KR102095096B1

KR102095096B1 - 다중특이적 항체 플랫폼 및 관련 방법

Info

Publication number: KR102095096B1
Application number: KR1020177035581A
Authority: KR
Inventors: 원준 장
Original assignee: 바이슨 테라퓨틱스 인크.
Priority date: 2015-08-26
Filing date: 2016-08-03
Publication date: 2020-03-30
Also published as: CA2985119C; US20190119406A1; AU2016312259A1; AU2016312259B2; US10538595B2; CN107106682A; KR20170142996A; EP3307321A1; JP2018518200A; CN107106682B; EP3307321A4; BR112017026543A2; JP6622396B2; CA2985119A1; WO2017034770A1

Abstract

새로운 다중특이적 항체 플랫폼, 다중특이적 항체, 및 이러한 항체를 제조하는 방법이 본원에서 개시된다. 하나의 쇄의 양전하 및 또 다른 쇄의 음전하를 증가시킴으로써 Fc 영역의 CH3 도메인 보유 폴리펩티드 쇄가 변형된다. 변형된 쇄들로의 공동형질감염에서의 이종이량체 형성이 동일한 세포주가 야생형 폴리펩티드로 형질감염되었을 때의 야생형 항체의 형성에 필적한다. 또한, 이러한 변형은 이종이량체의 간단한 1-단계 정제를 제공한다.

Description

다중특이적 항체 플랫폼 및 관련 방법

우선권 주장

본 출원은 2015년 8월 26일의 출원일을 갖는 미국 가출원 번호 US 62/209,978을 우선권 주장하고, 2016년 8월 3일에 출원된 국제 출원 번호 PCT/US2016/045325의 국내 출원이다. 본 출원은 상기 출원 모두를 우선권 주장하고, 이들 모두의 내용은 전문이 본원에 참조로 포함된다.

서열 목록

본 출원은 서열 데이터를 함유한다.

발명의 분야

본 발명은 다중특이적 항체 플랫폼, 이중특이적 항체를 포함한 다중특이적 항체, 및 그들을 생산하는 방법에 관한 것이다.

항체는 항원에 반응하여 B-림프구 유래 형질 세포가 분비하는 대형 당단백질이다. 5가지의 주요 항체 클래스가 있다: IgG, IgM, IgA, IgE, 및 IgD. IgG는 인체 내의 혈청 항체의 약 75%를 나타내고, 순환에서 발견되는 가장 통상적인 항체 유형이다. 5종의 주요 항체 클래스 모두에서, 기본 단위는 Y-형상 단량체이고, 이는 2개의 동일한 중쇄 (HC) 및 2개의 동일한 경쇄 (LC)로 구성된다. 각각의 LC는 1개의 가변 도메인 (VL) 및 1개의 불변 도메인 (CL)이 있다. 각각의 HC는 1개의 가변 도메인 (VH) 및 3개의 불변 도메인 (CH)이 있다. Y-구조 형태 내의 '팔'은 항원 결합 단편 (Fab)을 형성한다. 이러한 팔들은 Y 구조의 '기부'를 형성하는 동종이량체성 Fc 단편 (결정화가능한 단편)에 가요성 힌지 영역에 의해 연결된다. 항체가 면역계의 다른 성분과 소통하는 능력이 Fc-영역을 통해 매개된다. 포유동물 세포주에서 동종이량체성 Fc-영역을 생산하는 것이 관련 기술분야에 공지되어 있다. 이같은 동종이량체성 Fc 영역은, 예를 들어, 항체와 유사한 품질을 융합 단백질에 가져오는데 사용될 수 있다.

이중특이적 항체 (BsAb)는 2종의 상이한 항체의 단편으로 구성되는 인공 단백질이고, 따라서 BsAb는 2종의 상이한 유형의 항원에 결합한다. 이중특이적 항체는 다중특이적 항체에 속한다. 다중특이적 항체는 이중특이적, 삼중특이적, 또는 사중특이적 항체일 수 있다. 이같은 다중특이적 항체의 Fc-단편은 바람직하게는 이종이량체이다. 이중특이적, 뿐만 아니라 일반적으로 다른 다중특이적 항체는 광범위한 임상 및 진단 용도에서 엄청난 잠재력을 제시한 바 있다. 종양학 질환의 치료를 위해 유럽 연합 및 미국에서 승인된 2종의 이중특이적 항체 약물이 있다 (카투막소맙 및 블리나투맙). 이들의 독특한 특색으로 인해, 이중특이적 및 다중특이적 항체는 일반적으로 차세대 항체 치료제에 대한 매우 매력적인 형식인 것으로 기획되었다.

임상 연구 영역에서, 특이적 항체에 대한 진단 용도가 여러 발표물에서 기술된 바 있다 (예를 들어, 문헌 [Fanger et al. Crit. Rev. Immunol. 1992, 12:101-124]; [Nolan, et al. Biochem. Biophys. Acta. 1990, 1040:1-11]; [Song-Sivilai et al. Clin Exp. Immunol. 1990, 79:315]). 그러나, 이중특이적 항체 (BsAb)에 대한 가장 인상적인 용도는 면역-종양학 분야에 있다. 이론적으로, BsAb의 하나의 팔이 종양 세포 상의 종양 항원에 결합할 수 있고, BsAb의 제2 팔이 면역 이펙터 세포 마커에 결합할 수 있다. 따라서, BsAb가 면역 이펙터 세포 (자연 살해 세포 또는 이펙터 T-세포)를 동원하고 이를 종양 세포를 살해하도록 국소 종양 부위로 가져오는 가교제로서의 역할을 할 수 있다. 이러한 치료 용도가 다수의 발표물에 기술된 바 있다 (Hseih-Ma et al., Cancer Res. 1992, 52:6832-6839; Weiner et al., Cancer Res. 1993, 53:94-100; Shalaby et al. J. Exp. Med. 1992, 175:217; Weiner et al., J. Immunol. 1994, 152:2385).

BsAb 또는 다중특이적 항체를 제조하는 여러 상이한 방식이 관련 기술분야에 공지되어 있다. 1980년대에는, 2종의 상이한 하이브리도마의 교차-하이브리드에 의해 이중특이적 항체가 생성되었다 (Millstein and Cello, Nature 1983, 305:537-539). 2개의 상이한 중쇄 및 2개의 상이한 경쇄가 무작위로 쌍을 형성하는 것으로 인해, 이러한 하이브리드 하이브리도마 (쿼드로마로도 칭해짐)는 최대 10종의 상이한 종류의 항체 조합을 생성시킬 수 있었고, 이 중 1개만을 원하는 BsAb-형식이었다. 이러한 상황은 정확한 BsAb-형식의 번잡하고 수율이 낮은 정제를 초래하였다. 무작위 조합 문제를 극복하기 위해, 2개의 상이하게 변형된 Fc-도메인을 생성시켜 이러한 2개의 변형된 Fc 도메인이 서로 만날 때 이들이 동종이량체성 형성에 비해 이종이량체성 형성에 유리할 수 있게 하는 것이 바람직하다. 각각의 변형된 Fc는 독특한 결합 특이성이 있는 Fab 또는 ScFv와 융합될 수 있다. 결합 특이성이 상이한 이러한 2개의 상이하게 변형된 Fc 함유 단편이 포유동물 세포 배양물에서 공동-발현될 때, 이들은 유리한 수율로 이종이량체성 이중특이적 항체를 형성할 수 있다.

제1 CH3 도메인 및 제2 CH3 도메인의 전하가 재분포되어 이러한 2개의 상이하게 변형된 CH3 도메인이 동종이량체 형성에 비해 이종이량체 형성에 유리할 또 다른 접근법이 PCT 특허 출원 공보 WO2007/147901 및 미국 특허 8,592562에 개시되어 있다. 그러나, 일반적으로, 포유동물 세포에서 2개의 상이한 Fc 중쇄를 공동-발현시키는 것은 약간의 이종이량체성 Fc 단편의 형성을 초래할 수 있지만, 동종이량체성 단편의 실질적인 형성을 또한 초래할 수 있다. 공동-형질감염된 세포 배양물 또는 조작된 안정적인 세포주 상청액으로부터 이종이량체성 단편을 정제하는 것은 번잡하고 비싸다.

이러한 문제에 특정한 개선이 도입된 바 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호 5,807,706이 CH3 도메인에서의 소위 '노브-인투-홀(knob-into-hole)' 돌연변이를 개시한다. '노브-인투-홀' 전략을 사용함으로써, 예를 들어 미국 특허 출원 2014/0348839 및 2013/0245233에서 여러 다른 방법이 개시된 바 있다. 이러한 기술은 이종이량체가 더 높게 형성되는 것을 초래하였지만, 약간의 '홀' 동종이량체 및 '노브' 단량체가 여전히 존재하였다. 미국 특허 출원 번호 2012/0116057은 야생형 CH3 도메인에서 364 위치의 세린을 바람직하게는 알라닌으로 치환하는 것에 의한 이종이량체화 개선을 개시하였다. 이같은 치환은 이종이량체성 Fc의 응집 증가에 이르렀다.

치료 조성물의 개발에서 항체가 점점 더 중요해졌다. 이중특이적 항체를 포함한 다중특이적 항체 유도체가 암 요법을 위한 차세대 표적화 생물제제로서 고려될 수 있다. 다중특이적 항체는 적어도 2개의 항원 또는 에피토프에 결합한다. 실험적 암 요법에서 다중특이적 항체를 적용하는 것은 상이한 세포 표면 단백질들에 결합하여 증식성 또는 혈관형성-연관 경로의 더욱 완벽한 차단을 달성하는 분자를 포함한다. 다중특이적 항체는 면역 이펙터 세포를 종양에 전달하는 비히클로서 적용될 수도 있다. 따라서, 다중특이적 항체는 1개 초과의 항원에 결합하는 이의 역량으로 인해 바람직하다. 그러나, 이중특이적 항체를 포함한 다중특이적 항체의 제조 및 정제는 여전히 기술적 난제이고, 또한 매우 비싸다. 따라서, 이같은 항체를 높은 순도로 제조하기 위해 새로운 방법이 요구된다.

다양한 수단이 관련 기술분야에 공지되어 있지만, 본원에 기술된 발명에 의해 해소되는 모든 문제를 다루지 못한다. 본 발명의 한 실시양태가 첨부된 도면에서 예시되고, 본원에서 하기에서 더욱 상세하게 기술될 것이다.

본 발명은 하기의 바람직하고 유용한 이점 및 목적 및 다른 언급되지 않은 바람직하고 유용한 이점 및 목적을 부여하는데 성공한다. 본원에 기술된 발명은 이중특이적 항체를 포함한 새로운 다중특이적 항체, 새로운 항체 및 항체 유도체, 이러한 항체를 제공하는 새로운 방법, 및 고도로 정제된 새로운 다중특이적 항체를 제공하는 새로운 방법을 제공한다.

본 발명은 2개의 상이하게 변형된 포유동물 IgG Fc-영역, 뿐만 아니라 IgA, IgD, IgE 및 IgM Fc 영역의 이종이량체화를 강화하는 새로운 이중특이적 또는 다중특이적 항체 플랫폼을 제공한다. 본 발명은 힌지 영역에서의 임의적인 변형을 또한 제공한다. 본 발명은 높은 순도의 이종이량체를 달성하는 단순화된 1-단계 정제를 추가로 제공한다.

본 발명의 목적은 이종이량체화를 위해 제1 CH3-보유 폴리펩티드와 제2 CH3-보유 폴리펩티드 사이의 계면을 조작하도록 항체 CH3 도메인을 변형시키는 전략을 제공하는 것이다. 특히, 적어도 2개, 바람직하게는 2 내지 6개, 가장 바람직하게는 3 내지 4개의 양으로 하전된 아미노산, 예컨대 이에 제한되지는 않지만 아르기닌, 리신 또는 히스티딘이 아미노산 치환에 의해 제1 폴리펩티드의 계면에 도입되어 양전하를 증가시킨다. 동시에, 적어도 2개, 바람직하게는 2 내지 6개, 가장 바람직하게는 3 내지 4개의 음으로 하전된 아미노산, 예컨대 이에 제한되지는 않지만 아스파르트산 또는 글루탐산이 아미노산 치환에 의해 제2 폴리펩티드의 상보적인 계면에 도입되어 폴리펩티드 쇄의 음전하를 증가시킨다. 아마도 2개의 상보적인 CH3 도메인의 계면에서의 이러한 상이한 변형은 동종이량체 형성보다는 이종이량체 형성에 유리하도록 이러한 2개의 쇄 사이의 훨씬 더 강한 정전기 인력을 제공할 것이다. 추가적으로, 시스테인 분자가 하전된 아미노산과 함께 2개의 상보적인 CH3 도메인의 양쪽 계면의 적절한 위치에 도입되어 쇄간 디술피드 결합 형성을 허용하고 이종이량체 형성을 추가로 강화할 수 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 제1 폴리펩티드 쇄 상의 도입된 양으로 하전된 아미노산이 제2 폴리펩티드 쇄의 상보적 계면의 가장 가까운 근접 위치에 있는 반대의 음으로 하전된 아미노산과 상호작용하는 가장 적절하게 배향된 위치에 존재할 것이도록 이같은 아미노산 치환을 생성시키는 방법을 제공하는 것이다. 이러한 아미노산 치환이 적절하게 배치될 때, 이종이량체 형성이 정전기적으로 유리하다: 예를 들어, 반대 전하들이 2개의 쌍을 이룬 CH3 도메인의 계면의 가장 가까운 근접 위치에 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 이중특이적 또는 다중특이적 결합 단백질일 수 있는 이종이량체성 항체를 제조하는 방법을 제공하는 것이다. 이러한 이종이량체성 항체는 계면에서 만나고 이종이량체 형성을 강화하도록 합쳐지는 제1의 변형된 CH3 보유 폴리펩티드 및 제2의 변형된 CH3 보유폴리펩티드를 포함할 수 있다. 특정 측면에서, 이러한 분자는 이중특이적, 삼중특이적 또는 사중특이적 항체일 수 있다. 제1 CH3-함유 폴리펩티드의 N-말단이 중쇄 Fab 영역 (VH 및 CH1), ScFv, 프로바디, 모노바디, 디아바디, 나노바디, 리간드 또는 수용체 또는 임의 종류의 결합 도메인과 융합될 수 있다. 제1 CH3 함유 폴리펩티드의 C 말단이 상이한 중쇄 Fab 영역 (VH 및 CH1), ScFv, 프로바디, 모노바디, 디아바디, 나노바디, 리간드 또는 수용체 또는 임의 종류의 결합 도메인과 융합될 수 있다. 융합된 결합 단위와 제1 폴리펩티드 쇄 사이에서 펩티드 링커가 사용될 수 있다. 동시에, 제2 CH3 도메인 함유 폴리펩티드의 N-말단이 또 다른 상이한 중쇄 Fab 영역 (VH 및 CH1), ScFv, 프로바디, 모노바디, 디아바디, 나노바디, 리간드 또는 수용체 또는 임의 종류의 결합 도메인과 융합될 수 있다. 상기 제2 CH3 함유 폴리펩티드의 C-말단이 또 다른 상이한 중쇄 Fab 영역 (VH 및 CH1), ScFv, 프로바디, 모노바디, 디아바디, 나노바디, 리간드 또는 수용체 융합물 또는 임의 종류의 미니-결합 도메인과 융합될 수 있다. 융합된 결합 단위와 상기 제2 쇄 사이에서 펩티드 링커가 도입될 수 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 일시적으로 형질감염된 세포 배양 시스템, 안정적으로 조작된 세포주 시스템 또는 시험관내 무세포 단백질 합성 시스템을 사용하여 이같은 이종이량체성 단백질을 생산하는 방법을 제공하는 것이다. 이러한 시스템들은 제1 쇄 및 제2 쇄를 코딩하는 핵산을 포함한다. 이러한 2개의 쇄는 동일한 벡터 또는 2개의 별개의 벡터 상에서 코딩될 수 있다. 사용할 수 있는 세포 배양 시스템은 포유동물 세포 (예를 들어 CHO, HEK293 또는 골수종 NS0 세포), 곤충 세포, 효모 세포 또는 박테리아 세포 시스템을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 특정 실시양태에서, 제1 CH3 보유 폴리펩티드 및 제2 CH3 보유 폴리펩티드를 코딩하는 핵산들 사이의 비는 1:2 내지 2:1 이외의 비율로 다양할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 1:1 비가 사용된다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 이종이량체성 단백질을 정제하는 방법이다. 표준 모노클로날 항체 정제 기술을 사용하여 이종이량체성 항체를 정제할 수 있다. 이러한 기술은 단백질 A 친화성 크로마토그래피, 크기 배제 및 이온 교환 크로마토그래프, 뿐만 아니라 암모늄 침전을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.

바람직한 실시양태에서, 음으로 하전된 아미노산으로 치환된 제2 폴리펩티드는 동시에 이의 단백질 A 결합 성질을 거의 모두 상실하였다. 이러한 독특한 특색은 상기 이종이량체성 단백질의 정제를 위한 기술적 장점을 제공한다. 이종이량체성 항체 내의 제1 폴리펩티드만이 단백질 A에 결합하고, 제2 폴리펩티드는 결합하지 않기 때문에, 따라서 이종이량체가 단백질 A 칼럼에 대한 결합 친화성이 낮고, 2개의 쇄가 단백질 A에 결합하는 정상 Fc 동종이량체에 비교하여 더 높은 pH에서 용출될 수 있다. 본 발명으로부터 생성된 분자는 pH 4에서 용출될 수 있는 한편, 동종이량체는 단백질 A 칼럼 상에서 유지된다.

특정 실시양태에서, CH3 함유 폴리펩티드는 인간, 마우스, 소, 말, 닭, 래트, 비-인간 영장류, 낙타, 라마, 알파카, 과나코, 비큐나 또는 양으로부터의, 그러나 이에 제한되지 않는 면역글로불린 분자일 수 있다. 다른 측면에서, 면역글로불린은 IgG, IgA, IgM, IgE 및 IgD 또는 이들의 하위유형 (예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 등)일 수 있다. CH3 도메인 함유 폴리펩티드는 추가적인 변경, 예컨대 비-천연 아미노산, Fc 이펙터 기능 돌연변이 및 글리코실화 부위 돌연변이를 함유할 수 있다.

본 발명의 또 다른 측면은 상기 이종이량체성 항체가 제약 또는 치료 조성물로서 사용될 수 있는 것이다. 이종이량체성 단백질이 다른 제약상 허용되는 완충제, 성분 또는 부형제를 함유하는 조성물 내에 제제화될 수 있다. 이같은 제약 조성물은 질환을 치료하거나 질환을 예방하기 위해 환자에게 투여될 수 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 한 쌍의 항체 단편을 포함하고, 각각의 단편이 변형된 CH3 도메인을 함유하여 이종이량체성 형성을 촉진하는 분자를 제공하는 것이다. 한 측면에서, 이러한 분자는 유사한 발현 시스템에서 발현될 때 수율이 야생형 항체 Fc와 실질적으로 동일하다. 또 다른 추가 측면에서, 상기 분자의 제1 단편으로부터의 변형된 CH3 도메인은 바람직하게는 가장자리 계면에서 3 또는 4개의 아미노산 치환을 함유하고, 이 중 적어도 2개, 바람직하게는 2 내지 6개, 가장 바람직하게는 3 내지 4개가 아르기닌, 히스티딘 또는 리신으로부터 선택된 양으로 하전된 아미노산으로 변화된 바 있다. 1개의 아미노산이 양으로 하전된 아미노산, 시스테인 또는 다른 하전되지 않은 아미노산으로 변화될 수 있다. 또 다른 측면에서, 분자의 제2 단편으로부터의 변형된 CH3 도메인은 바람직하게는 가장자리 계면에서 3 또는 4개의 아미노산 치환을 함유하고, 이 중 적어도 2개, 바람직하게는 2 내지 6개, 가장 바람직하게는 3 내지 4개가 아스파르트산 또는 글루탐산으로부터 선택된 음으로 하전된 아미노산으로 변화된 바 있다. 1개의 아미노산이 음으로 하전된 아미노산, 시스테인 또는 다른 하전되지 않은 아미노산으로 변화될 수 있다.

본 발명의 목적은 제1 면역글로불린 중쇄 및 제2 면역글로불린 중쇄를 포함하며, 여기서 제1 중쇄의 CH3 도메인은 적어도 2개, 바람직하게는 2 내지 6개, 가장 바람직하게는 3 내지 4개의 아미노산 돌연변이를 포함하고, 제2 중쇄의 CH3 도메인은 적어도 2개, 바람직하게는 2 내지 6개, 가장 바람직하게는 3 내지 4개의 아미노산 돌연변이를 포함하고, 여기서 제1 중쇄 CH3 도메인 내의 적어도 2개, 바람직하게는 2 내지 6개, 가장 바람직하게는 3 내지 4개의 돌연변이는 2개, 바람직하게는 2 내지 6개, 가장 바람직하게는 3 내지 4개의 양으로 하전된 아미노산으로 돌연변이되고, 제2 중쇄의 CH3 도메인 내의 적어도 2개, 바람직하게는 2 내지 6개, 가장 바람직하게는 3 내지 4개의 돌연변이는 2개, 바람직하게는 2 내지 6개, 가장 바람직하게는 3 내지 4개의 음으로 하전된 아미노산으로 돌연변이되고, 여기서 각각의 돌연변이는 Y391 내지 S400의 가장자리 계면, Q347 내지 E357의 가장자리 계면 또는 D401 내지 L410의 중간 계면에 위치하는 것인 다중특이적 이종이량체성 항체 분자를 제공하는 것이다.

본 발명의 목적은 제1 면역글로불린 중쇄 및 제2 면역글로불린 중쇄를 포함하며, 여기서 제1 중쇄의 CH3 도메인은 적어도 2개, 바람직하게는 2 내지 6개, 가장 바람직하게는 3 내지 4개의 아미노산 돌연변이를 포함하고, 제2 중쇄의 CH3 도메인은 적어도 2개, 바람직하게는 2 내지 6개, 가장 바람직하게는 3 내지 4개의 아미노산 돌연변이를 포함하고, 여기서 제1 중쇄 CH3 도메인 내의 적어도 2개, 바람직하게는 2 내지 6개, 가장 바람직하게는 3 내지 4개의 돌연변이는 2개, 바람직하게는 2 내지 6개, 가장 바람직하게는 3 내지 4개의 양으로 하전된 아미노산으로 돌연변이되고, 제2 중쇄의 CH3 도메인 내의 적어도 2개, 바람직하게는 2 내지 6개, 가장 바람직하게는 3 내지 4개의 돌연변이는 2개, 바람직하게는 2 내지 6개, 가장 바람직하게는 3 내지 4개의 음으로 하전된 아미노산으로 돌연변이되고, 여기서 제1 중쇄의 CH3 도메인 내의 치환은 Y391K, Y391R, Y391H, K392R, K392H, T393K, T393R, T393H, T394K, T394R, T394H, P395K, P395R, P395H, P396K, P396R, P396H, V397K, V397R, V397H, V397C, L398K, L398R, L398H, D399K, D399R, D399H, S400K, S400R, S400H, Q347K, Q347R, Q347H, V348K, V348R, V348H, Y349K, Y349R, Y349H, T350K, T350R, T350H, F405R, F405K, F405H, Y407R, Y407K 및 Y407H로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 다중특이적 이종이량체성 항체 분자를 제공하는 것이다.

본 발명의 목적은 제1 면역글로불린 중쇄 및 제2 면역글로불린 중쇄를 포함하며, 여기서 제1 중쇄의 CH3 도메인은 적어도 2개, 바람직하게는 2 내지 6개, 가장 바람직하게는 3 내지 4개의 아미노산 돌연변이를 포함하고, 제2 중쇄의 CH3 도메인은 적어도 2개, 바람직하게는 2 내지 6개, 가장 바람직하게는 3 내지 4개의 아미노산 돌연변이를 포함하고, 여기서 제1 중쇄 CH3 도메인 내의 적어도 2개, 바람직하게는 2 내지 6개, 가장 바람직하게는 3 내지 4개의 돌연변이는 2개, 바람직하게는 2 내지 6개, 가장 바람직하게는 3 내지 4개의 양으로 하전된 아미노산으로 돌연변이되고, 제2 중쇄의 CH3 도메인 내의 적어도 2개, 바람직하게는 2 내지 6개, 가장 바람직하게는 3 내지 4개의 돌연변이는 2개, 바람직하게는 2 내지 6개, 가장 바람직하게는 3 내지 4개의 음으로 하전된 아미노산으로 돌연변이되고, 여기서 제2 중쇄의 CH3 도메인 내의 치환은 Y391D, Y391E, K392D, K392E, T393D, T393E, T394D, T394E, P395D, P395E, P396D, P396E, V397D, V397E, V397C, L398D, L398E, D399E, S400D, S400E, S354D, S354E, R355E, R355D, F405E, F405D, Y407E, Y407D, K409D 및 K409E로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 다중특이적 이종이량체성 항체 분자를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 제1 중쇄 및 제2 중쇄를 포함하며, 여기서 제1 중쇄의 CH3 도메인은 적어도 2개, 바람직하게는 2 내지 6개, 가장 바람직하게는 3 내지 4개의 아미노산 돌연변이를 포함하고, 제2 중쇄의 CH3 도메인은 적어도 2개, 바람직하게는 2 내지 6개, 가장 바람직하게는 3 내지 4개의 아미노산 돌연변이를 포함하고, 여기서 제1 중쇄 CH3 도메인 내의 적어도 2개, 바람직하게는 2 내지 6개, 가장 바람직하게는 3 내지 4개의 돌연변이는 적어도 2개, 바람직하게는 2 내지 6개, 가장 바람직하게는 3 내지 4개의 양전하를 제1 중쇄의 CH3 도메인에 도입하고, 제2 중쇄의 CH3 도메인 내의 적어도 2개, 바람직하게는 2 내지 6개, 가장 바람직하게는 3 내지 4개의 돌연변이는 적어도 2개, 바람직하게는 2 내지 6개, 가장 바람직하게는 3 내지 4개의 음전하를 제2 CH3 도메인에 도입하고, 여기서 제1 중쇄의 CH3 도메인은 서열식별번호(SEQ ID NO): 5 (OA)에 따른 아미노산 서열을 포함하고 제2 중쇄의 CH3 도메인은 서열식별번호: 7 (OB) 또는 서열식별번호: 11 (OD)에 따른 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 제1 중쇄의 CH3 도메인은 서열식별번호: 9 (OC)에 따른 아미노산 서열을 포함하고 제2 중쇄의 CH3 도메인은 서열식별번호: 7 (OB)에 따른 아미노산 서열을 포함하는 것인 다중특이적 항체 분자를 제공하는 것이다.

본 발명의 추가 목적은 이전의 항들 중 어느 한 항의 분자의 제1 중쇄 및 제2 중쇄를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 벡터이며, 여기서 코딩 서열은 동일한 벡터 또는 별개의 벡터 상에 있을 수 있고, 여기서 제1 쇄 및 제2 쇄를 코딩하는 핵산의 비는 달라질 수 있는 것인 핵산 벡터를 제공하는 것이다.

본 발명의 추가 목적은 다중특이적 항체의 CH3 도메인을 보유하며, 서열식별번호: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 16, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33 및 35로 이루어진 군으로부터 선택된 서열식별번호에 따른 아미노산 서열을 포함하는 단리된 폴리펩티드 쇄를 제공하는 것이다.

본 발명의 추가 목적은 a) 제1 CH3 도메인, 제1 CH2 도메인 및 제1 항원 결합 도메인을 포함하는 제1 폴리펩티드를 제공하는 단계; b) 제2 CH3 도메인, 제2 CH2 도메인 및 제2 항원 결합 도메인을 포함하는 제2 폴리펩티드를 제공하는 단계; c) 제1 폴리펩티드의 CH3 도메인 내의 적어도 2개, 바람직하게는 2 내지 6개, 가장 바람직하게는 3 내지 4개의 아미노산을 치환하며, 여기서 이러한 치환은 쇄의 양전하를 증가시키는 것인 단계; d) 제2 폴리펩티드의 CH3 도메인 내의 적어도 2개, 바람직하게는 2 내지 6개, 가장 바람직하게는 3 내지 4개의 아미노산을 치환하며, 여기서 이러한 치환은 쇄의 음전하를 증가시키는 것인 단계; e) 단계 a) 및 b)의 폴리펩티드 쇄를 적절한 세포주에서 공동-발현시키는 단계; f) 세포주에 의해 발현된 이량체로부터 제1 및 제2 폴리펩티드를 함유하는 이종이량체를 단리하는 단계; 및 임의로 g) 추가 단위를 폴리펩티드에 융합시킴으로써 단리된 이종이량체를 변형시키는 단계를 포함하는, 다중특이적 항체를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

도 1은 본 발명으로부터의 이중특이적 또는 다중특이적 항체 구조의 예의 개략적 예시를 제시한다. 본 발명은 이중특이적, 삼중특이적 또는 사중특이적 항체일 수 있는 분자를 제공한다. 패널 A 및 B (도 1a)는 2개의 통상적인 "Y" 형상의 이중특이적 항체 구조이다. 패널 C 및 D (도 1b)는 패널 A로부터 유도된 삼중특이적 및 사중특이적 항체 형식을 예시한다. 패널 E 및 F (도 1c)는 패널 B로부터 유도된 삼중특이적 및 사중특이적 항체이다.
도 2는 2개의 변형된 CH3 함유 폴리펩티드 단편 사이의 이종이량체성 형성의 평가를 위한 실험 절차의 개략적 예시이다. 일반적으로 장쇄는 양으로 하전된 아미노산 치환이 있는 CH1-힌지-CH2-CH3을 함유하는 반면, 일반적으로 단쇄는 음으로 하전된 아미노산 치환이 있는 힌지-CH2-CH3만을 함유한다. 장쇄 및 단쇄를 코딩하는 DNA를 1:1 비로 혼합하고, HEK293 세포 내로 형질감염시켰다. 3일 후, 세포 배양 상청액을 수확하고, 자기 단백질 A 풀-다운에 적용하였다. 자기 비드에 결합된 단백질을 SDS-PAGE 전기영동으로 분석하였다.
도 3은 다양한 샘플이 로딩된 SDS-PAGE 겔을 제시한다: M: 마커; 레인 1: WT 장쇄; 레인 2: WT 단쇄; 레인 3: WT 장쇄 및 단쇄의 공동-형질감염. 중간의 이종이량체 밴드에 더하여, 상당량의 장쇄 동종이량체 (상부) 및 단쇄 동종이량체 (하부)가 있다; 레인 4: 돌연변이체 OE 쇄; 레인 5: 돌연변이체 OF 쇄; 레인 6: OE 및 OF 쇄의 공동-형질감염; 레인 7: 돌연변이체 OA 쇄; 레인 8: 돌연변이체 OB 쇄. 단백질 A에 대한 OB의 결합 활성이 상실되는 것을 주목한다; 레인 9: OA 및 OB 쇄의 공동-형질감염. 이종이량체 밴드의 강도가 레인 4의 WT 이종이량체 밴드의 것에 필적하는 반면, 장쇄 및 단쇄 동종이량체 밴드 둘 다가 보이지 않는 것을 주목한다.
도 4는 다양한 샘플이 로딩된 SDS-PAGE 겔을 제시한다: 레인 1: 돌연변이 OA 쇄; 레인 2: 돌연변이 OB 쇄; 레인 3: OA 및 OB 쇄의 공동-형질감염: 레인 4: 돌연변이 OC 쇄: 레인 5: 돌연변이 OD 쇄; 레인 6: OC 및 OD 쇄의 공동-형질감염. 레인 6에 2개의 이종이량체 밴드가 있는 것을 주목한다.
도 5는 다양한 샘플이 로딩된 SDS-PAGE 겔을 제시한다. 레인 M: 마커; 레인 1: 돌연변이 OA 쇄; 레인 2: 돌연변이 OB 쇄; 레인 3: 돌연변이 OC 쇄; 레인 4: 돌연변이 OD 쇄; 레인 5: OA 및 OD 쇄의 공동-형질감염; 레인 6: 비어 있음; 레인 7: OC 및 OB 쇄의 공동형질감염.
도 6은 다양한 샘플이 로딩된 SDS-PAGE 겔을 제시한다. 레인 1 내지 3: OA 및 OB 쇄의 3개의 독립적인 공동-형질감염; 레인 4: 비어 있음; 레인 5: 대조군으로서의 야생형 장쇄 및 단쇄의 공동-형질감염.
도 7은 다양한 샘플이 로딩된 SDS-PAGE 겔을 제시한다. 레인 M: 마커; 레인 1: OG 및 OH 쇄의 공동-형질감염; 레인 2: 비어 있음; 레인 3: OI 및 OJ 쇄의 공동-형질감염; 레인 4: 비어 있음; 레인 5: OM 및 ON 쇄의 공동-형질감염.
도 8은 본 발명의 항체에 대한 단일 단계 단백질 A 칼럼 정제의 개략적 예시이다. 단쇄는 단백질 A 결합 활성을 상실한 돌연변이를 보유하고, 이의 동종이량체는, 존재한다면, 세정 단계 동안 칼럼을 관류할 것이다. 반면에, 장쇄는 단백질 A 결합을 유지한 돌연변이를 보유하고, 이의 동종이량체는, 존재한다면, 3 초과의 pH에서 용출될 때 칼럼 상에서 유지될 것이다. 장쇄 및 단쇄 이종이량체만이 4.0 내지 5.0 사이의 pH에서 용출되어 나올 수 있다.
도 9는 단백질 A 칼럼을 사용한 OA 및 OB 이종이량체 정제 결과를 제시한다. OA 및 OB 공동형질감염 샘플을 단백질 A 칼럼에 로딩하였다. 세정 후, 이종이량체 생성물이 먼저 pH 4.0에서 용출되고 나서, pH 2.8에서 용출되었다. 레인 2 내지 6은 pH 4.0에서 용출된 분획이고, 레인 7 내지 10은 pH 2.8에서 용출된 분획이다. 레인 4 및 5에서 제시된 바와 같이 OA 및 OB 이종이량체가 pH 4.0에서 용출될 수 있다.
도 10은 2개의 정제된 이중특이적 항체 생성물의 SDS-PAGE 분석을 제시한다. 레인 1은 분자 마커이고; 레인 2 내지 6은 제1 이중특이적 항체 생성물인 Her2xCD3.1 (항-Her2 및 항-CD3.1의 이종이량체)의 용출 분획이다. 레인 7 내지 10은 제2 이중특이적 항체 생성물인 Her2xCD3.2 (항-Her2 및 항-CD3.2의 이종이량체)의 용출 분획이다.
도 11은 이중 특이적 ELISA 결합 결과를 제시한다. TBS 및 PBS는 완충제 대조군이다. 항-Her2는 OA 단편에 융합된 헤르셉틴으로부터 유도된 scFv이다. 항-CD3.1 및 항-CD3.2는 OA 단편에 융합된 2개의 상이한 CD3 항체로부터 유도된 2개의 scFv이다. Her2xCD3.1은 항-Her2-OB 및 항-CD3.1-OA 이종이량체이다. Her2xCD3.2는 항-Her2-OB 및 항-CD3.2-OA 이종이량체이다. 이러한 결과는 2개의 이종이량체만이 이중 특이적 결합 활성을 제시하였음을 가리켰다. 다른 단일 결합 작용제들은 어떠한 이중 특이적 결합 활성도 제시하지 않았다.

정의:

본원에서 사용된 바와 같은 "아미노산"은 20개의 천연 발생 아미노산 중 하나 또는 특정한 한정된 위치에 존재할 수 있는 임의의 비-천연 유사체를 의미한다.

본원에서 사용된 바와 같은 "아미노산 돌연변이"는 폴리펩티드 서열에서의 아미노산 치환, 삽입, 및/또는 결실을 의미한다. 본원에서의 바람직한 아미노산 변형은 치환이다.

본원에서 사용된 바와 같은 "아미노산 치환" 또는 "치환"은 모체 폴리펩티드 서열 내의 특정 위치의 아미노산이 또 다른 아미노산으로 교체되는 것을 의미한다. 예를 들어, 치환 P395D는 폴리펩티드의 위치 395의 프롤린 아미노산이 아스파르트산 아미노산으로 교체된 변이체 폴리펩티드를 지칭한다.

본원에서 사용된 바와 같은 "항체"는 전장 항체, 뿐만 아니라 항체 단편을 포함하는 것을 의미한다. 항체는 임의의 유기체로부터의 천연 항체, 조작된 항체, 또는 실험, 치료 또는 기타 목적을 위해 재조합 기술에 의해 생성된 항체일 수 있다. 용어 "항체"는 모노클로날 및 폴리클로날 항체를 포함한다. 항체는 길항제, 효능제, 중화성, 억제성 또는 자극성일 수 있다.

본원에서 사용된 바와 같은 "항체 단편"은 전체 항체의 변형에 의해 생산되거나 또는 재조합 DNA 기술을 사용하여 드 노보 합성된, Fab, Fv, scFv, 또는 항체의 기타 항원-결합 하위서열과 같은 단백질을 의미한다.

본원에서 사용된 바와 같은 "이중특이적 항체" 또는 "BsAb"는 2종의 상이한 항체의 단편으로 구성되고, 따라서 2개의 상이한 유형의 항원에 결합하는 인공 단백질을 의미한다.

본원에서 사용된 바와 같은 "다중특이적 항체"는 이중특이적, 삼중특이적 또는 사중특이적 항체를 의미한다. 다중특이적 항체는 2개 이상의 상이한 항체의 단편으로 구성되고, 결과적으로 2개, 3개 또는 4개의 상이한 단백질에 결합한다.

본원에서 사용된 바와 같은 "미니바디"는 항체 단편 VL-VH-CH3로 이루어진 인공 항체 단편을 의미한다.

본원에서 사용된 바와 같은 "나노바디"는 단일한 단량체성 항체 가변 영역으로 이루어진 낙타류 항체 단편을 의미한다.

본원에서 사용된 바와 같은 "프로바디"는 활성화될 때까지 항원 결합 측면이 차폐되어 있는 인공 항체 분자를 의미한다.

본원에서 사용된 바와 같은 "디아바디"는 이량체화된 단일 쇄 가변 단편들이 있는 인공 항체 단편을 의미한다.

본원에서 사용된 바와 같은 "Fab" 또는 "Fab 영역"은 VL, VH, CL, 및 CH1 면역글로불린 도메인 또는 영역을 포함하는 폴리펩티드를 의미한다.

본원에서 사용된 바와 같은 "Fc" 또는 "Fc 영역" 또는 "Fc 단편"은 IgA, IgD, 및 IgG의 마지막 2개의 불변 영역 면역글로불린 도메인 (CH2 및 CH3), 및 IgE 및 IgM의 마지막 3개의 불변 영역 면역글로불린 도메인, 및 이러한 도메인들에 대해 N-말단에 있는 가요성 힌지 부분을 포함하는 폴리펩티드를 의미한다. Fc 영역의 경계는 다양할 수 있지만, 일반적으로 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 A231에서 시작하여 이의 카르복실-말단까지인 잔기를 포함하는 것으로 정의되고, 여기서 넘버링은 EU 넘버링 체계에 따른다.

본원에서 사용된 바와 같은 "힌지" 또는 "힌지 영역"은 항체의 제1 및 제2 불변 도메인 (CH1 및 CH2) 사이의 아미노산을 포함하는 가요성 폴리펩티드를 의미한다. 힌지는 본 발명의 목적을 위해 구조적으로 정의되고, IgG에 대해 본원에서 사용된 바와 같은 "힌지 영역"은 잔기 216-230을 포함하며, 여기서 넘버링은 EU 넘버링 체계에 따른다.

본원에서 사용된 바와 같은 "IgG"는 인식된 면역글로불린 감마 유전자에 의해 실질적으로 코딩되는 항체 클래스에 속하는 단백질을 의미한다. 인간에서, 이러한 클래스는 IgG1, IgG2, IgG3, 및 IgG4를 포함한다.

본원에서 사용된 바와 같은 "위치"는 단백질 서열 내의 장소를 의미한다. 위치는 순차적으로 또는 확립된 형식, 예를 들어 카바트(Kabat) 또는 EU 넘버링 체계에 따라 넘버링될 수 있다. 예를 들어, 위치 297은 인간 항체 IgG1 내의 위치이다.

본원에서 사용된 바와 같은 "단백질"은 단백질, 폴리펩티드, 올리고펩티드 및 펩티드를 포함하는, 적어도 2개의 공유결합으로 부착된 아미노산을 의미한다.

본원에서 사용된 바와 같은 "야생형 또는 WT"는 대립유전자 변이를 포함하는, 천연에서 발견되는 아미노산 서열 또는 뉴클레오티드 서열을 의미한다. WT 단백질은 의도적으로 변형되지 않은 아미노산 서열 또는 뉴클레오티드 서열을 갖는다.

본 개시내용은 2개의 상이하게 변형된 포유동물, 바람직하게는 인간 IgG Fc 영역 (즉, IgG1, 2, 3, 4 또는 IgA, IgD, IgE, IgM)의 이종이량체화를 강화하는 새로운 다중특이적 항체 플랫폼을 제공하고, 이러한 변형은 다른 포유동물 항체, 예를 들어 마우스 mIgG1, mIgG2A, mIgG2B 및 mIgG3을 또한 포함할 수 있다.

사실상 모든 항원이 본 발명의 항체에 의해 표적화될 수 있다. 본 발명의 항체 변이체를 광범위한 항체 생성물에서 사용할 수 있다. 한 실시양태에서, 본 발명의 항체 변이체는 치료제, 진단제 또는 연구 시약, 바람직하게는 치료제이다. 이러한 항체 변이체를 모노클로날 또는 폴리클로날인 항체 조성물에서 사용할 수 있다. 한 측면에서, 본 발명의 항체 변이체는 표적 항원을 지니는 표적 세포, 예를 들어 암 세포를 사망시키는데 사용된다. 또 다른 측면에서, 본 발명의 항체 변이체는 표적 항원을 차단, 길항 또는 효능화하는데, 예를 들어, 사이토카인 또는 사이토카인 수용체를 길항하는데 사용된다. 한 측면에서, 본 발명의 항체 변이체는 표적 항원을 차단, 길항 또는 효능화하고 표적 항원을 지니는 표적 세포를 사망시키는데 사용된다다. 본 발명의 항체 변이체는 다양한 치료 목적에 사용될 수 있다. 다양한 다른 치료제를 본 발명의 항체 변이체와 함께 투여하는 것에 사용할 수 있다. 한 측면에서, 항체는 항-혈관형성제와 함께 투여될 수 있다.

본 발명의 항체 변이체 및 하나 이상의 치료적으로 활성인 작용제가 제제화되어 있는 제약 조성물이 구상된다. 본 발명의 항체 변이체의 제제는 원하는 정도의 순도를 지니는 상기 항체를 임의적인 제약상 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제 (Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed., 1980)와 혼합함으로써 동결건조 제제 또는 수성 용액의 형태로 보관용으로 제조된다. 생체내 투여용으로 사용될 제제는 바람직하게는 무균성이다. 이는 멸균 여과막을 통한 여과 또는 기타 방법에 의해 쉽게 달성된다. 본원에 개시된 항체 및 다른 치료적으로 활성인 작용제는 또한 면역-리포솜으로서 제제화될 수 있고/있거나 마이크로캡슐 내에 포획될 수 있다.

제제 내의 치료적으로 활성인 항체 변이체의 농도는 약 0.1 내지 100 중량%로 변할 수 있다. 한 측면에서, 항체의 농도는 0.003 내지 1.0 몰농도 범위이다. 환자를 치료하기 위해, 치료적 유효 용량의 본 발명의 항체 변이체를 투여할 수 있다. 본원에서의 "치료적 유효 용량"은 투여하는 목적의 효과를 일으키는 용량을 의미한다. 정확한 용량은 치료 목적에 좌우될 것이고, 공지된 기술을 사용하여 관련 기술분야의 기술자에 의해 확인할 수 있다. 투여량은 0.01 내지 100 mg/체중 kg 이상, 예를 들어 0.1, 1, 10, 또는 50 mg/체중 kg의 범위일 수 있고, 1 내지 10 mg/kg이 바람직하다. 관련 기술분야에 공지된 바와 같이, 항체 분해, 전신 대 국소화 전달, 및 새로운 프로테아제 합성 속도, 뿐만 아니라 연령, 체중, 일반적인 건강, 성별, 식이, 투여 시간, 약물 상호작용 및 병태의 중증도에 대한 조정이 필수적일 수 있고, 관련 기술분야의 기술자에 의해 일상적인 실험으로 확인할 수 있다.

바람직하게는 무균성 수성 용액의 형태인 본 발명의 항체 변이체를 포함하는 제약 조성물의 투여는 경구, 피하, 정맥내, 비강내, 이내, 경피, 국소 (예를 들어, 겔, 연고, 로션, 크림 등), 복막내, 근육내, 폐내, 비경구, 직장 또는 안내를 포함하나 이에 제한되지는 않는 다양한 방식으로 행해질 수 있다.

야생형 항체 Fc는 2개의 동일한 힌지-CH2-CH3 폴리펩티드 단편으로 구성된다. 2개의 CH3 도메인 사이의 결합 상호작용이 2개의 폴리펩티드 단편의 이량체화에 이른다. 본 발명에서의 기본적인 아이디어는 제1 CH3 도메인 상에서의 양전하 분포 및 제2 CH3 도메인 상에서의 음전하 분포를 증가시켜서, CH3 도메인 이종이량체화를 강화하고, 항체 수율의 순도를 증가시키는 것이다. 이러한 목적을 달성하기 위해, 여러 항체 Fc 결정학 구조에서의 2개의 CH3 도메인 사이의 결합 계면을 연구하였다. 면역글로불린 중쇄 이량체 구조를 단백질 3D 구조 분석 소프트웨어 Cn3D4.3.1을 사용하여 분석하였다. PDB 데이터베이스로부터의 하기의 IgG X선 결정학 구조를 면밀히 검사하였다: 1L6X, 1HZH, 1OQX, 1H3X 및 4HAG. 2개의 동일한 중쇄 사이에서 가장 가깝게 근접하여 위치하는 것으로 인해 힌지 영역, N390 내지 S400, 및 Q347-E357의 CH3 도메인 가장자리 계면, 및 D401 내지 L410의 CH3 중간 계면에 특별한 관심이 집중되었다. 2개의 동일한 중쇄 사이의 가능한 상호작용 아미노산 쌍이 하기와 같이 확인되었다:

힌지 영역:

H224 - H224

T225 - T225

C226 - C226

P227 - P227

P228 - P228

C229 - C229

CH3 가장자리 계면:

Y391 - S400

K392 - D399

T393 - L398

T394 - V397

P395 - P396

P396 - P395

V397 - T394

L398 - T393

D399 - K392

S400 - Y391

S354 - T350

R355 - Y349

E356 - V348

E357 - Q347

CH3 중간 계면:

F405 - K409

Y407 - Y407

K409 - F405

더 강한 이온성 상호작용 힘을 제공하고 2개의 상이하게 변형된 중쇄 사이의 이종이량체 형성을 강화하기 위해, 최상의 돌연변이 조합을 확인하도록 아미노산 돌연변이 스캐닝 접근법을 사용하여 2개의 CH3 도메인 사이의 상기 기술된 계면을 검토하였다. 다양한 수의 아미노산 돌연변이 쌍을 테스트하였다. CH3 돌연변이에 더하여, 가능한 힌지 영역 돌연변이도를 돌연변이 스캐닝에 의해 또한 평가하였다.

간략하게, 적어도 2개, 바람직하게는 2 내지 6개, 가장 바람직하게는 3 내지 4개의 양으로 하전된 아미노산 (아르기닌, 히스티딘 또는 리신 등)을 연속적으로 또는 개별적으로 제1 중쇄 상의 가능한 상호작용 아미노산 위치 내로 도입하였다. 동시에, 적어도 2개, 바람직하게는 2 내지 6개, 가장 바람직하게는 3 내지 4개의 음으로 하전된 아미노산 (아스파르트산 또는 글루탐산 등)을 연속적으로 또는 개별적으로 상기 기술된 영역 내의 제2 중쇄 상의 가능한 상호작용 아미노산 위치 내로 도입하였다. 돌연변이유발을 위한 DNA 구축물은 인비보젠(InvivoGen) (캘리포니아주 샌디에고)에서 구입하였다. pFUSE-CHIg-hG1은 인간 신장 인자 1 프로모터에 의해 구동되는 CH1-힌지-CH2-CH3 단편의 발현을 위한 것이고, 일상적인 분자 클로닝에 의해 숙주 세포로부터 분비되는 발현 생성물을 제조하기 위해 IL-2 분비 신호 서열이 CH1의 N 말단 앞에 부가되었다. pFUSE-hIgG1-Fc2는 동일한 프로모터에 의해 구동되는 힌지-CH2-CH3 단편의 발현을 위한 것이다.

애질런트 테크놀러지즈(Agilent Technologies)로부터 구입한 퀵체인지 돌연변이유발 키트(Quikchange Mutagenesis Kit)를 사용함으로써 아미노산 돌연변이유발을 수행하였다. 모든 DNA 돌연변이유발 올리고 프라이머를 라이프 테크놀러지즈(Life Technologies)로부터 주문하였다. 하기 기술된 바와 같이 일련의 아미노산 치환 군이 생성되었다:

힌지 영역:

1. 쇄 A 내의 힌지 영역 (H1):

H224E, T225P, P227G, P228E

쇄 A는 서열식별번호: 1에 따른 아미노산 서열을 갖고, 서열식별번호: 2에 따른 핵산에 의해 코딩된다.

2. 쇄 B 내의 힌지 영역 (H2):

T225R, P227K, P228S

쇄 B는 서열식별번호: 3에 따른 아미노산 서열을 갖고, 서열식별번호: 4에 따른 핵산에 의해 코딩된다.

CH3 가장자리 계면:

3. 쇄 A 내의 가장자리 계면 (OA):

P395K, P396K, V397K

쇄 OA는 서열식별번호: 5에 따른 아미노산 서열을 갖고, 서열식별번호: 6에 따른 핵산에 의해 코딩된다.

4. 쇄 B 내의 가장자리 계면 (OB):

T394D, P395D, P396D

쇄 OB는 서열식별번호: 7에 따른 아미노산 서열을 갖고, 서열식별번호: 8에 따른 핵산에 의해 코딩된다.

5. 쇄 A 내의 가장자리 계면 (OC):

P395K, P396K, V397C

쇄 OC는 서열식별번호: 9에 따른 아미노산 서열을 갖고, 서열식별번호: 10에 따른 핵산에 의해 코딩된다.

6. 쇄 B 내의 가장자리 계면 (OD):

T394C, P395D, P396D

쇄 OD는 서열식별번호: 11에 따른 아미노산 서열을 갖고, 서열식별번호: 12에 따른 핵산에 의해 코딩된다.

7. 쇄 A 내의 가장자리 계면 (OG):

P395R, P396R, V397R

쇄 OG는 서열식별번호: 13에 따른 아미노산 서열을 갖고, 서열식별번호: 14에 따른 핵산에 의해 코딩된다.

8. 쇄 B 내의 가장자리 계면 (OH):

T394E, P395E, P396E

쇄 OH는 서열식별번호: 15에 따른 아미노산 서열을 갖고, 서열식별번호: 16에 따른 핵산에 의해 코딩된다.

9. 쇄 A 내의 가장자리 계면 (OI):

T393K, T394K, P395K

쇄 OI는 서열식별번호: 17에 따른 아미노산 서열을 갖고, 서열식별번호: 18에 따른 핵산에 의해 코딩된다.

10. 쇄 B 내의 가장자리 계면 (OJ):

P396D, V397D, L398D

쇄 OJ는 서열식별번호: 19에 따른 아미노산 서열을 갖고, 서열식별번호: 20에 따른 핵산에 의해 코딩된다.

11. 쇄 A 내의 가장자리 계면 (OM):

T394K, P395K, P396K

쇄 OM은 서열식별번호: 21에 따른 아미노산 서열을 갖고, 서열식별번호: 22에 따른 핵산에 의해 코딩된다.

12. 쇄 B 내의 가장자리 계면 (ON):

P395D, P396D, V397D

쇄 ON은 서열식별번호: 23에 따른 아미노산 서열을 갖고, 서열식별번호: 24에 따른 핵산에 의해 코딩된다.

13. 쇄 A 내의 가장자리 계면 (OP):

P396K, V397K, L398K

쇄 OP는 서열식별번호: 25에 따른 아미노산 서열을 갖고, 서열식별번호: 26에 따른 핵산에 의해 코딩된다.

14. 쇄 B 내의 가장자리 계면 (OQ):

T393D, T394D, P395D

쇄 OQ는 서열식별번호: 27에 따른 아미노산 서열을 갖고, 서열식별번호: 28에 따른 핵산에 의해 코딩된다.

15. 쇄 A 내의 가장자리 계면 (OS):

S354D, R355D

쇄 OS는 서열식별번호: 33에 따른 아미노산 서열을 갖고, 서열식별번호: 34에 따른 핵산에 의해 코딩된다.

16. 쇄 B 내의 가장자리 계면 (OT) 내의 가장자리 계면

V348K, Y349K, T350K

쇄 OT는 서열식별번호: 35에 따른 아미노산 서열을 갖고, 서열식별번호: 36에 따른 핵산에 의해 코딩된다.

CH3 중간 계면:

17. 쇄 A 내의 중간 계면 (OE):

F405E, Y407E, K409E

쇄 OE는 서열식별번호: 29에 따른 아미노산 서열을 갖고, 서열식별번호: 30에 따른 핵산에 의해 코딩된다.

18. 쇄 B 내의 중간 계면 (OF):

F405K, Y407K

쇄 OF는 서열식별번호: 31에 따른 아미노산 서열을 갖고, 서열식별번호: 32에 따른 핵산에 의해 코딩된다.

다른 가능한 돌연변이가 하기 목록으로부터 선택될 수 있다:

19. 쇄 A 내의 가장자리 계면 (OU):

Y391K, K392, T393K

20. 쇄 B 내의 가장자리 계면 (OV):

L398D, D399, S400D

21. 쇄 A 내의 가장자리 계면 (OK):

K392, T393K, T394K

22. 쇄 B 내의 가장자리 계면 (OL):

D399, L398D, V397D

23. 쇄 A 내의 가장자리 계면 (OW):

V397K, L398K, D399K

24. 쇄 B 내의 가장자리 계면 (OX):

K392D, T393D, T394D

25. 쇄 A 내의 가장자리 계면 (OY):

L398K, D399K, S400K

26. 쇄 B 내의 가장자리 계면 (OZ):

Y391D, K392D, T393D

27. 쇄 A 내의 가장자리 계면 (OS):

S354D, R355D

28. 쇄 B 내의 가장자리 계면 (OT)

V348K, Y349K, T350K

29. 쇄 A 내의 가장자리 계면 (RS):

S354D, R355E

30. 쇄 B 내의 가장자리 계면 (RT)

Q347R, Y349R, T350R

본 발명의 다른 측면에서, 돌연변이 H1을 돌연변이 OA 및 OC와 조합할 수 있다. 돌연변이 H2를 돌연변이 OB 및 OD와 조합할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 돌연변이 OE를 OA, OB, OC 및 OD와 조합할 수 있다; 돌연변이 OF를 돌연변이 OA, OB, OC 및 OD와 조합할 수 있다. 상기 쇄들의 다른 조합이 또한 이루어질 수 있다.

모노클로날 항체, 키메라 항체, 인간 또는 인간화 항체, 디아바디, 단일쇄 Fv (scFv), 중쇄만 있는 항체 (예를 들어, 나노바디), 피브로넥틴 결합 도메인, 다중특이적 항체 및 항체 접합체를 포함한 광범위한 항체가 본 발명의 이종이량체 분자를 구축하기 위한 원천 항체로서 사용될 수 있다. 원천 항체는 임의의 이소형 (예를 들어, IgG, IgE, IgD, IgA, IgM 및 IgY 등), 및 임의의 서브클래스 (예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, mIgG2a 및 mIgG2b 등)로부터의 것일 수 있다. 원천 항체는 관련 기술분야에 공지된 광범위한 단백질 또는 비-단백질 표적을 인식할 수 있다.

도 2는 2개의 변형된 중쇄 사이의 이종이량체 형성을 평가하기 위한 실험 절차의 개략적 예시를 제시한다. 도 2에서, 예를 들어, 제1 쇄는 CH1, 힌지 영역, CH2 및 CH3을 포함하는 장쇄이다. 제2 쇄는 힌지 영역, CH2 및 CH3만을 포함하는 단쇄이다. 제1 쇄의 CH3 도메인이 CH3 도메인의 양전하를 증가시키도록 아미노산 치환에 의해 돌연변이되었다. 바람직하게는, 제1 쇄는 2 내지 6개의 아미노산 돌연변이를 포함하였다. 그러나, 3 또는 4개의 아미노산 돌연변이가 가장 바람직한 결과를 제공하였다. 돌연변이 부위는 바람직하게는 Y391 내지 S400의 가장자리 계면 (예를 들어 Y391, K392, T393, T394, P395, P396, V397, L398, D399 및 S400), Q347 내지 E357의 가장자리 계면 (Q347, V348, Y349, T350, S354, R355, E356, E357) 및 D401 내지 L410의 중간 계면 (F405, Y407, 및 K409)으로부터 선택되었다. 가장 바람직한 치환은 T393K, T394K, P395K, P396K, V397K, V397C, L398K, V348K, Y349K 및 T350K로 이루어진 군으로부터 선택되었다. 그러나, CH3 도메인의 양전하가 치환 조합에 의해 증가되는 한 다른 치환을 또한 사용할 수 있었다. 본 발명에서, EU 항체 아미노산 넘버링 시스템을 사용하였다.

도 2에 제시된 바와 같은 제2 쇄는, 예를 들어, 힌지 영역, CH2 및 CH3만을 포함하는 단쇄이다. 제2 쇄의 CH3이 CH3 도메인의 음전하를 증가시키도록 제2 쇄에서의 아미노산 치환에 의해 돌연변이되었다. 바람직하게는, 제2 쇄는 2 내지 6개의 이같은 이같은 아미노산 돌연변이를 포함하였다. 그러나, 3 또는 4개의 아미노산 돌연변이가 가장 바람직한 결과를 제공하였다. 돌연변이 부위는 바람직하게는 Y391 내지 S400의 가장자리 계면 (Y391, K392, T393, T394, P395, P396, V397, L398, D399 및 S400), Q347 내지 E357의 가장자리 계면 (Q347, V348, Y349, T350, S354, R355, E356, E357), 뿐만 아니라 D401 내지 L410의 중간 계면 (F405, Y407, 및 K409)에서 선택되었다. 가장 바람직한 치환은 T393D, T394D, P395D, P396D, V397D, V397C, L398D, S354D 및 R355D로 이루어진 군으로부터 선택되었다. 그러나, CH3 도메인의 음전하가 치환 조합에 의해 증가되는 한 다른 치환을 또한 사용할 수 있었다.

상보적인 쌍의 돌연변이된 쇄들을 인간 배아 신장 HEK 293 세포 내로 공동-형질감염시켰다. 다른 포유동물 세포주, 예컨대 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포 및 마우스 NS0 세포를 또한 사용할 수 있었다. 공동-형질감염의 결과로서, 돌연변이된 장쇄 및 단쇄가 도 2의 우측에 제시된 바와 같은 3가지 상이한 방식으로 이량체화될 것이다. 이량체의 일부분은 장쇄 동종이량체일 것이고, 이들의 또 다른 일부분은 장쇄/단쇄 이종이량체일 것이며, 이들의 세번째 일부분은 단쇄 동종이량체일 것이다. 바람직한 이종이량체성 항체는 장쇄/단쇄 이종이량체이다. 도 1에서, 한 이같은 이중특이적 항체 구조가 개략적으로 제시된다. 도 1에 제시된 바와 같은 짧은 중쇄는 음전하가 증가된 돌연변이된 CH3, 돌연변이되지 않은 CH2, 및 항원 A에 대한 단일쇄 가변 단편 ScFv에 부착된 힌지 영역을 포함한다. 긴 중쇄는 증가된 양전하를 포함하도록 돌연변이된 CH3 도메인, 돌연변이되지 않은 CH2, 항원 B에 대한 항원 결합 단편 Fab에 부착된 힌지 영역을 포함한다. 도 1의 패널 C 및 D는 패널 A로부터 유도된 삼중특이적 및 사중특이적 항체 형식을 예시한다. 패널 E 및 F는 패널 B로부터 유도된 삼중특이적 및 사중특이적 항체 형식이다.

긴 중쇄 내의 증가된 양전하 및 짧은 중쇄 내의 증가된 음전하는 2개의 쇄의 CH3 도메인 내의 음전하와 양전하 사이의 더 강한 정전기 인력으로 인해 단쇄/장쇄 이종이량체 (도 2 참조)의 수율을 증가시킨다. 이러한 이유로, 바람직한 이종이량체의 수율이 더 높다.

짧은 중쇄 CH3 도메인 내의 증가된 음전하는 본 발명에 따른 항체의 또 다른 특별한 특색을 또한 초래한다; 즉 양으로 하전된 장쇄 Fc만이 항체 정제 시약인 단백질 A에 결합할 수 있고, 음으로 하전된 단쇄 Fc는 단백질 A에 결합하지 않는다. 이제 이러한 특색은 공동-형질감염된 HEK293 세포 배양물로부터 생산된 이종이량체 항체를 추가로 정제하는데 사용될 수 있다.

도 2에 제시된 바와 같이, 취득된 항체는 3가지 상이한 유형이다; 장쇄 동종이량체, 장쇄/단쇄 이종이량체 및 단쇄 동종이량체. 도 8은 단쇄/장쇄 이종이량체의 상기 기술된 특별한 특색을 기초로 하는 정제 단계의 개략적 예시를 제시한다. 공동-형질감염된 세포 배양물로부터 취득된 항체의 산출물을 단백질 A 친화성 칼럼에 러닝시켰을 때, 단쇄 동종이량체는 더 이상 단백질 A에 결합하지 않기 때문에 칼럼을 관류할 것이다. 2개의 장쇄가 있는 동종이량체는 칼럼 내의 단백질 A에 강하게 결합할 것인 반면, 장쇄 Fc만이 단백질 A에 대한 결합을 제공한다는 사실로 인해 이종이량체는 더 낮은 친화성으로 단백질 A에 결합할 것이다. pH가 4 이상인 용출 용액으로 칼럼을 용출시킴으로써, 이종이량체는 용출되어 나올 것이지만, 장쇄 동종이량체는 이들이 칼럼에 더 강하게 결합하는 것으로 인해 용출되어 나오지 않을 것이다. 따라서, 이종이량체가 이러한 pH에서 용출되는 유일한 종이다.

따라서, 본 발명은 적어도 2가지의 이점을 제공한다: 첫째로, CH3 도메인 내의 음전하와 양전하 사이의 더 강한 끌어당김으로 인해 장쇄/단쇄 이종이량체 형성의 수율이 증가된다; 바람직하게는, 이량체의 90-95%가 이종이량체이다. 둘째로, 더 높은 pH의 용출 용액을 사용함으로써 바람직한 단쇄/장쇄 이종이량체를 단일 단계 단백질 A 친화성 칼럼에서 정제할 수 있다.

상기 설명에서, 도 1에 제시된 예시적인 이중특이적 항체에 짧은 중쇄 및 긴 중쇄가 있기 때문에 중쇄가 단쇄 및 장쇄인 것으로 기술된다. 그러나, 짧은 중쇄 및 긴 중쇄가 있는 것이 필수적이지 않다. 쇄 둘 다가 ScFv 항원 결합 단편에 부착될 수 있거나, 또는 쇄 둘 다가 Fab 항원 결합 단편이 있을 수 있다. 상기 설명에서, 도 1에 제시된 바와 같은 항체는 2개의 상이한 단백질에 대한 2개의 결합 부위가 있는 이중특이적 항체이지만, 또한 항체는 삼중특이적 또는 사중특이적일 수 있고 3개 또는 4개의 상이한 항원 결합 부위가 있을 수 있다. 특이성이 상이한 이러한 결합 도메인들이 도 1의 패널 C-F에 제시된 바와 같이 이량체성 중쇄 둘 다의 N 말단 또는 C 말단에 융합될 수 있다.

본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 추가적인 돌연변이가 중쇄의 힌지 영역 내에 생성된다. 가장 바람직하게는, 힌지 영역 내의 돌연변이는 위치 H224, T225, P229 또는 P228의 아미노산 중 하나 이상에 위치한다. 제1 중쇄 내의 적어도 1개의 힌지 영역 돌연변이가 바람직하게는 H334E, T225P, P229G 및 P228G로부터 선택되고, 제2 중쇄 힌지 영역 내의 적어도 1개의 돌연변이가 T225R, P227S, 및 P228K로부터 선택된다.

본원에 기술된 항체 플랫폼이 Fc-영역이 있는 임의 유형의 이중특이적 또는 다중특이적 항체에 적용될 수 있다는 것을 이해하여야 한다. 또한, 항원 결합 단편이 원하는 바와 같이 선택될 수 있다는 것을 이해하여야 한다. 본 발명의 항체는 항-암 항원 항체일 수 있거나, 암 발달 또는 침습과 연관된 비-암성 단백질에 대해 특이적일 수 있거나, 또는 예를 들어 바이러스-연관 단백질에 대해 특이적일 수 있다. 하기의 단백질 목록에 속하는 단백질, 서브유닛, 도메인, 모티프 및 에피토프를 포함하나 이에 제한되지는 않는, 사실상 모든 항원이 본 발명의 항체에 의해 표적화될 수 있다: CD2; CD3, CD3E, CD4, CD11, CD11a, CD14, CD16, CD18, CD19, CD20, CD22, CD23, CD25, CD28, CD29, CD30, CD32, CD33 (p67 단백질), CD38, CD40, CD40L, CD52, CD54, CD56, CD80, CD147, GD3, IL-1, IL-1R, IL-2, IL-2R, IL-4, IL-5, IL-6, IL-6R, IL-8, IL-12, IL-15, IL-18, IL-23, 인터페론 알파, 인터페론 베타, 인터페론 감마; TNF-알파, TNF베타2, TNFα, TNF알파베타, TNF-R1, TNF-RII, FasL, CD27L, CD30L, 4-1BBL, TRAIL, RANKL, TWEAK, APRIL, BAFF, LIGHT, VEG1, OX40L, TRAIL 수용체-1, A1 아데노신 수용체, 림포톡신 베타 수용체, TACI, BAFF-R, EPO; LFA-3, ICAM-1, ICAM-3, EpCAM, 인테그린 베타1, 인테그린 베타2, 인테그린 알파4/베타7, 인테그린 알파2, 인테그린 알파3, 인테그린 알파4, 인테그린 알파5, 인테그린 알파6, 인테그린 알파v, 알파V베타3 인테그린, FGFR-3, 각질형성세포 성장 인자, VLA-1, VLA-4, L-셀렉틴, 항-Id, E-셀렉틴, HLA, HLA-DR, CTLA-4, T 세포 수용체, B7-1, B7-2, VNR 인테그린, TGF베타1, TGF베타2, 에오탁신1, BlyS (B-림프구 자극제), 보체 C5, IgE, 제VII인자, CD64, CBL, NCA 90, EGFR (ErbB-1), Her2/neu (ErbB-2), Her3 (ErbB-3), Her4 (ErbB4), 조직 인자, VEGF, VEGFR, 엔도텔린 수용체, VLA-4, 합텐 NP-cap 또는 NIP-cap, T 세포 수용체 알파/베타, E-셀렉틴, 디곡신, 태반 알칼리성 포스파타제 (PLAP) 및 고환 PLAP-유사 알칼리성 포스파타제, 트랜스페린 수용체, 암배아 항원 (CEA), CEACAM5, HMFG PEM, 뮤신 MUC1, MUC18, 헤파라나제 I, 인간 심장 마이오신, 종양-연관 당단백질-72 (TAG-72), 종양-연관 항원 CA 125, 전립선 특이적 막 항원 (PSMA), 고분자량 흑색종-연관 항원 (HMW-MAA), 암종-연관 항원, 당단백질 IIb/IIIa (GPIIb/IIIa), 루이스 Y 관련 탄수화물을 발현하는 종양-연관 항원, 인간 사이토메갈로바이러스 (HCMV) gH 외피 당단백질, HIV gp120, HCMV, 호흡기 세포융합 바이러스 RSV F, RSVF Fgp, VNR 인테그린, IL-8, 사이토케라틴 종양-연관 항원, Hep B gp120, CMV, gpIIbIIIa, HIV IIIB gp120 V3 루프, 호흡기 세포융합 바이러스 (RSV) Fgp, 단순 헤르페스 바이러스 (HSV) gD 당단백질, HSV gB 당단백질, HCMV gB 외피 당단백질, 및 클로스트리디움 페르프린겐스(Clostridium perfringens) 독소.

선택될 수 있는 항체는 하기 항원에 대한 항체를 포함하나 이에 제한되지는 않는다: PSMA, CD133, CD138, CD20, CD19, OX40, GITR, PD-1, PD-L1 또는 PD-L2, CTLA-4, KIR, LAG-3, CD3, TCRα, TCRβ, TCRγ, TCRδ, CD40, CD40L, VEGF, EGF, VEGFR, EGFR, Her1, Her2, Her3, EpCAM, 메소텔린(Mesothelin), 글리피칸(Glypican), CD28, Erb1, Erb2, B7-H3, ICOS, BMP1, BMP2, BMP3B, BMP4, CSF1, GM-CSF, FGF1, FGF2, FGF3, FGF4, PDGFR, TIGIT, CS1, TWEAK, CCL1, CCL2, CCL3, CCL13, CXCL1, CXCL2, CXCL3, IP-10, 푸코실-GM1, IGF1, IGF2, IGF1R, IGF2R, CD64, CD32a, CD32b, CD16, 인테그린, RANK 리간드, CEA, DLL-4, GM-CSFR, ADAMS, 마이오스타틴(Myostatin), PCSK9, CXCR4, IL-1 알파, IL-1 베타, IL-12, IL-18, TNF 알파, IL-23, IL-13, MIF, IL-17, IL-17R, IL-15, IL-9, IL-5, IL-5R, IL-6, IL-25, PEG2 등.

대안적으로, 본 발명의 항체는 바이러스-연관 표적, 예컨대 HIV 단백질, HPV 단백질, CMV-단백질, 인플루엔자 바이러스 단백질 또는 프리온 단백질에 대해 특이적일 수 있다.

특정 측면에서, 본 발명의 분자는 진단 및 치료 용도에 사용될 수 있다. 더욱 구체적으로, 본 발명으로부터의 분자는 하기의 표적 목록으로부터 선택되지만 이에 제한되지 않는 2개 또는 2개 초과의 표적 항원에 결합할 수 있는 이중특이적 또는 다중특이적 항체를 생성시키는데 사용될 수 있다: IL-1 알파, IL-1 베타, IL-12, IL-18, TNF 알파, IL-23, IL-13, MIF, IL-17, IL-17R, IL-15; VEGF, VEGFR, EGFR; IL-9, IL-5, IL-5R, IL-6, IL-25, IL-13, ADAMS, PEG2, Her1, Her2 및 Her3. 통상의 기술자는 다른 가능한 표적을 인식할 수 있을 것이다.

이제 본 발명이 비제한적인 실시예에 의해 기술된다.

실시예 1: 면역글로불린 Fc 영역 내의 이온성 상호작용을 담당하는 아미노산 잔기의 확인

면역글로불린 중쇄 이량체 구조를 단백질 3D 구조 분석 소프트웨어 Cn3D4.3.1을 사용하여 분석하였다. PDB 데이터베이스로부터의 하기의 IgG X선 결정학 구조를 면밀히 검사하였다: 1L6X, 1HZH, 1OQX, 1H3X 및 4HAG. 2개의 동일한 중쇄 사이에서의 꼭 맞는 근접성으로 인해 힌지 영역, N390 내지 S400의 CH3 도메인 가장자리 계면, 및 D401 내지 L410의 CH3 중간 계면에 특별한 관심이 집중되었다. 2개의 동일한 중쇄 사이의 가능한 상호작용 아미노산 쌍이 하기에 열거된다:

힌지 영역:

H224 - H224

T225 - T225

C226 - C226

P227 - P227

P228 - P228

C229 - C229

CH3 가장자리 계면:

Y391 - S400

K392 - D399

T393 - L398

T394 - V397

P395 - P396

P396 - P395

V397 - T394

L398 - T393

D399 - K392

S400 - Y391

S354 - T350

R355 - Y349

E356 - V348

E357 - Q347

CH3 중간 계면:

F405 - K409

Y407 - Y407

K409 - F405

본 발명에서 EU 항체 아미노산 넘버링 시스템을 아미노산 넘버링에 사용한다.

실시예 2: 이종이량체 형성을 촉진하는 중쇄 내의 아미노산의 변형

적절한 이온성 상호작용 힘을 제공하고 2개의 상이하게 변형된 중쇄 사이의 이종이량체 형성을 강화하기 위해, 적어도 2개, 바람직하게는 2 내지 6개, 가장 바람직하게는 3 내지 4개의 양으로 하전된 아미노산 (아르기닌 또는 리신 등)을 연속적으로 또는 개별적으로 제1 중쇄 상의 가능한 상호작용 아미노산 위치 내로 도입하였다. 동시에, 적어도 2개, 바람직하게는 2 내지 6개, 가장 바람직하게는 3 내지 4개의 음으로 하전된 아미노산 (아스파르트산 또는 글루탐산 등)을 연속적으로 또는 개별적으로 상기 기술된 영역 내의 제2 중쇄 상의 가능한 상호작용 아미노산 위치 내로 도입하였다. 돌연변이유발을 위한 벡터 구축물은 인비보젠 (캘리포니아주 샌디에고)에서 구입하였다: pFUSE-CHIg-hG1은 인간 신장 인자 1 프로모터에 의해 구동되는 CH1-힌지-CH2-CH3 단편의 발현을 위한 것이고, 일상적인 분자 클로닝에 의해 숙주 세포로부터 분비되는 발현 생성물을 제조하기 위해 IL-2 분비 신호 서열이 CH1의 N 말단 앞에 부가되었다. pFUSE-hIgG1-Fc2는 동일한 프로모터에 의해 구동되는 힌지-CH2-CH3 단편의 발현을 위한 것이다.

애질런트 테크놀러지즈로부터 구입한 퀵체인지 돌연변이유발 키트를 사용함으로써 아미노산 돌연변이유발을 수행하였다. 모든 DNA 돌연변이유발 올리고 프라이머를 라이프 테크놀러지즈로부터 주문하였다. 고순도의 이종이량체를 생성시키는 것의 최상의 돌연변이체 조합을 확인하도록 아미노산 돌연변이 스캐닝 접근법을 사용하여 중쇄 힌지 영역, CH3 가장자리 계면 및 중간 계면을 검토하였다. 일련의 아미노산 치환 군을 하기에서 열거하였다:

힌지 영역:

1. 쇄 A 내의 힌지 영역 (H1, 음으로 하전됨):

H224E, T225P, P227G, P228E

2. 쇄 B 내의 힌지 영역 (H2, 양으로 하전됨):

T225R, P227K, P228S

CH3 가장자리 계면:

3. 쇄 A 내의 가장자리 계면 (OA, 양으로 하전됨):

P395K, P396K, V397K

4. 쇄 B 내의 가장자리 계면 (OB, 음으로 하전됨):

T394D, P395D, P396D

5. 쇄 A 내의 가장자리 계면 (OC, 양으로 하전되고, 디술피드 결합 형성):

P395K, P396K, V397C

6. 쇄 B 내의 가장자리 계면 (OD, 음으로 하전되고, 디술피드 결합 형성):

T394C, P395D, P396D

7. 쇄 A 내의 가장자리 계면 (OG, 양으로 하전됨):

P395R, P396R, V397R

8. 쇄 B 내의 가장자리 계면 (OH, 음으로 하전됨):

T394E, P395E, P396E

9. 쇄 A 내의 가장자리 계면 (OI, 양으로 하전됨):

T393K, T394K, P395K

10. 쇄 B 내의 가장자리 계면 (OJ, 음으로 하전됨):

P396D, V397D, L398D

11. 쇄 A 내의 가장자리 계면 (OM, 양으로 하전됨):

T394K, P395K, P396K

12. 쇄 B 내의 가장자리 계면 (ON, 음으로 하전됨):

P395D, P396D, V397D

13. 쇄 A 내의 가장자리 계면 (OP, 양으로 하전됨):

P396K, V397K, L398K

14. 쇄 B 내의 가장자리 계면 (OQ, 음으로 하전됨):

T393D, T394D, P395D

15. 쇄 A 내의 가장자리 계면 (OS, 음으로 하전됨):

S354D, R355D

16. 쇄 B 내의 가장자리 계면 (OT, 양으로 하전됨):

V348K, Y349K, T350K

CH3 중간 계면:

17. 쇄 A 내의 중간 계면 (OE, 음으로 하전됨):

F405E, Y407E, K409E

18. 쇄 B 내의 중간 계면 (OF, 양으로 하전됨):

F405K, Y407K

돌연변이 H1을 돌연변이 OA 또는 OC와 또한 조합할 수 있다. 돌연변이 H2를 돌연변이 OB 또는 OD와 조합할 수 있다. 이러한 조합된 돌연변이는 단백질 A에 결합하는 단백질을 충분한 양으로 생산할 뿐만 아니라, 또한 이종이량체 형성에 유리하다. 그러나, 상당량의 단일 쇄 단량체가 최종 생성물 내에서 제시되었고, 이는 적어도 1회 이상의 정제 단계로 제거하는 것을 필요로 할 수 있다.

돌연변이 OE를 OA, OB, OC 및 OD와 조합할 수 있다; 돌연변이 OF를 돌연변이 OA, OB, OC 및 OD와 조합할 수 있다. 그러나, 이러한 조합된 돌연변이들은 단백질 A에 결합하는 단백질을 충분한 양으로 생산할 수 없었다.

실시예 3: HEK 293 세포의 공동-형질감염 및 단백질 생성물 분석

이종이량체 형성 효과를 평가하기 위해 이용한 실험 절차를 도 2에서 예시하였다. 양으로 하전된 아미노산이 있는 돌연변이된 폴리펩티드 쇄 A (일반적으로, 도면 내의 장쇄) 및 음으로 하전된 아미노산이 있는 돌연변이된 폴리펩티드 쇄 B (일반적으로, 도면 내의 단쇄)를 라이프 테크놀러지즈로부터의 293펙틴 형질감염 시약을 사용하여 단독으로 또는 서로 함께 HEK293 세포 내로 형질감염시켰다. 다양한 양으로 하전된 폴리펩티드 쇄 및 음으로 하전된 폴리펩디드 쇄 조합물이 HEK 293 세포에서 공동-발현되었다. 본 발명에서 양으로 하전된 폴리펩티드 쇄와 음으로 하전된 폴리펩디드 쇄 사이의 바람직한 비는 1:1이지만, 다른 비를 또한 사용할 수 있다. 형질감염 3일 후, 세포 배양 상청액을 원심분리로 수확하고, 단백질 A 자기 비드 (피어스(Pierce)) 풀-다운에 적용하였다. 자기 비드 상에 결합된 단백질 생성물을 SDS-PAGE 겔 전기영동 상에서의 이들의 이동성을 기초로 특성화하였다. 단백질이 결합되어 있는 수집된 단백질 A 자기 비드를 30 μL PBS 완충제에 재현탁시키고, 30 μL의 SDS-PAGE 로딩 완충제와 혼합하고, 5분 동안 끓였다. 끓인 샘플의 절반 부피를 10% SDS-PAGE 상에 로딩하여 장쇄 동종이량체, 장쇄 및 단쇄 이종이량체 및 단쇄 동종이량체를 분리하였다. 대표적인 이종이량체 형성 결과 중 일부가 도 3, 4, 5, 6 및 7에서 제시된다.

도 3은 하기 샘플이 로딩된 SDS-PAGE 겔을 제시한다: M: 마커; 레인 1: WT 장쇄; 레인 2: WT 단쇄; 레인 3: WT 장쇄 및 WT 단쇄의 공동-형질감염. 중간의 이종이량체 밴드에 더하여, 상당량의 장쇄 동종이량체 (상부) 및 단쇄 동종이량체 (하부)가 있다는 것을 주목한다; 레인 4: OE 돌연변이 쇄; 레인 5: OF 돌연변이 쇄; 레인 6: OE 및 OF 쇄의 공동-형질감염; 레인 7: OA 돌연변이 쇄; 레인 8: OB 돌연변이 쇄; 레인 9: OA 및 OB 쇄의 공동-형질감염. 도면의 좌측에, 각각의 단백질 밴드에 상응하는 구조가 제시된다. 장쇄/단쇄 이종이량체가 레인 3, 6 및 9에 명확하게 존재한다. 레인 3은 상당량의 장쇄 동종이량체 및 단쇄 동종이량체를 또한 제시한다. 유사하게, 레인 6이 이종이량체 밴드에 더하여 둘 다의 동종이량체를 제시하지만, 레인 3보다 양이 더 적다. 레인 9는 둘 다의 동종이량체가 실질적으로 없고, 주로 이종이량체를 제시한다. 이러한 결과를 기초로, OA 쇄 및 OB 쇄의 공동-발현이 높은 수율의 단쇄/장쇄 이종이량체성 항체를 제공하는 것으로 보인다. OA 쇄 내의 돌연변이는 하기와 같다: P395K, P396K 및 V397K. OB 쇄 내의 돌연변이는 T394D, P395D 및 P396D이다. 두번째로 양호한 조합은 OE 및 OF의 공동-발현인 것으로 보인다. OE 내의 돌연변이는 하기와 같다: F405E, Y407E 및 K409E. OF 내의 돌연변이는 하기와 같다: F405K, Y407K.

본 실시예의 한가지 중요한 측면은 돌연변이 OE/OF 및 돌연변이 OA/OB 이종이량체의 생성물 수율이 야생형 이종이량체의 것에 필적한다는 것이다. 이는 이러한 돌연변이들이 다중특이적 항체의 대규모 제작에 중요한, 통상적인 포유동물 세포 발현 시스템에서의 단백질 발현 수준을 손상시키지 않았음을 시사하였다.

본 실시예의 또 다른 중요한 측면은 돌연변이 OB가 레인 8에서 지시되는 바와 같이 단백질 A에 대한 이의 결합 활성을 모두 상실하였다는 것이다. 그러나, 이는 여전히 OA 돌연변이와 이종이량체를 형성할 수 있다. 돌연변이된 Fc 쇄 중 하나가 단백질 A에 대한 이의 결합 활성을 상실할 수 있지만, 제2 쇄가 여전히 단백질 A에 결합할 수 있는 한, 단백질 A에 결합된 이종이량체를 형성할 수 있는 것은 이종이량체성 중쇄에서 드물지 않다 (J. H. Davis et al., Protein Engineering, Design & Selection, 2010, 23:4, 195-202). 도 8에서 논의되는 바와 같이, 이러한 특별한 특색은 이종이량체성 항체 정제에서 기술적 장점이 된다.

도 4는 하기 샘플이 로딩된 SDS-PAGE 겔을 제시한다: 레인 1: OA 쇄; 레인 2: OB 쇄; 레인 3: OA 쇄 및 OB 쇄의 공동형질감염; 레인 4: OC 쇄, 레인 5: OD 쇄; 레인 6: OC 쇄 및 OD 쇄의 공동형질감염. 도면의 좌측에, 각각의 단백질 밴드에 상응하는 구조가 제시된다. 레인 1 내지 3으로부터의 데이터는 도 3의 레인 7 내지 9에서와 유사한 결과를 제시하여, 이러한 결과들이 재현가능하다는 것을 가리킨다. OC 쇄 내의 돌연변이는 하기와 같다: P395K, P396K 및 V397C. OD 쇄 내의 돌연변이는 T394C, P395D 및 P396D이다. 장쇄 내의 3개의 양으로 하전된 아미노산이 단쇄 내의 3개의 음으로 하전된 아미노산과 쌍을 이루는 대신에, 2개의 시스테인이 양쪽 쇄 상에 도입되어 V397C와 T394C 사이의 쇄간 디술피드 결합 형성을 허용하였고, 이는 아마도 이종이량체 형성을 강화할 것이다. 그러나, 레인 6에서 제시된 바와 같이, HEK293 세포에서의 OC 쇄 및 OD 쇄의 공동-발현은 2개의 이종이량체 밴드를 초래하였다. 디술피드 결합 형성이 불완전하고, 이것이 생성물의 비균질성을 증가시키는 것으로 제안된다. 일부 발표물에 따르면, 더 아래쪽의 중간 밴드 내의 여분의 디술피드 결합이 있는 이종이량체는 더 위쪽의 중간 밴드 내의 정상적인 이종이량체보다 더 빠르게 이동한다 (A. M. Merchant et al., Nature Biotechnology, 1998: 16). 추가적으로, 장쇄 동종이량체가 이러한 조합에서 명확하게 존재한다.

도 5는 하기 단백질이 로딩된 SDS-PAGE 겔을 제시한다: 레인 M: 마커; 레인 1: OA 쇄; 레인 2: OB 쇄; 레인 3: OC 쇄; 레인 4: OD 쇄; 레인 5: OA 쇄 및 OD 쇄의 공동-형질감염; 레인 6: 비어 있음; 레인 7: OC 쇄 및 OB 쇄의 공동-형질감염. 도면의 좌측에, 각각의 단백질 밴드에 상응하는 구조가 제시된다. 레인 5 및 7은 주요 단쇄/장쇄 이종이량체 항체를 제시한다. 이러한 레인들 둘 다가 미량의 동종이량체를 동종이량체를 또한 제시한다. 이러한 결과를 기초로, OA 쇄 및 OD 쇄의 공동-형질감염, 뿐만 아니라 OC 쇄 및 OB 쇄의 공동-형질감염이 비교적 더 높은 수율의 이종이량체성 쇄를 제공하는 것으로 보인다. OA 쇄 내의 돌연변이는 하기와 같다: P395K, P395K 및 V397K. OD 쇄 내의 돌연변이는 T394C, P395D 및 P396D이다. OC 쇄 내의 돌연변이는 P395K, P396K, C397C이고, OB 쇄 내의 돌연변이는 T394D, P395D 및 P396D이다.

도 6은 하기 샘플이 로딩된 SDS-PAGE 겔을 제시한다: 레인 1 내지 3: OA 쇄 및 OB 쇄의 3개의 독립적인 공동-형질감염; 레인 4: 비어 있음; 레인 5: 대조군으로서의 WT 장쇄 및 단쇄의 공동-형질감염. 레인 1 내지 3은 실질적으로 순수한 장쇄/단쇄 이종이량체 항체를 제시하여, OA 및 OB 이종이량체의 고순도 생산이 일관적임을 시사한다.

도 7은 하기 샘플의 SDS-PAGE 겔 분석이다: 레인 1: OG 쇄 및 OH 쇄의 공동-형질감염; 레인 2: 비어 있음; 레인 3: OI 쇄 및 OJ 쇄의 공동-형질감염; 레인 4: 비어 있음; 레인 5: OM 쇄 및 ON 쇄의 공동-형질감염. 각각의 쇄 내의 아미노산 돌연변이가 실시예 2에 개시되어 있다. 중간의 이종이량체 밴드에 더하여, 3개의 조합 모두에 적어도 하나의 동종이량체 밴드가 있다. 레인 1 및 3은 장쇄 동종이량체 밴드 (상부)가 있는 반면, 레인 5는 단쇄 동종이량체 밴드 (하부)가 있다. 이는 이종이량체 밴드의 수율을 최대화하기 위해 장쇄 및 단쇄 사이의 비가 조정될 필요가 있다 (1:1 비 이외의 것, 예컨대 1:2 또는 2:1이 요구된다)는 것을 시사한다. 레인 1에서는 더 많은 OH가 요구되고, 레인 3에서는 더 많은 OJ가 요구되며, 레인 5에서는 더 많은 OM이 요구된다.

실시예 4: 단일 단계 정제가 고도로 정제된 항체를 제공한다

도 8은 항체의 단일 단계 정제의 원리를 예시한다. Fc를 함유하는 이종이량체 이중특이적 또는 다중특이적 항체의 정제를 관련 기술분야에 공지된 방법을 사용함으로써 달성할 수 있다. 단백질 정제 공정 후의 이중특이적 또는 다중특이적 항체 생성물의 높은 순도를 달성하기 위해, 여러 공지된 기술이 아미노산 돌연변이 (예를 들어, H435R, 또는 Y436F)를 Fc 이종이량체 내의 2개의 쇄 중 하나에 의도적으로 도입하여 단백질 A에 대한 이의 결합 활성을 감소시키거나 제거하였다. US2014/0348839 (메드이뮨(MedImmune), WO 2010/151792, US20140248664 (리제네론(Regeneron)), PEGS2015 GBR1302 포스터 (글렌마크(Glenmark))에 이러한 방법들이 기술되었다. 이종이량체 Fc에서의 이같은 변형은 Fc 이종이량체 내의 1개의 쇄만이 그대로 단백질 A에 결합하게 하였다. 그 결과, 이러한 종류의 이종이량체는 야생형 동종이량체에 비교하여 단백질 A에 대한 결합이 더 약하고, 따라서 더 높은 pH (pH 4.0 내지 5.0)에서 용출될 수 있는 반면, 정상적인 Fc 동종이량체는 pH 2.8 내지 pH 3.0에서만 용출될 수 있다.

본 발명에서, HEK293 세포 내로의 돌연변이체 OA 및 OB의 공동-형질감염은 도 3, 4 및 6에서 제시된 바와 같이 고수율의 이종이량체 (95% 초과)를 생산할 수 있다. 동시에, 돌연변이체 OA는 이의 단백질 A 결합 활성을 유지한 반면 (도 3 레인 7; 도 4 레인 1 및 도 5 레인 1에서 입증된 바와 같음), 돌연변이체 OB는 이의 단백질 A 결합을 거의 모두 상실하였다 (도 3 레인 8; 도 4 레인 2 및 도 5 레인 2에서 입증된 바와 같음). 따라서, 상기 기술된 정제 공정을 OA/OB 이종이량체 정제에 쉽게 적용할 수 있다. OA/OB 이종이량체 정제 전략을 도 8에서 예시하였다.

한 실시양태에서, OA 및 OB로 공동-형질감염된 세포 배양 상청액을 수확하고, 단백질 A 칼럼에 적용하였다. OB는 단백질 A 결합 활성을 상실하였기 때문에, 이의 동종이량체는, 존재한다면, 칼럼을 관류하거나 또는 세정 단계에 의해 씻겨나갈 것이다. OA/OB 이종이량체만이 pH 4.2 (20 mM 시트르산나트륨, 1 M NaCl, pH 4.2)에서 칼럼으로부터 용출되었다. OA 동종이량체는 이러한 pH에서 칼럼에 남을 것이다. 이러한 단일 정제 단계를 사용하여, OA/OB 이종이량체를 높은 순도로 정제할 수 있다.

OA 및 OB 이종이량체 정제 성질이 도 9에서 예시된다. OA 및 OB 공동형질감염 샘플을 단백질 A 칼럼에 로딩하였다. 세정 후, 이종이량체 생성물이 먼저 pH 4.0에서 용출되고 나서, pH 2.8에서 용출되었다. 레인 2 내지 6은 pH 4.0에서 용출된 분획이고, 레인 7 내지 10은 pH 2.8에서 용출된 분획이다. 레인 4 및 5에서 제시된 바와 같이 OA 및 OB 이종이량체가 pH 4.0에서 용출될 수 있다.

OA 및 OB 이종이량체가 이중특이적 항체 형성을 촉진한다는 것을 입증하기 위해, 헤르셉틴 VL 및 VH로부터 유도된 항-Her2 scFv를 표준 분자 클로닝 방법을 사용하여 인-프레임으로 OB 단편과 융합시켜 항-Her2-OB를 생성시켰다. 추가적으로, 2종의 상이한 항-CD3 뮤린 항체 VL 및 VH로부터 유도된 2개의 항-CD3 scFv를 표준 분자 클로닝 방법을 사용하여 인-프레임으로 OA Fc 단편 (CH1 영역 없음)과 융합시켜 항-CD3.1-OA 및 항-CD3.2-OA를 생성시켰다. 라이프 테크놀러지즈로부터의 293펙틴을 사용하여 항-Her2-OB를 항-CD3.1-OA 또는 항-CD3.2-OA 중 하나와 함께 HEK 293 세포 내로 공동형질감염시킴으로써 2개의 이중특이적 항체가 생성되었다. 정제된 이중특이적 항체 생성물이 도 10에서 예시된다. 레인 1은 분자 마커이고; 레인 2 내지 6은 제1 이중특이적 항체 생성물인 Her2xCD3.1 (항-Her2 및 항-CD3.1의 이종이량체)의 용출 분획이다. 레인 7 내지 10은 제2 이중특이적 항체 생성물인 Her2xCD3.2 (항-Her2 및 항-CD3.2의 이종이량체)의 용출 분획이다.

이러한 이중특이적 항체들의 이중 특이적 결합 활성을 확인하기 위해, 이중 특이적 결합 ELISA 검정법을 수행하였다. ELISA 플레이트를 2 μg/mL의 인간 CD3으로 코팅하고, 1% BSA 차단제로 차단하였다. 이중특이적 항체 샘플 및 대조군 샘플을 플레이트에 첨가하고, 1시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 세정 후, Her2 항원 (2 ng/mL)을 플레이트에 첨가하고, 2시간 동안 인큐베이션하였다. 그 후, 써모 사이언티픽(Thermo Scientific)으로부터의 인간 ErbB2 (Her2) ELISA 키트를 사용함으로써 표준 항-Her2 ELISA를 수행하였다. ELISA 결과를 도 11에서 예시하였다. TBS 및 PBS는 완충제 대조군이다. 항-Her2는 OA 단편에 융합된 헤르셉틴으로부터 유도된 scFv이다. 항-CD3.1 및 항-CD3.2는 OA 단편에 융합된 2개의 상이한 CD3 항체로부터 유도된 2개의 scFv이다. Her2xCD3.1은 항-Her2-OB 및 항-CD3.1-OA 이종이량체이다. Her2xCD3.2는 항-Her2-OB 및 항-CD3.2-OA 이종이량체이다. 이러한 결과는 2개의 이중특이적 항체만이 이중 특이적 결합 활성을 제시하였음을 가리켰다. 다른 단일 특이적 작용제는 어떠한 이중 특이적 결합 활성도 제시하지 않았다.

본 발명이 어느 정도 상세하게 기술되었지만, 본 개시내용은 단지 예시로서 이루어졌다는 것과 본 발명의 취지 및 범주를 벗어나지 않으면서 일부분들의 구성 및 배열의 상세사항에서의 다수의 변화를 모색할 수 있다는 것을 이해하여야 한다.

서열 목록 첨부

서열식별번호: 1

유형: 단백질 (H1)

유기체: 인공 서열

Ser Asp Lys Thr Glu Pro Cys Gly Glu Cys Pro Ala Pro

서열식별번호: 2

유형: DNA

유기체: 인공 서열

5'-TCT GAC AAA ACT GAA CCC TGC GGA GAA TGC CCA GCA CCT-3'

서열식별번호: 3

유형: 단백질 (H2)

유기체: 인공 서열

Asp Lys Thr His Arg Cys Lys Ser Cys Pro Ala Pro

서열식별번호: 4

유형: DNA

유기체: 인공 서열

5'-GAC AAA ACT CAC CGA TGC AAA TCC TGC CCA GCA CCT-3'

서열식별번호: 5

유형: 단백질 (OA)

유기체: 인공 서열

Tyr Lys Thr Thr Lys Lys Lys Leu Asp Ser Asp

서열식별번호: 6

유형: DNA

유기체: 인공 서열

5'-TAC AAG ACC ACG AAG AAG AAG CTG GAC TCC GAC-3'

서열식별번호: 7

유형: 단백질 (OB)

유기체: 인공 서열

Tyr Lys Thr Asp Asp Asp Val Leu Asp Ser Asp

서열식별번호: 8

유형: DNA

유기체: 인공 서열

5'-TAC AAG ACC GAT GAC GAT GTG CTG GAC TCC GAC-3'

서열식별번호: 9

유형: 단백질 (OC)

유기체: 인공 서열

Tyr Lys Thr Thr Lys Lys Cys Leu Asp Ser Asp

서열식별번호: 10

유형: DNA

유기체: 인공 서열

5'-TAC AAG ACC ACG AAG AAG TGC CTG GAC TCC GAC-3'

서열식별번호: 11

유형: 단백질 (OD)

유기체: 인공 서열

Tyr Lys Thr Cys Asp Asp Val Leu Asp Ser Asp

서열식별번호: 12

유형: DNA

유기체: 인공 서열

5'-TAC AAG ACC TGC GAC GAT GTG CTG GAC TCC GAC-3'

서열식별번호: 13

유형: 단백질 (OG)

유기체: 인공 서열

Tyr Lys Thr Thr Arg Arg Arg Leu Asp Ser Asp

서열식별번호: 14

유형: DNA

유기체: 인공 서열

5'-TAC AAG ACC ACG AGA CGA AGG CTG GAC TCC GAC-3'

서열식별번호: 15

유형: 단백질 (OH)

유기체: 인공 서열

Asn Tyr Lys Thr Glu Glu Glu Val Leu Asp Ser

서열식별번호: 16

유형: DNA

유기체: 인공 서열

5'-AAC TAC AAG ACC GAA GAG GAA GTG CTG GAC TCC-3'

서열식별번호: 17

유형: 단백질 (OI)

유기체: 인공 서열

Asn Asn Tyr Lys Lys Lys Lys Pro Val Leu Asp

서열식별번호: 18

유형: DNA

유기체: 인공 서열

5'-AAC AAC TAC AAG AAG AAG AAG CCC GTG CTG GAC-3'

서열식별번호: 19

유형: 단백질 (OJ)

유기체: 인공 서열

Lys Thr Thr Pro Asp Asp Asp Asp Ser Asp Gly

서열식별번호: 20

유형: DNA

유기체: 인공 서열

5'-AAG ACC ACG CCT GAC GAT GAC GAC TCC GAC GGC-3'

서열식별번호: 21

유형: 단백질 (OM)

유기체: 인공 서열

Asn Tyr Lys Thr Lys Lys Lys Val Leu Asp Ser

서열식별번호: 22

유형: DNA

유기체: 인공 서열

5'-ACC TAC AAG ACC AAG AAA AAG GTG CTG GAC TCC-3'

서열식별번호: 23

유형: 단백질 (ON)

유기체: 인공 서열

Tyr Lys Thr Thr Asp Asp Asp Leu Asp Ser Asp

서열식별번호: 24

유형: DNA

유기체: 인공 서열

5'-TAC AAG ACC ACG GAT GAC GAC CTG GAC TCC GAC-3'

서열식별번호: 25

유형: 단백질 (OP)

유기체: 인공 서열

Lys Thr Thr Pro Lys Lys Lys Asp Ser Asp Gly

서열식별번호: 26

유형: DNA

유기체: 인공 서열

5'-AAG ACC ACG CCT AAG AAA AAG GAC TCC GAC GGC-3'

서열식별번호: 27

유형: 단백질 (OQ)

유기체: 인공 서열

Asn Asn Tyr Lys Asp Asp Asp Pro Val Leu Asp

서열식별번호: 28

유형: DNA

유기체: 인공 서열

5'-AAC AAC TAC AAG GAC GAC GAC CCC GTG CTG GAC-3'

서열식별번호: 29 (EPC)

유형: 단백질

유기체: 인공 서열

Asp Gly Ser Phe Glu Leu Glu Ser Glu Leu Thr Val Asp

서열식별번호: 30

유형: DNA

유기체: 인공 서열

5'-GAC GGC TCC TTC GAA CTC GAA AGC GAA CTC ACC GTG GAC-3'

서열식별번호: 31 (FPC)

유형: 단백질

유기체: 인공 서열

Asp Gly Ser Phe Lys Leu Lys Ser Lys Leu Thr

서열식별번호: 32

유형: DNA

유기체: 인공 서열

5'-GAC GGC TCC TTC AAA CTC AAG AGC AAG CTC ACC-3'

서열식별번호: 33 (OS)

유형: 단백질

유기체: 인공 서열

Thr Leu Pro Pro Asp Asp Glu Glu Met Thr

서열식별번호: 34 (OS)

유형: DNA

유기체: 인공 서열

5'-ACC CTG CCC CCA GAC GAT GAG GAG ATG ACC-3'

서열식별번호: 35 (OT)

유형: 단백질

유기체: 인공 서열

Arg Glu Pro Gln Lys Lys Lys Leu Pro Pro Ser

서열식별번호: 36 (OT)

유형: DNA

유기체: 인공 서열

5'-CGA GAA CCA CAG AAG AAG AAG CTG CCC CCA TCC-3'

SEQUENCE LISTING <110> Bison Therapeutics Inc. <120> Multispecific antibody platform and related methods <130> 2431 WZ 01 PCT <150> US62/209978 <151> 2015-08-26 <150> PCT/US2016/045325 <151> 2016-08-03 <160> 36 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(13) <223> synthesized <400> 1 Ser Asp Lys Thr Glu Pro Cys Gly Glu Cys Pro Ala Pro 1 5 10 <210> 2 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(39) <223> chemically synthesized <400> 2 tctgacaaaa ctgaaccctg cggagaatgc ccagcacct 39 <210> 3 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(12) <223> synthesized <400> 3 Asp Lys Thr His Arg Cys Lys Ser Cys Pro Ala Pro 1 5 10 <210> 4 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(36) <223> chemically synthesized <400> 4 gacaaaactc accgatgcaa atcctgccca gcacct 36 <210> 5 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence 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Claims

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제1 면역글로불린 중쇄 및 제2 면역글로불린 중쇄를 포함하고, 여기서 제1 면역글로불린 중쇄 및 제2 면역글로불린 중쇄는 상이하며; 제1 면역글로불린 중쇄의 CH3 도메인이 서열식별번호: 5 (OA)에 따른 아미노산 서열을 포함하고, 제2 면역글로불린 중쇄의 CH3 도메인이 서열식별번호: 7 (OB)에 따른 아미노산 서열을 포함하는, 다중특이적 이종이량체성 항체.
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제6항에 있어서, 제1 면역글로불린 중쇄가 양으로 하전된 아미노산 치환을 갖고 단백질 A 결합 활성을 유지하며; 제2 면역글로불린 중쇄가 음으로 하전된 아미노산 치환을 갖고 변경된 또는 상당히 감소된 단백질 A 결합 친화성을 갖는 것인 항체.
제6항에 있어서, 항체 내의 2개의 면역글로불린 중쇄 중 단지 1개가 단백질 A 결합 친화성을 유지함으로 인해, pH 3.0 보다는 pH 4.0에서 항체를 단백질 A 칼럼으로부터 용리시킬 수 있도록, 야생형 모노클로날 항체와 비교 시 감소된 단백질 A 결합 친화성을 제시하는 항체.
제6항에 있어서, 제1 및 제2 면역글로불린 중쇄가 Fab, ScFv, 모노클로날 항체, 1가 항체, 이중특이적 항체, 다중특이적 항체, 항체 약물 접합체, 모노바디, 디아바디, 나노바디, 프로바디, 효소 도메인, 리간드 또는 수용체 융합 단백질 및 미니-결합 도메인으로부터 선택된 1개 또는 2개의 결합 도메인을 추가로 포함하는 것인 항체.
제6항에 있어서, 하나 이상의 항체 경쇄를 추가로 포함하는 항체.
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제6항에 있어서, 인간 또는 인간화 IgG, IgA, IgM, IgE 및 IgD, 또는 이들의 서브클래스, 또는 그의 하이브리드인 항체.
제6항에 있어서, 인간 또는 인간화 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, 또는 이들의 서브클래스, 또는 그의 하이브리드인 항체.
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a. 제1 면역글로불린 중쇄 및 제2 면역글로불린 중쇄의 아미노산 잔기를 변형시키는 단계이고,
여기서 항체의 제1 면역글로불린 중쇄 및 제2 면역글로불린 중쇄 사이의 발현 비는 1:1인 단계;
b. 항체를 형성하기 위해 상기 제1 면역글로불린 중쇄 및 상기 제2 면역글로불린 중쇄를 발현하는 숙주 세포를 배양하는 단계; 및
c. 숙주 세포 배양물로부터 항체를 정제하는 단계
를 포함하는, 제6항 항체의 제조 방법.
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제6항의 항체를 포함하는 제약 조성물.
제23항에 있어서, 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물.
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