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CN104302665A - 与新生儿Fc受体的结合增强的变体Fc多肽 - Google Patents

与新生儿Fc受体的结合增强的变体Fc多肽 Download PDF

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CN104302665A CN201280070180.XA CN201280070180A CN104302665A CN 104302665 A CN104302665 A CN 104302665A CN 201280070180 A CN201280070180 A CN 201280070180A CN 104302665 A CN104302665 A CN 104302665A
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Abstract

本文描述了在环内或邻近处含有插入序列的变体Fc片段，如与对照Fc片段相比较，所述变体Fc片段在pH5-6下以较高亲和力和/或较高结合活性并且在生理pH值下以大致相同或较低的亲和力结合于新生儿Fc受体(FcRn)，即在生理pH值下具有极低或无结合活性。还描述了包含这些变体Fc片段的变体Fc多肽。另外描述了制备和鉴别此类Fc片段的方法以及用于制备和使用此类Fc多肽的方法。

Description

与新生儿Fc受体的结合增强的变体Fc多肽
优先权
本申请要求分别于2011年12月21日、2012年1月12日和2012年11月21日提交的美国临时申请No.61/578,780、61/585,993和61/729,050的权益，其各自整体并入本文。
领域
本发明涉及了包含变体Fc片段的多肽，与对照Fc片段相比较，所述变体Fc片段以较高亲和力和/或较强结合活性结合于新生儿Fc受体。本发明还涉及了分离、制备和使用此类多肽的方法。
背景
治疗性单克隆抗体已经被成功地用作多种疾病的治疗。抗体的相对较长的体内半衰期至少部分是由抗体Fc区与新生儿Fc受体(FcRn)的相互作用介导的。参见例如，Ghetie等(1996)，Eur.J.Immunol.26：690-96。FcRn在小于或等于6.0的pH值下以纳摩尔浓度的亲和力(KD为约100nM)结合于IgG抗体的Fc区，但在血液pH值(即，约pH7.4)下不结合。Tesar和(2001)，Curr.Opin.Struct.Biol.20(2)：226-233。当细胞例如通过胞饮作用将抗体内化之后，在核内体的酸性环境下，IgG可以被FcRn结合。同上。与进入核内体内默认的分解代谢路径相对，IgG当在核内体内结合FcRn时将被引导回到细胞表面。同上。在细胞表面处的大体上生理pH值环境中，IgG可以与FcRn解离并且再进入循环中。这一过程使得抗体在细胞内进行内化之后又回到循环中，与在细胞中核内体内降解相对。
本领域中需要具有增加的体内半衰期以减少给药量和/或给药频率的治疗性抗体。此类抗体由于具有增加的患者便利性并因此也可能具有增加的患者顺应性和/或降低的成本而特别有益。在当前有成本意识的卫生保健环境中，成本可以是治疗产品的实际效用的决定因素。
发明概述
本文提供了变体Fc片段，这些变体Fc片段在略呈酸性的pH值下以比对照Fc片段高的亲和力和/或高的结合活性结合于FcRn，并且在生理pH值下以与对照Fc片段大致相同或比对照Fc片段低的亲和力(即，具有极低或无结合活性)结合于FcRn。还提供了变体Fc多肽，这些变体Fc多肽含有变体Fc片段以及结合于靶分子的结合区。本文中已证实，含有具有以上提到的结合特性的变体Fc片段的变体Fc多肽还具有比对照Fc多肽长的体内半衰期。另外提供了编码这些Fc片段和Fc多肽的核酸以及使用这些核酸制备这些蛋白质的方法。还包括了用于延长Fc多肽的体内半衰期的方法，以及用于鉴别变体Fc片段的方法，如与对照Fc片段相比较，这些变体Fc片段在pH5-6下以较高亲和力结合于FcRn并且在生理pH值下以相当或较低的亲和力结合FcRn。
此处描述了变体Fc多肽，该变体Fc多肽包含人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4变体Fc片段，其中该变体Fc片段在该变体Fc片段的环5、8和/或10内或邻近处包含具有3到20、10到20、20到40、40到60或60到80个氨基酸的插入序列，其中相比于与该变体Fc多肽具有相同的氨基酸序列但在环5、8和/或10内或邻近处不含所述插入序列的对照Fc多肽，该变体Fc多肽在约5.0到约6.0的pH值下和/或在约5.0、5.2、5.5、5.7或6.0的pH值下以较高亲和力和/或较高结合活性结合于人新生儿Fc受体(hFcRn)，并且其中如与该对照Fc多肽相比较，该变体Fc多肽在生理pH值和/或在约7.4、7.5或7.6的pH值下以大致相同或较低的亲和力或结合活性(即，具有极低或无结合活性)结合于该人新生儿Fc受体(hFcRn)。在该变体Fc片段内或邻近处的插入序列可以是至少六个氨基酸长、不超过25个氨基酸长、6到16个氨基酸长和/或至少12个氨基酸长。在一些实施方案中，该插入序列不含甲硫氨酸和/或色氨酸残基。在该变体Fc片段内或邻近处的插入序列可以在前四个插入的氨基酸中包含至少一个半胱氨酸并且在后四个插入的氨基酸中包含至少一个半胱氨酸。任选地，该插入序列可以除在该插入序列的前四个或后四个氨基酸中存在任何半胱氨酸残基外不含半胱氨酸残基。在一些实施方案中，使用表1中所示的EU编号系统，该插入序列是在该变体Fc片段的环10内或邻近处，任选地在该变体Fc片段的氨基酸384与385之间。使用该EU编号系统，该插入序列可以在氨基酸383到387内。在一些实施方案中，使用表1中所示的EU编号系统，在该变体人Fc片段中的插入序列可以在氨基酸382与383、383与384、385与386、386与387、387与388、388与389、389与390或390与391之间。或者，使用表1中所示的EU编号系统，氨基酸384-386可以缺失，并且该插入序列可以在氨基酸383与387之间。在该变体Fc片段中的插入序列可以包含SEQ ID NO：13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、90-356及359-379中任一种的氨基酸序列。此外，在该变体Fc片段中的插入序列可以包含以下任一序列的氨基酸序列：SEQ ID NO：41-67；SEQ ID NO：90-246；SEQ ID NO：247-356；SEQ ID NO：367、369、372、373及375-379；SEQ ID NO：41-53、67、90-162、90-163、165-215、164-214、217-247、216-246、359-379及392-399、401-409、411-426、428-439、441-447、449-453、456、459、461、464及470、475、477-489、491-496中任一种的氨基酸4-9；SEQ ID NO：164、252及490的氨基酸4-10，及SEQ ID NO：215或216的氨基酸4-8；SEQID NO：248-288、290-306、342、400、410、427、440、448、454、455、457、458、460、465-469、471-474及476中任一种的氨基酸4-11；SEQ ID NO：289或307的氨基酸4-12；及SEQ ID NO：308-341和343-356中任一种的氨基酸4-13。
本文中还描述了变体Fc多肽，该变体Fc多肽包含人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4变体Fc片段，其中该变体Fc片段在环10内或邻近处包含具有3到20、10到20、20到40、40到60或60到80个氨基酸的插入序列，其中相比于与该变体Fc多肽相同但在环10内或邻近处不含所述插入序列的对照Fc多肽，该变体Fc多肽在约5.0到约6.0范围内的pH值下和/或在约5.0、5.2、5.5、5.7或6.0的pH值下以较高亲和力和/或较高结合活性结合于hFcRn，并且其中如与该对照Fc多肽相比较，该变体Fc多肽在生理pH值和/或在约7.4、7.5或7.6的pH值下以大致相同或较低的亲和力(即，具有极低或无结合活性)结合于该hFcRn。该插入序列可以为至少六个氨基酸长，可以为不超过25个氨基酸长，可以为6到16个氨基酸长，可以为至少12个氨基酸长，和/或可以在该插入序列的前四个氨基酸中含有至少一个半胱氨酸并且在该插入序列的后四个氨基酸中含有至少一个半胱氨酸。该插入序列可以在该插入序列的其它位置处不含半胱氨酸残基。该插入序列可以不含甲硫氨酸和/或色氨酸残基。根据EU编号系统，在该变体Fc片段中的插入序列可以在氨基酸383-387内。使用表1中所示的EU编号系统，在该变体Fc片段中的插入序列可以在氨基酸382与383、383与384、384与385、385与386、386与387、387与388、388与389、389与390或390与391之间。或者，使用该EU编号系统，氨基酸384-386可以缺失，并且该插入序列可以出现在氨基酸383与387之间。在该变体Fc片段中的插入序列可以包含SEQ ID NO：13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、90-356、359-379及392-496中任一种的氨基酸序列。此外，在该变体Fc片段中的插入序列可以包含以下任一序列的氨基酸序列：SEQ ID NO：41-67；SEQ ID NO：90-246；SEQ ID NO：247-356；SEQ ID NO：367、369、372、373及375-379；SEQ ID NO：41-53、67、90-162、90-163、165-215、164-214、217-247、216-246、359-379及392-399、401-409、411-426、428-439、441-447、449-453、456、459、461、464及470、475、477-489、491-496中任一种的氨基酸4-9；SEQ ID NO：164、252及490的氨基酸4-10；及SEQ ID NO：215或216的氨基酸4-8；SEQ ID NO：248-288、290-306、342、400、410、427、440、448、454、455、457、458、460、465-469、471-474及476中任一种的氨基酸4-11；SEQ ID NO：289或307的氨基酸4-12；及SEQ ID NO：308-341和343-356中任一种的氨基酸4-13。该变体Fc多肽可以是包含非抗体多肽的变体Fc融合蛋白。在特定实施方案中，针对该变体Fc融合蛋白的对照Fc融合蛋白可以是阿法赛特(alefacept)、利隆西普(rilonacept)、阿柏西普(aflibercept)、依那西普(etanercept)、罗米司亭(romiplostim)或阿巴西普(abatacept)。在其它实施方案中，该变体Fc多肽可以包含任何抗体的重链可变区(VH)和/或轻链可变区(VL)，并且还可以包含第一重链恒定区(CH1)和轻链恒定区(CL)。在一些实施方案中，该变体Fc多肽可以包含：(a)含VH区、第一重链恒定区(CH1)、铰链区、CH2区及CH3区的重链；和(b)含VL区和轻链恒定区(CL)的轻链。该变体Fc多肽可以是单价的。该变体Fc多肽可以是二聚体或可以是四聚体。
在其它实施方案中，本文描述了编码如本文所描述的变体Fc多肽或变体Fc片段的核酸，以及在这些变体Fc片段的环内或邻近处的插入序列。还描述了含有此类核酸的宿主细胞。还涵盖了制备变体Fc多肽或变体Fc片段的方法，该方法包括：(a)将编码该变体Fc多肽或Fc片段的核酸引入宿主细胞中，(b)在使得该核酸表达的条件下培养包含该核酸的宿主细胞，及(c)从培养基或细胞团回收表达的变体Fc多肽或Fc片段，其中该变体Fc片段，或含有变体Fc片段的变体Fc多肽在该变体Fc片段的环5、8和/或10内或邻近处包含具有3到20、10到20、20到40、40到60或60到80个氨基酸的插入序列，并且其中相比于对照Fc多肽或Fc片段，该变体Fc多肽或Fc片段在约5.0到约6.0范围内的pH值下和/或在约5.0、5.2、5.5、5.7或6.0的pH值下以较高亲和力和或较高结合活性结合于hFcRn，并且其中如与该对照Fc多肽或对照Fc片段相比较，该变体Fc多肽或Fc片段在生理pH值下和/或在约7.4、7.5或7.6的pH值下以大致相同或较低的亲和力或结合活性(即，具有极低或无结合活性)结合于人新生儿Fc受体(hFcRn)。
还描述了用于制备本文所描述的任何变体Fc片段或Fc多肽的方法，该方法包括：(a)将编码该变体Fc多肽或Fc片段的核酸引入宿主细胞中，(b)在使得该核酸表达的条件下培养包含该核酸的宿主细胞，及(c)从培养基或细胞团回收表达的变体Fc多肽或Fc片段。
在另一个实施方案中，本文描述了用于延长包含人IgG Fc片段的Fc多肽的半衰期的方法，该方法包括以下步骤：在环5、8和/或10内或邻近处选择供插入的位点；及将肽插入所选位点中，其中该肽包含选自以下序列的氨基酸序列：SEQ ID NO：41-67；SEQ ID NO：90-246；SEQ ID NO：247-356；SEQ ID NO：367、369、372、373及375-379；SEQ ID NO：41-53、67、90-162、90-163、165-215、164-214、217-247、216-246、359-379及392-399、401-409、411-426、428-439、441-447、449-453、456、459、461、464及470、475、477-489、491-496中任一种的氨基酸4-9；SEQ ID NO：164、252及490的氨基酸4-10；及SEQ ID NO：215或216的氨基酸4-8；SEQ ID NO：248-288、290-306、342、400、410、427、440、448、454、455、457、458、460、465-469、471-474及476中任一种的氨基酸4-11；SEQ ID NO：289或307的氨基酸4-12；及SEQ ID NO：308-341和343-356中任一种的氨基酸4-13。所选位点可以在环10内或邻近处，并且该插入位点可以在根据EU编号系统编号的氨基酸384与385之间。使用该EU编号系统，该插入位点可以在氨基酸383到387内。使用表1中所示的EU编号系统，在该变体Fc片段中的插入序列可以在氨基酸382与383、383与384、384与385、385与386、386与387、387与388、388与389、389与390或390与391之间。或者，使用该EU编号系统，氨基酸384-386可以缺失，并且该插入序列可以出现在氨基酸383与387之间。
本文还提供了用于鉴别人IgG变体Fc片段的方法，该人IgG变体Fc片段赋予包含该变体Fc片段的变体Fc多肽比对照Fc多肽长的体内半衰期，该方法包括以下步骤：(a)建立编码在环10内或邻近处含有插入序列的Fc片段的核酸文库，该插入序列包含4-20、10-20、20-40、40-60或60-80个随机化氨基酸；(b)对由该文库编码的Fc片段进行筛选以鉴别出变体Fc片段，该变体Fc片段(i)在pH5.5下和/或在约5-6的pH值下以比对照Fc片段高的亲和力和/或高的结合活性结合于人FcRn并且(ii)与该对照Fc片段相比较，在生理pH值下和/或在pH7.4、7.5或7.6下以相同或较低亲和力或结合活性(即，具有极低或无结合活性)结合于人FcRn；(c)构建出编码包含(b)中所鉴别的变体Fc片段的变体Fc多肽的核酸，其中已知当在体内施用给动物时，包含对照Fc片段而非该变体Fc片段的对照Fc多肽的浓度随时间呈线性降低；(d)将(c)的核酸引入宿主细胞中并在使得由该核酸编码的变体Fc多肽能够表达的条件下培养该宿主细胞；(e)从细胞团或细胞培养基中回收该变体Fc多肽；(f)将该变体Fc多肽施用给一只动物，并将该对照Fc多肽施用给另一只动物；及(g)在施用之后，随时间监测外周血中该变体Fc多肽和该对照Fc多肽的浓度，由此鉴别出赋予变体Fc多肽较长体内半衰期的变体Fc片段。使用表1中所说明的EU编号系统，步骤(a)的插入序列可以在384位与385位之间。使用该EU编号系统，该插入位点可以在氨基酸383到387内。使用表1中所示的EU编号系统，在该变体Fc片段中的插入序列可以在氨基酸382与383、383与384、384与385、385与386、386与387、387与388、388与389、389与390或390与391之间。或者，使用该EU编号系统，氨基酸384-386可以缺失，并且该插入序列可以出现在氨基酸383与387之间。
在另一个方面，提供了用于治疗慢性疾病的方法，该方法包括向有需要的患者施用如本文所描述的变体Fc多肽。
附图简述
图1：人FcRn(hFcRn)和人IgG1Fc片段中在FcRn与Fc片段结合时最紧密接触的部分的预测三维结构的带状图。顶图是hFcRn的三级结构的一部分的带状图。底图是人IgG1Fc片段当结合于FcRn时与FcRn最紧密接触的一部分的带状图。环是以细线示出，而α螺旋和β折叠是以条带示出。进行插入的六个位点是以如下文所描述来构建的八个文库的名称来指示，即，L1、L2A、L2B、L3、L4、L5、L6A及L6B。
图2：插入序列文库的格式。人IgG1Fc片段的序列(SEQ ID NO：1)示于上部。在进行插入或邻近于插入的环内的氨基酸是通过带下划线的粗体字型指示。文库名称(即，L1、L2A等)呈现在该特定文库中进行插入的区域上方。插入序列的格式于下文指示。在最左边的是文库名称，即，L1、L2A等。在文库名称右边紧挨着的是在任何氨基酸插入之前在插入位点周围的原始序列。斜体字母指示在插入之前缺失的氨基酸。垂直的虚线指示在未缺失氨基酸的文库中的插入位点。最右边的是在插入位点周围的序列以及在适合位置处的插入序列。名称“(19R)5”或“(19R)6”分别是指五个或六个随机化氨基酸，这些氨基酸可以是除半胱氨酸外的19种氨基酸中的任一种。名称“(20R)8”是指八个随机化氨基酸，这些氨基酸可以是二十种氨基酸中的任一种。
图3：来自文库L5的变体Fc片段分别在pH6和pH7.4下的缔合和解离曲线。左侧的曲线显示了使用ForteBio系统检测的反应(如实施例4中所解释)，其中这些曲线在中央垂线左边的部分显示了在pH6下各种Fc片段与FcRn的缔合的相对量，并且这些曲线在中央垂线右边的部分显示了在pH7.4下Fc片段与FcRn的解离。右侧的表格提供了在pH6下检测到的每一变体以及野生型Fc片段(FcWT)的最大结合反应。
图4：在食蟹猕猴中含变体Fc片段和对照Fc片段的抗体的平均浓度随注射后时间的变化。x轴指示了注射后的时间，以小时为单位，并且y轴指示在注射了抗体的食蟹猕猴的外周血中的抗体浓度，以纳克/毫升(ng/mL)为单位。
图5：环10的变体的序列。示出了人IgG1Fc片段中环的野生型或变体型式的氨基酸序列，其在任一侧带有三个相邻氨基酸。所示氨基酸序列依据图2的编号方案是氨基酸残基166-178，或根据如本图和表1中所示的EU编号(SEQ ID NO：563)是氨基酸381-393。未变化的野生型环区序列称为“野生型序列”。Fc变体5-1(由来自文库L5的分离株编码)中这一环区的序列称为“5-1”(SEQ ID NO：564)。插入的氨基酸序列是以带下划线的粗体字示出。下方示出了来自5-1的各种变体的同一环区的序列，这些变体具有相同的肽插入该环内或邻近处的不同位置中，在一些情形中有一些环氨基酸缺失。
图6：在环10的不同位置处具有相同插入序列的变体Fc片段分别在pH6和pH7.4下的缔合和解离曲线。左侧示出了各种变体Fc片段以及野生型Fc片段(FcWT)在pH6下的缔合曲线(在中央垂线的左侧)和在pH7.4下的解离曲线(在中央垂线的右侧)。右侧以表格形式示出了所检测的每一变体在pH6下的最大结合反应。
图7：来自在酵母中筛选的文库L5的变体Fc片段在pH6和pH7.4下的缔合和解离曲线。左侧示出了各种变体Fc片段以及野生型Fc片段(FcWT)在pH6下的缔合曲线(在中央垂线的左侧)和在pH7.4下的解离曲线(在中央垂线的右侧)。右侧以表格形式示出了所检测的每一变体在pH6下的最大结合反应。
图8：来自在酵母中筛选的文库L-8和L-10的变体Fc片段在pH6和pH7.4下的缔合和解离曲线。左侧示出了各种变体Fc片段以及野生型Fc片段(FcWT)在pH6下的缔合曲线(在中央垂线的左侧)和在pH7.4下的解离曲线(在中央垂线的右侧)。右侧以表格形式示出了所检测的每一变体在pH6下的最大结合反应。
图9：在食蟹猕猴中含变体Fc片段和对照Fc片段的抗体的平均浓度随注射后时间的变化。x轴指示了注射后的时间，以小时为单位，并且y轴指示在注射了抗体的食蟹猕猴的外周血中的抗体浓度，以纳克/毫升(ng/mL)为单位。
图10：在食蟹猕猴中含变体Fc片段和对照Fc片段的抗体的平均浓度随注射后时间的变化。x轴指示了注射后的时间，以小时为单位，并且y轴指示在注射了抗体的食蟹猕猴的外周血中的抗体浓度，以纳克/毫升(ng/mL)为单位。如所指示的，实心圆代表了注射Y-5-112的食蟹猕猴的个别数据点，并且实线代表了这些数据的平均值。类似地，三角形代表了注射抗体Y的食蟹猕猴的个别数据点，并且虚线代表了这些数据的平均值。
序列的简要说明
发明详述
治疗性蛋白质的增加体内半衰期的改变可以是有用的，因为此类蛋白质可以按较低的量和/或较低的频率给药。本发明提供了包含变体Fc片段的变体Fc多肽，这些变体Fc多肽在略呈酸性的pH值(如例如pH5.0-6.0)下以增加的亲和力和/或结合活性结合于FcRn，并且在约7.2到7.6的生理pH值下不能良好地结合于FcRn。如本文所证实的，如与对照Fc多肽相比较，此类含有变体Fc片段的变体Fc多肽可以具有较长的体内半衰期。提供了包含变体人Fc片段的变体Fc多肽，这些变体Fc多肽在环内或邻近处含有至少一个插入序列，并且如与不同之处仅在于不含插入序列的对照Fc多肽相比较，其在约5到6的pH值下以增强的亲和力和/或结合活性结合于FcRn。还提供了编码含有此类变体Fc片段的蛋白质和变体Fc多肽的核酸、含有此类核酸的宿主细胞及制备变体Fc多肽和变体Fc片段的方法。另外，提供了延长Fc多肽的半衰期的方法，并且还提供了鉴别变体Fc片段的方法，如与对照Fc片段相比较，这些变体Fc片段在pH5-6下以较高亲和力和/或结合活性并且在生理pH值下以较低或相当的亲和力和/或结合活性结合于FcRn。
如本文所描述的变体Fc片段在环内的所选位点处含有短插入序列。FcRn与Fc片段相互作用。免疫球蛋白结构域，如CH2或CH3结构域，具有包含β折叠部分与环交替的桶状结构。Hunkapiller和Hood(1989)，Adv.Immunol.44：1-63；Williams和Barclay(1988)，Ann.Rev.Immunol.6：381-405。Fc片段中的插入位点是在当FcRn结合于该Fc片段时作为与FcRn相对紧密接触的区域的一部分的环中或在邻近于这些区域的环中选择。图1示出了FcRn(顶图)和Fc片段(底图)的一部分的带状图，并且指出了Fc片段中选择的供插入的位点的位置。
如下文所示，在文库L5中的许多插入序列都具有所希望的使在pH5到6下与FcRn的结合增强并且在生理pH值下极少或不结合于FcRn的特性。其它文库，包括文库L1、L2B、L3及L4(参见图1和图2)，未得到具有所希望的特性的插入序列，即使是对大致相同数量的变体进行了筛选。文库L2A、L6A及L6B得到了具有所希望的特性的一些插入序列，不过数量比从文库L5所获得的数量少得多。意外地是，得到数量最多的具有所希望特性的插入序列的文库(即，文库L5)所在环区并非与FcRn最紧密接触的区域的部分。图1。
定义
如本文中所述，术语“亲和力”是指如实施例3中所解释，以如使用T100(或类似仪器)所测量的EC50值来度量的结合亲和力。如与对照Fc多肽(含有对照Fc片段)相比较，变体Fc多肽(含有变体Fc片段)对FcRn的“较高亲和力”意指，该变体Fc多肽具有的EC50值是该对照Fc多肽的EC50值的不超过50％。类似地，如与对照Fc多肽相比较，变体Fc多肽的“较低亲和力”意指，该变体Fc多肽具有的EC50值是对照Fc多肽的EC50值的超过150％。如果变体Fc多肽的EC50值是对照Fc多肽的EC50值的50％-150％，那么认为该变体Fc多肽的亲和力与该对照Fc多肽的亲和力“基本上相同”。
如本文中所述，术语“结合活性”是指如实施例4中所描述，在Octet系统中使用涂有生物素化人FcRn(hFcRn)的抗生蛋白链菌素生物传感器所测量的Fc多肽与FcRn的结合活性，其中缔合是在pH6下发生并且解离是在pH7.4下发生。如果所观察到的变体Fc多肽的最大反应是所观察到的对照Fc多肽的最大反应的至少1.5、1.75或2.0倍，那么变体Fc多肽在pH6下的结合活性被认为“高于”对照Fc多肽的结合活性。使用包含野生型Fc片段的对照Fc多肽所观察到的极少量的残留结合反应，即，大部分蛋白质在pH7.4下与hFcRn解离之后剩余的结合反应，称为“极低或无结合活性”。如果使用如实施例4中所描述的ForteBio系统，在一些或全部蛋白质在pH7.4下解离之后所检测到的变体Fc多肽的残留结合反应比使用对照Fc多肽所检测到的残留结合反应高出不超过0.2或0.1纳米，那么该变体Fc多肽也被认为在pH7.4下具有“极低或无结合活性”。
如本文中所述，“氨基酸”是指常常在人体蛋白质中发现的二十种L-氨基酸中的任一种，如下所示：丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸。
如本文中所述，“抗体”是指含有至少一个重链或轻链免疫球蛋白可变区的蛋白质。举例来说，scFv、包含两个或更多个scFv的分子及基本上由单一免疫球蛋白可变区组成的结构域抗体(如例如美国专利7,563,443中所描述)是如本文中所述的“抗体”。在许多情况下，抗体包括重链和轻链可变区以及人IgG Fc区。因此，术语“抗体”涵盖了含两个全长重链和两个全长轻链的全长抗体，如在哺乳动物中发现的天然存在的IgG、IgA、IgD、IgD或IgM抗体。Carayannopoulos和Capra，第3版FUNDAMENTAL IMMUNOLOGY的第9章，Paul编辑，Raven Press，New York，1993，第284-286页；这一参考文献中描述抗体的部分以引用的方式并入本文。示例性抗体包括阿达木单抗(adalimumab)(Abbott Laboratories)、英利昔单抗(infliximab)(Centocor Ortho Biotech Inc.)、优特克单抗(ustekinumab)(Centocor)、戈利木单抗(golimumab)(Centocor Ortho Biotech)、卡那单抗(canakinumab)(NovartisPharmceuticals Corporation)、奥法木单抗(ofatumumab)(Glaxo Group Ltd.)、托珠单抗(tocilizumab)(ChugaiSeiyaku Kabushiki Corp.，Japan)、贝利单抗(belimumab)( Human Genome Sciences，Inc.)、贝伐单抗(bevacizumab)(Genentech)、西妥昔单抗(cetuximab)(ImClone Systems Inc.)、依芬古单抗(efungumab)(Novartis AB Corp.)、依法珠单抗(efalizumab)(Genentech Inc.)、埃达珠单抗(etaracizumab)(Medimmune LLC)、吉妥珠单抗奥唑米星(gemtuzumab ozogamicin)(Wyeth)、吉瑞昔单抗(girentuximab)(Wilex AG Corp.，Germany)、那他珠单抗(natalizumab)(Elan Pharmceuticals，Inc.)、奥马珠单抗(omaliztmab)(Novartis AG Corp.，Switzerland)、奥戈伏单抗(oregovomab)(AltaRex Corp.，Canada)、帕利珠单抗(palivizumab)( Medimmune Inc.)、帕尼单抗(panitumumab)(Amgen Inc.)、兰尼单抗(ranibizumab)(Genentech Inc.)、利妥昔单抗(rituximab)(Idec Pharmaceuticals Corp.)、特非珠单抗(tefibazumab)(Inhibirex Corp.)、托西莫单抗(tositumomab)(GlaxoSmithKline Beecham Corp.)、曲妥珠单抗(trastuzumab)(Genentech Inc.)及地诺单抗(denosumab)(或Amgen Inc.)等等。这些IgG抗体可以属于IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同种型，并且可以是嵌合抗体、人抗体或人源化抗体。另外，术语“抗体”包括了含有两条重链并且不含轻链的二聚体抗体，如在骆驼、其它单峰骆驼物种及鲨鱼中所发现的天然存在的抗体。参见例如，Muyldermans等，2001，J.Biotechnol.74：277-302；Desmyter等，2001，J.Biol.Chem.276：26285-90；Streltsov等(2005)，Protein Science 14：2901-2909。抗体可以是单特异性的(即，仅结合于一类抗原)或多特异性的(即，结合于超过一类抗原)。在一些实施方案中，抗体可以是双特异性的(即，结合于两个不同种类的抗原)。另外，抗体可以是单价、二价或多价的，意指它可以一次性结合于一个或两个或更多个抗原分子。此类抗体的一些可能的形式包括单特异性或双特异性全长抗体、单特异性单价抗体(如国际申请WO 2009/089004和美国申请公布2007/0105199中所描述，其相关部分以引用的方式并入本文；及美国申请公布2005/0227324，其相关部分以引用的方式并入本文)，这些抗体可以抑制或活化其所结合的分子；二价单特异性或双特异性二聚体Fv-Fc、scFv-Fc或双功能抗体Fc、单特异性单价scFv-Fc/Fc，以及美国公布2009/0311253(其相关部分以引用的方式并入本文)中描述的多特异性结合蛋白和双可变结构域免疫球蛋白，及许多其它可能的抗体形式。
如本文中所述，“结合区”是指如本文所描述的“Fc多肽”、“对照Fc多肽”或“变体Fc多肽”中所包括的区域，该区域结合于靶分子，如例如在癌细胞、介导自体免疫性病症或发炎性病症的细胞、受感染的细胞、感染物或介导免疫效应功能的细胞(例如NK细胞)上高水平表达的蛋白质。结合区可以含有重链和/或轻链免疫球蛋白可变(VH和/或VL)区或非免疫球蛋白多肽。示例性结合区包括例如Fv(它包含通过连接子连接的VH和VL区)或结合于靶分子的人受体的可溶性形式。
如本文中所述，“Fc片段”是指由抗体铰链区的一部分或全部加上抗体的CH2和CH3区，以及任选地加上在如IgA或IgM抗体等一些天然存在的同种型中的CH3区下游发现的区域组成的多肽。该抗体可以属于IgG同种型，包括IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同种型，或者属于IgM、IgE、IgD或IgA同种型。该抗体可以是人或动物来源的。举例来说，抗体可以来自哺乳动物，如小鼠、大鼠、仓鼠、兔、山羊或绵羊，或来自骆驼类物种或鲨鱼。人IgG1、IgG2、IgG3及IgG4Fc片段的序列分别公开于SEQ ID NO：1、3、5及7。这些序列也显示于下表1中。一般来说，Fc片段经由两个Fc片段内CH3结构域之间的相互作用形成二聚体，这些二聚体因铰链区中半胱氨酸残基之间存在的二硫键而变得稳定。本文中称为“Fc区”的Fc片段具体地定义为二聚体Fc片段，不过普遍认为Fc片段一般将在生理条件下二聚化。二聚体可以在强还原条件下解离。
如本文中所述，“Fc多肽”是指包含Fc片段和结合区的蛋白质。Fc多肽包括抗体、Fc融合蛋白，以及含有另外的“药理学活性部分”的抗体或融合蛋白，该“药理学活性部分”是非肽有机部分(即，“小分子”)或肽，其可以用作毒素和/或可以模拟、拮抗或促进与Fc多肽共价缀合或融合的生物路径的活性。Fc多肽(如Fc片段)通常形成二聚体，这些二聚体是通过在两个Fc多肽的铰链区中的半胱氨酸残基之间的共价键来稳定。
如本文中所述，“对照Fc片段”是指与供比较的“变体Fc多肽”相同但不像变体Fc片段那样在环中具有插入序列的Fc片段。因此，“对照Fc片段”在该变体Fc片段具有插入序列的环中具有在天然存在的Fc片段中所见的未修饰的序列，该插入序列使该变体Fc片段在pH5到6下对于FcRn的亲和力增加。相对于天然存在的Fc片段，对照Fc片段可以含有除所述插入序列外的修饰。举例来说，在变体Fc片段和与其相比较的对照Fc片段中都可以存在以下描述的异源二聚化变化或其它微小修饰。因此，“对照Fc片段”与“变体Fc片段”之间的唯一差别是在变体Fc片段中的环内或邻近处的插入序列。“对照Fc区”被定义为包含两个对照Fc片段的二聚体，不过预期对照Fc片段一般会是以二聚体形式存在。
如本文中所述，“变体Fc片段”是指在Fc片段的环内或邻近处包括一个不超过80个、不超过60个、不超过40个或不超过20个氨基酸的插入序列的Fc片段。人IgG Fc片段中的环显示于表1中，并且进行插入的环显示于图2中。其它Fc片段中的环是本领域中已知的。本领域中已知众多序列。参见例如，Kabat等，Sequences of Proteins ofImmunological Interest，Public Health Service N.I.H.，Bethesda，MD，1991，其中有关铰链区、CH2区及CH3区的序列和三级结构的部分以引用的方式并入本文。Kabat等提供了众多序列的比对。根据Kabat等中所提供的比对、免疫球蛋白结构域的高度保守的结构和本文所提供的环的位置，以及本领域中可获得的丰富的其它信息，可以将环定位于来自任何物种的任何同种型的Fc片段中。举例来说，Protein DataBank网站含有丰富的有关许多蛋白质的三级结构的信息。在一些实施方案中，插入的氨基酸可以置换该环中天然存在的一到十个氨基酸。插入的氨基酸的数量可以比去除的氨基酸的数量更少、更多或相同。在其它实施方案中，最初在该环中的所有氨基酸都保留，并且插入的氨基酸是单纯地添加。在一些实施方案中，变体人IgG Fc片段可以包含其它“另外的微小修饰”，即，在除发生插入的环外的位置处的不超过十六个氨基酸的插入、缺失或取代。在一些实施方案中，在除发生插入的环外的位置处可以存在不超过1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个单氨基酸插入、缺失或取代。在其它实施方案中，变体Fc片段不包含任何另外的微小修饰。在一些实施方案中，这些另外的微小修饰可以是例如以下描述的“异源二聚化变化”，这些变化有助于形成异源二聚体Fc区。在一些实施方案中，这些另外的微小修饰可以包括保守氨基酸取代。
保守氨基酸取代包括以下取代：(1)针对丙氨酸的缬氨酸、亮氨酸或异亮氨酸；(2)针对精氨酸的赖氨酸、谷氨酰胺或天冬酰胺；(3)针对天冬酰胺的谷氨酰胺、谷氨酸或天冬氨酸；(4)针对天冬氨酸的谷氨酸、天冬酰胺或谷氨酰胺；(5)针对半胱氨酸的丝氨酸或丙氨酸；(6)针对谷氨酰胺的天冬酰胺、谷氨酸或天冬氨酸；(7)针对谷氨酸的天冬氨酸、谷氨酰胺或天冬酰胺；(8)针对丙氨酸的脯氨酸或丙氨酸；(9)针对组氨酸的天冬酰胺、谷氨酰胺、赖氨酸或精氨酸；(10)针对异亮氨酸的亮氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、丙氨酸或苯丙氨酸；(11)针对亮氨酸的异亮氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、丙氨酸或苯丙氨酸；(12)针对赖氨酸的精氨酸、天冬酰胺或谷氨酰胺；(13)针对甲硫氨酸的亮氨酸、苯丙氨酸或异亮氨酸；(14)针对苯丙氨酸的亮氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、丙氨酸或酪氨酸；(15)针对脯氨酸的丙氨酸；(16)针对丝氨酸的苏氨酸、丙氨酸或半胱氨酸；(17)针对苏氨酸的丝氨酸；(18)针对色氨酸的酪氨酸或苯丙氨酸；(19)针对酪氨酸的色氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸或丝氨酸；及(20)针对缬氨酸的异亮氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸或丙氨酸。
此外，在一些实施方案中，变体Fc片段可以含有另外的“药理学活性部分”，该“药理学活性部分”是非肽有机部分(即，“小分子”)或肽，其可以用作毒素和/或可以模拟、拮抗或促进与Fc片段共价缀合或融合的生物路径的活性。如果变体Fc片段含有此类药理学活性部分，那么其“对照Fc片段”也含有此类部分。
在其它实施方案中，变体人IgG Fc片段除在发生插入的环中存在的那些变化外不含变化。与“Fc片段”相同，“变体Fc片段”可以属于IgG同种型，包括IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同种型，或者属于IgM、IgE、IgD或IgA同种型。它可以是人或动物来源的。举例来说，Fc片段可以来自能够经过修饰以产生变体Fc片段的哺乳动物，如小鼠、大鼠、仓鼠、兔、山羊或绵羊，或来自骆驼类物种或鲨鱼。如同其它Fc片段一样，变体Fc片段通常为二聚体，并且“变体Fc区”具体地定义为二聚体变体Fc片段。
如本文中所述，“变体Fc多肽”包含变体Fc片段和结合区。任选地，变体Fc多肽可以含有多个结合区。变体Fc多肽可以是多聚体，如二聚体、三聚体、四聚体或更高级的多聚体。在许多情形中，该Fc多肽的变体Fc片段可以形成二硫键，从而二聚化。变体Fc多肽包括例如二聚体Fc融合蛋白、四聚体全长抗体(含有两个重链和两个轻链)、二聚体scFv-Fc等。这些多肽可以是异源多聚体或同源多聚体，如异源二聚体或同源二聚体。变体Fc多肽可以是抗体、Fc融合蛋白，或在一些实施方案中是包含另外的非抗体药理学活性部分的抗体或Fc融合蛋白。此类“药理学活性部分”可以与Fc多肽共价缀合或融合，并且可以是非肽有机部分(即，“小分子”)或肽，它可以充当毒素和/或可以模拟、拮抗或促进生物路径的活性。
如本文中所述，“Fc融合蛋白”是指含有与另一种非抗体多肽融合的Fc片段的蛋白质。该非抗体多肽包含了结合于靶分子的结合区，并且不包含抗体的重链或轻链可变区。Fc融合蛋白的结合区可以包含非抗体多肽，如受体的可溶性部分或者一种或多种结合于靶分子的肽(如例如，结合于靶蛋白的“单体结构域”，如美国专利7,820,790中所定义，它可以如美国专利7,820,790中所论述进行选择)，或其它多肽。美国专利7,820,790中描述单体结构域和这些单体结构域如何选择的部分以引用的方式并入本文。在具体实施方案中，Fc融合蛋白可以是依那西普(由Amgen Inc.销售)、罗米司亭(由Amgen Inc.销售)、阿法赛特(BiogenCorp.)、阿巴西普(由Bristol-Myers Squibb销售)、利隆西普(由Regeneron销售)或阿柏西普(EYLEATM，由Regeneron销售)。可以作为Fc融合蛋白结合区的一部分的其它多肽包括了含支架结构域的多肽，这些支架结构域已经随机分入某些位置中并针对结合于某一靶分子进行选择。这些支架结构域包括例如T淋巴细胞相关蛋白-4(CTLA-4；Nuttall等(1999)，Proteins 36：217-227)、葡萄球菌蛋白1的Z结构域(Nord等(1995)，Protein Eng.8：601-608)、绿色荧光蛋白及人纤连蛋白III型第十结构域(FN3；Koide等(1998)，J.Mol.Biol.284：1141-1151；Karatan等(2004)，Chem.&Biol.11：835-844)。这些参考文献中描述支架结构域及其在产生结合结构域方面的用途的部分以引用的方式并入本文。对于Fc融合蛋白，与含有Fc片段的其它蛋白质相同，可以形成多聚体，这些多聚体可以是二聚体。这些多聚体可以是异源多聚体或同源多聚体。Fc融合蛋白可以是异源二聚体或同源二聚体并且是双特异性或单特异性的。
如本文中所述，“变体Fc融合蛋白”是包括变体Fc片段的Fc融合蛋白。
如本文中所述，“对照Fc融合蛋白”是与供比较的变体Fc融合蛋白具有相同的氨基酸序列但不含在该变体Fc融合蛋白的Fc片段部分的环中的插入序列的Fc融合蛋白。
如本文中所述，“全长IgG抗体”是包含两个完整重链和两个完整轻链的IgG抗体。
“异源二聚化变化”一般是指在二聚体Fc区的两条链(即，A链和B链)中的促进异源二聚体Fc区(即，Fc区的A链和B链不具有同一性的氨基酸序列的Fc区)形成的变化。异源二聚化变化可以是不对称的，即，具有某一变化的A链可以与具有不同变化的B链配对。这些变化促进了异源二聚化并且不利于同源二聚化。是形成了异源二聚体还是同源二聚体可以通过如由聚丙烯酰胺凝胶电泳确定的大小差异来评估，在这些情形中，一条多肽链是Fc片段(即，缺乏除铰链区、CH2区及CH3区外的序列)并且另一条是scFv-Fc。这种配对的异源二聚化变化的一个实例是所谓的“按钮与孔(knobs and holes)”取代。参见例如，美国专利7,695,936和美国专利申请公布2003/0078385，其中描述此类突变的部分以引用的方式并入本文。如本文中所述，含有一对按钮与孔取代的Fc区在一个Fc片段(称为A链)中含有一种取代并且在另一个Fc片段(称为B链)中含有另一取代。举例来说，如与在未修饰的A链和B链下的发现相比较，已发现以下在IgG1Fc区的A链和B链中的按钮与孔取代可增加异源二聚体的形成：1)一条链中的Y407T与另一链中的T366Y；2)一条链中的Y407A与另一链中的T366W；3)一条链中的F405A与另一链中的T394W；4)一条链中的F405W与另一链中的T394S；5)一条链中的Y407T与另一链中的T366Y；6)一条链中的T366Y和F405A与另一链中的T394W和Y407T；7)一条链中的T366W和F405W与另一链中的T394S和Y407A；8)一条链中的F405W和Y407A与另一链中的T366W和T394S；及9)Fc的一条多肽链中的T366W与另一链中的T366S、L368A及Y407V。如本文中所述，突变是以下述方式表示。使用EU编号系统(参见下表1)，在通常存在于Fc片段中的指定位置处的氨基酸(使用单字母代码)之后是EU位置，随后是在该位置处存在的替代氨基酸。举例来说，Y407T意指通常存在于EU位置407处的酪氨酸被苏氨酸替代。作为此类变化的替代方案或除此类变化之外，建立新的二硫桥的取代可以促进异源二聚体的形成。参见例如，美国专利申请公布2003/0078385，其中描述此类突变的部分以引用的方式并入本文。在IgG1Fc区中的这些变化包括例如以下取代：在一个Fc片段中的Y349C与在另一个中的S354C；在一个Fc片段中的Y349C与在另一个中的E356C；在一个Fc片段中的Y349C与在另一个中的E357C；在一个Fc片段中的L351C与在另一个中的S354C；在一个Fc片段中的T394C与在另一个中的E397C；或在一个Fc片段中的D399C与在另一个中的K392C。类似地，改变例如CH3-CH3界面中一个或多个残基的电荷的取代可以增进异源二聚体的形成，如WO2009/089004中所解释，该案中描述此类取代的部分以引用的方式并入本文。此类取代在本文中称为“电荷对取代”，并且含有一对电荷对取代的Fc区在A链中含有一种取代并且在B链中含有不同的取代。电荷对取代的一般实例包括以下取代：1)一条链中的K409D或K409E加另一链中的D399K或D399R；2)一条链中的K392D或K392E加另一链中的D399K或D399R；3)一条链中的K439D或K439E加另一链中的D356K或D356R；和4)一条链中的K370D或K370E加另一链中的E357K或E357R。此外，两条链中的取代R355D、R355E、K360D或K360R当与其它异源二聚化变化一起使用时可以使异源二聚体稳定。特定的电荷对取代可以单独使用或与其它电荷对取代一起使用。单对电荷对取代及其组合的具体实例包括以下取代：1)在一条链中的K409E加另一链中的D399K；2)在一条链中的K409E加另一链中的D399R；3)在一条链中的K409D加另一链中的D399K；4)在一条链中的K409D加另一链中的D399R；5)在一条链中的K392E加另一链中的D399R；6)在一条链中的K392E加另一链中的D399K；7)在一条链中的K392D加另一链中的D399R；8)在一条链中的K392D加另一链中的D399K；9)在一条链中的K409D和K360D加另一链中的D399K和E356K；10)在一条链中的K409D和K370D加另一链中的D399K和E357K；11)在一条链中的K409D和K392D加另一链中的D399K、E356K和E357K；12)在一条链上的K409D和K392D与另一链上的D399K；13)在一条链上的K409D和K392D加另一链上的D399K和E356K；14)在一条链上的K409D和K392D加另一链上的D399K和D357K；15)在一条链上的K409D和K370D加另一链上的D399K和D357K；16)在一条链上的D399K加另一链上的K409D和K360D；及17)在一条链上的K409D和K439D加另一链上的D399K和E356K。这些异源二聚化变化中的任一种都可以作为如本文所描述的变体Fc区的一部分，其可以比对照Fc区高的亲和力结合于FcRn。
如本文所述，“环”是指Fc片段三级结构中连接β链从而构成核心免疫球蛋白折叠的β折叠的部分。环可以含有不超过两个被指定为涉及β折叠的连续残基(如在环10和11中；参见下表1)并且还可以含有指定为螺旋、转角、分离的β桥或弯曲的残基。如本文中所述，人IgG Fc区的环区显示于表1中。
“在环内的插入序列”或在任何氨基酸伸长“内”，例如在环10内的插入序列，是在环内的两个相邻氨基酸之间或在环内的一个氨基酸与不作为该环的一部分的相邻氨基酸之间的具有3-35、3-20、6-20、6-15、6-12、3-15、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16个氨基酸的插入序列。“在环内的插入序列”还涵盖从环去除氨基酸以及将其它氨基酸插入该环中的情形。插入到该环中的氨基酸的数量可以是3-35、3-22、4-20、6-18、6-15、6-12、3-15、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16个氨基酸，并且从该环去除的氨基酸的数量比插入到该环中的氨基酸数量更少、相同或更多。举例来说，可以从环中去除1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸。此外，“在环内的插入序列”涵盖在同一环内存在超过一个插入序列的实施方案，如在一个环内或邻近处的两对不同氨基酸之间的插入序列(如以上所描述)；或在该环内的一个或多个不相邻氨基酸缺失并且缺失的氨基酸被数量更少、相同或更多的氨基酸替代的实施方案。文库L3(如图2中所示)是此类插入方案的一个实例。
“在环内或邻近处的插入序列”与如以上所描述的“在环内的插入序列”相同，但它还包括插入序列在该环邻近处的第一个氨基酸与在该第一氨基酸邻近处并且在该环外的另一氨基酸之间的情形。
如本文中所述，“生理pH值”是约7.2-7.6的pH值。
“scFv-Fc/Fc”是基本上由通过一个或多个二硫键连接的scFv-Fc加Fc片段组成的二聚体蛋白质。另外，由Fc片段和scFv-Fc形成的Fc区可以在CH3结构域中含有如所描述的“异源二聚化变化”，如一对、两对、三对或更多对电荷对取代。
如本文中所述，“肽”是短的多肽。一般来说，肽的长度为2到80、2到60、2到50、2到40、2到30或2到20个氨基酸。
如本文中所述，“靶分子”是如本文所描述的Fc多肽的结合区所结合的分子。在一些实施方案中，靶分子是例如在癌细胞上高水平表达或在介导自体免疫病症或发炎性病症的细胞上或在受感染细胞上、感染物上或介导免疫效应功能的细胞(例如NK细胞)上表达的蛋白质。
如本文所描述，对于FcRn的亲和力高于对照Fc多肽的变体Fc多肽的“治疗有效量”是具有例如减小或消除癌症患者的肿瘤负担，或者减少或消除使用该蛋白质治疗的任何疾病状况的症状的作用的量。治疗有效量无需完全地消除该病症的所有症状，但可以可以降低一种或多种症状的严重程度，或延缓可能在所治疗的病症之后以某一频率发生的更严重的症状或更严重疾病的发作。或者，含有经过修饰的Fc多肽的蛋白质的治疗有效量当在体内施用给需要治疗的患者时足以可检测地影响相关生物标记物的表达。
本文所提到的任何疾病的“治疗”涵盖该疾病至少一种症状的减轻、该疾病的严重程度的降低，或者在一些情形中可能伴随该疾病或导致至少另一种疾病的更严重症状的疾病进展的延缓或预防。治疗无需意味着疾病的完全治愈。一种有用的治疗剂只需要降低疾病的严重程度、降低与该疾病或其治疗有关的一种或多种症状的严重程度，或延缓可能在所治疗的病症之后以某一频率发生的更严重的症状或更严重疾病的发作。
变体Fc多肽
本文提供了在pH5.0到pH6.0下以比对照Fc多肽高的亲和力和/或结合活性结合于FcRn的变体Fc多肽。与对照Fc多肽相同，这些变体Fc多肽在约pH7.2到约pH7.6下以较低亲和力和/或结合活性(如果有的话)结合于FcRn。这些变体Fc多肽可以(在修饰之前)是人或动物来源的并且可以属于IgG同种型，包括IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。该FcRn也可以是人或动物来源的。这些变体Fc多肽另外包含可以结合于靶分子(如本文所描述)并且可以用于治疗至少部分由该靶分子介导的疾病的结合区。在一些实施方案中，该靶分子不能直接地介导所治疗的病症，但结合于该靶分子可以用于定位Fc多肽或其所结合的靶分子。举例来说，双特异性Fc多肽可以桥接两种不同的细胞类型，例如癌细胞和免疫系统细胞，这些细胞各自在其表面上表达能够被Fc多肽结合的靶分子。变体Fc多肽可以是包含变体Fc片段的抗体或Fc融合蛋白。此外，变体Fc多肽可以是含有另外的非抗体结合区的抗体。任选地，变体Fc多肽可以含有人IgG变体Fc片段。
在下表1中，比对了人IgG1、IgG2、IgG3及IgG4Fc多肽的氨基酸序列(分别为SEQ ID NO：1、3、5及7)。序列是根据Edelman等(1969)，Proc.Natl.Acad.Sci.63：78-85(其相关部分以引用的方式并入本文)的EU系统进行编号。如表1中所示，单个数字可以用于指在全部四种人IgG同种型中都类似的位置，即使线性编号方案会强制对每种同种型的这一位置命名一个不同的数字。举例来说，在297位的天冬酰胺是存在于所有人IgG抗体中的众所周知并且高度保守的糖基化位点，称为天冬酰胺297，不管所论述的人IgG同种型如何。
人IgG3抗体具有的铰链区比其它人IgG同种型长得多，并且表1中仅示出了这一铰链区的最末端的羧基部分。表1中所示的人IgG1、IgG2及IgG4序列包括整个铰链区。如在表1中显而易见，人IgG4抗体的铰链区比IgG1抗体的铰链区少三个氨基酸。如与人IgG1相比较，人IgG2抗体具有略微较短的铰链区，并且在CH2区的氨基末端附近具有一个氨基酸的间隙。表1的IgG1行中所示的氨基酸216-447及IgG4行中的氨基酸224-447分别对应于SEQ ID NO：1的氨基酸1-232和SEQ ID NO：7的氨基酸6-229。表1的IgG3行中的氨基酸216到447对应于SEQ ID NO：5的氨基酸48-279。表1的IgG2行中的氨基酸237到447对应于SEQ ID NO：3的氨基酸18到228。
在表1中，位于如本文中所述的环中的氨基酸是以带下划线的粗体字显示。每一环在下方都标有数字，即，“环1”、“环2”等。更详细地说，环出现在以下位置：环1，SEQ ID NO：1的氨基酸29-43、SEQ ID NO：3的氨基酸25-39、SEQ ID NO：5的氨基酸76-90及SEQID NO：7的氨基酸26-40；环2，SEQ ID NO：1的氨基酸50-58、SEQ IDNO：3的氨基酸46-54、SEQ ID NO：5的氨基酸97-105及SEQ ID NO：7的氨基酸47-55；环3，SEQ ID NO：1的氨基酸70-72、SEQ ID NO：3的氨基酸66-68、SEQ ID NO：5的氨基酸117-119及SEQ ID NO：7的氨基酸67-69；环4，SEQ ID NO：1的氨基酸80-84、SEQ ID NO：3的氨基酸76-80、SEQ ID NO：5的氨基酸127-131及SEQ ID NO：7的氨基酸77-81；环5，SEQ ID NO：1的氨基酸92-103、SEQ ID NO：3的氨基酸88-99、SEQ ID NO：5的氨基酸139-150及SEQ ID NO：7的氨基酸89-100；环6，SEQ ID NO：1的氨基酸110-116、SEQ ID NO：3的氨基酸106-112、SEQ ID NO：5的氨基酸157-163及SEQ ID NO：7的氨基酸107-113；环7，SEQ ID NO：1的氨基酸122-131、SEQ IDNO：3的氨基酸118-127、SEQ ID NO：5的氨基酸169-178及SEQ IDNO：7的氨基酸119-128；环8，SEQ ID NO：1的氨基酸137-146、SEQID NO：3的氨基酸133-142、SEQ ID NO：5的氨基酸184-193及SEQ IDNO：7的氨基酸134-143；环9，SEQ ID NO：1的氨基酸158-162、SEQID NO：3的氨基酸154-158、SEQ ID NO：5的氨基酸205-209及SEQ IDNO：7的氨基酸155-159；环10，SEQ ID NO：1的氨基酸169-175、SEQID NO：3的氨基酸165-171、SEQ ID NO：5的氨基酸216-222及SEQ IDNO：7的氨基酸166-172；环11，SEQ ID NO：1的氨基酸179-188、SEQID NO：3的氨基酸175-184、SEQ ID NO：5的氨基酸226-235及SEQ IDNO：7的氨基酸176-185；环12，SEQ ID NO：1的氨基酸199-207、SEQID NO：3的氨基酸195-203、SEQ ID NO：5的氨基酸246-254及SEQ IDNO：7的氨基酸196-204；环13，SEQ ID NO：1的氨基酸214-221、SEQID NO：3的氨基酸210-217、SEQ ID NO：5的氨基酸261-268及SEQ IDNO：7的氨基酸211-218。
表1：人IgG Fc区的比对(比对以所呈现的次序分别公开了SEQID NO 1和3、SEQ ID NO：5的残基48-279及SEQ ID NO：7)
每一比对组的第五行中称为“DSSP”(代表蛋白质二级结构词典(Dictionary of Protein Secondary Structure))的标记是从Protein DataBank得到的1HZH(H链)结构取得，具有以下含义：“G”指代具有3个转角的螺旋(310螺旋)，具有最少3个残基的长度；“H”指代具有4个转角的螺旋(α螺旋)，具有最少4个残基的长度；“I”指代具有5个转角的螺旋(π螺旋)，具有最少5个残基的长度；“T”指代氢键合的转角(3、4或5个转角)；“E”指代呈平行和/或反平行β折叠构象的延长的链，具有最少2个残基的长度；“B”指代分离的β桥中的残基(单对β折叠氢键形成)；“S”指代弯曲(唯一的不基于氢键的分配)。不属于以上任一构象的氨基酸残基在“DSSP”行中以空白区指示。这些名称是本领域中的标准名称并且可见于Protein Data Bank(PDB)网站。
根据表1中的编号，人IgG Fc片段的铰链区从氨基酸216延伸到230。CH2区从氨基酸231延伸到340，并且CH3区从氨基酸341延伸到447。从表1中的比对显而易见，人IgG Fc片段的序列是高度保守的。大部分序列差异出现在铰链区中，并且极少数的序列差异出现在CH2区和CH3区中。因此，使用了包含在一种人IgG亚型的CH2或CH3区中含插入序列的人IgG变体Fc片段的变体Fc多肽获得的结果将同样适用于其它人IgG亚型。
在本文所描述的变体人IgG Fc多肽中的插入序列可以出现在已知在环中的位置。这些插入序列可以出现在Fc多肽的Fc片段部分的环1-13(如上表1中所示)的任一环内或邻近处。在一些实施方案中，可以在两个相邻氨基酸之间插入1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16，或者1-18、6-16、10-16、12-14、3-20、20-30、30-50或50-80个氨基酸，其中至少一个是包括在Fc片段的一个环中。在一些实施方案中，在该插入序列中非随机地包括两个半胱氨酸，在该插入序列的前四个和后四个氨基酸中各一个，由此将半胱氨酸之间的氨基酸局限在通过二硫键结合的紧密环中。在一些实施方案中，插入序列的前三个氨基酸是Gly-Gly-Cys，并且后三个氨基酸是Cys-Gly-Gly。在这两个半胱氨酸之间可以插入具有另外的4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或10-30个氨基酸的插入序列。在另其它实施方案中，该环中的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸缺失，并且被具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16，或者1-18、6-16、10-16、12-14、15-30、30-50或50-80个氨基酸的插入序列和/或被在插入序列的前四个和后四个氨基酸中含有两个半胱氨酸的插入序列替代。缺失的氨基酸的数量可以与插入的氨基酸的数量相同、比其数量更少或更多。在其它实施方案中，在单个环中可以出现超过一个插入序列。含有插入序列的变体Fc多肽可以在pH5到6下以比对照Fc多肽高的亲和力结合于人FcRn。插入的氨基酸可以包括全部20种氨基酸中的任一种或除半胱氨酸外的全部氨基酸中的任一种。另外，变体Fc片段可以仅在一个环中或在超过一个环中(如在2、3或4个环中)包含插入序列。
在Fc片段的环5、8或10内或邻近处的插入序列可以增加此类变体Fc片段在pH5到6下对人FcRn的结合亲和力。在具体实施方案中，可以在人IgG Fc片段的环8内或邻近处的氨基酸358与359之间或者在环10内或邻近处的氨基酸384与385之间进行插入(使用如表1中所说明的EU编号方案)。该插入序列可以含有4-20、1-18、6-16、10-16、12-14、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16个氨基酸。任选地，这些氨基酸可以局限于除半胱氨酸外的所有氨基酸。在一些实施方案中，该插入序列可以在插入序列的前四个和后四个氨基酸中含有半胱氨酸，并且插入的氨基酸可以另外地局限于除半胱氨酸外的氨基酸。在一些实施方案中，该插入序列可以不含半胱氨酸。在一些实施方案中，该插入序列可以具有选自以下序列的式：CXXXXXXC(SEQ ID NO：13)、CXXXXXXXC(SEQ IDNO：14)、CXXXXXXXXC(SEQ ID NO：15)、GCXXXXXXCG(SEQ IDNO：16)、GCXXXXXXXCG(SEQ ID NO：17)、GCXXXXXXXXCG(SEQ ID NO：18)、GGCXXXXXXCGG(SEQ ID NO：19)、GGCXXXXXXXCGG(SEQ ID NO：20)及GGCXXXXXXXXCGG(SEQ ID NO：21)、GGGCXXXXXXCGGG(SEQE ID NO：22)、GGGCXXXXXXXCGGG(SEQ ID NO：23)以及GGGCXXXXXXXXCGGG(SEQ ID NO：24)，其中X表示除半胱氨酸外的任何氨基酸。由于实际插入序列是由以下实施例中所描述的筛选方法得出，故随机的氨基酸可能在所观察到的Fc片段特性的改变中起到支配作用。因此，预期具有的插入序列仅含插入序列(与上述那些相同，这些插入序列含有一些非随机氨基酸)的随机化部分的变体Fc片段也可以具有所希望的特性。此类序列的实例包括SEQ ID NO：41-53的中间六个氨基酸，如SEQ ID NO：54-66所示。
在另一个实施方案中，环5内或邻近处的氨基酸308和309(使用如表1中所示的EU编号)缺失并且被4-20、1-18、6-16、10-16、12-14、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、15-20、20-40、40-60或60-80个氨基酸替代，这些氨基酸可以局限于除半胱氨酸外的所有氨基酸。在一些实施方案中，该插入序列可以在插入序列的前四个和后四个氨基酸中含有半胱氨酸，并且插入的氨基酸可以另外地局限于除半胱氨酸外的氨基酸。该插入序列可以具有选自SEQ ID NO：13-24的式。
这些包含上文和下文所描述的氨基酸插入序列的变体Fc片段以及含有这些变体Fc片段的Fc多肽可以在pH5到6下以比对照Fc片段高的亲和力和/或结合活性结合于人FcRn，并且可以在生理pH值下以与对照Fc片段相当或比其低的亲和力和/或结合活性结合于人FcRn。另外，这些变体Fc片段可以进一步变化，并且针对在pH5到6下赋予对于人FcRn的甚至更高亲和力和/或结合活性、在生理pH值下赋予对于人FcRn的更低亲和力和/或结合活性或者其它所希望的特性(如储存稳定性)的变化进行筛选。在以下实施例中，经显示，在Fc片段内的指定位点处插入特定氨基酸序列(例如SEQ ID NO：41-66和90-246)可有效增加Fc片段在pH5到6下对于人FcRn的亲和力和/或结合活性。
包含人IgG变体Fc片段的变体Fc多肽还包含结合于靶分子的结合区。此类变体Fc多肽与靶分子的结合可以调节，任选地拮抗或促进靶分子的生物活性，和/或可以用于将Fc多肽定位于表达该靶分子的位置。Fc多肽可以在Fc多肽中包括超过一个结合区，如两个、三个或四个结合区。由于在一些情形中，Fc多肽可以多聚化形成二聚体、三聚体或四聚体，故不同Fc多肽的多聚化可以形成能够结合于超过一个靶分子的多聚体Fc多肽。如果在Fc多肽中存在多个结合区，那么它们可以结合于相同或不同靶分子或靶分子的部分。靶分子活性的调节可以影响至少部分由该靶分子介导的疾病或病症的过程。人IgG变体Fc多肽可以包含一个结合区，该结合区包括结合于一个或多个靶分子的一个或多个抗体可变区。此类人IgG变体Fc多肽可以例如是全长抗体，如人、人源化或嵌合IgG抗体、scFc-Fv、抗体的单价形式，如国际申请公布WO2005/063816和美国申请公布2007/0105199(其相关部分以引用的方式并入本文)中所描述的那些，这些抗体包含二聚体Fc区，以及VH区、CH1区、VL区、CL区及铰链区。其它形式描述于例如美国申请公布201O/0286374(以引用的方式并入本文)的图2以及描述和/或提到图2的内容中，以及美国专利5,837,821中，该案描述了包含连接到Fc区的scFv的“微型抗体”。美国专利5,837,821中描述微型抗体的部分以引用的方式并入本文。或者，结合区可以包含结合靶分子的非抗体蛋白质(任选地人蛋白质)的全部或一部分。举例来说，该结合区可以包含受体的细胞外部分，如例如人p75肿瘤坏死因子受体(SEQ ID NO：13)或人T淋巴细胞相关蛋白-4(CTLA4)蛋白质(SEQ ID NO：14)的细胞外区域。
该结合区可以包含一种或多种结合于靶分子的肽(如例如，如美国专利7,820,790中所定义的结合于靶蛋白质的“单体结构域”，其可以如美国专利7,820,790中所论述进行选择)，或其它肽。美国专利7,820,790中描述单体结构域和这些单体结构域如何选择的部分以引用的方式并入本文。此类肽的一个实例是Fc融合蛋白罗米司亭(Amgen Inc.，Thousand Oaks，California)的结合部分。处方信息，Amgen Inc.，2008-2011。可以作为Fc融合蛋白结合区的一部分的其它多肽包括了含支架结构域的多肽，这些支架结构域已经随机分入某些位置中并针对结合于某一靶分子进行选择。这些支架结构域包括例如CTLA-4(Nuttall等(1999)，Proteins36：217-227)、葡萄球菌蛋白1的Z结构域(Nord等(1995)，Protein Eng.8：601-608)、绿色荧光蛋白及人纤连蛋白III型第十结构域(FN3；Koide等(1998)，J.Mol.Biol.284：1141-1151；Karatan等(2004)，Chem.&Biol.11：835-844)。这些参考文献中描述支架结构域及其在产生结合结构域方面的用途的部分以引用的方式并入本文。
结合区所结合的靶分子可以是这样的分子，其中调节该分子的生物活性可以影响疾病或病症的过程；或者可以是定位于患病区域中的分子，例如在癌细胞表面上表达的蛋白质。在自体免疫病症或发炎性病症中，靶分子可以是作用于在介导该病症方面起作用的路径的分子。靶分子可以是这样的分子，该分子被定位成使得结合于该靶分子将适当地放置Fc多肽，从而使其可以影响疾病的过程。举例来说，如果Fc多肽包括毒素，那么借助于结合于在癌细胞上高水平表达的蛋白质的结合区将其放置在癌细胞附近可能是有益的。靶分子包括例如一般类别的蛋白质，如可溶性配体、受体结合的配体、可溶性受体、膜结合的受体、膜通道蛋白、可溶性膜结合蛋白质，及非蛋白质抗原，包括细胞外和细胞内靶分子。示例性靶分子包括但不限于，以下人蛋白质：肿瘤坏死因子、肿瘤坏死因子受体、白细胞介素-1、白细胞介素-6(IL-6)、IL-6受体、CD80/86、CD20、CD33、CD52、白细胞介素-12、白细胞介素-23、白细胞介素-17、HER2、HER2neu受体、表皮生长因子受体(EGFR)、血管内皮生长因子(VEGF)、B细胞活化因子(BAFF)、RANK配体、OR51E2、紧密连接蛋白、CDH3、CD22、补体因子及硬化蛋白(sclerostin)等。
部分取决于产生变体Fc多肽的宿主细胞和/或所用纯化方法，该变体Fc多肽可以另外包含其它氨基酸序列，如有助于在真核细胞中分泌的信号序列(在该蛋白质的成熟形式中去除)、有助于在细菌中翻译的N末端甲硫氨酸和/或有助于蛋白质纯化或鉴别的标签序列(例如，聚组氨酸标签或标签)。
编码变体Fc片段文库的核酸
本文中还描述了编码具有插入序列的Fc片段的核酸文库，这些插入序列至少部分随机分配并且出现在Fc片段的环内或邻近处。图2图示了如以下实施例中所描述来制备的八个文库各自的格式。这些文库的序列以及由其编码的氨基酸序列公开于SEQ ID NO：25-40。这些文库可用于进行淘选，以便选出编码在pH5.0到6.0下以相比于对照Fc片段有所增强的亲和力结合于FcRn的变体人IgG Fc片段的个别核酸。这些变体人IgG Fc多肽还可以在pH7.2到7.6下如对照Fc片段不良(如果有的话)地结合于FcRn。
在一些实施方案中，这些编码在编码环区的区域(如表1中所陈述)中具有插入序列的Fc片段的核酸文库可以是人或动物来源的，包括编码小鼠、大鼠、兔或猴Fc片段或来自骆驼类物种的Fc片段的核酸。在一些实施方案中，编码的Fc片段可以是IgG Fc片段，如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4Fc片段，或IgA、IgE、IgD或IgM同种型的Fc片段。在这些核酸编码环的部分中的插入序列可以在编码环1、环2、环3、环4、环5、环6、环7、环8、环9、环10、环11、环12或环13的核苷酸序列内或邻近处，如表1中所示。
相较于文库中不同变体的数量，文库的大小是一个很重要的考虑。在最理想情况下，对文库进行的淘选程序将很有可能包括该文库中所包括的所有不同变体。文库中不同变体的数量取决于该文库中随机化位置的数量以及在每一随机化位置处可以使用的不同氨基酸的数量。举例来说，具有可以含有19种不同氨基酸中的任一种的六个随机化位置的文库在理论上可以具有196≈4.7×107种不同变体。如果例如，对109个表达这些变体的独立噬菌体或细菌进行淘选，那么在该筛选中将回收到具有所选特性的所有分离株的可能性极高。参见例如，Grossman和Turner，Mathematies for the Biological Sciences，第2章，第2.9部分，第97-104页，Macmillan Publishing Co.，Inc.，NewYork and Collier Macmillan Publishers，London，1974，该部分以引用的方式并入本文。涵盖大小使得有可能筛选出足够的分离株以检测具有所希望特性的稀有分离株的文库。因此，涵盖编码105到1013、106到1012或107到1010种不同变体的文库。
在Fc片段编码部分的编码环5、8及10的核苷酸序列内或邻近处具有随机化插入序列的文库可能是有益的。此类文库可以编码在环5、8或10内或邻近处含有20-40、4-20、1-18、6-16、10-16、12-14、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16个随机化氨基酸的插入序列的Fc片段。这些随机化氨基酸可以通过半胱氨酸残基侧接。在一些实施方案中，还可以在随机化氨基酸之前或之后插入其它非随机化氨基酸。在一些实施方案中，所编码的随机化氨基酸之前可以是Gly-Gly-Cys并且之后是Cys-Gly-Gly。
编码变体Fc多肽、Fc片段和插入序列的核酸
本文还描述了编码作为变体Fc多肽的一部分的特定变体Fc片段的核酸，以及编码在变体Fc片段的环内或邻近处的插入序列的核酸。编码Fc片段的核苷酸序列是本领域中已知的(参见例如，Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest，Public Health ServiceN.I.H.，Bethesda，MD，1991)，并且本文中报道了编码人IgG1、IgG2、IgG3及IgG4Fc片段的序列(分别为SEQ ID NO：2、4、6及8)。描绘了在Fc片段内环的位置(表1)并且本文中描述了这些区域中的各种类型的插入序列。还报道了编码使得在5到6范围内的pH值下与FcRn的结合增加的氨基酸插入序列的序列(参见例如，SEQ ID NO：41-53)。
更一般来说，本文描述了编码在环内或邻近处具有插入序列的变体Fc片段的核酸，其中该Fc片段可以在pH5-6下以比对照Fc片段高的亲和力结合于人FcRn。发生此类插入的位置包括Fc多肽内的环1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13。
可以使用编码变体Fc多肽的核酸，通过将这些核酸引入宿主细胞(包括原核宿主细胞或真核宿主细胞)中，并在使得由这些核酸编码的蛋白质得以表达的条件下培养这些细胞来产生变体Fc多肽。该变体Fc多肽可以从细胞团或培养物上清液回收。这些多肽可以通过本领域中众所周知的方法，如蛋白质A或蛋白质G亲和色谱法、尺寸排阻色谱法、离子交换色谱法及疏水相互作用色谱法等可用方法来纯化。
分离和制备变体Fc片段和Fc多肽的方法
变体Fc片段可以使用以下实施例中详细描述的筛选程序进行分离。从广义上看，制备一个核酸文库，该核酸文库编码在环内或邻近处具有包括随机化氨基酸在内的插入序列的Fc片段。然后，将这一文库引入病毒或细胞中，在使得来自该文库的核酸能够表达的条件下进行培养，由此该病毒(可以是例如杆状病毒或丝状噬菌体)或细胞(可以例如为细菌、酵母或哺乳动物细胞)可以展示含有这些插入序列的Fc片段。在替代性实施方案中，该文库可以在体外在核糖体展示系统中进行翻译，由此可以从这一混合物中选出具有所希望的特性的Fc片段及其编码核酸。或者，可以使用CIS展示系统。参见例如，Odegrip等(2004)，Proc.Natl.Acad.Sci.101(9)：2806-2810，其相关部分以引用的方式并入本文。在本发明的方法中，可以如以下实施例中所描述，通过用FcRn进行淘选来富集能够在5到6的pH值范围内以比对照Fc片段高的亲和力结合于人FcRn的变体Fc片段，并且使用例如酶联免疫吸附剂检验(ELISA)对其进行筛选，ELISA可以最初对数组分离株或对单一分离株进行。如果最初是对数组分离株进行ELISA，那么可以对这些分离株进行扩增并单独进行再筛选以获得表达相比于对照Fc片段在pH5-6下与人FcRn的亲和力增强并且在生理pH值下对于人FcRn的亲和力较低或大致相同的变体Fc片段的个别分离株。
在其它步骤中，可以从噬菌体或细胞(如细菌、酵母或哺乳动物细胞)分离，或在核糖体展示的情形中由RNA扩增编码变体Fc片段的核酸。可以对这些核酸进行测序以确定插入序列的确切位置和性质。使用这一信息，可以使用本领域中众所周知的方法构建出编码所希望的变体Fc多肽或变体Fc片段的核酸。必要时，可以对编码该变体Fc片段或Fc多肽的核酸进行进一步修饰。
此类核酸可以被插入到适用于表达Fc多肽或Fc片段的宿主细胞的载体中。这些核酸可以通过本领域中众所周知的任何方法引入宿主细胞中。可以使用的宿主细胞包括细菌(包括大肠杆菌)、酵母(包括酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或毕赤酵母(Pichia pastoris))、昆虫细胞、植物细胞及哺乳动物细胞(包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、293细胞及幼仓鼠肾(BHK)细胞)等。这些宿主细胞可以在使得所引入的核酸得以表达的条件下培养，并且可以从培养物上清液或细胞团中回收Fc多肽或Fc片段。
一般来说，用于将核酸引入宿主细胞中的程序可以取决于有待引入核酸的宿主细胞。将核酸引入细菌中的方法是本领域中众所周知的。举例来说，通常使用电穿孔或氯化钙转化法。用于将核酸引入酵母中的方法是本领域中众所周知的并且包括例如使用乙酸锂和聚乙二醇进行的转化法。用于将异源多肽引入哺乳动物细胞中的方法是本领域中众所周知的并且包括但不限于，葡聚糖介导的转染、磷酸钙沉淀、聚凝胺介导的转染、原生质体融合、电穿孔、多核苷酸封装于脂质体中及DNA直接显微注射到核中。
任一宿主细胞中所使用的表达载体将含有供维持质粒和供外源核苷酸序列克隆和表达的序列。这些序列典型地包括以下一个或多个核苷酸序列：启动子、一个或多个增强子序列、复制起点、转录终止序列、含有供体和受体剪接位点的完整内含子序列、编码用于多肽分泌的前导序列的序列、核糖体结合位点、聚腺苷酸化序列、用于插入有待表达的编码多肽的核酸的多连接子区及可选择标记物元件。
变体Fc多肽的治疗应用
本文描述的变体Fc多肽可以用作人多种病症的治疗剂。哪种变体Fc多肽适用于何种病症可以通过Fc多肽的结合区以及可能地其结构的其它方面(如例如连接的有毒部分)来确定。变体Fc多肽可以具有相比对照Fc多肽有所增加的体内半衰期并且因此可能需要比对照Fc多肽少和/或不太频繁的给药。因此，变体Fc多肽可能特别适合于治疗慢性病症，在这些病症中特别希望不太频繁的给药。然而，变体Fc多肽可以用作可以使用对照Fc多肽(具有与变体Fc多肽相同的氨基酸序列但在环中不具有插入序列)治疗的大多数或所有病症的治疗。本文描述的变体Fc多肽还可以与用于治疗所治疗的病症的其它药物同时使用。
举例来说，可以使用作为在环中含有插入序列的变体Fc多肽的Fc融合蛋白作为对于与使用对照Fc多肽相同的病症的治疗。然而，变体Fc多肽的给药量和/或频率可能因其半衰期增加而不同。举例来说，变体Fc多肽可以由治疗性Fc融合蛋白，如依那西普(适用于中度到重度类风湿性关节炎、多关节型幼年特发性关节炎、牛皮癣性关节炎、强直性脊椎炎及中度到重度斑块性牛皮癣)、阿巴西普(适用于中度到重度类风湿性关节炎、中度到重度多关节型幼年特发性关节炎)或罗米司亭(适用于慢性免疫性血小板减少性紫癜)开始，通过在这些分子各自的Fc片段部分的环中插入本文所公开的一种增强FcRn结合的插入序列(例如SEQ ID NO：41-53)来制备。可以例如在Fc融合蛋白的Fc片段部分的环5、8或10内或邻近处进行插入。可以使用依那西普、阿巴西普或罗米司亭的这些变体形式来治疗与未变化的依那西普、阿巴西普或罗米司亭所能治疗相同的疾病。
类似地，如果变体Fc多肽是治疗性抗体，如例如阿达木单抗、优特克单抗、戈利木单抗、那他珠单抗、英利昔单抗或地诺单抗，那么可以使用该抗体的包含变体Fc片段的此类变体形式来治疗与呈未变化形式的这些抗体所治疗相同的疾病。因此，如本文所描述的变体Fc片段可以改变治疗的剂量或频率，而不是使用该Fc多肽治疗的病症。
一般来说，Fc多肽被用于治疗多种疾病，包括肿瘤适应症、自体免疫性病症和发炎性病症、骨相关病症、病症、代谢病症，及神经病症，如例如慢性疼痛等。
药物组合物
本发明包括了包含本文所描述的变体Fc片段或变体Fc多肽的药物组合物。这些组合物可以包含治疗有效量的变体Fc多肽或变体Fc片段及一种或多种其它组分，如生理学上可接受的载剂、赋形剂或稀释剂。这些其它组分可以包括缓冲液、碳水化合物、多元醇、氨基酸、螯合剂、稳定剂和/或防腐剂等等。
施用方法
变体Fc多肽或变体Fc片段，或含有这些分子的药物组合物，可以通过任何可行的方法施用。包含蛋白质的治疗剂通常将通过注射施用，因为在不存在一些特殊配方或环境的情况下，口服施用会导致蛋白质在胃部的酸性环境中水解。皮下、肌肉内、静脉内、动脉内、病灶内或腹膜注射是可能的施用途径。局部施用也是可能的，尤其是对于涉及皮肤的疾病来说。或者，变体Fc多肽或变体Fc片段可以通过与粘膜接触，例如通过鼻内、舌下、阴道或直肠施用或以吸入剂形式施用。或者，某些包含变体Fc多肽或变体Fc片段的药物组合物可以口服施用。
以上已经大体上描述了本发明，以下实施例是出于说明而非限制目的提供。
实施例
实施例1：人FcRn：人IgG1Fc的三级结构模型的建立
为了帮助设计以下所描述的文库，基于Protein Data Bank(PDB登记号1FRT)中可获得的大鼠FcRn与大鼠IgG Fc片段的复合物的结构来建立人FcRn与人IgG1Fc片段的复合物的三级结构的同源模型。在Protein Data Bank(PDB)中分别对人IgG1Fc片段(SEQ ID NO：1)以及人FcRnα和β-2-微球蛋白(β2m)链SEQ ID NO：9和10的氨基酸序列进行搜索。基于氨基酸序列同源性和三级结构获得若干模板。选出FcRnα链结构(1EXU(A链)、1FRT(A链)及1|1A(A链))、FcRnβ2m链结构(1CE6(B链)、1HSA(B链)、1YPZ(B链)、1HHG(B链)及111A(B链))及Fc结构1HZH(H链)、1|1A(C链)、1OQO(A链)、1T83(A链)及2J6E(A链))。将FcRnα链结构1EXU(A链)、1FRT(A链)及1|1A(A链)重叠并且所得均方根差(root mean square deviation，RMSD)的值，即，重叠的蛋白质结构中类似原子之间的平均距离为到并且平均值为FcRnβ2m结构域结构1CE6(B链)、1HSA(B链)、1YPZ(B链)、1HHG(B链)及1|1A(B链)之间的RMSD值在到的范围内，并且平均值为Fc结构1HZH(H链)、1|1A(C链)、1OQO(A链)、1T83(A链)及2J6E(A链)之间的RMSD值在到的范围内，并且平均值为这些RMSD值指示，来自不同来源的模板FcRn和Fc结构共有极为相似的三级结构。
基于这些模板结构及人FcRn(hFcRn)和人IgG1Fc片段(hIgG1Fc)的氨基酸序列，使用计算软件Molecular Operating Environment(MOE；Chemical Computing Group，Montreal，Quebec，Canada)的基于linux的分子建模模块来建立hFcRn：hIgG1Fc复合物的同源模型。图1示出了这一模型化复合物中hIgG1Fc(下部)与hFcRn(上部)最紧密接触的部分，以及这些蛋白质的一些相邻区域。
实施例2：插入序列文库的构建
构建八个编码变体人IgG1Fc区的文库，每个文库具有不同种类的插入序列。图2示出了人IgG1Fe区的序列以及六个插入序列文库的位置和格式。插入了以下描述的插入序列文库的环的位置在图1和图2中是以L1、L2A、L2B、L3、L4、L5、L6A及L6B指示。Fc中的一些插入位点是hIgG1Fc与hFcRn之间最紧密接触的点(如L1、L2A、L2B及L3)，并且其它位点(L4、L5、L6A及L6B)是在距hFc与hFcRn之间的最紧密接触点一段距离处。
如图2中所示，在一些文库(如L1、L2A、L2B及L3)中，环内的氨基酸缺失并且被随机化氨基酸替代，在大多数情形中被数量略大于缺失氨基酸的随机化氨基酸替代。这些随机化氨基酸包括除半胱氨酸外的所有氨基酸。在文库L2B中，六个随机化氨基酸之前是序列Gly-Gly-Cys并且之后是序列Cys-Gly-Gly。由于预期两个半胱氨酸因其接近性而将形成二硫桥，故预期这些半胱氨酸之间的六个随机化氨基酸将形成空间上受约束的环。举例来说，在L2B中，六个随机化氨基酸之前是序列Gly-Gly-Cys并且之后是序列Cys-Gly-Gly，由此建立了含有这些随机化氨基酸的空间上受约束的环。在其它文库(即，L4和L5)中，在不缺失正常存在的任何氨基酸的情况下，插入随机化氨基酸。
使用两轮PCR来构建编码一组人IgG1变体Fc片段的L1、L2A、L2B、L3、L4及L5文库。在第一轮反应中用于第一组和第二组PCR反应的模板是已插入了编码人IgG1Fc片段的DNA(SEQ ID NO：2)的噬菌粒载体，由此允许其在适当细菌菌株中作为噬菌体外壳蛋白的一部分表达(pIgG1-Fc)。用于产生这些文库的第一轮反应中的第一组PCR反应利用了正向引物和反向引物，以便产生在上游端处含有ApaLI限制性酶位点的PCR片段。以下正向引物匹配在编码Fc片段的区域上游的载体序列，并且被用于第一轮反应中的所有第一组PCR反应：5′-GTTCCT TTC TAT TCTCAC-3′(SEQ ID NO：521)。在Fc编码序列内的反向引物如下：5′-GAG GGT GTC CTT GGG TTT TGGGGG-3′(SEQ ID NO：522；文库L1)；5′-GGT GAG GAC GCT GACCAC ACG GTA-3′(SEQ ID NO：523；文库L2A和L2B)；5′-ATG CATCAC GGA GCA TGA GAA GAC-3′(SEQ ID NO：524；文库L3)；5′-ATTATG CAC CTC CAC GCC GTC CAC-3′(SEQ ID NO：525；文库4)；及5′-ATT GCT CTC CCA CTC CAC GGC GAT-3′(SEQ ID NO：526；文库L5)。
在第一轮反应中的第二组PCR反应也使用了pIgG1-Fc作为模板并且使用了匹配Fc编码序列下游的载体序列的补体的寡核苷酸作为反向引物。这一反向引物具有以下序列：5′-CCC ATT CAG ATC CTCTTC-3′(SEQ ID NO：527)。用于这些反应的正向引物如下：文库L1，5′-AAA CCC AAG GAC ACC CTC(TRIM)6ACC CCT GAG GTC ACATGC-3′(SEQ ID NO：528)；文库L2A，5′-GTG GTC AGC GTC CTCACC(TRIM)6CAC CAG GAC TGG CTG AAT-3′(SEQ ID NO：529)；文库L2B，5′-GTG GTC AGC GTC CTC ACC GGT GGT TGT(TRIM)6TGT GGT GGT CAC CAG GAC TGG CTG AAT-3′(SEQ ID NO：530)；文库L3：5′-TCA TGC TCC GTG ATG CAT(TRIM)5CAC(TRIM)1CAC TAC ACG CAG AAG AGC-3′(SEQ ID NO：531)；文库L4：5′-GGC GTG GAG GTG CAT AAT GGT GGT TGT(TRIM)6TGT GGTGGT GCC AAG ACA AAG CCG CGG-3′(SEQ ID NO：532)；及文库L5：5′-GTG GAG TGG GAG AGC AAT GGT GGT TGT(TRIM)6TGTGGT GGT GGG CAG CCG GAG AAC AAC-3′(SEQ ID NO：533)。在这些寡核苷酸中，“TRIM”表示编码除半胱氨酸外的所有氨基酸的三核苷酸的混合物(Trimer Phosphoramidite Mix2，Glen Research目录号13-1992-95)。该混合物是以下三核苷酸的等摩尔量混合物：AAA、AAC、ACT、ATC、ATG、CAG、CAT、CCG、CGT、CTG、GAA、GAC、GCT、GGT、GTT、TAC、TCT、TGG、TTC。因此，编码除半胱氨酸外的所有氨基酸的密码子大致上同等地以TRIM混合物表示。因此，“(TRIM)6”意指在该寡核苷酸中包括了编码除半胱氨酸外的任何氨基酸的六个随机三核苷酸。
在第二轮PCR反应(对于每个文库一个反应)中，将来自以上所描述的第一轮的第一组和第二组PCR反应的产物用作模板。所用引物对于所有文库都是相同的并且如下所示：5′-GTT CCT TTC TAT TCTCAC-3′(正向；SEQ ID NO：534)和5′-CCC ATT CAG ATC CTC TTC-3′(反向；SEQ ID NO：535)。
文库L6A和L6B是在一轮PCR中使用pIgG1-Fc作为模板构建的。在以下描述的PCR反应中，归因于引物的序列，将Fc片段的编码区中的XmaI限制性位点(5′-CCCGGG-3′)改为XhoI限制性位点(5′-CTCGAG-3″)。这些变化是不会编码与未修饰pIgG1-Fc不同的氨基酸的沉默突变，并且是因为XhoI加NotI限制性消化比XmaI加NotI消化更有效而进行。用于这些反应的正向引物如下：文库L6A：5′-CTGCCC CCA TCT CGA GAT GAG CTG GGT TGT(TRIM)8TGT GGTGGT ACC AAC CAG GTC AGC CTG ACC-3′(SEQ ID NO：536)；文库L6B：5′-CTG CCC CCA TCT CGA GAT GAG CTG GGT TGT(NNK)8TGT GGT GGT ACC AAC CAG GTC AGC CTG ACC-3′(SEQ ID NO：537)。反向引物序列为5′-GGC CCC GTGATG GTGATGATG-3′(SEQID NO：538)。在L6B中，使用了称为NNK的三核苷酸的混合物，该混合物含有以32个简并密码子编码全部二十种氨基酸的三核苷酸。在这种三核苷酸混合物中，“N”表示随机化位置，该位置为腺苷、鸟苷、胞苷或胸苷，并且“K”表示部分受约束的位置，该位置为鸟苷或胸苷。
对于所有PCR反应，都使用了PCR核心试剂盒(Roche，目录号11 578 553 001)，利用以下反应条件：95℃下5分钟，随后是30个循环的95℃下45秒-55℃下45秒-72℃下90秒，以及最后72℃下10分钟。使用QIAquick PCR纯化试剂盒(QIAGEN，28104)对来自PCR反应的DNA进行纯化。用ApaLI和NotI(对于文库L1-L5)以及XhoI和NotI(对于文库L6A和L6B)消化约200μg的噬菌粒载体DNA和10μg纯化的PCR产物(来自第三轮PCR反应)。用QIAquick凝胶纯化试剂盒(QIAGEN，28704)对消化的DNA进行凝胶纯化。
使用T4DNA连接酶(New England Biolabs)以1：2的摩尔比连接消化的载体DNA与文库PCR产物。将混合物在16℃下孵育过夜。通过乙醇沉淀来纯化DNA。在2.5kV电场中，使用200Ω电阻和25μF电容将总计25μg DNA通过电穿孔放入1000μl的XL1-blue电转化感受态大肠杆菌细胞(Stratagene)中以获得约1×109个大肠杆菌转化株。文库的确切大小在7×108(对于L5)到1.8×109(对于L4)范围内。在1000mL含有100μg/mL氨比西林(ampicillin)和2％葡萄糖的2x YT培养基(该培养基含有16g/L细菌用胰蛋白胨、10g/L细菌用酵母提取物及5g/L NaCl，pH7.0-7.2)中接种细胞并使其生长直到OD600为约0.5。然后，添加约3×109个噬菌斑形成单元/毫升(PFU/mL)的M13辅助噬菌体，并且在37℃下孵育该培养物1小时。然后，对感染的细胞进行短暂离心并用含有100μg/ml氨比西林和40μg/mL卡那霉素(kanamycin)的1000mL 2x YT培养基使其再悬浮。使细胞在30℃下生长过夜。然后，用PEG6000使噬菌体沉淀。
除L6A和L6B外，在这些转化中使用的所有文库都含有六个随机化密码子，其中每个密码子编码十九种不同氨基酸中的任一种，因此预期其将编码约4.7×107(196)个不同的变体Fc片段。类似地，预期L6A将编码约1.76×1010(208)个不同的变体Fc片段，因为它含有八个随机化密码子，所述密码子编码20种不同氨基酸中的任一种。对于除文库L6A和L6B外的文库，根据每一文库中预期的不同变体数目，约109(在7×108到1.8×109范围内)的文库大小是变体数目的7-33倍。
实施例3：Fc环文库的筛选
如下所示，对表达在pH6.0下以相比野生型Fc片段有所增加的亲和力结合于FcRn(并且在pH7.4下具有较低结合亲和力)的变体Fc片段的噬菌体进行两轮淘选。在第一轮中，将噬菌体再悬浮于含有0.4ml的20mM MES(pH6.0)、5％脱脂乳、0.05％Tween20的液体中。用10μg的hFcRn涂布MAXISORPTM酶标板(Nunc，Rochester，NY)的四个孔中的每一个，并用5％脱脂乳阻断，并且以5×1011PFU/mL添加100μL噬菌体。在37℃下孵育1小时之后，用20mM MES(pH6.0)、0.2％Tween20洗涤孔3-10次。通过向每一孔中添加100μL磷酸盐缓冲生理盐水(PBS，pH7.4)并在37℃下孵育该板1小时来洗脱噬菌体。使用这些噬菌体再感染呈指数生长的大肠杆菌XL1-blue培养物，对其进行培养直到其OD600达到约0.5。然后，添加约3×109PFU/mL的M13辅助噬菌体，并且在37℃下孵育该培养物1小时。然后，对感染的细胞进行短暂离心并用含有100μg/ml氨比西林和40μg/ml卡那霉素的1000ml2x YT培养基再悬浮。使细胞在30℃下生长过夜。然后，用PEG6000使噬菌体沉淀。
使用这些噬菌体，使用与第一轮中所用基本上相同的方法来进行第二轮淘选。通过略微降低涂布在微量滴定板上的FcRn的浓度并增加洗涤次数来略微增加淘选的严格度。洗脱的噬菌体在洗涤若干次之后，被用于再感染OD600为约0.5的呈指数生长的大肠杆菌XL1-blue培养物，然后将其在37℃下培养一小时，并且铺放在含有约100μg/ml氨比西林和卡那霉素的板上以获得集落。
将单个集落接种于含有每孔120μL2x YT培养基的96孔组织培养板中，该培养基含有100μg/mL氨比西林和2％的葡萄糖。在振荡器上，使这些细胞在37℃下生长，直到OD600达到约0.5。然后，向每一孔中添加3×109个/mL M13辅助噬菌体并孵育1小时。然后，对细胞进行短暂离心并用每孔180μL含有100μg/mL氨比西林和40μg/mL卡那霉素的2x YT培养基再悬浮。然后，在振荡器上在30℃下将培养物孵育过夜。
将约100μL2μg/mL的生物素化人FcRn添加到涂有10μg/mL抗生蛋白链菌素的MAXISORPTM板的各孔中。在用PBS加0.05％Tween20(PBST)洗涤五次之后，向板中添加在pH6.0或pH7.4的MES缓冲液中过夜培养的噬菌体，并且在室温下孵育1小时。使用辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)缀合的抗M13抗体来检测结合噬菌体，并且通过微量滴定板读取器，使用在可见光范围内的波长对这些板进行评分。基于在pH5.5下较高的信号(由对照Fc片段所产生的信号的约150％)和在pH7.4下与对照Fc片段相当或较低的信号来选择阳性集落。在测试每一文库的具有分离的集落的单个96孔微量滴定板的第二轮筛选中，针对文库L2B、L3或L4未检测到阳性集落。针对文库L2A拣选的集落中有约20％为阳性的，而针对文库L6A和L6B拣选的集落中有约10％呈阳性。文库L5因为拣选出的集落中有约90％呈阳性而与所有其它文库明显相区别。因此，文库L5显然是产生最多阳性集落的文库。这些数据指示，插入文库5的位点对于分离在pH5-6下与FcRn的结合增加，同时在生理pH值下维持Fc片段对FcRn的较低亲和力的变体特别有利。
我们从文库L2A、L5、L6A及L6B中选出阳性集落，对其进行测序并如下文所描述进一步表征。结合是通过定量酶连免疫吸附剂检验(ELISA)来评估。ELISA评分反映了结合亲和力，其中较高的评分意味着较高的亲和力。典型地，高于约3-5分的评分指示超过背景的结合。这些阳性集落的插入序列的序列以及其在ELISA中的评分显示于下表2中。对于文库L5，根据图2中的编号，插入序列是在N169与G170之间。对于文库6A和6B，根据图2中的编号，插入序列是在L143与T144之间。
表2：所选阳性集落的序列和ELISA评分
*由于这些对照样品测量了多次，故将这些结果报道为一个范围。“WT”、“phg”和“培养基”分别意指表达对照Fc片段的噬菌体、不表达Fc片段的噬菌体及无噬菌体。
实施例4：有关结合缔合速率和解离速率的研究
为了对通过噬菌体ELISA鉴别的一些变体Fc片段进行进一步表征，针对经过鉴别的变体Fc片段的亚组表征在pH6和pH7.4下变体Fc片段与FcRn的结合。将编码所选变体Fc片段分离株的DNA(都来自文库L5)引入哺乳动物表达载体中，基本上如Thomas等(Proc.Natl.Acad.Sci.102(16)：5679-5684，2005；其相关内容以引用的方式并入本文)所描述，使用脱酰基化PEI，使用该表达载体转染293 6E细胞。选出对于结合于FcRn具有高ELISA评分的分离株。在Octet(ForteBio Inc.，Menlo Park，California)上用蛋白质A生物传感器(ForteBio，Inc.，目录号18-5010)，使用1∶2和1∶10稀释的条件培养基(conditioned media，CM)样品测量CM中变体Fc片段的浓度。使用以纯化的Fc融合蛋白建立的标准曲线来计算浓度。
在室温下，离线将100nM的生物素化hFcRn捕获到抗生蛋白链菌素(streptavidin，SA)生物传感器(FortéBio Inc.，18-5019)上，保持2小时。在Octet系统中，使用涂布这些生物素化hFcRn的SA生物传感器，可以经由光衍射实时检测未标记蛋白质的缔合和解离。在pH6或pH7.4下将变体Fc片段CM样品和对照Fc片段CM样品稀释到10μg/mL。三种缔合和解离条件设置如下：(1)在pH6下缔合和在pH6下解离；(2)在pH6下缔合和在pH7.4下解离；及(3)在pH7.4下缔合和在pH7.4下解离。将涂有生物素化hFcRN的SA生物传感器滴加到特定pH值的缓冲液中，保持1分钟，然后浸入特定pH值的含变体Fc片段或对照的样品中，保持5分钟以允许结合于FcRn。然后，将Fc生物传感器浸入特定pH值的缓冲液中，再保持5分钟，以使结合的Fc片段与FcRn解离。如使用Octet系统所实施的那样，通过使用生物膜层干涉技术有可能检测到Fc片段的结合和解离，从而实时检测结合和解离。
将不同pH值下变体Fc片段的缔合和解离速率与对照相比较。如与对照Fc片段相比较，在pH6结合较强、在pH6下解离速率较慢，在pH7.4下结合极弱并且在pH7.4下解离速率较快，是用于选择变体Fc片段进行进一步表征的标准。相对于对照Fc片段，所测试的61个变体Fc片段中有许多在pH6下显示出较多的结合和较慢的解离并且在pH6下结合之后在pH7.4下显示相当或更快的解离。图3示出了所测试的具有最有利的特性的24个变体Fc片段在pH6下结合(中央垂线的左侧)和在pH7.4下解离(中央垂线的右侧)的曲线。在曲线的右侧，列出了所测试的每一变体Fc片段的名称以及在实验的缔合阶段期间所观察到的最大结合反应(以纳米(nm)为单位)。最大反应的绝对数值可以随实验而略有变化，并且它与结合常数(如kon、kdis或KD(kdis/kon))不成正比。在图3中，利用野生型Fc片段观察到最小结合反应，并且所显示的所有变体在pH6下都具有较高的反应。大多数变体Fc片段在pH7.4下迅速解离，与野生型Fc片段相同。然而，变体5-1在pH7.4下解离明显比任何其它变体慢得多，而所测试的所有其它变体在pH7.4下迅速解离，与野生型Fc片段相同。Fc变体5-85明显是在pH6下具有最大反应的变体，同时在pH7.4下迅速解离。多种其它变体，如5-106、5-104、5-112、5-79、5-51及5-69等，也在pH6下具有较高反应并且在pH7.4下迅速解离。因此，从文库L5中分离出许多具有改善的特性的变体Fc片段。
实施例5：变体Fc片段的制备
将编码所选分离株的DNA(都来自文库L5)引入哺乳动物表达载体中，基本上如Thomas等(Proc.Natl.Acad.Sci.102(16)：5679-5684，2005；其相关内容以引用的方式并入本文)所描述，使用脱酰基化PEI，使用该表达载体转染293细胞。选择哺乳动物细胞是因为在这一系统中表达和翻译后处理比较容易。所用蛋白质表达和产生方法描述于Durocher等(Nucl.Acids Res.30(2)：e9，2002)中，其相关部分以引用的方式并入本文。使用蛋白质A亲和色谱法和尺寸排阻色谱法从培养基中纯化出所分泌的变体Fc片段。使用高效液相色谱法(Highperformance liquid chromatography，HPLC)来检查Fc片段的纯度。有关纯化方法的一般指导，参见Methods in Molecular Biology：ProteinPurification Protocols第244卷，Cultler编辑，Humana，New Jersey，2004。通过聚丙烯酰胺凝胶的考马斯蓝(Coomassie blue)染色来评估Fc变体的蛋白质滴度。所有分离株都以适当水平表达以供测试。
实施例6：变体Fc片段的热稳定性
差示扫描量热法(Differential Scanning Calorimetry，DSC)测量由热变性引起的解折叠的焓(ΔH)。溶液中的蛋白质分子(或其它大分子)在天然的折叠群体与变性的解折叠群体之间保持平衡。热跃迁中点温度(Tm)越高，当50％的蛋白质分子解折叠时，分子越稳定。DSC还被用于测定变性的热容量(ΔCp)的改变。DSC实验是用MicroCalVP-Capillary DSC(GE Helathcare，Piscataway,NJ)进行的，以便测量各种Fc片段的Tm。每一实验中纯化的对照Fc片段(Fc-WT)或变体Fc片段的浓度在10mM乙酸钠、9％蔗糖(pH5)中为0.5mg/mL。样品以60℃/小时的加热速率从20℃加热到95℃。当50％的个别结构域解折叠时，测定个别结构域的热跃迁中点温度(Tm)。变体Fc片段和对照野生型Fc片段的Tm值列于下表3中。
表3：变体Fc片段的Tm值
样品标识符 CH2结构域的Tm(℃) CH3结构域的Tm(℃)
Fc-WT 67.7 84.3
Fc-5-55 67.7 77.5
Fc-5-60 67.7 78.4
Fc-5-64 67.4 79.2
Fc-5-69 68.3 76.2
Fc-5-70 67.3 77.7
Fc-5-73 67.7 78.8
Fc-5-79 67.3 76.5
Fc-5-85 66.5 73.4
Fc-5-91 67.4 77.6
Fc-5-92 67.5 79.5
Fc-5-95 67.1 77
Fc-5-96 67.0 79.2
Fc-5-97 67.4 78.2
Fc-5-99 67.0 78.2
Fc-5-101 67.0 78.6
Fc-5-104 67.1 78.0
Fc-5-106 66.6 77.4
Fc-5-112 67.2 77.1
Fc-5-113 68.1 77.9
Fc-5-1 68.4 77.4
Fc-5-51 67.4 77.4
Fc-5-57 67.1 79.1
Fc-5-66 67.5 79
这些数据指示，CH2结构域的Tm基本上不受文库L5插入序列的影响，而在CH3结构域中受影响。尽管CH3结构域的Tm在变体Fc片段中相比对照Fc片段(Fc-WT)略有降低，但在变体Fc片段中CH3结构域的Tm值仍比CH2结构域的Tm值高出约10℃。因此，整个Fc结构域的热稳定性临界值较低，即，CH2结构域的Tm不受影响。
实施例7：变体Fc片段与人或食蟹猕猴FcRn的结合
使用T100分析系统(GE Healthcare Bio-Sciences ABPrivate Limited Liability Company，Uppsala，Sweden)测试在pH5.5和pH7.4下变体Fc片段与人FcRn和食蟹猕猴FcRn的结合。该测试由以下步骤组成：在结合条件下孵育各种浓度的变体Fc片段或对照Fc片段与固定量的人或食蟹猕猴FcRn，随后通过结合于固定有Fc片段的表面(在CM5(Biacore)芯片的流动池中)来测量这些混合物中游离的未结合的FcRn的量。固定在芯片上的Fc片段的量足以结合该混合物中基本上所有游离的未结合的FcRn。因此，通过使用T100分析系统，以表面等离子共振来定量地确定该混合物中未结合的FcRn的量。从这一信息，计算出EC50，即，使该混合物中50％的FcRn结合的变体或对照Fc片段的浓度。起初，测试在以上描述的实验中所鉴别的一组23个变体Fc片段(Fc-5-1被视为对照)与人FcRn的结合。基于这些数据，选出十四个变体Fc片段并进一步测试其与食蟹猕猴FcRn的结合。
该实验方案更详细地描述于下。如以上所描述，在293细胞中产生有待测试的Fc片段并进行纯化。使用胺偶合将野生型人对照Fc片段(Fc-WT)和变体Fc片段(Fc-5-1)以约6000个共振单元(resonanceunit，RU)的密度固定在CM5芯片(Biacore)的流动池上。使用Fc-5-1是因为它与Fc-WT不同，在pH7.4下也良好结合于FcRn。未结合固定的蛋白质的一个流动池被用作背景对照。可对连续样品使用单一流动池，通过用pH7.4的溶液在样品间进行洗涤以释放结合于固定在流动池上的Fc片段的FcRn。
为了获得所测试的不同分子和条件的适合信号，使用了不同的检验条件。对于在pH5.5下进行的检验，将10nM的人或食蟹猕猴FcRn与所测试的变体Fc片段和对照Fc片段的连续稀释液(在0.1～2,000nM范围内)混合，并且在室温下在10mM乙酸钠(pH5.5)、150mMNaCl、0.005％P20、0.1mg/mL BSA中孵育1小时。作为阳性对照，将10mM人和食蟹猕猴FcRn各自在相同溶液中并且在以上刚刚描述的相同温度下孵育相同的时间，但不添加Fc片段。在这些样品中，假定所有FcRn都未结合。通过在流动池的表面之上注射这些混合物，并经由表面等离子共振检测结合于表面的FcRn来测量这些混合物的每一种中的游离未结合的FcRn与固定的Fc-WT和Fc-5-1的结合。
对于在pH7.4下进行的检验，将10nM的人和食蟹猕猴FcRn与所测试的变体Fc片段和对照Fc片段的连续稀释液(在0.1～2,000nM范围内)混合，并且在室温下在含有0.005％聚山梨醇酯20、0.1mg/mLBSA的磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)中孵育1小时。作为阳性对照，将10mM人和食蟹猕猴FcRn各自在相同溶液中并且在以上刚刚描述的相同温度下孵育相同的时间，但不添加Fc片段。通过结合于固定的Fc-5-1Fc片段来测定这些混合物中游离的未结合的FcRn的量，该测定是通过将这些混合物注射到涂有Fc-5-1的流动池表面上并经由表面等离子共振来检测结合于这些表面的FcRn进行测量。在这些检验中使用Fc-5-1是因为它在pH7.4下以比Fc-WT高得多的亲和力结合于FcRn。
在这些混合物中FcRn结合反应随着Fc片段的浓度递增而降低表明，FcRn在溶液中结合于Fc片段，这阻止了FcRn结合于固定在流动池表面上的Fc片段。将FcRn结合信号对Fc片段浓度作图，在GraphPad Prism5TM软件中使用单位点竞争的非线性回归来计算EC50值。这些结果显示于表4中。
表4.Fc片段在pH5.5和7.4下与FcRn的结合的EC50值
*ND指示“未测定”。
表4中的数据指示，所测试的变体Fc片段中有许多在pH5.5下与人FcRn的结合基本上得到改善(即，具有基本上低于Fc-WT的EC50值)并且在pH7.4下保持低结合(即，具有高EC50值，与Fc-WT相同)。然而，其中五个片段(Fc-5-57、Fc-5-64、Fc-5-66、Fc-5-73及Fc-5-110)在pH5.5下的结合未显示较多改善。其中八个片段(Fc-5-55、Fc-5-60、Fc-5-79、Fc-5-91、Fc-5-92、Fc-5-96、Fc-5-101及Fc-5-112)在pH5.5下的结合仅显示约2-5倍的改善。这些数据进一步指示，变体Fc片段对于结合人FcRn和食蟹猕猴FcRn的EC50值是相当的。所测试的所有变体Fc片段(除被视为对照的Fc-5-1外)在pH7.4下都维持较低的与人FcRn和食蟹猕猴FcRn的结合。
实施例8：其它经过修饰的变体Fc片段的构建
制备变体Fc片段Fc-5-69和Fc-5-106的其它经过修饰的型式。变体Fc-5-69制备如下。将编码变体Fc片段Fc-5-69的DNA插入哺乳动物表达载体中作为模板，该表达载体也可以在大肠杆菌中繁殖。对于变体Fc-5-69-W1F，使用以下两种引物：正向引物，GAG AGCAAT GGT GGT TGT TTC CCG CTG CAG GAC TAC(SEQ IDNO：497)；和反向引物，GTA GTC CTG CAG CGG GAA ACA ACCACC ATT GCT CTC(SEQ ID NO：498)。对于Fc-5-69-W1Y，使用以下两种引物：正向引物，GAG AGC AAT GGT GGT TGT TAC CCG CTGCAG GAC TAC(SEQ ID NO：499)；和反向引物，GTA GTC CTG CAGCGG GTA ACA ACC ACC ATT GCT CTC(SEQ ID NO：500)。使用Quikchange定点诱变试剂盒(Stratagene，200518)方案。反应混合物为200nM dNTP、100nM引物、1ng DNA模板、1μLDNA聚合酶及水，总体积为50μL。反应在95℃下执行30秒，然后是16个循环的95℃下30秒，55℃下60秒，68℃下6分钟，随后是68℃下10分钟。然后，添加1μLDpnI，并且反应物在37℃孵育1小时。然后，在42℃下使用2μL混合物来转化30μl XL1-blue超级感受态细胞(Stratagene)，持续45秒。之后，添加0.5mL SOC，并且在37℃下，在振荡器上以300转/分钟(revolutions per minute，rpm)孵育细胞1小时。将转化的细胞平铺在LB-氨比西林琼脂板上并在37℃下孵育过夜。
拣选个别集落，并制备质粒DNA并且进行测序。DNA序列指示，变体Fc片段具有以下插入的氨基酸序列，这些序列与Fc-5-69中的插入序列仅有一个氨基酸不同：Fc-5-69-W1F，GGCFPLQDYCGG(SEQID NO：367)；及Fc-5-69-W1Y，GGCYPLQDYCGG(SEQ ID NO：368)。将编码这些变体Fc片段的DNA引入293细胞中，并且如以上所描述产生纯化的Fc片段以用于如以上所描述进行的结合检验中。
通过类似方法制备Fc-5-106的经过修饰的型式，但PCR反应的模板是插入到哺乳动物表达载体中的编码Fc-5-106的DNA。用于PCR反应的引物具有以下序列：Fc-5-106-M4A，正向引物，GGT GGTTGT GTT TTC AAC GCG TTC AAC TGT GGT GGT GGG(SEQ IDNO：501)，及反向引物，CCC ACC ACC ACA GTT GAA CGC GTTGAAAAC ACAACC ACC(SEQ ID NO：502)；Fc-5-106-M4G，正向引物，GGT GGT TGT GTT TTC AAC GGG TTC AAC TGT GGT GGTGGG(SEQ ID NO：503)，及反向引物，CCC ACC ACC ACA GTT GAACCC GTT GAA AAC ACA ACC ACC(SEQ ID NO：504)；Fc-5-106-M4H，正向引物，GGT GGT TGT GTT TTC AAC CAT TTCAAC TGT GGT GGT GGG(SEQ ID NO：505)，及反向引物，CCC ACCACC ACA GTT GAA ATG GTT GAA AAC ACA ACC ACC(SEQ IDNO：506)；Fc-5-106-M4I，正向引物，GGT GGT TGT GTT TTC AACATC TTC AAC TGT GGT GGT GGG(SEQ ID NO：507)，及反向引物，CCC ACC ACC ACA GTT GAA GAT GTT GAA AAC ACA ACC ACC(SEQ ID NO：508)；Fc-5-106-M4L，正向引物，GGT GGT TGT GTT TTCAAC TTG TTC AAC TGT GGT GGT GGG(SEQ ID NO：509)，及反向引物，CCC ACC ACC ACA GTT GAA CAA GTT GAAAAC ACAACCACC(SEQ ID NO：510)；Fc-5-106-M4N，正向引物，GGT GGT TGTGTT TTC AAC AAC TTC AAC TGT GGT GGT GGG(SEQ IDNO：511)，及反向引物，CCC ACC ACC ACA GTT GAA GTT GTT GAAAAC ACAACC ACC(SEQ ID NO：512)；Fc-5-106-M4Q，正向引物，GGT GGT TGT GTT TTC AAC CAG TTC AAC TGT GGT GGT GGG(SEQ ID NO：513)，及反向引物，CCC ACC ACC ACA GTT GAA CTGGTT GAAAAC ACAACC ACC(SEQ ID NO：514)；Fc-5-106-M4S，正向引物，GGT GGT TGT GTT TTC AAC TCG TTC AAC TGT GGTGGT GGG(SEQ ID NO：515)，及反向引物，CCC ACC ACC ACA GTTGAA CGA GTT GAA AAC ACA ACC ACC(SEQ ID NO：516)；Fc-5-106-M4T，正向引物，GGT GGT TGT GTT TTC AAC ACG TTCAAC TGT GGT GGT GGG(SEQ ID NO：517)，及反向引物，CCC ACCACC ACA GTT GAA CGT GTT GAA AAC ACA ACC ACC(SEQ IDNO：518)；Fc-5-106-M4V，正向引物，GGT GGT TGT GTT TTC AACGTG TTC AAC TGT GGT GGT GGG(SEQ ID NO：519)，及反向引物，CCC ACC ACC ACA GTT GAA CAC GTT GAA AAC ACA ACC ACC(SEQ ID NO：520)。
PCR反应是如以上所描述进行的并且被用于转化大肠杆菌。对来自个别集落的质粒DNA进行测序。选出编码具有以下插入序列的Fc片段的分离株：Fc-5-106-M4A，GGCVFNAFNCGG(SEQ ID NO：369)；Fc-5-106-M4G，GGCVFNGFNCGG(SEQ ID NO：370)；Fc-5-106-M4H，GGCVFNHFNCGG(SEQ ID NO：371)；Fc-5-106-M4I，GGCVFNIFNCGG(SEQ ID NO：372)；Fc-5-106-M4L，GGCVFNLFNCGG(SEQ ID NO：373)；Fc-5-106-M4N，GGCVFNNFNCGG(SEQ ID NO：374)；Fc-5-106-M4Q，GGCVFNQFNCGG(SEQ ID NO：375)；Fc-5-106-M4S，GGCVFNSFNCGG(SEQ ID NO：376)；Fc-5-106-M4T，GGCVFNTFNCGG(SEQ ID NO：377)；Fc-5-106-M4V，GGCVFNVFNCGG(SEQ ID NO：378)。
制备Fc-5-69和Fc-5-106的这些衍生物并使用实施例7中所描述的方法测试其在pH5.5和7.4下与人FcRn和食蟹猕猴FcRn的相对结合亲和力。
表5：变体5-69和Fc5-106与人FcRn和食蟹猕猴FcRn的结合
两种Fc-5-69衍生物在pH5.5下均显示比Fc-5-69本身弱的结合亲和力。两种Fc-5-106衍生物(Fc-5-106-M4I和Fc-5-106-M4L)在pH7.4下显示出比Fc-5-106高的与人FcRn和食蟹猕猴FcRn的结合亲和力。另外，包括这两种在内的四种Fc-5-106衍生物(Fc-5-106-M4I、Fc-5-106-M4L、Fc-5-106-M4T及Fc-5-106-M4V)在pH5.5下显示出相比Fc-5-106本身有所改善或大致相同的结合活性。对这四种衍生物与食蟹猕猴FcRn的结合亲和力进行测试。全部四种在pH5.5和7.4下对于结合于食蟹猕猴FcRn的EC50值都类似于对于人FcRn的结合。
实施例9：变体Fc片段的体内表征
为了确定含有以上所鉴别的变体Fc片段的抗体是否具有改善的体内药物动力学(pharmacokinetic，PK)特性，在食蟹猕猴中体内测试未修饰的抗体X(其为人IgG2抗人IL-23抗体)和含有变体Fc片段的抗体X的变体型式以确定药物动力学参数。选择抗体X作为适当抗体来测试变体Fc片段的药物动力学参数是因为已知其具有线性pK曲线并且因为已知IL-23在体内以低水平表达。因此，预期对于PK参数的靶相关影响将最小，使得更易于检测由变体Fc片段引起的pK影响。
制备五种变体IgG2抗体，称为(X-5-51、X-5-69、X-5-104、X-5-106及X-5-112)。这些IgG2抗体分别在与变体IgG1Fc片段Fc-5-51、Fc-5-69、Fc-5-104、Fc-5-106及Fc-5-112相同的位置(根据表1中的比对)具有相同的插入序列。更具体地说，这些插入序列在人IgG2Fc片段的氨基酸384与385之间(如表1中的EU编号)。含有编码抗体X重链的DNA的质粒被用作模板以进行使用以下引物的五种PCR反应：对于X-5-51，正向引物，5′-GAG TGG GAG AGC AAT GGT GGTTGT CAT CTG CCG TTC GCT GTT TGT GGT GGT GGG CAG CCGGAG AAC-3′(SEQ ID NO：539)，及反向引物，5′-GTT CTC CGG CTGCCC ACC ACC ACA AAC AGC GAA CGG CAG ATG ACA ACC ACCATT GCT CTC CCA CTC-3′(SEQ ID NO：540)；对于X-5-69，正向引物，5′-GAG TGG GAG AGC AAT GGT GGT TGT TGG CCG CTGCAG GAC TAC TGT GGT GGT GGG CAG CCG GAG AAC-3′(SEQID NO：541)，及反向引物，5′-GTT CTC CGG CTG CCC ACC ACC ACAGTA GTC CTG CAG CGG CCA ACA ACC ACC ATT GCT CTC CCACTC-3′(SEQ ID NO：542)；对于X-5-104，正向引物，5′-GAG TGG GAGAGC AAT GGT GGT TGT GGT CAT GAA TAC ATG TGG TGT GGTGGG CAG CCG GAG AAC-3′(SEQ ID NO：543)，及反向引物，5′-GTTCTC CGG CTG CCC ACC ACA CCA CAT GTA TTC ATG ACC ACAACC ACC ATT GCT CTC CCA CTC-3′(SEQ ID NO：544)；对于X-5-106，正向引物，5′-GAG TGG GAGAGC AAT GGT GGT TGT GTTTTC AAC ATG TTC AAC TGT GGT GGT GGG CAG CCG GAGAAC-3′(SEQ ID NO：545)，及反向引物，5′-GTT CTC CGG CTG CCCACC ACC ACA GTT GAA CAT GTT GAA AAC ACA ACC ACC ATTGCT CTC CCA CTC-3′(SEQ ID NO：546)；及对于X-5-112，正向引物，5′-GAG TGG GAG AGC AAT GGT GGT TGT GCT CTG TAC CCGACT AAC TGT GGT GGT GGG CAG CCG GAG AAC-3′(SEQ IDNO：547)，及反向引物，5′-GTT CTC CGG CTG CCC ACC ACC ACAGTT AGT CGG GTA CAG AGC ACA ACC ACC ATT GCT CTC CCACTC-3′(SEQ ID NO：548)。使用Quikchange定点诱变试剂盒(Stratagene，200518)方案。反应混合物为200nM dNTP、100nM引物、1ng DNA模板、1μLDNA聚合酶及水，总体积为50μL。反应在95℃下执行30秒，然后是16个循环的95℃下30秒，55℃下60秒，68℃下6分钟，随后是68℃下10分钟。然后，添加1μL DpnI，并且反应物在37℃孵育1小时。然后，在42℃下使用2μL混合物来转化30μlXL1-blue超级感受态细胞(Stratagene)，持续45秒。之后，添加0.5mLSOC，并且在37℃下，在振荡器上以300rpm孵育细胞1小时。将转化的细胞平铺在LB-氨比西林琼脂板上并在37℃下孵育过夜。拣选个别集落，并且制备质粒DNA并进行测序，以确保所选分离株具有预期的DNA序列。
以与以上关于Fc片段所描述基本上相同的方式制备抗体，但用编码IgG2重链(包括编码变体或对照Fc片段的部分)和抗体X的轻链的DNA转柒哺乳动物宿主细胞。在适于表达这些抗体的条件下孵育宿主细胞，并且从培养基中回收抗体，如以上所描述进行纯化并用于以下实验中。
食蟹猕猴(每组n＝2)静脉内接受单剂1mg/kg剂量的未修饰或变体型式的抗体X并且在8周的生活期的期间进行跟踪。在实验过程内的指定时间点收集血样。在给药前以及给药后0.25、1、4、8、12、24、48、72、168、240、336、408、504、576、672、744、840、1008、1176及1344小时收集样品。
使用抗人IgG夹心ELISA，通过与由相同分子得出的标准曲线相比较来确定所注射的抗体的全身浓度。具体地说，在PBS中稀释小鼠抗人Fc抗体，将其涂布到板上并在室温下孵育2小时。将孔内含物丢弃，并向各孔中添加PBS-Tween20(ThermoScientific)作为阻断缓冲液。在室温下孵育一小时之后，用PBS-Tween-20洗涤板中各孔，并且向孔中添加血清样品并在振荡下孵育1小时。再次洗涤各孔，并向板中添加辣根过氧化物酶标记的小鼠抗人Fc抗体。在一小时孵育之后，洗涤各孔并且使用3，3′，5，5′四甲基联苯胺(TMB)底物来显影10分钟。用添加到板中的磷酸或硫酸来淬灭所引起的比色反应。在450nm和650nm下测定光学密度(OD)，并且用在450nm下的OD值减去在650nm下的OD值。在7.0.0.04版Watson LIMS中，使用权重设定为1/Y2的逻辑斯谛模型(logisticmodel)，通过数据回归将OD值转化成研究样品的浓度。
使用在7.0.0.04版Watson LIMS内提供的PK分析包进行药物动力学分析。暴露(曲线下面积(AUC))和清除率(mL/kg/hr)值是由这一分析得出。使用每一食蟹猕猴的最后5个取样时间点的浓度随时间变化的数据来计算半衰期(T1/2)值。
如图4中所示，含有变体Fc片段的抗体X的变体型式X-5-51、X-5-69、X-5-104、X-5-106及X-5-112在食蟹猕猴中在指定取样时间点都呈现比未修饰的抗体X高的mAb浓度。如表6中所示，与未修饰的抗体X相比较，所测试的所有抗体X的变体型式都呈现增加的暴露值和降低的清除率值。此外，抗体X的五种变体型式中有四种具有增加的半衰期。不展现增加的半衰期的一种变体(X-5-106)可能表示可能在一只猴中产生了针对注射的抗体的抗药物抗体的情形，因为由所测试的两只猴中的一只得到的数据指示极短的半衰期(48小时)，而来自另一只猴的数据指示半衰期增加(538小时)。用以测量抗药物抗体的存在的其它实验可以阐明这一问题。
表6：半衰期、暴露和清除率的平均值
一般来说，这些数据指示，在食蟹猕猴中，变体Fc片段在pH5.5-6.0下与FcRn的结合增加(相对于对照Fc片段)以及在pH7.4下自FcRn迅速解离与含有变体Fc片段的抗体的体内半衰期较长有关。然而，这些数据未显示出在pH5.5或6下IgG1变体Fc片段的结合改善的程度与具有与该变体Fc片段相同的插入序列的全长IgG2抗体的药物动力学参数改善的程度之间的确切数量关系。不过，这些数据指示，X-5-51、X-5-69、X-5-104及X-5-112相对于未变化的抗体X具有增加的半衰期，并且表明对于X-5-106也是如此。此外，所测试的所有变体抗体相比于对照抗体都具有较低的清除率和较高的暴露。
实施例10：在替代性位点具有插入序列的变体Fc片段的构建
来自文库L5的许多变体具有所希望的特性的事实指示，这些插入序列的位置是有利的。以下实验的进行是为了确定在与L5插入位点相同的环内或邻近处的其它位点是否可能具有更好的特性。为了测试这一观点，将选定的一种肽插入这一环中的不同位置，并且测试所得变体Fc片段与FcRn的结合。选择变体Fc片段5-1的肽插入序列作为肽进行插入。这一肽具有以下氨基酸序列：GGCGMPIEFCGG(SEQ ID NO：67)。如图5(使用了表1中所示例的EU编号系统)中所示，将这一肽插入文库L5环内或邻近处除文库L5插入位点外的位点。如以上实施例4中所描述，使用涂有生物素化huFcRn的SA生物传感器(ForteBio Inc.18-5019)来检验所得Fc片段与FcRn的结合。
更详细地说，如下制备编码这些变体Fc片段的DNA构建体。使用定点诱变试剂盒(Stratagene，200518)方案。反应混合物是由200nM dNTP、100nM引物、1ng DNA模板、1μL DNA聚合酶及水构成，总体积为50μL。对于每一变体，用于这些反应中的引物显示于下表7中。DNA模板是插入到载体中的编码野生型人IgG1Fc多肽的cDNA。反应在95℃下执行30秒，然后是16个循环的95℃下30秒，55℃下60秒及68℃下6分钟，随后是最后一个循环的68℃下10分钟。然后，添加1μL DpnI，并且反应物在37℃孵育1小时。然后，在42℃下使用2μL混合物来转化30μLXL1-blue超级感受态大肠杆菌细胞(Stratagene)，持续45秒。之后，添加0.5mL具有分解代谢物阻遏的Super Optimal Broth(SOC；含有2％细菌用胰蛋白胨、0.5％酵母提取物、10mM NaCl、2.5mM KCl、10mM MgCl2及20mM葡萄糖)，并在37℃下，在振荡器上以300转/分钟(rpm)孵育细胞1小时。将转化的细胞平铺在LB-氨比西林琼脂板上并在37℃下孵育过夜。
表7：在构建编码变体Fc片段的DNA的PCR反应中使用的引物
拣选个别集落，并制备质粒DNA并且进行测序。将编码这些变体Fc片段的DNA引入293-6E细胞中，并且在如以上所描述的ForteBio结合检验中使用条件培养基(CM)中的来自这些细胞的Fc片段。参见实施例4。
有关在pH6下结合及在pH7下解离的结果示于图6中。两个变体Fc片段5-1-10和5-1-2在pH6下都具有比变体5-1强的最大反应，而且在pH7.4下较慢地解离。参见图6。如与变体5-1相比较，所有其它构建体在pH6下显示略有降低的最大反应，但所有这些反应都与野生型Fc片段(图6中称为FcWT)相当或比其高。另外，与5-1不同，这些构建体在pH7.4下的解离与FcWT相当。因此，除5-1-2和5-1-10(这两者在383位与384位之间具有插入序列)外，在环10内或邻近处具有插入序列的大部分Fc变体在pH7.4下都比变体5-1解离快。此外，变体5-1-1、5-1-2、5-1-3、5-1-9及5-1-10在pH6下明显具有比FcWT变体5-1高的最大反应，而变体5-1-6、5-1-7及5-1-8具有与FcWT相当的最大反应。变体5-1-4和5-1-5的反应仅略高于FcWT。这些数据指示，肽的插入在环10内的某些位点处具有较有利的影响。具体地说，在382位与383位、383位与384位、384位与385位、385位与386位(使用如表1和图5中所说明的EU编号系统)之间进行插入而产生的Fc变体在pH6下的最大反应强于FcWT并且在pH7.4下迅速解离。相比之下，在388位与389位、389位与390位或390位与391位之间具有插入序列的Fc变体具有类似于FcWT的特性。最后，在386位与387位或387位与388位之间具有插入序列的Fc变体在pH6下显示出的反应略高于FcWT并且在pH7.4下迅速解离。此外，如与FcWT相比较，去除氨基酸384-386并且在其位置插入肽(如在变体5-1-9和5-1-10中一样)也使这些Fc变体的特性改善。在插入序列的开始和结束处包括三个而非像5-1-9中一样包括两个甘氨酸残基的5-1-10的略微较长的插入序列具有比在383位与384位之间具有插入序列(不伴随缺失)的任何其它变体(包括5-1-2)高的反应。这些数据指示，在382位与387位之间的区域内插入可以增强与FcRn的结合的肽可以增强在pH6下Fc片段与FcRn的结合，同时保持其在pH7.4下自FcRn快速解离。另一方面，在388位与391位之间插入此类肽相比于FcWT基本上不会增强在pH6下Fc片段与FcRn的结合活性和/或亲和力，并且对于在pH7.4下解离也具有极少或无影响。因此，这些数据指出环10的一部分，即，从382位到386、387或388位(EU编号)，含有特别有利的位点以进行可增强在pH6下与FcRn的结合活性和/或亲和力的插入。
实施例11：通过酵母展示来选择变体Fc片段
为了获得不同组的变体Fc多肽，使用酵母展示来进行选择。为了制备供在酵母中进行筛选的文库，使用三个先前制备的文库作为起点。这些文库之一是文库L5，如以上所描述。参见图2和实施例2。另外两个文库在与文库L5完全相同的位点具有插入序列并且使用与用于制备文库L5相同的一般方法制备，但插入序列的格式不同，其中文库L5编码具有六个随机化氨基酸的插入序列，而文库L-8和L-10分别编码具有八个和十个随机化氨基酸的插入序列。具体地说，这些文库编码了具有以下格式的插入序列：文库L-8，GGC(19R)8CGG(SEQ ID NO：88)；及文库L-10，GGC(19R)10CGG(SEQ ID NO：89)。与文库L5中的相同，这些插入序列都在169位的“N”与170位的“G”之间(根据图2中的编号方案)。“(19R)8”和“(19R)10”分别指示八个和十个随机化氨基酸，这些氨基酸可以是除半胱氨酸外的任何氨基酸。
用SacII和NotI消化文库L5、L-8及L-10，并且对所得到的编码变体Fc片段的片段进行纯化并连接到适于在大肠杆菌和酿酒酵母中表达的载体中。该载体还在具有插入序列的框内编码HA标签(一种来自人流感血凝素的短肽序列(YPYDVPDYA)(SEQ ID NO：575))，该标签被用于确定这些Fc区展示于酵母细胞的表面上。将这三个新文库引入大肠杆菌中，具体地说，引入XL1-Blue超级感受态大肠杆菌细胞中。使用标准乙酸锂方法，使用来自约5×108个大肠杆菌转化株的DNA来转化约1-2×109个酿酒酵母细胞。将酿酒酵母的过夜培养物在100毫升酵母提取物蛋白胨右旋糖培养基(含有20g/L细菌用蛋白胨、10g/L酵母提取物、2％葡萄糖(YPD))中稀释到OD600为0.2-0.3，并且在30℃下，在300转/分钟(rpm)振荡下生长，直到OD600达到1.0-2.0。然后，用30毫升水和30毫升100mM LiOAc洗涤细胞。对于每一文库，向细胞中添加含有1M LiOAc、50％PEG、单链载体DNA、水及25ug文库DNA的转化混合物。每次转化在42℃下热休克45分钟。使细胞集结成团，然后使其在30℃下在50毫升YPD培养基中生长1小时。再次使细胞集结成团并且用30毫升SD-leu培养基(14.7g/L柠檬酸钠、4.29g/L柠檬酸、2％右旋糖、6.7g/L酵母氮源(yeast nitrogen base，YNB)、1.6g/L不含亮氨酸的酵母合成培养基补料(Sigma，Y1376))洗涤。然后，将细胞再悬浮于10毫升SD-leu培养基中。然后，将10毫升经过转化的细胞接种于300毫升SD-leu培养基中并使其在30℃下生长过夜。
通过将过夜培养物的等分试样(约108个细胞)接种于诱导培养基(5.4g/L Na2HPO4、8.56g/L NaH2PO4、2％半乳糖、6.7g/L YNB及1.6g/L不含亮氨酸的酵母合成培养基补料(Sigma，Y1376))中并在20℃下培养细胞约48小时来诱导酵母转化株中变体Fc片段的表达。
对这些经过诱导的细胞进行短暂离心并将其再悬浮于pH7.4的磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)缓冲液(+0.5％BSA)中。然后，将0.5-1×108个经过诱导的细胞与1μM生物素化FcRn(生物素-FcRn)一起孵育一小时。然后洗涤细胞并将其与2μg/mL经过标记的抗生蛋白链菌素(抗生蛋白链菌素(SA)-Alexa647(目录号S32357，Invitrogen))一起孵育15分钟。然后，洗涤细胞并将其与抗Cy5/抗Alexa647微珠(目录号130-091-395，MACS Miltenyi Biotec)一起孵育15分钟。洗涤细胞并且使用LS柱(目录号130-042-401，MACS Miltenyi Biotec)和分离单元(目录号130-091-051，MACS MiltenyiBiotec)进行分离。收集前置柱、穿流液(flow-thru)、洗涤液及洗脱部分的等分试样用于FACS分析。收集穿流液和洗涤液作为耗尽的群体，该群体含有表达变体Fc多肽的细胞，这些Fc多肽在pH7.4下以极低亲和力结合于FcRn。
然后使这一耗尽的细胞群在30℃下在SD-leu培养基中生长过夜。然后，如以上所描述，在20℃下在诱导培养基中诱导细胞约48小时。在pH5.5的MES缓冲液(20mM MES、137mM NaCl、0.5％BSA)中进行后续的洗涤和孵育步骤。在冰上，将经过诱导的细胞与250nM生物素-FcRn一起孵育一小时。随后，添加SA-Alexa647(2μg/mL)和抗HA-FITC(1μg/mL)，并且在洗涤并通过细胞粗过滤器之后，在pH5.5下对细胞进行FACS分析。设置门控来收集对于FITC和Alexa展现稳固信号的细胞。然后，将这些细胞在30℃下在SD-leu培养基中培养过夜，然后在20℃下在诱导培养基中诱导约48小时。然后，在第二轮中，在冰上将经过诱导的细胞与25nM生物素-FcRn一起孵育一小时，并且如以上所描述，重复进行标记、洗涤、染色、FACS、培养及诱导步骤。最后，在第三轮中，在冰上将经过诱导的细胞与5nM生物素-FcRn一起孵育一小时，随后如以上所描述，进行标记、洗涤、染色、FACS及培养步骤。因此，最终的结果是表达Fc片段的细胞群，这些Fc片段可以在pH5.5下以比野生型Fc片段高的亲和力结合FcRn。
对这一细胞群进行铺板，并且从文库L5中选出500个集落并从文库L-8和L-10中各选出400个集落进行进一步分析。这些个别集落各自如以上所描述在30℃下于SD-leu培养基中培养过夜。由酵母质粒DNA确定这些分离株各自的插入序列的序列。总的来说，分别在文库L5、L-8及L-10各自的这些分离株中发现317、265及313个独特序列。然后，如以上所描述，在20℃下在诱导培养基中诱导细胞48小时。同时在pH5.5的MES缓冲液(20mM MES、137mM NaCl、0.5％BSA)和pH7.4的PBS缓冲液(+0.5％BSA)中进行后续的洗涤和孵育步骤。将每一样品的约5×105个细胞与250nM生物素-FcRn和1μg/ml抗HA-FITC一起孵育1小时。然后，洗涤细胞并将其与2μg/mL SA-Alexa647一起孵育15分钟。洗涤细胞并经由FACS分析其结合以确定这些细胞是否在pH5.5较强地结合FcRn并且在pH7.4下较弱地结合FcRn。从每一文库中选出在pH5.5下显示最强的结合于FcRn的信号，而且在pH7.4下显示较弱的结合于FcRn的信号并且具有少数或无甲硫氨酸或色氨酸残基的个别细胞系进行进一步分析。所选的这些分离株包括分别来自L5、L-8及L-10的158、59及50个细胞系，并且这些分离株中的插入序列的序列显示于下表8中。(注意，名称为5y-37的克隆不包括在进一步分析中，因为它无法成功地再克隆到适当载体中。)
表8：在pH5.5下以高亲和力并且在pH7.4下以低亲和力结合的变体Fc多肽的序列
将从每一文库选出的个别克隆汇集起来并且使用Zymoprep酵母质粒微型制备型II试剂盒(D2004，Zymo Research)来分离DNA。使用正向引物(5′GGA AAA GTC GAC TAG ACC ACC ATG GA3′(SEQ IDNO：357))和反向引物(5′CTT TGC GGC CGC TCA TTA TTT 3′(SEQID NO：358))对汇集的DNA进行PCR。使用PCR核心试剂盒(Roche，目录号11 578 553 001)，并利用以下反应条件：95℃下5分钟，随后是30个循环的95℃下45秒、55℃下45秒、72℃下90秒，以及最后72℃下10分钟。在37℃下用SaII和NotI限制性酶(New EnglandBiolabs)消化PCR反应物和哺乳动物表达载体过夜。用QIAquick凝胶纯化试剂盒(28704，Qiagen)对消化的DNA进行凝胶纯化。使用T4DNA连接酶(New England Biolabs)连接消化的载体DNA和PCR产物并且在16℃下孵育过夜。使用连接的DNA转化XL10-gold高效感受态大肠杆菌细胞(#200315，Stratagene)，并且选出个别克隆。将从含有编码每一所选变体Fc多肽的DNA的大肠杆菌克隆得到的质粒DNA引入293-6E哺乳动物细胞中。具体地说，将293-6E细胞以5×104个细胞/孔接种于涂有聚D-赖氨酸的96孔平底微量滴定板中并在37℃下孵育过夜。然后，使用HD转染试剂(#E2312，Promega)将200ng质粒DNA转染到细胞中并在37℃下孵育过夜。次日，将生长培养基更换成含有0.5％胰蛋白胨的无血清培养基。在37℃下再生长6天之后收集条件培养基。然后，使用实施例4中所描述的ForteBio技术测试含有变体Fc片段的条件培养基与FcRn的结合。具有最有利的结合特征的变体Fc片段分别在pH6和7.4下的缔合和解离曲线示于图7中。
图7示出了来自酵母文库L5的28个最佳变体Fc片段以及野生型Fc片段(FcWT)分别在pH6和pH7.4下关于FcRn结合的缔合和解离曲线，并且图8示出了选自酵母文库L-8和L-10的18个最佳变体Fc片段的FcRn结合曲线。所有的L5变体Fc片段在pH6下都具有比FcWT高得多的最大反应，即，较高的结合活性。在pH7.4下，与FcWT类似，都迅速解离，即，具有极低或无结合活性。L-8和L-10变体Fc片段在pH6下都具有比FcWT高得多的最大反应，即，较高的结合活性。在pH7.4下，都迅速解离，不过大部分显示出在FcWT未观察到的较低水平的残留结合。因此，如与FcWT相比较，所有这些变体Fc片段都具有了有利的特性。因此，具有不同长度的肽插入序列可以成功地用于增强在pH6下与FcRn的结合活性，同时保持在pH7.4下自FcRn迅速解离并具有极少或无残留结合。
实施例12：酵母中所选变体Fc片段的体内表征
为了确定含有在以上所描述的酵母筛选中所鉴别的变体Fc片段的抗体是否具有改善的体内药物动力学(PK)特性，在食蟹猕猴中体内测试未修饰的抗体X(其为人IgG2抗人IL-23抗体)和含有变体Fc片段的抗体X的变体型式以确定药物动力学参数。选择抗体X作为适当抗体来测试变体Fc片段的药物动力学参数是因为已知其具有线性pK曲线并且因为已知IL-23在体内以低水平表达。因此，预期对于PK参数的靶相关影响将最小，使得更易于检测由变体Fc片段引起的pK影响。
制备六种变体IgG2抗体，称为(X-5y-8、X-5y-132、X-5y-38、X-5y-91、X-5y-119及X-5y-127)。这些IgG2抗体分别在与变体IgG1Fc片段5y-8、5y-132、5y-38、5y-91、5y-119及5y-127相同的位置处具有相同的插入序列。含有编码抗体X重链的DNA的质粒被用作模板以进行使用以下引物的五种PCR反应：对于X-5y-8，正向引物，5′-GAG TGG GAG AGC AAT GGT GGT TGT CCG GTT CTG CTGTTC AAC TGT GGT GGT GGG CAG CCG GAG AAC-3′(SEQ IDNO：380)，及反向引物，5′-GTT CTC CGG CTG CCC ACC ACC ACAGTT GAA CAG CAG AAC CGG ACA ACC ACC ATT GCT CTC CCACTC-3′(SEQ ID NO：381)；对于X-5y-132，正向引物，5′-GAG TGGGAG AGC AAT GGT GGT TGT GTT TTC TCT GCT CTG TGG TGTGGT GGT GGG CAG CCG GAG AAC-3′(SEQ ID NO：382)，及反向引物，5′-GTT CTC CGG CTG CCC ACC ACC ACA CCA CAG AGC AGAGAA AAC ACA ACC ACC ATT GCT CTC CCA CTC-3′(SEQ IDNO：383)；对于X-5y-38，正向引物，5′-GAG TGG GAG AGC AAT GGTGGT TGT GAA ACT TAC TGG TTG TTC TGT GGT GGT GGG CAGCCG GAG AAC-3′(SEQ ID NO：384)，及反向引物，5′-GTT CTC CGGCTG CCC ACC ACC ACA GAA CAA CCA GTA AGT TTC ACA ACCACC ATT GCT CTC CCA CTC-3′(SEQ ID NO：385)；对于X-5y-91，正向引物，5′-GAG TGG GAG AGC AAT GGT GGT TGT CCG CAT TGGCCG TTC GAA TGT GGT GGT GGG CAG CCG GAG AAC-3′(SEQID NO：386)，及反向引物，5′-GTT CTC CGG CTG CCC ACC ACC ACATTC GAA CGG CCA ATG CGG ACA ACC ACC ATT GCT CTC CCACTC-3′(SEQ ID NO：387)；对于X-5y-119，正向引物，5′-GAG TGGGAG AGC AAT GGT GGT TGT GCT TTC GAA TTC ATC TAC TGTGGT GGT GGG CAG CCG GAG AAC-3′(SEQ ID NO：388)，及反向引物，5′-GTT CTC CGG CTG CCC ACC ACC ACA GTA GAT GAA TTCGAA AGC ACA ACC ACC ATT GCT CTC CCA CTC-3′(SEQ IDNO：389)；及对于X-5y-127，正向引物，5′-GAG TGG GAG AGC AATGGT GGT TGT CAG TAC TTC TTG CCG TGT GGT GGT GGG CAGCCG GAG AAC-3′(SEQ ID NO：390)，及反向引物，5′-GTT CTC CGGCTG CCC ACC ACC ACA CGG CAA GAA GTA CTG ACA ACC ACCATT GCT CTC CCA CTC-3′(SEQ ID NO：391)。使用Quikchange定点诱变试剂盒(Stratagene，200518)方案。反应混合物为200nM dNTP、100nM引物、1ng DNA模板、1μL DNA聚合酶及水，总体积为50μL。反应在95℃下执行30秒，然后是16个循环的95℃下30秒，55℃下60秒，68℃下6分钟，随后是68℃下10分钟。然后，添加1μL DpnI，并且反应物在37℃孵育1小时。然后，在42℃下使用2μL混合物来转化30μL XL1-blue超级感受态细胞(Stratagene)，持续45秒。之后，添加0.5mL SOC，并且在37℃下，在振荡器上以300rpm孵育细胞1小时。将转化的细胞平铺在LB-氨比西林琼脂板上并在37℃下孵育过夜。拣选个别集落，并且制备质粒DNA并进行测序，以确保所选分离株具有预期的DNA序列。
以与以上关于Fc片段所描述基本上相同的方式制备抗体，但用编码IgG2重链(包括编码变体或对照Fc片段的部分)和抗体X的轻链的DNA转染哺乳动物宿主细胞。在适于表达这些抗体的条件下孵育宿主细胞，并且从培养基中回收抗体，如以上所描述进行纯化并用于以下实验中。
食蟹猕猴(每组n＝2)静脉内接受单剂1mg/kg剂量的未修饰或变体型式的抗体X并且在8周的生活期的期间进行跟踪。使用先前所测试的抗体X-5-112以及抗体X本身作为对照。在实验过程内的指定时间点收集血样。在给药前以及给药后0.25、1、4、8、12、24、48、72、168、240、336、408、504、576、672、744、840、1008、1176及1344小时收集样品。在血液样品中检测抗体并且基本上如以上在实施例9中所描述来进行药物动力学分析。
如图9中所示，与未修饰的抗体X相比较，含有所测试的所有变体Fc片段的抗体X的变体型式在大部分取样时间点(包括超过400小时的所有时间点)在食蟹猕猴中呈现较高的mAb浓度。另外，一些变体与先前所测试的X-5-112相当，包括X-5y-8、X-5y-127及X-5y-91。
下表11示出了在本研究中在每一食蟹猕猴中抗体X及其变体的半衰期(T1/2)、暴露(曲线下面积(AUC))及清除率(CI)。
表11：半衰期(T1/2)、暴露(AUC)及清除率(CI)的对应值。
在注射每一变体的两只猴的至少一只中，所有变体都显示出相比抗体X有所增加的半衰期和AUC。在猴#207和#213中，X-5y132和X-5y-119分别具有比抗体X短的半衰期。这可以被解释成意指这些特定的猴产生了抗药物抗体，导致这些抗体更迅速的清除。对于所测试的大多数变体，AUC值也高于抗体X的AUC值。
除猴#207和#213外，这些药物动力学参数的平均数据显示于下表12中。包括了抗体X和X-5-112的上表6中所报道的来自先前研究的值，显示了这些值随研究变化而相对恒定。
表12：半衰期(T1/2)、暴露(AUC)及清除率(CI)的平均值。
*这些是实施例9和表6中所报道的来自先前研究的值并且包括在此处以供比较。
#在本研究中所测试的两只猴中仅一只被纳入，因为怀疑抗药物抗体是引起在另一只猴中所观察的快速清除的原因。
这些数据显示，抗体X和X-5-112的药物动力学参数随研究变化而相对恒定。这些也指示，在所测试的所有变体中，半衰期和暴露都增加。因此，这些数据大体上指示，在食蟹猕猴中，变体Fc片段在pH5.5-6.0下与FcRn的结合增加(相对于对照Fc片段)以及在pH7.4下自FcRn迅速解离与含有变体Fc片段的抗体的体内半衰期较长有关。
实施例13：具有非线性PK曲线的含变体Fc抗体的体内表征
为了确定具有非线性PK曲线的抗体的PK特性是否因本文所描述的一种肽的插入而改善，将变体Fc片段Fc-5-112中的插入序列转移到抗体Y(一种具有非线性PK曲线的人IgG2抗体)中。基本上如以上所描述来制备抗体Y的这一变体形式(一种称为Y-5-112的变体IgG2抗体)，但使用适于在抗体Y中产生所需变化的不同PCR引物。
如以上实施例9中所描述来制备抗体。食蟹猕猴(每组n＝2)静脉内接受单剂10mg/kg剂量的抗体Y或抗体Y-5-112并且在8周的生活期的期间进行跟踪。在给药前，以及给药后0.083(5分钟)、0.25、0.5、1、2、4、6、8、12、24、36、48、72、96、120、144、168、192、216、240、264、288、312、336、384、432、480、528、576、624、672、720、768、816、864、912、960、1008、1056、1104、1152、1200、1248、1296及1344小时收集血样。
使用夹心ELISA来测定食蟹猕猴血清中的浓度。在PBS中稀释小鼠抗人抗体并且将其添加到96孔微量滴定板的孔中。在标称5℃孵育过夜或长达三天之后，丢弃孔内含物，并且将包含阻断剂BLOTTO(Scientific)的阻断缓冲液分配到板孔中。在环境室温(ambient room temperature，ART)下孵育最少一小时之后，排空板孔并且用1X洗涤溶液(2mM咪唑、O.02％Tween20、0.5mM EDTA、160mM NaCl，由KPL，Inc.以20X溶液销售)洗涤六次。在阻断剂BLOTTO中将研究试样、检验标准品及在100％猴血清中制备的质量控制样品稀释50倍，然后添加到板孔中。混合板孔的内含物，同时在板振荡器上孵育60分钟。接下来，洗涤板孔，并向板孔中添加辣根过氧化物酶标记的小鼠抗人抗体。在最后的一小时的孵育之后，洗涤板孔并且使用单组份3，3′，5，5′-四甲基联苯胺(TMB)底物溶液显影。通过向板孔中添加硫酸来淬灭所引起的比色反应。在450nm和650nm的双波长下测定光学密度，并且用在450nm下获得的值减去在650nm下获得的值。在7.0.0.01版Watson LIMS中，使用权重设定为1/Y2的逻辑斯谛模型，通过数据回归将OD值转化成经过稀释的研究试样的浓度。
如图10中所示，抗体Y具有双相PK曲线，其中大致呈线性相从0小时延伸到到约216小时。之后，抗体Y浓度急剧下降。抗体Y-5-112具有类似的曲线，但该曲线的线性、逐渐递减的部分从约0小时延伸到约432小时。因此，如与抗体Y相比较，抗体Y-5-112中的插入序列显然降低了PK曲线的线性部分的斜率，由此增加了总体暴露。

Claims (48)

1.一种变体Fc多肽，所述变体Fc多肽包含人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4变体Fc片段，
其中所述变体Fc片段在所述变体Fc片段的环5、8和/或10内或邻近处包含具有3到20个氨基酸的插入序列，
其中相比于与所述变体Fc多肽具有相同的氨基酸序列但在环5、8和/或10内或邻近处不含所述插入序列的对照Fc多肽，所述变体Fc多肽在pH6.0下以较高的结合活性结合于人新生儿Fc受体(hFcRn)，并且
其中所述变体Fc多肽在pH7.4下对于结合于nFcRn具有极低或无结合活性，并且在pH7.4下检测到的残留结合反应比使用所述对照Fc多肽所检测的结合反应高出不超过0.1纳米。
2.如权利要求1所述的变体Fc多肽，其中在所述变体Fc片段的环5、8和/或10内或邻近处的插入序列为至少六个氨基酸长。
3.如权利要求2所述的变体Fc多肽，其中在所述变体Fc片段的环5、8和/或10内或邻近处的插入序列是6到16个氨基酸长。
4.如权利要求1到3中任一项所述的变体Fc多肽，其中在所述变体Fc片段的环5、8和/或10内或邻近处的插入序列为至少12个氨基酸长。
5.如权利要求1到4中任一项所述的变体Fc多肽，其中在所述变体Fc片段的环5、8和/或10内或邻近处的插入序列在前四个插入的氨基酸中包含至少一个半胱氨酸并且在后四个插入的氨基酸中包含至少一个半胱氨酸。
6.如权利要求1到5中任一项所述的变体Fc多肽，其中所述插入序列是在所述变体Fc片段的环10内或邻近处。
7.如权利要求6所述的变体Fc多肽，其中使用表1中所示的EU编号系统，所述插入序列是在氨基酸383到387内。
8.如权利要求7所述的变体Fc多肽，
其中使用表1中所示的EU编号系统，在所述变体人Fc片段中的插入序列是在所述变体Fc片段的氨基酸382与383、氨基酸383与384、氨基酸384与385、氨基酸385与386、氨基酸386与387或氨基酸387与388之间，或
其中使用所述EU编号系统，氨基酸384-386缺失，并且所述插入序列是在氨基酸383与387之间。
9.如权利要求8所述的变体Fc多肽，
其中使用表1中所示的EU编号系统，在所述变体人Fc片段中的插入序列是在所述变体Fc片段的氨基酸382与383、氨基酸383与384、氨基酸384与385或氨基酸385与386之间，或
其中使用所述EU编号系统，氨基酸384-386缺失，并且所述插入序列是在氨基酸383与387之间。
10.如权利要求1到9中任一项所述的变体Fc多肽，其中所述变体人Fc片段是变体IgG1Fc片段。
11.如权利要求1到9中任一项所述的变体Fc多肽，其中所述变体人Fc片段是变体IgG2Fc片段。
12.如权利要求1到11中任一项所述的变体Fc多肽，其中在所述变体Fc片段中的插入序列具有SEQ ID NO：13-24中任一种的氨基酸序列。
13.如权利要求1到11中任一项所述的变体Fc多肽，其中在所述变体Fc片段中的插入序列包含SEQ ID NO：41-67、90-356、359-367、369、372、373及375-379中任一种的氨基酸序列。
14.如权利要求1到11中任一项所述的变体Fc多肽，其中在所述变体Fc片段中的插入序列包含选自以下序列的氨基酸序列：
(a)SEQ ID NO：216的氨基酸4-8；
(b)SEQ ID NO：41-53、67、90-163、165-215及217-247和359-378中任一种的氨基酸4-9；
(c)SEQ ID NO：164的氨基酸4-10；
(d)SEQ ID NO：248-288、290-306及342中任一种的氨基酸4-11；
(e)SEQ ID NO：289或307的氨基酸4-12；及
(f)SEQ ID NO：308-341和343-356中任一种的氨基酸4-13。
15.一种变体Fc多肽，所述变体Fc多肽包含人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4变体Fc片段，
其中所述变体Fc片段在环10内或邻近处包含具有3到20个氨基酸的插入序列，
其中所述变体Fc多肽在pH6.0下与hFcRn的结合活性高于与所述变体Fc多肽相同但在环10内或邻近处不含所述插入序列的对照Fc多肽的结合活性，并且
其中所述变体Fc多肽在pH7.4下对于结合于hFcRn具有极低或无结合活性，并且在pH7.4下检测到的残留结合反应比使用所述对照Fc多肽所检测的结合反应高出不超过0.1纳米。
16.如权利要求15所述的变体Fc多肽，其中所述插入序列为至少六个氨基酸长。
17.如权利要求15或16所述的变体Fc多肽，其中所述插入序列在所述插入序列的前四个氨基酸中含有至少一个半胱氨酸并且在所述插入序列的后四个氨基酸中含有至少一个半胱氨酸。
18.如权利要求15到17中任一项所述的变体Fc多肽，其中所述插入序列是6到16个氨基酸长。
19.如权利要求15到18中任一项所述的变体Fc多肽，其中所述插入序列为至少12个氨基酸长。
20.如权利要求15到19中任一项所述的变体Fc多肽，其中使用表1中所示的EU编号系统，所述插入序列是在氨基酸383到387内。
21.如权利要求20所述的变体Fc多肽，
其中使用表1中所示的EU编号系统，在所述变体人Fc片段中的插入序列是在所述变体Fc片段的氨基酸382与383、氨基酸383与384、氨基酸384与385、氨基酸385与386、氨基酸386与387或氨基酸387与388之间，或
其中使用所述EU编号系统，氨基酸384-386缺失，并且所述插入序列是在氨基酸383与387之间。
22.如权利要求21所述的变体Fc多肽，其中使用表1中所示的EU编号系统，在所述变体Fc片段中的插入序列是在氨基酸384与385之间。
23.如权利要求15到22中任一项所述的变体Fc多肽，其中在所述变体Fc片段中的插入序列具有SEQ ID NO：13-24中任一种的氨基酸序列。
24.如权利要求23所述的变体Fc多肽，其中在所述变体Fc片段中的插入序列包含SEQ ID NO：41、42、43、44、45、50、97、180及216中任一种的氨基酸序列。
25.如权利要求15到22中任一项所述的变体Fc多肽，其中在所述变体Fc片段中的插入序列包含SEQ ID NO：54、55、56、57或58的氨基酸序列。
26.如权利要求15到25中任一项所述的变体Fc多肽，所述变体Fc多肽包含人IgG1变体Fc片段。
27.如权利要求15到25中任一项所述的变体Fc多肽，所述变体Fc多肽包含人IgG2变体Fc片段。
28.如权利要求15到25中任一项所述的变体Fc多肽，所述变体Fc多肽包含人IgG4变体Fc片段。
29.如权利要求1到28中任一项所述的变体Fc多肽，所述变体Fc多肽是包含非抗体多肽的变体Fe融合蛋白。
30.如权利要求29所述的变体Fc多肽，其中针对所述变体Fc融合蛋白的对照Fc融合蛋白是阿法赛特、利隆西普、阿柏西普、依那西普、罗米司亭或阿巴西普。
31.如权利要求1到28中任一项所述的变体Fc多肽，所述变体Fc多肽包含抗体的重链可变区(VH)和/或轻链可变区(VL)。
32.如权利要求31所述的变体Fc多肽，所述变体Fc多肽另外包含第一重链恒定区(CH1)和轻链恒定区(CL)。
33.如权利要求31或32所述的变体Fc多肽，所述变体Fc多肽包含VH区和VL区。
34.如权利要求39到41中任一项所述的变体Fc多肽，所述变体Fc多肽包含
(a)包含VII区、第一重链恒定区(CII1)、铰链区、CII2区及CII3区的重链，和
(b)包含VL区和轻链恒定区(CL)的轻链。
35.如权利要求31到34中任一项所述的变体Fc多肽，所述变体Fc多肽是单价的。
36.如权利要求1到35中任一项所述的变体Fc多肽，所述变体Fc多肽是二聚体。
37.如权利要求31到34中任一项所述的变体Fc多肽，所述变体Fc多肽是四聚体。
38.一种核酸，所述核酸编码如权利要求1到37中任一项所述的变体Fc多肽。
39.一种宿主细胞，所述宿主细胞含有如权利要求38所述的核酸。
40.一种用于制备变体Fc多肽的方法，所述方法包括
将编码所述变体Fc多肽的核酸引入宿主细胞中，
在使得所述核酸表达的条件下培养包含所述核酸的所述宿主细胞，及
从所述培养基或所述细胞团回收表达的变体Fc多肽，
其中所述变体Fc多肽包含在变体Fc片段的环5、8和/或10内或邻近处包含具有3到20个氨基酸的插入序列的所述变体Fc片段，并且
其中所述变体Fc多肽在pH6.0下结合于hFcRn的结合活性高于对照Fc多肽，并且
其中所述变体Fc多肽在pH7.4下具有极低或无结合活性，并且在pH7.4下检测到的残留结合反应比使用所述对照Fc多肽所检测的结合反应高出不超过0.1纳米。
41.如权利要求40所述的方法，其中所述核酸是如权利要求38所述的核酸。
42.一种用于延长包含人IgG Fc片段的Fc多肽的半衰期的方法，所述方法包括以下步骤：
在环5、8和/或10内或邻近处选择供插入的位点；和
将肽插入所述所选位点中，其中所述肽包含选自以下序列的氨基酸序列：
(a)SEQ ID NO：41-67、90-356、359-367、369、372、373及375-379；
(b)SEQ ID NO：216的氨基酸4-8；
(c)SEQ ID NO：41-53、67、90-163、165-215及217-247和359-378中任一种的氨基酸4-9；
(d)SEQ ID NO：164的氨基酸4-10；
(e)SEQ ID NO：248-288、290-306及342中任一种的氨基酸4-11；
(f)SEQ ID NO：289或307的氨基酸4-12；及
(g)SEQ ID NO：308-341和343-356中任一种的氨基酸4-13。
43.如权利要求42所述的方法，其中所述位点是在环10内或邻近处。
44.如权利要求43所述的方法，其中所述插入位点是在根据EU编号系统编号的氨基酸383到387内。
45.如权利要求44所述的方法，
其中使用所述EU编号系统，所述插入序列是在所述变体Fc片段的氨基酸382与383、氨基酸383与384、氨基酸384与385或氨基酸385与386之间，或
其中使用所述EU编号系统，氨基酸384-386缺失，并且所述插入序列是在氨基酸383与387之间。
46.一种用于鉴别人IgG变体Fc片段的方法，所述人IgG变体Fc片段赋予包含所述变体Fc片段的变体Fc多肽比对照Fc多肽长的体内半衰期，所述方法包括以下步骤：
(a)建立编码在环10内或邻近处含有插入序列的Fc片段的核酸文库，所述插入序列包含4-20个随机化氨基酸；
(b)对由所述文库编码的Fc片段进行筛选以鉴别出(i)在pH6下以比对照Fc片段高的结合活性结合于hFcRn并且(ii)在pH7.4下对于结合于hFcRn具有极低或无结合活性的变体Fc片段；
(c)构建出编码包含(b)中所鉴别的变体Fc片段的变体Fc多肽的核酸，其中已知当在体内施用给动物时，包含对照Fc片段而非所述变体Fc片段的对照Fc多肽的浓度随时间呈线性降低；
(d)将(c)的所述核酸引入宿主细胞中并在使得由所述核酸编码的变体Fc多肽能够表达的条件下培养所述宿主细胞；
(e)从所述细胞团或细胞培养基中回收所述变体Fc多肽；
(f)将所述变体Fc多肽施用给一只动物，并将所述对照Fc多肽施用给另一只动物；及
(g)在施用之后，随时间监测外周血中所述变体Fc多肽和所述对照Fc多肽的浓度，由此鉴别出赋予变体Fc多肽较长的体内半衰期和较多的暴露的变体Fc片段。
47.如权利要求46所述的方法，其中使用如表1中说明的EU编号系统，步骤(a)的插入序列是在384位与385位之间。
48.一种用于治疗慢性疾病的方法，所述方法包括向有需要的患者施用如权利要求1到37中任一项所述的变体Fc多肽。
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