BRPI0514694B1 - Processo de produção de etanercept em cultura de células de produção em larga escala - Google Patents

Abstract

produção de proteína de fusão tnfr-ig a presente invenção refere-se a um sistema aperfeiçoado para produção em grande escala de proteínas e/ou tnfr-igs em culturas de células, particularmente em meios caracterizados por um ou mais de: 1) uma concentração cumulativa de aminoácido maior que cerca de 70 mm; ii) uma razão molar cumulativa de glutamina para asparagina de menos que cerca de 2; iii) uma razão molar cumulativa de glutamina para aminoácido total de menos que cerca de 0,2; iv) uma razão molar cumulativa de íon inorgânico para aminoácido total de cerca de 0,4 para 1; ou v) uma concentração cumulativa combinada de asparagina e glutamina entre cerca de 16 e 36 mm, é provido. o uso de um tal sistema permite produção de altos níveis de proteína e menos acumulação de certos fatores indesejáveis como amônio e/ou lactato. adicionalmente, processos de cultura incluindo um desvio de temperatura, tipicamente incluindo uma diminuição em temperatura quando a cultura atingiu cerca de 20-80% de sua densidade máxima de células, são providos. alternativamente ou adicionalmente, a presente invenção provê processos de modo que, após atingirem um pico, níveis de lactato e/ou amônio na cultura diminuem com tempo.

Description

DE PRODUÇÃO DE ETANERCEPT EM CULTURA DE CÉLULAS DE PRODUÇÃO EM LARGA ESCALA.

Pedidos Relacionados

Este pedido reivindica prioridade para Números de Pedido de

Patente Provisórios 60/605 097, 60/604 941, e 60/605 074, cada um dos quais foi depositado em 27 de agosto de 2005, e cada um dos quais é aqui incorporado por referência em sua totalidade.

Antecedentes da Invenção

Proteínas e polipeptídeos tornaram-se crescentemente importantes como agentes terapêuticos. Na maioria dos casos, proteínas terapêuticas e polipeptídeos são produzidos em cultura de células, a partir de células que foram engenheiradas e/ou selecionadas para produção de níveis incomumente altos da particular proteína ou polipeptídeo de interesse. Controle e otimização de condições de cultura de células são criticamente importantes para produção comercial bem sucedida de proteínas e polipeptídeos.

Muitas proteínas e polipeptídeos produzidos em cultura de células são produzidas em um processo de batelada ou batelada - alimentada, onde células são cultivadas por um período de tempo, e então a cultura é terminada e a proteína ou polipeptídeo produzido é isolado. A última quantidade e qualidade de proteína ou polipeptídeo produzida pode ser dramaticamente afetada pelas condições da cultura de células. Por exemplo, tradicionais processos de cultura de batelada - alimentada e batelada freqüentemente resultam em produção de produtos de despejo metabólico que têm efeitos prejudiciais sobre crescimento de célula, viabilidade, e produção ou estabilidade da proteína ou polipeptídeo de interesse. Embora tenham sido feitos esforços para aperfeiçoamento de produção de proteínas e polipeptídeos em processos de cultura de batelada e batelada alimentada, permanece uma necessidade de adicionais aperfeiçoamentos.

Adicionalmente, significante esforço foi investido no desenvolvimento de meios definidos (isto é, meios montados a partir de componentes individuais conhecidos e carecendo de s oro ou outros subprodutos animais) para uso em cultura de células, particularmente células mamíferas. CaractePetição 870180145134, de 26/10/2018, pág. 12/27 ^/Ó rísticas de crescimento de células podem ser muito diferentes em meios definidos como contrastados com meios derivados de soro. Há uma particular necessidade de desenvolvimento de sistemas aperfeiçoados para produção de proteínas e polipeptídeos através de cultura de células em meios definidos.

Sumário da Invenção

A presente invenção provê um sistema aperfeiçoado para a produção em grande escala de proteínas e/ou polipeptídeos em cultura de células. Por exemplo, a presente invenção provê processos de cultura em escala comercial (por exemplo, 500 L ou mais) que utilizam um meio caracterizado por um ou mais de: (i) uma quantidade de aminoácido cumulativa por volume unitário maior que cerca de 70 mM, (ii) uma razão molar de glutamina cumulativa para asparagina cumulativa de menos que 2, (iii) uma razão molar de glutamina cumulativa para aminoácido total cumulativo de menos que cerca de 0,2, (iv) uma razão molar de íon inorgânico cumulativa para aminoácido total cumulativo entre cerca de 0,4 para 1, (v) uma quantidade cumulativa combinada de glutamina e por volume unitário maior que cerca de 16 mM. Aqueles versados na técnica entenderão que “cumulativa”, como usado acima, refere-se à quantidade total de um particular componente ou componentes adicionados no curso da cultura de células, incluindo componentes adicionados no início da cultura e componentes adicionados subseqüentemente. Em certas realizações preferidas da invenção, é desejável minimizar “alimentações” da cultura com o tempo, de modo que é desejável maximizar quantidades presentes inicialmente. É claro, componentes de meio são metabolizados durante cultura de modo que culturas com as mesmas quantidades cumulativas de dados componentes terão diferentes níveis absolutos se aqueles componentes são adicionados em momentos diferentes (por exemplo, todos presentes inicialmente vs. alguns adicionados por alimentações).

De acordo com a presente invenção, uso de tal meio permite produção de altos níveis de proteína e menos acumulação de certos fatores indesejáveis como amônio e/ou lactato.

Aqueles versados na técnica entenderão que as formulações de

meios da presente invenção abrangem ambos, meios definidos e nãodefinidos. Em certas realizações preferidas da presente invenção, o meio de cultura é um meio definido no qual a composição do meio é conhecida e controlada.

Em certas realizações preferidas da presente invenção, os processos de cultura incluem troca de cultura de um primeiro conjunto de condições de cultura para um segundo conjunto de condições de cultura de modo que um desvio metabólico das células é obtido. Em algumas realizações, esta mudança é realizada quando a cultura atingiu cerca de 20-80% de sua densidade máxima de células. Em algumas realizações, a mudança envolve alteração de temperatura (ou faixa de temperatura) na qual a cultura é mantida. Alternativamente ou adicionalmente, a presente invenção provê processos ajustados de modo que, após atingir um pico, níveis de lactato e/ou amônio na cultura diminuem com o tempo. Em outras realizações, a mudança envolve mudança de pH, osmolalidade ou o nível de indutores químicos, como ácidos alcanóicos ou seis sais.

Culturas de células da presente invenção opcionalmente podem ser suplementadas com nutrientes e/ou outros componentes de meio incluindo hormônios e/ou outros fatores de crescimento, partículas íons (como sódio, cloreto, cálcio, magnésio, e fosfato), tampões, vitaminas, nucleosídeos ou nucleotídeos, elementos em traços (compostos inorgânicos usualmente presentes em concentrações finais muito baixas), aminoácidos, lipídeos , ou glicose ou outra fonte de energia. Em certas realizações, da presente invenção, pode ser benéfico suplementar os meios com indutores químicos como hexametileno-bis(aetamida) (“HMBA”) e butirato de sódio (“NaB”). Estes suplementos opcionais podem ser adicionados no início da cultura ou podem ser adicionados em um ponto posterior de modo a reabastecer nutrientes esgotados ou por outra razão. Em geral, é desejável selecionar-se a composição de meio inicial para minimizar suplementação de acordo com a presente invenção.

Várias condições de cultura podem ser monitoradas de acordo com a presente invenção, incluindo pH, densidade de células, viabilidade de

células, níveis de lactato, níveis de amônio, osmolaridade, ou título do polipeptídeo ou proteína expressa.

Breve Descrição do Desenho

A Figura 1 mostra uma comparação de Meio 1 e Meio 2 em frascos agitados usando células anti-GDF-8.

A Figura 2 mostra crescimento e viabilidade de células de células anti-GDF-8 em Meio 1.

A Figura 3 mostra crescimento de células de culturas de células anti-GDF-8 em condições de cultura sem alimentação de glutamina e controle.

A Figura 4 mostra viabilidade de célula de culturas de células anti-GDF-8 em condições de cultura sem alimentação de glutamina e controle.

A Figura 5 mostra níveis de amônio de culturas de células antiGDF-8 em condições de cultura sem alimentação de glutamina e controle.

A Figura 6 mostra níveis de lactato de culturas de células antiGDF-8 em condições de cultura sem alimentação de glutamina e controle.

A Figura 7 mostra título anti-GDF-8 em condições de cultura sem alimentação de glutamina e controle.

A Figura 8 mostra densidade de células de culturas de células anti-GDF-8 em condições de cultura controle e sem alimentação de glutamina.

A Figura 9 mostra viabilidade de célula de culturas de células anti-GDF-8 em condições de cultura controle e privada de alimentação de glutamina.

A Figura 10 mostra níveis de amônio de culturas de células antiGDF-8 em condições de cultura controle e provada de alimentação de glutamina.

A Figura 11 mostra níveis de lactato de culturas de células antiGDF-8 em condições de cultura controle e privada de glutamina.

A Figura 12 mostra título anti-GDF-8 em condições de cultura controle e privada de glutamina.

A Figura 13 mostra resposta de dose de ferro de células antiGDF-8 em Meio 1 e Meio 2.

A Figura 14 mostra densidade de células de culturas alimentadas com glutamato e glutamina.

A Figura 15 mostra viabilidade de células de culturas alimentadas com glutamato e glutamina.

A Figura 16 mostra título anti-Lewis Y em culturas alimentadas com glutamato e glutamina.

A Figura 17 mostra níveis de lactato em culturas alimentadas com glutamato e glutamina.

A Figura 18 mostra níveis de amônio em culturas alimentadas com glutamato e glutamina.

A Figura 19 mostra osmolaridade de culturas alimentadas com glutamato e glutamina.

A Figura 20mostra densidade de células de células anti-Lewis Y. Cada gráfico é a média de dois frascos agitados crescidos usando as mesmas condições.

A Figura 21 mostra viabilidade de células de células anti-Lewis Y. Cada gráfico é a média de dois frascos agitados crescidos usando as mesmas condições.

A Figura 22 mostra título médio de cultura anti-Lewis Y. Cada gráfico é a média de dois frascos agitados crescidos usando as mesmas condições.

A Figura 23 mostra níveis de amônio de células anti-Lewis Y. Cada gráfico é a média de dois frascos agitados crescidos usando as mesmas condições.

A Figura 24 mostra um impulsor de salto usado em culturas de batelada - alimentada.

A Figura 25 mostra crescimento de células de células anti-GDF8 sob várias condições experimentais.

A Figura 26 mostra viabilidade de células anti-GDF-8 sob várias condições experimentais.

A Figura 27 mostra título anti-GDF-8 sob várias condições experimentais.

A Figura 28 mostra níveis de lactato de culturas anti-GDF-8 sob várias condições experimentais.

A Figura 29 mostra níveis de amônio de culturas anti-GDF-8 sob várias condições experimentais.

A Figura 30 mostra crescimento de célula de células anti-GDF-8 sob várias condições experimentais.

A Figura 31 mostra título anti-GDF-8 sob várias condições experimentais.

A Figura 32 mostra níveis de lactato de culturas anti-GDF-8 sob várias condições experimentais.

A Figura 33 mostra níveis de amônio de culturas anti-GDF-8 sob várias condições experimentais.

A Figura 34 mostra crescimento de célula de células anti-GDF-8 em Meio 9 modificado contendo vários níveis de glutamina e asparagina.

A Figura 35 mostra viabilidade de células de células anti-GDF-8 em Meio 9 modificado contendo vários níveis de glutamina e asparagina.

A Figura 36 mostra níveis de lactato de culturas anti-GDF-8 em Meio 9 modificado contendo vários níveis de glutamina e asparagina.

A Figura 37 mostra níveis de amônio de culturas anti-GDF-8 em Meio 9 modificado contendo vários níveis de glutamina e asparagina.

A Figura 38 mostra níveis de glutamina de culturas anti-GDF-8 em Meio 9 modificado contendo vários níveis de glutamina e asparagina.

A Figura 39 mostra título anti-GDF-8 em Meio 9 modificado contendo vários níveis de glutamina e asparagina.

A Figura 40 mostra osmolaridade de culturas de anti-GDF-8 em Meio 9 modificado contendo vários níveis de glutamina e asparagina.

A Figura 41 mostra crescimento de célula de células anti-GDF-8 em meios contendo vários níveis de asparagina e cisteína.

A Figura 42 mostra níveis de lactato de culturas de anti-GDF-8 em meios contendo vários níveis de asparagina e cisteína.

A Figura 43 mostra níveis de amônio de culturas anti-GDF-8 em meios contendo vários níveis de asparagina e cisteína.

A Figura 44 mostra níveis de glutamina de culturas anti-GDF-8 em meios contendo vários níveis de asparagina e cisteína.

A Figura 45 mostra níveis de glutamato de culturas anti-GDF-8 em meios contendo vários níveis de asparagina e cisteína.

A Figura 46 mostra título de anti-GDF-8 em meios contendo vários níveis de asparagina e cisteína.

A Figura 47 mostra osmolaridade de culturas de anti-GDF-8 em meios contendo vários níveis de asparagina e cisteína.

A Figura 48 mostra crescimento de células de células anti-GDF8 em meios contendo vários níveis de aminoácidos e vitaminas.

A Figura 49 mostra níveis de lactato de culturas de anti-GDF-8 em meios contendo vários níveis de aminoácidos e vitaminas.

A Figura 50 mostra níveis de amônio de culturas de anti-GDF-8 em meios contendo vários níveis de aminoácidos e vitaminas.

A Figura 51 mostra níveis de glutamina de culturas de anti-GDF8 em meios contendo vários níveis dé aminoácidos e vitaminas.

A Figura 52 mostra título de anti-GDF-8 em meios contendo vários níveis de aminoácidos e vitaminas.

A Figura 53 mostra crescimento de células anti-GDF-8 em meios contendo vários níveis de vitaminas, elementos em traços E e ferro.

A Figura 54 mostra níveis de lactato de culturas de anti-GDF-8 em meios contendo vários níveis de vitaminas, elementos em traços E e ferro.

A Figura 55 mostra níveis de amônio de culturas de anti-GDF-8 em meios contendo vários níveis de vitaminas, elementos em traços E e ferro.

A Figura 56 mostra título de anti-GDF-8 em meios contendo vários níveis de vitaminas, elementos em traços E e ferro.

A Figura 57 mostra crescimento de células anti-GDF-8 em Meios

1, 3e9.

A Figura 58 mostra título anti-GDF-8 em Meio 1,3 e 9.

A Figura 59 mostra títulos de antí-GDF-8 extrapolados para vários níveis de glutamina sozinha e glutamina e asparagina combinadas totais.

A Figura 60 mostra crescimento de células anti-ABeta sob várias condições de meios testadas.

A Figura 61 mostra viabilidade de células anti-ABeta sob várias condições de meios testadas.

A Figura 62 mostra níveis de lactato de culturas de anti-ABeta 10 sob várias condições de meios testadas.

A Figura 63 mostra níveis de amônio de culturas de anti-ABeta sob várias condições de meios testadas.

A Figura 64 mostra título de anti-ABeta em várias condições de meios testadas.

A Figura 65 mostra osmolaridade de culturas de anti-ABeta sob várias condições de meios testadas.

A Figura 66 mostra crescimento de células expressando TNFRIg sob várias condições experimentais.

A Figura 67 mostra viabilidade de células expressando TNFR-lg 20 sob várias condições experimentais.

A Figura 68 mostra glucose residual em culturas de células expressando TNFR-lg sob várias condições experimentais.

A Figura 69 mostra níveis de glutamina em culturas de células expressando TNFR-lg sob várias condições experimentais.

A Figura 70 mostra concentração de lactato em culturas de células expressando TNFR-lg sob várias condições experimentais.

A Figura 71 mostra níveis de amônio em culturas de células expressando TNFR-lg sob várias condições experimentais.

A Figura 72 mostra título relativo de TNFR-lg sob várias condi30 ções experimentais.

A Figura 73 mostra densidades de células anti-GDF-8 crescidas em bio-reatores de 6000 L e 1 L.

A Figura 74 mostra títulos de células anti-GDF-8 crescidas em bio-reatores de 6000 L e 1 L.

A Figura 75 mostra níveis de lactato de células antí-GDF-8 crescidas em bio-reatores de 6000 L e 1 L.

A Figura 76 mostra níveis de amônio de células anti-GDF-8 crescidas em bio-reatores de 6000 L e 1 L.

Definições “Cerca”, “aproximadamente”: como aqui usados, os termos “cerca” e “aproximadamente” como aplicados a uma ou mais particulares condições de cultura de células, referem-se a uma faixa de valores que são similares ao valor referência estabelecido para aquela condição ou condições de cultura. Em cerca realizações, o termo “cerca” refere-se a uma faixa de valores que cai dentro de 25, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 porcento ou menos do valor referência estabelecido para aquela condição ou condições de cultura.

“Aminoácido”: O termo “aminoácido” como aqui usado refere-se a qualquer dos vinte aminoácidos ocorrendo naturalmente que são normalmente usados na formação de polipeptídeos, ou análogos ou derivados daqueles aminoácidos. Aminoácidos da presente invenção são providos em meio para culturas de células. Os aminoácidos providos no meio podem ser providos como sais ou em forma de hidrato.

“Anticorpo”: O termo “anticorpo” como aqui usado refere-se a uma molécula de imunoglobulina ou uma porção ativa de imunoglobulina de uma molécula de imunoglobulina, tal como um fragmento FaB ou F(ab’)2, que contem um ou mais sítios de ligação de antígeno que liga especificamente (reação imuno com) um antígeno. Os termos “anticorpos monoclonais” e “composição de anticorpo monoclonal”, como aqui usados, referemse a uma população clonal de moléculas de anticorpos que contêm somente uma espécie de um sítio de ligação de antígeno capaz de reação imuno com um particular epítopo de um antígeno, enquanto os termos “anticorpos policlonais” e “composição de anticorpo policlonal” referem-se a uma população de moléculas de anticorpos que contêm múltiplas espécies de sítios de liga-

ção de antígeno capazes de interagirem com um particular antígeno. A definição de anticorpos monoclonais inclui ambas, moléculas clonais derivadas por tradicionais tecnologias assim como moléculas de seqüência definida derivadas por manipulação ou mutação de específicos resíduos, por exemplo, anticorpos humanizados.

“Cultura de batelada”: O termo “cultura de batelada” como aqui usado refere-se a um processo de cultura de células no qual todos os componentes que serão por último usados na cultura de células, incluindo o meio (ver definição de “meio” abaixo) assim como as próprias células, são providas no início do processo de cultura. Uma cultura de batelada é tipicamente interrompida em algum ponto e as células e/ou componentes no meio são colhidos e opcionalmente purificados.

“Bio-reator”: O termo “bio-reator” como aqui usado refere-se a qualquer vaso usado para o crescimento de cultura de célula mamífera. O bioreator pode ser de qualquer tamanho tanto quanto ele seja útil para a cultura de células mamíferas. Tipicamente, o bio-reator será de pelo menos 1 litro e pode ser de 10, 100, 250, 500, 1000, 2500, 5000, 8000, 10 000, 120000 litros ou mais, ou qualquer volume intermediário. As condições internas do bioreator, incluindo, mas não limitado a pHe temperatura, são tipicamente controladas durante o período de cultura. O bio-reator pode ser composto por qualquer material que seja apropriado para retenção de culturas de células mamíferassuspensas em meios sob as condições de cultura da presente invenção, incluindo vidro, plástico ou metal. O termo “bio-reator de produção” como aqui usado refere-se ao bio-reator final usado na produção do polipeptídeo ou proteína de interesse. O volume do bio-reator de produção de cultura de célula de grande escala é tipicamente pelo menos 500 litros e pode ser 1000, 2500, 5000, 8000, 10000. 12000 litros ou mais, ou qualquer volume intermediário. Aqueles versados na técnica estarão cientes e serão capazes de escolher bio-reatores para uso na prática da presente invenção.

“Densidade de célula”: O termo “densidade de célula” como aqui usado refere-se àquele número de células presentes em um dado volume de meio.

“Viabilidade de células”: O termo “viabilidade de célula” como aqui usado refere-se à habilidade de células em cultura sobreviverem sob um dado conjunto de condições de cultura ou variações experimentais. O termo como aqui usado também refere-se àquela porção de células que estão vivas em um particular momento em relação ao número total de células, vivas e mortas, na cultura naquele momento.

“Cultura”, “Cultura de células” e “Cultura de células mamíferas”: Estes termos como aqui usados referem-se a uma população de células mamíferas que é suspensa em um meio (ver definição de “meio” abaixo) sob condições apropriadas para sobrevivência e/ou crescimento da população de células. Como será claro para aqueles versados na técnica, estes termos como aqui usados podem se referir à combinação compreendendo a população de células mamíferas e o meio no qual a população está suspensa.

“Cultura de batelada alimentada”: O termo “cultura de batelada alimentada” como aqui usado refere-se a um processo de cultura de células no qual adicionais componentes são providos à cultura em algum tempo subseqüente ao início do processo de cultura. Os componentes providos tipicamente compreendem suplementos nutricionais para as células que foram esgotados durante o processo de cultura. Uma cultura de batelada ali20 mentada é tipicamente interrompida em algum ponto e as células e/ou componentes no meio são colhidas e opcionalmente purificadas.

“Fragmento”: O termo “fragmento” como aqui usado refere-se a polipeptídeos e é definido como qualquer porção discreta de um dado polipeptídeo que é única para ou característica daquele polipeptídeo. O termo como aqui usado também refere-se a qualquer porção discreta de um dado polipeptídeo que retém pelo menos uma fração da atividade do polipeptídeo de inteiro comprimento. Preferivelmente a fração de atividade retida é pelo menos 10% da atividade do polipeptídeo de inteiro comprimento. Mais preferivelmente a fração de atividade retida é pelo menos 20%, 30%, 40%, 50%,

60%, 70%, 80%, ou 90% da atividade do polipeptídeo de inteiro comprimento. Ainda mais preferivelmente a fração de atividade retida é pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% da atividade do polipeptídeo de inteiro com-

primento. Mais preferivelmente, a fração de atividade retida é 100% da atividade do polipeptídeo de inteiro comprimento. O termo como aqui usado refere-se a qualquer porção de um dado polipeptídeo que inclui pelo menos um elemento de seqüência estabelecida encontrado no polipeptídeo de inteiro comprimento. Preferivelmente, o elemento seqüência abrange pelo menos 45, mais preferivelmente pelo menos cerca de 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 ou mais aminoácidos do polipeptídeo de inteiro comprimento.

“Gene: O termo “gene” como aqui usado refere-se a qualquer seqüência de nucleotídeos, ADN ou ARN, pelo menos alguma porção da qual codifica um produto final discreto, tipicamente, mas não limitado a, um polipeptídeo, que funciona em algum aspecto de metabolismo ou desenvolvimento celular. O termo não é pretendido referir-se somente à seqüência codificante que codifica o polipeptídeo ou outro produto final discreto, mas também pode abranger regiões precedendo e seguindo a seqüência codificante que modula o nível basal de expressão (ver definição de “elemento de controle genético” abaixo), assim como seqüências intervenientes (“introns”) entre segmentos codificantes individuais (“exons”).

“Elemento de controle genético: O termo “elemento de controle genético” como usado aqui refere-se a qualquer elemento de seqüência que modula a expressão de um gene ao qual está operavelmente ligado. Elementos de controle genético podem funcionar através de tanto aumento ou diminuição de níveis de expressão e podem estar localizados antes, dentro ou após a seqüência codificante. Elementos de controle genético podem atuar em qualquer estágio de expressão de gene através de regulação, por exemplo, iniciação, elongação ou terminação de transcrição, união de ARNm, edição de ARNm, estabilidade de ARNm, localização de ARNm dentro da célula, iniciação, elongação ou terminação de tradução, ou qualquer outro estágio de expressão de gene. Elementos de controle genético podem funcionar individualmente ou em combinação uns com os outros.

“Hibridoma”: O termo “hibridoma” como aqui usado refere-se a uma célula criada por fusão de uma célula imortalizada derivada de uma fonte imunológica e uma célula produzindo anticorpo. O resultante hibridoma é

uma célula imortalizada que produz anticorpos. As células individuais usadas para criar o hibridoma podem ser de qualquer fonte mamífera, incluindo, mas não limitado a, rato, porco, coelho, carneiro, porco, cabra e humana. O termo também abrange linhas de células trioma, que resultam quando progênie de fusões de mieloma hetero-híbridos, que são o produto de uma fusão entre células humanas e uma linha de células de mieloma murina, são subseqüentemente fundidos com uma célula de plasma. Além disso, o termo é pretendido incluir qualquer linha de célula híbrida imortalizada que produza anticorpos tais como, por exemplo, quadromas (ver, por exemplo, Milstein et al., Nature, 537:3053(1983)).

Densidade de Células Viáveis Integrada”: O termo “densidade de células viáveis integrada” como aqui usado refere-se à densidade média de células viáveis sobre o curso da cultura multiplicada pela quantidade de tempo que a cultura foi corrida. Assumindo a quantidade de polipeptídeo e/ou proteína produzida é proporcional ao número de células viáveis presentes sobre o curso da cultura, densidade de células viáveis integrada é uma ferramenta útil para estimar a quantidade de polipeptídeo e/ou proteína produzida no curso da cultura. ' “Meio”, “meio de cultura de célula”, “meio de cultura”: Estes termos como aqui usados referem-se a uma solução contendo nutrientes que alimentam crescimento de células mamíferas. Tipicamente, estas soluções provêm aminoácidos essenciais e não-essenciais, fontes de energia, e elementos em traços requeridos pela célula para crescimento mínimo e/ou sobrevivência. A solução também pode conter componentes que aperfeiçoam crescimento e/ou sobrevivência acima de taxa mínima, incluindo hormônios e fatores de crescimento. A solução é preferivelmente formulada para um pH e concentração de sal ótima para sobrevivência e proliferação de células. O meio também pode ser um “meio definido” - um meio livre de soro que não contém proteínas, hidrolisados ou componentes de composição desconhecida. Meios definidos são livres de componentes derivados de animal e todos os componentes têm uma estrutura química conhecida.

“Produto de despejo metabólico”: O termo “produto de despejo

metabólico” como aqui usado refere-se a compostos produzidos pela cultura de células como um resultado de processos metabólicos normais ou anormais que são de algum modo prejudiciais para a cultura de células, particularmente em relação à expressão ou atividade de um desejado polipeptídeo ou proteína recombinante. Por exemplo, os produtos de despejo metabólicos podem ser prejudiciais para o crescimento ou viabilidade da cultura de células, podem diminuir a quantidade de polipeptídeo ou proteína recombinante produzida, podem alterar a dobra, estabilidade, glicosilação ou outra modificação pós-translacional do polipeptídeo ou proteína expressa, ou podem ser prejudiciais para as células e/ou expressão ou atividade do polipeptídeo ou proteína recombinante em qualquer número de outras maneiras. Produtos de despejo metabólicos exemplares incluem lactato, que é produzido como um resultado de metabolismo de glucose, e amônio, que é produzido como um resultado de metabolismo de glutamina. Uma meta da presente invenção é diminuir a produção de, reduzir ou mesmo eliminar produtos de despejo metabólicos em culturas de células mamíferas.

Osmolaridade” e “osmolalidade: Osmolalidade” é uma medida da pressão osmótica de partículas de soluto dissolvidas em uma solução aquosa. As partículas de soluto incluem ambos, íons e moléculas nãoionizadas. Osmolalidade é expressa como a concentração de partículas osmoticamente ativas (isto é, osmoles) dissolvidas em 1 kg de solução (1 mOsm/kg H₂O a 38°C é equivalente a uma pressão osmótica de 19 mm Hg). Osmolaridade”, em contraste, refere-se ao número de partículas de soluto dissolvidas em 1 litro de solução. Quando aqui usada, a abreviatura “mOsm” significa “miliosmoles/kg de solução”.

“Cultura de perfusão”: O termo “cultura de perfusão” como aqui usado refere-se a um processo de cultura de células onde adicionais componentes são providos contínua ou semi-continuamente para a cultura subseqüente ao início do processo de cultura. Os componentes providos tipicamente compreendem suplementos nutricionais para as células que foram esgotados durante o processo de cultura. Uma porção das células e/ou componentes no meio é tipicamente colhida em uma base contínua ou semi

- contínua e é opcionalmente purificada.

“Polipeptídeo”: O termo “polipeptídeo” como aqui usado referese a cadeia sequencial de aminoácidos ligados via ligações peptídicas. O termo é usado para referir-se a uma cadeia de aminoácido de qualquer comprimento, mas aqueles versados na técnica entenderão que o termo não é limitado a cadeias compridas e pode se referir a uma cadeia mínima compreendendo dois aminoácidos ligados via uma ligação peptídica.

“Proteína”: O termo “proteína” como aqui usado refere-se a um mais polipeptídeos que funcionam como uma unidade discreta. Se um polipeptídeo simples é a unidade de funcionamento discreta e requer permanente associação física com outros polipeptídeos de modo a formar a unidade de funcionamento discreta, os termos “polipeptídeo” e “proteína” como aqui usados são usados intercambiavelmente. Se unidade funcional discreta é compreendida por mais de um polipeptídeo que associam-se fisicamente uns com os outros, o termo “proteína” como aqui usado refere-se aos múltiplos polipeptídeos que são fisicamente acoplados e funcionam juntos como a unidade discreta.

“Polipeptídeo expresso recombinantemente” e “polipeptídeo recombinante”: Estes termos como aqui usados referem-se a um polipeptídeo expresso a partir de uma célula hospedeira mamífera que foi geneticamente engenheirada para expressar este polipeptídeo. O polipeptídeo expresso recombinantemente pode ser idêntico ou similar a polipeptídeos que são normalmente expressos na célula mamífera hospedeira. O polipeptídeo expresso recombinantemente também pode ser estranho para a célula hospedeira, isto é, heterólogo para peptídeos normalmente expressos na célula mamífera hospedeira. Alternativamente, o polipeptídeo expresso recombinantemente pode ser quimérico em que porções do polipeptídeo contêm seqüêncías de aminoácidos que são idênticas ou similares a polipeptídeos normalmente expressos na célula hospedeira mamífera, enquanto outras porções são estranhas para a célula hospedeira.

“Semeando”: O termo “semeando” como aqui usado refere-se ao processo de provimento de uma cultura de células a um bio-reator ou um outro vaso. As células podem ter sido previamente propagadas em um outro bio-reator ou vaso. Altemativamente, as células podem ter sido congeladas e descongeladas imediatamente antes para prover as mesmas para o bioreator ou vaso. O termo refere-se a qualquer número de células, incluindo uma célula simples.

“Título”: O termo “título” como aqui usado refere-se à quantidade total de polipeptídeo ou proteína expressa recombinantemente produzida por uma cultura de célula mamífera dividida por uma dada quantidade de volume de meio. Título é tipicamente expresso em unidades de miligramas de polipeptídeo ou proteína por mililitro de meio.

Descrição Detalhada de Certas Realizações Preferidas

A presente invenção provê sistemas aperfeiçoados para a produção de proteínas e/ou polipeptídeos por uma cultura de células. Em particular, a invenção provê sistemas que minimizam produção de um ou mais produtos metabólicos prejudiciais para crescimento de célula, viabilidade, e/ou produção de proteína ou qualidade. Em uma realização preferida da presente invenção, a cultura de células é uma cultura de batelada ou batelada alimentada. Outras certas realizações preferidas da invenção são discutidas em detalhes abaixo. Aqueles versados na técnica entenderão, entretanto, que várias modificações para estas realizações preferidas estão dentro do escopo das reivindicações apostas. São as reivindicações e seus equivalentes que definem o escopo da presente invenção, que não é e não deve ser limitado a ou por esta descrição de certas realizações preferidas. Polipeptídeos

Qualquer polipeptídeo que possa ser expresso em uma célula hospedeira pode ser produzido de acordo com a presente invenção. O polipeptídeo pode ser expresso a partir de um gene que é endógeno para a célula hospedeira, ou de um gene que é introduzido na célula hospedeira através de engenharia genética. O polipeptídeo pode ser um que ocorre em natureza, ou altemativamente pode ter uma seqüência que foi engenheirada ou selecionada pela mão humana. Um polipeptídeo engenheirado pode ser montado a partir de outros segmentos de polipeptídeos que individualmente

ocorrem em natureza, ou pode incluir um ou mais segmentos que não estão ocorrendo naturalmente.

Polipeptídeos que desejavelmente podem ser expressos de acordo com a presente invenção freqüentemente serão selecionados nas bases de uma atividade biológica ou química interessante. Por exemplo, a presente invenção pode ser empregada para expressar qualquer enzima, receptor, anticorpo, hormônio, fator regulador, antígeno, agente ligante, etc., farmacêutica ou comercialmente relevante.

Anticorpos

Dado o grande número de anticorpos correntemente em uso ou sob investigação como agentes farmacêuticos ou outros comerciais, produção de anticorpos é de particular interesse de acordo com a presente invenção. Anticorpos são proteínas que têm a habilidade de se ligar especificamente a um particular antígeno. Qualquer anticorpo que possa ser expresso em uma célula hospedeira pode ser usado de acordo com a presente invenção. Em uma realização preferida, o anticorpo a ser expresso é um anticorpo monocional.

Em uma outra realização preferida, o anticorpo monocional é um anticorpo quimérico. Um anticorpo quimérico contem fragmentos de aminoácidos que são derivados de mais de um organismo. Moléculas de anticorpo quimérico podem incluir, por exemplo, um domínio de ligação de antígeno a partir de um anticorpo de um camundongo, rato, ou outras espécies, com regiões constantes humanas. Uma variedade de abordagens para fabricação de anticorpos quiméricos foram descritas. Ver, por exemplo, Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81, 6851 (1985); Takeda et al., Nature 314, 452 (1985), Cabílly et al., patente US 4 816 567; Boss et al., patente US 4 816 397; Tanaguchi et al., publicação de patente EP 171496; publicação de patente EP 0173494, patente GB 2177096B.

Em uma outra realização preferida, o anticorpo monocional é um anticorpo humano derivado, por exemplo, através de uso de bibliotecas de mostra de fago ou mostra de ribossoma (ver, por exemplo, Winter et al., patente US 6 291 159 e Kawasaki, patente US 5 658 754) ou o uso de espé-

cies xenográficas nas quais os genes de anticorpos nativos são inativados e funcionalmente substituídos com genes de anticorpos humanos, enquanto deixando intactos outros componentes do sistema imune nativo (ver, por exemplo, Kucherlapati et al., patente US 6 657 103).

Em uma outra realização preferida, o anticorpo monoclonal é um anticorpo humanizado. Um anticorpo humanizado é um anticorpo quimérico onde a grande maioria dos resíduos de aminoácidos é derivada de anticorpos humanos, assim minimizando qualquer potencial reação imune quando liberado para um sujeito humano. Em anticorpos humanizados, resíduos de aminoácidos nas regiões de determinação de complementaridade são substituídos, pelo menos em parte, com resíduos de uma espécie não-humana que conferem uma desejada especificidade ou afinidade de antígeno. Tais moléculas de imunoglobulina alteradas podem ser fabricadas através de qualquer uma de várias técnicas conhecidas (por exemplo, Teng et al., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A., 80, 7308-7312 (1983); Kozbor et al., Immunology Today, 4, 7279 (1983); Olsson et al., Meth. Enzymol., 92, 3-16 (1982)), e são preferivelmente fabricadas de acordo com os ensinamentos de PCT Publication WO92/06193 ou EP 0239400, todas as quais são aqui incorporadas por referência). Anticorpos humanizados podem ser produzidos comercialmente através de, por exemplo, Scotgn Limited, 2 Holly Road, Twickenham, Middlesex, Great Britain. Para ainda referência ver Jones et al., Nature 321:522525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); e Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992), todas as quais são aqui incorporadas por referência.

Em uma outra realização preferida, os anticorpos monoclonais, quiméricosou humanizados descritos acima podem conter resíduos de aminoácidos que não ocorrem naturalmente em qualquer anticorpo em quaisquer espécies em natureza. Estes resíduos estranhos podem ser utilizados, por exemplo, para conferir especificidade, afinidade ou função efetora nova ou modificada sobre o anticorpo monoclonal, quimérico ou humanizado. Em uma outra realização preferida, os anticorpos descritos acima podem ser conjugados a drogas para fármacoterapia sistêmica, tais como toxinas, dro-

gas citotóxicas de baixo peso molecular, modificadores de resposta biológica, e radionuclidos (ver, por exemplo, Kunz et al., Calicheamicin derivativecarrier conjugates, US 20040082764 A1).

Em uma realização, o anticorpo é um anticorpo que se liga especificamente ao fragmento Apde proteína precursora amilóide ou a outros componentes de uma placa amilóide, e é útil em combate de acumulação de placas amilóides no cérebro que caracteriza mal de Alzheimer. (Ver, por exemplo, pedido provisório US 60/636 684).

Em uma outra realização, anticorpos da presente invenção são direcionados contra antígenos de superfície de célula expressos sobre células alvos e/ou tecidos em desordens proliferativas como câncer. Em uma realização, o anticorpo é um anticorpo anti-Lewis Y lgG1. Lewis Y é um antígeno carboidrato com a estrutura Fucal -> 2Gaipi -» 4[Fuca 1 -> 3]GlcNacp1 -> 3R (Abe et al. (1983) J. Biol. Chem., 258 11793-11797). Antígeno Lewis Y é expresso sobre a superfície de 60% a 90% de tumores epiteliais humanos (incluindo aqueles da mama, cólon, pulmão e próstata), pelo menos 40% dos quais superexpressam este antígeno, e tem limitada expressão em tecidos normais. '

De modo a alvejar Ley e efétivamente alvejar um tumor, um anticorpo com exclusiva especificidade para o antígeno é idealmente requerido. Assim, preferivelmente, os anticorpos anti-Lewis Y da presente invenção não reagem - cruzado com as estruturas tipo 1 (isto é, as séries - lacto de grupos de sangue (Lea and Leb)) e, preferivelmente, não ligam outros epítopos tipo 2 (isto é, estrutura neolacto) como estruturas Lex e H-tipo 2. Um exemplo de um anticorpo anti-Lewis Y preferido é designado hu3S913 (ver patentes US 6 310 185; 6 518 415; 5 874 060, aqui incorporadas em suas totalidades). O anticorpo humanizado hu3S193 (Attia, M.A., et al., 1787-1800) foi gerado por enxerto - CDR a partir de 3S193, que é um anticorpo monoclonal murino elevado contra célula de adenocarcinoma com excepcional especificidade para Ley (Kitamura, K., 12957-12961). Hu3S193 não somente retem a especificidade de 3S193 para Ley mas também ganhou na capacidade de mediar citotoxidez celular dependente de complemento (daqui por diante

referida como CDC) e citotoxidadez celular dependente de anticorpo (daqui por diante referida como ADCC) (Attia, M.A., et al., 1787-1800). Este anticorpo alveja xenoenxertos expressando Ley em camundongo nu como demonstrado por estudos de biodistribuição com hu3S193 marcada com 1251, 111 ln, ou 18F, assim como outros radio-marcadores que requerem um agente quelante, tal como 111 ln, 99mTc, ou 90Y (Clark, et al. 4804-4811).

Em uma outra realização, o anticorpo é um dos anticorpos antiGDF-8 humanos chamados Myo29, Myo28, e Myo22, e anticorpos e fragmentos de ligação de antígeno derivados dos mesmos. Estes anticorpos são capazes de ligação a GDF-8 madura com alta afinidade, inibem atividade de GDF-8 in vitro e in vivo como demonstrado, por exemplo, através de inibição de ligação de ActRIlB e ensaios de gene repórter, e podem inibir atividade de GDF-8 associada com regulação negativa de massa de músculo de esqueleto e densidade de osso. Ver, por exemplo, Veldman, et al., pedido de patente US 20040142382.

Receptores

Uma outra classe de polipeptídeos que foi mostrada ser eficaz como agentes farmacêuticos e/ou comerciais incluem receptores. Receptores são tipicamente glicoproteínas trans-membrana que funcionam através de reconhecimento de um ligante sinalizando extracelular. Receptores tipicamente têm um domínio proteína cinase em adição ao domínio de reconhecimento de ligante, que inicia um caminho sinalizante através de fosforilação de moléculas intracelulares alvos com ligação de ligante, conduzindo a mudanças desenvolvimentais ou metabólicas dentro da célula. Em uma realização, os receptores de interesse são modificados de modo a remover-se os domínios de transmembrana e/ou intracelulares, no lugar dos quais opcionalmente pode ser ligado um domínio-lg. Em uma realização preferida, receptores para serem produzidos de acordo com a presente invenção são receptores tirosina cinases (RTKs). A família RTK inclui receptores que são cruciais para uma variedade de funções de numerosos tipos de células (ver, por exemplo, Yarden and Ullrich, Ann. Ver. Biochem. 57:433-478, 1988; Ullrich and Schlessinger, Cell 61:243-254, 1990, aqui incorporado por referên-

cia). Exemplos não-limitantes de RTKs incluem membros da família de receptor de fator de crescimento de fibrobiasto (FGF), membros da família de receptor de fator de crescimento epidérmico (EGF), receptor de fator de crescimento derivado de plaqueta (PDGF), tirosina cinase com imunoglobulina e domínios-1 de homologia de EGF (TIE-1) e receptores de TIE-2 (Sato et al., Nature 376(6535):70-74 (1995), aqui incorporado por referência) e receptor de c-Met, alguns dos quais foram sugeridos promoverem angiogênese, direta ou indiretamente (Mustonen and Alitalo, J. Cell Biol. 129:895-898, 1995). Outros exemplos não-limitantes de RTKs incluem cinase de fígado fetal 1 (FLK-1) (algumas vezes referida como receptor contendo domínio de inserção de cinase (KDR) (Terman et al., Oncogene 6:1677-83, 1991) ou receptor de fator de crescimento de célula endotelial vascular 2 (VEGFR-2)), tirosina cinase-1 semelhante-fms (Flt-1) (DeVries et al. Science 255; 989991, 1992; Shibuya et al., Oncogene 5:519-524, 1990), algumas vezes referido como receptor de fator de crescimento de célula endotelial vascular 1 (VEGFR-1), neuropilina-1, endoglina, endosialina, e Ax1. Aqueles versados na técnica estarão cientes de outros receptores que podem ser preferivelmente expressos de acordo com a presente invenção.

Em uma realização particularmente preferida, inibidores de fator de necrose de tumor, na forma de receptores alfa e beta de fator de necrose de tumor (TNFR-1; EP 417 563 publicada em 20 de março de 1991; e TNFR2, EP 417 014 publicada em 20 de março de 1991) são expressos de acordo com a presente invenção (para revisão, ver Naismith and Sprang, J Inflamm. 47(1-2):1-7 (1995-96), aqui incorporado por referência). De acordo com um realização, o inibidor de fator de necrose de tumor compreende um receptor de TNF solúvel e preferivelmente um TNFR-lg. Em uma realização, os inibidores de TNF preferidos da presente invenção são formas solúveis de TNFRI e TNFRII, assim como proteínas de ligação de TNF solúveis, em uma outra realização, a fusão TNFR-lg é uma TNFR:Fc, um termo que é aqui usado refere-se a “etanercept”, que é um dímero de duas moléculas da porção extracelular do receptor de TNF-alfa p75, cada molécula consistindo em uma porção Fc de 235 aminoácidos de IgG.sub.1 humana.

Fatores de Crescimento e Outras Moléculas Sinalizantes

Uma outra classe de polipeptídeos que foi mostrada ser efetiva como agentes farmacêuticos e/ou comerciais incluem fatores de crescimento e outras moléculas sinalizantes.Fatores de crescimento são tipicamente glicoproteínas que são secretadas por células e se ligam a e ativam receptores sobre outras células, iniciando uma mudança metabólica ou desenvolvimental na célula receptora. Em uma realização, a proteína de interesse é um polipeptídeo de fusão ActRIlB compreendendo do domínio extracelular do receptor de ActRIlB e a porção Fc de um anticorpo (ver, por exemplo, Wolfman, et al., ActRIlB fusion polypeptides and uses therefor, US2004/0223966 A1). Em uma outra realização, o fator de crescimento pode ser um própeptídeo GDF-8 (ver, por exemplo, Wolfman, et al., Modified and stabilized GPF propeptides and uses thereof, US2003/0104406 A1). Alternativamente, a proteína de interesse pode ser uma proteína contendo domínio follistatina (ver, por exemplo, Hill, et al., GASP1: a follistatin domain containing protein, US 2003/0162714 A1, Hill, et al., GASP1: a follistatin domain containing protein, US2005/0106154 A1, Hill, et al., Follistatin domain containing proteins, US 2003/0180306 A1). ‘

Exemplos não-limitantes de fatores de crescimento de mamíferos e outras moléculas sinalizantes incluem citocinas; fator de crescimento epidérmico (EGF); fator de crescimento derivado de plaqueta (PDGF); fatores de crescimento de fibroblasto (FGFs) como aFGF e bFGF; fatores de crescimento transformante (TGFs) como TGF-alfa e TGF-beta, incluindo TGF-beta 1, TGF-beta 2, TGF-beta 3, TGF-beta 4, ou TGF-beta 5; fator de crescimento-l e II semelhante a insulina (IGF-I e IGF-II); des(1-3)-IGF-l (IGFI de cérebro), proteínas de ligação de fator de crescimento semelhante a insulina; proteínas CD como CD-3, CD-4, CD-8, e CD-19; eritropoietina; fatores osteoindutores; imunotoxinas; uma proteína morfogênica de osso (BMP); um interferon tal como interferon alfa, beta e gama; fatores de estimulação de colônia (CSFs), por exemplo, M-CSF, GM-CSF, e G-CSF; interleucinas (TLs), por exemplo, IL-1 a IL-10; fator de necrose de tumor (TNF) alfa e beta; cadeia-A de insulina; cadeia-B de insulina; pró-insulina; hormônio de estimu-

lação de folículo; calcitonina; hormônio luteinizante; glucagon; fatores coagulantes como fator VIIIC, fator IX, fator de tecido, e fator de von Willebrands; fatores anti-coagulantes como Proteína C; fator natriurético atrial; tensoativo de pulmão; um ativador de plasminogênio, tal como urocinase ou urina humana ou ativador de plasminogênio tipo - tecido (t-PA); bombesina; trombina; fator de crescimento hemopoiético; encefalinase; RANTES (regulado sobre ativação de célula-T normalmente expressa e secretada); proteína inflamatória de macrófago humano (ΜΙΡ-1-alfa); substância de inibição mullerian; cadeia-A relaxina; cadeia-B relaxina; pró-relaxina; peptideo associado com gonadotropina de camundongo; fatores neurotróficos como fator neurotrófico derivado de osso (BDNF), neurotrofina-3, 4, 5 ou 6 (NT-3, NT-4, NT-5, ou NT-6), ou um fator de crescimento de nervo como NGF-beta. Aqueles versados na técnica estarão cientes de outros fatores de crescimento ou moléculas sinalizantes que podem ser expressas de acordo com a presente invenção.

Receptores Acoplados a Proteína-G

Uma outra classe de polipeptídeos que foi mostrada ser efetiva como agente farmacêuticos e/ou comercial inclui fatores de crescimento e outras moléculas sinalizantes. Receptores acoplados a proteína-G (GPCRs) são proteínas que têm sete domínios trans-membrana. Com ligação de um ligante a um GPCR, um sinal é transduzido dentro da célula o que resulta em uma mudança em uma propriedade biológica ou fisiológica da célula.

GPCRs, junto com proteínas-G e efetores (enzimas intracelulares e canais que são modulados por proteínas-G), são os componentes de um sistema de sinalização modular que conecta o estado mensageiros secundários intracelulares para entradas extracelulares. Estes genes e produtos - genes são potenciais agentes causadores de doença.

Específicos defeitos no gene rodopsina e o gene receptor vasopressina V2 foram mostrados causarem várias formas de retinite pigmentosa dominante autossômica e recessiva autossômica, diabetes insipidus nefrogênica. Estes receptores são de crítica importância para ambos, o sistema nervoso central e processos fisiológicos periféricos. A superfamília de prote24

ína GPCR agora contém acima de 250 tipos de paralogos, receptores que representam variantes geradas por duplicações de genes (ou outros processos), como opostos a ortólogos, a mesmo receptor de espécies diferentes. A superfamília pode ser partida em cinco famílias: Família I, receptores tipificados por rodopsina e o receptor beta2-adrenérgico e correntemente representada por acima de 200 membros únicos; Família II, a família de receptor de hormônio de paratiróide/calcitonina/família de receptor de secretina; Família III, a família de receptor glutamato metabotrópico em mamíferos; Família IV, a família de receptor cAMP, importante na quimiotaxia e desenvolvimento de D. discoideum; e Família V, os receptores de feromônio de emparelhamento de fungos como STE2.

GPCRs incluem receptores para aminas biogênicas, para mediadores lipídeos de inflamação, hormônios peptídeos, e mediadores de sinal sensorial. O GPCR torna-se ativado quando o receptor se liga ao seu ligante extracelular. Mudanças conformacíonais no GPCR, que resultam da interação de ligante - receptor, afetam a afinidade de ligação de uma proteína G aos domínios intracelulares de GPCR. Isto permite GTP se ligar com aperfeiçoada afinidade à proteína G. '

Ativação da proteína G por GTP conduz à interação da subunidade alfa de proteína G com adenilato ciclase ou outros geradores de molécula segundo mensageiro. Esta interação regula a atividade de adenilato ciclase e portanto produção de um molécula segundo mensageiro, cAMP. cAMP regula fosforilação e ativação de outras proteínas intracelulares. Alternativamente, níveis celulares de outras moléculas segundo mensageiro, como cGMP ou eicosinóides, podem ser regulados ascendentemente ou regulados descendentemente através de atividade de GPCRs. A subunidade a de proteína G é desativada por hidrólise da GTP por GTPase, e as subunidades α, β, γ reassociam. A proteína G heterotrimérica então dissocia da adenilato ciclase ou outro gerador de molécula segundo mensageiro. Atividade de GPCR também pode ser regulada por fosforilação dos domínios ou laços intra- e extra-celulares.

Receptores de glutamato formam um grupo de GPCRs que são

importantes em neurotransmissão. Glutamato é o principal neurotransmissor no CNS e é acreditado ter papéis importantes em plasticidade neuronal, memória, aprendizado e algumas desordens neurológicas como epilepsia, acidente vascular cerebral, e neurodegeneração (Watson, S. e S. Arkinstall (1994) The G-Protein Linked Receptor Facts Book, Academic Press, San Diego CA, pp. 130-132). Estes efeitos de glutamato são mediados por duas classes distintas de receptores chamados inonotrópicos e metabotrópicos. Receptores ionotrópicos contêm um canal de cátion intrínseco e mediam rápidas ações excitantes de glutamato. Receptores metabotrópicos são moduladores, aumentando a capacidade de excitação de membrana de neurônios através de inibição de condutâncias de potássio dependente de cálcio e ambas, inibindo e potencializando transmissão excitante de receptores ionotrópicos. Receptores metabotrópicos são classificados em cinco subtipos baseado em farmacologia agonista e caminhos de transdução de sinal e são amplamente distribuídos em tecidos do cérebro.

A família de polipeptídeo intestinal vasoativo (VIP) é um grupo de polipeptídeos relacionados cujas ações também são mediadas por GPCRs. Membros chaves desta família são os próprios VIP, secretina, e fator de liberação de hormônio de crescimento (GRF). VIP tem um amplo perfil de ações fisiológicas incluindo relaxamento de músculos lisos, estimulação ou inibição de secreção em vários tecidos, modulação de várias atividades de células imunes, e várias atividades excitantes e inibidoras no CNS. Secretina estimula secreção de enzimas e íons no pâncreas e intestino e também está presente em pequenas quantidades no cérebro. GRF é um importante agente neuroendócrino regulando síntese e liberação de hormônio de crescimento a partir da pituitária anterior (Watson, S. e S. Arkinstall supra, pp. 278283).

Seguindo ligação de ligante ao GPCR, uma alteração conformacional é transmitida para a proteína G, que faz com que a subunidade-aifa troque uma molécula GDP ligado por uma molécula GTP e dissocie das subunidades-βγ. A forma ligada-GTP da subunidade-α tipicamente funciona como uma metade de modulação - efetora, conduzindo à produção de se-

gundo mensageiros, como AMP cíclica (por exemplo, através de ativação de adenilato ciclase), diacil glicerol, ou inositol fosfatos. Mais que 20 diferentes tipos de subunidades-α são conhecidos no homem, que associam com uma menor reunião de subunidades β e γ. Exemplos de proteínas G de mamífero incluem Gi, Go, Gq, Gs e Gt. Proteínas G são extensivamente descritas em Lodish H. et al. Molecular Cell Biology (Scientific American Books Inc., New York, N.Y., 1995), os conteúdos do qual são aqui incorporados por referência.

GPCRs são um principal alvo para ação e desenvolvimento de droga. De fato, receptores conduziram a mais de metade das drogas atualmente conhecidas (Drews, Nature Biotechnology, 1996, 14:1516) e GPCRs representam o alvo mais importante para intervenção terapêutica com 30% de drogas clinicamente prescritas tanto antagonizando como agonizando um GPCR (Milligan, G. and Rees, S., (1999) TIPS, 20:118-124). Isto demonstra que estes receptores têm uma história provada, estabelecida, como alvos terapêuticos.

Em geral, praticantes da presente invenção selecionarão seu polipeptídeo de interesse, e saberão sua precisa seqüência de aminoácidos. As técnicas da presente invenção foram aplicadas com sucesso para produção de diversos polipeptídeos incluindo, por exemplo, um anticorpo monoclonal humano direcionado para fator 8 de diferenciação e crescimento (Exemplos 1, 3, 4, 7-14), anticorpo anti-Lewis Y humanizado (Exemplos 5 e 6), anti-ABeta (Exemplo 15) e uma proteína de fusão Fc dimérica de receptor de fator de necrose de tumor (Exemplo 16), indicando que a presente invenção será útil para expressão de uma variedade de diferentes polipeptídeos e proteínas. Qualquer dada proteína que é para ser expressa de acordo com a presente invenção terá suas próprias características idiossincráticas e pode influenciar a densidade ou viabilidade de células das células cultivadas, e pode ser expressa em menores níveis que um outro polipeptídeo ou proteína desenvolvido sob idênticas condições de cultura. Aqueles versados na técnica serão capazes de modificar apropriadamente as etapas e composições da presente invenção de modo a otimizar crescimento de célula e/ou produção de qualquer dado polipeptídeo ou proteína expresso.

Elementos de Controle Genético

Como será claro para aqueles versados na técnica, elementos de controle genético podem ser empregados para regular expressão de gene do polipeptídeo ou proteína. Tais elementos de controle genético devem ser selecionados para serem ativos na célula hospedeira relevante. Elementos de controle podem ser constitutivamente ativos ou podem ser induzíveis sob definidas circunstâncias. Elementos de controle induzíveis são particularmente úteis quando a proteína expressa é tóxica ou tem efeitos de outro modo prejudiciais sobre crescimento e/ou viabilidade de célula. Em tais exemplos, regulação de expressão do polipeptídeo ou proteína através de elementos de controle induzíveis pode aperfeiçoar viabilidade de célula, densidade de célula, e/ou rendimento total do polipeptídeo ou proteína expresso. Um grande número de elementos controles úteis na prática da presente invenção são conhecidos e disponíveis na técnica.

Promotores mamíferos constitutivos representativos que podem ser usados de acordo com a presente invenção incluem, mas não são limitados a, o promotor hipoxantina fosforibosil transferase (HPTR), o promotor adenosina desaminase, o promotor piruvato cinase, o promotor beta actina assim como outros promotores constitutivos conhecidos por aqueles versados na técnica. Adicionalmente, promotores virais que foram mostrados dirigirem expressão constitutiva de seqüências codificantes em células eucarióticas incluem, por exemplo, promotores de vírus símios, promotores vírus herpes simplex, promotores vírus papiloma, promotores adenovírus, promotores de vírus de imunodeficiência humana (HIV), promotores vírus sarcoma de Rous, promotores citometalovírus (CMV), as repetições terminais longas (LTRs) de vírus de leucemia murina Moloney e outros retrovírus, o promotor timidina cinase de vírus de herpes simplex assim como outros promotores virais conhecidos por aqueles versados na técnica.

Promotores induzíveis dirigem expressão de seqüências codificantes ligadas operavelmente na presença de um agente de indução e também podem ser usados de acordo com a presente invenção. Por exemplo, em células mamíferas, o promotor metalotioneína induz transcrição de se28 qüências codificardes à jusante na presença de certos íons de metais. Outros promotores induzíveis serão reconhecidos por e/ou conhecidos por aqueles versados na técnica.

Em geral, a seqüência de expressão de gene também incluirá /

seqüências não-traduzindo 5’ e não-transcrevendo 5’ envolvidas com a iniciação de tradução e transcrição, respectivamente, tal como uma caixa TATA, seqüência de capeamento, seqüência CAAT, e semelhantes. Elementos aperfeiçoadores opcionalmente podem ser usados para aumentarem os níveis de expressão dos polipeptídeos ou proteínas a serem expressos. Exemplos de elementos aperfeiçoadores que foram mostrados funcionarem em células mamíferas incluem o aperfeiçoador de gene inicial SV40, como descrito em Dijkema et al., EMBO J. (1985) 4:761 e o aperfeiçoador/promotor derivado da repetição terminal longa (LTR) do vírus de sarcoma de Rous (RSV), como descrito em Gorman et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA (1982b) 79:6777 e citomegalovírus humano, como descrito em Boshart et al., Cell (1985) 41:521.

Sistemas para ligação de elementos controles a seqüências codificantes são bem conhecidos na técnica (técnicas de ADN recombinante e biologia molecular genérica são descritas em Sambrook, Fritsch, and Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold spring Harbor, NY, 1989, que é aqui incorporado por referência). Vetores comerciais apropriados para inserção de seqüência codificante preferida para expressão em várias células mamíferas sob uma variedade de condições de crescimento e indução são também bem conhecidos na técnica.

Introdução de seqüências codificantes e elementos de controle relacionados em células hospedeiras

Processos apropriados para introdução em células hospedeiras mamíferas de ácidos nucléicos suficientes para obtenção de expressão dos polipeptídeos ou proteínas de interesse são bem conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, Gething et al., Nature, 293:620-625 (1981); Mantei et al., Nature, 281:40-46 (1979); Levinson et al.; EP 117 060; e EP 117 058, todas aqui incorporadas por referência.

Para células mamíferas, processos preferidos de transformação incluem o processo de precipitação com fosfato de cálcio de Grahan e van der Erb, Virology, 52:456-457 (1978) ou a lipofectamine (Gibco BRL) Processo de Hawley-Nelson, Focus 15:73 (1193). Aspectos genéricos de transformações de sistema hospedeiro de célula mamífera foram descritos por Axel na patente US 4 399 216 expedida em 16 de agosto de 1983. Para várias técnicas para transformação de células mamíferas, ver Keown et al., Metods in Enzymology (1989), Keown et al., Methods in Enzymology, 185:527-537 (1990), e Mansour et al., Nature, 336:348-352 (1988). Exemplos representativos não-limitantes de apropriados vetores para expressão de polipeptídeos ou proteínas em células mamíferas incluem pCDNAI; pCD, ver Okayama, et al. (1985) Mol. Cell Biol. 5:1136-1142; pMCIneo poli-A, ver Thomas, et al. (1987) Cell 51:503-512; e um vetor baculovírus tal como pAC 373 ou pAC 610.

Em realizações preferidas, o polipeptídeo ou proteína é estavelmente transfectado na célula hospedeira. Entretanto, aqueles versados na técnica reconhecerão que a presente invenção pode ser usada com células mamíferas transfectadas transienteniente ou estavelmente.

Células

Qualquer célula mamífera ou tipo de célula suscetível a cultura de célula, e a expressão de polipeptídeos, pode ser utilizada de acordo com a presente invenção. Exemplos não-limitantes de células mamíferas que podem ser usadas de acordo com a presente invenção incluem linha mieloma de camundongo BALB/c (NOS/1, ECACC No: 85110503); retinoblastos humanos (PER.C6(CruCell, Leiden, The Netherlands)); linha CV1 de rim de macaco transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); linha de rim embriônico humano (células 293 ou 293 subclonadas para crescimento em cultura em suspensão, Graham et al., J. Gen Virol., 36:59 (1977)); células de rim de hamster filhote (BHK, ATCC CCL 10); células de ovário de hamster Chinês +/- DHFR (CHO, Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980)); células sertoli de camundongo (TM4, Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 (1980)); células de rim de macaco (CV1 ATCC CCL 70); células de rim de macaco verde Africano (VERO-76, ATCC CRL-1 587); células de carcinoma cervical humano (HeLa, ATCC CCL 2); células de rim canino ((MDCK, ATCC CCL 34); células de fígado de rato búfalo (BRL 3^a, ATCC CRL 1442); células de pulmão humano (W138, ATCC CCL 75); células de fígado humano (Hep G2, HB 8065); tumor mamário de camundongo (MMT 060562, ATCC CCL51); células TRI (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci., 383:44-68 (1982)); células MRC 5; células FS4; e uma linha de hepatoma humano (Hep G2). Em uma realização particularmente preferida, a presente invenção é usada na cultura de e expressão de polipeptídeos e proteínas das linhas de células CHO.

Adicionalmente, qualquer número de linhas de células hibridoma disponíveis comercialmente e não-comercialmente que expressam polipeptídeos ou proteínas pode ser utilizado de acordo com a presente invenção. Aqueles versados na técnica apreciarão que linhas de células hibridoma podem ter diferentes requisitos de nutrição e/ou podem requerer diferentes condições de cultura para ótimo crescimento e expressão de polipeptídeo ou proteína, e serão capazes de modificar condições quando necessário.

Como notado acima, em muitos exemplos as células serão selecionadas ou engenheiradas para produzirem altos níveis de proteína ou polipeptídeo. Freqüentemente, células são geneticamente engenheiradas para produzirem altos níveis de proteína, por exemplo, através de introdução de um gene codificando a proteína ou polipeptídeo de interesse e/ou através de introdução de elementos controles que regulam expressão do gene (se endógeno ou introduzido) codificando o polipeptídeo de interesse.

Certos polipeptídeos podem ter efeitos prejudiciais sobre crescimento de célula, viabilidade de célula ou alguma outra característica das células que por último limitam produção do polipeptídeo ou proteína de interesse de algum modo. Mesmo entre uma população de células de um tipo particular engenheiradas para expressarem um específico polipeptídeo, existe variabilidade dentro da população celular de modo que certas células individuais crescerão melhor e/ou produzirão mais polipeptídeo de interesse. Em certas realizações preferidas da presente invenção, a linha de célula é empi31 ricamente selecionada pelo praticante para crescimento robusto sob as particulares condições escolhidas para cultura de células. Em realizações particularmente preferidas, células individuais engenheiradas para expressarem um particular polipeptídeo são escolhidas para produção em grande escala baseado em crescimento de célula, densidade final de células, porcentagem de viabilidade de células, título do polipeptídeo expresso ou qualquer combinação destas ou quaisquer outras condições julgadas importantes pelo praticante.

Fase de Cultura de Células

Procedimentos típicos para produção de um polipeptídeo de interesse incluem culturas em batelada e culturas em batelada - alimentada. Processos de cultura em batelada tradicionalmente compreendem inoculação de uma cultura de produção em grande escala com uma cultura semente de uma particular densidade de células, desenvolvimento de células sob condições condutoras a crescimento e viabilidade de células, colheita de cultura quando as células atingem uma especificada densidade de células, e purificação de polipeptídeo expresso. Procedimentos de cultura de batelada - alimentada incluem uma adicional’ etapa ou etapas de suplementação de cultura em batelada com nutrientes e outros componentes que são consumidos durante o crescimento das células. Um problema persistente e nãoresolvido com tradicionais culturas em batelada ou batelada - alimentada é a produção de produtos de despejo metabólicos, que têm efeitos prejudiciais sobre crescimento de célula, viabilidade, e produção de polipeptídeos expressos. Dois produtos de despejo metabólicos que têm efeitos são lactato e amônio, que são produzidos como um resultado de metabolismo de glucose e glutamina, respectivamente. Em adição à produção enzimática de amônio como um resultado de metabolismo de glutamina, amônio também se acumula em culturas de células como um resultado de degradação nãometabólica com o tempo. A presente invenção provê um processo aperfeiçoado de produção em grande escala de polipeptídeos que minimiza os efeitos prejudiciais de amônio e lactato através de diminuição e mesmo reversão de acumulação destes produtos de despejo em culturas de células. Aqueles

versados na técnica reconhecerão que a presente invenção pode ser empregada em qualquer sistema no qual células são cultivadas, incluindo, mas não limitado a, sistemas em batelada, batelada alimentada e perfusão. Em certas realizações preferidas da presente invenção, as células são crescidas em sistemas de batelada ou batelada alimentada.

Meios

Formulações tradicionais de meios, incluindo meios comercialmente disponíveis como Ham’s F10 (Sigma), Minimal Essential Médium ([MEM], Sigma), RPMI-1640 (Sigma), e Dulbecco’s Modified Eagle’s Médium (, Sigma), contiveram níveis relativamente altos de glucose e glutamina em comparação a outros aminoácidos. Estes componentes são pensados serem requeridos em abundância uma vez que eles são as fontes de energia metabólica primária para as células. Entretanto, rápido consumo destes nutrientes conduz à acumulação de lactato e amônio como descrito acima. Adicionalmente, altos níveis iniciais de glucose e glutamina e a subseqüente acumulação de lactato e amônio resultam em alta osmolaridade, uma condição que por si própria é freqüentemente prejudicial para crescimento de célula, viabilidade de célula e a produção de polipeptídeos.

A presente invenção provê uma variedade de formulações de meios que, quando usados de acordo com outras etapas de cultura aqui descritas, minimizam e mesmo revertem acumulação de lactato e amônio. Formulações de meios da presente invenção que foram mostradas terem efeitos benéficos sobre crescimento e/ou viabilidade de célula ou sobre expressão de polipeptídeo ou proteína incluem um ou mais de: i) uma quantidade de aminoácido cumulatica por volume unitário maior que cerca de 70 mM, ii) uma razão molar de glutamina cumulativa para asparagina cumulativa de menos que cerca de 2, iii) uma razão molar de glutamina cumulativa para aminoácido total cumulativo de menos que cerca de 0,2, iv) uma razão molar der íon inorgânico cumulativo para aminoácido total cumulativo entre cerca de 0,4 a 1, e v) uma quantidade cumulativa combinada de glutamina e asparagina por volume unitário maior que cerca de 16 mM. Aqueles versados na técnica entenderão que “cumulativa”, como usado acima, refere-se à quantidade total de um particular componente ou componentes adicionados sobre o curso da cultura de células, incluindo componentes adicionados no início da cultura e componentes adicionados subseqüentemente. Aqueles versados na técnica entenderão que as formulações de meios da presente invenção abrangem ambos, meios definidos e não-definidos.

Formulações de meios tradicionais começam com um nível relativamente baixo de aminoácidos totais em comparação com as formulações de meios da presente invenção. Por exemplo, o tradicional meio de cultura de células conhecido como DME-F12 (uma mistura 50:50 de mio Eagle modificado Dulbecco e meio Ham’s F12) tem um teor de aminoácidos total de 7,29 mM, e o tradicional meio de cultura de células conhecido como RPMI1640 tem um teor de aminoácidos total de 6,44 mM (ver, por exemplo, H.J. Morton, In Vitro, 6:89-108 (1970), R.G.Ham, Proc. Nat. Assoe. Sci. (USA), 53:288-293 (1965), G.E. Moore et al., J. Am. Medical Assn., 199:519-24 (1967), todos aqui incorporados por referencia). Em certas realizações da presente invenção, a concentração de aminoácidos nos meios de cultura é preferivelmente maior que cerca de 70 mM. Ainda mais preferivelmente, as formulações de meios da presente invenção contêm concentrações de aminoácidos maiores que cerca de 70 mM nos meios de partida. Foi mostrado que quando as concentrações de aminoácidos dos meios de partida estão nesta faixa, densidade de célula e título são aumentados por todo o período de crescimento da cultura (Ver Exemplo 13).

Adicionalmente, em certas realizações da presente invenção, a razão molar de glutamina para asparagina nos meios de cultura é reduzida comparada a outros meios disponíveis comercialmente e nãocomercialmente. Preferivelmente a razão molar de glutamina para asparagina nos meios de cultura é de menos que cerca de dois.

Adicionalmente, em certas realizações da presente invenção, a razão molar de glutamina para aminoácidos totais nos meios de cultura é reduzida comparada a outros meios comercialmente e não-comercialmente disponíveis. Preferivelmente a razão molar de glutamina para aminoácidos totais nos meios de cultura é de menos que cerca de 0,2.

Um interessante e inesperado resultado de diminuição de razão molar de glutamina para asparagina ou para a concentração total de aminoácidos nos meios de partida de acordo com a presente invenção foi que em adição a uma observada diminuição na acumulação de amônio, um diminuição na cumulação de lactato também foi vista. Em certas realizações, os níveis acumulados de amônio e lactato são não somente menores que aqueles em culturas controles, mas de fato realmente diminuem após uma acumulação inicial (por exemplo, ver Exemplos 3 e 7).

Boraston (patente US 5 871 999) mostrou um meio de cultura no qual a razão molar de íons inorgânicos totais para aminoácidos totais está entre 1 e 10. Boraston mostrou que através de provimento de meio de cultura no qual a razão molar de íons inorgânicos totais para aminoácidos totais está nesta faixa, agregação de células CHO crescidas no meio é diminuída. Em uma outra realização preferida da presente invenção, a razão molar de íons inorgânicos totais para aminoácidos totais no meio de cultura é mesmo ainda reduzida, para entre cerca de 0,4 a 1. Como mostrado no Exemplo 13, redução desta razão de 1,75 para aproximadamente 0,7 resulta em um acentuado aumento em densidade de célula e produção de polipeptídeo ou proteína expressa por todo o período de crescimento da cultura.

Em uma outra realização preferida da presente invenção, o meio de cultura contem uma concentração combinada de glutamina e asparagina de entre cerca de 16 e 36 mM. Como mostrado no Exemplo 14, Tabela 22, meios que contêm uma concentração total combinada de glutamina e asparagina dentro desta faixa exibem maiores títulos de polipeptídeo expresso que meios que contêm concentração total combinada de asparagina e glutamina fora desta faixa. Aqueles versados na técnica serão capazes de escolher a exata concentração de glutamina e asparagina combinadas dentro desta faixa de modo a otimizar crescimento e/ou viabilidade de célula e para maximizar a produção do polipeptídeo expresso.

Além disso, aqueles versados na técnica reconhecerão que qualquer uma das condições listadas acima pode ser usada tanto sozinha como em várias combinações umas com as outras. Através de utilização de formulação de meios que exibe uma, algumas ou todas as características acima, aqueles versados na técnica serão capazes de otimizar crescimento e/ou viabilidade de célula e maximizar a produção do polipeptídeo expresso.

Qualquer uma destas formulações de meios mostradas na presente invenção opcionalmente pode ser suplementada quando necessário com hormônios e/ou outros fatores de crescimento, particulares íons (como sódio, cloreto, cálcio, magnésio e fosfato), tampões, vitaminas, nucleosídeos ou nucleotídeos, elementos em traços (compostos inorgânicos usualmente presentes em concentrações muito baixas), aminoácidos, lipídeos, hidrolisatos de proteína, ou glicose ou outra fonte de energia. Em certs realizações da presente invenção, pode ser benéfico suplementar os meios com indutores químicos como hexametileno bis(acetamida) (“HMBA”) e butirato de sódio (“NaB”). Estes suplementos opcionais podem ser adicionados no início da cultura ou podem ser adicionados em um ponto posterior de modo a reabastecer nutrientes esgotados ou por uma outra razão. Aqueles versados na técnica estarão cientes de quaisquer suplementos desejáveis ou necessários que podem ser incluídos nas formulações de meios mostradas.

Provimento de uma cultura de células mamíferas

Vários processos de preparação de células de mamíferos para produção de proteínas ou polipeptídeos através de cultura de batelada ou batelada alimentada são bem conhecidos na técnica. Como descrito acima, um ácido nucléico suficiente para obter expressão (tipicamente um vetor contendo o gene codificando o polipeptídeo ou proteína de interesse e quaisquer elementos de controle genético operavelmente ligados) pode ser introduzido na linha de célula hospedeira através de qualquer uma de um número de técnicas bem conhecidas. Tipicamente, células são selecionadas para determinar quais das células hospedeiras realmente tomaram o vetor e expressam o polipeptídeo ou proteína de interesse. Processos tradicionais de deteção de um particular polipeptídeo ou proteína de interesse expresso por células mamíferas incluem, mas não são limitados a, técnicas de imuno histoquímica, imuno precipitação, citometria de fluxo, microscopia de imuno fluorescência, SDS-PAGE, Western blots, ensaio emuno sorvente ligado -

enzima (ELISA), cromatografia líquida de alta performance (HPLC), ensaios de atividade biológica e cromatografia de afinidade. Aqueles versados na técnica estarão cientes de outras técnicas apropriadas para deteção de polipeptídeos ou proteínas expressos. Se múltiplas células hospedeiras expressam o polipeptídeo ou proteína de interesse, algumas ou todas das técnicas listadas podem ser usadas para determinar quais das células expressam aquele polipeptídeo ou proteína nos níveis mais altos.

Uma vez uma célula que expresse o polipeptídeo ou proteína de interesse tenha sido identificada, a célula é propagada em cultura através de qualquer um da variedade de processos bem conhecidos por aqueles versados na técnica. A célula expressando o polipeptídeo ou proteína de interesse é tipicamente propagada crescendo a mesma em uma temperatura e em um meio que conduz à sobrevivência, crescimento e viabilidade da célula. O volume de cultura inicial pode ser de qualquer tamanho, mas é freqüentemente menor que o volume de cultura do bio-reator de produção usado na produção final do polipeptídeo ou proteína de interesse, e freqüentemente células são passadas várias vezes em bio-reatores de volume crescente antes de semeadura de bio-reator de produção. A cultura de células pode ser agitada para aumentar oxigenação do meio e dispersão dos nutrientes para as células. Alternativamente ou adicionalmente, especiais dispositivos de espargimento que são bem conhecidos na técnica podem ser usados para aumentar e controlar oxigenação da cultura. De acordo com a presente invenção, aqueles versados na técnica entenderão que pode ser benéfico controlar ou regular certas condições internas do bio-reator, incluindo mas não limitado a pH, temperatura, oxigenação, etc.

A densidade de células de partida no bio-reator de produção pode ser escolhida por aqueles versados na técnica. De acordo com a presente invenção, a densidade de célula de partida no bio-reator de produção pode ser tão baixa como uma célula simples por volume de cultura. Em realizações preferidas da presente invenção, densidades de células de partida no bio-reator de produção podem variar de cerca de 2x10² células viáveis por mL a cerca de 2x10³, 2x10⁴, 2x10⁵, 2x10⁶, 5x10⁶ ou 10x10® células viá-

veis por mL e maior.

Culturas de células inicial e intermediária podem ser crescidas para qualquer desejada densidade antes de semeadura de seguinte bioreator de produção intermediário ou final. É preferido que a maioria das‘células permaneçam vivas antes de semeadura, embora viabilidade total ou próxima de total não seja requerida. Em uma realização da presente invenção, as células podem ser removidas do sobrenadante, por exemplo, através de centrifugação de baixa velocidade. Também pode ser desejável lavar as células removidas com um meio antes de semeadura do bio-reator seguinte para remover quaisquer produtos de despejo metabólicos indesejados ou componentes de meio. O meio pode ser o meio no qual as células foram previamente crescidas ou pode ser um meio diferente ou uma solução de lavagem selecionada pelo praticante da presente invenção.

As células então podem ser diluídas para uma densidade apropriada para semeadura de bio-reator de produção. Em uma realização preferida da presente invenção, as células são diluídas no mesmo meio que será usado no bio-reator de produção. Alternativamente, as células podem ser diluídas em um outro meio ou solução, dependendo das necessidades e desejos do praticante da presente invenção ou para acomodar particulares requisitos das próprias células, por exemplo, se elas serão estocadas por um curto período de tempo antes de semeadura de bio-reator de produção.

Fase de Crescimento Inicial

Uma vez o bio-reator de produção tenha sido semeado como descrito acima, a cultura de células é mantida na fase de crescimento inicial sob condições que conduzem à sobrevivência, crescimento e viabilidade da cultura de células. As precisas condições irão variar dependendo do tipo de célula, o organismo do qual a célula foi derivada, e a natureza e caráter do polipeptídeo ou proteína expresso.

De acordo com a presente invenção, o bio-reator de produção pode ser de qualquer volume que seja apropriado para produção em grande escala de polipeptídeos ou proteínas. Em uma realização preferida, o volume do bio-reator de produção é de pelo menos 500 litros. Em uma outra rea38 üzação preferida, o volume do bio-reator de produção é de 1000, 2500, 5000, 8000, 10 000, 12 000 ou mais, ou qualquer valor entre os mesmos. Aqueles versados na técnica estarão cientes e serão capazes de escolherem um apropriado bio-reator para uso na prática da presente invenção. O bio-reator de produção pode ser construído de qualquer material que conduza ao crescimento e viabilidade de células e que não interfira com expressão ou estabilidade do polipeptídeo ou proteína produzida.

A temperatura da cultura de células na fase de crescimento inicial será selecionada baseado primariamente na faixa de temperaturas na qual a cultura de células permanece viável. Por exemplo, durante a fase de crescimento inicial, células CHO crescem bem a 37°C. Em geral, maioria de células mamíferas crescem bem dentro de uma faixa de cerca de 25°C a 42°C. Preferivelmente, células mamíferas crescem bem dentro da faixa de cerca de 35°C a 40°C. Aqueles versados na técnica serão capazes de selecionar apropriada temperatura ou temperaturas nas quais desenvolver as células, dependendo das necessidades das células e os requisitos de produção do praticante.

Em uma realização da presente invenção, a temperatura da fase de crescimento inicial é mantida em uma temperatura constante, simples. Em uma outra realização, a temperatura da fase de crescimento inicial é mantida dentro de uma faixa de temperaturas. Por exemplo, a temperatura pode ser estavelmente aumentada ou diminuída durante a fase de crescimento inicial. Altemativamente, a temperatura pode ser aumentada ou diminuída por quantidades discretas em vários momentos durante a fase de crescimento inicial. Aqueles versados na técnica serão capazes de determinar se uma temperatura simples ou múltipla deve ser usada, e se a temperatura deve ser ajustada estavelmente ou através de quantidades discretas.

As células podem ser crescidas durante a fase de crescimento inicial por uma maior ou menor quantidade de tempo, dependendo das necessidades do praticante e os requisitos das próprias células. Em uma realização, as células são crescidas por um período de tempo suficiente para obter uma densidade de célula viável que é uma dada porcentagem da den-

sidade máxima de célula viável que as células podem eventualmente atingir se deixadas crescerem sem distúrbio. Por exemplo, as células podem ser crescidas por um período de tempo suficiente para obter uma desejada densidade de célula viável de 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 75, 80, 85, 90, 95 ou 99 porcento de densidade máxima de célula viável.

Em uma outra realização as células são deixadas crescerem por um definido período de tempo. Por exemplo, dependendo da concentração de partida da cultura de células, a temperatura na qual as células são crescidas, e a taxa de crescimento intrínseca das células, as células podem ser crescidas por 0, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ou mais dias. Em alguns casos, as células podem ser deixadas crescerem por um mês ou mais. As células podem ser crescidas por 0 dia no bioreator de produção se seu crescimento em um bio-reator semente, na temperatura de fase de crescimento inicial, foi suficiente de modo que a densidade de célula viável no bio-reator de produção no momento de sua inoculação está já na desejada porcentagem da densidade máxima de célula viável. O praticante da presente invenção será capaz de escolher a duração da fase de crescimento inicial dependendo de requisitos de produção de polipeptídeo ou proteína e as necessidades das próprias células.

A cultura de células pode ser agitada ou sacudida durante a fase de cultura inicial de modo a aumentar oxigenação e dispersão de nutrientes para as células. De acordo com a presente invenção, aqueles versados na técnica entenderão que pode ser benéfico controlar ou regular certas condições internas do bio-reator durante a fase de crescimento inicial, incluindo mas não limitado a pH, temperatura, oxigenação, etc. Por exemplo, pH pode ser controlado através de suprimento de uma apropriada quantidade de ácido ou base e oxigenação pode ser controlada com dispositivos de espargimento que são bem conhecidos na técnica.

Condições Móveis de Cultura

De acordo com os ensinamentos da presente invenção, no fim da fase de crescimento inicial, pelo menos uma das condições de cultura pode ser deslocada de modo que um segundo conjunto de condições de

cultura é aplicado e um desvio metabólico ocorre na cultura. A acumulação de metabólitos inibidores, mais notadamente lactato e amônia, inibe crescimento. Um desvio metabólico, realizado através de, por exemplo, uma mudança na temperatura, pH, osmolalidade ou nível de indutor químico da cultura de células, pode ser caracterizado por uma redução na razão de uma específica taxa de produção de lactato para uma específica taxa de consumo de glucose. Em uma realização não-limitante, as condições de cultura são desviadas através de deslocamento de temperatura da cultura. Entretanto, como é conhecido na técnica, mudança de temperatura não é o único mecanismo através do qual uma apropriada mudança metabólica pode ser obtida. Por exemplo, uma tal mudança metabólica também pode ser obtida através de mudança de outras condições de cultura incluindo, mas não limitado a, pH, osmolalidade e níveis de butirato de sódio. Como discutido acima, a cronometragem de mudança de cultura será determinada pelo praticante da presente invenção, baseado nos requisitos de produção de polipeptídeo ou proteína ou as necessidades das próprias células.

Quando mudando a temperatura da cultura, a mudança de temperatura pode ser relativamente gradual. Por exemplo, pode levar várias horas ou dias para completar a mudança de temperatura. Alternativamente, a mudança de temperatura pode ser relativamente abrupta. Por exemplo, a mudança de temperatura pode ser completada em menos que várias horas. Dado o apropriado equipamento de produção e controle, como é padrão na produção em larga escala comercial de polipeptídeos ou proteínas, a mudança de temperatura pode ser mesmo completa dentro de menos que uma hora.

A temperatura da cultura de células na subseqüente fase de crescimento será selecionada baseado primariamente na faixa de temperaturas na qual a cultura de células permanece viável e expressa polipeptídeos ou proteínas recombinantes em níveis comercialmente adequados. Em geral, maioria de células mamíferas permanecem viáveis e expressam polipeptídeos ou proteínas recombinantes em níveis comercialmente adequados dentro de uma faixa de cerca de 25°C a 42°C. Preferivelmente, células ma41 míferas permanecem viáveis e expressam polipeptídeos ou proteínas recombinantes em níveis comercialmente adequados dentro de uma faixa de cerca de 25°C a 35°C. Aqueles versados na técnica serão capazes de selecionar apropriada temperatura ou temperaturas na qual crescer células, dependendo das necessidades das células e os requisitos de produção do praticante.

Em uma realização da presente invenção, a temperatura da subseqüente fase de crescimento é mantida em uma temperatura constante, única. Em uma outra realização, a temperatura da subseqüente fase de crescimento é mantida dentro de uma faixa de temperaturas. Por exemplo, a temperatura pode ser estavelmente aumentada ou diminuída durante a subseqüente fase de crescimento. Alternativamente, a temperatura pode ser aumentada ou diminuída por quantidades discretas em vários tempos durante a subseqüente fase de crescimento. Aqueles versados na técnica entenderão que múltiplas mudanças de temperatura discretas são abrangidas nesta realização. Por exemplo, a temperatura pode ser alterada uma vez, as células mantidas nesta temperatura ou faixa de temperatura por um certo período de tempo, após o que a temperatura pode ser novamente alterada tanto para uma temperatura maior como menor. A temperatura da cultura após cada mudança discreta pode ser constante ou pode ser mantida dentro de uma certa faixa de temperaturas.

No exemplo 16, são mostrados dados que demonstram a eficácia de emprego de duas mudanças sucessivas de temperatura, embora seja entendido por aqueles versados na técnica que de acordo com a presente invenção, três ou mais mudanças sucessivas de temperatura podem ser usadas para aumentar viabilidade e/ou densidade de célula e/ou aumentar expressão de polipeptídeos ou proteínas recombinantes. A temperatura ou faixas de temperaturas da cultura de células após cada mudança sucessiva de temperatura pode ser maior ou menor que a temperatura(s) ou faixa(s) de temperatura precedendo a mudança. Em uma realização preferida da presente invenção, cada temperatura ou faixa de temperaturas sucessiva é menor que a temperatura ou faixa de temperaturas precedente.

Fase de Produção Subseqüente

De acordo com a presente invenção, uma vez as condições da cultura de células tenham sido mudadas como discutido acima, a cultura de células é mantida por uma subseqüente fase de produção sob um segundo conjunto de condições de cultura conduzindo à sobrevivência e viabilidade da cultura de células e apropriadas para expressão do desejado polipeptídeo ou proteína em níveis comercialmente adequados.

Como discutido acima, a cultura pode ser desviada através de mudança de uma ou mais de um número de condições de cultura incluindo, mas não limitado a, temperatura, pH, osmolalidade, e níveis de butirato de sódio. Em uma realização, a temperatura da cultura é alterada. De acordo com esta reivindicação, durante a subseqüente fase de produção, a cultura é mantida em uma temperatura ou faixa de temperaturas que é menor que a temperatura ou faixa de temperaturas da fase de crescimento inicial. Por exemplo, durante a subseqüente fase de produção, células CHO expressam bem polipeptídeos e proteínas recombinantes dentro de uma faixa de 25°C a 35°C. Como discutido acima, mudanças múltiplas de temperatura discretas podem ser empregadas para aumentar densidade ou viabilidade de célula ou para aumentar expressão do polipeptídeo ou proteína recombinante.

De acordo com a presente invenção, as células podem ser mantidas na fase de produção subseqüente até uma desejada densidade de célula ou título de produção ser atingido. Em uma realização, as células são mantidas na fase de produção subseqüente até o título do polipeptídeo ou proteína recombinante atingir um máximo. Em outras realizações, a cultura pode ser colhida antes deste ponto, dependendo do requisito de produção do praticante ou as necessidades das próprias células. Por exemplo, as células podem ser mantidas por um período de tempo suficiente para obter uma densidade de célula viável de 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75i 80, 85, 90, 95 ou 99 porcento de densidade máxima de célula viável. Em alguns casos, pode ser desejável permitir a densidade de célula viável atingir um máximo, e então permitir a densidade de célula viável declinar para algum nível antes de colheita de cultura. Em um exemplo extremo,

pode ser desejável permitir a densidade de viável abordar ou se aproximar de zero antes de colheita de cultura.

Em uma outra realização da presente invenção, as células são deixadas crescerem por um definido período de tempo durante a fase de produção subseqüente. Por exemplo, dependendo da concentração da cultura de células no início da fase de crescimento subseqüente, a temperatura na qual as células são crescidas, e a taxa de crescimento intrínseca das células, as células podem ser desenvolvidas por 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ou mais dias. Em alguns casos, as células podem ser deixadas crescendo por um mês ou mais. O praticante da presente invenção será capaz de escolher a duração da fase de produção subseqüente dependendo dos requisitos de produção de polipeptídeo ou proteína e as necessidades das próprias células.

Em certos casos, pode ser benéfico ou necessário suplementar a cultura de células durante a subseqüente fase de produção com nutrientes ou outros componentes de meios que foram esgotados ou metabolizados pelas células. Por exemplo, pode ser vantajoso suplementar a cultura de células com nutrientes ou outros componentes de meio observados terem sido esgotados durante monitoramento da cultura de células (vèr ‘Monitoração de Condições de Cultura’ seção abaixo). Alternativamente ou adicionalmente, pode ser benéfico ou necessário suplementar a cultura de células antes da subseqüente fase de produção. Como exemplos não-limitantes, pode ser benéfico ou necessário suplementar a cultura de células com hormônios e/ou outros fatores de crescimento, particulares íons (como sódio, cloreto, cálcio, magnésio e fosfato), tampões, vitaminas, nucleosídeos ou nucleotídeos, elementos em traços (compostos inorgânicos usualmente presentes em concentrações finais muito baixas), aminoácidos, lipídeos, ou glicose ou outra fonte de energia.

Estes componentes suplementares podem ser todos adicionados à cultura de células de uma vez, ou eles podem ser providos para a cultura de células em uma série de adições. Em uma realização da presente invenção, os componentes suplementares são providos para a cultura de

células em momentos múltiplos em quantidades proporcionais. Em uma outra realização, pode ser desejável prover somente certos dos componentes suplementares inicialmente, e prover os componentes restantes em um momento posterior. Ainda em uma outra realização da presente invenção, a cultura de células é alimentada continuamente com estes componentes suplementares.

De acordo com a presente invenção, o volume total adicionado à cultura de células deve ser otimamente mantido em uma quantidade mínima. Por exemplo, o volume total do meio ou solução contendo os componentes suplementares adicionados à cultura de células pode ser 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 ou 50% do volume da cultura de células antes de provimento de componentes suplementares.

A cultura de células pode ser agitada ou sacudida durante a fase de produção subseqüente de modo a aumentar oxigenação e dispersão de nutrientes para as células. De acordo com a presente invenção, aqueles versados na técnica entenderão que pode ser benéfico controlar ou regular certas condições internas do bio-reator durante a subseqüente fase de crescimento, incluindo mas não limitado a pH, temperatura, oxigenação, etc. Por exemplo, pH pode ser controlado através de fornecimento de uma apropriada quantidade de ácido ou base e oxigenação pode ser controlada com dispositivos de espargimento que são bem conhecidos na técnica.

Monitoração de Condições de Cultura

Em certas realizações da presente invenção, o praticante pode verificar ser benéfico ou necessário monitorar periodicamente particulares condições da cultura de células crescendo. Monitoração de condições de cultura de células permite que o praticante determine se a cultura de células está produzindo polipeptídeo ou proteína recombinante em níveis sub-ótimos ou se a cultura está perto de entrar em uma fase de produção sub-ótima. De modo a monitorar certas condições de cultura de células, será necessário remover-se pequenas alíquotas da cultura para análises. Aqueles versados na técnica entenderão que tal remoção pode potencíalmente introduzir contaminação na cultura de células, e terão apropriados cuidados para minimi-

zar o risco de tal contaminação.

Como exemplo não-limitante, pode ser benéfico ou necessário monitorar temperatura, pH, densidade de células, viabilidade de células, densidade de célula, viabilidade de célula, densidade de célula viável integrada, níveis de lactato, níveis de amônio, osmolaridade, ou título do polipeptídeo ou proteína expresso. Numerosas técnicas são bem conhecidas as quais permitirão aqueles versados na técnica medir estas condições. Por exemplo, densidade de célula pode ser medida usando um hematocitômetro, um contador Coulter, ou exame de densidade de célula (CEDEX). Densidade de célula viável pode ser determinada manchando uma amostra de cultura com azul Trypan. Uma vez que somente células mortas tomam o azul Trypan, densidade de célula viável pode ser determinada através de contagem de número total de células, dividindo o número de células que tomam o corante pelo número total de células, e tomando a recíproca. HPLC pode ser usada para determinar os níveis de lactato, amônio ou o polipeptídeo ou proteína expresso. Alternativamente, o nível do polipeptídeo ou proteína expresso pode ser determinado através de técnicas padrões de biologia molecular como manchamento Coomassie de géis SDS-PAGE, Western blotting, ensaios Bradford, ensaios Lowry, ensaios Biuret, e absorbância de UV. Também pode ser benéfico ou necessário monitorar as modificações póstraducionais do polipeptídeo ou proteína expresso, incluindo fosforilação e glicosilação.

Isolamento de Polipeptídeo Expresso

Em geral, será tipicamente desejável isolar e/ou purificar proteínas ou polipeptídeos expressos de acordo com presente invenção. Em uma realização preferida, o polipeptídeo ou proteína expresso é secretado no meio e assim células e outros sólidos podem ser removidos, como através de centrifugação ou filtração por exemplo, como uma primeira etapa no processo de purificação. Esta realização é particularmente útil quando usada de acordo com a presente invenção, uma vez que os processos e composições aqui descritos resultam em aumentada viabilidade de célula. Como um resultado, menos células morrem durante o processo de cultura, e menos enzi-

mas proteolíticas são liberadas no meio o que pode potencialmente diminuir o rendimento do polipeptídeo ou proteína expresso.

Alternativamente, o polipeptídeo ou proteína expresso é ligado à superfície da célula hospedeira. Nesta realização, os meios são removidos e as células hospedeiras expressando o polipeptídeo ou proteína são lisadas como uma primeira etapa no processo de purificação. Lise de células hospedeiras mamíferas pode ser obtida através de qualquer número de meios bem conhecidos por aqueles versados na técnica, incluindo interrupção física por pérolas de vidro e exposição a condições de alto pH.

O polipeptídeo ou proteína pode ser isolado e purificado através de processos padrões incluindo, mas não limitados a, cromatografia (por exemplo, cromatografia de troca de íons, afinidade, exclusão de tamanho, e de hidróxi apatita), filtração com gel, centrifugação, ou solubilidade diferencial, precipitação com etanol ou através de qualquer outra técnica disponível para a purificação de proteínas (ver, por exemplo, Scopes, Protein Purification Principies and Practice 2nd Edition, Springer-Verlag, New York, 1987; Higgins, S.J. and Hames, B.D. (eds.), Protein Expression: A Practical Approach, Oxford Univ Press, 1999; e Deutscher, M.P., Simon, M.I., Abelson, J.N. (eds.), Guide to Protein Purification: Methods in Enzymology (Methods in Enzymology Series, Vol 182), Academic Press, 1997, todos aqui incorporados por referência). Para cromatografia de imunoafinidade em particular, a proteína pode ser isolada através de sua ligação a uma coluna de afinidade compreendendo anticorpos que foram elevados contra aquela proteína e foram afixados a um suporte estacionário. Alternativamente, etiquetas de afinidade como seqüência de revestimento influenza, poli histidina, ou glutationa-S-transferase pode ser ligada à proteína através de técnicas recombinantes padrões para permitir fácil purificação através de passagem sobre a apropriada coluna de afinidade. Inibidores de protease como fluoreto de fenil metil sulfonila (PMSF), leupeptina, pepstatina ou aprotinina podem ser adicionados em qualquer um ou todos os estágios de modo a reduzir ou eliminar degradação do polipeptídeo ou proteína durante o processo de purificação. Inibidores de protease são particularmente desejados quando células

Ό'-ά têm de ser lisadas de modo a isolar e purificar o polipeptídeo ou proteína expresso. Aqueles versados na técnica apreciarão que a exata técnica de purificação irá variar dependendo do caráter do polipeptídeo ou proteína a ser purificado, o caráter das células das quais o polipeptídeo ou proteína é expresso, e a composição do meio no qual as células são crescidas. Formulações Farmacêuticas

Em certas realizações preferidas da invenção, polipeptídeos ou proteínas produzidos terão atividade farmacológica e serão úteis na preparação de compostos farmacêuticos. Composições inventivas como descritas acima podem ser administradas a um sujeito ou podem primeiro ser formuladas para liberação através de qualquer rota disponível incluindo, mas não limitado a rota parenteral (por exemplo, intravenosa), intradérmica, subcutânea, oral, nasal, bronquial, oftálmica, transdérmica (tópica), transmucosa, retal e vaginal. Composições farmacêuticas inventivas tipicamente incluem um polipeptídeo ou proteína purificado expresso a partir de uma linha de células mamíferas, um agente de liberação (isto é, um polímero catiônico, transportador molecular de peptídeo, tensoativo, etc., como descrito acima) em combinação com um carreador farmaceuticamente aceitável. Como aqui usada, a frase “carreador farmaceuticamente aceitável” inclui solventes, meios de dispersão, revestimentos, agentes antibacteriais e antifungos, agentes isotônicos e de retardo de absorção, e semelhantes, compatíveis com administração farmacêutica. Compostos ativos suplementares também podem ser incorporados nas composições.

Uma composição farmacêutica é formulada para ser compatível com sua rota pretendida de administração. Soluções ou suspensões usadas para aplicação parenteral, intradérmica ou subcutânea podem incluir os seguintes componentes: um diluente estéril como água para injeção, solução salina, óleos fixos, polietileno glicóis, glicerina, propileno glicol, ou outros solventes sintéticos; agentes antibacteriais como álcool benzílico ou metil parabenos; antioxidantes como ácido ascórbico ou bissulfito de sódio; agentes quelantes tais como ácido etileno diamino tetra acético; tampões como acetatos, citratos ou fosfatos e agentes para o ajuste de tonicidade como cloreto de sódio ou dextrose. O pH pode ser ajustado com ácidos ou bases, como ácido clorídrico ou hidróxido de sódio. A preparação parenteral pode ser encerrada em ampolas, seringas descartáveis ou frascos de doses múltiplas fabricados de vidro ou plástico.

Composições farmacêuticas apropriadas para uso injetável tipicamente incluem soluções aquosas estéreis (onde solúvel em água) ou dispersões e pós estéreis para a preparação extemporânea de soluções ou dispersões injetáveis estéreis. Para administração intravenosa, apropriados carreadores incluem solução salina fisiológica, água bacteriostática, Cremophor EL (BASF, Parsippany, NJ) ou solução salina tamponada com fosfato (PBS). Em todos os casos, a composição deve ser estéril e deve ser fluida na extensão de existência de fácil disposição em seringa. Formulações farmacêuticas preferidas são estáveis sob as condições de fabricação e estocagem e têm de ser preservadas contra a ação contaminante de microorganismos como bactérias e fungos. Em geral, o relevante carreador pode ser um meio solvente ou de dispersão contendo, por exemplo, água, etanol, poliol (por exemplo, glicerol, propileno glicol, e polietileno glicol líquido, e semelhantes), e suas misturas apropriadas. A própria fluidez pode ser mantida, por exemplo, através do uso de um revestimento tal como lecitina, através de manutenção do requerido tamanho de partícula no caso de dispersão e através do uso de tensoativos. Prevenção da ação de microorganismos pode ser obtida através de vários agentes antibacteriais e anti-fungo, por exemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido ascórbico, timerosal e semelhantes. Em muitos casos, será preferível incluir agentes isotônicos, por exemplo, açúcares, poli álcoois como manitol, sorbitol, ou cloreto de sódio na composição. Absorção prolongada das composições injetáveis pode ser efetuada através de inclusão na composição de um agente que retarda absorção, por exemplo, mono estearato de alumínio e gelatina.

Soluções injetáveis estéreis podem ser preparadas através de incorporação de polipeptídeo ou proteína purificado na requerida quantidade em um apropriado solvente com um ou uma combinação de ingredientes enumerados acima, seguido por esterilização filtrada. Genericamente, dis-

persões são preparadas através de incorporação de polipeptídeo ou proteína purificada expresso de uma linha de células mamíferas em um veículo estéril que contem um meio de dispersão básico e os outros ingredientes requeridos a partir daqueles enumerados acima. No caso de pós estéreis para a preparação de soluções injetáveis estéreis, os processos preferidos de preparação são secagem à vácuo e secagem - congelamento que rendem um pó do ingrediente ativo plus qualquer adicional ingrediente desejado a partir de uma sua solução previamente filtrada - estéril.

Composições orais genericamente incluem um diluente inerte ou um carreador comestível. Para o propósito de administração terapêutica oral, o polipeptídeo ou proteína purificada pode ser incorporada com excipientes e usado na forma de tabletes, trociscos, ou cápsulas, por exemplo, cápsulas de gelatina. Composições orais também podem ser preparadas usando um carreador fluido para uso como uma lavagem bucal. Agentes ligantes farmaceuticamente compatíveis, e/ou materiais adjuvantes podem ser incluídos como parte da composição. Os tabletes, pílulas, cápsulas, trociscos e semelhantes podem conter qualquer um dos seguintes ingredientes, ou compostos de uma natureza similar: um ligante tal como celulose microcristalina, goma tragacanto, ou gelatina; um excipiente tal como amido ou lactose, um agente desintegrante como ácido algínico, Primogel, ou amido de milho; um lubrificante como estearato de magnésio ou Sterotes; um glidante como dióxido de silício coloidal; um agente adoçante como sucrose ou sacarina; ou um agente aromatizante como hortelã pimenta, salicilato de metila, ou aroma de laranja. Formulações para liberação oral podem vantajosamente incorporar agentes para aperfeiçoamento de estabilidade dentro de trato gastrointestinal e/ou para aperfeiçoar absorção.

Para administração através de inalação, as composições inventivas compreendendo um polipeptídeo ou proteína purificada expressa a partir de uma linha de células mamíferas e um agente de liberação são preferivelmente liberados na forma de um espargimento de aerossol a partir de um recipiente ou dispensador pressurizado que contem um propelente apropriado, por exemplo, um gás tal como dióxido de carbono, ou um nebulizador. A presente invenção particularmente contempla liberação das composições usando um espargimento nasal, inalador, ou outra liberação direta para as vias aéreas superiores e/ou inferiores. Administração intranasal de vacinas de ADN direcionadas contra vírus infíuenza foi mostrada induzir respostas de célula T CD8, indicando que pelo menos algumas células no trato respiratório podem tomar ADN quando liberado através desta rota, e os agentes de liberação da invenção aperfeiçoarão tomada celular. De acordo com certas realizações da invenção as composições compreendendo um polipeptídeo purificado expresso a partir de uma linha de células mamíferas e um agente de liberação são formulados como partículas porosas grandes para administração com aerossol.

Administração sistêmica também pode ser através de meios trans-mucosa ou trans-dérmicos. Para administração trans-mucosa ou transdérmica, penetrantes apropriados para a barreira a ser penetrada são usados na formulação. Tais penetrantes são genericamente conhecidos na técnica, e incluem, por exemplo, para administração trans-mucosa, detergentes, sais de bile, e derivados de ácido fusídico. Administração trans-mucosa pode ser realizada através do uso de sprays nasais ou supositórios. Para administração transdérmica, o polipeptídeo ou proteína purificado e agentes de liberação são formulados em ungüentos, salvas, géis, ou cremes como genericamente conhecido na técnica.

As composições também podem ser preparadas na forma de supositórios (por exemplo, com convencionais bases de supositório como manteiga de cacau e outros glicerídeos) ou enemas de retenção para liberação retal.

Em uma realização, as composições são preparadas com carreadores que protegerão o polipeptídeo ou proteína contra rápida eliminação do corpo, tal como uma formulação de liberação controlada, incluindo implantes e sistemas de liberação microencapsulados. Polímeros biocompatíveis, biodegradáveis, podem ser usados, tais como etileno - acetato de vinila, poli anidridos, ácido poliglicólico, colágeno, poli orto ésteres, e ácido poli lático. Processos para preparação de tais formulações serão visíveis para

aqueles versados na técnica. Os materiais também podem ser obtidos comercialmente de Alza Corporation e Nova Pharmaceuticals, Inc. Suspensões de lipossomas (incluindo lipossomas direcionadas para células infectadas com anticorpos monoclonais para antígenos virais) também podem ser usa5 das como carreadores farmaceuticamente aceitáveis. Estes podem ser preparados de acordo com processos conhecidos por aqueles versados na técnica, por exemplo, como descrito na patente US 4 522 811.

É vantajoso formular-se composições orais e parenterais em forma de dosagem unitária para facilidade de administração e uniformidade de dosagem. Forma de dosagem unitária como aqui usado refere-se a unidades fisicamente discretas apropriadas como dosagens unitárias para o sujeito a ser tratado; cada unidade contendo uma quantidade predeterminada de polipeptídeo ou proteína ativa calculada para produzir o desejado efeito terapêutico em associação com o requerido carreador farma15 cêutico.

O polipeptídeo ou proteína expresso de acordo com a presente invenção pode ser administrado em vários intervalos e sobre diferentes períodos de tempo como requerido, por exemplo, uma vez por semana por entre cerca de 1 a 10 semanas, entre 2 a 8 semanas, entre cerca de 3 a 7 sema20 nas, cerca de 4, 5, ou 6 semanas, etc. Aqueles versados na técnica apreciarão que certos fatores podem influenciar a dosagem e cronometragem requeridas para tratar efetivamente um sujeito, incluindo mas não limitado à seriedade da doença ou desordem, prévios tratamentos, a saúde geral e/ou idade do sujeito, e outras doenças presentes. Genericamente, tratamento de um sujeito com um polipeptídeo ou proteína como aqui descrito pode incluir um tratamento simples ou, em muitos casos, pode incluir uma série de tratamentos. Além disso é entendido que apropriadas doses podem depender de potência do polipeptídeo ou proteína e opcionalmente podem ser talhadas para o particular receptor, por exemplo, através de administração de doses crescentes até uma resposta desejada pré-selecionada ser obtida. É entendido que o específico nível de dose para qualquer particular sujeito animal pode depender de uma variedade de fatores incluindo a atividade do

Orc.

específico polipeptídeo ou proteína empregado, a idade, peso de corpo, saúde geral, gênero, e dieta do sujeito, o tempo de administração, a rota de administração, a taxa de excreção, qualquer combinação de droga, e o grau de expressão ou atividade a ser modulada.

A presente invenção inclui o uso de composições inventivavs para tratamento de animais não-humanos. Da mesma maneira, doses e processos de administração podem ser selecionados de acordo com princípios conhecidos de farmacologia e medicina veterinária. Orientação pode ser encontrada, por exemplo, em Adams, R. (ed.), Veterinary Pharmacology and Therapeutics, 8^th edition, lowa State University Press; ISBN: 0813817439; 2001.

Composições farmacêuticas inventivas podem ser incluídas em um recipiente, embalagem, ou dispensador junto com instruções para administração.

A descrição anterior é para ser entendida como sendo representativa somente e não é pretendida ser limitante. Processos alternativos e materiais para implementação da invenção e também adicionais aplicações serão aparentes para aqueles versados na técnica, e são pretendidos serem incluídos nas reivindicações acompanhantes.

Exemplos

Exemplo 1: Meio 1 aperfeiçoado para processo de batelada - alimentada de anti-GDF-8

Processos de batelada - alimentada tradicionais para cultivo de linhas de células têm várias desvantagens incluindo o tempo e esforço requeridos para administrar as alimentações e a necessidade de equipamento especial em bio-reatores de larga escala. O objetivo foi desenvolver meios de bateladas para a produção de proteínas de interesse em bio-reatores de larga escala que requerem alimentações mínimas.

Materiais e Processos

Linhagens e Meios: Células de ovário de hamster Chinês (“CHO”) foram engenheiradas para expressarem um anticorpo monoclonal contra fator 8 de crescimento e diferenciação (“células anti-GDF-8”) (ver

Veldman et al., Neutralizing Antibodies Against GDF-8 e Uses Therefor, US20040142382 A1). Células anti-GDF-8 foram usadas para testar novos meios de batelada. Meio 1 e Meio 2 foram comparados para suas habilidades para suportar altas densidade e viabilidade der células. As composições deste meios, assim como Meio 3 são listadas na Tabela 1. Meios são fabricados através de adição de todos os componentes seguros para FeSO₄.7H₂O. Os meios são então ajustados para pH 7,25, a osmolaridade é anotada e FeSO₄.7FÍ2O é então adicionado.

Condições de Cultura: Para experimentos em frasco, células an10 ti-GDF-8 foram crescidas em frascos de agitação e passadas três vezes. Para experimentos de bio-reator, células anti-GDF-8 foram crescidas em meios por 12 dias, suplementados diariamente com 2% em volume de 20X meio de alimentação Meio 4 (Tabela 3) ou 3% em volume de 16X Meio 4 (Tabela 4) após dia 5. Para os primeiros 4 dias, células foram crescidas a

37°C. No dia 5, células foram deslocadas para 31 °C.

Análises de Amostra: Amostras diárias foram tomadas das culturas e foram analisadas para níveis de aminoácidos, vitamina, ferro, fosfato, glucose e glutamina. '

Tabela 1. Composições de Meio 1, Meio 2 e Meio 3

	Meio 1	Meio 2	Meio 3
Aminoácidos	mg/L	mM	mg/L	mM	mg/L	mM
Alanina	96,03	1,08	17,80	0,20	24,87	0,28
Arginina	1186,99	6,82	347,97	2,00	423,43	2,43
Asparagina.H2O	713,59	4,76	75,00	0,50	173,90	1,16
Ácido aspártico	318,53	2,39	26,20	0,20	52,72	0,40
Cisteína.HCl.H2O	70,01	0,40	70,19	0,40	70,01	0,40
Cistina.2HCI	297,09	0,95	62,25	0,20	62,09	0,20
Ácido glutâmico	158,59	1,08	29,40	0,20	41,08	0,28
Glutamina	1892,40	12,96	1163,95	7,97	1162,40	7,96
Glicina	95,88	1,28	30,00	0,40	35,92	0,48
Histidina.HCI.H2O	369,10	1,76	46,00	0,22	75,27	0,36

	Meio 1	Meio 2	Meio 3
Isoleucina	623,63	4,76	104,99	0,80	151,90	1,16
Leucina	852,31	6,51	104,99	0,80	172,69	1,32
Lisina.HCl	945,96	5,20	145,99	0,80	218,38	1,20
Metionina	291,82	1,96	29,80	0,20	53,55	0,36
Fenilalanina	428,62	2,60	65,99	0,40	98,81	0,60
Prolina	372,25	3,24	68,99	0,60	96,40	0,84
Serina	904,71	8,62	126,00	1,20	273,07	2,60
Treonina	513,39	4,31	94,99	0,80	132,81	1,12
Triptofano	159,32	0,78	16,00	0,08	28,99	0,14
Tirosina.2Na.2H2O	560,81	2,15	103,79	0,40	145,10	0,56
Valina	505,36	4,32	93,99	0,80	131,17	1,12
Vitaminas	mg/L	mM	mg/L	mM	mg/L	mM
Biotina	2,00	8,21	0,20	0,82	0,36	1,49
Pantotenato de cálcio	22,02	46,27	2,24	4,71	4,03	8,47
Cloreto de colina	87,67	630,74	8,98	64,60	16,11	115,92
Ácido fólico	25,95	58,84	2,65	6,01	4,76	10,80
Inositol	123,39	685,47	12,60	69,99	22,64	125,79
Nicotinamida	19,60	160,70	2,02	16,56	3,61	29,62
Piridoxal.HCI	1,99	9,83	2,00	9,85	1,99	9,83
Piridoxina.HCI	18,06	87,67	0,03	0,15	1,67	8,10
Riboflavina	2,20	5,85	0,22	0,59	0,40	1,06
Tiamina.HCI	21,51	63,84	2,17	6,44	3,92	11,64
Vitamina B12	6,93	5,12	0,78	0,58	1,34	0,99
Sais inorgânicos	mg/L	mM	mg/L	mM	mg/L	mM
C3OI2	115,78	1,04	116,09	1,05	115,78	1,04
KCI	310,94	4,17	311,77	4,18	310,94	4,17
Na2HPO4	70,81	0,50	70,99	0,50	70,81	0,50
NaCl	1104,96	18,92	5539,00	94,85	3704,96	63,44

	Meio 1	Meio 2	Meio 3
NaH2PO4.H2O	636,33	4,61	62,49	0,45	114,33	0,83
MgSO4	48,70	0,41	48,83	0,41	48,70	0,41
MgSO4.7H2O	0,03	95,00			8,60	95,00
MgCI2	28,53	0,30	28,61	0,30	28,53	0,30
NaHCO3	2000,00	23,81	2440,00	29,04	2440,00	29,04
Elementos em traços	mg/L	mM	mg/L	mM	mg/L	mM
Selenito de sódio	28,00	161,94	5,00	28,92	7,00	40,49
Fe(NO3)3*9H2O	49,86	123,42	50,00	123,75	49,86	123,42
CuSO4	2,69	16,80	0,80	5,00	0,97	6,06
CuSO4*5H2O	11,24	45,00			7,49	30,00
FeSO4*7H2O	2503,85	9006,64	839,96	3021,45	1542,85	5549,81
ZnSO4’7H2O	2734,77	9528,82	429,96	1498,12	1383,80	4821,59
MnSO4’H2O	0,26	1,51			0,17	1,01
Na2SiO3’9H2O	210,00	739,27			140,00	492,84
(ΝΗ4)6Μο7Ο24·4Η2Ο	1,86	1,50			1,24	1,00
nh4vo3	0,98	8,33			0,65	5,56
NíSO4’6H2O	0,20	0,74			0,13	0,49
SnCI2*2H2O	0,18	0,80			0,12	0,53
Outros componentes	mg/L	mM	mg/L	mM	mg/L	mM
Hidrocortisona	0,23	0,64	0,04	0,10	0,09	0,24
Putrescina*2HCI	6,48	40,22	1,08	6,70	2,48	15,39
Ácido linoléico	0,22	0,80	0,04	0,14	0,06	0,20
Ácido tióctico	0,56	2,73	0,10	0,49	0,14	0,69
D-glucose (dextrose)	16039,43	89107,92	6150,72	34170,64	11042,24	61345,76
PVA	2560,00		2400,00		2520,00
Insulina	54,00		10,00		14,00
Piruvato de sódio	54,85	498,63	55,00	499,95	54,85	498,63

Resultados e Conclusões

A Figura 1 mostra que a taxa de crescimento de células antiGDF-8 foi similar em ambos, Meio 1 e Meio 2 nos experimentos em frasco.

A Figura 2 mostra que em bio-reatores, Meio 1 exibiu um significante aumento em densidade e viabilidade de célula final sobre Meio 3. O título final também aumentou significantemente, de 551 mg/L para o processo de plataforma para 976 mg/L com Meio 1 (dados não mostrados). A temperatura foi alterada de 37°C para 31 °C no dia 5. Devido ao inesperado alto crescimento de células, as culturas foram alimentadas diariamente após o dia 5 tanto com 2% em volume de 20X Meio 4 como 3% em volume de 16X Meio 4. Assim, este não é um verdadeiro experimento de batelada como originalmente pretendido. Asparagina e tiamina foram suplementadas nos meios de alimentação começando no dia 10.

No desenvolvimento de meios de batelada concentrada, vários conceitos possíveis precisam ser considerados. Primeiro, nutrientes concentrados podem provar toxidez para as células. Nos meios desenvolvidos neste exemplo, todos os nutrientes e componentes foram determinados estarem abaixo de limites de toxidez (dados não mostrados).

Segundo, os meios de bateladas concentrados necessariamente têm uma maior osmolaridade que meios não-concentrados, o que foi mostrado ter efeitos prejudiciais sobre crescimento e viabilidade de célula. Este problema pode ser driblado através de diminuição de quantidade de NaCI nos meios de partida. Além disso, os meios de batelada concentrados contêm insuficientes níveis de glucose para sustentar crescimento para o inteiro período de cultura. Assim, culturas foram suplementadas diariamente após dia 5 com uma alimentação de glucose.

Terceiro, insulina e glutamina são suscetíveis a degradação durante o período de cultura de 12 dias. Assim, a cultura foi suplementada com estes componentes em adição a glucose.

Finalmente, ferro precipitará de solução contendo altas concentrações de fosfato em alto pH. Este problema pode ser driblado através da adição de ferro no fim do processo de preparação de meios, após o pH ter sido ajustado para um nívei apropriado.

Exemplo 2: Desenvolvimento de meio de alimentação concentrado (Meio 5) para células anti-GDF-8 em processo de batelada - alimentada

No Exemplo 1, um processo de batelada para cultura de células anti-GDF-8 usando Meio 1 foi desenvolvido. Devido à alta densidade de células que resultou durante o processo, foi determinado que suplementação de nutrientes em adição a glucose e glutamina ainda foi vantajosa. Entretanto, suplementação de batelada com 8X meios de alimentação Meio 4 resulta em excessiva diluição da cultura. Meios de alimentação mais concentrados foram desenvolvidos de modo a driblar este problema.

Materiais e Processos e Resultados

A Tabela 2 lista as composições de Meio 4A-1, Meio 4B, Traço B e Traço D usadas nas formulações de Tabelas 3-7.

Tabela 2. Composições de Meio 4A-1, Meio 4B, Traço B e Traço D usadas 15 nas formulações de Tabelas 3-7,___

	Meio 4A-1	Meio 4B	Elementos em Traços B	Elementos em Traços D
Aminoácidos	mg/L	mM	mg/L	mM	mg/L	mM	mg/L	mM
Alanina	17,80	0,20
Arginina	191,00	1,10
Asparagina.H2O	135,00	0,90
Ácido aspártico			66,50	0,50
Ácido glutâmico			29,40	0,20
Glicina	15,00	0,20
Histidina.HCI.H2O	73,50	0,35
Isoleucina	118,00	0,90
Leucina	170,00	1,30
Lisina.HCI	182,00	1,00
Metionina	59,60	0,40
Fenilalanina	82,50	0,50
Prolina	69,00	0,60

	Meio 4A-1	Meio 4B	Elementos em Traços B	Elementos em Traços D
Serina	158,00	1,50
Treonina	95,20	0,80
Triptofano	32,60	0,16
Tirosina.2Na.2H2O			104,00	0,40
Valina	93,60	0,80
Vitaminas	mg/L	mM	mg/L	mM	mg/L	mM	mg/L	mM
Biotina	0,41	1,68
Pantotenato de cálcio	4,50	9,45
Cloreto de colina	17,90	128,78
Ácido fólico			5,30	12,02
Inositol	25,20	140,00
Nicotinamida	4,00	32,79
Piridoxina.HCI	4,10	19,90
Riboflavina	0,45	1,20
Tiamina.HCI	4,40	13,06
Vitamina B12	1,40	1,03
Elementos em traços	M9/L	mM	mg/L	μΜ	gg/L	mM	pg/L	mM
(NH4)6Mo7O24’4H2O					1,24	1,00
CuSO4	0,43	2,69
CuSO4’5H2O							7,49	30,00
FeSO4’7H2O							834	3000
MnSO4*H2O					0,17	1,01
Na2SiO3’9H2O					140,00	492,84
NH4VO3					0,65	5,56
NíSO4*6H2O					0,13	0,49

	Meio 4A-1	Meio 4B	Elementos em Traços B	Elementos em Traços D
SnCI2*2H2O					0,12	0,53
ZnSO4*7H2O	230,00	801,39					863	3007
Outros componentes	pg/L	nM	M9/L	nM	pg/L	nM	pg/L	nM
Ácido linoléico			42,00	0,15
Ácido tióctico			105,00	0,51
D-qlucose (dextrose)			1000000	5555,56

20Χ Meio 4

Os primeiros meios concentrados foram desenvolvidos como 20X Meio 4. As formulações de meios para 20X Meio 4 são providas na Tabela 3.

Tabela 3. Folha de trabalho de meios de alimentação 20X M	eio 4
Parte	Componente	Quantidade	Unidade
I	Meio 4A-1	31,120	g/L
	Nucellin	' 40,000	ml/L
	Estoque H/P	20,000	ml/L
	Estoque selenito	2,000	ml/L
	PVA	2,400	g/L
	NaH2PO4.H2O	2,610	g/L
	MgSO4.7H2O	0,430	g/L
	Ácido aspártico	1,330	g/L
	Ácido glutâmico	0,588	g/L
	Ácido linoléico	0,840	ml/L
	Ácido tióico	2,100	ml/L
	Tirosina.2Na (PM 225)	1,790	g/L
	1000X Traço B	6,000	ml/L
	Glucose	100,000	g/L
	Glutamina	14,600	g/L
	PH para 7,0

Parte	Componente	Quantidade	Unidade
	Osmolaridade anotada	1064,000	mOsm
II	Cisteína (400 mM)	Adicionar 108 mL Traço D, 0,25 g de FeSO4.7H2O a 280 mL de estoque de cisteína
III	Ácido fólico	720 mL de ácido fólico 6 mM

Nota: Nucellin é fabricado por Eli Lilly (Indianápolis, IN, USA); estoque

H/P = 0,036 mg/mL hidrocortiisona, 1,08 mg/mL Putrescina,2HCI.

A formulação de meios consiste em 3 partes: I, II, III. Parte I é a versão concentrada de 8X Meio 4 com os componentes individuais de Meio

4B exceto ácido fólico devido aos conceitos da solubilidade desta vitamina. Parte II é estoque de ferro, Traço D e cisteína ácida, para evitar possível precipitação de ferro se adicionado na parte I. Parte III é estoque de ácido fólico. Parte I é adicionada 2% em volume diariamente começando no dia 5 e partes II e III são adicionadas uma vez no dia 5 junto com Parte I.

O pH final dos meios de alimentação foi ajustado para 7,0 e osmolaridade foi cerca de 1064 mOsm. Uma alimentação de 2% resultará em 2 g/L glucose, 2 mM glutamina e um àumento de osmolaridade de 14 mOsm para a cultura.

Z_ 16XMeio4

Para reduzir o aumento em osmolaridade, os meios de alimentação foram trocados de 20X Meio 4 (2% em volume diário) para 16X Meio 4 (3% em volume diário). A formulação de meios para 16X Meio 4 é provida na Tabela 4.

Tabela 4. Folha de trabalho de meios de alimentação 16X Meio 4

Parte	Componente	Quantidade	Unidade
i	Meio 4A-1	24,896	g/L
	Nucellin®	32,000	m1/L
	Estoque H/P	16,000	ml/L
	Estoque selenito	1,600	ml/L
	PVA	2,400	g/L
	NaH2PO4.H2O	2,088	g/L

Parte	Componente	Quantidade	Unidade
	MgSO4.7H2O	0,344	g/L
	Ácido aspártico	1,064	g/L
	Ácido glutâmico	0,470	g/L
	Ácido linoléico	0,672	ml/L
	Ácido tióctico	1,680	ml/L
	Tirosina.2Na (PM 225)	1,432	g/L
	1000Χ Traço B	9,000	ml/L
	Glutamina	6,280	g/L
	pH para 7,0
	Anotar osmolaridade	295,000	mOsm
II	Cisteína (400 mM)	Adicionar 108 mL Traço D, 0,25 g de Fe- SO4.7H2O a 280 mL de estoque de cisteína
III	Ácido fólico	720 mL de ácido fólico 6 mM

Nota: Nucellin é fabricado por Eli Lilly (Indianápolis, IN, USA); estoque

H/P = 0,036 mg/mL de hidrocortisona, 1,08 mg/mL de Putrescina.2HCI

Neste 16X Meio 4 modificado, glucose também foi eliminada para ainda reduzir a osmolaridade e proporcionar alguma flexibilidade da ali5 mentação de glucose. Osmolaridade total dos meios de alimentação é agora 295 mOsm.

3,_16X Meio 4

Mudanças foram feitas para a formulação de 16X Meio 4. Solução estoque de ferro foi adicionada na alimentação resultando em uma adi10 ção 0,45 μΜ cada alimentação. Adicionalmente, glucose foi adicionada de novo para render uma adição de 1,5 g/L cada alimentação. A formulação de meios para este 16X Meio 4 modificado é provida na Tabela 5.

Tabela 5, Folha de trabalho de meios de alimentação 16X Meio 4

Parte	Componente	Quantidade	Unidade
I	Meio 4A-1	24,896	aZL
	Nucellin	32,000	ml/L
	Estoque H/P	16,000	ml/L
	Estoque selenito	1,600	ml/L
	PVA	2,400	g/L
	NaH2PO4.H2O	2,088	g/L
	MgSO4.7H2O	0,344	g/L
	Ácido aspártico	1,064	g/L
	Ácido glutâmico	0,470	g/L
	Ácido linoléico	0,672	ml/L
	Ácido tióctico	1,680	ml/L
	Tirosina.2Na (PM 225)	1,432	g/L
	1000X Traço B	9,000	ml/L
	Glucose	50,000	g/L
	Glutamina	7,300	g/L
	pH para 7,0
	FeSO4.7H2O	15,000	ml/L
	Anotar osmolaridade	. 607,000	mOsm
II	Ácido fólico	720 mL de ácido fólico 6 mM
III	Cisteína (400 mM)	Adicionar 108 mL Traço D, 0,25 g Fe- SO4.7H2O a 280 mL de estoque de cisteína

Nota: Nucellin é fabricado por Eli Lilly (Indianápolis, IN, USA); estoque

H/P = 0,036 mg/mL de hidrocortisona, 1,08 mg/mL de Putrescina.2HCI.

4_16X Meio 4

Aqui, os meios de alimentação (16X Meio 4) foram fabricados em meios combinados ao invés de 3 alimentações separadas como nas últimas várias bateladas. Testes foram realizados para assegurar que ácido fólico pode ser dissolvido na concentração requerida e que nem ferro nem ácido fólico precipitou de solução após estocagem a 4°C ou em temperatura ambiente por 6 dias. A formulação de meios para ο 16X Meio 4 combinado é provida na Tabela 6.

Tabela 6. Folha de trabal	ho de meios de alimentação 16X Meio 4
Componente	Quantidade	Unidade
Meio 4A-1	24,896	g/L
Nucellin	32,000	ml/L
Estoque H/P	16,000	m1/L
Estoque de selenito	1,600	ml/L
PVA	2,400	g/L
NaH2PO4.H2O	2,088	g/L
MgSO4.7H2O	0,344	g/L
Ácido aspártico	1,064	g/L
Ácido glutâmico	0,470	g/L
Ácido linoléico	0,672	ml/L
Ácido tióctico	1,680	ml/L
Tirosina.2Na (PM 225)	1,432	g/L
Glucose	66,700	g/L
Glutamina	7,300	g/L
Ácido fólico	70,560	mg/L
Cisteína ácida (400 mM)	6,250	ml/L
Estoque de FeSO4 (1 mM)	23,000	ml/L
1000x Traço B	9,000	ml/L
1000x Traço D	3,300	ml/L
pH esperado 6,11	Ajustar para 7,0
Anotar osmolaridade	724.000	mOsm

Nota: Nucellin é fabricado por Eli Lilly (Indianápolis, IN, USA); estoque

H/P = 0,036 mg/mL de hidrocortisona, 1,08 mg/mL de Putrescina.2HCI.

A osmolaridade final dos meios é 724 mOsm, com uma adição 5 diária de glucose de 2 g/L e adição de glutamina de 1,5 mM.

5._12X Meio 4

Aqui, várias mudanças foram feitas para os meios de alimentação. Pulverizado de Meio 4B foi usado ao invés de adição de cada ingrediente individual em Meio 4B. Pulverizado de Meio 4B foi misturado com glucose e dissol10 vido separadamente sob condições básicas através de titulação de solução

para pH 10,15. Adicional asparagina e tiamina foram adicionadas uma vez que os resultados de análises de aminoácido e vitamina mostraram que estes dois elementos foram exauridos no final do processo de batelada - alimentada. Uso de 12X Meio 4 ainda reduziu o aumento de osmolaridade quando alimentado para a cultura. A formulação de meios para 12X Meio 4 é provida na Tabela 7.

Tabela 7. Folha de trabalho de meios c	e alimentação 12X i	/ieio 4
Componente	Quantidade	Unidade
Meio 4A-1	18,672	g/L
Nucellin®	24,000	ml/L
Estoque H/P	12,000	ml/L
Estoque de selenito	1,200	ml/L
PVA	2,400	g/L
Asparagina.H2O	1,620	g/L
NaH2PO4.H2O	1,566	g/L
MgSO4.7H2O	0,258	g/L
Glutamina	5,475	g/L
Tiamina	0,040	g/L
Meio 4B pré-dissolvido & glucose	-175	ml/L
Cisteína ácida (400 mM) '	4,688	ml/L
Anotar pH
Ajustar pH para 7,2 com HCI 5 N
Estoque de FeSO4 (1 mM)	17,250	ml/L
1000x Traço B	6,750	ml/L
1000x Traço D	2,475	ml/L
Anotar pH (esperado 7,18)
Anotar Osm	566,000
Meio 4B pré-dissolvido & glucose* (para 11 de meios de alimentação)
Água	150 mi
Misturar Meio 4B (14,5 g) com glucose (38,3 g)	Adicionar
Ajustar pH usando NaOH 25% até dissolvido (pH de cerca de 10,25)

Nota: Nucellin é fabricado por Eli Lilly (Indianápolis, IN, USA); estoque

H/P = 0,036 mg/mL de hidrocortisona, 1,08 mg/mL de Putrescina.2HCI.

A osmolaridade final é 566 mOsm. Uma alimentação diária de 4% em volume rende um aumento de osmolaridade aproximado de 8,6, um aumento em glucose de 2 g/L e um aumento em glutamina de 1,5 mM. A formulação de meios 12X Meio 4 é também conhecida como Meio 5. Meio 5 é fácil de fabricar comparado a 20X Meio 4 ou 16X Meio 4, e estável por 10 dias tanto em temperatura ambiente como a 4°C (dados não mostrados). Exemplo 3: Processo de batelada - alimentada com privação de glutamina para cultura de células anti-GDF-8

Células CHO requerem glutamina nos meios de partida para sobreviverem. Tradicionalmente, níveis iniciais de glutamina são altos e glutamina é alimentada diariamente após dia 5 até o fim do processo de batelada - alimentada. Tradicionais processos de batelada - alimentada normalmente resultam em altos níveis de lactato e amônio nas culturas de células, os quais são conhecidos terem efeitos inibidores sobre crescimento de célula, densidade de célula e expressão de proteína recombinante. Processos de batelada - alimentada onde glucose é lentamente adicionada à cultura foram mostrados diminuir produção de lactato e aperfeiçoar crescimento de célula, densidade de célula e expressão de· proteína recombinante. Entretanto, processos da técnica anterior para manipulação de adição de glucose não são práticos para fabricação em larga escala. Aqui, através de utilização de meios de cultura com menores níveis de partida de glutamina e eliminando glutamina da alimentação, é mostrado que menores níveis de amônio e lactato são produzidos, conduzindo a aumentada viabilidade de célula. Adicionalmente, em culturas privadas de glutamina, expressão de proteína recombinante é aumentada e osmolaridade final é reduzida.

Materiais e Processos

Linhagens e Meios: células anti-GDF-8 foram cultivadas em um modo de batelada - alimentada em Meio 1 em bio-reator de 1 L.

Condições de Cultura: Células foram crescidas por doze dias em bio-reatores de 1 L. A temperatura foi deslocada de 37°C para 31 °C no dia 4 ou 5 dependendo do crescimento de célula. Três processos de batelada - alimentada foram testados: um processo normal (controle), um pro66 cesso de alimentação sem glutamina e um processo de privação de glutamina. Detalhes pertinentes destes processos são listados na Tabela 8 e Tabela 9. .

Tabela 8. Processo de batelada - alimentada em bio-reatores de 1 L com 5 processo sem alimentação de glutamina__

	Processo Controle	Processo sem alimentação de glutamina
Glutamina em meios de partida (mM)	13mM	13 mM
Alimentação de glutamina	5 mM no Dia 4	Nenhuma alimentação de glutamina
Meios de alimentação	Meio 5 (com glutamina 37,5 mM)	Meio 5 sem glutamina
Esquema de alimentação	4% diários a partir de Dia 5	4% diários a partir de Dia 5
Mudança de temperatura para 31 °C	Dia 4	Dia 5

Tabela 9. Processo de batelada - alimentada em bio-reatores de 1 L com

processo de privação c	e glutamina '
	Processo Controle	Processo de Baixa Glutamina
Glutamina de meios de partida (mM)	13mM	4 mM
Alimentação de glutamina	5 mM no Dia 4	Nenhuma alimentação de glutamina
Meios de alimentação	Meio 5 (com glutamina 37,5 mM)	Meio 5 sem glutamina
Esquema de alimentação	4% diários a partir de Dia 5	4% diários a partir de Dia 5
Mudança de temperatura para 31 °C	Dia 4	Dia 5

Análises de amostra: Amostras diárias foram tomadas das culturas e foram analisadas para densidade de célula, viabilidade de célula, ní10 veis de lactato, glutamina, e amônio. Título de anticorpo anti-GDF-8 expresso também foi medido diariamente.

Resultados e Conclusões

A Figura 3 mostra a densidade de células de culturas crescidas em alimentação sem glutamina ou condições de batelada - alimentada controles. Em ambos os casos, densidade de célula foi similar no curso do expe5 ri mento.

A Figura 4 mostra porcentagem de viabilidade de célula em culturas crescidas sem alimentação de glutamina ou condições de batelada alimentada controles. A cultura de alimentação sem glutamina mostrou uma viabilidade de célula acentuadamente maior na direção do fim do experimen10 to, começando no dia 6.

A Figura 5 mostra níveis de amônio em culturas crescidas sem alimentação de glutamina ou condições controles de batelada - alimentada. A cultura sem alimentação de glutamina mostrou uma acentuada diminuição em níveis de amônio na direção do fim do experimento, começando no dia 4.

A Figura 6 mostra níveis de lactato em culturas crescidas sem alimentação de glutamina ou condições controles de batelada - alimentada. Níveis de lactato foram levemente menores na cultura sem alimentação de glutamina por todo o curso do experimento.

A Figura 7 mostra título de anticorpo anti-GDF-8 em culturas crescidas sem alimentação de glutamina ou condições controles de batelada - alimentada. Título de anticorpo anti-GDF-8 final foi maior na cultura sem alimentação de glutamina.

A Figura 8 mostra a densidade de células de culturas crescidas privadas de glutamina ou condições controle de batelada - alimentada. Em ambos os casos, densidade de células foi similar sobre o curso do experimento.

A Figura 9 mostra viabilidade de célula em culturas crescidas em condições privadas de glutamina ou de batelada - alimentada padrão. Em ambos os casos, viabilidade de célula foi similar sobre o curso do experi30 mento.

A Figura 10 mostra níveis de amônio em culturas crescidas em condições privadas de glutamina ou de batelada - alimentada controle. A

cultura privada de glutamina mostrou uma acentuada diminuição em níveis de amônio por todo o curso do experimento.

A Figura 11 mostra níveis de lactato em culturas crescidas em condições privadas de glutamina ou de batelada - alimentada controle. A cultura privada de glutamina mostrou uma acentuada diminuição em níveis de lactato na direção do fim do experimento, começando no dia 4.

A Figura 12 mostra título de anticorpo anti-GDF-8 em culturas crescidas em condições privadas de glutamina e de batelada - alimentada controle. Título de anticorpo anti-GDF-8 final foi maior na cultura privada de glutamina.

Coletivamente estes resultados indicam que diminuídos níveis de glutamina são benéficos para culturas de células reduzindo a quantidade de produção de amônio, aumentando viabilidade de célula e aumentando título de anticorpo anti-GDF-8 expresso. Em adição, nas culturas privadas de glutamina, baixos níveis de lactato foram observados, possivelmente devido à diminuída taxa de consumo de glucose. Diminuídos níveis de amônio e lactato também têm o efeito de redução de osmolaridade total. Elevada osmolaridade também é conhecida ter efeitos inibidores sobre crescimento e viabilidade de célula. Baixos níveis iniciais de glutamina junto com a elimina20 ção da alimentação de glutamina também têm o efeito positivo de reduzir amônio produzido como um resultado de degradação de glutamina nãoenzimática em meios estocados. Eliminação de glutamina na alimentação também simplifica o processo de cultura de células anti-GDF-8.

Exemplo 4: Resposta de dose de ferro de células anti-GDF-8 em Meio 1 e

Meio 2

Meio 1 é muito mais concentrado em nutrientes que Meio 2. Os ótimos níveis de ferro para crescimento de célula em Meio 1 foram determinados de modo a evitar-se problemas com deficiência de ferro durante cultura de células.

Materiais e Processos

Células anti-GDF-8 foram cultivadas em placas para uma passagem em Meio 1 ou Meio 2. Concentrações de ferro destes meios foram

manipuladas pela adição de diferentes quantidades de solução estoque de ferro. Densidades finais de células foram medidas por CEDEX.

Resultados e Conclusões

A Figura 13 mostra a dose - resposta de Fe de células anti5 GDF-8 em Meio 1 e Meio 2 contendo diferentes concentrações de ferro. Em Meio 2, a densidade de células foi relativamente constante para concentrações de ferro variando de 3 μΜ a 15 μΜ. Em Meio 1, densidade de célula aumenta com crescente concentração de ferro mas atinge um máximo após aproximadamente 5 μΜ. Esta diferença pode ser devida ao alto teor de nu10 triente em Meio 1, que pode reduzir disponibilidade de ferro para as células como uma conseqüência de quelação de ferro nos meios. Estes resultados indicam que níveis de ferro devem ser mantidos acima de 5 μΜ para evitar problemas com deficiência de ferro em Meio 1.

Exemplo 5. Substituição de glutamato para glutamina no processo de bio-reator

Três experimentos foram realizados para testar os efeitos de substituição de glutamato para glutamina em um processo de cultura de células anti-Lewis Y.

Materiais e Processos ·

Os experimentos foram realizados em bio-reatores de 10 L em pH 7,1, 30% oxigênio dissolvido, e uma temperatura de partida de 37°C com uma mudança para 31 °C no dia 5. Gases de espargimento e espaço superior foram 88% de uma mistura de 93% ar/7% CO2 e 12% oxigênio. Os meios de partida em todos os experimentos foi Meio 1, que contem glutamina. Meios de alimentação e esquema de alimentação incluindo alimentações su25 plementares de glucose e glutamina são mostrados na Tabela 10. Colunas intituladas “glutamato” foram alimentadas com Meio 5 modificado, não contendo glutamina, mas contendo uma concentração molar de glutamato igual à concentração molar de glutamina em Meio 5 padrão.

Tabela 10. Esquema de alimentação

Dia	9040-44	9040-56	9040-64
Glutamato 1	Glutamina 1	Glutamato 2	Glutamina 2	Glutamato 3	Glutamina 3
0
1
2
3
4		5 mM gin		5 mM gin	3 g/L gluc3	7,7 mM g/l 2,9 g/l glu
5	3,6 g/gluc	5 mM gin 5,5 g/L gluc	3,5 g/L gluc	5 mM gin 6 g/L gluc	3 g/L gluc	3 g/L glu
6	12% 16X Meio 4	12% 16X Meio 4	17% Meio 5	17% 16X Meio 4	29% Meio 5	29% Meio 5
7		4 mM gin
8
9		2,5 g/L gluc
10	10% 16X Meio 4	10% 16X Meio 4	8% Meio 5	5% 16X Meio 4
11		1 g/L gluc
12
13		1 g/L gluc

Resultados e Conclusões

Dentro de cada experimento, densidade células é similar como mostrado na Figura 14. Densidade de células são baixas nos experimentos de Glutamina 2 e Glutamato 2 devido a um desvio de pH para cerca de 6,7 no dia 3 do processo. A queda em densidade entre dia 6e 7 nos experimentos de Glutamina 3 e Glutamato 3 é devida aos 29% de alimentação de meios no dia 6.

A Figura 15 mostra viabilidade de célula das culturas alimenta10 das com glutamato e glutamina. Viabilidades permaneceram maiores durante a segunda metade do processo nos bio-reatores contendo culturas alimentadas com glutamato.

No Experimento 1, título anti-Lewis Y é similar entre as culturas alimentadas com glutamato e glutamina. A Figura 16 mostra que em Experimentos 2 e 3, títulos de anti-Lewis Y são menores nos reatores alimentados com glutamina. O menor título anti-Lewis Y observado nestes reatores pode ser devido aos altos níveis de lactato produzidos, como mostrado na Figura 17.

Bio-reatores correndo com glutamato nos meios de alimentação têm uma menor concentração de amônio (Figura 18) e uma menor osmolaridade (Figura 19).

O ensaio ELISA de ligação foi usado para testar atividade de amostras dos experimentos Glutamina 1 e Glutamato 1. As atividades foram similares: 110% de referência para a amostra Glutamina 1 e 122% de referência para a amostra Glutamato 1 (dados não mostrados).

A substituição de glutamina por glutamato nestes experimentos não tem um efeito significante sobre densidade de célula. Entretanto, viabilidade de célula é menor nos bio-reatores alimentados com glutamina. Amônio, lactato e osmolaridade são menores nos bio-reatores alimentados com glutamato comparados àqueles alimentados com glutamina. Em média, título anti-Lewis Y é maior nos bio-reatores alimentados com glutamato e atividade é essencialmente a mesma sob ambas condições.

Exemplo 6, Substituição de glucose e glutamina no processo de cultura de células anti-Lewis Y

O propósito deste experimento foi testar os efeitos de substituição de glucose e glutamina com os meios de alimentação listados na Tabela

11 abaixo na cultura de células anti-Lewis Y (ver Bogheart et al., Antibodytargeted chemotherapy with the calicheamicin conjugate hu3S193-N-acetyl gamma calicheamicin dimethyl hydrazide targets Lewis Y and eliminates Lewis Y-positive human carcinoma cells and xenografts, Clin. Can. Res. 10:4538-49 (2004)). Densidade de células, viabilidade de células, título anti10 Lewis Y e níveis de amônio foram medidos.

Materiais e Processos

O experimento foi realizado em frascos de agitação de 250 mL em um volume de partida de 75 mL. Todos os frascos de agitação foram semeados com 0,25x10® células/mL em Meio 2. Os frascos foram incubados a 37°C em uma incubadora de CO₂ 7% por 14 dias. Nos dias 3 e 4, os frascos foram alimentados com 5% em volume de meio de alimentação Meio 6. A composição de Meio 6 é listada na Tabela 11. Nos dias 5-13 os frascos foram alimentados com 5% em volume de uma das soluções de alimentação listadas na Tabela 12. Cada condição foi realizada em duplicata. Amostras foram tomadas diariamente para contagens de células por CEDEX e ensaios para amônio, glucose e lactato.

Tabela 11. Composição de M	eio 6
Aminoácidos	mg/L	mM	Elementos em Traços	pg/L	nM
Alanina	142,48	1,60	Selenito de sódio	40,00	231,35
Arginina	1528,84	8,79	CuSO4	3,44	21,51
Asparagina.H2O	1080,60	7,20	CuSO4*5H2O	7,49	30,00
Ácido aspártico	532,40	4,00	FeSO4’7H2O	2534	9115
Cistina.2HCI	473,00	1,51	ZnSO4‘7H2O	2704	9421
Ácido glutâmico	235,38	1,60	MnSO4’H2O	0,17	1,01
Glutamina	4820,00	33,01	Na2SiO3’9H2O	140	492,84
Glicina	120,07	1,60	(NH4)6Mo7O24*4H2O	1,24	1,00
Histidína.HCI.H2O	588,32	2,80	nh4vo3	0,65	5,56

Aminoácidos	mg/L	mM	Elementos em Traços	pg/L	nM
Isoleucina	944,52	7,21	NiSO4*6H2O	0,13	0,49
Leucina	1360,75	10,39	SnCI2’2H2O	0,12	0,53
Lisina.HCI	1456,80	8,00	AICI3*6H2O	1,20	4,97
Metionina	477,06	3,20	AgNO3	0,17	1,00
Fenilalanina	660,36	4,00	(33(02(^02)2	2,55	9,98
Prolina	552,31	4,80	KBr	0,12	1,01
Serina	1264,70	12,04	CdCI2’2,5H2O	2,28	9,99
Treonina	762,02	6,40	CoCI2’6H2O	2,38	10,00
Triptofano	260,94	1,28	CrCI3	0,32	2,02
Tirosina.2Na.2H2O	832,62	3,19	NaF	4,20	100,02
Valina	749,21	6,40	GeO2	0,53	5,07
Vitaminas	Mg/L	mM	RbCI	1,21	10,01
Biotina	3,28	0,01	ZrOCI2’8H2O	3,22	9,99
Pantotenato de cálcio	36,02	0,08
Cloreto de colina	143,28	1,03	Outros componentes	yg/L	nM
Ácido fólico	42,43	0,10	Hidrocortisona	288	0,79
Inositol	201,71	1,12	Putrescina.2HCI	8000	49,66
Nicotinamida	32,02	0,26	Ácido linoléico	336,25	1,20
Piridoxina.HCI	32,82	0,16	Ácido tióctico	840,63	4,08
Riboflavina	3,60	0,01
Tiamina.HCl	35,22	0,10	Outros Componentes	Mg/L	mM
Vitamina B12	11,21	0,01	D-glucose (dextrose)	33005,99	183,37
			PVA	2400,00
Sais Inorgânicos	Mg/L	mM	Nucellin®	80,00
KH2PO4	1635,00	12,02
MgSO4*7H2O	171,98	0,70

Tabela 12. Alimentações nos dias 5-13. Meio 6 modificado não contem glicose ou glutamina

GluGIn	Meio 6 modificado + 43 g/L de glicose + 4,82 g/L de glutamina (controle)
Glu	Meio 6 modificado + 43 g/L glicose + 4,82 g/L de glutamato
GluAsp	Meio 6 modificado + 43 g/L de glicose + 4,36 g/L de asparagina
GluGlyGIn	Meio 6 modificado + 43 g/L de glicose + 6,71 g/L de glicil glutamina
GluGlu	Meio 6 modificado + 43 g/L de galactose + 4,82 g/L de glutamina
GalGIu	Meio 6 modificado + 43 g/L de galactose + 4,82 g/L de glutamato
GalGIn	Meio 6 modificado + 43 g/L galactose + 4,36 g/L asparagina
GalGIyGIn	Meio 6 modificado + 43 g/L galactose + 6,71 g/L glicil glutamina
GalAso	Meio 6 + 43 g/L glucose

Resultados e Conclusões

A mais alta densidade de células foi vista quando glutamato ou 5 glicil glutamina foram substitutos para glutamina na presença de glicose ou galactose nos meios de alimentação. Densidade de células foi genericamente menor nas culturas alimentadas com glucose/glutamina, galactose/glutamina, ou somente glucose (Figura 20). Viabilidade final foi mais alta nas culturas alimentadas somente com glucose, seguidas pelas culturas ali10 mentadas com glucose/glutamato. A viabilidade mais baixa foi vista em culturas alimentadas com glutamina ou asparagina ombinada com glicose ou galactose (Figura 21).

Título no dia 14 foi mais alto nas culturas alimentadas com glucose/glicil glutamina e glucose/glutamato em cerca de 700 μg/mL. Título foi mais baixo nas culturas alimentadas com galactose/glicil glutamina e galactose/asparagina em cerca de 500 μg/mL. Título no controle de glucose/glutamina foi cerca de 570 μg/mL (Figura 22).

Os níveis mais baixos de amônio foram vistos nos frascos alimentados com glucose/glutamato ou somente glucose. Os frascos alimenta20 dos com galactose/glutamato, glucose/glutamina, glucose/glicil glutamina, e glucose/asparagina mostraram níveis intermediários de amônio. Os frascos alimentados com galactose/asparagina, galactose/glicil glutamina e galactose/glutamina tiveram os níveis mais altos de amônio (Figura 23).

Níveis de glucose permaneceram acima de 1 g/L em todos os frascos alimentados com galactose até dia 11. A partir de dia 11 até dia 14, a glucose nestas culturas nunca foi completamente esgotada, permanecendo entre 0,6 e 1 g/L, sem diferenças significantes entre as diferentes culturas.

Níveis de glucose aumentaram em todos os frascos alimentados com glicose ou glicose combinada com um outro substrato até o dia 10. Do dia 10 até dia 14 nestas culturas, níveis de glucose permaneceram bem constantes e similares uns aos outros. No dia 14 cerca de 8,4 g/L de glucose permaneceram nas culturas alimentadas com glucose/glutamato e cerca de 10,8 g/L de glucose permaneceram nas culturas alimentadas somente com glucose.

Níveis de lactato atingiram uma alta de cerca de 2,4 g/L no dia 5, quando condições foram as mesmas para todas as células, e caiu para essencialmente zero em todas as culturas pelo dia 14. Níveis de lactato foram mais altos a partir do dia 10 até dia 14 no controle de glucose/glutamina, mas foram abaixo de 1 g/L durante este tempo (dados não mostrados).

Todas as condições testadas neste experimento resultaram em densidade de células maior que a condição controle glucose/glutamina. Todas as condições testadas exceto a condição galactose/asparagina resultaram em maior viabilidade final que tanto o controle glucose/glutamina como a condição alimentada com galactose/glutamina. Título no controle de glucose/glutamina foi cerca de 570 pg/mL comparado a uma alta de cerca de 700 pg/mL na condição alimentada com glucose/glicil glutamina e a condição alimentada com glucose/glutamato.

Exemplo 7. Avaliação de um processo privado de glutamina para a produção de anti-GDF-8

Típicos processos de produção de batelada - alimentada requerem múltiplas alimentações sobre o período de cultura. Estas alimentações são designadas para substituir nutrientes no meio que possam ter sido esgotados pelas células ou possam ter degradado durante a batelada. Estas alimentações criam complicações quando o processo é aumentado em escala para ser usado em maiores reatores, tal como a necessidade de um salto impulsor (ver Figura 24). Além disso, as alimentações diluem a quantidade de anti-GDF-8 já secretada na cultura e por isso afeta o título de colheita. O uso de um processo de batelada pode permitir inoculação do bio-reator em volume inteiro, ao invés de um volume parcial de modo a acomodar as alimentações, o que pode remover a necessidade de um salto impulsor e reduzir grandemente qualquer efeito de diluição sobre produtividade.

Glutamina é uma das razões mais importantes de uma abordagem de batelada - alimentada ser usada uma vez que ela não é estável a 37°C foi pensado que ela precisava ser reabastecida durante uma cultura em batelada. Entretanto, resultados de Exemplos 2, 5, e 6, onde uma estratégia de privação de glutamina foi testada, mostraram um significante aumento em produtividade comparados a um reator controle que foi alimentado com glutamina. Este resultado foi combinado com o processo de batelada para criar um processo de batelada de privação de glutamina que foi testado neste Exemplo.

Materiais e Processos

Células anti-GDF-8 foram crescidas em bio-reatores de 1L por 12 dias de acordo com as seguintes quatro condições de crescimento. Parâmetros de bio-reator para todas as condições foram mantidos idênticos. Oxigênio dissolvido foi mantido em não menos que 23% de saturação de ar através de espargimento com ar e pH foi mantido em 7,00 através de adição de uma solução contendo bicarbonato de sódio a 0,58 M e carbonato de sódio em 0,71 Μ. A temperatura de todas as culturas foi mantida em 37°C para os primeiros quatro dias da batelada. No quarto dia da batelada a temperatura de todos os bio-reatores foi diminuída para 31 °C e mantida neste ponto para a duração da batelada. As culturas de batelada - alimentada e controle foram alimentadas com 8%, 12%, e 8% de volume total de reator de seus respectivos meios de alimentação nos dias 5, 7, e 10, respectivamente.

1) Controle.

- inoculação de Meio 7 (ver Tabela 13).

- Meio 8 de alimentação, alimentado em dias 5, 7, e 10 (ver

Tabela 13).

XL·

- alimentar 5 mM de glutamina no dia 4.

- diminuir a temperatura para 31 °C no dia 4.

2) privação de glutamina de batelada - alimentada.

- inoculação de Meio 7 com somente 4 mM de glutamina (ver

Tabela 13).

- Meio 8 de alimentação sem glutamina, alimentado em dias 5, 7, e 10 (ver Tabela 13).

- nenhuma glutamina alimentada no dia 4.

- diminuir a temperatura para 31 °C no dia 4.

3) Privação de glutamina de batelada.

- inoculação de de meio de batelada de novo meio com somente 4 mM de glutamina (ver Tabela 13).

- nenhum meio de alimentação.

- nenhuma alimentação de glutqamina.

- diminuir a temperatura para 31 °C no dia 4.

- adicionar 5 g/L de glucose no dia 8.

4) privação de glutamina de batelada suplementada no dia 8.

- inoculação de meio de batelada de novo meio com somente 4 mM de glutamina (ver Tabela 13).

- nenhum meio de alimentação.

- diminuir a temperatura para 31 °C no dia 4.

- adicionar 4 g de glucose, 375 mg de asparagina, 3 mL de estoque de FeSCU 1 mM, 3,33 mL de estoque de Nucellin 5 g/L, 2,57 mL de hidrocortisona 36 mg/L e 1,0 g/L de solução estoque de Putrescina, 0,23 mL de estoque de selenito de sódio 50 mg/L, e 13,1 mg de tiamina no dia 8. Tabela 13. Composições de meios usados

	PM	Meio 7	Meio 8	Meios de Batelada
Aminoácidos		mM	mM	mM
L-alanina	89,0	1,08	2,4	0,2
L-arginina	174,0	6,84	13,2	4
L-asparagina.H2O	150,0	4,76	21,4	7,5
Ácido L-aspártico	133,0	2,40	6	1,65

Q,

	PM	Meio 7	Meio 8	Meios de Batelada
Aminoácidos		mM	mM	mM
L-cisteína.HCI.H2O	176,0	0,40	0	0,4
L-cistina.2HCI	313	0,95	1,875	1
Ácido L-glutâmico	147,0	1,08	2,4	1,08
L-glutamina	146,0	13,00	37,5	4
Glicina	75,0	1,28	2,4	1,54
L-histidina.HCI.H2O	210,0	1,76	4,2	1,76
L-isoleucina	131,0	4,76	10,8	2,83
L-leucina	131,0	6,52	15,6	4,7
Lisina.HCI	182,0	5,20	12	5,2
L-metionina	149,0	1,96	4,8	2,6
L-fenilalanina	165,0	2,60	6	2,2
L-prolina	115,0	3,24	7,2	4,1
L-serina	105,0	8,60	18 .	8,6
L-treonina	119,0	4,32	9,6	3,2
L-triptofano	204,0	0,78	1,92	1,04
L-tirosina.2Na.2H2O	261,0	2,16	4,8	1,75
L-valina	117,0	4,32	9,6	4
Vitaminas		μΜ	μΜ	μΜ
Biotina	244,0	8,31	20,4	11
Pantotenato de D-cálcio	476,0	46,06	112,8	46,06
Cloreto de colina	139,0	632,2	1548	840
Ácido fólico	441,0	58,8	144	58,8
l-inositol	180,0	686	1680	911
Nicotinamida	122,0	161,7	396	215
Piridoxina.HCI	206,0	88,15	240	88
Piridoxal.HCI	203,0	10	0	10
Riboflavina	376,0	5,37	13,2	1,1
Tiamina.HCI	337,0	63,7	274,7	117

	PM	Meio 7	Meio 8	Meios de Batelada
Aminoácidos		mM	mM	mM
Vitamina B12	1355,0	4,9	12	7,8
Sais inorgânicos
NaCl	58,5	18,8 mM
KCI	74,6	4,2 mM		4,19 mM
C3CI2	111	1,05 mM		1,05 mM
Selenito de sódio	173	27 pg/L	60 pg/L	60 pg/L
NaH2PO4.H2O	142	4,68 mM	11 mM	4,68 mM
Na2HPO4	138	0,5 mM		0,3986 mM
MgSO4	120	1,15 mM	1,05 mM	1,15 mM
MgCI2	95	0,3 mM		0,3 mM
FeSO4.7H2O	278	9 μΜ	24,675 μΜ	9 μΜ
Fe(NO3)3.9H2O	404	0,125 μΜ		0,124 μΜ
ZnSO4.7H2O	287	9,2 μΜ	17 μΜ	9,2 μΜ
CuSO4	160	0,05 μΜ	0,074 μΜ	0,064 μΜ
NaHCO3	84	23,8 mM		23,8 mM
Outros
Glucose	180	16 g/L	38,3 g/L	15 g/L
Álcool polivinílico		2,56 g/L	2,4 g/L	2,56 g/L
Hidrocortisona	363	0,23 mg/L	0,43 mg/L	0,28 mg/L
Putrescina.2HCI	161	6,4 mg/L	12 mg/L	7,7 mg/L
Piruvato de sódio	110	500 μΜ		500 μΜ
Ácido linoléico	280	0,81 μΜ	1,8 μΜ	0,81 μΜ
Ácido tióctico	206	2,7 μΜ	6 μΜ	2,7 μΜ
Nucellin®		54 mg/L	120 mg/L	50 mg/L
1000x Traço B		1,5 ml/L	6,75 ml/L	1,5 ml/L

Resultados e Conclusões

Crescimento de células para os primeiros 4 dias foi similar para os processos controle e batelada, enquanto o processo de batelada - alimentada privada de glutamina teve uma densidade de células levemente menor e permaneceu um pouco menor para o resto da batelada. Ambos processos de batelada mantiveram maiores densidades de células para a duração da batelada, provavelmente devido à falta de qualquer significante diluição (ver figura 25). Viabilidades de todas as culturas foram as mesmas até dia 8. Entretanto, é interessante notar que no dia 11, a viabilidade do processo de batelada que não foi suplementada foi menor que os outros três bio-reatores e terminou significantemente menor no final do dia. Isto sugere que o meio de batelada ainda pode ser otimizado uma vez que o processo de batelada suplementada teve uma viabilidade que foi a mesma como os bio-reatores de batelada - alimentada (ver Figura 26).

Células cultivadas em tanto o processo de batelada privada de glutamina como no processo de batelada - alimentada privada de glutamina superaram as mesmas células cultivadas no processo de batelada - alimentada controle em produtividade. O processo de batelada - alimentada controle teve um título de dia de colheita de 685 pg/mL, enquanto o processo de batelada - alimentada privada de glutamina teve um título de colheita de 1080 pg/mL, cerca de 58% maior que o controle. Isto é similar a resultados vistos anteriormente. O processo de batelada não-suplementada privada de glutamina teve um título de dia de colheita de 960 pg/mL, 40% maior que o controle, similar ao processo de batelada - alimentada privada de glutamina, enquanto o processo de batelada privada de glutamina teve o título mais alto em 1296 pg/mL. Isto é um aumento de 89% acima de controle (ver Figura 27).

Quando os níveis de inibidor para as quatro condições foram analisados os resultados mostraram que os níveis de lactato e amônio para todos os três processos privados de glutamina foram significantemente menores que o controle. De fato, após dia 4, aquelas três condições interromperam produção ou iniciaram consumo de lactato enquanto o controle continuou a produzir lactato por toda a batelada (ver Figura 28). Como esperado, os níveis de amônio foram muito menores nos processos privados de glutamina

e declinaram após dia 4, enquanto o controle continuou a produzir amônia (ver Figura 29).

Neste exemplo, combinação de um processo de batelada com uma estratégia de privação de glutamina resultou em um aperfeiçoamento de 40% em produtividade sobre o processo de batelada - alimentada controle para células anti-GDF-8. Os dados também sugerem que com alguma otimização do meio de batelada, um aperfeiçoamento de quase duas vezes em produtividade pode ser obtido. Este aperfeiçoamento em produtividade pode ser atribuído a dois fatores. Primeiro, privação de glutamina aumenta produtividade diretamente ou através de manutenção de níveis de amônia e lactato muito baixos. Segundo, devido à ausência de alimentações, o título não é diluído durante a batelada. Aumentada produtividade junto com a facilidade de operação inerente em um processo de batelada torna o mesmo uma atrativa opção para produção de polipeptídeos recombinantes.

Exemplo 8. Efeitos de concentrações de glutamina e asparagina em meios de batelada sobre processo de cultura de células anti-GDF-8

Em Exemplos 2, 5 e 6, foi demonstrado que privação de glutamina conferiu benefícios sobre culturas de batelada - alimentada em duas linhas de células, incluindo aumentado crescimento de célula, viabilidade de célula e título assim como diminuída produção de lactato e amônio. Asparagina também parece desempenhar um papel em meios de batelada.

Materiais e Processos

Células anti-GDF-8 foram cultivadas por doze dias em bioreatores de 1 L em Meio 9 modificado com diferentes concentrações de asparagina e asparagina. Composição de Meio 9 base é listada na Tabela 14. Variações experimentais sobre esta composição base são listadas na Tabela 15. As culturas foram incubadas a 37°C para os primeiros 5 dias com a exceção de Reator 4, cuja temperatura foi 30°C para o primeiro dia devido a problemas de controle de temperatura. As culturas foram deslocadas para 31°C no dia 6. No dia 7, as culturas foram alimentadas uma vez com 5% em volume de Meio 5 carecendo de glutamina. Culturas foram medidas diariamente para densidade de célula, título anti-GDF-8, níveis de lactato e amônio.

Tabela 14. Composição de IV	eio 9.
Aminoácidos	mg/L	mM	Elementos em Traços	pg/L	nM
Alanina	17,80	0,20	Selenito de sódio	69,16	400,00
Arginina	696,00	4,00	Fe(N03)3'9H20	50,00	123,76
Asparagina.H2O	3000,00	20,00	CUSO4	10,24	64,00
Ácido aspártico	219,45	1,65	CuSO4'5H20	99.88	400,00
Cisteína.HCI.H2O	70,40	0,40	FeSO47H20	4170	15000
Cisteína.2HCI	468,75	1,50	ZnSO47H20	2640	9200
Glutamato mono - sódio	33,80	0,20	MnSO4*H20	33,80	200,00
Glutamina	584,00	4,00	Νά2θίθ3 9H2O	284,07	1000
Glicina	115,50	1,54	(NH4)6Mo7O24'4H20	247,20	200,00
Histidina.HCI.H2O	474,60	2,26	nh4vo3	2,34	20,00
Isoleucina	570,73	4,36	NÍSO46H2O	5,26	20,00
Leucina	1030,70	7,87	SnCI2'2H2O	0,90	4,00
Lisina.HCI	1401,40	7,70	AICI36H20	0,97	4,00
Metionina	387,40	2,60	KBr	0,48	4,00
Fenilalanina	507,00	3,07	CrCI3	15,83	100,00
Prolina	539,50	4,69	NaF	0,17	4,00
Serina	1052,00	10,02	GeO2	0,42	4,00
Treonina	564,80	4,75	Kl	33,20	200,00
Triptofano	274,16	1,34	RbCI	0,48	4,00
Tirosina.2Na.2H2O	745,75	2,86	H3BO3	12,37	200,00
Valina	749,00	6,40	LiCI	0,17	4,00
Vitaminas	Mg/L	mM	Outros Componentes	pg/L	nM
Biotina	2,68	0,01	Hidrocortisona	540,00	1,49
Pantotenato de cálcio	21.92	0,05	Putrescina.2HCI	15000	93,11
Cloreto de colina	158,46	1,14	Ácido linoléico	290,00	1,04
Ácido fólico	25,93	0,06	Ácido tióctico	716,00	3,48
Inositol	163,98	0,91

Aminoácidos	mg/L	mM	Elementos em Traços	pg/L	nM
Nicotinamida	26,23	0,22	Outros Componentes	Mg/L	mM
Piridoxal.HCI	2,03	0,01	D-glucose (Dextrose)	15000,00	83,33
Piridoxina.HCI	36,13	0,18	PVA	2560,00
Riboflavina	2,41	0,01	Nucellin®	50,00
Tiamina.HCl	39,43	0,12	Piruvato de sódio	55.00	0,50
Vitamina B12	21,17	0,02
Sais Inorgânicos	Mg/L	mM
CaCI2	116,55	1,05
KCI	312,90	4,19
Na2HPO4	56,60	0,40
NaCl	1100,00	18,80
NaH2P04«H20	645,84	4,68
MgSO4	138,00	1,15
MgCI2	28,50	0,30
NaHCOs	2000,00	23,81
Tabela 15. Condições testad	as de glutamina e asparagina
Reator 1	Reator 2	Reator 3 Reator 4 Reator 5	Reator 6
Linha de células	Anti-GDF-8
Meios	Meios de	Batelada (Meio 9)
	1 mM	1 mM	1 mM 4 mM 4 mM	4 mM
Níveis de glutamina
	8 mM	12 mM	20 mM 8 mM 12 mM	20 mM
Níveis de asparagina
Densidade de Semea-	0,3 a 0,35
dura (x106/mL)
Meios de Alimentação	Meio 5 - Glutamina, 5% no Dia 7
Dias de Cultura	12
Mudança de Tempera-	Dia 6	Dia 6	Dia 6 Dia 5 Dia 5	Dia 4
tura (37-31°)

Resultados e Conclusões

As Figuras 30, 31, 32 e 33 mostram o crescimento de células de células anti-GDF-8, título de anti-GDF-8, níveis de lactato e níveis de amônio, respectivamente, por todo o curso dos experimentos sob as várias condições experimentais.

Sob todas as condições experimentais, glutamina 4 mM é melhor que glutamina 1 mM em todos os níveis de asparagina testados. Em níveis de glutamina comparáveis, condições de asparagina de 12 mM e 20 mM são melhores que condições de asparagina de 8 mM. Diminuídos níveis de lactato e NH₄ foram observados no fim da cultura para todas as condições testadas.

Exemplo 9. Efeitos de concentrações de glutamina e asparagina em meios de batelada sobre processo de cultura de células anti-GDF-8

No Exemplo 8, foi demonstrado que Meio 9 contendo uma concentração inicial de 4 mM de glutamina desempenha melhor que meios contendo glutamina 1 mM, independente de níveis de asparagina. Este exemplo demonstra o efeito de meios contendo níveis de glutamina de 13 mM e vários níveis de asparagina. ·

Materiais e Processos

Células anti-GDF-8 foram cultivadas por doze dias em bioreatores de 1 L em Meio 9 modificado com diferentes concentrações de glutamina e asparagina como listado na Tabela 16. As culturas foram incubadas a 37°C pelos primeiros 3 dias. As culturas foram então mudadas para 31 °C no dia 4. No dia 7, as culturas foram alimentadas uma vez com 5% em volume de Meio 5 carecendo de glutamina. Culturas foram medidas periodicamente para densidade de células, viabilidade de células, níveis de lactato e amônio e níveis de glutamina, título anti-GDF-8, e osmolaridade.

Tabela 16. Condições testadas de asparagina e glutamina

	Reator 1	Reator 2	Reator 3	Reator 4	Reator 5	Reator 6
Linha de células	Anti-GDF-8
Meios	Meios de Batelada (	/leio 9)
Níveis de glutamina	4 mM	4 mM	13 mM	13 mM	13 mM	13 mM
Níveis de asparagina	20 mM	20 mM	20 mM	12 mM	12 mM	8 mM
Densidade de Semeadura (x106/mL)	0,3 a 0,35
Meios de alimentação	Meio 5 carecendo de glutamina, 5% no Dia 7
Dias de Cultura	12
Mudança de Temperatura (37-31 °C)	Dia 4	Dia 4	Dia 4	Dia 4	Dia 4	Dia 4

Resultados e Conclusões

As Figuras 34, 35, 36, 37, 38, 39 e 40 mostram o crescimento de célula de células anti-GDF-8, porcentagem de viabilidade de células anti5 GDF-8, níveis de lactato níveis de amônio, níveis de glutamina, título de antiGDF-8, e osmolaridade, respectivamente, por todo o curso dos experimentos sob as várias condições experimentais.

Entre todas as codições testadas, somente Meio 9 contendo glutamina 13 mM e asparagina 20 mM mostraram significantes efeitos adversos sobre crescimento de célula e título. Glutamina é exaurida em todas as culturas em aproximadamente o mesmo tempo, independente de se a cultura inicia com glutamina 4 mM ou 13 mM. O mais alto título anti-GDF-8 é obtido em culturas que contêm glutamina 13 mM e asparagina 12 mM. Todas as condições exibiram diminuídos níveis de lactato e amônio próximo do final da cultura. Níveis de amônio foram mais altos na cultuira contendo glutamina 13 mM e asparagina 20 mM.

Exemplo 10. O efeito de níveis de asparagina e cisteína sobre a diminuição observada em níveis de lactato e amônio em células anti-GDF-8 cultivadas em Meio 9

Em Exemplos 2, 5 e 6, foi verificado que culturas crescidas sob condição de privação de glutamina exibem diminuídos níveis de lactato e

amônio no fim do processo de cultura. Entretanto, culturas crescidas em Meio 9 sob condições de não-privação de glutamina ainda exibem diminuídos níveis de lactato e amônio no fim do processo de cultura. Este efeito não foi observado em outros meios como Meio 1, onde privação de glutamina parece necessá5 ria para os diminuídos níveis de lactato e amônio. Meio 9 e Meio 1 diferem nos níveis de asparagina (20 mM em Meio 9 versus 11 mM total em Meio 1 plus alimentação) e cistina ácida (1,5 mM em Meio 9 versus 0,95 mM em Meio 1). Este exemplo testa se estes dois componentes foram responsáveis pela diminuição observada nos níveis de lactato e amônio no fim da cultura.

Materiais e Processos

Células anti-GDF-8 foram cultivadas em bio-reatores de 1 L por 12 dias. Células foram inicialmente cultivadas a 37°C e foram mudadas para 31 °C no dia 4 ou dia 5 em 8-10x10®/mL. A Tabela 7 lista as várias condições experimentais testadas. Amostras foram tomadas diariamente e salvas para análise de título por HPLC Proteína ^a

Tabela 17. Condições estadas de asparagina e cisteína

Meios	Gin (mM)	Asn (mM)	Gin Total (mM)'	Asn Total (mM)	Alimentação
					Meio 5, 30% total
Meio 1	13	5	29	11	5 Mm Gin, dia 4
					Meio 5-Gln, 30% total
Meio 1	4	5	4	11
					Meio 5-Gln, 5% dia 7
Meios de bateladas (meio 9)	4	20	4	21
Meio 1 + Asn 5 mM + cisteína 0,5 mM					Meio 5, 30% total
13	10	29	16	5 mM Gin, dia 4
					Meio 5, 30% total
Meios de batelada (Meio 9)	13	20	29	21	5 mM Gin, dia 4

Nota:

Meio 5-Gln = Meio 5 carecendo de glutamina.

Resultados e Conclusões

Células anti-GDF-8 crescidas em Meio 9 exibiram diminuídos níveis de lactato de amônio no fim do processo de cultura, independente de se as culturas partiram com 4 mM ou 13 mM de glutamina (ver Figuras 42 e 43). Em contraste, Meio 1 somente exibiu diminuídos níveis de lactato e amônio no fim do processo de cultura quando as culturas foram iniciadas com glutamina 4 mM (ver Figuras 42 e 43). Adição de extra asparagina e cistina para Meio 1 contendo glutamina 13 mM não resulta em diminuídos níveis de lactato e amônio no fim do processo de cultura (ver Figuras 42 e 43).

Culturas que exibiram diminuídos níveis de lactato e amônio no fim do processo de cultura (Meio 1 com glutamina 4 mM, Meio 9 com glutamina 4 mM e Meio 9 com glutamina 13 mM) também foram observadas terem menor osmolaridade total no fim do processo de cultura (ver Figura 47).

Meio 9 com glutamina 4 mM exibiu o mais alto título anti-GDF-8, seguido por Meio 9 com glutamina 13 mM alimentada no dia 4 (ver Figura 46). Levando o efeito de diluição da alimentação em conta, Meio 9 contendo glutamina 4 mMteve título anti-GDF-8 equivalente a Meio 9 contendo glutamina 13 mM. ·

Exemplo 11.0 efeito de níveis de aminoácido e vitamina sobre a diminuição observada em níveis de lactato e amônio em células anti-GDF-8 cultivadas em Meio 9

O Exemplo 10 testou se diferença em níveis de asparagina e cisteína entre Meio 1 e Meio 9 foi responsável pela observada diminuição em níveis de lactato e amônio no fim do processo de cultura em Meio 9 que não foi privado de glutamina. Foi determinado que estes fatores não foram responsáveis pela diminuição observada. Meio 1 e Meio 9 também diferem em suas concentrações de aminoácido e vitamina. Este exemplo testa se diferenças em concentrações de aminoácidos e vitamina entre estes dois meios são responsáveis pela diminuição observada.

Materiais e Processos

Células anti-GDF-8 foram cultivadas em bio-reatores de 1 L por dias. Células foram inicialmente cultivadas a 37°C e foram mudadas para σ?/ °C no dia 4 em 8-10x10⁶/mL. A Tabela 18 lista as várias condições experimentais testadas. Aminoácidos, vitaminas, hidrocortisona e putrescina, elementos em traços E (composição listada na Tabela 19) e ferro foram adicionados às várias condição de Meio experimental 1 de modo que os níveis destes componentes foram iguais aos níveis em Meio 9. Amostras foram tomadas diariamente e salvas para análise de título por HPLC Proteína A.

Tabela 18. Condições testadas de aminoácido e vitamina

Meios	Gin (mM)	Asn (mM)	Alimentação	Dia 5	Dia 7	Dia 10	Dia 11
Meio 1	13	5	Meio 5 30%	8% Meio	12%	8% Meio
			total Gin 5	5	Meio 5	5
			mM, dia 4
Meio 1 +	13	15	Meio 5 30%	8% Meio	12%	8% Meio
AA			total Gin 5	5	Meio 5	5
			mM, dia 4
Meio 1 +	13	15	Meio 5 30%	8% Meio	12%	8% Meio	4 g/L
Vit, H/P,			total Gin 5	5	Meio 5	5	gluco
E, Fe			mM, dia 4
Meio 1 +	13	15	Meio 5 3Ó%	8% Meio	12%	8% Meio	4 g/L
tudo			total Gin 5	5	Meio 5	5	gluco
			mM, dia 4
Meio 9	13	20	Meio 5 30%	8% Meio	12%	8% Meio
com Gin			total Gin 5	5	Meio 5	5
13 mM			mM, dia 4

Nota: AA = aminoácidos, H/P = 0,036 mg/mL de hidrocortisona, 1,08 mg/mL Putrescina.2HCI, E: Elementos em Traços E.

Tabela 19: Composição de Elementos em Traços E
Elementos em Traços	pg/L	nM
(N H4)6 Μο7024·4 H20	123,60	100,00
AICI3.6H20	0,48	2,00
H3B03	6 ,18	100,00
CrCI3	7,92	50,00
CuSO4.5H2O	49,94	200,00
Ge02	0,21	2,00
KBr	0,24	2,00
Kl	16,60	100,00
LiCI	0,08	2,00
MnSO4»H2O	16,90	100,00
Na2SiO3.9H20	142,03	500,00
NaF	0,08	2,00
NH4VO3	1,17	10,00
NiSO4’6H20	2,63	10,00
RbCI	0,24	2,00
SnCI2*2H20	0,45	2,00
Sodium Selenite	34,58	200,00

Resultados e Conclusões

Todas as condições testadas exibiram diminuídos níveis de lactato e amôniono fim do processo de cultura exceto para Meio 1 contendo aminoácidos adicionados, indicando que aumentados níveis de aminoácidos em Meio 9 comparado a Meio 1 provavelmente não são responsáveis pelas diminuições em níveis de lactato e amônio (ver Figuras 49 e 50). Entretanto, Meio 1 contendo vitaminas hidrocortisona e putrescina, elementos em traços Ee ferro adicionados exibiu menores níveis de lactato e amônio no fim do processo de cultura comparado a Meio 1 contendo aminoácidos adicionados (ver Figuras 49 e 50). Isto indica que estes componentes podem ser responsáveis pelas diminuições observadas em Meio 9.

Culturas crescidas em Meio 1 contendo vitaminas, hidrocortisona e putrescina, elementos em traços E e ferro adicionados exibiram os mais baixos níveis de amônio por todo o experimento devido às menores quantidades totais de asparagina e glutamina nos meios de partida (ver Figura 50).

Exemplo 12. Q efeito de vitamina, elementos em traços E e níveis de ferro sobre a diminuição observada em níveis de lactato e amônio em células antiGDF-8 cultivadas em Meio 9,

No exemplo 11, foi determinado que os aumentados níveis de vitaminas, hidrocortisona e putrescina, elementos em traços E e ferro em Meio 9 em relação a Meio 1 podem ser responsáveis pela diminuição em níveis de lactato e amônio observados no fim do processo de cultura. Aqui, estes componentes foram testados individualmente e em combinação para determinar qual, se algum, foi responsável pela diminuição observada. Materiais e Processos

Células anti-GDF-8 foram cultivadas em bio-reatores de 1 L por 12 dias. Células foram inicialmente cultivadas a 37°C e foram mudadas para 31 °C no dia 4 em 8-10x10⁶ células/mL, com a exceção de Meio 1 contendo elementos em traços E, que que foram mudados no dia 4 em cerca de 6x10® células/mL. A Tabela 20 lista as várias condições experimentais testadas. Hidrocortisona e putrescina foram adicionadas a todas as condições de Meio 1 de modo que os níveis destes componentes foram idênticos aos níveis em Meio 9. Vitamina, elementos em traços E (composição listada na Tabela 19) e ferro foram adicionados às várias condições experimentais de Meio 1 de modo que os níveis destes componentes foram iguais aos níveis em Meio 9. Amostras foram tomadas diariamente e salvas para análise de título por HPLC Proteína ^a

Tabela 20. Condições testadas de aminoácido e vitamina

Média	Gin	Asn	Feed Meio 5 30%	Temp	Dia 4 Dia 5 8% Meio	Dia 7 Dia 10 12%
Meio 1+Fe	13	15	total Meio 5 30%	dia 4	5 mM Gin, dia 4 5 8% Meio	Meio 5 8% Meio 12%
Meio 1+E	13	15	total Meio 5 30%	dia 4	5 mM Gin, dia 4 5 8% Meio	Meio 5 8% Meio 12%
Meio 1+Vit	13	15	total Meio 5 30%	dia 4	5 mM Gin, dia 4 5 8% Meio	Meio 5 8% Meio 12%
Meio 1+Fe+E	13	15	total Meio 5 30%	dia 4	5 mM Gin, dia 4 5 8% Meio	Meio 5 8% Meio 12%
Meio 1+Fe+Vit	13	15	total Meio 5 30%	dia 4	5 mM Gin, dia 4 5 8% Meio	Meio 5 8% Meio 12%
Meio 1+E+Vit Meio 9 with 13	13	15	total Meio 5 30%	dia 4	5 mM Gin, dia 4 5 8% Meio	Meio 5 8% Meio 12%
mM Gin	13	20	total	dia 4	5 mM Gin, dia 4 5	Meio 5 8% Meio

Nota: E: elementos em traços E.

Resultados e Conclusões

De todas as condições testadas, somente Meio 9 contendo glutamina 13 mM e Meio 1 contendo elementos em traços E exibiram níveis diminuídos de lactato e amônio no fim do processo de cultura (ver Figuras 54 e 55). Deve ser notado que os diminuídos níveis observados para Meio 1 contendo elementos em traços E podem ser devidos ao fato de que esta cultura teve temperatura mudada quando as células estavam em cerca de 6x10⁶ células/mL.

Meio 9 contendo glutamina 13 mM exibiu maior título anti-GDF-8 que qualquer uma das formulações de Meio 1.

Exemplo 13. Comparação de Meios 1, 3 e 9 sobre crescimento de célula e título anti-GDF-8

Este experimento foi realizado para medir as diferenças em crescimento de célula e título anti-GDF-8 usando Meios 1, 3 e 9. Materiais e Processos

Células anti-GDF-8 foram cultivadas em vários meios e sob condições de alimentação como listadas na Tabela 21. Informação de meios pertinente é listada na Tabela 22. Células foram crescidas em bio-reatores de 1 L por 12 dias e foram mudadas de 37°C para 31 °C no dia 4.

Tabela 21. Condições testadas de meios e alimentação

				Alimenta- ção
Meios	Asn	Gin	Dia 3	Dia 4	Dia 5	Dia 6	Dia 7	Dia 10	Dia 11
Meio 3	14 mM	4 mM	3,3% Meio 5 -Gin	3,3% Meio 5-Gin	3,3% Meio 5 -Gin	3,3% Meio 5 -Gin	10% Meio 5 -Gin	3,3% meio 5 -Gin	3,3% Meio 5 - Gin
Meio 3	14 mM	4 mM	3,3% Meio 5 -Gin	3,3% Meio 5-Gin	3,3% Meio 5 -Gin	3,3% Meio 5 -Gin	10% Meio 5 -Gin	3,3% Meio 5 -Gin	3,3% Meio 5 - Gin
Meio 1	14 mM	4 mM			8% Meio 5 -Gin		12% Meio 5 -Gin	8% Meio 5 -Gin
Meio 9	20 mM	4 mM				5% Meio 5 -Gin

Nota: Meio 5 -Gin - Meio 5 carecendo de glutamina

abela 22, Resumo de meios

Média	Asn	Gin	Feed	AA(Starting)/(Total)	lon/Total AA
Meio 3	14	4 mM	34% Meio 5-Gln	34 mM/64 mM	1.75
Meio 9	20	4 mM	5% Meio 5-Gln	91.4 mM/94.3 mM	.72
Meio 1	14	4 mM	31.6% Meio 5-	78 mM/96.4 mM	.74

Resultados e Conclusões

Células anti-GDF-8 cultivadas em Meio 9 exibiram a mais alta densidade de células e título anti-GDF-8, enquanto células anti-GDF-8 culti5 vadas em Meio 3 exibiram a mais baixa densidade de células e título antiGDF-8 (ver Figuras 57 e 58). O fato de que Meio 9 produz resultados superiores a Meio 1 indica que é melhor prover os componentes de meios nos meios de partida antes que prover os mesmos através de alimentações múltiplas. Adicionalmente, o fato de que ambos Meio 1 e Meio 9 desempenham melhor que Meio 3 indica que provimento de aminoácidos em concentrações maiores que cerca de 70 mM provê resultados superiores do que provendo aminoácidos em concentrações de menos que cerca de 70 mM. Finalmente, provimento de aminoácidos em concentrações maiores que cerca de 70 mM nos meios de partida resulta nas mais altas densidades de células e títulos (comparar Meio 9 vs. Meio 1). ·

Exemplo 14. Análise estatística de níveis ótimos totais de glutamina e asparagina em Meio 9 para cultura de células anti-GDF-8 em bio-reatores

Materiais e Processos

Células anti-GDF-8 foram crescidas em bio-reatores de 1 L e foram mudadas de 37°C para 31 °C nos dias indicados na Tabela 23. Títulos finais foram submetidos a um teste-T de modo a determinar o nível ótimo de glutamina sozinha e o nível ótimo de glutamina e asparagina combinadas total. A Tabela 23 resume algumas condições experimentais relevantes e resultados finais para células anti-GDF-8 crescidas em Meio 9.

Tabela 23. Condições experimentais relevantes e resultados finais para células anti-GDF-8 crescidas em Meio 9

Meios	Gin (mM)	Asn (mM)	Dia de mudança de alimentação	Titulo WmL)	Título/1200	Gin to- tai	Asn to- tal	total
Meio 9	1	8	6 5% Meio 5-Gln	615,2	0,51	1	9
Meio 9	1	8	6 5% Meio 5-Gln	857,1	0,71	4	9
Meio 9	1	12	6 5% Meio 5-Gln	947	0,79	1	13
Meio 9	4	12	4 5% Meio 5-Gin	1184	0,99	4	13
Meio 9	4	20	4 5% Meio 5-Gln	769,6	0,64	1	21
Meio 9	4	8	5 5% Meio 5-Gln	1262,6	1,05	13	9
Meio 9	4	20	4 5% Meio 5-Gln	1198	1,00	4	21
Meio 9r	4	20	4 5% Meio 5-Gln	1321,1	,10	4	21
Meio 9	4	20	4 5% Meio 5-Gln	1162,4	0,97	4	21
Meio 9	13	20	4 5% Meio 5-Gln	1436,6	1,20	4	21
Meio 9	15	12	4 5% Meio 5-Gln	1638,6	1,37	13	13
Meio 9	13	12	4 5% Meio 5-Gln	1606,7	1,34	13	13
Meio 9	13	20	4 5% Meio 5-Gln	1075,91	0,90	13	21
Meio 9	13	20	4 5% Meio 5-Gln	1058,4	0,88	13	21
Meio 9	13	20	4 5% Meio 5-Gln	1075,91	0,90	15	21
Meio 9	13	5	4 Asn, Gin, 5% Meio 5-Gln	974,52	0,81	28,5	11
Meio 9	13	20	4 Asn, Gin, 5% Meio 5-Gln	831,81	0,69	28,5	26
Meio 9	13	20	4 Meio 5, 30% total, 5 mM Gin	975,4	0,81	28,5	26
Meio 9	13	20	4 Meio 5, 30% total, 5 mM Gin	973,5	0,81	28,5	26

Nota: Meio 5-Gln - Meio 5 carecendo de glutamina

Resultados e Conclusões

A Figura 59 mostra títulos anti-GDF-8 extrapolados para vários níveis de glutamina sozinha e glutamina e asparagina combinadas total. A Tabela 24 mostra os resultados de um teste-T comparando título normalizado de níveis de glutamina entre 2 e 15 mM e níveis de glutamina fora desta faixa. A Tabela 25 mostra os resultados de um teste-T comparando título normalizado de níveis de glutamina e asparagina combinadas entre 16 e 36 mM e níveis de glutamina e asparagina combinadas fora desta faixa.

Ambos resultados de teste-T indicaram signlficantes diferenças em títulos anti-GDF-8 entre os dois grupos que foram comparados. Culturas crescidasw em Meio 9 contendo entre 2 e 15 mM de glutamina e entre 16 e

mM de glutamina e asparagina combinadas exibiram maiores títulos de anti-GDF-8 que culturas crescidas em meios com níveis de glutamina e glutamina e asparagina combinadas que caem fora destas faixas. Em todos os experimentos, níveis de asparagina foram maiores que 9 mM.

Tabela 24 Resultados de teste-T comparando título normalizado de condições 2 mM<Gln<15 mM versus Gln>15 mM, Gln<2 mM

Título normalizado	Gln>15, Gln<2	2<Gln<15
Média	0,724649917	1,033147493
Variância	0,013326655	0,036834109
Observações	7	12
Variância reunida	0,028537361
Diferença média hipótese	0
df	17
tStat	-3,839791986
P (T<=t) uma-cauda	0,000656219
T crítica uma -cauda	1,739606432
P(T<=t) duas-caudas	0,001312438
T crítica duas-caudas	2,109818524

Tabela 25. Resultados de teste-T comparando título normalizado de condições 16 mM<Gln+Asn<36 mM versus Gln+Asn>36 mM, Gln+Asn<16 mM.

Título normalizado	Asn+Gln>36, Asn+Gln<16	16<Asn+Gln<36
Variância reunida	0,735066584	1,027071104
Diferença média hipótese	0,012061148	0,041504987
df	7	12
T Stat	0,031113044
P (T<=t) uma-cauda	0
T crítica uma -cauda	17
P(T<=t) duas-caudas	-3,480816823
T crítica duas-caudas	0,001430281

Exemplo 15. Efeitos de meio sobre cultura de células

Este exemplo investigou a performance de três variações de meio de cultura de células em escala intermediária utilizando culturas sementes de alta densidade. Todos os meios testados foram esperados mos5 trarem aperfeiçoamentos sobre o meio de Fase 1 (Meio 10 alimentado com meio de alimentação Meio 11), baseado em dados de bio-reator de pequena escala.

Materiais e Processos

Células CHO expressando um anticorpo monocional lgG1 peptí10 deo anti-Abeta humanizado (“células anti-ABeta”) foram testadas em vários meios, como mostrado na Tabela 26 (ver Basi et al., Humanized Antibodies that Recognize Beta Amyloid Peptide, WO 02/46237). O ponto de fixação de extremidade inferior de pH foi 7,0 controlado com Na2CO₃ 0,95 M + K2CO3 0,05 M, exceto para Fase 1, que foi controlada com uma solução contendo bicarbonato de sódio em 0,58 M e carbonato de sódio em 0,71 M. Oxigênio dissolvido foi controlado em 30% através de espargimento com demanda de ar, agitação foi em 60 rpm, e o meio de alimentação foi Meio 5 (com ou sem glutamina, como notado). Todas as culturas foram crescidas em escala de 130 L exceto para 03P49B501, que foi crescida em escala de 500 L. Em re20 sumo, Meio 1 é enriquecido com todos os nutrientes, sem condideração para taxas de tomada relativa, enquanto Meio 12foi balanceado através de remoção de nutrientes aparentemente desnecessários a partir da versão indiscriminadamente enriquecida. As composições de Meios 10, 11 e 12 são listadas na Tabela 27.

Tabela 26. Meio inicial, quantidades de alimentação e fontes sementes para corridas pilotos

N°- de	Descrição	Meio	Quantida-	Alimen-	Fonte	Se-	Densidade
batelada		Inicial	de alimentada	tação de Gin?	mente		de Semente (viáveis/mL)
1	Fase 1	Meio 10	38%*	Sim	Bolsas onda	de	0,2x106
2	Meio rico, alto teor de Gin (1)	Meio 1	16%	Sim	Bolsas onda	de	0,2x106
3.	Med rico, alto teor de Gin (2)	Meio 1	16%	Sim	Bolsas ondas	de	0,2x106
4	Meio rico, menor teor de Gin	Meio 1	15%	Não	Bolsas ondas	de	0,2x106
5	Meio balanceado, baixo teor Gin (1)	Meio 12	10%	Não	Bolsas ondas	de	0,2x106
6	Meio bal, baixo Gin (2)	Meio 12	9%	Não	Bolsas ondas	de	0,2x106
7	Meio bai, baixo Gin, semente densa	Meio 12	5%'	Não	Bio-reator de alta densidade	2,0x106

Ό processo de Fase 1 foi alimentado com Meio 12, que não é tão rico como Meio 5.

Tabela 27. Composições de Meios 10, 11 e 12

	Meio 10	Meio 11	Meio 12
Aminoácidos
Alanina	24,87	0,28	142,48	1,60	17,80	0,20
Arginina	423,43	2,43	1528,84	8,79	696,00	4,00
AsparagÍna.t-bO	173,90	1,16	1080,60	7,20	1500,00	10,00
Ácido aspártico	52,72	0,40	532,40	4,00	219,45	1,65
Cisteina.HCI.H2O	70,01	0,40			70,40	0,40
Cisteína.2HCI	62,09	0,20	470,00	1,50	312,50	1,00
Ácido glutâmico	41,08	0,28	235,38	1,60

	Meio 10	Meio 11	Meio 12
Aminoácidos
Glutamato de mono-sódio					33,80	0,20
Glutamina	1162,40	7,96	6000,00	41,10	584,00	4,00
Glicina	35,92	0,48	120,07	1,60	115,50	1,54
Histidina.HCI.H2O	75,27	0,36	588,32	2,80	369,60	1,76
Isoleucina	151,90	1,16	944,52	7,21	370,73	2,83
Leucina	172,69	1,32	1360,75	10,39	615,70	4,70
Lisina.HCI	218,38	1,20	1456,80	8,00	946,40	5,20
Metionina	53,55	0,36	477,06	3,20	387,40	2,60
Fenilalanina	98,81	0,60	660,36	4,00	363,00	2,20
Prolina	96,40	0,84	552,31	4,80	471,50	4,10
Serina	273,07	2,60	1264,70	12,04	903,00	8,60
Treonina	132,81	1,12	762,02	6,40	380,80	3,20
Triptofano	28,99	0,14	260,94	1,28	212,16	1,04
Tirosina.2Na.2H2O	145,10	0,56	832,62	3,19	456,75	1,75
Valina	131,17	1,12	749,21	6,40	468,00	4,00
Vitaminas	mg/L	mM	mg/L	mM	mg/L	mM
Biotina	0,36	1,49	3,28	13,45	2,68	11,00
Pantotenato de cálcio	4,03	8,47	36,02	75,67	21,93	46,06
Cloreto de colina	16,11	115,92	143,28	1030	116,76	840,00
Ácido fólico	4,76	10,80	42,43	96,22	25,93	58,80
Inositol	22,64	125,79	201,71	1120	163,98	911,00
Nicotinamida	3,61	29,62	32,02	262,44	26,23	215,00
Piridoxal.HCI	1,99	9,83			2,03	10,00
Piridoxina.HCI	1,67	8,10	32,82	159,31	18,13	88,00
Riboflavina	0,40	1,06	3,60	9,58	0,41	1,10
Tiamina.HCl	3,92	11,64	35,22	104,51	39,43	117,00
Vitamina B12	1,34	0,99	11,21	8,27	10,57	7,80
Sais inorgânicos	mg/L	mM	mg/L	mM	mg/L	mM
CaCI2	115,78	1,04	113,27	1,02	116,55	1,05
KCI	310,94	4,17			312,90	4,19

0//

	Meio 10	Meio 11	Meio 12
Aminoácidos
KH2PO4			1640,00	12,06
Na2HPO4	70,81	0,50			56,60	0,40
NaCl	3704,96	63,44
NaH2PO4’H20	114,53	0,83			645,84	4,68
MgSO4	48,70	0,41			138,00	1,15
MgSO4'7H20	8,60	0,03	170,00	0,69
MgCI2	28,53	0,30			28,50	0,30
NaHCO3	1220,00	14,52			2000,00	23,81
Elementos em traços	pg/L	nM	pgiL	nM	pg/L	nM
Selenito de sódio	7,00	40,49	40,00	231,35	53,65	310,27
Fe(NO3)3'9H20	49,86	123,42			50,00	123,76
CuSO4	0,97	6,06	3,44	21,51	10,00	62,50
CuSO4'5H2O	7,49	30,00	7,49	30,00	49,94	200,00
FeSO4.7H20	1542	5549	2534	9115	3366	12000
ZnSO4.7H20	1383	4821 .	2704	9421	2640	9198
MnSO4«H20	0,17	1,01	0,17	1,01	16,90	100,00
Na2Si03.9H20	140	492,84	140,00	492,84	142,03	500,00
(N H4)6Mo7O24.4 H20	1,24	1,00	1,24	1,00	123,60	100,00
NH4VO3	0,65	5,56	0,65	5,56	1,17	10,00
NÍSO4.6H20	0,13	0,49	0,13	0,49	2,63	10,00
SnCI2.2H20	0,12	0,53	0,12	0,53	0,45	2,00
AICI3.6H20			1,20	4,97	0,48	2,00
Ag NO3			0,17	1,00
Ba(C2H302)2			2,55	9,98
KBr			,12	1,01	0,24	2,00
CdCI2.2.5H20			2,28	9,99
CoCI2.6H2O			2,38	10,00
CrCI3			0,32	2,02	7,92	50,00
NaF			4,20	100,02	0,08	2,00
Ge02			0,53	5,07	0,21	2,00
Kl			0,17	1,02	16,60	100

6//

	Meio 10	Meio 11	Meio 12
Aminoácidos
RbCI			1,21	10,01	0,24	2,00
ZrOCI2.8H20			3,22	9,99
H3B03					6,18	100,00
LiCI					0,08	2,00
Outros componentes	pg/L	pM	pg/L	pM	pgiL	PM
Hidrocortisona	86,40	,24	288,00	0,79	360,00	0,99
Putrescina.2HCI	2480	15,39	8000	49,66	10000	62,07
Ácido linoléico	56,69	0,20	336,25	1,20	290,00	1,04
Écido tióctico	141,71	0,69	840,63	4,08	716,00	3,48
Outros componentes	mg/L	mM	mg/L	mM	mg/L	mM
D-glucose (dextrose)	11042,2 4	61,35	43005,99	238,92	15000,00	83,33
PVA	2520,00		2400,00		2560,00
Nucellin®	14,00		80,00		50,00
Piruvato de sódio	54,85	0,50 .			55,00	0,50

Resultados e Conclusões

Mudanças de meios conduziram a estável aperfeiçoamento através do curso destes experimentos. Em termos de crescimento de células, viabilidade, níveis reduzidos de lactato, níveis reduzidos de amônio, e título, reduzidos níveis de glutamina foram melhores que níveis elevados (ver Figuras 60-64) e meio balanceado (batelada) foi melhor que meio rico (Meio 1, ver Figuras 60-64). Culturas iniciadas de alta densidade de inoculum exibiram maior título final que culturas que partiram de menor densidade de inoculum (ver Figura 64).

Diferente do que foi observado em bio-reatores de pequena escala, o primeiro meio (Meio 1 com alta Gin) resultou em menores títulos que o processo original (ver figura 64). Também não houve mudança para tomada de lactato após a mudança de temperatura (ver Figura 62). Isto sugere que pode haver alguma sensibilidade de escala com este meio. Esta conclu15 são é suportada por corridas paralelas de pequena escala (2 L) que foram

100 feitas junto com estes experimentos de escala intermediária (dados não mostrados). As últimas formulações de meios contendo menos glutamina não foram sensíveis a escala, pelo menos nestes experimentos (ver Figuras 60-65). Os processos duplicados (bateladas 2 e 3 e Bateladas 5 e 6) mostra reproduzibilidade de corrida-para-corrida muito boa (ver Figuras 60-65), aumentando a confiança em todos os dados reunidos nesta campanha.

Exemplo 16. Produção de TNFR-lg usando Meio 9

Materiais e Processos

Células CHO expressando uma proteína de fusão dimérica consistindo na porção de ligação - ligante extracelular do receptor de fator de necrose de tumor humano de 75 quilodálton (p75) (TNFR) ligado à porção Fc de lgG1 (“células TNFR-lg”) foram semeadas em alta densidade a partir de um reator de perfusão e diluídas ára 3x10® células viáveis /mL em Meio 9 para a etapa de bio-reator de produção.

Resultados e Conclusões

As Figuras 66, 67, 68, 69, 70, 71 e 72 mostram crescimento de célula, viabilidade de célula, glucose residual, níveis de glutamina, concentração de lactato, concentração de amônio, e título relativo de produto, respectivamente. Sob a faixa de menores modificações para o processo, todas as condições renderam bom crescimento de célula, alta viabilidade celular, e alto título total final.

Para todas condições deste experimento, o subproduto inibidor metabólico lactato foi tanto consumido, como a concentração estabilizou, sugerindo que produção de lactato foi impedida. Similarmente, para o metabóiito inibidor amônio, níveis elevaram-se inicialmente, mas em algu m tempo após a mudança de temperatura o amônio começou a ser consumido pelas células. Neste exemplo, as culturas de células TNFR-lg foram submetidas aos indutores químicos butirato de sódio, e HMBA.

Exemplo 17. Comparação de condições de cultura de larga e pequena escala

Materiais e Processos

Para determinar se o tamanho da cultura afetou relevantes ca-

101 racterísticas de cultura, células anti-GDF-8 foram crescidas em bio-reatores de pequena escala de 1 litro ou bio-reatores de larga escala de 6000 litros. Células foram crescidas a 37°C e mudadas para 31 °C no dia 4.

Resultados e Conclusões

Como pode ser visto nas Figuras 73, 74, 75 e 76 (que mostram densidade de célula, título, níveis de lactato e níveis de amônio, respectivamente), não existiram diferenças relevantes entre as culturas de pequena escala de 1 litro e de grande escala de 6000 litros para estas características. Ambos níveis de lactato e amônio começaram a diminuir após a mudança de temperatura no dia 4. Este exemplo demonstra que o tamanho da cultura não afeta densidade de células, viabilidade de células, níveis de lactato e níveis de amônio quando as culturas são submetidas às mesmas condições de crescimento.

Claims (30)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Processo de produção de etanercept em cultura de células de produção em larga escala, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de:

   5 provimento de uma cultura de célula compreendendo:

   células CHO que contêm um gene codificando etanercept, cujo gene é expresso sob condição de cultura de célula; e um meio contendo glutamina e tendo uma característica de meio selecionada do grupo consistindo em: (i) uma quantidade de aminoácido 10 cumulativa por volume unitário maior que 70 mM, (ii) uma razão molar de glutamina cumulativa para asparagina cumulativa menor que 2, (iii) uma razão molar de glutamina cumulativa para aminoácido total cumulativo menor que

   0,2, (iv) uma razão molar de íon inorgânico cumulativa para aminoácido total cumulativo entre 0,4 e 1, (v) uma quantidade cumulativa combinada de

   15 glutamina e asparagina por volume unitário maior que 16 mM;

   em que a quantidade total cumulativa de histidina, isoleucina, leucina, metionina, fenilalanina, triptofano, tirosina e prolina por volume unitário no referido meio é superior a 25 mM;

   em que a concentração inicial de glutamina do referido meio é 20 inferior ou igual a 10 mM;

   em que a densidade inicial das referidas células de mamífero é pelo menos 2x10⁵ células/ml;

   manutenção da dita cultura em uma fase de crescimento inicial sob um primeiro conjunto de condições de cultura por um primeiro período de

   25 tempo suficiente para permitir que as ditas células reproduzam para uma densidade de célula viável dentro de uma faixa de 20% - 80% da densidade de célula viável máxima possível se a dita cultura fosse mantida sob o primeiro conjunto de condições de cultura;

   em que o primeiro conjunto de condições compreende uma

   30 primeira faixa de temperatura que é de 30 a 42 Ό;

   em que o referido primeiro período de tempo está entre 1-7 dias;

   alteração de pelo menos uma das condições de cultura, de modo

   Petição 870180145134, de 26/10/2018, pág. 13/27 que um segundo conjunto de condições de cultura seja aplicado;

   manutenção da dita cultura por um segundo período de tempo sob o segundo conjunto de condições e por um segundo período de tempo de modo que o etanercept se acumule na cultura de células,

   5 em que o referido segundo conjunto de condições compreende uma segunda faixa de temperatura que é de 29 a 35 °C;

   em que o total do referido primeiro período de tempo e o referido segundo período de tempo é de pelo menos 5 dias;

   em que a cultura de células de produção em larga escala é pelo

   10 menos 500L.
2. 2. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o dito meio tem duas características de meio selecionadas do grupo consistindo em: (i) uma quantidade de aminoácido cumulativa por volume unitário maior que 70 mM, (ii) uma razão molar de glutamina

   15 cumulativa para aminoácido total cumulativo de menos que 0,2, (iii) uma razão molar de íon inorgânico cumulativo para aminoácido cumulativo entre 0,4 e 1, (iv) uma quantidade cumulativa combinada de glutamina e asparagina por volume unitário maior que 16 mM.
3. 3. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo

   20 fato de que a concentração inicial de glutamina do dito meio é menor que ou igual a 4 mM.
4. 4. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a quantidade cumulativa total por volume unitário de glutamina do dito meio é menor que ou igual a 10 mM.

   25 5. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a quantidade cumulativa total por volume unitário de glutamina do dito meio é menor que ou igual a 4 mM.

   6. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que glutamina é somente provida no meio inicial no início da cultura

   30 de células.

   7. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a densidade inicial das ditas células mamíferas é pelo menos

   Petição 870180145134, de 26/10/2018, pág. 14/27

   2x10⁶ células/mL.

   8. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a etapa de provimento compreende provimento pelo menos 1.000 L de uma cultura.
5. 5 9. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a etapa de provimento compreende provimento pelo menos 10.000 L de uma cultura.
6. 10. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o dito primeiro conjunto de condições compreende uma primeira

   10 faixa de temperatura que é 37 graus Celsius.
7. 11. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o dito segundo conjunto de condições compreende uma segunda faixa de temperatura que é 31 graus Celsius.
8. 12. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo 15 fato de que compreende ainda uma segunda etapa de mudança subsequente à dita primeira mudança de pelo menos uma das condições de cultura compreendendo mudança de pelo menos uma das condições de cultura, de modo que um terceiro conjunto de condições é aplicado à cultura.
9. 13. Processo de acordo com a reivindicação 12, caracterizado 20 pelo fato de que o dito terceiro conjunto de condições compreende uma terceira faixa de temperatura que é de 27 a 37 graus Celsius.
10. 14. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o dito primeiro período de tempo é de 4 dias.
11. 15. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo 25 fato de que a dita cultura de células é ainda provida com componentes suplementares.
12. 16. Processo de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que os ditos componentes suplementares são providos em intervalos múltiplos.

    30
13. 17. Processo de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que os ditos componentes suplementares são selecionados de um grupo consistindo em hormônios e/ou outros fatores de crescimento, íons

    Petição 870180145134, de 26/10/2018, pág. 15/27 particulares (como sódio, cloreto, cálcio, magnésio e fosfato), tampões, vitaminas, nucleosídeos ou nucleotídeos, elementos em traços (compostos inorgânicos usualmente presentes em concentrações finais muito baixas), aminoácidos, lipídeos, ou glicose ou outra fonte de energia.

    5
14. 18. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o referido meio é um meio definido contendo glutamina e tendo pelo menos duas características de meio selecionadas do grupo consistindo em: (i) uma concentração inicial de aminoácido maior que 70 mM, (ii) uma razão molar de glutamina para asparagina menor que 2, (iii) uma razão molar

    10 de glutamina para aminoácido total menor que 0,2, (iv) uma razão molar de íon inorgânico para aminoácido total de 0,4 a 1, e v) uma concentração combinada de glutamina e asparagina maior que 16 mM.
15. 19. Processo de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que o meio é um meio definido contendo glutamina e tendo pelo

    15 menos três características de meio selecionadas do grupo consistindo em: (i) uma concentração inicial de aminoácido maior que 70 mM, (ii) uma razão molar de glutamina para asparagina menor que 2, (iii) uma razão molar de glutamina para aminoácido total menor que 0,2, (iv) uma razão molar de íon inorgânico para aminoácido total de 0,4 a 1, e v) uma concentração combinada
16. 20 de glutamina e asparagina maior que 16 mM.

    20. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o dito meio compreende um meio contendo glutamina e tendo uma característica de meio selecionado do grupo consistindo em:

    (i) uma concentração inicial de aminoácido maior que 70 mM, (ii) 25 uma razão molar de glutamina para asparagina menor que 2, (iii) uma razão molar de glutamina para aminoácido total menor que 0,2, (iv) uma razão molar de íon inorgânico para aminoácido total de 0,4 a 1, e v) uma concentração combinada de glutamina e asparagina maior que 16 mM.
17. 21. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo 30 fato de que a dita cultura não é suplementada com componentes adicionais sobre o curso de produção do dito etanercept.
18. 22. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo

    Petição 870180145134, de 26/10/2018, pág. 16/27 fato de que glicil glutamina é substituta para glutamina na dita cultura.
19. 23. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a quantidade total cumulativa de histidina, isoleucina, leucina, metionina, fenilalanina, prolina, triptofano, tirosina, e prolina por volume

    5 unitário no dito meio é maior que 35 mM.
20. 24. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o dito meio tem uma característica de meio selecionada do grupo consistindo em:

    (i) uma quantidade total cumulativa de histidina por volume 10 unitário maior que 1,7 mM;

    (ii) uma quantidade total cumulativa de isoleucina por volume unitário maior que 3,5 mM;

    (iii) uma quantidade total cumulativa de leucina por volume unitário maior que 5,5 mM;

    15 (iv) uma quantidade total cumulativa de metionina por volume unitário maior que 2,0 mM;

    (v) uma quantidade total cumulativa de fenilalanina por volume unitário maior que 2,5 mM;

    (vi) uma quantidade total cumulativa de prolina por volume unitário 20 maior que 2,5 mM;

    (vii) uma quantidade total cumulativa de triptofano por volume unitário maior que 1,0 mM;

    (viii) uma quantidade total cumulativa de tirosina por volume unitário maior que 2,0 mM;
21. 25 (ix) uma quantidade total cumulativa de prolina por volume unitário maior que 2,5 mM.

    25. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a quantidade total cumulativa de serina por volume unitário no dito meio é maior que 10 mM.

    30
22. 26. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a quantidade total cumulativa de asparagina por volume unitário no dito meio é maior que 8 mM.

    Petição 870180145134, de 26/10/2018, pág. 17/27
23. 27. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a quantidade total cumulativa de asparagina por volume unitário no dito meio é maior que 12 mM.
24. 28. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo 5 fato de que a quantidade total cumulativa de fosforoso por volume unitário no dito meio é maior que 5 mM.
25. 29. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a quantidade total cumulativa de glutamato por volume unitário no dito meio é maior que 1 mM.

    10
26. 30. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a quantidade total cumulativa de pantotenato de cálcio por volume unitário no dito meio é maior que 20 mg/L.
27. 31. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a quantidade total cumulativa de nicotinamida por volume unitário

    15 no dito meio é maior que 25 mg/L.
28. 32. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a quantidade total cumulativa de piridoxina e piridoxal por volume unitário no dito meio é maior que 35 mg/L.
29. 33. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo 20 fato de que a quantidade total cumulativa de riboflavina no dito meio é maior que 2,0 mg/L.
30. 34. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a quantidade total cumulativa de cloridrato de tiamina por volume unitário no dito meio é maior que 7 mg/L.