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CN109641958A - huTNFR1相互作用的单价抑制剂 - Google Patents

huTNFR1相互作用的单价抑制剂 Download PDF

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CN109641958A CN201780034895.2A CN201780034895A CN109641958A CN 109641958 A CN109641958 A CN 109641958A CN 201780034895 A CN201780034895 A CN 201780034895A CN 109641958 A CN109641958 A CN 109641958A
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Abstract

本发明提供了huTNFR1受体的抑制剂，其是人或人源化的抗体构建体，通过抗原结合部分单价识别huTNFR1，特征在于特定的CDR序列；所述抑制剂的药物制剂；产生所述抑制剂的方法；以及所述抑制剂的医疗用途。

Description

huTNFR1相互作用的单价抑制剂
技术领域
本发明涉及TNF-huTNFR1受体相互作用的抑制剂，该抑制剂以高亲和力单价识别huTNFR1。
背景技术
肿瘤坏死因子(TNF)是一种多效性细胞因子并且是炎症的中枢介质。TNF水平升高与多种炎性疾病相关，包括类风湿性关节炎、银屑病和克罗恩病(Crohn’s disease)。几种TNF-中和试剂已经批准用于治疗这些疾病，包括可溶性TNF受体(依那西普)以及抗-TNF抗体(英夫利昔单抗、阿达木单抗、赛妥珠单抗、戈利木单抗)，还有许多处于研发当中。超过100万的患者接受了TNF拮抗剂治疗，并详细记录了疗效。然而，长时间进行整体TNF抑制增加了结核病复发，严重感染，甚至恶性肿瘤的风险。因此，所有经批准的抗-TNF药物的医学信息都包括广泛警告和预防措施。
两种TNF受体(CD120a，TNFR1和CD120b，TNFR2)在结合TNF后介导信号转导(Locksley等，2001，Cell 104：487-501)。促炎反应主要由广泛表达的TNFR1介导。TNFR1由膜结合形式的TNF(mTNF)和可溶性TNF(sTNF)两者激活，可溶性TNF由mTNF通过蛋白水解来产生。相比之下，TNFR2以更受限制的方式表达，例如由免疫细胞、内皮细胞和神经元表达，只能通过mTNF激活。TNFR2的激活主要诱导抗凋亡信号并且在体外可以导致细胞增殖。此外，TNFR2似乎在组织内稳态和再生中起作用。
作为影响两种TNF受体的整体TNF中和的替代物，选择性抑制TNFR1信号传导已经获得了越来越多的关注(Fischer等，2015，Antibodies 4：48-70)。最近，已经描述了选择性中和TNFR1活性的TNF突变蛋白(R1antTNF)(Shibata等，2008，Cytokine 2：229-33)。该TNF突变蛋白以未经修饰或PEG化的蛋白(PEG-R1antTNF)施用，在急性鼠肝炎模型和鼠胶原诱导的关节炎模型中显示出治疗功效。选择性抑制TNFR1的有益效果进一步得到来自显性阴性TNF突变蛋白(XPro1595)的结果的支持，其能够与sTNF形成无活性复合物，从而选择性抑制由TNFR1介导的促炎作用，同时保持对感染的先天免疫力(Olleros等，2009，J.Infect.Dis.199：1053-63)。
TNFR1特异性抗体也可以实现TNFR1的选择性抑制。例如，单克隆鼠源抗体H398，以及US5736138中描述的对人TNFR1具有选择性的抗体，显示出对TNF介导的信号转导和细胞毒性具有强有力的抑制(Moosmayer等，1995，Ther.Immunol.2：31-40)。
WO2008/113515A2描述了H398的人源化形式。具体地，人源化抗体生产为Fab片段(IZI-06.1)产生，并在体外显示出与亲本抗体的Fab片段相当的中和活性。重要的是，H398抗体没有实现TNF活性的完全阻断，这通过高浓度下从拮抗剂转化为部分激动剂来解释。这一点通过TNFR1交联的剂量依赖性增加，从而潜在地形成不依赖于配体的功能性TNFR1信号传导复合物得到了解释。
使IZI-06.1亲和力成熟的尝试得到一个突变体(scFvIG11)，其显示出抗原结合亲和力增加两倍，这在体外也造成对TNF介导的细胞毒性抑制略微得到改善(Zettlitz KA，论文2012，Stuttgart)。
Kontermann等(Journal of Immunotherapy 2008，31(3)：225-234)描述了IZI-06.1的单价抗体片段作为TNFR1选择性TNF拮抗剂。
通过诱导模拟配体的应答，发现针对TNFR1的抗体具有激动潜力。该应答表明，信号转导是通过因多价TNF三聚体的结合而引发受体聚集来启动的。具体来讲，已知二价抗-TNFR1抗体由于受体交联而具有TNFR激活的风险，这造成它们自身的促炎反应，包括细胞毒性和细胞凋亡，这在治疗TNF介导的病状中是达不到预期目标的。
WO2012035141A1描述了IgG1型抗-huTNFR1抗体，其被称为ATROSAB，具有缺乏介导效应因子功能的经修饰的Fc区，发现这样限制了抗体的激动潜力。
Richter等(2013，PLoS One 8：e72156)描述了如通过测量分别由TNF或LTα诱导，从HeLa和HT1080细胞释放IL-6和IL-8，ATROSAB抑制TNFR1与其天然配体TNF和淋巴毒素α(LTα)的相互作用。
发明内容
本发明的目的是提供一种改善的抗-huTNFR1试剂，其具有改善的TNFR1抑制特性，同时避免由内部TNF模拟激动活性所引起的任何副作用。
本发明的目的通过所要求保护的主题来实现。
根据本发明，提供了一种TNF-huTNFR1受体相互作用的抑制剂，其是通过抗原结合部分单价识别huTNFR1的人或人源化的抗体构建体。
具体地，所述抗原结合部分包括：
-重链可变(VH)结构域，包括CDR序列CDRH1、CDRH2和CDRH2，和
-轻链可变(VL)结构域，包括CDR序列CDRL1、CDRL2和CDRL2，其中
A
a)所述CDRH1的序列被鉴定为SEQ ID 1；
b)所述CDRH2的序列被鉴定为SEQ ID 10；
c)所述CDRH3的序列被鉴定为SEQ ID 3；
d)所述CDRL1的序列被鉴定为SEQ ID 4；
e)所述CDRL2的序列被鉴定为SEQ ID 5；和
f)所述CDRL3的序列被鉴定为SEQ ID 11；
或者
B
a)所述CDRH1的序列是SEQ ID 1的功能活性CDR变体；和/或
b)所述CDRH2的序列是SEQ ID 10的功能活性CDR变体；和/或
c)所述CDRH3的序列是SEQ ID 3的功能活性CDR变体；和/或
d)所述CDRL1的序列是SEQ ID 4的功能活性CDR变体；和/或
e)所述CDRL2的序列是SEQ ID 5的功能活性CDR变体；和/或
f)所述CDRL3的序列是SEQ ID 11的功能活性CDR变体；
或者
其中，除了CDRH2中的第5位和CDRL3中的第3位之外，所述功能活性CDR变体在各自的CDR序列的任何位置包括不超过1个或2个点突变。
实施方式B的功能活性CDR变体决定实施方式A的抑制剂的功能活性变体，其中CDRH2序列的功能活性CDR变体具体地包括第5位为G或S中任一个的氨基酸序列；和，CDRL3序列的功能活性CDR变体具体地包括第3位为G或S中任一个的氨基酸序列。例如本文进一步描述的，功能活性CDR变体具体地决定与huTNFR1结合的高亲和力。具体地，功能活性变体是实施方式A的抑制剂的亲和力成熟的变体，特别地，其中CDR序列的1、2、3、4、5或6个是功能活性CDR变体。
具体地，与之前经改造得到的IZI-06.1改进形式scFvIG11相比，已经令人惊讶地证明本文所述的抑制剂显示出改善的结合特性。
具体地，抗原结合部分与huTNFR1结合，且KD小于5×10-9M且k解离(off)小于10-3s-1。在确定单价结合的标准测试中具体地测定了结合亲和力和结合特征(结合和解离)，基本上排除了二价结合的亲合力效应(avidity effect)。标准测试是基于通过石英晶体微天平(QCM)在生理温度(约37℃，或37℃+/-1℃)下的测量。这种亲和力测量特别是以Fab形式进行的。因此，如果抗体构建体是除Fab分子之外的任何其它形式，则特别地将抗原结合位点引入相应的Fab分子中，用于通过QCM在37℃进行亲和力测量。这确保了单价结合物的亲和力测量结果的可比性，而不管可能干扰亲和力测量的亲合力效应。特别优选的QCM以中等受体密度进行。具体地，通过QCM在37℃下，在50～100Hz范围内，例如约50Hz，或50Hz+/-10Hz，或50Hz+/-5Hz的中等受体密度下，测定Fab形式的与huTNFR1结合的抗体构建体的亲和力。通过QCM测定结合亲和力的标准测试在以下实施例部分中进行了描述。
具体地，KD小于4×10-9M，或小于3×10-9M，或小于2×10-9M，或小于10-9M，或甚至小于10-10M
具体地，k解离小于10-3，或小于5×10-4s-1，或小于10-4s-1，或小于10-5s-1。
具体地，抗原结合部分识别huTNFR1，且k结合(on)为至少105M-1s-1。
根据一个具体的方面，如在基于细胞的分析中所测定的，优选通过在Kym-1细胞中抑制TNFR1介导的细胞死亡的分析，或通过分别抑制HeLa细胞或HT1080细胞释放IL-6或IL-8的分析所测定的，抑制剂直接抑制TNF-huTNFR1受体的相互作用。具体地，在Kym-1细胞中抑制TNFR1介导的细胞死亡的分析中，IC50值小于5.0×10-9M。具体地，在抑制HeLa细胞释放IL-6的分析中，IC50值小于4.0×10-8M，或在抑制HT1080细胞释放IL-8的分析中，IC50值小于2.0×10-8M。
由于单价相互作用，已经特别地消除了抗体构建体的TNF模拟激动电位，同时与TNFR1结合亲和力增强，特别是解离速率低，更有效地抑制TNFR1依赖性的TNF响应。
根据另一个具体的方面，如在基于细胞的分析中所测定的，优选地通过在Kym-1细胞中抑制TNFR1介导的细胞死亡的分析，或通过抑制HeLa细胞和/或HT1080细胞释放IL-6或IL-8的分析所测定的，抑制剂直接抑制huTNFR1-受体与淋巴毒素α的相互作用。
具体地，所述抗原结合部分包括一个或多个Fv结构域或由一个或多个Fv结构域组成，所述一个或多个Fv结构域形成单价结合位点。根据一个具体的方面，所述Fv结构域是VH结构域和VL结构域，两者通过结构域的β-折叠结构的相互作用而彼此关联。
根据一个方面，所述抗原结合部分特异性识别表位，该表位包括huTNFR1的膜远端CRD1和CRD2的亚结构域A1。
特异性结合表位由huTNFR1的N末端区域的第1至115位氨基酸表示。
根据一个具体的实施方式，如本文进一步描述的，所述抗体构建体特异性结合与H398抗体所识别的表位相同或与之重叠的表位。具体地，所述抗体构建体干扰H398抗体与其表位的结合，这样它可以与huTNFR1竞争性地结合。
具体地，所述抗体构建体至少包括亲和力成熟的人源化H398抗体的VH结构域，和可选的Fv结构域(作为与VL关联或结合的VH)。具体地，H398抗体和人源化的ATROSAB抗体(如本文进一步描述的)的特征在于包括以下序列或由以下序列组成的CDR序：
SEQ ID 1：H398 CDRH1，
SEQ ID 2：H398 CDRH2，
SEQ ID 3：H398 CDRH3，
SEQ ID 4：H398 CDRL1，
SEQ ID 5：H398 CDRL2，
SEQ ID 6：H398 CDRL3。
具体地，所述抗体构建体包括VH结构域和VL结构域，其中VH结构域和VL结构域中的至少一个是亲本结构域的亲和力成熟的功能变体，在任一互补决定区(CDR)序列中包括至少一个点突变，其中，
a)亲本VH结构域的特征在于CDR序列：SEQ ID 1(CDRH1)、SEQ ID 2(CDRH2)和SEQID 3(CDRH3)；和
b)亲本VL结构域的特征在于CDR序列：SEQ ID 4(CDRL1)、SEQ ID 5(CDRL2)和SEQID 6(CDRL3)；
这些CDR序列是按照Kabat编号方案的。
具体地，所述至少一个点突变在SEQ ID 2(CDRH2)和/或SEQ ID 6(CDRL3)的任一个中，优选地其中CDRH2序列是SEQ ID 7，CDRL3序列是SEQ ID 8。
具体地，可以在任一CDR序列中引入1或2个点突变以产生功能活性CDR变体。具体地，与亲本结构域的任一CDR序列相比，所述功能活性CDR变体具有至少60％、或至少70％、或至少80％的序列同一性，优选具有至少85％或至少90％的序列同一性，或每一CDR序列仅有1个点突变，优选地其中CDR序列是CDRH2序列或CDRL3序列。
具体地，所述抗体构建体包括被称为ATROSAB的人源化抗体的亲和力成熟的序列，其包括用于亲和力成熟目的的VH和VL序列。ATROSAB的特征具体地在于以下VH和VL序列：
SEQ ID 22：ATROSAB VH，
SEQ ID 23：ATROSAB VL。
具体地，所述抗原结合部分是：
A
选自组成员i)至ii)组成的组中，其中
i)
是抗原结合部分，其包括：
a)被鉴定为SEQ ID 1的CDRH1序列；
b)被鉴定为SEQ ID 10的CDRH2序列，其中第5位的X是S；
c)被鉴定为SEQ ID 3的CDRH3序列；
d)被鉴定为SEQ ID 4的CDRL1序列；
e)被鉴定为SEQ ID 5的CDRL2序列；和
f)被鉴定为SEQ ID 11的CDRL3序列，其中第3位的X是G；
和
ii)
是抗原结合部分，其包括：
a)被鉴定为SEQ ID 1的CDRH1序列；
b)被鉴定为SEQ ID 10的CDRH2序列，其中第5位的X是S；
c)被鉴定为SEQ ID 3的CDRH3序列；
d)被鉴定为SEQ ID 4的CDRL1序列；
e)被鉴定为SEQ ID 5的CDRL2序列；和
f)被鉴定为SEQ ID 11的CDRL3序列，其中第3位的X是S；
或者
B
是亲本抗原结合部分的功能活性变体的抗原结合部分，所述亲本抗原结合部分是A的任一组成员。
具体地，所述功能活性变体包括：
a)亲本抗体的任一CDR序列的至少一种功能活性CDR变体，除了CDRH2的第5位和CDRL3的第3位之外，该功能活性CDR变体在相应的CDR序列的任何位置处包括不超过1或2个点突变；和/或
b)在VH或VL序列任一者的骨架区中的至少一个点突变。
具体地，功能活性CDR变体的特征在于CDRH2序列，其中第5位的氨基酸序列是G或S中的任一个；和，CDRL3序列，其中第3位的氨基酸序列是G或S中的任一个。具体地，例如本文进一步描述的，功能活性CDR变体的特征在于与huTNFR1结合的高亲和力。
具体地，在任一FR序列中可以引入一个或多个点突变以产生功能活性FR变体，特别是人或人源化的FR序列。
具体地，VH或VL序列任一者的功能活性FR1变体包括一个或多个，例如几个点突变，例如高达2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个点突变，以获得与亲本FR1序列相比具有至少40％或至少45％的序列同一性，或至少50％的序列同一性，或至少60％的序列同一性，或至少70％的序列同一性，或至少80％的序列同一性，或至少90％的序列同一性的变体序列。
具体地，VH或VL序列任一者的功能活性FR2变体包括一个或多个，例如几个点突变，例如高达2、3、4或5个点突变，以获得与亲本FR2序列相比具有至少70％或至少80％的序列同一性，或至少90％的序列同一性的变体序列。
具体地，VH或VL序列任一者的功能活性FR3变体包括一个或多个，例如几个点突变，例如高达2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个点突变，以获得与亲本FR3序列相比具有至少50％或至少60％的序列同一性，或至少70％的序列同一性，或至少80％的序列同一性，或至少90％的序列同一性的变体序列。
具体地，VH或VL序列任一者的功能活性FR4变体包括一个或多个，例如几个点突变，例如高达2、3、4或5个点突变，以获得与亲本FR4序列相比具有至少70％或至少80％的序列同一性，或至少90％的序列同一性的变体序列。
根据一个具体的实施方式，所述抗体构建体选自由Fab分子、scFv分子，单可变结构域、二硫键稳定性Fv(dsFv)、半IgG1抗体和Fv结构域，或前述任一者的功能活性衍生物组成的组，优选地其中，所述抗体构建体与亲水性聚合物例如PEG偶联，和/或与多肽融合，该多肽例如为人(或小鼠)血清白蛋白、转铁蛋白、白蛋白结合结构域或肽、Ig结合结构域或肽、PEG-模拟多肽延伸物(PEG-mimetic polypeptide extension)、抗体Fc片段、携带突变以允许优选的异源二聚化(优于同源二聚化)的抗体Fc片段，或前述多肽任一者的功能变体。
具体地，所述抗体构建体是与抗体Fc片段融合的Fab、scFv、dsFv或Fv结构域中的任一者，其中Fc由CH2和CH3结构域的异源二聚体组成，其中CH2和/或CH3结构域携带一个或多个点突变，该点突变允许进行优于同源二聚化的异源二聚化。具体地，Fc中的一个或两个CH3结构域经修饰以改变氨基酸结构，例如获得含CH3/CH3结构域的异源二聚体的Fc。
具体地，所述抗体构建体包括与抗体Fc区或片段融合的Fv结构域，具有或不具有其他抗体结构域，但保持所述抗体构建体的单价结合结构。一个具体的实例是与Fc或经修饰的Fc融合的Fab部分或Fv部分。
具体的实施方式包括人IgG1 Fc，其中CH2-CH3结构域通过一个或多个“杵臼(knobs-into-holes)”突变形成异源二聚体，例如：
“杵”突变，其修饰CH3的β-折叠表面，存在于一个CH3结构域单体上，为T366W；和
“臼”突变，其修饰CH3的β-折叠表面，存在于另一CH3结构域单体上，选自由T366S、L368A、Y407V组成的组。
具体地，所述抗体构建体包括Fc区，该Fc区包括一个或多个突变以下调效应子功能。根据一个具体的方面，该Fc区经糖改造以下调效应子功能。
具体地，所述抗体构建体包括(人IgG1)Fc区，该Fc区的特征在于FcγR沉默的CH2和CH3结构域，例如通过选自由E233P、L234V、L235A、ΔG236、A327G、A330S和P31S、S228P、L234A、L235A、H268Q、A330S、P331S、V234A、G237A、P238S、H268A、V309L组成的组一个或多个突变。
根据一个优选的实施方式，所述抗体构建体包括IgG1的Fc区，该IgG1 Fc区发生突变以下调效应子功能。优选地，该Fc区包括具有选自由E233P、L234V、L235A、ΔG236、A327G、A330S和P331S(Kabat EU索引编号)组成的组中至少一个突变的重链。优选地，将所述突变中的至少两种，更优选的将至少三种、四种、五种或所有六种突变，改造至人IgG1的Fc序列中。人IgG1的Fc序列具体地包括在被鉴定为SEQ ID 24的氨基酸序列中。SEQ ID 24鉴定为人IgG1的Fc和铰链区(野生型IgG1的铰链区(SEQ ID 35)，加上CH2-CH3结构域)的序列。
具体地，所述抗体构建体包括人源化或人的骨架区。
具体地，所述抗体构建体是PEG化的、HES化的或PSA化的。
具体地，所述抗体构建体是径分子量在5000～150000g/mol范围内的PEG聚乙二醇化的。示例性的抗体构建体，例如Fab，是经PEG 40000聚乙二醇化。
具体地，所述抗体构建体是半抗体IgG1，特征在于仅一个Fab部分、铰链区和一个Fc部分，其中铰链区和/或Fc部分(特别是人IgG1的Fc)包括一个或多个突变以避免发生重链二聚化(Gu等(2015)PLoS One 10(1)：e0116419)，例如选自以下项组成的组：
-在铰链区(SEQ ID 35)中的突变：C226S、C229S(EU编号)，和
-在Fc部分中的突变：P395A、F405R、Y407R、K409D(EU编号)。
具体地，所述抗体构建体是Fv-Fc融合蛋白，其中VH通过第一铰链区与第一CH2-CH3结构域链融合，VL通过第二铰链区与第二CH2-CH3结构域链融合。优选地，该第一CH2-CH3结构域链和该第二CH2-CH3结构域链彼此之间有一个或多个点突变的不同，例如以允许第一CH2-CH3结构域链和第二CH2-CH3结构域链之间优先发生异源二聚化，从而获得以Fc异源二聚体为特征的Fv-Fc制备物，例如通过如上所述的“杵臼”突变来获得。此外，第一铰链区和第二铰链区可经如下修饰：GTDKTHTSPPCPAPPVAG(SEQ ID 42)、GTDKTHTCPPSPAPPVAG(SEQ ID 43)或GTDKTHTSPPSPAPPVAG(SEQ ID 44)。
具体地，所述抗体构建体是二硫键稳定性Fv(dsFv)，其特征在于一个或多个额外的(人工)域间二硫键。通过在VH或VL结构域的适当位置引入一个或多个额外的半胱氨酸残基来获得该二硫键，这些位置可以用作桥接VH和VL结构域的二硫键的桥墩，所述二硫键在还原半胱氨酸时获得。根据具体的实例，二硫键可以在VH中的任何以下位置以及VL中的相应位置处引入Fv中：VH中的44C和VL中的100C，VH中的108C和VL中的55C，VH中的106C和VL中的56C，或VH中的101C和VL中的46C。
根据一个具体的方面，与亲本Fv结构域相比，所述抗体构建体包括以增强的亲和力结合huTNFR1的Fv结构域，其中亲本Fv结构域的特征在于被鉴定为SEQ ID 12的亲本VH结构域和被鉴定为SEQ ID 16的亲本VL结构域。
具体地，VH和VL结构域中的至少一个是亲本结构域的亲和力成熟的功能变体，在CDR序列或骨架(FR)序列任一者中包括至少一个点突变。
具体地，
a)VH结构域包括以下序列或由以下序列组成，其中该序列选自由SEQ ID 13～15或SEQ ID 13～15任一者的功能活性变体组成的组；和/或；
b)VL结构域包括以下序列或由以下序列组成，其中该序列选自由SEQ ID 17～19或SEQ ID 17～19任一者的功能活性变体组成的组；或
c)其中，a)或b)的功能活性变体在CDR或FR序列任一者中包括至少一个点突变。具体地，a)或b)的功能活性变体的特征在于：
a)在任一CDR序列的、除了CDRHD2的第5位和CDRL3的第3位之外的任何其它位置的1或2个点突变；和/或
b)在VH或VL序列任一者的骨架区中的至少一个点突变。
具体地，所述抑制剂包括VH和VL结构域的组合，其为：
A
选自由组成员i)至ix)组成的组，其中
i)
VH包括SEQ ID 13或由SEQ ID 13组成；并且
VL包括SEQ ID 17或由SEQ ID 17组成；
ii)
VH包括SEQ ID 14或由SEQ ID 14组成；并且
VL包括SEQ ID 18或由SEQ ID 18组成；
iii)
VH包括SEQ ID 15或由SEQ ID 15组成；并且
VL包括SEQ ID 19或由SEQ ID 19组成；
iv)
VH包括SEQ ID 14或由SEQ ID 14组成；并且
VL包括SEQ ID 19或由SEQ ID 19组成；
v)
VH包括SEQ ID 15或由SEQ ID 15组成；并且
VL包括SEQ ID 18或由SEQ ID 18组成；
vi)
VH包括SEQ ID 13或由SEQ ID 13组成；并且
VL包括SEQ ID 18或由SEQ ID 18组成；
vii)
VH包括SEQ ID 14或由SEQ ID 14组成；并且
VL包括SEQ ID 17或由SEQ ID 17组成；
viii)
VH包括SEQ ID 13或由SEQ ID 13组成；并且
VL包括SEQ ID 19或由SEQ ID 19组成；
和
ix)
VH包括SEQ ID 15或由SEQ ID 15组成；并且
VL包括SEQ ID 17或由SEQ ID 17组成；
或者
B
A的组成员i)～ix)任一者的VH和VL结构域的组合，其中VH结构域是SEQ ID 13～15任一者的功能活性变体，和/或VL结构域是SEQ ID 17～19任一者的功能活性变体，该功能活性变体的特征在于：
a)在任何CDR序列的、除了CDRHD2的第5位和CDRL3的第3位之外的任何其它位置处的1或2个点突变；和/或
b)在VH或VL序列任一者的骨架区中的至少一个点突变。
上述功能活性变体可以是在任何CDR序列中具有至少一个点突变的功能活性CDR变体，和/或在任何FR序列中具有至少一个点突变的功能活性变体。然而，上述功能活性CDR变体的特征具体地在于CDRH2序列，其中第5位的氨基酸序列是G或S中的任一个；和CDRL3序列，其中第3位的氨基酸序列是G或S中的任一个。如本文进一步描述的，上述功能活性CDR变体的特征具体地在于与huTNFR1结合的高亲和力。
根据一个具体的方面，与亲本抗体构建体相比，所述抗体构建体具有增强的热稳定性，其中所述抗体构建体包括Fv结构域，该Fv结构域是亲本Fv结构域的、在VH或VL序列任一者的骨架区中具有至少一个点突变的功能变体，优选地其中VH结构域序列是(亲本)IZI06.1的VH序列(SEQ ID 20)的变体，并且包括任何氨基酸(Kabat编号)：
a)FR1中的第1位：Q或H；
b)CDRH2中的
i)第3位：Y或V；
ii)第5位：Y、T或S；
iii)第6位：S或Q；
iv)第8位：H或E；
v)第10位：Y或K；
vi)第13位：E或D。
进一步优选的变体涉及VL序列(SEQ ID 21)并且包括CDRL3中的S91G点突变(第3位)。
具体地，如通过动态光散射测定的，所述抗体构建体或抑制剂的优选变体的热稳定性为至少60℃，或至少61℃，或至少62℃，或至少63℃，或至少64℃，或至少65℃。
本发明还提供了一种药物制剂，其包括本文所述的抑制剂以及药学上可接受的载剂。
由于抑制剂和抗体构建体的拮抗特性，所述药物制剂可以包括高浓度的抑制剂，同时避免由激动活性引起的副作用。
在不存在全长免疫球蛋白结构的情况下，所述抑制剂特别地具有降低的免疫原性并且可以重复使用而不会形成抑制物，例如抗药物抗体(ADA)。
令人惊讶地发现了，所述抑制剂可以用于治疗产生ADA的患者，该患者例如产生了抗免疫球蛋白或抗体免疫治疗剂的抗体。在现有技术中，这种ADA的存在将特别地排除使用针对TNFR1的抗体进行进一步免疫疗法，因为当与细胞表面上的TNFR1结合，ADA就具有使抗体交联的潜力，从而激活TNFR1信号传导。然而，令人惊讶地是，即使存在ADA时，本文所述的抑制剂也不会激活TNFR1信号传导。
具体地，可以将所述药物制剂施用于已经产生ADA的受试者，其中ADA例如为针对抗-huTNFR1抗体或任何IgG结构的ADA。
具体地，所述制剂配制为肠胃外使用，优选地通过静脉内或皮下施用。
本发明进一步提供了一种制备本文所述的huTNFR1抑制剂的方法，该方法使用重组的哺乳动物表达系统来表达所述抗体构建体。
具体地，使用生产细胞系，该生产细胞系是真核或哺乳动物细胞系，包括不同来源的细胞系，例如人，如HEK或PER.C6；仓鼠，如CHO或BHK；猴，如COS-1或COS-7；小鼠，如C127、SP2/0或NS0；或酵母，如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)。
具体地，使用CHO生产细胞系。
可选的原核生产细胞系包括，例如大肠杆菌。
本发明进一步提供了用于医疗用途的抑制剂，具体地，用于治疗需要抗TNF疗法的人受试者。
因此，本发明进一步提供了一种治疗需要抗TNF治疗的人受试者的方法，通过施用有效量的本文所述的抑制剂。
具体地，TNFR1特异性抑制剂用作不能使TNFR1交联的TNF拮抗剂，作为用抗TNF疗剂治疗的替代方案。这种TNF拮抗剂，也被认为是生物性TNF拮抗剂，通常提供为治疗用途，其中TNFR1介导的TNF功能在关节、皮肤和肠道的慢性非感染性炎症发病机理中的生物学相关性已经得到证实。
因为可能使药物结合的TNFR1交联并激活TNFR1信号传导，所以由治疗性抗体或天然存在的抗体诱导的药物特异性抗体(ADA)也可能导致不希望的激动活性。因此，优选的抗体构建体缺乏同源二聚化的Fc区或缺乏Fc区，例如Fab或scFv形式，相应的药物组合物不太可能导致交联和对炎症过程的增强的刺激活性。
根据一个具体的实施方式，所述抑制剂向受试者重复施用。
优选地，本文所述的抑制剂或抗体具有低的免疫原性潜力，可以用于治疗受试者而不会诱导对抗体的不期望的免疫应答。
为此，优选的抗体构建体由人源化或人的抗体序列组成，并且例如缺乏同源二聚化的Fc区或缺乏Fc区，例如Fab或scFv形式。相应的药物组合物不太可能导致丧失耐受性(例如，重复施用时)，从而改善治疗剂的安全性和功效。
具体实施方式涉及对受试者进行治疗，该受试者针对治疗性抗体，特别是包括Fc区的、已经用于先前治疗的抗体，具有免疫应答或高水平的抗体。优选地，用本文所述的抗体构建体治疗这些患者，该抗体构建体缺乏同源二聚化的Fc区或缺乏Fc区。
具体地，提供本文所述的抑制剂用于治疗患病的人受试者的医疗用途，所述疾病示出抗TNF疗法或非生物性改变疾病抗风湿药物(DMARD)。具体地，所述医疗用途涵盖：用有效量的抑制剂进行一线治疗，其中示出抗TNF疗法或非生物性DMARD；或作为二线治疗，其中抗TNF或非生物性DMARD疗法失败了。
具体地，受试者患有：
a)关节、皮肤和肠道的急性或慢性炎症(传染性或非传染性)；和/或
b)自身免疫性疾病、类风湿性关节炎、银屑病、银屑病关节炎、幼年型关节炎、强直性脊柱炎、克罗恩病(Morbus Crohn)、多发性硬化症、充血性心力衰竭、代谢病、细胞因子释放综合征、感染性休克、急性和慢性神经退行性疾病、中风、阿尔茨海默病和帕金森病、溃疡性结肠炎、胰腺炎、COPD、急性暴发性病毒或细菌感染、代谢性疾病、慢性神经退行性疾病、TNF/TNFR1作为致病性病理介质的基因遗传病、周期性发热综合征、巨颌症和癌症。
特别地，治疗与上述所列疾病任一者相关的炎性疾病症状。具体地，治疗患有上述a)中的任一种疾病和b)中的任一种疾病的受试者。
根据一个具体的方面，本发明进一步提供了编码本文所述的抑制剂的分离的核酸。具体地，所述核酸可操作地连接至天然情况下不与该核酸一起存在的非编码或编码核酸序列，例如包括异源启动子或调节序列。具体地，所述核酸是人工核酸。
本发明进一步提供了载体，其包括表达盒或质粒，各自均包括编码序列以表达蛋白质构建体，该蛋白质构建体包括多肽或蛋白质或蛋白质衍生物，或由其组成，包括如本文所述的抑制剂抗体的抗原结合位点或VH和/或VL。
本发明进一步提供了宿主细胞，其包括本文所述的表达盒、表达载体或质粒。
本发明进一步提供了一种产生本文所述的抑制剂的方法，其中将所述宿主细胞培养或保持在产生所述抗体的条件下。
特别优选的是，宿主细胞和使用该宿主细胞的产生方法，该宿主细胞包括：
-表达载体，其并入了编码序列以表达抗体轻链；和
-表达载体，其并入编码序列以表达抗体重链。
根据一个具体的方面，本发明进一步提供了一种重组的宿主细胞，其包括本文所述的核酸或表达载体。
附图说明
图1.H398和ATROSAB与人TNFR1-Fc的结合。a)通过标准ELISA分析ATROSAB和H398的平衡结合(n＝3，平均值±SD)。在高受体密度(195Hz)的条件下测试ATROSAB(b)和H398(c)的QCM结合动力学。使用3.9nM和62.5nM之间的五种浓度，一式三份。
图2.通过ATROSAB和H398抑制TNF的作用。随着ATROSAB和H398浓度增加，抑制由0.1nM TNF(a)和LTα(b)诱导的HT1080细胞分泌IL-8。n＝3的实验数据显示为由TNF或LTα单独引发的最大IL释放的百分比。
图3.在低受体密度下的结合动力学。在48Hz的受体密度下，通过QCM测定Atrosab(a)和H398(b)与人TNFR1-Fc的亲和力。
图4.scFvIZI06.1(VH：SEQ ID 20，VL：SEQ ID 21)与亲本VH和VL序列以及亲和力成熟的变体的序列比对。a)比对ATROSAB(scFvIZI06.1)、scFvIG11、scFvT12B和scFvFRK13.7的VH序列；b)VL序列的比对。残基根据Kabat编号方案编号，点表示与scFvIZI06.1相比相同的氨基酸。4个或更多氨基酸的序列如下所示。scFvFRK13.7的FR1中的序列：SASV(SEQ ID 36)；DRVT(SEQ ID 37)。scFvFRK13.7的FR3中的序列：SLQP(SEQ ID38)。
图5.文库EP03的选择。在每轮选择后，在ELISA中分析扩增的噬菌体库与人TNFR1-Fc的总结合(a)。选择的候选物表达为可溶性scFv形式，并在QCM测量中测试其与人TNFR1-Fc的结合(b)。显示了多次重复的单个实验的平均值和SD，scFvIZI06.1和scFvIG11在b中用作对照。
图6.scFvT12B的表达和表征。A)scFvT12B以及对照抗体scFvIZI06.1和scFvIG11的考马斯染色的SDS-PAGE(12％)。在ELISA(b)和QCM分析(c)中测试了与人TNFR-Fc的结合，其中显示了测量(虚线)和拟合(实线)。在d)中证明了抑制TNF(0.1nM)诱导的IL-8释放。B)和d)显示了以一式两份进行的两个(d)或三个(b)单独实验的平均值和SD。
图7.scFvIZI06.1(VH：SEQ ID 20，VL：SEQ ID 21)与人源化序列的比对。将VH(a)和VL(b)的人源化序列与ATROSAB的单链可变片段的序列进行比对。相同的残基用点表示。4个或更多氨基酸的序列如下所示。在FRK13.1和FRK13.2的VH(a)FR1中的序列：GGLV(SEQ ID39)。在FRK13.1和FRK13.2的VH(a)FR3中的序列：NAKNSL(SEQ ID40)、LQMN(SEQ ID 41)。在FRK13.1和FRK13.2的VL(b)FR1中的序列：SASV(SEQ ID 36)、DRVT(SEQ ID 37)。在FRK13.1和FRK13.2的VL(b)FR3中的序列：SLQP(SEQ ID 38)。
图8.人源化scFv抗体的产生。A)与scFvT12B组合的人源化scFv变体的基因型。在适当表达的情况下，通过SDS-PAGE(b，12％，考马斯染色)分析纯化的scFv片段，随后通过SEC(c，Yarra SEC-2000柱，流速0.5ml/min)进行分析。
图9.与人TNFR1的结合以及对人TNFR1的阻断。通过ELISA测试人源化的scFv抗体与人TNFR1-Fc的结合(a)，以及抑制由TNF(0.1nM)诱导的HT1080细胞的IL-8释放(b，仅对强结合的scFv进行)。scFvIZI06.1和scFvT12B作为对照(显示了平均值和SD，n＝3)。
图10.人源化的scFv片段的热稳定性。通过动态光散射分析scFv抗体的分子稳定性。通过目视判读所显示的数据点，来确定Tm。
图11.IgG13.7和Fab13.7的表达和纯化。表达和纯化通过SDS-PAGE(a，12％分离凝胶，还原条件；b，8％分离凝胶，还原条件)和尺寸排阻色谱(c，Yarra SEC-2000柱，流速0.5ml/min)来评估。根据已知质量和保留时间的标准蛋白，内插指示分子量。
图12.scFv13.7衍生物的物种选择性。在标准ELISA中，测试了IgG13.7和Fab13.7与人和小鼠来源的TNFR1和TNFR2两者的结合。显示了两个单独实验的平均值和SD。
图13.FRK13.7抗体与人TNFR1-Fc的平衡结合。在ELISA中，测试了渐增的浓度与huTNFR1-Fc的结合(n＝3，平均值±SD)。
图14.来自scFvFRK13.7的IgG和Fab的QCM分析。使用石英晶体微天平，收集了ATROSAB(a)、FabATR(b)、IgG13.7(c)和Fab13.7(d)与人TNFR1-Fc相互作用的实时动力学数据。一式三份地分析了64nM和4nM之间的浓度(ATROSAB和IgG13.7)或128nM至8nM之间的浓度(FabATR和Fab13.7)。
图15.FRK13.7抗体的生物活性。a和b中显示了由FRK13.7抗体形式引发的HT1080细胞的IL-8释放(尺寸增加以显示低和非激动构建体)，以及HeLa细胞的IL-6释放(c)。TNF、ATROSAB和FabATROSAB(FabATR)作为对照。显示了两个单独实验的平均值和SD。
图16.Fab13.7对TNF诱导的白细胞介素释放的抑制。显示了对0.1nM TNF诱导的IL-8(a)和IL-6释放(b)的抑制。ATROSAB和FabATROSAB(FabATR)作为对照。显示了三个单独实验的平均值和SD。
图17.Kym-1细胞毒性的诱导和抑制。通过对剩余贴壁细胞进行KV染色，分析了IgG13.7和Fab13.7在Kym-1细胞中引发细胞死亡的潜力(a)。在相同的分析中，分析了Fab13.7抑制0.01nM TNF诱导的细胞毒性的抑制潜力(b)。ATROSAB和FabATR作为对照。显示了两到三个单独实验的平均值和SD(刺激细胞毒性[a]n＝2，抑制[b]n＝3)。
图18.ATROSAB和Fab13.7的交联。通过ELISA，证明了Fab特异性多克隆山羊血清与Fab3.7的浓度依赖性结合(a)。在IL-8释放分析中，使用64μg/ml的Fab特异性山羊血清，分析了交联的Fab13.7对HT1080的影响，并与ATROSAB进行比较(n＝2，平均值±SD)。
图19.Fab13.7和FabATR的药代动力学研究。使用在小鼠基因的基因座处纯合性携带人TNFR1细胞外结构域的C57BL/6J小鼠(n＝3)，测定单剂量注射(25μg)后的初始和终末血浆半衰期，以及ATROSAB的生物利用度(曲线下的面积)。通过ELISA检测了血清样品中剩余的活性抗体。
图20.Fab13.7PEG的产生和生物活性。a)Fab13.7PEG的基因型。b)通过SDS-PAGE(12％，考马斯染色)分析纯化蛋白的聚乙二醇(PEG)修饰。使用不同的TCEP(三(2-羧乙基)膦)浓度和不同长度(5kDa、20kDa、40kDa)的PEG链。c)通过ELISA测试Fab13.7PEG与人TNFR1-Fc的结合(n＝3，平均值±SD)。d)使用0.1nM重组人TNF，分析了由Fab13.7PEG引发的HeLa细胞的IL-6释放，以及对TNF诱导的IL-6释放的抑制(e，n＝3，平均值±SD)。f)使用在小鼠基因的基因座处纯合性携带人TNFR1的细胞外结构域的C57BL/6J小鼠(n＝3)，测定了单剂量注射(25μg)后的初始和终末血浆半衰期，以及Fab13.7PEG和参比蛋白Fab13.7和ATROSAB的生物利用度(曲线下的面积)。通过ELISA检测了血清样品中剩余的活性抗体。
图21.Fab13.7-MSA的产生和生物活性。a)Fab13.7-MSA的基因型。b)通过SDS-PAGE(12％，考马斯染色)，随后通过SEC(c，Yarra SEC-2000柱，流速0.5ml/min)分析了纯化的蛋白。d)通过ELISA，测试了Fab13.7-MSA与人TNFR1-Fc的结合(n＝2，平均值±SD)。e)使用0.1nM重组人TNF，分析了由Fab13.7-MSA引发的HT1080细胞的IL-8释放(n＝1，重复的平均值±SD)，以及对TNF诱导的IL-8释放的抑制(f，n＝2，平均值±SD)。g)使用在小鼠基因的基因座处纯合性携带人TNFR1的细胞外结构域的C57BL/6J小鼠(n＝3)，测定了单剂量注射(25μg)后初始和终末血浆半衰期，以及Fab13.7-MSA和参比蛋白Fab13.7和ATROSAB的生物利用度(曲线下的面积)。通过ELISA检测了血清样品中剩余的活性抗体。
图22.IgG13.7半的产生和生物活性。a)IgG13.7半的基因型。b)通过SDS-PAGE(12％，考马斯染色)，随后通过SEC(c，Yarra SEC-2000柱，流速0.5ml/min)分析了纯化的蛋白。d)通过ELISA测试了IgG13.7半与人TNFR1-Fc的结合(n＝2，平均值±SD)。e)使用0.1nM重组人TNF，分析了由IgG13.7半引发的HT1080细胞的IL-8释放(n＝1，重复的平均值±SD)，以及对TNF诱导的IL-8释放的抑制(f，n＝2，平均值±SD)。g)使用在小鼠基因的基因座处纯合性携带人TNFR1的细胞外结构域的C57BL/6J小鼠(n＝3)，测定了单剂量注射(25μg)后初始和终末的血浆半衰期，以及IgG13.7半和参比蛋白Fab13.7和ATROSAB的生物利用度(曲线下的面积)。通过ELISA检测了血清样品中剩余的活性抗体。
图23.Fab13.7-Fckih0DS的产生和生物活性。a)Fab13.7-Fckih0DS的基因型。b)通过SDS-PAGE(12％，考马斯染色)，随后通过SEC(c，Yarra SEC-3000柱，流速0.5ml/min)分析了纯化的蛋白质。d)通过ELISA测试了Fab13.7-Fckih0DS与人TNFR1-Fc的结合(n＝2，平均值±SD)。e)使用0.1nM重组人TNF，分析了Fab13.7-Fckih0DS引发的HT1080细胞的IL-8释放(n＝2，平均值±SD)，以及对TNF诱导的IL-8释放的抑制(f，n＝2，平均值±SD)。g)使用在小鼠基因的基因座处纯合性携带人TNFR1的细胞外结构域的C57BL/6J小鼠(n＝3)，测定单剂量注射(25μg)后初始和终末血浆半衰期，以及Fab13.7-Fckih0DS和参比蛋白Fab13.7和ATROSAB的生物利用度(曲线下的面积)。通过ELISA检测了血清样品中剩余的活性抗体。
图24.Fv13.7-Fckih0DS的产生和生物活性。a)Fv13.7-Fckih0DS的基因型。b)通过SDS-PAGE(12％，考马斯染色)，随后通过SEC(c，Yarra SEC-3000柱，流速0.5ml/min)分析了纯化的蛋白。d)通过ELISA测试了Fv13.7-Fckih0DS与人TNFR1-Fc的结合(n＝1，重复的平均值±SD)。e)使用0.1nM重组人TNF，分析了由Fv13.7-Fckih0DS引发的HT1080细胞的IL-8释放(n＝2，平均值±SD)，以及对TNF诱导的IL-8释放的抑制(f，n＝2，平均值±SD)。g)使用在小鼠基因的基因座处纯合性携带人TNFR1的细胞外结构域的C57BL/6J小鼠(n＝3)，测定了单剂量注射(25μg)后初始和终末血浆半衰期，以及Fv13.7-Fckih0DS和参比蛋白Fab13.7和ATROSAB的生物利用度(曲线下的面积)。通过ELISA检测了血清样品中剩余的活性抗体。
图25.抗体序列(SEQ ID 1～33)
SEQ ID 1：H398或ATROSAB的CDRH1
SEQ ID 2：H398或ATROSAB的CDRH2
SEQ ID 3：H398或ATROSAB的CDRH3
SEQ ID 4：H398或ATROSAB的CDRL1
SEQ ID 5：H398或ATROSAB的CDRL2
SEQ ID 6：H398或ATROSAB的CDRL3
SEQ ID 7：SEQ ID 2的CDRH2变体
SEQ ID 8：SEQ ID 6的CDRL3变体
SEQ ID 9：CDRH2变体IG11
SEQ ID 10：CDRH2变体T12B或Fab13.7
SEQ ID 11：CDRL3变体T12B
SEQ ID 12：IG11的VH序列
SEQ ID 13：T12B或13.5或13.7的VH序列
SEQ ID 14：13.1或13.3或13.6的VH序列
SEQ ID 15：13.2或13.4或13.8的VH序列
SEQ ID 16：IG11的VL序列
SEQ ID 17：T12B或13.6或13.8的VL序列
SEQ ID 18：13.1或13.4或13.5的VL序列
SEQ ID 19：13.2或13.3或13.7的VL序列
SEQ ID 20：scFvIZI06.1的VH序列
SEQ ID 21：scFvIZI06.1的VL序列
SEQ ID 22：ATROSAB VH
SEQ ID 23：ATROSAB VL
SEQ ID 24：人IgG Fc
SEQ ID 25：Fab13.7的重链
SEQ ID 26：Fab13.7的轻链
SEQ ID 27：Fab13.7PEG的重链
SEQ ID 28：Fab13.7-MSA的重链
SEQ ID 29：IgG13.7半的重链
SEQ ID 30：Fd13.7-Fc0DS
SEQ ID 31：LC13.7-Fc0DS
SEQ ID 32：VH13.7-Fc0DS
SEQ ID 33：VL13.7-Fc0DS
SEQ ID 34：Fab13.7修饰以插入PEG
SEQ ID 35：铰链0Ds
SEQ ID 36：scFvFRK13.7的FR1中引入的序列
SEQ ID 37：scFvFRK13.7的FR1中引入的序列
SEQ ID 38：scFvFRK13.7的FR3中引入的序列
SEQ ID 39：FRK13.1和FRK13.2的FR1中引入的序列
SEQ ID 40：FRK13.1和FRK13.2的FR3中引入的序列
SEQ ID 41：FRK13.1和FRK13.2的FR3中引入的序列
SEQ ID 42～44：经修饰的铰链区
本文使用的术语具有以下含义：
VH CDR1＝CDRH1
VH CDR2＝CDRH2
VH CDR3＝CDRH3
VL CDR1＝CDRL1
VL CDR2＝CDRL2
VL CDR3＝CDRL3
除非另有说明，否则本文提到的CDR序列是根据Kabat编号的，即根据Kabat命名法确定(参见Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，PublicHealth Service，U.S.Department of Health and Human Services(1991))，特别是附图中列出的那些CDR序列。应当理解，本发明和权利要求书的范围还应涵盖相同的抗体和CDR，但具有不同的编号和命名的CDR区，其中CDR区根据IMGT系统定义(The internationalImMunoGeneTics，Lefranc等，1999，Nucleic Acids Res.27：209-212)。
具体实施方式
除非本文另有说明或与上下文明显矛盾，否则在描述本发明的内容中(特别是在以下权利要求书的内容中)，术语“一(a)”和“一(an)”和“所述/该/上述(the)”以及类似指代的使用应被解释为涵盖单数和复数。
除非另有说明，否则术语“包括(comprising)”、“具有(having)”、“包括(including)”和“包含/含有/含(containing)”应被解释为开放式术语(即，意味着“包括，但不限于”)。为了本发明的目的，认为术语“由......组成”是术语“包括”优选的实施方式。如果在下文中，一组被定义为包括至少一定数量的实施方式，则这意味着还涵盖优选仅由这些实施方式组成的一组。
在本文中，“抑制剂”被描述为“抗体构建体”或“抗体”。本文所用的术语“抗体构建体”也简称为“抗体”或“本发明的抗体”，是指非天然存在的抗体，其是经改造以单价结合huTNFR1靶标的人工构建体，或通过将天然存在的抗体切割成片段获得。为此，术语“抗体”理解为包括由抗体结构域组成或包括抗体结构域的多肽或蛋白质，其中抗体结构域理解为具有或不具有接头序列的、免疫球蛋白的重链和/或轻链的恒定结构域和/或可变结构域。如果包括β-桶状结构，其中β-桶状结构由通过环状序列连接的抗体结构域结构的至少两个β-链组成，则多肽理解为抗体结构域。抗体结构域可以具有天然的结构，或通过诱变或衍生化作用来修饰，例如，修饰抗原结合特性或任何其他特性，例如稳定性或功能特性，例如与Fc受体FcRn和/或Fcγ受体的结合。
本文所用的抗体构建体包括至少一个抗原结合部分，其中抗体的仅一个抗原结合部分识别huTNFR1靶标。因此，所述抗体构建体与huTNFR1受体的结合仅是单价的。特别地，所述抗原结合部分包括抗原结合位点或携带抗原结合位点的抗体结构域。可以单独或组合使用任何可变抗体结构域来构建抗原结合位点。具体地，通过CDR序列的组合形成抗原结合位点。CDR序列的这种组合也理解为CDR结合位点，例如，由一个可变结构域的三个CDR序列形成的抗原结合口袋，例如CDRH1、CDRH2和CDRH3的组合，或CDRL1、CDRL2和CDRL3的组合，或两个可变结构域的六个CDR序列形成，例如CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2和CDRL3的组合。或者，可以使用这样的抗原结合位点，其来自受体的天然配体或是人工构建体。
具体地，单个可变抗体结构域的CDR结合位点可以用作抗原结合位点，例如可变区的重链和轻链结构域的结合位点(例如dAb、Fd、VL、Vκ、Vλ、VH、VHH)，或成对的可变抗体结构域的结合位点，例如VH/VL对。
因此，包括CDR结合位点的抗体构建体可以包括单个可变抗体结构域或一对可变结合结构域，任选地进一步包括其它可变结构域(但具有不同的抗原结合特异性)，即双特异性或多特异性抗体构建体，其中只有一个抗原结合位点针对huTNFR1，而至少一个其他的抗原结合位点针对不同于huTNFR1的其它靶标，因为本文进一步描述的抗体构建体仅单价结合huTNFR1靶标。任选地，所述抗体构建体还包括恒定抗体结构域，或可变和/或恒定抗体结构域的组合，具有或不具有连接序列或铰链区。示例性的抗体构建体是Fab、F(ab′)、(Fab)2、scFv、Fv或全长抗体。
示例性的单价、单特异性结合物是Fab、scFv、Fv、结构域抗体、IgG半抗体或单价IgG，例如由一条完整的轻链、一条完整的重链和缺少Fd(Fd＝VH-CH1)的额外的Fc链组成的单臂IgG，其中的Fc链可以根据杵臼技术(或其他不对称Fc部分)来产生以避免重链的同源二聚化。
也可以使用二价形式，其中仅一个效价识别TNFR1靶标，而另一个效价识别不同的靶标。因此，可以使用包括两个或更多个抗原结合位点的双特异性或寡特异性构建体，只要仅有一个抗原结合位点针对TNFR1受体即可。
术语“全长抗体”用于指任何二价抗体分子，其包括至少大部分Fc结构域以及在天然存在的抗体单体中常见的其他结构域。该表述在本文中用于强调具体的抗体分子不是抗体片段。
本文中术语“Fv”理解为可变结构域的区域，其并入了例如VH、VL或VH/VL的CDR结合位点。因此，术语“Fv”特别适用于VH、VL或VH/VL，其是通过两个可变结构域的β-折叠结构之间使用或不使用接头进行相互作用而与VL结构域相关联的VH结构域。
此外，术语“抗体”应具体包括分离形式的抗体，基本上不含针对不同靶抗原或包括抗体结构域的不同结构排列的其他抗体。此外，分离的抗体可以包含在组合制剂中，组合制剂包含分离的抗体，例如与至少一种其他抗体(例如具有不同特异性的单克隆抗体或抗体片段)的组合，或其他治疗活性物质和/或辅助剂的组合。
术语“抗体”应适用于动物来源(包括人种)，例如哺乳动物，包括人、鼠、兔、山羊、羊驼、牛和马，或禽类，例如母鸡的抗体，该术语应特别包括基于动物来源的序列(例如人序列)的重组抗体。特别地，该术语适用于包括人源化或人序列或由其组成的抗体构建体，这在抗体构建体用于治疗人受试者的药物目的时，是优选的。
在一些实施方式中，可以使用具有不同物种来源的序列的嵌合抗体，例如鼠和人来源的序列。
关于抗体使用的术语“嵌合”是指如下抗体，在该抗体中，重链和轻链的氨基酸序列各自的一部分与来自特定物种或属于特定类别的抗体中的相应序列同源，而链的剩余部分与另一物种或类别的相应序列同源。通常，轻链和重链两者的可变区模拟来自一种哺乳动物的抗体的可变区，而恒定部分与来源于另一种哺乳动物的抗体序列同源。例如，可变区可以来源于目前已知的来源，使用来自容易获得的非人宿主生物的B细胞或杂交瘤，与来源于例如人细胞制剂的恒定区组合。
关于抗体使用的术语“人源化”是指具有基本上来源于非人种免疫球蛋白的抗原结合位点的分子，其中分子的剩余免疫球蛋白结构是基于人免疫球蛋白的结构和/或序列。抗原结合位点可以包括融合到恒定结构域上的完整的可变结构域，或者仅包括移植到可变结构域中的适当骨架区上的互补决定区(CDR)。抗原结合位点可以是野生型或经修饰的，例如，通过一个或多个氨基酸替换，优选地经修饰以更接近地与人免疫球蛋白类似。人源化抗体的一些形式保留了所有CDR序列(例如人源化的小鼠抗体包括来自小鼠抗体的所有六个CDR)。其他形式具有相对于原始抗体发生改变的一个或多个CDR。
对抗体的人源化技术没有限制，只要抗体与期望抗原结合即可。人源化的实例包括但不限于互补决定区移植(CDR移植)(Jones等，1986，Nature 321，522-525)、特异性决定残基移植(SDR移植)(Kashmiri等，2005，Methods 36，25-34)、可变结构域重构(Roguska等，1994，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91，969-973)、通过CDR移植进行的基于结构的选择和人源化(Hwang等，2005，Methods 36，35-42)以及去免疫策略(Hellendom等，2004，Cancer CellInternational 4(Suppl.I)，20)。
在本发明的一个具体实施方式中，本文所述的抗体是人源化的抗体，其包含人源的氨基酸序列和非人源(例如啮齿动物来源)的氨基酸序列。
在一个优选的实施方式中，本文所述的抗体可以包括Fc区，所述Fc区来源于通过例如重组核酸技术获得的人源化的抗体。在这方面，抗体或其至少一个片段可以包含一个或多个突变或变异，例如被添加、缺失或替换的氨基酸或核酸，只要对与huTNFR1的相互作用没有负面影响即可。进一步地，抗体可以包含一个或多个突变或变异，例如被添加、缺失或替换的氨基酸或核酸，其对huTNFR1的相互作用具有正面影响并且改善了所述分子的拮抗活性。特别地，这种经突变的变体具有更好的亲和力和/或更好的抑制活性。
例如，所述抗体可以是具有与鼠抗体H398相同的结合特异性的人源化抗体，但单价结合靶标huTNFR1，并且优选地来自H398，使用H398抗体作为亲本抗体。尽管结合特异性优选是相同的，但精确的特异性可能由于人源化或其他突变技术而发生改变。
小鼠抗人TNFR1单克隆抗体H398的特征在于如WO2008113515A2中描述的VH和VL序列。人源化后，获得人源化的VH和VL序列，其特征在于如WO2008113515A2中描述的序列(IZI-06.1 VH(SEQ ID 20)，IZI-06.1VL(SEQ ID 21))。人源化的抗体已经转化为IgG1分子(ATROSAB)，该IgG1分子包含缺乏介导效应子功能的经修饰的Fc区，而特征仍然在于为IZI-06.1 VH和IZI-06.1 VL的VH和VL序列。WO2008113515A2的序列通过引用并入本文。
在CHO细胞中产生的经纯化的ATROSAB，对人和恒河猴的TNFR1-Fc融合蛋白以及用重组TNFR1融合蛋白转染的小鼠胚胎成纤维细胞显示出强有力的结合，亲和力与亲本小鼠抗体H398相同。使用嵌合的人/小鼠TNFR1分子，ATROSAB的表位定位于N-末端区域(氨基酸残基1～70)，包括第一富含半胱氨酸的结构域(CRD1)和CRD2的A1亚结构域。在体外，ATROSAB有效地抑制典型的TNF介导的响应，如凋亡诱导和NFκB依赖性基因表达的激活，如IL-6和IL-8的产生。
由于H398或ATROSAB抗体的特征在于高亲合力，但通过QCM在生理条件下测量Fab形式(例如，如果抗原结合位点以相应的Fab片段的形式来提供)时具有中等亲和力，因此目的是通过增强对TNFR1的亲和力来改善治疗潜力。然而，当ATROSAB的亲和力成熟后，发现以更高亲和力与TNFR1结合的完整的二价衍生物是高度激动的，这会对患者的治疗带来问题。
本文所述的抗体单价结合靶标，从而令人惊讶地克服了高亲和力的激动活性问题，即使当抗体与受体的解离很低(低k解离速率)时也是如此。
优选地，本文所述的抗体具有与表位结合的特异性，包括huTNFR1的至少膜远端CRD1以及CDR2的亚结构域A1，或基本上由其组成。
在一个具体的实施方式中，本文所述的抗体包括H398的一个或多个互补决定区(CDR)，(例如WO2008/113515A2中所述的)或其部分，赋予与huTNFR1的结合。H398或ATROSAB的CDR可以以任何组合存在，例如可以存在所述CDR中的两个、三个、四个、五个或六个。另外，在本文所述的huTNFR1-抗体中可以存在任何CDR的多个拷贝或遗传变体，只要抗体对人TNFR1显示出足够的亲和力即可。
关于抗体使用的术语“人”理解为包括如下抗体，该抗体具有源自人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区。例如在CDR中，本文所述的人抗体可包括不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外随机或位点特异性诱变，或通过体内体细胞突变引入的突变)。人抗体包括从人免疫球蛋白文库中，或从一种或多种人免疫球蛋白转基因的动物中，分离的抗体。
术语“抗体”具体包括任何类别或亚类的抗体。取决于抗体重链的恒定结构域的氨基酸序列，可以将抗体指定为主要抗体类别IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且其中一些可以进一步分为亚类(同种型)，例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。
该术语进一步适用于单克隆或多克隆抗体，特别是重组抗体，该术语包括通过重组方法制备、表达、产生或分离的所有抗体和抗体结构，例如源自动物，例如哺乳动物包括人的抗体，其包括来自不同来源的基因或序列，例如鼠、嵌合的、人源化的抗体或杂交瘤衍生的抗体。其他实例是指从经转化以表达抗体的宿主细胞中分离的抗体，或从抗体或抗体结构域的重组、组合文库中分离的抗体，或通过任何其他方法制备、表达、产生或分离的抗体，其中该任何其他方法涉及将抗体基因序列剪接到其他DNA序列中。
应当理解，术语“抗体”还指抗体的衍生物，特别是功能活性衍生物。抗体衍生物理解为一种或多种抗体结构域或抗体和/或融合蛋白的任何组合，其中可以在一种或多种其他蛋白或化学物质(例如其他抗体，例如包括CDR环的结合结构、受体多肽，以及配体、支架蛋白、酶、毒素等)的任何位置处融合或连接抗体的任何结构域。可以通过各种化学技术，例如共价偶联、静电相互作用、二硫键键合等，与其他物质连接或结合，来获得抗体的衍生物。与抗体结合的其他物质可以是脂质、碳水化合物、核酸、有机和无机分子，或其任何组合，例如前药或药物。具体的实施方式涉及将抗体与亲水性聚合物结合，以获得与亲水性聚合物(例如PEG)偶联和/或与多肽(例如人血清白蛋白、转铁蛋白、Ig结合结构域、PEG模拟多肽延伸物、抗体Fc片段，或任何前述多肽的功能变体)融合的抗体构建体的功能活性衍生物。这种功能活性衍生物是例如PEG化、HES化或PSA化的抗体构建体。通过与半衰期延长部分(例如聚乙二醇(PEG化)、糖基化PEG、羟乙基淀粉(HES化)或聚唾液酸(PSA))连接，来修饰这些抗体构建体。具体地，通过与半衰期延长部分的一个或多个分子共价连接，来产生衍生物。
根据一个具体的方面，本文所述的抗体构建体包括功能活性Fc变体，所述功能活性Fc变体源自人IgG Fc(SEQ ID 24)的任何天然存在的变体。
可以通过改变上述序列来获得功能活性Fc变体，并且功能活性Fc变体的特征在于具有与相应序列所显示的生物活性相似的生物学活性，包括使抗体稳定或赋予延长的半衰期的能力。在本文所述的抗体中使用的优选的Fc变体包括降低Fc效应子功能的突变。
功能活性衍生物特别通过不改变抗体本身的一级氨基酸序列的融合或共价化学修饰来产生。衍生物可以例如具有所需的性质，包括例如延长循环半衰期、增强稳定性、降低清除率或改变免疫原性。
在本发明的一个具体的实施方式中，huTNFR1抗体包括额外的标签(tag)，允许与生物学上可接受的化合物特异性相互作用。关于可在本发明中使用的标签没有特别的限制，只要它对huTNFR1-抗体与huTNFR1的单价结合或当施用于人时的免疫原性响应没有负面影响或负面影响可以忽略。合适的标签的实例包括His-标签、Myc-标签、FLAG-标签、Strep-标签、钙调蛋白-标签、GST-标签、MBP-标签和S-标签。
本文所述的抗体可以与标记物或报道分子缀合，所述标记物或报道分子例如选自由有机分子、酶标记物、放射性标记物、有色标记物、荧光标记物、生色标记物、发光标记物、半抗原、地高辛、生物素、金属络合物、金属、胶体金及其混合物组成的组。与标记物或报道分子缀合的抗体可用于例如分析系统或诊断方法中。
本文所述的抗体可以与其他分子缀合，允许在例如结合分析(例如ELISA)和结合研究中容易地检测到所述缀合。
应当理解，术语“抗体”还指抗体的变体，包括具有亲本CDR序列的功能活性CDR变体和亲本抗体的功能活性变体抗体。
具体地，可以使用源自本文所述抗体的抗体，比如它的CDR序列和任选地它的VH和/或VL序列。因此，示例性抗体可以用作亲本抗体以获得衍生物，其中产生保持功能活性的一种或多种CDR区或CDR变体。
源自亲本抗体或抗体序列(例如亲本CDR或FR序列)的抗体在本文中特别理解为，通过例如生物信息学或重组工程，或通过化学衍生或合成而获得的亲本序列的突变体或变体。
具体地，源自本文所述抗体的抗体可以包括它的至少一个或多个CDR区或CDR变体，例如，重链可变区的至少3个CDR和/或轻链可变区的至少3个CDR，同时在至少一个CDR或FR区中或在HC或LC的恒定区中具有至少一个点突变，且是功能活性的。
术语“变体”特别指通过以下方法获得的抗体，例如突变抗体或抗体片段，例如诱变方法，特别是缺失、替换、将插入物引入特定抗体氨基酸序列或区域中或使氨基酸序列化学衍生化，例如在恒定结构域中进行以改造抗体稳定性、效应子功能或半衰期，或在可变结构域中进行以改善抗原结合特性，例如本领域可用的亲和力成熟技术。可以使用任何已知的诱变方法，包括例如通过随机化技术获得的在所需位置的点突变。在某些情况下，随机选择位置，例如用任何可能的氨基酸或选择优选的氨基酸，以使抗体序列随机化。术语“诱变”是指用于改变多核苷酸或多肽序列的任何本领域公认的技术。优选的诱变类型包括易错PCR诱变、饱和诱变或其他定点诱变。
术语“变体”具体包括功能活性变体。
本文所用的术语CDR序列的“功能活性变体”理解为“功能活性CDR变体”，并且本文所用的抗体的“功能活性变体”理解为“功能活性抗体变体”。功能活性变体是指通过对该序列(亲本抗体或亲本序列)进行修饰而产生的序列，其中的修饰通过以下方式进行：插入、缺失或替换一个或多个氨基酸，或化学衍生化一个或多个氨基酸残基来进行修饰，或对核苷酸序列内的核苷酸，或序列任一末端或两个末端进行修饰，例如对CDR序列的N-末端和/或C-末端的1或2个氨基酸，和/或中心的1个或氨基酸(即在CDR序列的中间)进行修饰，这些修饰不影响特别是不损害该序列的活性。在结合位点对所选靶抗原具有特异性的情况下，尽管可以改变结合特异性，例如改变对特定表位的精细特异性、亲和力(affinity)、亲合力(avidity)、K结合或K解离速率等，但抗体的功能活性变体仍然具有相同或预定的结合特异性。例如，亲和力成熟的抗体特别理解为功能活性的变体抗体。因此，在亲和力成熟的抗体中的经修饰的CDR序列理解为功能活性的CDR变体。
在优选的实施方式中，亲本抗体的功能活性变体：
a)是所述抗体的生物活性片段，该片段包括分子序列的至少50％，优选地至少60％，至少70％，至少80％，至少90％，或至少95％，最优选地至少97％、98％或99％；
b)是源自所述抗体但具有至少一个氨基酸替换、添加和/或缺失，其中功能活性变体与所述抗体的分子或一部分具有序列同一性，例如具有至少50％序列同一性的抗体，优选地具有至少60％，更优选地至少70％，更优选地至少80％，还更优选地至少90％，甚至更优选地至少95％，最优选地至少97％、98％或99％序列同一性的抗体；和/或
c)由所述抗体或其功能活性变体，和额外的与多肽或核苷酸序列异源的至少一个氨基酸或核苷酸组成。
在本发明一个优选的实施方式中，本文所述的抗体的功能活性变体与上述变体基本相同，但与其多肽或核苷酸序列不同，因为其源自不同物种的同源序列。
具体地，本文所述的功能活性的抗体构建体、变体或衍生物在TNFR1抗原结合方面具有功能活性，特别具有高结合亲和力(特别是由KD和k解离速率所确定的)，并且还考虑避免任何潜在的激动副作用(例如在基于细胞的分析中所测定的)。用于测定抑制TNFR1介导的细胞死亡的示例性分析使用Kym-1细胞。其他用于测定TNF-或LTα-介导的炎症响应的示例性分析分别测定了对HeLa细胞或HT1080细胞的IL-6或IL-8释放的抑制。这些分析在实施例部分中进行了列举说明。
例如通过改变亲本抗体的序列，可以获得功能活性变体，例如包括与图中所列任何抗体相同的结合位点的抗体，但在结合位点之外的抗体区域内具有修饰；或者，源自这样的亲本抗体，通过在结合位点内进行修饰但不损害抗原结合；功能活性变体优选地具有与亲本抗体基本相同的生物活性或甚至改善的活性，包括特异性或选择性结合TNFR1抗原的能力，例如具有高亲和力，任选地通过高结合和低解离来结合抗原。
本文所述的抗体构建体的主要功能是作为TNF-huTNFR1相互作用的抑制剂来起作用。本文中术语“抑制剂”理解为通过抑制TNFR1信号传导或不同的机制而具有如下能力的物质：
a)在体外和/或体内调节(例如减少或消除)TNFR1信号传导，和/或
b)在体外和/或体内抑制TNFR1介导的细胞死亡，和/或
c)在体外和/或体内抑制TNF介导的细胞刺激以释放炎性细胞因子。
根据本发明，这种能力或功能特别地认为是所需的生物活性。特别地，本文所述的抑制剂干扰一个或多个分子TNF与细胞表面的一个或多个TNFR1分子的结合。对于治疗应用，在不受理论束缚的情况下，本发明的TNF-huTNFR1相互作用抑制剂可以在TNF存在下抑制huTNFR1信号传导，或在TNF存在下抑制huTNFR1介导的细胞死亡，或在TNF存在下抑制细胞刺激以释放炎性细胞因子。无论潜在的机制如何，TNF-huTNFR1相互作用抑制剂的抗炎活性都可以治疗炎性紊乱或疾病。通过下调或阻断TNF-huTNFR1的蛋白-蛋白相互作用，可以实现对炎性疾病的作用。
本文所用的术语“信号传导”和“信号转导”代表这样的生物化学过程，其涉及经由细胞表面受体，通过特定的和连续的系列分子将细胞外刺激传递至细胞核中的基因，导致对刺激产生特定的细胞响应。
如在离体的细胞分析或在体内以剂量依赖性方式所测量的，抑制huTNFR1相互作用可以导致下调TNFR1信号传导或信号转导的作用。如在离体的细胞分析中测定的，抑制剂或抗体构建体以及变体或衍生物的功能活性的特征在于抑制功能，其在体内抑制TNF-huTNFR1相互作用或LTα-huTNFR1相互作用。可以采用其他的分析来排除与交联的TNFR1受体相关的实质性副作用，交联的TNFR1受体会激动(agonise)TNF-TNFR1相互作用。合适的分析是测定抗体或变体对HeLa或HT1080细胞的活性，在不存在使HeLa或HT1080细胞分别产生炎性细胞因子IL-6或IL-8的刺激活性。在下面的实施例部分描述了示例性测试。
抑制通常导致huTNFR1相互作用或活性的效果减少至少50％，或至少60％，或至少70％，或至少80％，或至少90％，或最大水平。产生和表征本文所述的抑制剂或抗体的方法是本领域已知的。在一个优选的实施方式中，通过利用表达huTNFR1的细胞的一种或多种细胞分析，或通过体内分析，产生并筛选具有预定义性质的抗体变体。对于这样的分析，通常外源地添加抗体，使得例如在存在和不存在TNF的情况下，可以结合细胞以确定拮抗和激动活性。这些分析通常基于免疫球蛋白的功能；也就是说，抗体与huTNFR1结合并介导一些生化事件的能力，例如阻断TNF与所述细胞结合(例如在竞争性结合分析中)、TNF/受体结合抑制、存在或不存在TNF时细胞因子(特别是炎性白细胞介素如IL-6或IL-8)表达的减少、细胞凋亡等。
这些分析通常涉及监测细胞对抗体的响应，例如细胞存活、细胞死亡、细胞形态的变化或转录激活，例如天然基因或报道基因的细胞表达。对于一些分析，除靶细胞之外，可能需要添加其他的细胞或组分，例如血清补体或效应子细胞，例如外周血单核细胞(PBMC)、NK细胞、巨噬细胞等。这些其他的细胞可以来自任何生物体，优选人、小鼠、大鼠、兔和猴。
监测细胞死亡或活力的方法是本领域已知的，包括使用染料、免疫化学、细胞化学和放射性试剂。例如，半胱天冬酶(caspase)染色分析能够测量细胞凋亡，而放射性底物或荧光染料(如阿尔玛蓝)的摄取或释放能够检测细胞生长或活化。
在细胞分析中，转录激活也可以作为分析功能的方法。在这种情况下，可以通过分析可能上调的天然基因或免疫球蛋白来监测响应，例如可以测量某些白细胞介素的释放，或者可以通过报道构建体读出。细胞分析还可以涉及测量作为对本文所述抗体存在的响应的细胞形态变化。
本文所述的抗体优选地仅具有TNF-拮抗活性(特别是没有可检测的激动活性)，因此，减少由于循环中TNF水平增加所引起的炎症反应，该炎症反应可能导致不期望的炎症响应、细胞凋亡和坏死、器官衰竭和感染性休克。如在使用半饱和浓度的TNF或LTα的细胞分析中测量的，优选地TNF和LTα分别在0.01～0.1nM的范围内，例如通过下面的实施例进一步描述的测试系统测量的，优选的抗体具有对应于IC50小于100nM，优选地小于20nM，更优选小于10nM，最优选在个位数的纳摩尔范围或更小的拮抗活性。
优选地，例如通过下面的实施例进一步描述的测试系统，在相同的细胞分析中，然而不使用TNF，来测量潜在的TNF-模拟的激动活性。如果在不存在TNF的情况下，孵育HeLa或HT1080细胞不诱导或只是边缘诱导细胞因子，例如在抗体为至少5nM或约10nM的浓度下，升高的IL-6或IL-8水平小于0.5ng/ml，则本文所述的抗体优选地不具有明显的激动活性。优选地，不存在或仅有边缘或阴性细胞因子产生，其可以通过小于10pg/105细胞的量来测定。在优选的实例中，细胞因子的表达和释放在18小时内小于2.5pg/100000细胞。优选地，激动活性因此低于基础水平，或小于对相当TNF浓度的响应的2％，优选地小于等效或最大TNF响应的1％。
如果在不存在TNF的情况下，孵育HeLa或HTl080细胞仅导致边缘诱导细胞因子，小于对相当TNF浓度的响应的2％，优选小于等效TNF响应的1％，则本文所述的抗体优选地不具有显著的激动活性。
已经特别证明，本文所述的示例性抗体不引发炎性细胞因子例如IL-6或IL-8的表达或释放。因此，尽管对TNFR1具有高亲和力，但可以避免不期望的炎性病症或组织损伤。这些副反应的减少对于提供药物制剂来治疗慢性疾病特别有用。
本文所用的术语“基本上相同的生物活性”指基本上相同的活性所示的活性，其为所测定的可比较的或亲本抗体的至少20％，至少50％，至少75％，至少90％，例如至少100％，或至少125％，或至少150％，或至少175％，或例如高达200％，或甚至更高的活性。
在huTNFR1抗原结合方面，本文所述的优选的抗体构建体是功能活性的，优选地以高亲和力与抗原结合，KD小于5×10-9M，或小于4×10-9M，或小于3×10-9M，或小于2×10-9M，或小于10-9M，或小于10-10M。具体地，解离的趋势很低，k解离小于10-3s-1，或小于5×10-4s-1，或小于10-5s-1。具体地，结合的趋势很高，k结合为至少105M-1s-1或106M-1s-1。
优选的抗体变体仍然特异性识别huTNFR1靶标，同时亲和力可能增加和/或解离更低和/或结合更高，以有效地结合靶标，并在延长的时间内保持抗原-抗体的相互作用。而且，例如通过抗体的亲和力成熟获得的，KD、k解离和/或k结合值的差异可以是1、2或3个对数。
抗体的结合亲和力通常根据抗体的浓度来表征，在该浓度下一半抗原结合位点被占据，被称为解离常数(Kd或KD)。通常，KD＜10-8M时则认为结合物是高亲和力结合物，在某些情况下，例如以更高的亲和力用于治疗目的，例如KD＜10-9M，甚至更优选为KD＜10-10M。
然而，在一个特别优选的实施方式中，抗原结合亲和力具有中等亲和力，例如，KD小于10-7。可以提供中等亲和力的结合物，并且具体地用于改造具有所需亲和力性质的亲和力成熟的变体，其可以用作本文所述的抑制剂。
亲和力成熟是一过程，通过该过程产生对靶抗原具有增加的亲和力的抗体。为了产生根据本发明公开的各个实施方式的亲和力成熟的抗体，可以使用本领域可利用的任一种或多种制备和/或使用亲和力成熟文库的方法。这种亲和力成熟的示例性方法和用途，例如随机诱变、细菌突变株传代、定点诱变、突变热点靶向、简约诱变(parsimoniousmutagenesis)、抗体改组、轻链改组、重链改组、CDR1和/或CDR1诱变，以及适用于实施根据本发明公开的各个实施方式的方法和用途的产生和使用亲和力成熟文库的方法，包括例如在以下中公开的那些：Wark和Hudson，2006，Advanced Drug Delivery Reviews 58：657-670。
随着抗体的结构改变，包括氨基酸诱变或作为免疫球蛋白基因区段中发生体细胞突变的结果，产生抗原的结合位点的变体，并选择具有更强亲和力的变体。亲和力成熟的抗体可以表现出比亲本抗体高几个对数倍的亲和力。单个亲本抗体可以进行亲和力成熟。或者，可以将对靶抗原具有相似结合亲和力的抗体库当作亲本结构，这些亲本结构经改变以获得亲和力成熟的单个抗体或这些抗体的亲和力成熟库。
本文所述的抗体的优选亲和力成熟变体表现出结合亲和力增加至少2倍，优选地增加至少5倍，优选地增加至少10倍，优选地增加至少50倍，或优选地增加至少100倍。可以在使用亲本分子的相应文库的选择活动期间使用亲和力成熟，来获得本文所述的抗体，其中亲本分子的相应文库具有中等结合亲和力的抗体。或者，通过本文所述的抗体的亲和力成熟，甚至可以进一步增加亲和力，以获得对应于KD小于10-10M或甚至小于10-11M的高值。
在一些实施方式中，通过亲和力ELISA分析来测定结合亲和力。在一些实施方式中，通过BIAcore、ForteBio或MSD分析来测定结合亲和力。在一些实施方式中，通过动力学方法来测定结合亲和力。在一些实施方式中，通过平衡/溶液方法来测定结合亲和力。在一些实施方式中，通过标准石英晶体微天平(QCM)测量来测定结合亲和力，特别是在类似于生理条件(约37℃，密度约50Hz)的预定条件下来测定。
术语“功能活性变体”还包括天然存在的等位基因变体，以及突变体或任何其他非天然存在的变体。如本领域所知，等位基因变体是(多)肽的替代形式，其特征在于具有基本上不改变多肽生物学功能的一个或多个氨基酸的替换、缺失或添加。
功能活性变体可以通过多肽或核苷酸序列中的序列改变来获得，例如，通过一个或多个点突变来获得，其中当与本发明结合使用时，序列改变保留或改善未改变的多肽或核苷酸序列的功能。这样的序列改变可以包括但不限于(保守的)替换、添加、缺失、突变和插入。
具体的功能活性变体是包括CDR变体的抗体构建体。CDR变体包括由CDR区中d至少一个氨基酸修饰的氨基酸序列，其中所述修饰可以是氨基酸序列的化学改变或部分改变，该修饰允许变体保留未经修饰的序列的生物学特征。CDR氨基酸序列的部分改变可以是一个至数个氨基酸，例如1或2个，或甚至更多个，多达3、4或5个氨基酸的缺失或替换，或一个至数个氨基酸，例如1或2个，或甚至更多个，多达3、4或5个氨基酸的添加或插入，或一个至数个氨基酸，例如1或2个，或甚至更多个，多达3、4或5个氨基酸的化学衍生化，或它们的组合。氨基酸残基中的替换可以是保守替换，例如，用一个疏水氨基酸替换成另一个疏水氨基酸。
保守替换是在一类氨基酸中发生的那些，它们在其侧链和化学性质上是相关的。这些类别的实例是具有碱性侧链、具有酸性侧链、具有非极性脂肪族侧链、具有非极性芳族侧链、具有不带电荷的极性侧链、具有小侧链、具有大侧链等的氨基酸。
点突变特别理解为对多核苷酸进行改造得到一氨基酸序列的表达，该氨基酸序列(对于有差异的氨基酸)以一个或多个单一(非-连续的)或双联体氨基酸的替换或交换、缺失或插入的方式，而不同于未经改造的氨基酸序列。
骨架区中的一些点突变将增强可制造性，例如，通过重组的产生宿主细胞系改善其表达来增强可制造性。一些实施方式还包括骨架区中的点突变，以改善体内和/或体外的稳定性，例如通过其热稳定性测定的。例如，VH序列可以包括一个或多个、数个点突变，这些点突变已证明基本上增加了抗体的热稳定性。热稳定的变体是例如抗体构建体的变体，包括IZI06.1的VH和VL序列(VH：SEQ ID 20，VL：SEQ ID 21)，其中VH结构域序列是(亲本)IZI06.1VH序列(SEQ ID：20)的变化并且包括任何以下氨基酸(Kabat编号)：
a)在FR1中的第1位：Q或H；
b)在CDRH2中
i)第3位：Y或V；
ii)第5位：Y、T或S；
iii)第6位：S或Q；
iv)第8位：H或E；
v)第10位：Y或K；
vi)第13位：E或D。
进一步优选的变化涉及VL序列(SEQ ID 21)并且包括CDRL3中的S91G点突变(第3位)。
替代的种系序列可用于人源化目的，这可以产生包括有限数量的点突变的其他FR变体，并且该变体会再次具有增加的热稳定性。
在下面的实施例部分提供了用于测定热稳定性的示例性分析法。
优选的点突变是指具有相同极性和/或电荷的氨基酸的交换。在这方面，氨基酸是指由六十四个三联体密码子编码的二十种天然存在的氨基酸。这20种氨基酸可分为具有中性电荷、正电荷和负电荷的那些。
以下示出了“中性”氨基酸以及它们对应的三字母和单字母密码子和极性：
丙氨酸：(Ala，A)非极性，中性；
天门冬酰胺：(Asn，N)极性，中性；
半胱氨酸：(Cys，C)非极性，中性；
谷氨酰胺：(Gln，Q)极性，中性；
甘氨酸：(Gly，G)非极性，中性；
异亮氨酸：(Ile，I)非极性，中性；
亮氨酸：(Leu，L)非极性，中性；
蛋氨酸：(Met，M)非极性，中性；
苯丙氨酸：(Phe，F)非极性，中性；
脯氨酸：(Pro，P)非极性，中性；
丝氨酸：(Ser，S)极性，中性；
苏氨酸：(Thr，T)极性，中性；
色氨酸：(Trp，W)非极性，中性；
酪氨酸：(Tyr，Y)极性，中性；
缬氨酸：(Val，V)非极性，中性；和
组氨酸：(His，H)极性，正(10％)中性(90％)。
带“正”电荷的氨基酸是：
精氨酸：(Arg，R)极性，正；和
赖氨酸：(Lys，K)极性，正。
带“负”电荷的氨基酸是：
天冬氨酸：(Asp，D)极性，负；和
谷氨酸：(Glu，E)极性，负。
关于本文所述的抗体序列和同源物的“百分比(％)氨基酸序列同一性”定义为在通过比对序列，如果需要引入空位(gap)，以实现最大百分比的序列同一性，而不考虑任何保守替换作为序列同一性的一部分，在候选序列中与特定多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。本领域技术人员可以确定适当的参数用于测量比对，包括在所比较序列的全长实现最大比对所需的任何算法。
抗体变体特别理解为包括具有特定的糖基化模式(例如通过糖改造产生)的同源物、类似物、片段、修饰或变体，其是功能性的并且可以用作功能性等同物，例如，结合特定的靶标并具有功能性质。
本文所述的抗体可以表现出或可以不表现出Fc效应子功能。虽然作用模式主要通过中和没有Fc效应子功能的抗体来介导，但Fc通过形成免疫复合物，可以募集补体并帮助从循环中消除靶抗原，例如毒素。
特定的抗体可以缺乏活性Fc部分，因此，可以由不含抗体Fc部分或不含Fcγ受体结合位点的抗体结构域组成，或者包括缺乏Fc效应子功能的抗体结构域，例如通过修饰来减少Fc效应子功能，特别是消除或减少ADCC和/或CDC活性。替代的抗体可以经改造来掺入修饰以增加Fc效应子功能，特别是增强ADCC和/或CDC活性。
本文所用的术语“Fc片段”或“Fc区”应特别包括那些突变体，或缺乏Fc受体结合特性的功能活性变体，例如经糖基改造的Fc区，或具有下调的效应子功能和/或延长的半衰期的那些。
本文所用的术语“效应子功能”是指通过与抗体Fc区结合的效应子配体所介导的作用。示例性效应子配体是与免疫球蛋白结合的Fc受体或Fc受体类分子。Fc受体是在某些细胞(包括自然杀伤细胞、巨噬细胞、中性粒细胞和肥大细胞)表面发现的蛋白，有助于免疫系统的保护功能。有几种不同类型的Fc受体，根据它们识别的抗体类型对其进行分类；结合最常见类别的抗体IgG的那些被称为Fc-γ受体(FcγR或FcgR)。FcγR家族包括一些成员：FcγRI(CD64)、FcγRIIA(CD32a)、FcγRIIB(CD32b)、FcγRIIIA(CD16a)、FcγRIIIB(CD16b)。在效应子分子中，还有补体蛋白，例如C1q。
另一种Fc受体，即新生儿Fc受体(FcRn)，也结合IgG并参与该抗体的保存和半衰期。根据本发明，优选地是FcRn介导的功能不被下调。
术语“下调”是指通过基因突变，或下调基因表达或基因表达产物(例如核酸或多肽)的活性，特别是通过降低结合特性，如亲和力、亲合力或特异性，包括至少部分地抑制结合配体(例如效应子配体)，来减少由一个基因或一组基因或多肽介导的作用。由此可以获得表现出降低的ADCC和/或CDC的抗体。
抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)是通过具有Fc受体的细胞杀死被抗体包覆的靶细胞，其中的Fc受体识别所结合的抗体的恒定区。大多数ADCC由NK细胞介导，NK细胞在其表面上具有Fc受体FcγRIII或CD16。典型的分析法使用靶细胞，如Ramos细胞与连续稀释的抗体一起孵育，然后加入新鲜分离的效应子细胞。然后ADCC分析进一步孵育数小时，并检测细胞毒性的百分比。通常，靶标∶效应子的比例约为1∶16，但可能是1∶1至1∶50。
补体依赖性细胞毒性(CDC)是杀死细胞的一种机制，其中与靶细胞表面结合的抗体固定补体，组装攻膜复合物，该复合物在靶细胞膜中打孔，随后导致细胞裂解。除了使用含补体的血清而不是效应子细胞之外，常用的CDC分析遵循与ADCC测定相同的程序。
如通过ADCC或CDC分析法测定的，优选以与对照相比提供细胞溶解百分比明显降低的方式测定，本文所述的抗体具有缺乏介导效应子功能的Fc区，优选下调的细胞毒性活性。绝对百分比降低优选地高于10％，更优选地高于20％，甚至更优选地高于30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％。最优选地，抗体基本上不含ADCC或CDC活性中的至少一种，例如，与天然(未经修饰的)抗体相比，具有小于10％的典型ADCC和/或CDC活性。本文所用的术语“基本上不含”还指完全缺乏在标准分析中测量的这种活性的那些抗体变体。
Fc区内的特定点突变是本领域已知的，以有效地下调效应子功能。利用了人IgG上的结合位点区域中对于不同Fcγ受体(FcgR)特别优选的突变，会消除经由FcgR的免疫募集。人和鼠IgG对FcgR的结合位点主要定位于由IgG残基233～239组成的下铰链区。其他广泛的部分，例如测定了对于人FcγRI的Gly316～Lys338，对于人FcγRIII的Lys274～Arg301和Tyr407～Arg416。人IgG1的Fc片段与人FcγRIIIA的晶体结构描绘了参与结合FcγRIIIA的IgG1残基Leu234～Ser239、Asp265～Glu269、Asn297～Thr299和Ala327～Ile332。Shields等(2001，J.Biol.Chem.276：6591-604)提供的综述涉及人IgG1的对于FcγR受体(FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIB和FcγRIIIA)的高分辨率分布。
取决于具体的突变或表达系统的选择，抗体或Fc区可以是糖基化的或不是糖基化的，或是经糖基改造以获得特定的糖基化模式。
关于抗体序列或Fc区的术语“糖基改造”是指由于糖基改造而具有经修饰的ADCC和/或CDC的糖基化变体。所有的抗体在重链恒定区的保守位置包含碳水化合物结构，各同种型具有独特排列的N-连接的碳水化合物结构，其可变地影响蛋白质组装、分泌或功能活性。IgG1型抗体是糖蛋白，在每个CH2结构域的Asn297处具有保守的N连接的糖基化位点。与Asn297连接的两个复合双角寡糖被包埋在CH2结构域之间，与多肽骨架形成广泛的接触，并且它们的存在对于抗体介导效应子功能(如抗体依赖性细胞毒性(ADCC))是必需的(Lifely等，1995，Glycobiology 5：813-822)。例如通过突变N297，例如为A或T299，来除去N297处的N-聚糖，通常产生ADCC降低的非糖基化Fc。
抗体糖基化中的主要差异发生在细胞系之间，甚至在不同培养条件下生长的给定细胞系也能观察到微小差异。在细菌细胞中的表达通常提供基本上不含ADCC和/或CDC活性的无糖基化抗体。报道CHO细胞具有改善的ADCC活性，其中CHO细胞具有四环素调节的β(1，4)-N-乙酰葡糖胺基转移酶III(GnTIII)(一种催化二等分GlcNAc形成的糖基转移酶)表达(Umana等，1999，Nature Biotech.17：176-180)。除了选择宿主细胞外，在抗体重组产生期间影响糖基化的因素包括生长模式、培养基配方、培养密度、氧合、pH、纯化方案等。
术语“抗原结合位点”或“结合位点”是指参与抗原结合的抗体部分。抗原结合位点由重(“H”)和/或轻(“L”)链的N-末端可变(“V”)区的氨基酸残基或其可变结构域形成。重链和轻链的V区内的三个高度趋异的延伸段(称为“高变区”)插入在较保守的侧翼延伸段(称为骨架区)之间。抗原结合位点提供了与结合的表位或抗原的三维表面互补的表面，并且高变区被称为“互补决定区”或“CDR”。包含在CDR中的结合位点在本文中也称为“CDR结合位点”。
本文所用的术语“抗原”与术语“靶标”或“靶抗原”可互换使用，是指被抗体结合位点识别的整个靶分子或此类分子的片段。具体地，抗原的亚结构，例如多肽或碳水化合物结构，通常称为“表位”，例如与免疫学相关的B细胞表位或T细胞表位，可以被这样的结合位点识别。huTNFR1抗原是包括受体结构的抗原，其作为大多数人细胞表面上的单-或多聚细胞因子受体能够特异性结合三聚体TNF或LTα。
本文所用的术语“huTNFR1”是指TNF1的CD120a TNFR1(p55/60，TNFRSF1A肿瘤坏死因子受体超家族，成员1A[智人(人)]，基因ID：7132)受体，在大多数人细胞上普遍表达。
本文所用的术语“表位”特别指如下的分子结构，该分子结构可以完全构成抗体的结合位点的特异性结合配偶体，或是特异性结合配偶体的一部分。表位可以由碳水化合物、肽结构、脂肪酸、有机物、生物化学物或无机物或其衍生物及其任何组合构成。如果表位包括在肽结构，例如肽、多肽或蛋白质中，则它通常包括至少3个氨基酸，优选地5～40个氨基酸，更优选地约10～20个氨基酸。表位可以是线性表位或构象表位。线性表位由多肽或碳水化合物链的一级序列的单一区段组成。线性表位可以是连续的或重叠的。
构象表位由通过多肽折叠形成三级结构而聚集在一起的氨基酸或碳水化合物组成，这些氨基酸在线性序列中不一定彼此相邻。具体地且就多肽抗原而言，构象表位或不连续表位的特征在于存在在一级序列中分开的、两个或更多个离散的氨基酸残基，但当多肽折叠成天然蛋白质/抗原时，在分子表面上组装成连续的结构。
本文中，术语“表位”特别指ATROSAB识别的表位，其包括huTNFR1的至少膜远端CRD1和CDR2的亚结构域A1，或基本上由其组成的表位。
术语“表达”以以下方式理解。核酸分子可用于表达目的，该核酸分子包括表达产物(例如本文所述的抗体)所需的编码序列和调控序列(例如可操作连接的启动子)。用这些序列转化或转染的宿主能够产生编码的蛋白。为了实现转化，表达系统可以包括在载体中；然而，也可以将相关的DNA整合到宿主染色体中。具体地，该术语是指在合适的条件下，宿主细胞和相容的载体，例如表达由载体携带并导入宿主细胞的外源DNA编码的蛋白。
编码DNA是如下的DNA序列，其编码特定的多肽或蛋白(例如抗体)的特定氨基酸序列。启动子DNA是如下的DNA序列，其启动、调控或以其他方式介导或控制编码DNA的表达。启动子DNA和编码DNA可以来自相同的基因或来自不同的基因，并且可以来自相同或不同的生物。重组克隆载体通常包括一个或多个复制系统用于克隆或表达，一个或多个标记物(例如抗生素抗性)用于在宿主中进行选择，以及一个或多个表达盒。
本文所用的“载体”定义为如下的DNA序列，其是在合适的宿主生物中，克隆的重组核苷酸序列(即重组基因)的转录，及其mRNA的翻译所需的。
“表达盒”是指编码表达产物的DNA编码序列或DNA片段，其可以插入到载体的确定的限制性位点中。表达盒限制性位点经设计，以确保表达盒插入适当的阅读框中。通常，外源DNA插入载体DNA的一个或多个限制性位点中，然后与可传递的载体DNA一起被载体携带进入宿主细胞中。具有插入或添加的DNA的DNA片段或序列(例如表达载体)，也可以称为“DNA构建体”。
表达载体包括表达盒，并且通常另外包括在宿主细胞或基因组整合位点自主复制的起始点、一种或多种可选择性标记物(例如氨基酸合成基因或赋予对抗生素(例如博莱霉素、卡那霉素、G418或潮霉素)抗性的基因)、许多限制酶切割位点、合适的启动子序列和转录终止子，这些组分可操作地连接在一起。本文所用的术语“载体”包括自主复制的核苷酸序列以及基因组整合核苷酸序列。常见的载体类型是“质粒”，其通常是自身包含双链DNA的分子，可以容易地接受额外的(外源)DNA，并且可以容易地被引入到合适的宿主细胞中。质粒载体通常包含编码DNA和启动子DNA，并且具有一个或多个适于插入外源DNA的限制性位点。具体地，术语“载体”或“质粒”是指可以将DNA或RNA序列(例如外源基因)引入到宿主细胞中的运载工具，以转化宿主并促进引入序列的表达(例如转录和翻译)。
本文所用的术语“宿主细胞”是指原代受试细胞及其任何后代，其中原代受试细胞经转化以产生特定的重组蛋白，例如本文所述的抗体。应当理解，并非所有的后代都与亲本细胞完全相同(由于故意或无意的突变或环境差异)，然而，这些改变的后代也包括在这些术语中，只要后代保留与最初转化的细胞相同的功能性即可。术语“宿主细胞系”是指宿主细胞的细胞系，用于表达重组基因以产生重组多肽，例如重组抗体。本文所用的术语“细胞系”是指特定细胞类型所建立的克隆，所述细胞类型已经获得了在长时间段内增殖的能力。可以将这样的宿主细胞或宿主细胞系保持在细胞培养物中，和/或进行培养以产生重组多肽。
关于核酸、抗体或其他化合物，本文所用的术语“分离的”或“分离”是指这样化合物，其已经与自然相关的环境充分分离，以便以“基本上纯的”形式存在。“分离的”不一定意味着排除与其他化合物或材料的人工或合成混合物，或者存在不干扰基本活性的杂质，该杂质可能是例如由于纯化不完全而存在。特别地，本发明中分离的核酸分子也意味着包括非天然存在(例如经密码子优化的核酸或cDNA)或化学合成的那些。
同样地，本文进一步描述的分离的抗体特别是非天然存在的，例如，如与另一种抗体或活性剂一起提供在组合制剂中，该组合在自然中不存在；或作为天然存在的抗体的衍生物或变体；或天然存在的抗体的经优化或亲和力成熟的变体；或具有经改造以改善抗体稳定性的骨架区的抗体。通过这种优化或改造，抗体包括一种或多种合成的结构或序列或特征，这在自然界中的抗体中不会发现。
关于本文所述的核酸，有时使用术语“分离的核酸”。当用于DNA时，该术语是指与一序列分离的DNA分子，该DNA分子在其所来源的生物体的天然存在的基因组中，与该序列紧密接邻。例如，“分离的核酸”可以包括插入载体(例如质粒或病毒载体)中的DNA分子，或整合到原核或真核细胞或宿主生物的基因组DNA中的DNA分子。当用于RNA时，术语“分离的核酸”主要指由如上定义的分离的DNA分子编码的RNA分子。或者，该术语可以指已经与天然状态(即，在细胞或组织中)中与之相关的其他核酸充分分离的RNA分子。“分离的核酸”(DNA或RNA)可以进一步代表通过生物或合成方法直接产生，并与其产生过程中存在的其他组分分离的分子。
关于多肽或蛋白，例如本文所述的分离的抗体，术语“分离的”具体是指如下化合物，该化合物不含或基本上不含与其天然相关的物质，例如在化合物的天然环境中或化合物的制备(当通过体外或体内实施的重组DNA技术进行这种制备时)环境(例如细胞培养物)中发现的其他化合物。分离的化合物可以与稀释剂或佐剂一起配制，并且仍然为了实际目的而是分离的，例如，当用于诊断或治疗时，多肽或多核苷酸可以与药学上可接受的载剂或赋形剂混合。
本文所用的术语“重组”是指“由基因工程制备或是基因工程的结果”。重组宿主具体包括表达载体或克隆载体，或其已经过基因改造以包含重组核酸序列，特别是使用对宿主来说外源的核苷酸序列来进行。通过在宿主中表达相应的重组核酸来产生重组蛋白。
本文进一步描述的抗体构建体可以是重组抗体。为此，本文所用的术语“重组抗体”包括通过重组方法制备、表达、产生或分离的抗体，例如(a)从人免疫球蛋白基因的转基因或转染色体的动物(例如小鼠)，或由其制备的杂交瘤分离的抗体，(b)从经转化以表达抗体的宿主细胞分离的抗体，例如从转染瘤分离的抗体，(c)从重组、组合的人抗体文库或抗体的抗原结合序列文库分离的抗体，和(d)通过涉及将人免疫球蛋白基因序列剪接到其他DNA序列中的任何其他方法，制备、表达、产生或分离的抗体。此类重组抗体包括经过改造以包括重排和突变的抗体，所述重排和突变例如发生在抗体成熟期间。根据本发明，可以使用本技术领域内的常规分子生物学、微生物学和重组DNA技术。这些技术在文献中有充分说明。参见，例如，Maniatis，Fritsch&Sambrook，“分子克隆：实验室指南(MolecularCloning：A Laboratory Manual)，冷泉港(Cold Spring Harbor)，(1982)。
本文所述的抗体优选地提供为重组蛋白，所述重组蛋白通过使用宿主细胞的重组表达系统产生，例如通过在大肠杆菌的周质空间中表达，或在真核表达系统(例如酵母或哺乳动物)中作为分泌蛋白表达，例如通过CHO、HEK或人生产宿主细胞系表达。
中国仓鼠卵巢(CHO)细胞最常用于抗体产生。除了提供合适的糖基化模式外，这些细胞允许连续一致地产生遗传稳定、高产的克隆细胞系。在简单的生物反应器中，使用无血清培养基可以将它们培养至高密度，并允许开发安全且可重复的生物过程。
当在无血清条件，任选地在不含任何动物来源的蛋白质/肽的培养基中建立、适应和完全培养时，宿主细胞是最优选的。
本文所用的“特异性”结合、识别或靶向是指结合物(例如抗体或抗原结合部分)对异质分子群中的靶抗原或相应表位表现出明显的亲和力。因此，在指定条件下(例如，免疫分析)，结合物特异性结合靶抗原，并且以不明显的量与样品中存在的其他分子结合。特异性结合是指结合在靶标特性方面是选择性的，如选择的那样高、中或低的结合亲和力或亲合力。如果与其他靶标相比，结合常数或结合动力学相差至少10倍(理解为至少1个对数差异)，优选地相差至少100倍(理解为至少2个对数差异)，更优选地至少1000倍(理解为至少3个对数差异)，则通常可以实现选择性结合。差异性结合可以通过免疫分析来确定，优选通过免疫印迹、ELISA或其他免疫学方法来确定。抗体分子对特定靶标的特异性可以通过竞争分析来确定，例如，Harlow等(抗体：实验室手册(ANTIBODIES：ALABORATORY MANUAL)，冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press)，冷泉港(Cold SpringHarbor)，N.Y.，1988)所述。通过本领域已知的重组抗体优化方法可以改造或改善选择性结合。例如，可以对本文所述的免疫球蛋白链的可变区的某些区域进行一种或多种优化策略，包括所选CDR和/或骨架区的轻链改组(shuffling)、目的(destinational)诱变、CDR融合(amalgamation)和定向诱变。
本文所述的抑制剂具体地包括如下抗体，该抗体具有与由特定CDR序列(SEQ ID 1～6或其功能CDR变体)确定的、与TNFR1靶标结合或与H398或ATROSAB相同的表位或重叠表位结合相同的特异性或相同的抗原结合位点。
术语“具有相同的特异性”、“具有相同的结合位点”或“结合相同的表位”的使用表明等同的单克隆抗体表现出相同或基本相同的，即相似的免疫反应(结合)特征，并竞争用于结合预先选择的靶结合序列。抗体分子对特定靶标的相对特异性可以通过竞争分析来相对地确定，例如，Harlow等(ANTIBODIES：A LABORATORY MANUAL，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1988)所述。
本文中竞争是指通过竞争ELISA分析或通过ForteBio分析测定的高于约30％的相对抑制。可能需要设定更高的相对抑制阈值作为标准，该标准在特定的背景下是适当的竞争水平，例如，其中竞争分析用于选择或筛选经设计具有预期的结合抗原功能的新抗体。因此，例如，可以设定竞争性结合的标准，其中检测到至少40％的相对抑制，或至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，至少90或甚至至少100％，则认为抗体具有足够的竞争性。
本文所用的术语“受试者”是指温血哺乳动物，特别是人或非人的动物。特别地，本文所述的医疗用途或相应的治疗方法应用于需要预防或治疗与炎症相关的疾病的受试者。受试者可以是具有患炎性疾病(包括早期或晚期疾病)的风险的患者。术语“患者”包括接受预防性或治疗性治疗的人和其他哺乳动物受试者。因此，术语“治疗”是指包括预防性和疗效性治疗两者。
例如治疗受试者，用于预防或治疗炎症性疾病。特别地，治疗受试者，该受试者具有急性或慢性炎性疾病或发展此类疾病或疾病复发的风险，或是患有此类炎性疾病的受试者。
具体地，术语“疗法”是指疗法措施，旨在涵盖给药以以治愈疾病或减轻疾病症状。
具体地，术语“预防”是指预防措施，旨在降低疾病发生或疾病复发的风险。
通过抑制TNF-TNFR1相互作用、阻止TNFR下游信号传导途径的激活，本文所述的抑制剂可以特异性地调节细胞存活，从而最小化其在免疫细胞中启动的促炎程序并降低自身免疫和炎性疾病的异常状态。使用抑制剂来阻止TNFR1与其TNF配体的相互作用会减少致病细胞群的扩增和存活，并减少促炎细胞因子的产生以及改善TNF介导的炎症。在自身免疫疾病的情况下，TNF-TNFR相互作用主要发生在免疫应答期间。特异性免疫细胞类型的功能受TNF-TNFR相互作用的控制，并且可以通过本文所述的抑制剂进行调节。
在炎性疾病中，存在抗TNF治疗剂的适应症。因此，本文所述的抑制剂或抗体用作常规的抗TNF治疗剂的替代物。
具体地，本文所述的药物组合物适用于治疗任何下列疾病或与其相关的炎性病症(或炎性疾病)，所述疾病选自由自身免疫疾病、类风湿性关节炎、银屑病、银屑病关节炎、幼年型关节炎、强直性脊柱炎、克罗恩病(Morbus Crohn)、多发性硬化症、充血性心力衰竭、代谢病、细胞因子释放综合征、感染性休克、急性和慢性神经退行性疾病(包括中风、阿尔茨海默病和帕金森病)组成的组。其他适当的适应症包括溃疡性结肠炎、胰腺炎、COPD和其他慢性炎症和/或自身免疫疾病、急性暴发性病毒或细菌感染、代谢性疾病、慢性神经变性疾病、以TNF/TNFR1为致病病理介质的遗传性疾病，优选地选自周期性发热综合症和巨颌症以及癌症。
本文使用的术语“治疗有效量”可与化合物(例如本文所述的抗体)的任何术语“有效量”或“足够量”互换使用，当向受试者施用时，“治疗有效量”是足以实现有益或所需结果(包括临床结果)的量或活性，因此，有效量或其同义词取决于其应用的环境。
有效量意指化合物的量足以治疗、预防或抑制此类疾病或病症。在疾病的情况下，本文所述的抗体的治疗有效量特别地用于治疗、调节、减弱、逆转或影响疾病或病症，其受益于对TNF-TNFR1相互作用的抑制。
对应于这种有效量的化合物的量会根据各种因素而发生变化，例如给予的药物或化合物、药物制剂、给药途径、疾病或病症的类型、待治疗的受试者或宿主的身份等，但仍然可以由本领域技术人员常规确定。
本文所述的优选的药物组合物包括治疗有效量的如上限定的huTNFR1抗体以及任选地一种或多种其他组分，所述其他组分选白药学上可接受的载剂、药学上可接受的盐、助剂、稳定剂、稀释剂和溶剂或其任何组合组成的组。
根据本发明，治疗患者的方法包括以下步骤：向有需要的患者施用治疗有效量的如上限定的huTNFR1抗体。治疗有效量通常为0.5～500mg的范围，优选地为1～400mg的范围，甚至更优选地为至多300mg，至多200mg，至多100mg或至多10mg，但可以标示更高的剂量，例如用于治疗急性疾病。
在一个实施方式中，本文所述的抗体是施用于患者的唯一治疗活性剂。或者，本文所述的抗体与一种或多种其他治疗剂组合施用，该其他治疗剂包括但不限于TNF拮抗剂、抗炎剂、细胞因子、生长因子或其他治疗剂。TNFR1拮抗性抗体可以与一种或多种其他治疗方案同时或连续施用，优选地与抗TNF治疗剂(例如抗TNF抗体)一起施用。本文所述的抗体优选地作为一线治疗或作为二线治疗施用予患者，或作为急性或慢性治疗，其中在二线治疗中抗TNF治疗剂是无效的。特别优选的医疗用途是用于治疗慢性疾病。
此外，使用治疗有效量的本文所述抗体的受试者治疗或预防方案可以由单次施用组成，或者包括一系列应用。例如，抗体可以每年施用至少一次、半年施用至少一次或每月施用至少一次。然而，在另一个实施方式中，对于给定的治疗，抗体可以以每周施用约一次至约每日施用，来施用予受试者。治疗期的长度取决于许多因素，例如疾病的严重程度、急性或慢性疾病、患者的年龄、抗体形式的浓度和活性。还应理解，治疗或预防的有效剂量可在特定治疗或预防方案的过程中增加或减少。通过本领域已知的标准诊断分析，可以得到剂量的变化并且是明显的。在某些情况下，可能需要长期施用。
一旦鉴定出具有所需结合特性的抗体，就可以通过本领域已知的方法，包括例如杂交瘤技术或重组DNA技术来产生这样的抗体(包括抗体片段)。
可以使用已知的重组表达载体(例如本文所述的质粒，或包括编码抗体序列的核苷酸序列的表达盒)，例如通过分离编码所需抗体链的DNA，并用编码序列转染重组宿主细胞用于表达，来产生重组单克隆抗体。重组宿主细胞可以是原核和真核细胞，例如如上所述的那些。
根据一个具体的方面，核苷酸序列可以用于遗传操作，以使抗体人源化或改善抗体的亲和力或其他特征。例如，如果抗体用于人的临床试验和治疗，则可以将恒定区改造至更接近人恒定区以避免免疫应答。可能需要对抗体序列进行遗传操作以获得对靶标的更大的亲和力。对本领域技术人员显而易见的是，可以改变抗体的一个或多个多核苷酸，但仍然保持其对靶抗原的结合能力。
通过各种方法产生抗体分子通常是容易理解的。例如，美国专利6331415(Cabilly等)描述了重组产生抗体的方法，其中重链和轻链同时由单个载体或由单个细胞中的两个独立的载体表达。Wibbenmeyer等(1999，Biochim Biophys Acta 1430：191-202)以及Lee和Kwak(2003，J.Biotechnology 101：189-198)描述了使用在独立宿主细胞培养物中表达的质粒，从独立产生的重链和轻链产生单克隆抗体。在例如Harlow等(ANTIBODIES：ALABORATORY MANUAL，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y，1988)中，提供了与抗体产生相关的多种其他技术。
根据一个具体的方面，可以对本文所述的抗体进行测序，然后可以将多核苷酸序列克隆到载体中用于表达或增殖。编码抗体的序列可以保持在宿主细胞的载体中，然后宿主细胞可以扩增并冷冻以备将来使用。可以通过本领域已知的方法从B细胞克隆出抗体基因，在细胞培养物中进行重组单克隆抗体的产生。
另一方面，本发明提供了分离的核酸，其包括用于产生本文所述的重组抗体的编码序列。
编码抗体的核酸可以具有任何合适的特征并且包括任何合适的特点或其组合。因此，例如，编码抗体的核酸的形式为DNA、RNA或其杂合体，并且可以包括非天然存在的碱基和经修饰的骨架(例如促进核酸稳定性的硫代磷酸酯骨架)或两者。优选的核酸可以是经密码子优化的序列。有利地，核酸可以包含在本文所述的表达盒、载体或质粒中，所述表达盒、载体或质粒包括促进在靶宿主细胞中所需的表达、复制和/或选择的特点。这些特点的实例包括复制起始组分、选择基因组分、启动子组分、增强子元件组分、聚腺苷酸化序列组分、终止子组分等，其中许多合适的实例是已知的。
本公开还提供了重组DNA构建体，其包括一种或多种本文所述的核苷酸序列。这些重组构建体与载体(例如质粒、噬菌粒、噬菌体或病毒载体)结合使用，载体中插入了编码任何公开的抗体的DNA分子。
通过细胞系培养，例如培养重组真核(哺乳动物或昆虫)或原核(细菌)的宿主细胞产生单克隆抗体的任何方法，来产生单克隆抗体分子。用于制备单克隆抗体的合适的方法的实例包括&Milstein(1975，Nature 256：495-497)的杂交瘤方法和人B细胞杂交瘤方法(Kozbor，1984，J.Immunol.133：3001；和Brodeur等，1987，单克隆抗体生产技术和应用(Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications)，(Marcel Dekker，Inc.，New York)，pp.51-63)。
可以使用杂交瘤方法鉴定或获得本文所述的抗体。在此类方法中，使小鼠或其它合适的宿主动物(例如仓鼠)免疫以引发淋巴细胞产生或能够产生抗体，所述抗体特异性结合用于免疫的蛋白。或者，可以在体外使淋巴细胞免疫。然后使用合适的融合剂(例如聚乙二醇)将淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，以形成杂交瘤细胞。
对于针对抗原的单克隆抗体的产生，分析杂交瘤细胞生长的培养基。优选地，通过免疫沉淀法或通过体外结合分析法，例如放射免疫分析法(RIA)或酶联免疫吸附分析法(ELISA)，测定由杂交瘤细胞产生的单克隆抗体的结合特异性。
然后可以从杂交瘤上清液中纯化单克隆抗体(mAb)，用于进一步测试其对靶抗原的特异性结合，以及改造抗体，例如用于不同的诊断或治疗目的。
在某些情况下，通过针对huTNFR1抗原的筛选而得到huTNFR1特异性抗体。为了增加分离差异结合克隆的可能性，可以通过对不同抗原或表位进行逐步筛选来施加多种选择压力。
用于鉴定具有所需的选择性结合特性的抗体的筛选方法可以通过展示技术完成，展示技术使用展示抗体序列或其抗原结合序列的文库(例如使用噬菌体、细菌、酵母或哺乳动物细胞；或体外展示系统将核酸信息翻译成对应的(多)肽)。基于ELISA、Western印迹或用流式细胞术进行表面染色，例如使用标准分析，可以评估反应性。
分离的抗原可以例如用于从抗体文库中选择抗体，例如噬菌体、噬菌粒或酵母展示的抗体文库。
此外，本发明提供了药物组合物，其包括本文所述的抑制剂或抗体以及药学上可接受的载剂或赋形剂。根据本发明这些药物组合物可以以推注注射(bolus injection)或输注或通过连续输注施用。适于促进这种施用方式的药物载剂在本领域是已知的。
药学上可接受的载剂通常包括任何和所有合适的溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等，其与本文所述的抗体或相关组合物或组合是在生理学上相容的。药学上可接受的载剂的其他实例包括无菌水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、右旋糖、甘油、乙醇等，及其任何组合。
在一个这样的方面，抗体可以与适于所需给药途径的一种或多种载剂组合，抗体可以例如与乳糖、蔗糖、淀粉、链烷酸的纤维素酯、硬脂酸、滑石粉、硬脂酸镁、氧化镁、磷酸和硫酸的钠盐和钙盐、阿拉伯胶、明胶、海藻酸钠、聚乙烯吡咯烷、聚乙烯醇中的任意一种混合，并且任选地进一步压片或包封用于常规施用。或者，抗体可以溶解在盐水、水、聚乙二醇、丙二醇、羧甲基纤维素胶体溶液、乙醇、玉米油、花生油、棉籽油、芝麻油、黄蓍胶和/或各种缓冲液中。其他载剂、佐剂和施用方式在制药领域中是已知的。载剂可以包括控释材料或延时材料，例如单独或与蜡一起的单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯，或本领域已知的其他材料。
其他药学上可接受的载剂是本领域已知的并且描述于例如雷明顿药物科学(REMINGTON′S PHARMACEUTICAL SCIENCES)中。液体制剂可以是溶液、乳液或悬浮液，并且可以包括赋形剂，例如悬浮剂、增溶剂、表面活性剂、防腐剂和螯合剂。
考虑了药物组合物，其中配制了本文所述的抑制剂或抗体以及一种或多种治疗活性剂。通过将具有所需纯度的所述抗体与任选的药学上可接受的载剂、赋形剂或稳定剂混合成冻干制剂或水溶液的形式，来制备本文所述的抗体的稳定制剂以用于储存。对用于体内施用的制剂进行灭菌。这可以通过无菌过滤膜或其他方法过滤而容易地完成。本文公开的抗体和其他治疗活性剂也可以配制成免疫脂质体和/或包埋在微胶囊中。
包括本文所述的抑制剂或抗体的药物组合物可以通过多种方式施用，包括口服、皮下、静脉内、鼻内、耳内、透皮、粘膜、局部(例如凝胶、药膏、乳液、乳膏等)、腹腔内、肌内、肺内(例如采用可吸入的技术或肺部递送系统)、阴道、肠胃外、直肠或眼内施用。
用于肠胃外施用的示例性制剂包括适于皮下、肌内或静脉内注射的那些，例如无菌溶液、乳液或悬浮液。
在一个实施方式中，本文所述的抗体是施用于受试者的唯一治疗活性剂，例如作为疾病改善或预防的单一疗法。
在另一个实施方式中，例如，在混合物或试剂盒中，将本文所述的抗体与其他活性物质组合，以治疗需要治疗或预防的受试者，例如作为疾病改善或预防的组合疗法。
与一种或多种其他治疗剂或预防剂(例如抗生素、炎症的类固醇和非类固醇抑制剂)组合可以包括标准治疗，例如甲氨蝶呤和/或扑热息痛和/或其他基于抗体的治疗。该组合可以具体地包括用于治疗原发性疾病的药剂，其中原发性疾病中的炎症过程会导致继发性炎性疾病。原发性疾病是例如癌症，并且这种组合例如包括抗增殖化疗剂和/或细胞静止素。
在组合治疗中，抗体可以作为混合物施用，或者与一种或多种其他治疗方案同时施用，例如在伴随治疗之前、与伴随治疗同时或在伴随治疗之后施用。
本文所述的抗体或相应的药物制剂的生物特性可以在离体的细胞、组织和整个生物体实验中进行表征。如本领域所知，通常在动物体内测试药物，包括但不限于小鼠、大鼠、兔子、狗、猫、猪和猴子，以测量药物治疗疾病或疾病模型的功效，或测量药物的药代动力学、药理、毒性和其他性质。动物可以称为疾病模型。通常在小鼠中测试治疗剂，包括但不限于裸鼠、SCID小鼠、异种移植小鼠和转基因小鼠(包括敲入和敲除)。这样的实验可以提供有意义的数据，用于确定抗体用作治疗剂或预防剂的潜力，以及适当的半衰期、效应子功能、抑制剂活性和/或被动免疫疗法的免疫应答。可以使用任何生物体进行测试，优选哺乳动物。例如，由于它们与人类的遗传相似性，灵长类动物、猴子可以是合适的治疗模型，因此可以用于测试受试药剂或组合物的功效、毒性、药代动力学、药理、半衰期或其他性质。最终需要在人体中进行测试用于批准作为药物，因此当然可以考虑这些实验。因此，可以在人体中测试本文所述的抗体和相应的药物组合物，以确定它们的治疗或预防功效、毒性、免疫原性、药代动力学和/或其他临床特性。
根据本发明，产生了靶向人TNFR1而没有激动交叉反应性的抗体构建体。选择性抑制TNFR1提供了中和TNF的促炎活性或炎性响应的机会。具体地，提供了单价高亲和力的结合物，其不仅令人惊讶地避免了对应的二价抗体不期望的副作用，而且更令人惊讶的是，被抗人Ig抗体(ADA)交联时不转化成激动剂，而被抗人Ig抗体(ADA)交联时转化成激动剂通常在慢性疾病治疗方案的反复给药过程中可能发展。
抗TNFR1抗体，称为ATROSAB，根据WO2012035141A1制备，是在哺乳动物细胞中产生的人源化的抗体，并显示出与亲本小鼠H398 IgG相似的结合和中和行为。其没有表现出全长抗体所预期的激动活性。
然而，一旦产生亲和力增加的变体，令人惊讶地发现ATROSAB抗体具有激动活性。因此，原则上避免亲和力成熟以减少不希望的副作用。本发明现在基于令人惊讶的发现，即，即使亲和力增加至KD小于10-8M，特别是即使k解离基本上降低，单价结合huTNFR1受体的抗体构建体也不显示出这种激动活性。
本文所述的抑制剂是有效的TNFR1选择性拮抗剂，并且允许用于疾病的新的治疗选择，其中指示抗TNF治疗剂，或其中抗TNF治疗剂无效或甚至加剧疾病进展，所述疾病包括多发性硬化、充血性心力衰竭、代谢病(II型糖尿病)、细胞因子释放综合征、感染性休克、急性(中风)和慢性(阿尔茨海默病和帕金森病)神经退行性疾病。在已知临床上对抗TNF治疗有响应的疾病中，尤其是在TNFR1的特异性阻断和TNFR2功能维持显示为有希望的治疗方法的那些疾病中，抑制剂可以是特别有用的治疗选择。
将以下限定的主题被认为是本发明的实施方式：
1.一种huTNFR1受体的抑制剂，其是通过抗原结合部分单价识别huTNFR1的人或人源化的抗体构建体，如通过石英晶体微天平(QCM)在37℃对Fab形式所测定的，KD小于5×10-9M且k解离小于10-3s-1。
2.根据定义1所述的抑制剂，其直接抑制TNF-huTNFR1受体的相互作用或huTNFR1受体与淋巴毒素α的相互作用，如在细胞分析中所测定的，优选地通过在Kym-1细胞中抑制TNFR1介导的细胞死亡且IC50值小于5.0×10-9的分析所测定的，或通过抑制HeLa细胞释放IL-6且IC50值小于4.0×10-8的分析所测定的，或通过抑制从HT1080细胞释放IL-8且IC50值小于2.0×10-8的分析所测定的。
3.根据定义1或2所述的抑制剂，其中所述抗原结合部分包括VH和VL结构域，其中VH和VL结构域中的至少一个是亲本结构域的、在任何互补决定区(CDR)序列中包括至少一个点突变的亲和力成熟的功能变体，其中
a)亲本VH结构域的特征在于CDR序列：SEQ ID 1(CDRH1)、SEQ ID 2(CDRH2)和SEQID 3(CDRH3)；和
b)亲本VL结构域的特征在于CDR序列：SEQ ID 4(CDRL1)、SEQ ID 5(CDRL2)和SEQID 6(CDRL3)：
所述CDR序列是根据Kabat编号方案的。
4.根据定义3所述的抑制剂，其中所述至少一个点突变在SEQ ID 2(CDRH2)和/或SEQ ID 6(CDRL3)中的任一者中，优选地其中CDRH2序列是SEQ ID 7，并且CDRL3序列是SEQID 8。
5.根据定义4或5所述的抑制剂，其中所述抗原结合部分是
A
选自由组成员i)至ii)组成的组，其中
i)
是抗原结合部分，其包括
a)鉴定为SEQ ID 1的CDRH1序列；
b)鉴定为SEQ ID 10的CDRH2序列；
c)鉴定为SEQ ID 3的CDRH3序列；
d)鉴定为SEQ ID 4的CDRL1序列；
e)鉴定为SEQ ID 5的CDRL2序列；和
f)鉴定为SEQ ID 11的CDRL3序列；
和
ii)
是抗原结合部分，其包括
a)鉴定为SEQ ID 1的CDRH1序列；
b)鉴定为SEQ ID 10的CDRH2序列；
c)鉴定为SEQ ID 3的CDRH3序列；
d)鉴定为SEQ ID 4的CDRL1序列；
e)鉴定为SEQ ID 5的CDRL2序列；和
f)鉴定为SEQ ID 6的CDRL3序列；
或
B
抗原结合部分，其是亲本抗原结合部分的功能活性变体，所述亲本抗原结合部分是A的任何组成员。
6.根据定义5所述的抑制剂，其中所述功能活性变体包括
a)亲本抗体的任何CDR序列的至少一种功能活性CDR变体；和/或
b)在VH或VL序列任一者的骨架区中的至少一个点突变。
7.根据定义1～6中任一项所述的抑制剂，其中所述抗体构建体选自Fab分子、scFv分子、二硫键稳定性Fv(dsFv)、半IgG1抗体和Fv结构域或前述任何物质的功能活性衍生物组成的组，优选地其中所述抗体构建体与亲水性聚合物偶联，例如PEG，和/或与多肽融合，例如人血清白蛋白、转铁蛋白、白蛋白结合域或肽、Ig结合域、PEG模拟的多肽延伸区、抗体Fc片段、携带突变以允许优选的异源二聚化的抗体Fc片段或任何前述多肽的功能变体。
8.根据定义7所述的抑制剂，其中所述抗体构建体是Fab、scFv、dsFv或Fv结构域中的任一种，所述抗体构建体与抗体Fc片段融合，其中Fc由CH2和CH3结构域的异源二聚体组成，其中CH2和/或CH3结构域携带一个或多个点突变，所述点突变允许优于同源二聚化的异源二聚化。
9.根据定义1～8中任一项所述的抑制剂，其中所述抗体构建体是PEG化的、HES化的或PSA化的。
10.根据定义1～9中任一项所述的抑制剂，其中所述抗体构建体包括以比亲本Fv结构域高的亲和力结合huTNFR1的Fv结构域，其中所述亲本Fv结构域的特征在于，鉴定为SEQ ID 12的亲本VH结构域和鉴定为SEQ ID 16的亲本VL结构。
11.根据定义10所述的抑制剂，其中VH和VL结构域中的至少一个是亲本结构域的亲和力成熟的功能变体，在任何CDR或骨架(FR)序列中包括至少一个点突变。
12.根据定义11所述的抑制剂，其中
a)所述VH结构域包括选自由SEQ ID 12～15组成组中的序列或由其组成；
b)所述VL结构域包括选自由SEQ ID 16～19组成的组的序列或由其组成；或
c)至少一个Fv结构域包括a)或b)任一个的功能活性变体，其中所述功能活性变体在任何CDR或FR序列中包括至少一个点突变。
13.根据定义10～12中任一项所述的抑制剂，
其中Fv结构域是VH和VL结构域的组合，所述Fv结构域是
A
选自由组成员i)至ix)组成的组，其中
i)
VH包括SEQ ID 13或由其组成，并且
VL包括SEQ ID 17或由其组成；
ii)
VH包括SEQ ID 14或由其组成，和
VL包括SEQ ID 18或由其组成；
iii)
VH包括SEQ ID 15或由其组成，并且
VL包括SEQ ID 19或由其组成；
iv)
VH包括SEQ ID 14或由其组成，并且
VL包括SEQ ID 19或由其组成；
v)
VH包括SEQ ID 15或由其组成，并且
VL包括SEQ ID 18由其组成；
vi)
VH包括SEQ ID 13或由其组成，并且
VL包括SEQ ID 18或由其组成；
vii)
VH包括SEQ ID 14或由其组成，并且
VL包括SEQ ID 17或由其组成；
viii)
VH包括SEQ ID 13或由其组成，并且
VL包括SEQ ID 19或由其组成；
和
ix)
VH包括SEQ ID 15或由其组成，并且
VL包括SEQ ID 17或由其组成；
或
B
Fv结构域是VH和VL结构域的组合，其中任何VH和VL结构域是A的组成员中任一者的亲本结构域的功能活性变体。
14.根据定义10～13中任一项所述的抑制剂，其中如通过动态光散射测定的，所述抗体构建体具有至少60℃，或至少61℃，或至少62℃，或至少63℃，或至少64℃或至少65℃的增加的热稳定性，其中所述抗体构建体包括Fv结构域，所述Fv结构域是亲本Fv结构域的功能变体，所述亲本Fv结构域在VH或VL序列任一者的骨架区中具有至少一个点突变。
15.一种药物制剂，其包括根据定义1～14中任一项所述的抑制剂以及药学上可接受的载剂。
16.根据定义15所述的制剂，其配制为肠胃外使用，优选地通过静脉内或皮下施用。
17.一种产生定义1～14中任一项所述的抑制剂的方法，所述方法使用重组哺乳动物表达系统以表达抗体构建体。
18.根据定义17所述的方法，其中使用CHO生产细胞系。
19.根据定义1～14中任一项所述的抑制剂，用于治疗需要抗TNF治疗的人受试者。
20.根据定义19所述的用于所述用途的抑制剂，其中所述抑制剂重复施用于受试者。
21.根据定义19或20所述的用于所述用途的抑制剂，其中所述受试者已经产生了抗DMARD或抗药物的抗体。
22.根据定义19～21中任一项所述的用于所述用途的抑制剂，所述抑制剂作为一线治疗，其中指示抗TNF疗法或非生物DMARD疗法，或作为二线治疗，其中抗-TNF或非生物DMARD治疗剂无效。
23.根据定义20-22中任一项所述的用于所述用途的抑制剂用途，其中所述受试者患有
a)关节、皮肤和肠道的急性或慢性炎症(传染性或非传染性)；和/或
b)自身免疫性疾病、类风湿性关节炎、银屑病、银屑病关节炎、幼年型关节炎、强直性脊柱炎、克罗恩病、多发性硬化症、充血性心力衰竭、代谢病、细胞因子释放综合征、感染性休克、急性和慢性神经退行性疾病、中风、阿尔茨海默病和帕金森病、溃疡性结肠炎、胰腺炎、COPD、急性暴发性病毒或细菌感染、代谢性疾病、慢性神经退行性疾病、以TNF/TNFR1为致病病理介质的遗传性疾病、周期性发热综合征、巨颌症和癌症。
通过以下实施方式进一步说明本发明，但本发明不限于此。
实施例
实施例1：ATROSAB和H398的结合和生物活性
ATROSAB(根据WO2012035141产生的全长抗体)及其亲本小鼠抗体H398(如WO2008113515A2中所述)对人TNFR1显示出相似的结合活性，在标准ELISA中的EC50值分别为0.25nM和0.15nM(图1a)。进一步地，在高受体密度的条件下，通过QCM技术测定出相似的亲和力(KD值)，其中ATROSAB为0.35nM，H398为0.23nM(图1b和c)。
虽然在ELISA和QCM中具有相似的结合，但对于抑制HT1080细胞的TNF-或LT-诱导的IL-8释放，H398比ATROSAB强10至12倍(图2)。考虑到与IL-8释放分析中的HT1080细胞的体外情况相比，在ELISA和QCM测量(在高密度芯片上进行的)中的受体是过高的，因此决定使用受体密度较低的芯片来重复QCM测量。如图3所示，获得的ATROSAB的KD值为4.5nM，H398的KD值为1.6nM(也参见表1)。有趣的是，虽然ATROSAB和H398的KD值相差因子(factor)2.8，但ATROSAB的结合速率(k结合)比H398的k结合快2.6倍，而H398的解离速率(k解离)比ATROSAB的解离慢约7.6倍(图3，表1)。因此，与TNF或LT竞争结合受体，ATROSAB(较快的结合速率)更快地占据游离受体，而H398(较慢的解离速率)阻断占据的受体更长。
考虑到在标准IL-8释放分析的设定中(见下文)，受体构成连续内化的基础，并且内化的受体仍然介导信号传导，与受体结合保持更长时间的抗体(较慢的解离速率)可能是更强的抑制剂。可以排除由于内体小泡(endosomal compartment)中的酸化条件引起的pH依赖性效应，因为在pH 5.4、pH 6.4、pH7.4和pH 8.4进行的实验中，ELISA中ATROSAB和H398与人TNFR1-Fc的结合彼此之间没有明显的差异(数据未显示)。因此，决定将精力放在ATROSAB的“解离速率成熟的”变体的开发上。
表1.ATROSAB和H398的结合和生物活性
实施例2：噬菌体展示第1部分——定点诱变和平衡选择
在先前的工作(Kirstin Zettlitz的博士论文，2010)中，使用单独随机化的CDRH1、CDRH2、CDRL1和CDRL2的噬菌体展示文库，对ATROSAB进行亲和力成熟。在这些CDR中，随机选择在IZI06.1的模型结构中、鉴定为会暴露于抗原结合位点中的位置。使用可溶性生物素化的huTNFR1-Fc与经链霉亲和素包覆的磁性免疫磁珠(Dynabeads)组合，在平衡条件下进行选择。选择条件显示在表2中。虽然鉴定了所有四个CDR的优选的残基，但仅发现CDRH2中的突变(表3)在TNFR1结合方面一些改善。从第6轮中分离出，并且如QCM所测定的，显示出ScFvIG11与TNFR1-Fc结合的KD比scFvIZI06.1(ATROSAB)高两倍。选择ScFvIG11用于进一步的实验，因为与scFvIZI06.1(7.6×10-4s-1)相比，ScFvIG11的解离速率常数k解离降低了近3倍，为2.6×10-4s-1，这表明抗体从抗体-受体复合物中解离的较慢。scFvIZI06.1和scFvIG11的序列比对如图4所示。
表2.使用生物素化的抗原进行平衡选择的条件。
表3：定点诱变的位置，文库L2a
CDRH2(Kabat) 502a3456789602345
scFvlZl06.1 EIYPYSGHAYYNEKFKA
随机化的残基 X.X.XX.X.X..X....
计算的多样性 2.68×10<sup>8</sup>
文库大小 2.57×10<sup>8</sup>
功能性 73％
实施例3：噬菌体展示第2部分——随机诱变和竞争选择
用于以下选择实验的文库是通过对包括scFvIG11的VH和VL(6.2×105菌落形成单位)的整个序列进行易错PCR来产生的。10个分析的单个克隆表明整体诱变率为7.5个突变/每千个碱基对(7.5/kbp)。在CDR中，覆盖整个scFv序列的25％(729bp中的180bp)，观察到55个突变中的15个(27％)，表明突变的分布相当平均。
选择亲和力成熟的克隆scFvT12B
在淘选抗人TNFR1之前，使用人TNFR2进行阴性选择轮，以在选择过程中保持受体选择性。使用固定在免疫试管(immunotubes)上的人TNFR1-Fc，选择结合行为得到改善的经展示的scFv片段。在每轮之后，通过多克隆噬菌体ELISA记录选择库的总结合变化，证明在三轮选择后提高了约2倍(图5a，选择条件显示在表4中)。
表4.选择条件
轮 抗原 噬菌体 竞争
1 1μg/ml 10μl -
2 0.1μg/ml 1ul -
3 0.01μg/ml 1μl 10nM＊
*对于DynaBeads和免疫试管中的选择，溶液中未标记的人TNFR1用于竞争。
将在ELISA中示出对人TNFR1的结合最强(表5)的候选噬菌体表达为可溶性scFv片段，并使用具有中等受体密度的传感器芯片，通过QCM进行动力学分析。克隆scFvT12B显示为从受体中释放的最慢，由最低的k解离值表示(图5b，表5)。
表5.候选噬菌体相关的EC50和k解离值，展示文库EP03与scFvIZI06.1相比
克隆 EC<sub>50</sub> k<sub>解离</sub>
IZI06.1 1 1
IG11 n.d. 0,31
T12B 0,017 0,25
B12B 0,021 0,77
T2A 0,023 0,47
T1C 0,009 0,76
B8E 0,046 0,41
T12E 0,047 0,50
T7B 0,062 0,47
T9H 0,041 0,38
B6F 0,251 0,66
T10D 0,006 0,72
总之，在QCM解离速率筛选中，scFvT12B显示出最佳的结合特征，被认为是改善受体阻断的关键属性。与scFvIG11相比，scFvT12B的DNA序列在三个位置发生了改变，重链可变结构域(VH)CDRH2中的Q1H和T53S，以及轻链可变结构域CDRL3中的S91G(VL，图4)。
scFvT12B的表征
在大肠杆菌TG1的周质中产生可溶性抗体片段scFvT12B、scFvIZI06.1和scFvIG11，并且通过SDS-PAGE证实了适当的表达，其中可以观察到在纯化的样品中有少量的污染(图6a)。在ELISA中证明了与人TNFR1的浓度依赖性结合，显示了scFvIZI06.1、scFvIG11和scFvT12B的EC50值分别为3.8nM、2.6nM和2.0nM(图6b，表6)。因此，与scFvIG11相比，scFvT12B在应用的条件下显示出结合改善了1.3倍。通过QCM测定的KD值，scFvIZI06.1为28.9，scFvIG11为24.9，而scFvT12B为6.0，这表明与scFvIG11相比，scFvT12B的结合改善了4.1倍(图6c，表6)。亲和力的变化源于改善的结合速率常数(k结合增加了2.1倍)和解离速率常数(k解离降低了2.0倍，表6)。最后，与scFvIZI06.1和scFvIG11相比，scFvT12B在体外阻断了TNF诱导的白细胞介素-8释放，且具有改善的拮抗活性(图6d)。由于在应用的高浓度scFv下信号增加，所获得的数据不能朝标准抑制曲线汇聚。然而，近似半抑制浓度反映了，scFvT12B对人TNFR1的阻断比scFvIG11强约7倍(表6)。
表6.与scFvIZI06.1和scFvIG11相比scFvT12B的特征。改善以关于scFvIG11值的因子表示。
scFvIZI06.1 scFvIG11 scFvT12B 改善的
EC<sub>50</sub>(nM) 3，8 2，6 2，0 1.3
k<sub>结合</sub>(M<sup>-1</sup>s<sup>-1</sup>) 5.0×10<sup>5</sup> 1.5×10<sup>5</sup> 3.0×10<sup>5</sup> 2.1
k<sub>解离</sub>(s<sup>-1</sup>) 1.4×10<sup>-2</sup> 3.6×10<sup>-3</sup> 1.8×10<sup>-2</sup> 2.0
K<sub>D</sub>(nM) 28.9 24.9 6.0 4.1
IC<sub>50</sub>(nM)* ～200 ～300 ～45 ～6.7
*近似的IC50值，源自去除最后1～2个数据点后对所获得的11-8数据的评估。
实施例3：H398的重复人源化
如上所述，证明了H398在阻断TNF介导的细胞响应方面比ATROSAB更有效(Zettlitz等，2010)，因此概括了得到scFvIZI06.1(ATROSAB)的人源化过程。为了鉴定替代的人种系基因，优先考虑序列同一性的人性化，并且使用了与scFvH398具有相当低的同源性的克隆用于VH和VL的重复人源化。选择了名为3-11*01和1-39*02的基因，因为它们具有完全的人性化(Abhinandan和Martin 2007)，由更高的正z分数值表示(表7)。将鼠抗体H398的CDR序列转移至所选种系序列的骨架中，得到抗体片段scFvFRK13。使用自动生成的SDR模板(1995，Andrew C.R.Martin，UCL)分析新生成的scFv的规范结构，指示了H71位和L2位上的非典型氨基酸。因此，将这些残基替换为用于产生ATROSAB(VH：R71A，VL：I2V)的氨基酸。与scFvIZI06.1相比，人源化的scFv的重链和轻链的氨基酸序列在氨基酸替换之前(scFvFRK13.1)和氨基酸替换之后(scFvFRK13.2)的变化在图7中的比对中进行了评述。
表7.H398的人源化。
基因座 克隆 同一性 BLAST分数 Z-分数
H398-VH - - - -2.023
1-69＊08 DP88 60.2％ 127 0.317＊
3-11＊01 DP35 45.9％ 109 1.987
基因座 克隆 同一性 BLAST分数 Z-分数
H398-VL - - - -1.829
2D-28＊01 DPK15 79.0％ 161 -1.401＊
1-39＊02 DPK9 54.0％ 109 1.204
*用于人源化的IZI06.1(ATROSAB scFv)的种系基因。
scFvFRK13的表达和表征
除了scFvFRK13.1和scFvFRK13.2之外，克隆并产生了它们的重链和轻链可变结构域的组合以及与scFvT12B的重链或轻链的组合(图8)。在还原条件下，在SDS-PAGE中分析了scFv片段，证明仅scFvFRK13.5和scFvFRK13.7整体表达并干净纯化(图8b)。对于所有其他的构建体，观察到分子量更高和更低的带，表明蛋白样品被污染或产物发生降解。此外，仅scFvFRK13.5和scFvFRK13.7在尺寸排阻色谱中显示出干净的峰，对应于计算的分子量(图8c)。对于这两种蛋白，检测到较短保留时间的较低信号，可能代表存在二聚体scFv或更高级的聚集体。这些发现表明新人源化的VH结构域导致scFv分子不稳定。
使用scFv抗体T12B和IZI06.1作为对照蛋白，在ELISA中进一步分析了scFvFRK13.1～13.8的受体结合(图9a)。虽然scFvFRK13.5、scFvFRK13.7和scFvT12B与人TNFR1结合并具有约1nM的相当的EC50值(表8)，但是scFv的剩余组仅在高于100nM的浓度时显示出弱结合。类似地，scFvFRK13.5、scFvFRK13.7和scFvT12B抑制TNF诱导的HT1080细胞的IL-8释放，IC50值为约300nM。对照蛋白scFvIZI06.1显示出TNFR1阻断，IC50值为932nM(图9b，表8)。此外，通过动态光散射研究了热稳定性。ScFvFRK13.5和scFvFRK13.7分别显示了63℃和65℃的熔解温度，而scFvIZI06.1和scFvT12B的熔解温度分别为59℃和55℃(图10)。值得注意的是，scFvIZI06.1在较低温度下已经显示出平均计数率增加，表明蛋白质结构的部分不稳定。相比之下，在熔点以下时，scFvT12B、scFvFKR13.5和scFvFRK13.7的信号几乎恒定，表明在较低温度范围内改善的稳定性。
表8.人源化的scFvH398抗体片段的表征。
总之，包含新人源化的VH结构域的scFv抗体不能被适当地表达，并且似乎破坏与人TNFR1的结合。含scFvT12B再人源化的VL结构域和VH结构域的ScFvFRK13.7，表达至足够纯度，并且与huTNFR1-Fc的结合和“解离速率成熟的”单链Fv抗体scFvT12B同样强。此外，scFvFRK13.7显示出改善的热稳定性。
实施例4：scFvFRK13.7转化为IgG和Fab片段
通过标准克隆和PCR技术，将scFvFRK13.7的重链和轻链可变结构域引入ATROSABIgG和ATROSAB Fab的背景中。以下将IgG-FRK13.7和Fab-FRK13.7分别称为IgG13.7和Fab13.7。在HEK293T细胞中瞬时产生蛋白，并通过蛋白质A(IgG13.7)或抗体(Fab13.7)亲和色谱进行纯化。由于IgG13.7在较高分子量处的小峰，而对其进行了额外的制备型SEC(FPLC)。通过还原(图11a)和非还原条件(图11c)下的SDS-PAGE，以及通过尺寸排阻色谱(SEC，图11c)，监测了表达和蛋白质完整性。在所有实验中，使用ATROSAB和FabATROSAB(FabATR)作为对照。在电泳过程中，所有四种蛋白质均显示出与所计算的分子量相关的条带。类似地，在凝胶过滤中观察到的吸收峰证实了均质蛋白质制剂，所有表观分子量均与预期的大小一致。与人TNFR2和两种小鼠TNF受体相比，Fab13.7和IgG13.7在ELISA中保留了它们对人TNFR1的特异性(图12)。
FRK13.7抗体与人TNFR1的结合
在ELISA中检测IgG13.7和Fab13.7与人TNFR1-Fc的结合，Fab13.7的EC50值为1.4nM，IgG13.7的EC50值为0.76nM。由更高的EC50值表明，对照蛋白ATROSAB和FabATR的结合显示出比IgG13.7和Fab13.7分别弱1.4倍和8.7倍(图13)。
此外，使用中等(86Hz)或高(184Hz)受体密度的传感器芯片，通过石英晶体微天平进行结合动力学评估。对照抗体ATROSAB显示出在中等受体密度下与人TNFR1-Fc有明显的双相相互作用，由分别由0.38nM和78nM的KD值表示的高亲和力或低亲和力的部分组成(图14a，表9)。相比之下，在OneToTwo结合分析中，IgG13.7显示出在1.77×10-4至9.30×10-4范围内的k解离值(数据未显示)，产生非常少量的解离蛋白，因此很难检测到单价和二价结合和解离亚群之间的差异。因此，在高密度芯片上测试IgG13.7，其中二价相互作用明显占优势，并且可以在很大程度上忽略单价相互作用对结合信号的贡献，允许在OneToOne分析中进行评估。考虑到二价结合情况，测定的0.11nM的KD值反映出比ATROSAB提高3.5倍(图14c)。在检测期间(5分钟)，单价对照蛋白FabATR几乎完全与中等受体密度的芯片解离，显示解离速率常数(k解离)为1.5×10-2s-1并且KD值为30nM(图14b)。相比之下，由k解离值7.3×10-4S-1表示，Fab13.7从抗体-受体复合物中的解离相当慢，而结合速率常数(k结合)与FabATR几乎相同。这导致Fab13.7与人TNFR1的亲和力增强了19倍，KD值为1.6nM(图14d，表9)。
表9.IgG13.7和Fab13.7的亲和力测定。
ATROSAB IgG13.7 FabATR Fab13.7
B<sub>最大</sub>1(Hz) 16.8 6.36 8.93
B<sub>最大</sub>2(Hz) 10.73 55.93
k<sub>结合</sub>1(M<sup>-1</sup>s<sup>-1</sup>) 2.82×10<sup>5</sup> 5.01×10<sup>5</sup> 4.70×10<sup>5</sup>
k<sub>解离</sub>1(s<sup>-1</sup>) 2.19×10<sup>-2</sup> 1.50×10<sup>-2</sup> 7.32×10<sup>-4</sup>
K<sub>D</sub>1(nM) 78 30 1.6
k<sub>结合</sub>2(M<sup>-1</sup>s<sup>-1</sup>) 1.06×10<sup>6</sup> 5.35×10<sup>5</sup>
k<sub>解离</sub>2(s<sup>-1</sup>) 4.07×10<sup>-4</sup> 5.92×10<sup>-5</sup>
K<sub>D</sub>2(nM) 0.38 0.11
因此，与相比，已经证明了ATROSAB(FabATR)的单价抗体构建体是远不如Fab13.7的huTNFR1的结合物。如果以Fab形式测量scFv亲和力，则scFv IZI-06.1与huTNFR1的结合亲和力与FabATR相似。虽然现有技术中测量scFv IZI-06.1可显示更好的结果(由于二聚化scFv分子的亲合力效应)，但是结合的亲和力(以Fab形式)非常低并且与FabATR相当。
scFvFRK13.7衍生蛋白在体外的生物活性和药代动力学
为了研究亲和力成熟和再人源化对自身拮抗性抗体ATROSAB的影响，分别测试了scFvFRK13.7衍生的IgG和Fab诱导HT1080和HeLa细胞释放白细胞介素-8和-6的潜力。ATROSAB(其包括在内作为对照)仅在IL-8的情况下显示出所描述的边缘受体激活(Richter等，2013)，在进行的IL-6释放实验中未观察到高于细胞背景的刺激(图15b和c)。单价对照蛋白FabATR没有刺激相应的细胞类型释放IL-8和IL-6。一致地，未观察到比未经处理的细胞增加的Fab13.7诱导的白细胞介素释放。然而，IgG13.7明显地刺激IL-8和IL-6释放，使得白细胞介素水平为33nM TNF作用的20％至87％，其在先前实验中由TNF刺激的最大响应附近。
有趣的是，由0.1nM TNF引发的HT1080细胞的IL-8释放被ATROSAB和FabATR抑制，可相比的IC50值分别为118nM和151nM(图16a)。类似地，对于由0.1nM TNF引发的HeLa细胞的IL-6释放，ATROSAB和FabATR显示出同样强的抑制(图16b，表10)。由于其激动活性，未测定IgG13.7的半抑制浓度(IC50)。相比之下，Fab13.7以剂量依赖性方式抑制了0.1nM TNF引起的IL-8和IL-6释放，IC50值分别为18.7nM和31.4nM，这表明TNF中和比全长IgG ATROSAB提高了5.8倍至6.2倍。
此外，在Kym-1细胞中，研究了源自scFvFRK13.7的全长IgG和Fab片段促进或抑制TNFR1介导的细胞死亡的潜力。与对照蛋白ATROSAB和FabATR一致，Fab13.7的刺激不会导致任何可检测到的细胞毒性(图17a)。另一方面，IgG13.7在很宽的浓度范围消灭了几乎100％的Kym-1细胞，与使用33nM TNF的阳性对照相当。为了研究非激动性Fab13.7的抑制能力，将Kym-1细胞与0.01nM TNF一起孵育，在单次处理中杀死约90％的细胞。Fab13.7以及对照蛋白ATROSAB和FabATR抑制了TNF介导的细胞死亡，IC50值分别为4.7nM、24nM和37nM，证实了白细胞介素释放分析中的观察结果(图17b，表10)。
表10.ATROSAB和FRK13.7抗体的生物活性
为了评估在药物特异性抗体存在下Fab13.7潜在的激动活性风险，结合分离自山羊的多克隆抗人Fab血清，测试了Fab13.7对HT1080细胞的生物活性。在标准结合ELISA中，可以显示出人Fab特异性山羊血清与Fab13.7的结合(图18a)，然而，在IL-8释放分析中，未检测到Fab13.7与64μg/ml血清一起的高于细胞背景的增加的刺激活性(图18b)。然而，对与抗人Fab血清进行共处理，ATROSAB显示出IL-8的诱导明显增加(图18b)。在先前的实验中，使用ATROSAB和抗人Fc抗体一起获得了类似的结果(未公开，数据未显示)。
使用转基因C57BL/6J小鼠分析了FabATR和Fab13.7的药代动力学特性，其中转基因C57BL/6J小鼠的TNFR1细胞外结构域被替换成人的对应物(图19)。约0.25小时的初始半衰期表明在体内迅速分布。两种Fab片段从血液中快速除去，FabATR的终末半衰期为1.7小时而Fab13.7的终末半衰期为1.56小时。这些结果表明，与ATROSAB的Fab片段相比，经发展的TNFR1拮抗性Fab13.7的药代动力学特征未发生改变。对数据的总结显示在表11中。
表11.FabATR和Fab13.7的药代动力学分析
实施例5：Fab13.7的PEG化衍生物
为了避免Fab13.7在体内相当短的循环时间，对几种策略进行了研究，旨于一方面增加流体动力学半径，另一方面使FcRn介导的药物再循环。
首先，如所述(Choy等，2002)那样，在重链恒定结构域1(CH1)处对Fab13.7(Fd：SEQID 25，轻链：SEQ ID 26)进行修饰。简言之，将IgG1铰链区天然存在的氨基酸序列的一部分(包括第一半胱氨酸残基，随后是两个丙氨酸残基)C-末端地添加至CH1结构域(...DKTHTCAA(SEQ ID 34)，图20a，SEQ ID 27，轻链参见Fab13.7，SEQ ID 26)，产生Fab13.7′。使用0.625mM TCEP，将PEG40000缀合至Fab13.7′，以减少新引入的半胱氨酸残基可能形成的二硫键(图20b)。在ELISA中，与未经修饰的Fab13.7相比，由此产生的Fab13.7PEG与固定的人TNFR1-Fc融合蛋白结合的EC50值增加了2.6倍(图20c，表12)。如在使用HT1080细胞进行的IL-8释放分析中测定的，Fab13.7PEG在体外未显示出显著激活TNFR1(图20d)。在相同的分析条件下，Fab13.7PEG抑制由0.1nM可溶性TNF诱导的HT1080细胞的IL-8释放，IC50值比Fab13.7高4.9倍(图20e，表12)。Fab13.7用PEG40000修饰导致在体内的药代动力学特征得到改善。与Fab13.7相比，初始和终末半衰期以及曲线下面积分别增加了3.8、18.0和22.2因子(图20f，表12)。
表12.单价Fab13.7变体的生物活性
*在不同的单次实验中检测到变化的值
实施例6：Fab13.7 MSA融合蛋白
在另一种方法中，通过基因改造使Fab13.7与小鼠血清白蛋白(MSA)融合，通过12个氨基酸的接头连接(图21a，Fd-MSA：SEQ ID 28，轻链参见Fab13.7，SEQ ID 26)。在非还原条件下，由此产生的Fab13.7-MSA在SDS-PAGE中显示出一单一条带，对应于所计算的分子量114kDa(图21b)。在还原条件下观察到两条带，这对应于解离的轻链和与MSA部分融合的Fd片段。尺寸排阻色谱证实了蛋白质结构的完整性以及不存在聚集或寡聚体化的蛋白质级分(图20c)。在ELISA中，Fab13.7-MSA与固定的人TNFR1-Fc融合蛋白结合，EC50值比未经修饰的Fab13.7增加了1.7倍(图21d，表12)，并且如在使用HT1080细胞进行的IL-8释放分析中测定的，在体外未显示出显著激活TNFR1(图21e)。在相同的分析条件下，Fab13.7-MSA抑制由0.1nM可溶性TNF诱导的HT1080细胞的IL-8释放，IC50值比Fab13.7增加了1.9倍(图21f，表12)。Fab13.7与MSA融合导致在体内的药代动力学特征得到改善。与Fab13.7相比，初始和终末半衰期以及曲线下面积分别增加了7.8、4.3和21.3因子(图21g，表12)。
实施例7：IgG-13.7半抗体
为了产生包含完整的Fab13.7部分以及位于CH2-CH3转换处的FcRn结合位点的单价IgG分子，而改变了IgG1铰链区和Fc部的氨基酸组成以避免发生重链二聚化(图22a，重链IgG 13.7半：SEQ ID 29，轻链参见Fab13.7，SEQ ID 26)。简言之，铰链区的两个半胱氨酸被丝氨酸替换(C224S、C227S)，以阻止链间二硫键的形成。将另外四个突变引入CH3结构域中(P393A、F403R、Y405R、K407D)，以阻止同源CH3-CH3相互作用(还参见Gu等，2015，SEQ ID29，轻链参见Fab13.7，SEQ ID 26)。在非还原条件下，由此产生的IgG13.7半在SDS-PAGE中显示一单一条带，对应于所计算的分子量73kDa(图22b)。在还原条件下观察到两条带，对应于重链和轻链。尺寸排阻色谱证实了蛋白质结构的完整性以及不存在聚集或寡聚体化的蛋白质级分(图21c)。在ELISA中，IgG13.7半与固定的人TNFR1-Fc融合蛋白结合，EC50值比未经修饰的Fab13.7增加了1.9倍(图22d，表12)，并且如使用HT1080细胞进行IL-8释放分析所测定的，在体外未显示出TNFR1的显著激活(图22e)。在相同的分析条件下，IgG13.7半抑制由0.1nM可溶性TNF诱导的HT1080细胞的IL-8释放，IC50值比Fab13.7增加了1.8倍(图22f，表12)。Fab13.7与单体Fc部分的融合导致在体内的药代动力学特征得到改善。与Fab13.7相比，IgG13.7半的初始和终末半衰期以及曲线下面积分别增加了3.7、2.3和4.5因子(图22g，表12)。
实施例8：单价Fab13.7-Fc融合蛋白
为了克服在IgG13.7半情况下药代动力学特性改善有限的问题，而将Fab13.7的Fd和轻链均融合至由FcγR-沉默的CH2和CH3结构域组成的蛋白质部分，其包含另外的突变，所述另外的突变应用“杵臼”修饰促进异源二聚化(图23a，Merchant等，2013，Fd13.7-Fc臼：SEQ ID 30，LC13.7-Fc杵：SEQ ID 31)。简言之，除了CH1、铰链区和CH2的突变(据报道其抑制与Fcγ受体的结合(Armor等，1999，Richter等，2013，Shields等，2001，Zettlitz等，2010))以及如上所述的在铰链区中半胱氨酸至丝氨酸的变化之外，在CH3结构域中引入了突变T366S、L368A和Y407V，其中CH3结构域与Fd片段连接，而将与Fab13.7轻链连接的CH3结构域的单个苏氨酸残基变为色氨酸(T366W)。在非还原条件下，由此生成的Fab13.7-Fckih0DS(Fab13.7连接到Fc部，以杵臼[kih]驱动异源二聚化并且在铰链区中没有二硫键[0DS]键)在SDS-PAGE中显示一单一条带，对应于全蛋白质计算的分子量98kDa(图23b)。在还原条件下，观察到两条带，对应于重链和轻链。尺寸排阻色谱证实了蛋白质结构的完整性以及不存在聚集或寡聚体化的蛋白质级分(图23c)。在ELISA中，Fab13.7-Fckih0DS与固定的人TNFR1-Fc融合蛋白结合，与未经修饰的Fab13.7相比具有相似的活性(图23d，表12)，并且如在使用HT1080细胞进行的IL-8释放分析中测定的，在体外没有显示TNFR1的显著激活(图23e)。在相同的分析条件下，Fab13.7-Fckih0DS抑制了由0.1nM可溶性TNF诱导的HT1080细胞的IL-8释放，IC50值比Fab13.7增加了2.3倍(图23f，表12)。Fab13.7与异源二聚化的Fc部融合使在体内的药代动力学特征得到改善。与Fab13.7相比，Fab13.7-Fckih0DS的初始和终末半衰期以及曲线下面积分别增加了7.0、8.9和21.3因子(图23g，表12)。
实施例9：单价Fv13.7-Fc融合蛋白
在另一种形式中，Fv13.7的可变结构域(VH、VL)分别与Fc链的铰链区融合(VH-铰链-Fc(杵)、VL-铰链-Fc(臼))，如对Fab13.7-Fckih0DS(图24a，VH13.7-Fc臼：SEQ ID 32，VL13.7-Fc杵：SEQ ID 33)所述。在还原和非还原条件下，由此生成的Fv13.7-Fckih0DS在SDS-PAGE中显示一单一条带，对应于分子量相似的两个独立的多肽链，得到全蛋白质计算的MW98kDa(图24b)。尺寸排阻色谱证实了蛋白质结构的完整性以及不存在聚集或寡聚体化的蛋白质级分(图24c)。在ELISA中，Fv13.7-Fckih0DS与固定的人TNFR1-Fc融合蛋白结合，活性比未经修饰的Fab13.7略微增加(图24d，表12)，并且如使用HT1080细胞进行的IL-8释放分析中测定的，在体外没有显示TNFR1的显著激活(图24e)。在相同的分析条件下，Fv13.7-Fckih0DS抑制由0.1nM可溶性TNF诱导的HT1080细胞的IL-8释放，IC50值与Fab13.7类似(图24f，表12)。Fv13.7与异源二聚化Fc部融合使在体内的药代动力学特征得到改善。与Fab13.7相比，Fv13.7-Fckih0DS的初始和终末半衰期以及曲线下面积分别增加了4.1、10.5和15.4因子(图24g，表12)。
当前的数据证明，与ATROSAB和FabATR相比，Fab13.7的拮抗效力得到提高，这源于抗体受体复合物的相当慢的解离。由于在白细胞介素释放和细胞毒性分析中观察到ATROSAB和FabATR的IC50值类似，因此仅存在一个受体结合位点而非两个似乎不会降低抑制TNF介导的TNFR1激活的能力。相比之下，缺乏人TNFR1的第二结合位点消除了在IgG13.7的情况下观察到的激动效力。此外，在单独或者存在对人Fab特异性的多克隆山羊血清(旨在通过抗体介导的交联恢复双价或多价)的情况下，都没有检测到Fab13.7的激动活性。这可以表明在体内环境中发生与炎症相关的副作用的风险降低，即使在抗药物免疫应答的情况下也是如此。最后，由于尺寸减小且缺乏FcRn介导的药物再循环，与完整的IgG分子相比，Fab13.7在血液中表现出相当短的循环时间。半衰期延长策略的实现能克服这个缺点，强调了Fab13.7被成功修饰的潜力，以满足未来临床应用中在人体长时间循环的需求。
实施例10：标准分析的具体材料和方法
材料
辣根过氧化物酶(HRP)缀合的抗小鼠IgG(Fc特异性)抗体、HRP缀合的抗人IgG(整个分子，Fc特异性，Fab特异性)抗体分别购自西格玛(Sigma)(陶夫基尔兴(Taufkirchen)，德国)。靶向scFv抗体His-标签的HRP缀合的抗体购自圣克鲁斯生物技术(Santa CruzBiotechnology)(圣克鲁兹(Santa Cruz)，USA)。人横纹肌肉瘤细胞系Kym-1在RPMI 1640培养基、10％FCS、2mM L-谷氨酰胺中生长，HT1080wt细胞，HeLa细胞在RPMI 1640培养基、5％FCS、2mM L-谷氨酰胺中生长。人TNFR2-Fc融合蛋白(Mohler等，1993，The Journal ofImmunology 151.Jg.，Nr.3，S.1548-1561)。化学品购自罗斯(Roth)(卡尔斯鲁厄(Karlsruhe)，德国)，而酶(克隆和PCR)和补充试剂购自赛默飞(ThermoFisher)(慕尼黑(Munich)，德国)。以下明确说明了任何不同来源的消耗品。
TNFR1-Fc融合蛋白的表达
使用UniProtKB(Swiss-Prot)条目P19438(人(智人)TNFR1)、P20333(人(智人)TNFR2)和P25119(小鼠(小家鼠)TNFR2)的序列信息，在各个结构域之间引入适当的限制性位点，合成产生(Geneart，雷根斯堡(Regensburg)，德国)了编码人TNFR1(aa 29～211)、小鼠TNFR1(aa 30～212)和小鼠TNFR2(aa 23～258)的细胞外区域的DNA，并克隆到pSecTagL1-Fc(从pSecTag-FcHis修饰，(Muller等，J.Immunol.Methods(2008)339(1)：90-8))中。使用脂质体(lipofectamine)(Invitrogen，Karlsruhe，德国)，用质粒DNA转染HEK293细胞，并如所述那样在博莱霉素(zeocin)存在下选择稳定转染的克隆(Muller等，J.Biol.Chem(2007)282(17)：12650-60)。将细胞在RPMI、5％FCS、2mM L-谷氨酰胺中扩增至90％细胞覆盖(confluence)。为了产生蛋白质，将培养基替代成Opti-MEM I(Invitrogen，Karlsruhe德国)，每3～4天收集一次上清液。如下所述，从细胞培养上清液中纯化蛋白质。
scFv抗体片段在大肠杆菌TG1周质中的表达
将含表达质粒的大肠杆菌TG1的起始培养物在20ml 2xTY(100μg/ml氨苄青霉素，1％葡萄糖)中，37℃孵育过夜。第二天，将10ml的过夜培养物接种到1升2xTY(100μg/ml氨苄青霉素，0.1％葡萄糖)中，并在37℃振荡孵育直至OD[600nm]达到0.8～1.0。加入1ml IPTG(最终浓度1mM)后，将培养物在室温下再孵育3～4小时。4500*g离心收获细菌，将沉淀块重悬于PPB中至终体积为50ml。为了从周质中释放出抗体片段，加入0.25ml溶菌酶(ddH2O中10mg/ml)，然后悬浮液在冰上孵育30分钟。在下一个离心步骤(10000*g，10分钟，4℃)之前，通过加入0.5ml 1M MgSO4来稳定剩余的成球细胞(spheroblast)。将上清液在4℃下用PBS透析过夜。如下所述，在额外的离心步骤(1000*g，15分钟，4℃)后，从透析的溶液中纯化抗体片段。
瞬时转染后IgG13.7和Fab3.7的表达
培养HEK293细胞直至5个175cm2的瓶子达到70～90％的细胞覆盖。首先将100μg载体DNA和250μl脂质体各自混合，各自使用7ml Opti-MEM，然后混合在一起并在室温下孵育30分钟。使用Opti-MEM将转染混合物调节至25ml的体积，将每个瓶中的培养基替换为5ml转染溶液，并将细胞在37℃以及5％CO2孵育4～6小时。产生通过将转染培养基替换为50mlOpti-MEM来开始，其中Opti-MEM每隔一天更换一次，直至收集到至少一升。如下所述，对上清液进行无菌过滤并纯化。
蛋白质纯化-固定化金属亲和色谱(IMAC)
经无菌过滤的组织培养物上清液或透析的周质提取物与Ni-NTA(Ni-NTA琼脂糖，64-17-5，Macherey-Nagel，Dueren，德国)一起在4℃转动过夜。为了收集纯化树脂，通过重力流或中等真空压力，将含有珠粒的上清液装载到色谱柱中。使用含有20mM咪唑的IMAC缓冲液进行洗涤，直到伴随的布拉德(Bradford)试验(90μl Bradford试剂(500-0006，BIO-RAD，Munich，德国)+10μl样品混合在96孔微量滴定板中)在流出液中几乎检测不到蛋白质。用IMAC缓冲液中的250mM咪唑从树脂上洗脱蛋白质，并收集500μl的级分。合并含蛋白质的级分(如所述那样，通过Bradford快速测试进行确定)并用PBS透析。
蛋白质纯化-抗体和蛋白A亲和色谱
使用AFrProtein A-650F(蛋白A树脂，22805，Tosoh，Stuttgart，德国)或HiTrap KappaSelect(与琼脂糖基质缀合的κ链选择性抗体片段，17-5458-12，GEHealthcare，Chalfont St Giles，GB)树脂，按照IMAC所述的那样进行操作。用PBS进行洗涤，并且用pH 2～3的100mM甘氨酸从树脂上洗脱下蛋白质。将洗脱的级分直接合并，并立即用PBS透析。
制备型尺寸排阻色谱
在制剂中聚集或多聚体组装蛋白的情况下，使用纯化器进行另外的尺寸排除步骤。使用PBS作为液相，在Superdex 200 10/300GL柱上以0.5ml/min的流速分离蛋白质。收集200μl的级分，合并含有峰的样品用于进一步的实验。
蛋白质表征-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)
使用3μg蛋白质制备物以及指定百分比的积层和分离凝胶，严格按照Laemmli1970进行SDS-PAGE。
蛋白质表征-尺寸排阻色谱(SEC)
为了确定流体动力学半径，使用Waters 2695 HPLC结合Phenomenex Yarra SEC-2000柱(300×7.8mm，流速0.5ml/min)分析了30μg纯化的蛋白质样品。流动相为0.1MNa2HPO4/NaH2PO4、0.1M Na2SO4，pH 6.7。使用以下标准蛋白：甲状腺球蛋白(669kDa)、去铁蛋白(443kDa)、醇脱氢酶(150kDa)、BSA(66kDa)、碳酸酐酶(29kDa)、FLAG肽(1kDa)。
蛋白质表征-动态光散射测定热稳定性
使用ZetaSizer Nano ZS(Malvern，Herrenberg，德国)，通过动态光散射测量随温度升高的稳定性。使用PBS，将约100μg纯化的蛋白质样品调节至总体积1ml，并施加到石英比色杯中。测量每秒基洛尔计数(kcps)，表示溶液中变性蛋白质颗粒的尺寸，其中在加热时蛋白质聚集，变性蛋白质颗粒的尺寸增加。温度从35℃逐步升高至80℃(1℃间隔，每次测量前平衡2分钟)。
酶联免疫吸附分析(ELISA)
用100μl指定的蛋白质(在PBS中为1μg/ml，参见表3.3)包被微量滴定板，并在4℃孵育过夜。用2％MPBS(PBS中的脱脂乳，每孔200μl)在室温下封闭残留的结合位点2小时，随后用PBS洗涤两次。将100μl在2％MPBS中稀释的样品在室温孵育一小时，然后用100μl在2％MPBS中的HRP缀合的检测抗体进行最后的孵育步骤。在竞争实验的情况下，分别制备两种分析的蛋白质样品(经滴定或稀释至单一浓度)并混合，然后将它们施加到板上。用100μl TMB底物溶液检测结合的蛋白，通过加入50μl 1M H2SO4终止HRP反应，并使用Infinite微量滴定板读数器(TECAN，Maennedorf，瑞士)测量450nm波长处的吸收值。在每个孵育步骤之间以及检测之前，将板用PBST洗涤三次并用PBS洗涤两次。
使用石英晶体微天平进行亲和力测量
通过石英晶体微天平测量(A-100 C-Fast或Cell-200 C-Fast，Attana，斯德哥尔摩(Stockholm)，瑞典)，测定蛋白质-蛋白质相互作用中的实时结合动力学。根据制造商的方案，结合配偶体(配体，例如TNF1-Fc)之一以不同的密度(在饱和条件下接近200Hz，以证实先前公布的结果，以及50～100Hz，特别是约50Hz，以建立较低的受体密度条件，更类似于细胞表面上的情况)，化学固定在羧基传感器芯片上。用稀释在pH 7.4的PBST(PBS，0.1％Tween 20)中的样品(分析物)，在37℃，以25μl/min的流速进行结合实验。芯片用25μl 5mMNaOH或20mM甘氨酸(pH 2.0)再生。每进行三次测量，测量一次运行缓冲液的注射，将其从结合曲线中减去。使用Attana为特定设备提供的软件来收集数据，并通过Attaché办公评估(Office Evaluation)软件(Attana，Stockholm，瑞典)和TraceDrawe(ridgviewinstruments，Vange，瑞典)进行分析。
Kym-1细胞毒性分析
将Kym-1细胞(每孔1×104)接种到96孔微量滴定板中，并在37℃和5％CO2孵育过夜。将蛋白质在RPMI 1640+10％FCS中稀释。如果在竞争实验中一起使用两种蛋白质，则单独制备两种样品(滴定或稀释至单一浓度)，混合后将它们施加到板上。将板在37℃和5％CO2孵育24小时，然后弃去上清液，并向细胞中加入50μl结晶紫溶液。随后，将板在ddH2O中洗涤20次并干燥。通过加入100μl甲醇并在室温下振荡10分钟，溶解剩余的紫色染料(由通过染色溶液中的甲醇固定的活细胞和贴壁细胞产生)。使用Infinite微量滴定板读数器(Tecan，Maennedorf，瑞士)测量板。
白细胞介素释放分析
按每孔2×104个HeLa或HT1080细胞，将细胞接种到96孔微量滴定板中并在100μlRPMI 1640+5％FCS中生长过夜。第二天，更换上清液以除去组成性产生的细胞因子。将细胞与系列稀释的样品一起在RPMI 1640+5％FCS中于37℃和5％CO2孵育。在竞争实验的情况下，分别制备两种分析的蛋白质样品(经滴定或稀释至单一浓度)，混合后将它们施加到板上。未刺激的细胞作为对照。16～20小时后，将板以500g离心5分钟，并根据制造商的方案通过ELISA直接分析细胞上清液。将上清液稀释于RPMI 1640(不含FCS)中，并将抗体稀释于试剂稀释液(0.1％BSA、0.05％Tween 20、20mM TRIS、150mM NaCl，pH7.5)中。使用PBS中的2％BSA(牛血清白蛋白)封闭包被的微量滴定板，如上对ELISA所述的，进行洗涤以及检测和测量。用于检测细胞培养上清液中的IL-6和IL-8的夹心ELISA试剂盒购自Immuno Tools(Friesoythe，德国)。
药代动力学
向在特定小鼠基因的基因座上携带人TNFR-1的细胞外结构域基因(C57BL/6J-huTNFRSF1Aecdtm1UEG/izi)的转基因C57BL/6J小鼠，静脉内注射12μg～25μg分析的蛋白质。未改变遗传背景的C57BL/6J作为对照。在3分钟、30分钟、1小时、3小时和6小时后，以及3天和7天后，收集血液样品并立即在冰上孵育。通过离心(13000g，4℃，10分钟)分离血清并于-20℃储存。如上所述，通过结合ELISA检测血清中剩余的蛋白质。数据显示为3分钟值的百分比。或者，从获得的曲线内插注射时间处的ELISA信号，并基于注射剂量和小鼠的平均血液体积设定初始体内浓度，得到在测量时间点的指示的浓度。
噬菌体展示-受体载体pHENIS_scFvIG11-fsSTOP的克隆
使用引物NcoI_VHIZI06.1_反(back)和BstZ17I_fsSTOP_BssHII_正(for)，通过PCR(如上所述)从模板pHENIS-scFvL2a_huBR6_IG11(Zettlitz 2010b)扩增出编码scFvIG11的DNA序列。在用NcoI和BstZ17I消化后，将获得的含有移码结合终止密码子的DNA片段再次插入pHENISscFvL2a_huBR6_IG1中，得到受体载体pHENIS_scFvIG11-fsSTOP。
噬菌体展示-生成选择文库EP03
根据制造商的方案，使用GeneMorph II随机诱变试剂盒(GeneMorph II RandomMutagenesis Kit)(200550，安捷伦科技(Agilent Technologies)，圣克拉拉(SantaClara)，CA，USA)，通过易错PCR产生用于scFvIG11亲和力成熟的选择文库EP03，以产生scFvT12B。通过使用引物LMB2和fdSeq1，来扩增模板DNA pHENIS-scFvLib2a_huBR6_IG11。为了产生适度的突变发生率，在30个循环的PCR反应中使用0.1μg模板DNA。将得到的PCR产物经酶NcoI和NotI消化后，克隆到受体载体pHENIS_scFvIG11_fsSTOP中。在16℃过夜，进行连接。第二天，通过加入1/10的100％乙醇的连接混合物体积(LMV)3M NaAc(pH 5.2)、5μl糖原(20μg/μl)和2.7LMV沉淀连接的DNA。在-80℃孵育1小时后，将DNA离心(13000*g，室温，5分钟)，并将空气干燥的沉淀物重悬于40μl ddH2O中，再以2～4μl等份冷冻在-20℃。3.18.3.电转感受态大肠杆菌TG1的制备，将在SOB培养基(含有1％葡萄糖)中生长的大肠杆菌TG1的5ml过夜培养物转移到500ml新鲜的SOB中，接种培养物并生长，直至OD[600nm]达到0.5～1.0。随后将细胞在冰上冷却至少15分钟，并通过离心(2000*g，4℃，15分钟)收获。将细胞沉淀物轻轻重悬于200ml冰冷却的ddH2O中(首先使用20ml，重悬后再加入180ml)。完全如上所述，第二次重复离心/重悬的循环，然后将重悬的细胞在冰上保持30分钟并再次离心(2000*g，4℃，15分钟)。将细菌重悬于50ml 10％甘油中，在冰上再孵育30分钟，并通过离心(1500*g，4℃，15分钟)再次收集。将得到的沉淀物重悬至500～1000μl的最终体积，保持在冰上并直接用于电穿孔。
噬菌体展示-大肠杆菌TG1的电穿孔
新鲜制备电转感受态大肠杆菌TG1(StrataGen，Kirkland，WA，USA)，并将40μl细胞悬浮液与冷冻的等份连接的DNA混合。在冰上孵育1分钟后，将DNA细菌混合物转移至电穿孔比色杯(BIO-RAD，Munich，德国)并立即进行电穿孔(17kV/cm，200Ω，25μF，XCell，BIO-RAD，Munich，德国)。随后，通过用1ml LB冲洗比色杯来拯救转化的细胞，将其转移到培养管中并在37℃振荡孵育1小时，然后在LBamp琼脂板上铺板。出于对照目的，将10μl、1μl和0.1μl转化的样品，以及2.5μl含2μl ddH2O或1μl pUC DNA(0.1ng/μl)与感受态细胞混合的电穿孔样品，分别铺板于LBamp琼脂板上。
噬菌体展示-辅助噬菌体的制备
使用来自过夜培养物的大肠杆菌TG接种500ml 2xTY培养物(OD[600nm]0.05～0.07)，其中的过夜培养物起始于在最小平板上新鲜划线的细菌。在OD[600nm]为0.4～0.5时，加入1ml VSC M13辅助噬菌体(StrataGen，Kirkland，WA，USA)，将培养物在不进行振荡的情况下在37℃培养30分钟，再在37℃下振荡培养30分钟。随后，加入卡那霉素至最终浓度为30μg/ml，并将培养物在30℃下振荡孵育过夜。最后，通过离心(4000*g，45分钟，室温)分离细菌，并将含有噬菌体的上清液以1ml等份试样储存在-20℃。
噬菌体展示-噬菌体拯救和沉淀
从LB琼脂板收集转化的细菌，并接种50ml 2xTY(2％葡萄糖、100μg/ml氨苄青霉素)至起始OD[500nm]为0.05～0.07。当通过37℃振荡孵育使培养物的OD[600nm]达到0.4～0.5时，加入1ml VSC M13辅助噬菌体，首先将培养物在不进行振荡的情况下在37℃孵育(30分钟)，然后再振荡孵育(30分钟)。随后，通过离心(4000*g，室温，15分钟)收获细菌，重悬于含有100μg/ml氨苄青霉素和30μg/ml卡那霉素的50ml新鲜的2xTY中，并在30℃下振荡孵育过夜。第二天，将细菌离心(4000*g，室温，30分钟)，将10ml 20％PEG6000添加至40ml上清液中，轻轻混合并在4℃下转动1小时。离心(4000*g，室温，30分钟)后，将沉淀的噬菌体溶解在1ml PBS中，再次在13000*g以及室温离心10分钟。含有扩增的噬菌体的无菌上清液立即用于选择(或储存在4℃以备后用)。
噬菌体展示-免疫试管选择
免疫试管包被有人TNFR1-Fc或人TNFR2-Fc，浓度随每轮选择而减少(第1轮：1和0.1μg/ml，第2轮：0.1和0.01μg/ml等等；huTNFR2总是以2μg/ml包被)。用2％MPBS封闭试管。将1或10μl沉淀的噬菌体加入1ml 2％MPBS中，并在经人TNFR2-Fc包被的试管中孵育，以消除交叉反应的噬菌体。该阴性选择仅在第一轮选择之前进行。在室温孵育1小时后，将上清液转移到包被有人TNFR1-Fc的免疫试管中并再孵育1小时。从第2轮开始，将可溶性人TNFR1-Fc加入免疫试管中，终浓度为5μg/ml，以快速捕获解离的噬菌体并阻止它们与固定化受体结合。随后弃去上清液，用PBST(0.1％吐温(Tween)20)洗涤试管10次，用PBS洗涤10次。在孵育7分钟后，用1ml 100mM TEA(三乙胺)洗脱噬菌体。立即用500μl 1M TrisHCl缓冲液(pH7.5)中和洗脱的噬菌体，并加入到8.5ml早期对数期大肠杆菌TG1中。如上所述进行孵育以进行转导(37℃，静置，30分钟；37℃，振荡，30分钟)。通过离心(4000*g，室温，10分钟)分离细菌并铺板至LBamp板上。
噬菌体展示-受体-Fc融合蛋白的生物素化
将蛋白质样品与过量20倍摩尔的Sulfo-NHS-SS-生物素(Biotin)(Pierce，Rockford，USA)混合并在室温下孵育2小时后，将人TNFR1-Fc和人TNFR2-Fc生物素化。通过在4℃用PBS透析过夜，从样品中除去剩余的游离Sulfo-NHS-SS-生物素(Biotin)。在对固定化TNF的标准结合ELISA中，测试TNFR1-Fc和TNFR2-Fc的成功生物素化。通过PolyHRP-Strep，检测结合的受体-Fc融合蛋白。如上所述进行ELISA。
噬菌体展示-在磁性免疫磁珠(Dynabead)上的平衡选择
为了以交叉反应的方式除去与人TNFR2结合的噬菌体或融合的Fc部分，将1μl或10μl沉淀的噬菌体加入到含有0.1μM人TNFR2-Fc的1ml 2％MPBS中，并在室温下转动孵育1小时。随后，将50μl磁性链霉亲和素蛋白包被的Dynabeads加入到选择混合物中，并再转动5分钟。然后，通过将2ml反应管放入磁性装置(-S，Life Technologies，Carlsbad，CA，USA)中分离珠粒，将选择混合物转移到新的2ml反应管中，并将人TNFR1-Fc加入选择混合物中(第1轮：10nM/1nM，第2轮：1nM/0.1nM，第3轮：0.1nM/0.01nM)。在室温下孵育(转动1小时)后，在选择混合物中加入10μl Dynabeads，并如对人TNFR2-Fc的阴性选择轮所述那样进行孵育和分离。弃去上清液，向珠粒中加入1ml 10mM DTT(二硫苏糖醇)，以从抗原中释放结合的噬菌体。如对免疫试管选择所述进行转导。
噬菌体展示-多克隆噬菌体ELISA
通过多克隆噬菌体ELISA，测试噬菌体库的所有结合的变化。实验步骤描述在ELISA部分中，这里进行噬菌体展示选择的抗原用于包被。将10μl沉淀的噬菌体与90μl 2％MPBS混合，施加到微量滴定板上，并使用抗M13-HRP抗体(27942101，GE Healthcare，Chalfont St Giles，GB)检测结合的噬菌体。
噬菌体展示-噬菌体展示选择的筛选
将单个克隆(100至400个菌落)接种到1～4个微量滴定板的每孔100μl 2xTYLBamp中，这些单个克隆挑取自最后一轮的选择转导后从平板中，并在37℃下振荡孵育。当看到浑浊时，加入25μl含有VCS M13辅助噬菌体(每个微量滴定板1ml)的LB，并如所述那样进行孵育转导。随后，将25μl含有240μg/ml卡那霉素(终浓度30μg/ml)的LB加入微量滴定板中，并将板在30℃孵育，振荡过夜。第二天，通过离心(500*g，室温，5分钟)分离细菌，并将上清液与2％MPBS以1∶1混合，并在单点测量或滴定中，通过如多克隆噬菌体ELSIA中所述的进行ELISA分析。
噬菌体展示-包含细菌培养物上清液的噬菌体的解离速率筛选
使用QCM技术，通过解离速率筛选测定携带scFv的噬菌体的解离速率常数。与所述方案类似地进行噬菌体拯救，然而，将其规模缩小至5ml LB培养物。100μl过夜培养物(或纯化的scFv制剂)用于接种，并且当培养物显示出可见的混浊时，加入VSC M13辅助噬菌体。如上所述进行以下步骤。在没有沉淀的情况下，将含有噬菌体的上清液以1∶2稀释在PBST(0.1％吐温20)中，并施加到传感器芯片上，其中传感器芯片上固定有中等密度(48Hz)的huTNFR1-Fc。运行缓冲液以1∶1与LB混合，以最小化缓冲效应。使用Attaché办公软件(office software)(Attana，Stockholm，瑞典)分析三次测量的平均值。
Fab13.7与聚乙二醇的偶联
将经半胱氨酸修饰的Fab13.7(Fab13.7′)与甲氧基-PEG40kDa2马来酰亚胺(mPEG-Mal)偶联。前一天，通过加入TCEP(三(2-羧乙基)膦，f.c.5mM)并在室温下孵育2小时，来还原蛋白质。然后通过在D-TubeTM Dialyzer Mini(MW截止6-8kDa)中用氮饱和的1×Nellis缓冲液(10mM Na2HPO4/NaH2PO4缓冲液，0.2mM EDTA，30mM NaCl，pH 6.7)在4℃下使用磁力搅拌器透析过夜，来除去TCEP。将还原的Fab13.7′与mPEG-Mal以1∶10的摩尔比(蛋白质：mPEG-Mal)混合，并在室温下孵育1小时。为了避免Fab13.7′再氧化，用氮气覆盖孵育物。最后，通过在室温下加入L-半胱氨酸(f.c.100μM)10分钟，来猝灭游离的和反应性马来酰亚胺基团。
参考文献
Abhinandan KR，Martin AC.Analyzing the″degree of humanness″of antibodysequences.J Mol Biol.2007 369(3)：852-62.
Richter F，Liebig T，Guenzi E，Herrmann A，Scheurich P，Pfizenmaier K，Kontermann RE.Antagonistic TNF receptor one-specific antibody(ATROSAB)：receptor binding and in vitro bioactivity.PLoS One.2013 8(8)：e72156.doi：10.1371/journal.pone.0072156.eCollection 2013.
Zettlitz KA，Lorenz V，Landauer K，Münkel S，Herrmann A，Scheurich P，Pfizenmaier K，Kontermann R.ATROSAB，a humanized antagonistic anti-tumornecrosis factor receptor one-specific antibody.MAbs.2010 2(6)：639-47.
Armour KL，Clark MR，Hadley AG，Williamson LM.Recombinant human IgGmolecules lacking Fcgamma receptor I binding and monocyte triggeringactivities.Eur J Immunol.1999 Aug；29(8)：2613-24.
Choy EH，Hazleman B，Smith M，Moss K，Lisi L，Scott DG，Patel J，Sopwith M，lsenberg DA.Efficacy of a novel PEGylated humanized anti-TNF fragment(CDP870)in patients with rheumatoid arthritis：a phase II double-blinded，randomized，dose-escalating trial.Rheumatology(Oxford).2002 Oct；41(10)：1133-7.
Gu J，Yang J，Chang Q，Liu Z，Ghayur T，Gu J.ldentification of Anti-EGFRand Anti-ErbB3 Dual Varriable Domains lmmunoglobulin(DVD-lg)Proteins withUnique Activities.PLoS One.2015；10(5)：e0124135.Published online 2015 May21.doi：10.1371/journal.pone.0124135
Merchant M，Ma X，Maun HR，Zheng Z，Peng J，Romero M，Huang A，Yang NY，Nishimura M，et al.Monovalent antibody design and mechanism of action ofonartuzumab，a MET antagonist with anti-tumor activity as a therapeutic agentProc Natl Acad Sci U S A.2013 August 6；110(32)：E2987-E2996.Published online2013 July 23.doi：10.1073/pnas.1302725110
Shields RL，Namenuk AK，Hong K，Meng YG，Rae J，Briggs J，Xie D，Lai J，Stadlen A，Li B，Fox JA，Presta LG.High resolution mapping of the binding siteon human lgG1 for Fc gamma RI，Fc gamma RII，Fc gamma RIII，and FcRn and designof IgG1 variants with improved binding to the Fc gamma R.J Biol Chem.2001 Mar2；276(9)：6591-604.Epub 2000 Nov 28.

Claims (21)

1.一种huTNFR1受体的抑制剂，所述抑制剂是通过抗原结合部分单价识别huTNFR1的人或人源化的抗体构建体，其中所述抗原结合部分包括：
-重链可变(VH)结构域，所述重链可变(VH)结构域包括CDR序列CDRH1、CDRH2和CDRH2，以及
-轻链可变(VL)结构域，所述轻链可变(VL)结构域包括CDR序列CDRL1、CDRL2和CDRL2，其中：
A
a)CDRH1序列被鉴定为SEQ ID 1；
b)CDRH2序列被鉴定为SEQ ID 10；
c)CDRH3序列被鉴定为SEQ ID 3；
d)CDRL1序列被鉴定为SEQ ID 4；
e)CDRL2序列被鉴定为SEQ ID 5；和
f)CDRL3序列被鉴定为SEQ ID 11；
或者
B
a)CDRH1序列是SEQ ID 1的功能活性CDR变体；和/或
b)CDRH2序列是SEQ ID 10的功能活性CDR变体；和/或
c)CDRH3序列是SEQ ID 3的功能活性CDR变体；和/或
d)CDRL1序列是SEQ ID 4的功能活性CDR变体；和/或
e)CDRL2序列是SEQ ID 5的功能活性CDR变体；和/或
f)CDRL3序列是SEQ ID 11的功能活性CDR变体；
其中，除了CDRH2中的第5位和CDRL3中的第3位之外，所述功能活性CDR变体在相应的CDR序列中的任何位置包括不超过1个或2个点突变。
2.根据权利要求1所述的抑制剂，其中，所述抗体构建体选自由Fab分子、scFv分子、二硫键稳定性Fv(dsFv)、半IgG1抗体和Fv结构域，或前述物质任一种的功能活性衍生物组成的组，优选地，其中所述抗体构建体与亲水性聚合物偶联和/或与多肽融合，所述亲水性聚合物例如为PEG，所述多肽例如为人血清白蛋白、转铁蛋白、白蛋白结合结构域或肽、Ig结合结构域、PEG-模拟多肽延伸物、抗体Fc片段、携带突变以允许优选的异源二聚化的抗体Fc片段，或前述多肽任一种的功能变体。
3.根据权利要求2所述的抑制剂，其中，所述抗体构建体是Fab、scFv、dsFv或Fv结构域中的任一种，所述抗体构建体与抗体Fc片段融合，其中所述Fc由CH2结构域和CH3结构域的异源二聚体组成，其中所述CH2结构域和/或所述CH3结构域携带一个或多个点突变，允许进行比同源二聚化优选的异源二聚化。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的抑制剂，其中，所述抗体构建体是PEG化的、HES化的或PSA化的。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的抑制剂，其中，与亲本Fv结构域相比，所述抗体构建体包括与huTNFR1的结合亲和力增加的Fv结构域，
其中所述亲本Fv结构域的特征是被鉴定为SEQ ID 12的亲本VH结构域和被鉴定为SEQID 16的亲本VL结构域；优选地，其中该VH结构域和该VL结构域中的至少一个是亲本结构域的亲和力成熟的功能变体，在CDR序列或骨架(FR)序列任一者中包括至少一个点突变。
6.根据权利要求1～5中任一项所述的抑制剂，其中
a)所述VH结构域包括以下序列或由该序列组成，其中该序列选自由SEQ ID 13～15，或SEQ ID 13～15中任一者的功能活性变体组成的组；和/或
b)所述VL结构域包括以下序列或由该序列组成，其中该序列选自由SEQ ID 17～19，或SEQ ID 17～19中任一者的功能活性变体组成的组；
其中，a)或b)的功能活性变体的特征在于：
a)在任一CDR序列中的，除CDRH2中的第5位和CDRL3中的第3位之外的任何其它位置处的1个或2个点突变；和/或
b)在VH序列或VL序列任一者的骨架区中的至少一个点突变。
7.根据权利要求1～6中任一项所述的抑制剂，包括VH结构域和VL结构域的组合，所述VH结构域和VL结构域的组合为：
A
选自由组成员i)至ix)组成的组，其中
i)
VH包括SEQ ID 13和由SEQ ID 13组成；且
VL包括SEQ ID 17或由SEQ ID 17组成；
ii)
VH包括SEQ ID 14或由SEQ ID 14组成；且
VL包括SEQ ID 18或由SEQ ID 18组成；
iii)
VH包括SEQ ID 15或由SEQ ID 15组成；且
VL包括SEQ ID 19或由SEQ ID 19组成；
iv)
VH包括SEQ ID 14或由SEQ ID 14组成；且
VL包括SEQ ID 19或由SEQ ID 19组成；
v)
VH包括SEQ ID 15或由SEQ ID 15组成；且
VL包括SEQ ID 18或由SEQ ID 18组成；
vi)
VH包括SEQ ID 13或由SEQ ID 13组成；且
VL包括SEQ ID 18或由SEQ ID 18组成；
vii)
VH包括SEQ ID 14或由SEQ ID 14组成；且
VL包括SEQ ID 17或由SEQ ID 17组成；
viii)
VH包括SEQ ID 13或由SEQ ID 13组成；且
VL包括SEQ ID 19或由SEQ ID 19组成；
和
ix)
VH包括SEQ ID 15或由SEQ ID 15组成；且
VL包括SEQ ID 17或由SEQ ID 17组成；
或者
B
A的组成员i)～ix)中任一者的VH结构域和VL结构域的组合，其中VH结构域是SEQ ID13～15中任一者的功能活性变体，和/或VL结构域是SEQ ID 17～19中任一者的功能活性变体，
该功能活性变体的特征在于：
a)在任一CDR序列中的，除了CDRH2的第5位和CDRL3的第3位以外的任何其它位置处的1个或2个点突变；和/或
b)在VH序列或VL序列中任一者的骨架区中的至少一个点突变。
8.根据权利要求1～7中任一项所述的抑制剂，其中，所述抗原结合部分结合huTNFR1，其中如通过石英晶体微天平(QCM)在37℃对Fab形式所测定的，KD小于5×10-9M并且k解离小于10-3s-1。
9.根据权利要求1～8中任一项所述的抑制剂，其中，如通过动态光散射所测定的，所述抗体构建体具有至少60℃，或至少61℃，或至少62℃，或至少63℃，或至少64℃，或至少65℃的增加的热稳定性。
10.一种药物制剂，包括权利要求1～9中任一项所述的抑制剂以及药学上可接受的载剂，优选地，其中所述制剂被配制为用于肠胃外使用，优选地通过静脉内或皮下施用。
11.一种产生权利要求1～9中任一项所述的抑制剂的方法，所述方法使用重组的哺乳动物表达系统来表达抗体构建体，其中优选地使用CHO产生细胞系。
12.权利要求1～9中任一项所述的抑制剂用于治疗患有疾病的人受试者，其中指示抗TNF疗法或非生物性改变疾病抗风湿药物(DMARD)，所述抑制剂优选地作为一线治疗，或作为二线治疗，所述二线治疗中抗TNF或非生物性DMARD疗法失败了。
13.根据权利要求12所述的用于上述用途的抑制剂，其中，所述受试者已经产生了抗药物抗体。
14.根据权利要求12或13所述的用于上述用途的抑制剂，其中，所述受试者患有：
a)关节、皮肤和肠道的急性或慢性炎症；和/或
b)自身免疫性疾病、类风湿性关节炎、银屑病、银屑病关节炎、幼年型关节炎、强直性脊柱炎、克罗恩病、多发性硬化症、充血性心力衰竭、代谢病、细胞因子释放综合征、感染性休克、急性和慢性神经退行性疾病、中风、阿尔茨海默病和帕金森病、溃疡性结肠炎、胰腺炎、COPD、急性暴发性病毒或细菌感染、代谢性疾病、慢性神经退行性疾病、TNF/TNFR1作为致病性病理介质的基因遗传病、周期性发热综合征、巨颌症和癌症。
15.一种对需要抗TNF疗法的人受试者的治疗方法，所述方法通过施用有效量的权利要求1～9中任一项所述的抑制剂进行治疗。
16.根据权利要求15所述的方法，其中，所述受试者患有其中指示抗TNF疗法或非生物DMARD治疗剂的疾病，优选地作为一线治疗，或作为二线治疗，所述二线治疗中抗TNF或非生物DMARD疗法失败了。
17.根据权利要求15或16所述的方法，其中所述受试者已经产生了抗药物抗体。
18.根据权利要求15～17中任一项所述的方法，其中，所述受试者患有：
a)关节、皮肤和肠道的急性或慢性炎症；和/或
b)自身免疫性疾病、类风湿性关节炎、银屑病、银屑病关节炎、幼年型关节炎、强直性脊柱炎、克罗恩病、多发性硬化症、充血性心力衰竭、代谢病、细胞因子释放综合征、感染性休克、急性和慢性神经退行性疾病、中风、阿尔茨海默病和帕金森病、溃疡性结肠炎、胰腺炎、COPD、急性暴发性病毒或细菌感染、代谢性疾病、慢性神经退行性疾病、TNF/TNFR1作为致病性病理介质的遗传性疾病、周期性发热综合征、巨颌症和癌症。
19.一种分离的核酸，编码权利要求1～9中任一项所述的抑制剂。
20.一种表达载体，包括权利要求19所述的核酸。
21.一种重组宿主细胞，包括权利要求19所述的核酸或权利要求20所述的表达载体。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2018371232A1 (en) * 2017-11-27 2020-05-21 Baliopharm Ag Anti-huTNFR1 therapy of nonalcoholic steatohepatitis
EP3810095A1 (en) 2018-06-20 2021-04-28 Progenity, Inc. Treatment of a disease of the gastrointestinal tract with a tnf inhibitor

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1655814A (zh) * 2001-11-01 2005-08-17 Uab研究基金会 肿瘤坏死因子相关细胞凋亡诱导配体受体的选择性抗体及其用途
CN101679520A (zh) * 2007-03-19 2010-03-24 斯图加特大学 huTNFR1选择性拮抗剂
EP2493504A1 (en) * 2009-10-27 2012-09-05 Glaxo Group Limited Stable anti-tnfr1 polypeptides, antibody variable domains&antagonists

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US8859739B2 (en) * 2010-09-16 2014-10-14 Baliopharm Ag Anti-huTNFR1 antibody and methods of use thereof for treatment

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1655814A (zh) * 2001-11-01 2005-08-17 Uab研究基金会 肿瘤坏死因子相关细胞凋亡诱导配体受体的选择性抗体及其用途
CN101679520A (zh) * 2007-03-19 2010-03-24 斯图加特大学 huTNFR1选择性拮抗剂
EP2493504A1 (en) * 2009-10-27 2012-09-05 Glaxo Group Limited Stable anti-tnfr1 polypeptides, antibody variable domains&antagonists

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