳胶微球表面的结合试剂，所述的标记试剂是连接有标记物的结合试剂。结合试剂与乳胶微球和标记物的连接，可根据其化学结构和所带官能团的类型选择合适的偶联化学完成（Greg T.Hermanson,Bioconjugate Techniques,Academic Press,1996；Bioconjugation Protocols.Strategies and Methods(Niemeyer,S.M.(ed.)in Methods in MolecularBiology(Walker,J.,series ed.)Vol.283,Humana Press,2004）。捕获试剂可以是直接参与结合反应的抗体、抗原、抗体/抗原以外的其它结合蛋白、半抗原、核酸、寡核苷酸等特异性结合物质，也可以是用以捕获结合反应形成的免疫复合物或核酸杂交体的特异性结合物质，如链霉亲合素、亲合素、抗核酸杂交体抗体、抗小分子抗体或重组抗原常用标签结合物。

所述的乳胶微球用以固定捕获试剂。乳胶微球直径约1-5μm；微球直径需与滤膜孔径相匹配，使反应溶液透过滤膜时微球能被滤膜交织的纤维捕集。乳胶微球比重应与水相近，使之在水溶液中能均匀悬浮于反应体系，便于结合反应的快速进行。乳胶微球表面需含有-COOH、-NH₂、-CHO等活性官能团，使其能通过温和的化学反应结合捕获试剂。

所述的标记试剂指连接有标记物的抗体、抗原、抗体/抗原以外的其它结合蛋白、半抗原、核酸、寡核苷酸、（链）亲合素等特异性结合物质。标记试剂连接的标记物所发出的信号可以采用直接检测方式，无需加入引发剂或酶催化反应底物。标记物可以是荧光物质、上转换发光物质、化学发光物质、酶、放射性核素；但最好使用能直接激发发光的荧光、上转换发光材料。为降低本底信号，荧光标记物优先使用具有长荧光寿命的稀土离子螯合物，稀土离子螯合物优先使用Eu³⁺、Sm³⁺、Tb³⁺三种更容易获得高荧光量子产率的螯合物，或包埋有这些螯合物的荧光纳米微粒；荧光标记物也可选择波长处于红外或近红外区的荧光分子。

所述的反应杯指本方法所需的一种反应容器，其底部含有冻干固化的标记试剂和捕获试剂。反应杯可以是微孔、试管或其他形状的容器，其目的是容纳试剂并使结合反应在其中进行。为方便使用，反应杯首选每条8孔或12孔的96孔板；根据待测的标本量和标本处理能力，也可选择384孔微孔板。

所述的样本指血清、血浆、尿液、样品试子、粪便/土样/动植物组织提取液、微生物培养液、脊液或上述样品经过核酸扩增后的溶液；可以使用细胞裂解后的全血溶液为样本，也可使用全血蛋白经变性、聚集、离心后的上清溶液为样本，但由于血细胞容易阻塞滤膜微孔，不能直接使用全血为样本。

以下对上述试剂组分制作和检测步骤做进一步叙述：

1、试剂各组分制作

（1）分离测试杯

按图1所示，在吸水杯空腔填充已切割成柱状的吸水内芯，填充后的吸水柱芯略高于吸水杯上沿；在吸水柱芯表面放置滤膜，将接收池底部压于滤膜之上，使用超声焊接机（Herrmann公司，德国）实现接收池与吸水杯的高精度连接。

（2）捕获试剂

使用表面含活性官能团的乳胶微球，通过EDCI法、异硫氰基法、戊二醛法、高碘酸钠法等常规化学偶联技术将结合试剂偶联于乳胶微球表面（Bioconjugate Techniques,Greg T.Hermanson,Academic Press,1996）；经离心、洗涤、封闭，完成捕获试剂的制备。

活性官能团指-NH₂、-COOH、-SH、-NHNH₂、-NCS、-CHO、-CO-、-OH等容易在温和条件下与结合试剂发生偶联反应的化学基团。

（3）标记试剂

使用连接有活性官能团的标记物，通过活性官能团与结合试剂的化学反应，经分离、纯化，制备标记试剂。制备标记试剂所需的化学偶联技术与制备捕获试剂相似。

（4）捕获试剂和标记试剂的固化

以含有盐、表面活性剂、活性保护剂、赋型剂的缓冲溶液稀释捕获试剂和标记试剂至要求的浓度，按5-50μl/微孔加入反应杯，冻干，封口。对于某些捕获试剂与标记试剂之间存在结合反应的检测体系（如：竞争免疫分析中的捕获抗体和标记抗原或标记半抗原），捕获试剂和标记试剂的固化分二步完成：先固化其中一种试剂，形成固化层后，再在固化层表面滴加微小体积（2-5μl）的另一种试剂，真空抽干。反应杯首选可拆分的微孔板微孔。反应杯无需预处理。

（5）洗涤液的配制：

在常用生物缓冲液中加入盐、表面活性剂。

2、检测步骤

（1）结合反应

在反应杯中加入缓冲溶液、样品或/和校准品，以移液器重复4-8次吸入、压出动作，溶解反应杯中的捕获试剂和标记试剂，使捕获试剂、标记试剂、待测物质之间发生特异性结合反应，标记试剂通过非竞争或竞争方式被乳胶微球表面的结合试剂捕获，形成免疫复合物或核酸杂交分子。

（2）洗涤分离

将反应杯中的反应溶液加入分离测试杯，反应溶液透过滤膜渗入吸水柱，乳胶微球被网络于滤膜材料之中；加入洗涤溶液，洗涤溶液透过滤膜渗入吸水柱的同时，被网络于滤膜的乳胶微球得到洗涤，微球表面的免疫复合物或核酸杂交分子与游离的标记试剂得以分离。

（3）测定

将分离测试杯置于检测仪器，检测滤膜捕集的免疫复合物或核酸杂交分子中标记物的信号强度；通过对比标本与校准品或质控品的信号强度，实现待测物的定量测定。

有益效果

（1）以滤膜捕集方式分离结合标记试剂和游离标记试剂，简便、快速而且高效。该方式避免了以微孔/试管为结合试剂载体的生物分析所要求的多次重复洗涤操作，不需要使用洗板机或磁架等专用设备，只需在反应溶液渗入吸水杯后滴入洗涤液即可快速实现游离与结合标记试剂的有效分离。

（2）由于所有乳胶微粒被捕集于小面积的滤膜，同时也由于激发光可透过半透明或透明膜材，因此被富集于滤膜内的微球表面复合物所含标记物具有优良的可检测性，显著地改善了本方法的检测灵敏度。

（3）本发明所用膜材只用于分离游离标记试剂与结合标记试剂，避免了IF、IC以膜材为结合反应场所（膜材上固定有结合试剂）容易导致检测精密度差的问题，基于此，本发明所述方法用于实施定量检测具有优良的可重复性。

（4）本发明采用易悬浮、具有高比表面的乳胶微球作为结合反应的载体，结合反应在准均质液相环境中进行，反应过程无需震荡，反应快速，结合反应得以在短时间内完成。

（5）使用反应杯作为结合反应的场所，反应时间精确可控，避免了IF、IC检测方式在不同检测之间因溶液层析速度不一致、标记试剂溶解速度不一致或溶液渗入膜材速度不一致而造成的反应程度上的变化，有效改善了检测的精密性。

（6）本发明使用的分离测试杯与96孔板微池大小一致，可与反应杯置于同一96孔板板架，可在同一微孔板实施反应、分离和信号检测，可有效提高检测通量。

（7）本发明采用可直接激发发光的荧光材料或上转换发光物质为标记物，信号的生成无需加入引发剂或酶催化，这种直接检测方式进一步简化了检测操作，缩短了检测时间。

（8）结合反应所需试剂，包括捕获试剂、标记试剂、pH缓冲试剂、盐、表面活性剂、保护剂均被固化于反应杯底部，检测时只需加入缓冲液与标本，使用移液器通过简单的吸入、压出操作溶解固化试剂，结合反应便可快速完成，避免了常规检测所需的试剂稀释、配制、加入等操作，也无须使用专门的振荡装置。

（9）以本发明所述装置实施免疫检测和核酸杂交分析，操作简便，反应快速，无需专用的震荡设备和洗涤装置，检测精密性高，灵敏度好。因此，基于本装置研制自动化检测仪器难度小，本方法比常规生物分析更容易实现检测自动化。

附图说明

图1为本发明分离测试杯的结构示意图；其中，a为剖面图；b为分解图；c为立体图；

图2为本发明检测38例尿液IP-10浓度与PlexMark^TM3试剂测量值的相关性；

图3为本发明检测42例血清HBV DNA；

图4为本发明检测倍比稀释的HBV DNA扩增产物。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。由于本领域专业人员可以容易地依照本发明所述方式设计不同形状但实施效果相同或相似的装置，本发明不限于所提及装置的特定外形和以下二例所涉及特定待测物的检测，依照同一概念设计的其它大小、形状的装置或用于其它待测物检测的装置用也属于本发明范畴。

标注：

TRIFMA：Time-resolved immunofluorometric immunoassay（时间分辨免疫荧光测定）；

IP-10：interferon-inducible protein10（干扰素诱导蛋白10）；

PlexMark^TM3：基于Luminex平台的3种肾功能标志物联检试剂（Invitrogen公司）；

HBV DNA：乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸；

BHTCT：4,4'-Bis(1",1",1"-trifluoro-2",4"-butanedione-6-oyl)-chlorosulfo-o-terphenyl,4,4'-双(1",1",1"-三氟-2",4"-丁二酮基)-氯磺基-邻三联苯；

EDCA：1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride，1-3-二甲基氨基丙基-3-乙基碳化二亚胺盐酸盐;

MES:2-Morpholinoethanesulfonic acid，2-(N-吗啡啉)乙磺酸；

Sulfo-NHS：N-Hydroxysulfo succinimide sodium salt，N-羟基硫代琥珀酰亚胺；

PVP：Polyvinylpyrrolidone，聚乙烯吡咯烷酮；

BSA：Bovine serum albumin，牛血清白蛋白；

PEG：polyethyleneglycol，聚乙二醇；

β-ME：β-mercaptoethanol，β-巯基乙醇；

TSA缓冲液：50mM Tris-HCl,pH7.75,含NaCl0.9%，NaN₃0.05%。

实施例1以BHTCT-Eu³⁺为标记物实施IP-10TRIFMA

肾脏移植后，随着移植肾功能的改善，尿液lP-10浓度往往明显下降；尿液IP-10测定是监测移植肾功能的诊断指标。

步骤如下：

1）捕获抗体制备

A)取0.3mg抗IP-10单克隆抗体（Lifespan Biosciences,Inc.）对500ml PBS缓冲液(50mM，pH8.0，含0.9%NaCl)透析过夜。

B)在200μl乳胶微球（美国ACME microspheres公司，Catalog No.CP255-10）中加入1mlMES缓冲液（50mM，pH6.5），混匀，5000×g离心20min，移去上清，加入1.2ml MES缓冲液分散；加入200μl含4mg EDCA、8mg Sulfo-NHS的MES缓冲液，室温反应20min。

C）5000×g离心20min，弃上清；加入1.0ml MES缓冲液，超声3次（300W，每次超声1S，间隔30S）以分散乳胶微球；重复离心、超声一次。

D）加入0.3mg步骤A)所述的抗IP-10单抗PBS缓冲液，混匀，室温反应6小时。

E）加入50μl含酪蛋白/BSA的Tris-HCl溶液(50mM Tris-HCl，PH8.0，0.5%酪蛋白，0.5%BSA，0.5%NaCl，0.1%叠氮钠)，温育30min；按步骤C)所述离心、超声分散二次。

F）5000×g离心30min，移去上清，加入500μl PBS缓冲液(50mM，pH8.0,含0.9%NaCl,0.5%BSA，0.2%PVP-4000)，4度贮存。

2）标记抗体制备

A)制备4,4'-双(1",1",1"-三氟-2",4"-丁二酮基)-氯磺基-邻三联苯（BHTCT）：

参照文献（Feng-Bo Wu,Chao Zhang,A new europiumβ-diketone chelate for ultrasensitivetime-resolved fluorescence immunoassays，Analytical Biochemistry2002,311,57–67）制备BHTCT：将40ml无水乙醚、3.1g三氟乙酸乙酯和1.6邻三联苯依次加入烧瓶，搅拌下缓慢加入2.5g甲醇钠，室温反应48h。将反应混合液加入50ml15%的H₂SO₄水溶液，搅拌10min。取乙醚层，常压蒸干，得黄色粘性固体。以热乙醇溶解固体，过滤，蒸馏浓缩至～6ml；加入100ml石油醚(沸点:30－60℃)，搅拌，过滤除去不溶物；旋干石油醚，真空干燥，得到亮黄色固体BHTT。

在含1g BHTT烧瓶中加入6ml氯磺酸，搅拌下水浴加热至45℃，反应6h。快速搅拌下，在～400g碎冰中滴入反应液，继续搅拌约5min，快速过滤，收集不溶物。以少量蒸溜水洗涤不溶物二次，真空干燥；以氯仿重结晶固体，得泥黄色固体BHTCT；分装，-20℃密封保存于充满氩气的西林瓶。制备反应:

B）BHTCT标记抗IP-10多克隆抗体

BHTCT水溶性差，以BHTCT直接标记抗体易造成抗体聚集，影响抗体活性。本发明先BHTCT标记富含-NH₂、水溶性好、分子量较小的BSA，再以BSA-BHTCT连接抗IP-10抗体，效果满意。

a)制备BSA-BHTCT

在2ml含8mg BSA的CB缓冲液(0.lmol/L，含0.9%NaCl，pH9.0)中缓慢滴加100μl60mg/ml BHTCT乙醇溶液，室温反应30min。以0.2μm滤器滤除BHTCT悬浮颗粒；以100mMPBS为洗涤液(pH7.5)，使用Sephadex G50色谱柱(1.5×45cm)分离BSA-BHTCT与游离BHTCT；BSA-BHTCT以PEG-20000浓缩至～1.0mg/ml。

b)BSA-BHTCT连接抗IP-10多克隆抗体（pAb）制备pAb-BSA-BHTCT-Eu

在3ml含3mg BSA-BHTCT的PBS溶液（100mM,pH7.5）加入1mg固体EDCA（Cas25952-53-8，Sigma）和2mg Sulfo-NHS(Sigma),磁搅拌使其溶解，室温反应20min；

c)加入β-ME(分子量：78）使其在溶液中浓度为30mM，室温静置5min;

d)在上述Sulfo-NHS活化的BSA-BHTCT溶液中加入1.0ml含1.5mg IP-10多克隆抗体(Thermo,PA1-75175)的PBS溶液（0.1M,pH7.5),室温静置60min。加入EuCl₃溶液使Eu³⁺浓度为8μmol/L，静置30min。

e)以TSA缓冲液透析3×24h，共换透析液3次，1000ml/次；收集标记抗体（Ab-BSA-BHTCT-Eu),4℃贮存。

3)捕获抗体与标记抗体的固化

配制稀释缓冲液：25mM Tris-HCl，pH7.75,含5%BSA,2%海藻糖,0.9%NaCl,0.05%NaN3,0.02%Tween20,0.1%牛γ-球蛋白,0.05%鼠IgG。

以稀释缓冲液稀释捕获抗体（与乳胶微粒连接）与标记抗体（pAb-BSA-BHTCT-Eu）分别至50μg/ml、20μg/ml，按20μl/孔加入反应杯微孔，冷冻干燥，以micro^TS热封仪封闭微孔。4）免疫检测

在反应杯中加入50μlIP-10校准品和尿液标本（经PlexMark^TM3试剂测定，Invitrogen,Lot:A12323），以移液器吸入、压出校准品或尿液标本5-8次，溶解反应杯底部固化的捕获抗体与标记抗体，室温静置20min，取40μl反应溶液加入分离测试杯，待溶液渗入吸水柱，滴入5滴共～80μl洗涤液，待洗涤液渗入吸水柱，将分离测试杯置于荧光检测仪（达瑞DR-M6608）测定荧光；检测仪通过对比校准品与标本的荧光强度计算IP-10浓度。检测参数：激发波长为334nm，检测波长614nm，单循环延迟时间200μs，检测时间400μs，1000循环/S。

5）IP-10测定值与PlexMark^TM3试剂测定值的相关性

以本方法检测了38份肾移植术后患者的尿液标本，以Origin软件分析本方法（IP-10TRIFMA）测定值与PlexMark^TM3试剂测定值的相关性，相关系数r=0.960；本方法检测值(Y)与PlexMark^TM3试剂测定值(X)的数学关系为：Y=0.925X+0.18。本方法检测时间约25min，检测灵敏度为0.36pg/ml（零浓度校准品重复测定12次的荧光强度标准差的2倍在校准曲线上对应的IP-10浓度），检测线性范围为0-1000ng/ml，实验内、实验间不精密性（变异系数CV）分别<3.2%、7.8%。

实施例2HBV DNA杂交分析

肝脏移植术后的乙肝病毒感染是我国肝移植外科的重要课题。常规的血清学检测往往不能确定肝脏供者的HBV感染状态，部分HBsAg阴性供者仍含有低水平的HBV复制，具有一定的传染性，因此测定器官供体的HBV DNA可以补充血清学检测的不足，避免肝脏移植术后乙肝病毒再感染的发生。

1)标本DNA提取

使用QIAamp MinElute Virus Spin试剂盒(QIAGEN,Germany)提取HBV DNA模版：在含200μl血清的试管中加入200μl缓冲液AL和25μl QIAGEN蛋白，56℃孵育15min，加入250μl无水乙醇，室温孵育5min。将酶解液加入分离微柱，6000g离心1min；加入500μl缓冲液AW1，6000g离心1min；加入500μl缓冲液AW2，6000g离心1min.加入500μl无水乙醇，6000g再次离心1min。56℃干燥微柱3min。加入100μl缓冲液AVE，20000g离心1min，洗脱的病毒DNA模板溶液于-20℃贮存。

2）捕获探针制备

以实施例1制备捕获抗体相同的工艺将链亲合素（Streptavidin,Sigma）与乳胶微球连接，制备偶联有链亲合素的乳胶微球（乳胶微球-Streptavidin）。

在1.5ml EP管中加入含200μg乳胶微球-Streptavidin的PBS溶液(50mM,pH7.5，0.1%PVP-4000)，加入26μg5'端生物素标记的寡核苷酸探针

（Biotin-ACTGTTCAAGCCTCCAAGCTGTGCCTTGGGTGGCTTTGGGGC，上海生工生物工程有限公司），静置30min；5000g离心30min,以PBS缓冲液洗涤（50mM PBS，pH7.5,含0.05%Tween-20），重复一次离心、洗涤，将乳胶微球分散于PBS缓冲液，得到连接有杂交探针的乳胶微球（微球-探针）。

3）BHTCT标记抗Dig单克隆抗体（McAb-BSA-BHTCT-Eu）

标记方法同实施例1抗IP-10多克隆抗体的制备。

4）捕获探针与抗Dig抗体（McAb-BSA-BHTCT-Eu）的固化

以缓冲液(25mM Hepes-HCl,pH7.6,30mmol/L NaCl,20mmol/L EDTA,1%山梨醇)稀释捕获探针（微球-探针）与标记抗体（McAb-BSA-BHTCT-Eu）至20μg/ml、10μg/ml，按20μl/孔加入微孔，冷冻干燥;以microTS热封仪封闭微孔。

5）HBV DNA扩增与标记

在PCR管中加入扩增混合液100μl，其中含10μl模板溶液，200μmol/L dATP、dCTP、和dGTP，182μmol/L dTTP，18μmol/L dig-11-dUTP（地高辛-脱氧尿嘧啶核苷三磷酸，Roche），0.5μmol/L引物GGGAGGAGATTAGGTTAA（核苷酸编号1747-1764）、GAGTGCGAATCCACACTC（核苷酸编号2377-2360）（上海生工生物工程有限公司），50mmol/L KCl，10mmol/L Tris-HCl(pH8.3)，2.0mmol/L MgCl2,0.01%Gelatin，2.5U Taq DNAPolymerase(山东博奥克生物科技有限公司)。在DNA热循环仪（Perkin Elmer）上94℃预变性1min,94℃变性30s,45℃退火45s,72℃延伸60s,共40循环,最后于72℃延伸5min。dig-11-dUTP被随机插入630bp的扩增子。

6）杂交

在反应杯中加入50μl杂交缓冲液（25mM Hepes-HCl,pH7.6,30mmol/L NaCl,20mmol/LEDTA），以移液器吸入、压出溶液4-8次以溶解固化的捕获探针和BHTCT标记的抗Dig抗体；取扩增产物30μl于EP管,置于92℃2min，取20μl变性后扩增产物加入反应杯，混匀，60℃杂交30min。

7）检测

取50μl杂交溶液加入分离测试杯，待溶液渗入吸水柱，滴入4-5滴共约100μl洗涤液，待洗涤液渗入吸水柱，将分离测试杯置于荧光检测仪测定荧光。

8）稀释实验

取1份HBV DNA扩增后标本，以杂交缓冲液倍比稀释成原浓度的1/2、1/4、1/8、1/16、1/32、1/64，重复上述6）、7）杂交、检测步骤，以考察本方法的稀释线性。

9）检测结果

以上述方法检测22份HBsAg阴性血清标本、20份HBsAg/HBeAg双阳性血清标本（ABBOTT），结果示于图3。结果显示，以50000CPS为CUT-OFF，22份HBsAg阴性标本中21份标本检测结果为HBV DNA阴性，1份HBV DNA阳性；取该HBsAg阴性/HBV DNA阳性标本以二种HBV荧光定量PCR试剂进行复测，结果均为阳性，检测浓度分别为7.86×10⁴IU/ml（达安生物）、1.19×10⁵IU/ml（ROCHE），提示本发明方法对该标本的HBV DNA阳性检测结果为真阳性。以本发明方法检测20份HBsAg/HBeAg双阳性标本，20份标本HBVDNA杂交检测均为阳性，其中S/Co≥4.0的阳性标本16份；以本方法检测倍比稀释的HBVDNA扩增子，杂交后检测得到的荧光强度与理论荧光强度（按稀释倍数计算）呈现良好的线性关系（r=0.946）（图4）。以上结果表明，以本发明方法实施核酸杂交分析检测病毒核酸具有可靠的灵敏性和特异性。

以上二例实施结果表明，采用可直接激发发光的长寿命荧光物质为标记，以半透明/透明膜材分离游离标记物和结合标记物，可有效实施高灵敏的定量免疫检测和核酸杂交分析。本方法排除了IF、IC难以实现高精密定量检测的多种内因，检测精密度高，重现性好。由于本发明以低本底、无内滤效应的长寿命荧光为检测信号，待测物浓度范围可达3～4个量级。同其它典型的非均相分析方法一样，本方法也需要分离结合标记试剂与游离标记试剂，但基于本发明所述装置实施的分离操作简单、高效、快速，整个检测过程无需专用洗涤设备；同时，由于反应过程中具有高比表面的乳胶微球能稳定地悬浮于反应体系，结合反应在准均质液相环境中进行，反应过程无需震荡，反应快速，结合反应得以在短时间内完成。由于本发明无需使用专用的洗涤、震荡设备，具有灵敏、精密、操作简单、检测快速、检测浓度范围广特点，因此本发明既具有典型的POCT检测的多种特点，也适用于中心实验室检测，同现有的各种检测平台相比，具有明显的方法学优势。

Claims (11)

1.一种基于纤维膜捕集分离的定量检测装置，其特征在于：所述定量检测装置包括分离测试杯、反应杯、分析缓冲液和洗涤液；其中，分离测试杯由接收池、吸水杯和二者之间的微孔滤膜组成，反应杯底部固化有捕获试剂和标记试剂，所述捕获试剂固定于乳胶微球表面；所述的标记试剂指连接有标记物的抗体、抗原、抗体/抗原以外的其它结合蛋白、半抗原、核酸、寡核苷酸、链亲合素。

2.根据权利要求1所述的一种基于纤维膜捕集分离的定量检测装置，其特征在于：所述吸水杯包括吸水柱芯和吸水杯空腔，吸水柱芯的直径与吸水杯空腔的直径一致，高度高于吸水杯空腔。

3.根据权利要求2所述的一种基于纤维膜捕集分离的定量检测装置，其特征在于：所述吸水柱芯为由纤维材料或合成纤维材料制作的柱状棉芯或由层状吸水材料层叠、压制后切割成的柱状体；所述吸水柱芯高度为空腔高度的1.05-1.20倍。

4.根据权利要求1所述的一种基于纤维膜捕集分离的定量检测装置，其特征在于：所述微孔滤膜被压制于接收池和吸水杯之间，紧贴于吸水柱芯之上。

5.根据权利要求4所述的一种基于纤维膜捕集分离的定量检测装置，其特征在于：所述微孔滤膜为半透明或透明的玻璃纤维或聚酯。

6.根据权利要求1所述的一种基于纤维膜捕集分离的定量检测装置，其特征在于：所述乳胶微球直径与微孔滤膜孔径相匹配，乳胶微球表面含有活性官能团。

7.根据权利要求1所述的一种基于纤维膜捕集分离的定量检测装置，其特征在于：所述标记试剂为直接检测或通过激发光引发检测信号的荧光标记物、上转换发光物质、化学发光物质、酶或放射性核素。

8.根据权利要求7所述的一种基于纤维膜捕集分离的定量检测装置，其特征在于：所述荧光标记物为Eu³⁺、Sm³⁺、Tb³⁺螯合物或包埋有Eu³⁺、Sm³⁺、Tb³⁺螯合物的荧光纳米微粒。

9.根据权利要求1所述的一种基于纤维膜捕集分离的定量检测装置，其特征在于：所述分析缓冲液含有酸碱缓冲组分、盐、表面活性剂和抗干扰剂；所述洗涤液为含有表面活性剂的缓冲溶液。

10.根据权利要求1所述的一种基于纤维膜捕集分离的定量检测装置，其特征在于，所述的分离测试杯和反应杯置于同一96孔板板架，实施高通量检测。

11.一种如权利要求1所述的基于纤维膜捕集分离的定量检测方法，包括：

(1)制作分离测试杯：由接收池、吸水杯和二者之间的微孔滤膜组成；

(2)制备捕获试剂和标记试剂；捕获试剂和标记试剂被固化于反应杯的底部，其中所述捕获试剂偶联于乳胶微球表面；

(3)将样品、分析缓冲液加入反应杯，溶解反应杯中固化的捕获试剂和标记试剂，使捕获试剂、标记试剂与样品之间发生结合反应，在微球表面形成复合物；

(4)将反应杯所含溶液加入分离测试杯，反应溶液透过微孔滤膜并渗入吸水杯中的吸水材料，乳胶微球及其表面复合物被网络于微孔滤膜中；

(5)加入洗涤液洗去滤膜中残留的标记试剂；

(6)将分离测试杯置于检测仪器，检测滤膜网络的复合物中标记物的信号强度，实现样品的定量测定。