ES2624185T3 - Método de cultivo celular que utiliza un medio enriquecido con aminoácidos - Google Patents
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Abstract
Un método de cultivo de una célula CHO mediante cultivo semi-continuo, que comprende la adición de un medio semi-continuo que comprende serina, cisteína y tirosina, donde el medio semi-continuo se alimenta en la solución de cultivo en múltiples lotes secuencial o continuamente, caracterizado por que la concentración de serina en la solución de cultivo se mantiene a 2 mM o más alta, y la concentración de tirosina en la solución de cultivo se mantiene a 1 mM o más alta, donde la concentración de serina y tirosina se mantienen durante un periodo desde el cuarto día al décimo día del cultivo y donde la concentración de cisteína en la solución de cultivo puede ser de 0,4 mM o más alta durante una parte de o un periodo de cultivo completo a partir del tercer día del cultivo, donde dicho método se utiliza en un procedimiento que comprende el cultivo de una célula capaz de producir una proteína deseada para obtener la proteína deseada.
Description
Se puede utilizar serina sola, derivados de la misma, y sales de la misma. Se puede utilizar serina natural, serina sintética, o serina producida por recombinación genética. La concentración de serina en la solución de cultivo es, por ejemplo, 1 mM o más alta, preferiblemente 2 mM o más alta al menos durante un periodo predeterminado en el cultivo. Un medio que comprende serina utilizado convencionalmente normalmente comprende aproximadamente
5 0,5 mM de serina, por lo tanto se reconoce que la concentración de serina en la presente divulgación es significativamente alta (Dulbecco, R., Freeman, G. Virology 8, p396 (1959), Nature, New Biology (1971) 230, p52)).
De manera similar, se puede utilizar cualquiera de entre tirosina sola, derivados de la misma, y sales de la misma. Se puede utilizar tirosina natural, tirosina sintética, o tirosina producida por recombinación genética. De manera similar se puede utilizar cualquiera de entre cisteína sola, derivados de la misma y sales de la misma, incluyendo cisteína que sea un dímero de cisteína. Se puede utilizar cisteína natural, cisteína sintética, o cisteína producida por recombinación genética. La concentración de tirosina en la solución de cultivo es de 1 mM o más alta y/o la concentración de cisteína es la concentración de cisteína del medio inicial o más alta al menos durante un periodo predeterminado durante el cultivo.
15 En el caso de emplear el cultivo semi-continuo como método de cultivo de células en la presente divulgación, la serina y tirosina y/o cisteína se disuelven a altas concentraciones para enriquecer un medio semi-continuo y se añade el medio semi-continuo o bien continuamente o secuencialmente durante el cultivo de manera que las concentraciones de estos aminoácidos se mantengan en concentraciones predeterminadas o más altas. Específicamente, por ejemplo, se puede utilizar un medio semi-continuo que comprenda L-serina a una concentración de aproximadamente 10-1000 mM, preferentemente 20-500 mM, más preferentemente 50-200 mM, en el medio semi-continuo. De manera alternativa, se puede utilizar un medio semi-continuo que comprenda Ltirosina a una concentración de aproximadamente 0,01-1000 mM, preferentemente 1-200 mM, más preferentemente 10-100 mM, o un medio semi-continuo que comprenda clorhidrato de L-cisteína monohidrato a una concentración de
25 aproximadamente 0,01-500 mM, preferentemente 0,1-50 mM, más preferentemente 1-10 mM, en el medio semicontinuo.
En el caso en el que se añada el medio semi-continuo a la solución de cultivo descrita en el presente documento, una cantidad de medio semi-continuo que se va a añadir secuencial o continuamente durante un periodo de cultivo o durante un cierto periodo durante el periodo de cultivo puede ser del 1-150 %, preferentemente 5-50 %, más preferentemente 8-20 %, o una cantidad del medio inicial.
En la presente divulgación, un periodo de adición del medio semi-continuo a la solución de cultivo incluye al menos una parte de o un periodo completo desde el punto de inicio al punto final de la fase de crecimiento celular del 35 cultivo. Un periodo preferido es un periodo desde al menos 4 días después del punto de inicio de la fase de crecimiento exponencial (normalmente alrededor del día 3 del cultivo) de las células que se van a cultivar, preferentemente desde 3 días después del punto de inicio de la fase de crecimiento exponencial, más preferentemente desde el punto de inicio de la fase de crecimiento exponencial (normalmente alrededor del día 3 del cultivo). Es preferible iniciar la alimentación al menos a los 3 días desde el momento en que la concentración del aminoácido en la solución de cultivo alcanza una concentración predeterminada o menor, preferentemente el día 1, más preferentemente antes de que la concentración del aminoácido alcance la concentración predeterminada. En los casos en los que el periodo de cultivo no es mayor de dos semanas, la alimentación se puede llevar a cabo o continuar al menos hasta el décimo día del cultivo, preferentemente hasta 5 días antes del final del cultivo, preferentemente 4 días antes, más preferentemente 3 días antes. En los casos en los que el periodo de cultivo es
45 mayor de dos semanas la alimentación se puede llevar a cabo o continuar al menos hasta el décimo día de cultivo, preferentemente hasta 5 días antes del final del cultivo, más preferentemente hasta 4 días antes del final del cultivo, incluso más preferentemente hasta 3 días antes del final del cultivo.
Los componentes que se utilizan habitualmente en los medios para el cultivo de células (preferentemente células animales) se pueden utilizar apropiadamente como otros componentes en la solución de cultivo para su uso en los métodos descritos en el presente documento, que incluyen aminoácidos, vitaminas, factores lipídicos, fuentes de energía, osmorreguladores, fuentes de hierro, y tampones del pH. Además de los componentes anteriores, se pueden añadir, un elemento metálico menor, tensioactivos, cofactores de crecimiento, nucleósidos, o similares. Los componentes del medio, incluyendo los componentes característicos, para su uso en el presente documento se
55 pueden dividir, y se pueden añadir por separado en el cultivo celular. Específicamente, por ejemplo, se puede utilizar una alta concentración de serina sola y los componentes del medio del cultivo celular, sea al mismo tiempo o en diferentes momentos.
Ejemplos específicos de otros componentes de la solución de cultivo incluyen: aminoácidos tales como L-alanina, Larginina, L-asparagina, ácido L-aspártico, L-glutamina, ácido L-glutámico, glicina, L-histidina, L-isoleucina, L-leucina, L-lisina, L-metionina, L-ornitina, L-fenilalanina, L-prolina, L-treonina, L-triptófano, y L-valina, preferentemente Lalanina, L-arginina, L-asparagina, ácido L-aspártico, L-glutamina, ácido L-glutámico, glicina, L-histidina, L-isoleucina, L-leucina, L-lisina, L-metionina, L-fenilalanina, L-prolina, L-treonina, L-triptófano, y L-valina; vitaminas tales como Linositol, biotina, ácido fólico, ácido lipoico, nicotinamida, ácido nicotínico, ácido p-aminobenzoico, pantotenato 65 cálcico, clorhidrato de piridoxal, clorhidrato de piridoxina, riboflavina, clorhidrato de tiamina, vitamina B12, y ácido ascórbico, preferentemente biotina, ácido fólico, ácido lipoico, nicotinamida, pantotenato cálcico, clorhidrato de
piridoxal, riboflavina, clorhidrato de tiamina, vitamina B12, y ácido ascórbico; factores lipídicos tales como cloruro de colina, tartrato de colina, ácido linoleico, ácido oleico, y colesterol, preferentemente cloruro de colina; fuentes de energía tales como glucosa, galactosa, manosa, y fructosa, preferentemente glucosa; osmorreguladores tales como cloruro sódico, cloruro potásico, y nitrato potásico, preferentemente cloruro sódico; fuentes de hierro tales como
5 EDTA férrico, citrato férrico, cloruro ferroso, cloruro férrico, sulfato ferroso, sulfato férrico, y nitrato férrico, preferentemente cloruro férrico, EDTA férrico, y citrato férrico; y tampones de pH tales como bicarbonato sódico, cloruro cálcico, fosfato dihidrógeno sódico, HEPES, y MOPS, preferentemente bicarbonato sódico.
Además de los componentes anteriores, la solución de cultivo puede comprender, por ejemplo, elementos metálicos menores tales como sulfato de cobre, sulfato de manganeso, sulfato de zinc, sulfato de magnesio, cloruro de níquel, cloruro de estaño, cloruro magnésico, y silicito sódico, preferentemente sulfato de cobre, sulfato de zinc, y sulfato magnésico; tensioactivos tales como Tween 80 y Pluronic F68; y cofactores de crecimiento tales como insulina recombinante, IGF recombinante, EGF recombinante, FGF recombinante, PDGF recombinante, TGF-alfa recombinante, clorhidrato de etanolamina, selenito sódico, ácido retinoico, y clorhidrato de putrescina,
15 preferentemente selenito sódico, clorhidrato de etanolamina, IGF recombinante, y clorhidrato de putrescina; y nucleósidos tales como desoxiadenosina, desoxicitidina, desoxiguanosina, adenosina, citidina, guanosina y uridina.
En el presente documento, pueden estar contenidos antibióticos, tales como estreptomicina, penicilina G potásica, y gentamicina, e indicadores del pH, tales como rojo fenol.
La cantidad de otros componentes de la solución de cultivo están normalmente en intervalos adecuados de 0,051500 mg/l de aminoácidos, 0,001-10 mg/l de vitaminas, 0-200 mg/l de factores lipídicos, 1-20 g/l de fuentes de energía, 0,1-10000 mg/l de osmorreguladores, 0,1-500 mg/l de fuentes de hierro, 1-10000 mg/l de tampones de pH, 0,00001-200 mg/l de elementos metálicos menores, 0-5000 mg/l de tensioactivos, 0,05-10000 µg/l de cofactores de
25 crecimiento, y 0,001-50 mg/l de nucleósidos, pero no se limita a estos intervalos y se puede determinar apropiadamente dependiendo del tipo de célula que se cultive, el tipo de proteína deseada, y similares.
El pH de la solución de cultivo depende de las células que se van a cultivar, pero normalmente es un pH de 6,8-7,6, y muy a menudo adecuadamente puede ser un pH de 7,0-7,4.
En la presente divulgación, las células se pueden cultivar utilizando un medio sintético completo en el que se disuelven los componentes anteriores. También es posible utilizar como medio básico un medio conocido convencionalmente para el cultivo celular animal, y el medio se puede suplementar con los componentes característicos para su uso en el presente documento. Ejemplos de medios básicos disponibles en el mercado que
35 se pueden utilizar como medio de cultivo celular animal incluyen: D-MEM (Medio Eagle Modificado de Dulbecco), DMEM/Mezcla F-12 1:1 (Medio Eagle Modificado de Dulbecco: Mezcla de Nutrientes F-12), RPMI1640, CHO-S-SFMII (Invitrogen), CHO-SF (Sigma-Aldrich), EX-CELL 301 (JRH biosciences), CD-CHO (Invitrogen), IS CHO-V (Irvine Scientific), y PF-ACF-CHO (Sigma-Aldrich). En los casos en que se cultivan las células por cultivo semi-continuo, se pueden utilizar dichos medios disponibles en el mercado como medio inicial en un estadio temprano del cultivo celular. Se puede concentrar el mismo medio utilizado como medio inicial y suplementarse con serina y tirosina y/o cisteína y entonces utilizarlos como medio semi-continuo.
Los métodos de cultivo de la presente divulgación se pueden utilizar para cultivar distintas células (por ejemplo, células bacterianas, células fúngicas, células de insecto, células vegetales, células animales) sin ninguna limitación. 45 Por ejemplo, se pueden cultivar células COS recombinantes o células CHO recombinantes que portan un gen que codifica una proteína deseada preparada por modificación genética, o células fusionadas que producen anticuerpos, ejemplificadas por el hibridoma tal como de ratón-humano, ratón-ratón. Los métodos de la presente divulgación se pueden utilizar para cultivar células animales para obtener proteínas tipo natural que producen las células animales,
o para cultivar células BHK, células HeLa, y similares, así como las células descritas anteriormente.
Las células animales que se pueden utilizar en la presente divulgación son las células CHO en las que se ha introducido un gen que codifica una proteína deseada. La proteína deseada no se limita particularmente y puede ser cualquier proteína tal como anticuerpos, tales como anticuerpos naturales, fragmentos de anticuerpo, fragmentos pequeños de anticuerpo o “minicuerpos”, anticuerpos quiméricos, y anticuerpos humanizados (por ejemplo, los
55 anticuerpos anti-receptor de IL-6, anticuerpos anti-glipicano-3, anticuerpos anti-CD3, anticuerpos anti-CD20, anticuerpos anti-GPIIb/IIIa, anticuerpos anti-TNF, anticuerpos anti-CD25, anticuerpos anti-EGFR, anticuerpos antiHer2/neu, anticuerpos anti-RSV, anticuerpos anti-CD33, anticuerpos anti-CD52, anticuerpos anti-IgE, anticuerpos anti-CD11a, anticuerpos anti-VEGF, anticuerpos anti-VLA4) y proteínas fisiológicamente activas (por ejemplo, factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF), factor estimulante de colonias de macrófagos granulocitos (GM-CSF), eritropoyetina, interferón, interleucina tal como IL-1 e IL-6, t-PA, urocinasa, seroalbúmina, factor de coagulación sanguínea), pero se prefieren especialmente los anticuerpos.
Los anticuerpos producidos por los métodos descritos en el presente documento incluyen no solo anticuerpos monoclonales derivados de animales, tales como seres humanos, ratones, ratas, hámsteres, conejos, y monos, sino 65 también anticuerpos recombinantes modificados genéticamente de manera artificial, tales como anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados, y anticuerpos biespecíficos. La clase de inmunoglobulina de un anticuerpo no
Los métodos de administración de los productos farmacéuticos de la presente divulgación puede ser la administración oral y la administración parenteral, pero se prefiere la administración parenteral; ejemplos específicos incluyen la inyección (por ejemplo, la administración general o local por inyección intravenosa, inyección intramuscular, inyección intraperitoneal, inyección subcutánea, o similares), la administración transnasal,
5 administración pulmonar y administración percutánea.
La presente divulgación se describe en detalle posteriormente, en referencia a los Ejemplos y Ejemplos de referencia.
15 Una composición de un medio y un método de preparación son los siguientes.
Medio inicial: Se disolvió un medio de cultivo celular animal disponible en el mercado y luego se esterilizó por filtración. Medio semi-continuo: Se disolvió un medio de cultivo celular animal para su uso en el medio inicial de manera que la concentración del medio de cultivo celular animal era tres veces la concentración del medio inicial. Después, se añadieron 50 mM de serina, 1,8 mM de clorhidrato de cisteína monohidrato, y 14,5 mM de tirosina, y se disminuyó el pH con ácido clorhídrico hasta que los componentes del medio se disolvieron completamente (alrededor de un pH de 1,5). Después de confirmar que los componentes del medio estaban completamente
25 disueltos, el medio resultante se esterilizó por filtración. Células: cepa de células CHO (en referencia al documento WO 2006/006693) que produce una IgG humanizada (anticuerpo anti-glipicano-3).
El medio inicial se cargó en un aparato de cultivo celular tipo jarra, y se añadieron las células CHO hasta que había 2 x 105 células/ml para comenzar el cultivo en condiciones de 37 ⁰C y un 10 % de CO2. Durante un periodo de cultivo de 14 días, se controló automáticamente un límite inferior de pH de 7,0, y se controló una concentración de oxígeno disuelto automáticamente al 40 %. A partir del tercer día de cultivo, se alimentó con el medio semi-continuo con un caudal constante (1,0 g/hora con respecto a 1 l de medio inicial), y el cultivo se continuó hasta el día catorce. Se llevó a cabo la toma de muestras al principio del cultivo y los días tercero, quinto, séptimo, décimo, duodécimo y
35 catorceavo. Se sometieron los sobrenadantes de las muestras respectivas a cromatografía de afinidad utilizando proteína A para medir las concentraciones de anticuerpos que se producían, se sometieron a tinción con azul tripano para medir la tasa de supervivencia, y se sometieron a un método de enzima inmovilizada para cuantificar el lactato. Como se muestra en la Figura 1, en el caso del cultivo semi-continuo (de control) utilizando el medio semi-continuo que no se había enriquecido con serina, cisteína, y tirosina, la concentración de anticuerpo que se obtuvo como resultado del cultivo de 14 días era aproximadamente de 1,6 g/l. Por otra parte, en el caso del cultivo semi-continuo (Ser, Cys, Tyr) utilizando el medio semi-continuo que tenía un pH bajo y que comprendía cantidades aumentadas de serina, cisteína y tirosina a altas concentraciones, la concentración de anticuerpo que se obtuvo como resultado del cultivo de 14 días era de aproximadamente 2,2 g/l; la concentración era aproximadamente un 40 % más alta. La Figura 2 muestra la transición de viabilidad (tasa de supervivencia) durante el periodo de cultivo. Además, como se
45 muestra en la Figura 3, la concentración de lactato transicionaba a un nivel bajo desde el tercer día del cultivo en el cultivo semi-continuo utilizando el medio semi-continuo que tenía un pH bajo y enriquecido con serina, cisteína y tirosina, en comparación con el cultivo semi-continuo utilizando el medio semi-continuo que no estaba enriquecido con serina, cisteína y tirosina.
Una composición de un medio y un método de preparación son los siguientes.
55 Medio inicial: Se disolvió un medio de cultivo celular animal disponible en el mercado y luego se esterilizó por filtración. Medio semi-continuo: Se disolvió un medio de cultivo celular animal para su uso en el medio inicial de manera que la concentración del medio de cultivo celular animal era tres veces la concentración del medio inicial. Después, se añadieron 50 mM de serina, 1,8 mM de clorhidrato de cisteína monohidrato, y 14,5 mM de tirosina, y se disminuyó el pH con ácido clorhídrico hasta que los componentes del medio se disolvieron completamente (alrededor de un pH de 1,5). Después de confirmar que los componentes del medio estaban completamente disueltos, el medio resultante se esterilizó por filtración. Células: cepa de células CHO que produce IgG humanizada transformada con un gen transportador de taurina.
65
El medio inicial se cargó en un aparato de cultivo celular tipo jarra, y se añadieron las células CHO hasta que había 2 x 105 células/ml para comenzar el cultivo en condiciones de 37 ⁰C y un 10 % de CO2. Durante un periodo de cultivo de 14 días, se controló automáticamente un límite inferior de pH de 7,0, y se controló la concentración de oxígeno disuelto automáticamente a un 40 %. A partir del tercer día de cultivo, se alimentó con el medio semi-continuo con 5 un caudal constante (1,5 g/hora con respecto a 1 l de medio inicial), y el cultivo se continuó hasta el día catorce. Se llevó a cabo la toma de muestras al principio del cultivo y los días tercero, quinto, séptimo, duodécimo y catorceavo. Se sometieron los sobrenadantes de las muestras respectivas a cromatografía de afinidad utilizando proteína A para medir las concentraciones de anticuerpos que se producían, se sometieron a tinción con azul tripano para medir la tasa de supervivencia, y se sometieron a un método de enzima inmovilizada para cuantificar el lactato. Como se muestra en la Figura 4, en el caso del cultivo semi-continuo (de control) utilizando el medio semi-continuo que no se había enriquecido con serina, cisteína, y tirosina, la concentración de anticuerpo que se obtuvo como resultado del cultivo de 14 días era aproximadamente de 1,3 g/l. Por otra parte, en el caso del cultivo semi-continuo (Ser, Cys, Tyr) utilizando el medio semi-continuo que tenía un pH bajo y que comprendía cantidades aumentadas de serina, cisteína y tirosina a altas concentraciones, la concentración de anticuerpo que se obtuvo como resultado del cultivo
15 de 14 días era de aproximadamente 2,0 g/l; la concentración era aproximadamente un 54 % más alta. Como se muestra en la Figura 5, en el caso del cultivo semi-continuo utilizando el medio semi-continuo que no estaba enriquecido con serina, cisteína, y tirosina, la tasa de supervivencia era del 52 % el día catorce del cultivo de 14 días. Por otra parte, en el caso del cultivo semi-continuo utilizando el medio semi-continuo que tenía un pH bajo y que comprendía cantidades aumentadas de serina, cisteína, y tirosina a altas concentraciones, la tasa de supervivencia era del 78 % el día catorce del cultivo de 14 días; se mantuvo una alta viabilidad. Además, como se muestra en la Figura 6, la concentración de lactato transicionaba a un nivel bajo desde el tercer día de cultivo en el cultivo semi-continuo utilizando el medio semi-continuo que tenía un pH bajo y enriquecido con serina, cisteína y tirosina, en comparación con el cultivo semi-continuo utilizando el medio semi-continuo que no estaba enriquecido con serina, cisteína y tirosina.
25 Ejemplo 3. Cultivo semi-continuo que presenta la contribución de altas concentraciones de serina, cisteína, y tirosina para conseguir una producción con un alto rendimiento de anticuerpos (una cepa de células CHO transformadas con un gen de anticuerpo y un gen transportador de taurina de hámster)
Una composición de un medio y un método de preparación son los siguientes.
Medio inicial: Se disolvió un medio de cultivo celular animal disponible en el mercado y luego se esterilizó por filtración. Medio semi-continuo (Ser, Cys, Tyr): se disolvió un medio de cultivo celular animal para su uso en el medio inicial
35 de manera que la concentración del medio de cultivo celular animal era tres veces la concentración del medio inicial. Después, se añadieron 50 mM de serina, 1,8 mM de clorhidrato de cisteína monohidrato, y 14,5 mM de tirosina, y se disminuyó el pH con ácido clorhídrico hasta que los componentes del medio se disolvieron completamente (alrededor de un pH de 1,5). Después de confirmar que los componentes del medio estaban completamente disueltos, el medio resultante se esterilizó por filtración. Medio semi-continuo (Ser, Cys): se disolvió un medio de cultivo celular animal para su uso en el medio inicial de manera que la concentración del medio de cultivo celular animal era tres veces la concentración del medio inicial. Después, se añadieron 50 mM de serina, y 1,8 mM de clorhidrato de cisteína monohidrato, y se disminuyó el pH con ácido clorhídrico hasta que los componentes del medio se disolvieron completamente (alrededor de un pH de 1,0). Después de confirmar que los componentes del medio estaban completamente disueltos, el medio
45 resultante se esterilizó por filtración. Medio semi-continuo (Ser, Tyr): se disolvió un medio de cultivo celular animal para su uso en el medio inicial de manera que la concentración del medio de cultivo celular animal era tres veces la concentración del medio inicial. Después, se añadieron 50 mM de serina, y 14,5 mM de tirosina, y se disminuyó el pH con ácido clorhídrico hasta que los componentes del medio se disolvieron completamente (alrededor de un pH de 1,0). Después de confirmar que los componentes del medio estaban completamente disueltos, el medio resultante se esterilizó por filtración. Medio semi-continuo (Cys, Tyr): se disolvió un medio de cultivo celular animal para su uso en el medio inicial de manera que la concentración del medio de cultivo celular animal era tres veces la concentración del medio inicial. Después, se añadieron 1,8 mM de clorhidrato de cisteína monohidrato, y 14,5 mM de tirosina, y se disminuyó el
55 pH con ácido clorhídrico hasta que los componentes del medio se disolvieron completamente (alrededor de un pH de 1,0). Después de confirmar que los componentes del medio estaban completamente disueltos, el medio resultante se esterilizó por filtración. Células: cepa de células CHO transformada con un gen transportador de taurina que produce IgG humanizada.
El medio inicial se cargó en un aparato de cultivo celular tipo jarra, y se añadieron las células CHO hasta que había 2 x 105 células/ml para comenzar el cultivo en condiciones de 37 ⁰C y un 10 % de CO2. Durante un periodo de cultivo de 14 días, se controló automáticamente un límite inferior de pH de 7,0, y se controló la concentración de oxígeno disuelto automáticamente a un 40 %. A partir del tercer día de cultivo, se alimentó con el medio semi-continuo con un caudal constante (1,0 g/hora con respecto a 1 l de medio inicial), y el cultivo se continuó hasta el día catorce. Se
65 llevó a cabo la toma de muestras al principio del cultivo y los días tercero, quinto, séptimo, décimo, duodécimo y catorceavo. Las concentraciones de anticuerpos que se produjeron en los sobrenadantes de las muestras
respectivas se midieron por cromatografía de afinidad utilizando proteína A, y las concentraciones de aminoácidos, serina y tirosina, en los sobrenadantes de las respectivas muestras se midieron por análisis de aminoácidos utilizando una columna de intercambio iónico. Como se muestra en la Figura 7, en el caso del cultivo semi-continuo (de control) utilizando el medio semi-continuo que no se había enriquecido con serina, cisteína, y tirosina, la 5 concentración de anticuerpo que se obtuvo como resultado del cultivo de 14 días era aproximadamente de 1,16 g/l. Por otra parte, en el caso del cultivo semi-continuo (Ser, Cys, Tyr) utilizando el medio semi-continuo que tenía un pH bajo y que comprendía cantidades aumentadas de serina, cisteína y tirosina a altas concentraciones, la concentración de anticuerpo que se obtuvo como resultado del cultivo de 14 días era de aproximadamente 1,87 g/l; en el caso del cultivo semi-continuo (Ser, Cys) utilizando el medio semi-continuo que tenía un pH bajo y que 10 comprendía cantidades aumentadas de serina y cisteína a altas concentraciones, la concentración del anticuerpo que se obtuvo como resultado del cultivo de 14 días era de 1,47 g/l; en el caso del cultivo semi-continuo (Ser, Tyr) utilizando el medio semi-continuo que tenía un pH bajo y comprendía cantidades aumentadas de serina y tirosina a altas concentraciones, la concentración del anticuerpo que se obtuvo como resultado del cultivo de 14 días era de 1,41 g/l; y en el caso del cultivo semi-continuo (Cys, Tyr) utilizando el medio semi-continuo que tenía un pH bajo y 15 comprendía cantidades aumentadas de cisteína y tirosina, la concentración del anticuerpo que se obtuvo como resultado del cultivo de 14 días era de 1,18 g/l. Los resultados sugieren que las altas concentraciones de serina, cisteína y tirosina contribuían en este orden a la producción de anticuerpos con un alto rendimiento. Los resultados también sugieren que la adición de altas concentraciones de serina, cisteína, y tirosina juntas en el medio semicontinuo en el mismo caso contribuía más significativamente a la producción de anticuerpos con un alto rendimiento.
20 Las Figuras 8 y 9 muestran las transiciones de las concentraciones de serina y tirosina durante el periodo de cultivo de 14 días. En el control, la concentración de serina era de 0,63 mM y la concentración de tirosina era de 0,34 mM el quinto día, y la concentración de serina era de 0,4 mM o menor y la concentración de tirosina era de 0,4 mM o menor a partir del séptimo día de cultivo. Por otra parte, la concentración de serina se mantuvo a 2 mM o más alta
25 en el cultivo utilizando el medio semi-continuo suplementado con serina, y la concentración de tirosina se mantuvo a 1 mM o más alta en el cultivo utilizando el medio semi-continuo suplementado con tirosina.
Los siguientes Ejemplos de Referencia describen la preparación de las cepas de células CHO transformadas con un gen transportador de taurina que producen IgG humanizada que se utilizaron en los Ejemplos 2 y 3 descritos
30 anteriormente.
Se extrajo el ARN total de las células que producían un anticuerpo anti-receptor de la IL-6 (documento JP H08
35 99902A), que se obtuvo transformando un gen de anticuerpo anti-receptor de la IL-6 en células CHO DXB11. A continuación, se sintetizó el ADNc dependiente de poliA. Se obtuvo un gen transportador de taurina de hámster (TauT de hámster) por PCR utilizando una matriz fragmentada de ADNc por tres tipos de enzimas de restricción, SaII, XhoI, y EcoRI. Se diseñaron y utilizaron cebadores de PCR que contenían secuencias conservadas 5’, 3’ que son comunes entre los TauT de rata/ratón. Tras determinar la secuencia de nucleótidos del gen clonado, se confirmó
40 que el gen codificaba el TauT de ratón, basándose en la homología con TauT conocidos de otras especies biológicas (Figura 10). La secuencia de aminoácidos del TauT de ratón era altamente homogénea con la del ratón (96 % de identidad), rata (96 % de identidad), y humana (93 % de identidad); por lo tanto, se especuló que el TauT de hámster era un transportador que tenía 12 dominios transmembrana (Figura 11).
Se construyó un plásmido de expresión pHyg/TauT (Figura 12) con un promotor CMV añadiendo una secuencia Kozak al gen TauT de hámster (de aquí en adelante “TauT”) obtenido por la clonación del Ejemplo de referencia 1.
50 Las células CHO que expresaban el anticuerpo anti-glipicano-3, como la cepa parental, (referirse al documento WO 2006/006693), se transformaron por electroporación con el plásmido pHyg/TauT o un plásmido de control pHyg (400 µg/ml), seguido por la expansión de todas las cepas celulares que presentaban un crecimiento estable (pHyg/TauT: 8 cepas, pHyg: 7 cepas). Después de preparar el ARNm TauT, se llevó a cabo el procedimiento TaqMan para seleccionar 7 cepas que presentaban una expresión superior sobre la cepa parental para obtener células
55 transformadas con pHyg/TauT. Una cantidad media de la expresión de ARNm de las células transformadas (7 cepas) era aproximadamente de 40 veces la del control (7 cepas).
60 <SEQ ID NO: 1> SEQ ID NO: 1 muestra la secuencia básica de un gen que codifica un transportador de taurina de hámster. <SEQ ID NO: 2> SEQ ID NO: 2 muestra la secuencia de aminoácidos del transportador de taurina de hámster.
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