BR122014028365B1 - Artigo industrializado compreendendo um primeiro recipiente que compreende uma composição de humab4d5-8 nele contida e um segundo recipiente que compreende umacomposição rhumab 2c4 nele contida - Google Patents

Abstract

artigo industrializado compreendendo um primeiro recipiente que compreende uma composição de humab4d5-8 nele contida e um segundo recipiente que compreende uma composição rhumab 2c4 nele contida o presente pedido descreve anticorpos anti-erbb2 humanizados e métodos de tratamento de câncer com anticorpos anti-erbb2, tais como anticorpos anti-erbb2 humanizados.

Description

“ARTIGO INDUSTRIALIZADO COMPREENDENDO UM PRIMEIRO RECIPIENTE QUE COMPREENDE UMA COMPOSIÇÃO DE HUMAB4D5-8 NELE CONTIDA E UM SEGUNDO RECIPIENTE QUE COMPREENDE UMA COMPOSIÇÃO RHUMAB 2C4 NELE CONTIDA”

Dividido do PI 0012198-3, depositado em 23/06/2000

Campo da Invenção [001] A presente invenção refere-se a anticorpos anti-ErbB2 humanizados e métodos de tratamento de câncer com anticorpos anti-ErbB2, tais como anticorpos anti-ErbB2 humanizados.

Antecedentes da Invenção [002] A família ErbB2 de tirosina quinases de receptores são mediadores importantes do crescimento, diferenciação e sobrevivência celular. A família de receptores inclui quatro membros distintos, que incluem receptor de fator de crescimento epidérmico (EGFR ou ErbB1), HER2 (ErbB2 ou p185^neu), HER3 (ErbB3) e HER4 (ErbB4 ou tiro2).

[003] EGFR, codificado pelo gene erbB1, foi relacionado com as causas de malignidade humana. Particularmente, observou-se maior expressão de EGFR em câncer de mama, bexiga, pulmão, cérebro, garganta e estômago, bem como glioblastomas. O aumento da expressão de receptor de EGFR é muitas vezes associada com maior produção do ligante EGFR, transformando o fator de crescimento alfa (TGF-α), pelas mesmas células tumorais que resultam na ativação de receptor por um processo estimulador autócrino. Baselga e Mendelsohn, Pharmac. Ther., 64:127-154, 1994. Anticorpos monoclonais dirigidos contra o EGFR ou seus ligantes, TGF-α e EGF, foram avaliados como agentes terapêuticos no tratamento dessas malignidades. Vide, por exemplo, Baselga e Mendelsohn, acima; Masui et al., Cancer Research, 44:1002-1007, 1984; e Wu et al., J. Clin. Invest., 95:1897-1905, 1995.

[004] O segundo membro da família ErbB, p185^neu, foi

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2/135 identificado originalmente como produto do gene de transformação de neuroblastomas de ratos tratados quimicamente. A forma ativada do protooncogene neu resulta de uma mutação pontual (valina em ácido glutâmico) na região de transmembrana da proteína codificada. A amplificação do homólogo humano de neu é observada em cânceres de mama, ovário e correlatos com mau prognóstico (Slamon et al., Science, 235:177-182, 1987; Slamon et al., Science, 244:707-712, 1989; e patente US 4.968.603). Até o momento, nenhuma mutação pontual análoga à do proto-oncogene neu foi relatada para tumores humanos. A sobre-expressão de ErbB2 (freqüentemente, mas não uniformemente devido à amplificação genética) também foi observada em outros carcinomas, incluindo carcinomas do estômago, endométrio, glândulas salivares, pulmão, rim, cólon, tiróide, pâncreas e bexiga. Vide, entre outros, King et al, Science, 229:974, 1985; Yokota et al., Lancet, 1:765-767, 1986; Fukushigi et al., Mol. Cell. Biol., 6:955-958, 1986; Geurin et al., Oncogene Res., 3:21 -31, 1988; Cohen et al., Oncogene, 4:81 -88, 1989; Yonemura et al., Cancer Res., 51:1034, 1991; Borst et al., Gynecol. Oncol. 38:364, 1990; Weiner et al., Cancer Res., 50:421-425, 1990; Kern et al., Cancer Res., 50:5184, 1990; Park et al., Cancer Res., 49:6605, 1989; Zhau et al., Mol. Carcinog., 3:354-357, 1990; Aasland et al., Br. J. Cancer, 57:358-363, 1988; Williams et al., Pathiobiology, 59:46-52, 1991; e McCann et al., Cancer, 65:88-92, 1990. O ErbB2 pode ser sobre-expresso em câncer de próstata (Gu et al., Cancer Lett., 99:185-9, 1996; Ross et al., Hum. Pathol., 28:827-33, 1997; Ross et al., Cancer, 79:2162-70, 1997; e Sadasivan et al., J. Urol., 150:126-31, 1993).

[005] Foram descritos anticorpos dirigidos aos produtos de proteína p185^neu de ratos e ErbB2 humanos. Drebin e colegas levantaram anticorpos contra o produto genético neu de rato, p185^neu. Vide, por exemplo, Drebin et al., Cell, 41:695-706, 1985; Myers et al., Meth. Enzym., 198:277-290, 1991; e WO 94/22478. Drebin et al., Oncogene, 2:273-277, 1998 relatam que

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3/135 misturas de anticorpos reativas com duas regiões distintas de p185^neu resultam em efeitos anti-tumorais sinérgicos sobre células NIH-3T3 transformadas por neu implantadas em camundongos nus. Vide também a patente US 5.824.311, concedida em 20 de outubro de 1998.

[006] Hudziak et al., Mol. Cell. Biol., 9(3):1165-1172, 1989, descrevem a geração de um quadro de anticorpos anti-ErbB2 que foram caracterizados através da utilização da linhagem celular de tumor de mama humano SK-BR3. A proliferação celular relativa das células SK-BR-3 em seguida à exposição dos anticorpos foi determinada por manchas violetas de cristal das monocamadas após 72 horas. Através da utilização deste ensaio, obteve-se inibição máxima com o anticorpo denominado 4D5 que inibiu a proliferação celular em 56%. Outros anticorpos no quadro reduziram a proliferação celular à extensão menor neste ensaio. Concluiu-se adicionalmente que o anticorpo 4D5 sensibiliza as linhagens celulares de tumor de mama que sobre-expressam ErbB2 para os efetores citotóxicos de TNF-α. Vide também a patente US 5.677.171, concedida em 14 de outubro de 1997. Os anticorpos anti-ErbB2 discutidos em Hudziak et al., são caracterizados adicionalmente em Fendly et al., Cancer Research, 50:1550-1558, 1990; Kotts et al., In Vitro, 26(3):59A, 1990; Sarup et al., Growth Regulation, 1:72-82, 1991; Shepard et al., J. Clin. Immunol., 11(3):117-127, 1991; Kumar et al., Mol. Cell. Biol., 11(2):979-986, 1991; Lewis et al., Cancer Immunol. Immunother., 37:255263, 1993; Pietras et al., Oncogene, 9:1829-1838, 1994; Vitetta et al., Cancer Research, 54:5301-5309, 1994; Sliwkowski et al., J. Biol. Chem., 269(20):14661-14665, 1994; Scott et al., J. Biol. Chem., 266:14300-5, 1991; D'souza et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 91:7202-7206, 1994; Lewis et al., Cancer Research, 56:1457-1465, 1996; e Schaefer et al., Oncogene, 15:1385-1394, 1997.

[007] Uma versão humanizada recombinante do anticorpo anti

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ErbB2 4D5 de murinos (huMAb4D5-8, rhuMAbHER2 ou Herceptin®; patente US 5.821.337), é clinicamente ativo em pacientes com cânceres de mama metastáticos com sobre-expressão de ErbB2 que tenham recebido extensiva terapia anti-câncer anterior (Baselga et al., J. Clin. Oncol., 14:737-744, 1996). Herceptin^® recebeu aprovação comercial da Administração de Alimentos e Drogas em 25 de setembro de 1998 para o tratamento de pacientes com câncer de mama metastático, cujos tumores sobre-expressam a proteína ErbB2.

[008] Outros anticorpos anti-ErbB2 com diversas propriedades foram descritos em Tagliabue et al., Int. J. Cancer, 47:933-937, 1991; McKenzie et al., Oncogene, 4:543-548, 1989; Maier et al., Cancer Res., 51:5361-5369, 1991; Bacus et al., Molecular Carcinogenesis, 3:350-362, 1990; Stancovski et al., PNAS (USA), 88:8691-8695, 1991; Bacus et al., Cancer Research, 52:2580-2589, 1992; Xu et al., Int. J. Cancer, 53:401-408, 1993; WO 94/00136; Kasprzyk et al., Cancer Research, 52:2771-2776, 1992; Hancock et al., Cancer Res., 51:4575-4580, 1991; Shawver et al., Cancer Res., 54:13671373, 1994; Arteaga et al., Cancer Res., 54:3758-3765, 1994; Harwerth et al., J. Biol. Chem., 267:15160-15167, 1992; patente US 5.783.186; e Klapper et al., Oncogene, 14:2099-2109, 1997.

[009] Seleção de homologia resultou na identificação de dois outros membros da família de receptores de ErbB; ErbB3 (patente US 5.183.884 e 5.480.968, bem como Kraus et al., PNAS (USA), 86:9193-9197, 1989) e ErbB4 (pedido de patente EP 599.274; Plowman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 90:1746-1750, 1993; e Plowman et al., Nature, 366:473475, 1993). Ambos estes receptores exibem maior expressão sobre pelo menos algumas linhagens celulares de câncer de mama.

[010] Os receptores de ErbB são geralmente encontrados em diversas combinações em células e estuda-se a heterodimerização para

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5/135 aumentar a diversidade das reações celulares para uma série de ligantes ErbB (Earp et al., Breast Cancer Research and Treatment, 35:115-132, 1995). EGFR é unido por seis ligantes diferentes; fator de crescimento epidérmico (EGF), fator alfa de crescimento de transformação (TGF-α), anfirregulina, fator de crescimento epidérmico de ligação de heparina (HB-EGF), betacelulina e epirregulina (Groenen et al., Growth Factors, 11:235-257, 1994). Uma família de proteínas de heregulina resultante da divisão alternativa de um gene isolado são ligantes para ErbB3 e ErbB4. A família de heregulina inclui alfa, beta e gama heregulinas (Holmes et al., Science, 256:1205-1210, 1992; patente US 5.641.869; e Schaefer et al., Oncogene, 15:1385-1394, 1997); fatores de diferenciação neu (NDFs), fatores de crescimento glial (GGFs); atividade indutora de receptores de acetilcolina (ARIA); e fator derivado de neurônios motores e sensoriais (SMDF). Para análise, vide Groenen et al., Growth Factors, 11:235-257, 1994; Lemke, G., Molec. & Cell Neurosci., 7:247-262, 1996 e Lee et al., Pharm. Rev., 47:51-85, 1995. Foram identificados recentemente três ligantes ErbB adicionais; neurregulina-2 (NRG-2), que é relatada unindo ErbB3 ou ErbB4 (Chang et al., Nature, 387:509-512, 1997; e Carraway et al., Nature, 387:512-516, 1997); neurregulina-3, que liga ErbB4 (Zhang et al., PNAS (USA), 94(18):9562-7, 1997); e neurregulina-4, que liga ErbB4 (Harari et al., Oncogene, 18:2681-89, 1999) HB-EGF, betacelulina e epirregulina também se ligam a ErbB4.

[011] Embora EGF e TGFa não unam ErbB2, EGF estimula EGFR e ErbB2 para formar um heterodímero, que ativa EGFR e resulta na transfosforilação de ErbB2 no heterodímero. A dimerização e/ou transfosforilação parecem ativar a tirosina quinase de ErbB2. Vide Earp et al., acima. De forma similar, quando ErbB3 for co-expresso com ErbB2, forma-se um complexo de sinalização ativo e os anticorpos dirigidos contra ErbB2 são capazes de romper esse complexo (Sliwkowski et al., J. Biol. Chem.,

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269(20):14661-14665, 1994). Além disso, a afinidade de ErbB3 para heregulina (HRG) aumenta para um estado de afinidade mais alta quando co-expresso com ErbB2. Vide também Levi et al., Journal of Neuroscience, 15:1329-1340, 1995; Morrissey et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 92:1431-1435, 1995; e Lewis et al., Cancer Res., 56:1457-1465, 1996 com relação ao complexo de proteína de ErbB2-ErbB3. ErbB4, como ErbB3, forma um complexo de sinalização ativa com ErbB2 (Carraway e Cantley, Cell, 78:5-8, 1994).

Descrição Resumida da Invenção [012] Em primeiro aspecto, a presente invenção proporciona um método de tratamento de câncer em seres humanos, em que o câncer expressa o receptor de fator de crescimento epidérmico (EGFR), que compreende a administração a seres humanos de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo que se liga ao ErbB2.

[013] Diversas vantagens da utilização de um anticorpo que se liga ao ErbB2 para o tratamento desse câncer, em oposição às drogas destinadas a EGFR, são contempladas no presente. Particularmente, EGFR é altamente expresso em fígado e pele e isso proporciona enorme potencialidade para drogas ativas, em que a droga se liga a EGFR. Além disso, observou-se toxicidade à pele para outras drogas destinadas a EGFR, tais como o anticorpo C225 anti-EGFR quimérico e a droga de molécula pequena ZD1839 que liga EGFR. Antecipa-se que os anticorpos que se ligam ao ErbB2 apresentam melhor perfil de segurança que essas drogas.

[014] Quando o anticorpo utilizado para a terapia do presente pedido bloquear a ativação de ligantes de um receptor de ErbB e/ou possuir característica biológica de anticorpo monoclonal 2C4, são atingidas vantagens adicionais. Embora drogas destinadas a EGFR interfiram apenas com EGFR, por exemplo, os anticorpos de interesse específico no presente (por exemplo, 2C4, incluindo suas variantes maduras por afinidade e/ou humanizadas)

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7/135 interferirão com heterodímeros de EGFR/ErbB2, ErbB3/ErbB4 e ErbB2/ErbB3. Além disso, os anticorpos do presente que se ligam ao ErbB2 e bloqueiam a ativação de ligantes de um receptor de ErbB serão complementares a drogas destinadas a EGFR, em que drogas destinadas a EGFR não são complementares entre si.

[015] A presente invenção proporciona adicionalmente um método de tratamento de câncer em seres humanos, em que o câncer não é caracterizado pela sobre-expressão do receptor de ErbB2, que compreende a administração ao ser humano de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo que se liga ao ErbB2 e bloqueia a ativação de ligantes de um receptor de ErbB.

[016] Além disso, a presente invenção proporciona um método de tratamento de câncer independente de hormônios em seres humanos, que compreende a administração ao ser humano de quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo que se liga ao receptor de ErbB2 e bloqueia a ativação de ligante de um receptor de ErbB.

[017] A presente invenção proporciona adicionalmente um método de tratamento de câncer em seres humanos, que compreende a administração ao ser humano de quantidades terapeuticamente eficazes de (a) um primeiro anticorpo que se ligue ao ErbB2 e inibe o crescimento de células cancerosas que sobre-expressam ErbB2; e (b) um segundo anticorpo que se liga ao ErbB2 e bloqueia a ativação de ligantes de um receptor de ErbB.

[018] A presente invenção também proporciona um método de tratamento de câncer em seres humanos, em que o câncer é selecionado a partir do grupo que consiste de câncer do cólon, reto e colo-retal, que compreende a administração ao ser humano de quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo que se liga ao ErbB2 e bloqueia a ativação de ligante de um receptor de ErbB.

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8/135 [019] Em realizações adicionais, a presente invenção proporciona artigos industrializados para utilização (entre outros) nos métodos acima. A presente invenção proporciona, por exemplo, um artigo industrializado que compreende um recipiente e uma composição nele contida, em que a composição compreende um anticorpo que se liga ao ErbB2, e que compreende adicionalmente uma inserção de pacote indicando que a composição pode ser utilizada para o tratamento de câncer que expresse o receptor de fator de crescimento epidérmico (EGFR).

[020] A presente invenção refere-se adicionalmente a um artigo industrializado que compreende um recipiente e uma composição nele contida, em que a composição compreende um anticorpo que se ligue ao ErbB2 e bloqueie a ativação de ligantes de um receptor de ErbB, compreendendo adicionalmente um inserção de pacote que indica que a composição pode ser utilizada para o tratamento de câncer, em que o câncer não é caracterizado pela sobre-expressão do receptor de ErbB2.

[021] Além disso, a presente invenção refere-se a um artigo industrializado que compreende um recipiente e uma composição nele contida, em que a composição compreende um anticorpo que se ligue ao ErbB2 e bloqueie a ativação de ligantes de um receptor de ErbB, compreendendo adicionalmente uma inserção de pacote que indica que a composição pode ser utilizada para o tratamento de câncer independente de hormônios.

[022] Em realização adicional, é fornecido um artigo industrializado que compreende (a) um primeiro recipiente com uma composição nele contida, em que a composição compreende um primeiro anticorpo que se ligue ao ErbB2 e inibe o crescimento de células cancerosas que sobre-expressem o ErbB2; e (b) um segundo recipiente com uma composição nele contida, em que a composição compreende um segundo anticorpo que se ligue ao ErbB2 e bloqueie a ativação de ligantes de um

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9/135 receptor de ErbB.

[023] É fornecido um artigo industrializado adicional que compreende um recipiente e uma composição nele contida, em que a composição compreende um anticorpo que se ligue ao ErbB2 e bloqueie a ativação de ligantes de um receptor de ErbB, compreendendo adicionalmente uma inserção de pacote que indica que a composição pode ser utilizada para o tratamento de um câncer selecionado a partir do grupo que consiste de câncer do cólon, reto e colo-retal.

[024] A presente invenção proporciona adicionalmente: um anticorpo humanizado que se liga ao ErbB2 e bloqueia a ativação de ligantes de um receptor de ErbB; uma composição que compreende o anticorpo humanizado e um veículo farmaceuticamente aceitável; e um imunoconjugado que compreende o anticorpo humanizado conjugado com um agente citotóxico.

[025] Além disso, a presente invenção proporciona o ácido nucléico isolado que codifica o anticorpo humanizado; um vetor que compreende o ácido nucléico; uma célula hospedeira que compreende o ácido nucléico ou o vetor; bem como um processo de produção do anticorpo humanizado, que compreende o cultivo de uma célula hospedeira compreendendo o ácido nucléico, de forma que o ácido nucléico seja expresso e, opcionalmente, compreendendo ainda a recuperação do anticorpo humanizado do cultivo de células hospedeiras (por exemplo, do meio de cultivo de células hospedeiras).

[026] A presente invenção refere-se ainda a um imunoconjugado que compreende um anticorpo que se liga ao ErbB2 conjugado a uma ou mais moléculas de caliqueamicina e a utilização desses conjugados para o tratamento de câncer que expresse ErbB2, tal como câncer de sobreexpressão de ErbB2, em seres humanos. Preferencialmente, o anticorpo no conjugado é anticorpo monoclonal 4D5, tal como 4D5 humanizado (e,

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10/135 preferencialmente, huMAb4D5-8 (Herceptin®); ou anticorpo monoclonal 2C4, tal como 2C4 humanizado. O anticorpo do imunoconjugado pode ser um anticorpo intacto (tal como um anticorpo IgG1 intacto) ou um fragmento de anticorpo (tal como Fab, F(ab)2, diacorpo, etc.).

Breve Descrição dos Desenhos [027] As Figuras 1A e 1B ilustram o mapeamento de epítopos de resíduos 22 a 645 no domínio extracelular (ECD) de ErbB2 (seqüência de aminoácido, que inclui seqüência de sinais, exibida na Fig. 1A; SEQ ID N^o 13), conforme determinado por análise mutante de truncagem e mutagênese dirigida ao local (Nakamura et al., J. of Virology, 67 (10):6179-6191, 1993; e Renz et al., J. Cell Biol., 125(6):1395-1406, 1994). As diversas truncagens de ErbB2-ECD ou mutações pontuais foram preparadas a partir de cDNA, utilizando-se tecnologia de reação em cadeia de polimerase. Os mutantes de ErbB2 foram expressos na forma de proteínas de fusão de gD em um plasmídeo de expressão de mamíferos. Esse plasmídeo de expressão utiliza o promotor/amplificador de citomegalovírus com terminação SV40 e os sinais de poliadenilação localizados posterior ao inserto de cDNA. O DNA de plasmídeo foi transfectado em 293 células. Um dia após a transfecção, as células foram marcadas metabolicamente por uma noite em DMEM de baixa glicose livre de metionina e cisteína, contendo 1% de soro bovino fetal dialisado e 25 pCi de ³⁵S metionina e ³⁵S cisteína cada. Os sobrenadantes foram colhidos e os anticorpos monoclonais anti-ErbB2 ou anticorpos controle foram adicionados ao sobrenadante e incubados por duas a quatro horas a 4°C. Os complexos foram precipitados, aplicados a um gel de grau de SDS Tricina a 10-20% e corridos em eletroforese a 100 V. O gel foi eletro-transferido sobre uma membrana e analisado através de auto-radiografia. Conforme exibido na Fig. 1B, os anticorpos anti-ErbB2 7C2, 7F3, 2C4, 7D3, 3E8, 4D5, 2H11 e 3H4 ligam diversos epítopos ECD de ErbB2.

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11/135 [028] As Figuras 2A e 2B demonstram o efetor de anticorpos monoclonais anti-ErbB2 2C4 e 7F3 sobre a ativação por rHRG31 de células MCF7. A Fig. 2A exibe curvas de reação à dosagem para a inibição de 2C4 ou 7F3 de estímulo por HRG de fosforilação de tirosina. A Fig. 2B exibe curvas de reação à dosagem para a inibição de rHRG31 177-244 marcado por ¹²⁵I em ligação às células MCF7 por 2C4 ou 7F3.

[029] A Figura 3 ilustra a inibição de rHRGp1^7-244 marcado por ¹²⁵I em ligação a um quadro de linhagens celulares tumorais humanas pelos anticorpos monoclonais anti-ErbB2 2C4 ou 7F3. Os anticorpos monoclonais controle são anticorpos monoclonais de murinos ajustadas para isotipos que não bloqueiam a ligação de rHRG. A ligação de rHRG31177-244 marcada por ²⁴⁵I não específica foi determinada a partir de incubações paralelas realizadas na presença de 100 nM de rHRG31. Os valores para a ligação de rHRGp1n7-244 marcado por ¹²⁵I não específica foram de menos de 1% do total para todas as linhagens celulares testadas.

[030] As Figuras 4A e 4B demonstram o efetor dos anticorpos monoclonais 2C4 e 4D5 sobre a proliferação de células MDA-MB-175 (Fig. 4A) e SK-BR-3 (Fig. 4B). As células MDA-MB-175 e SK-BR-3 foram semeadas em placas de 96 cavidades e mantidas em adesão por duas horas. Conduziu-se experimento em meio contendo 1% de soro. Foram adicionados anticorpos anti-ErbB2 ou meio isolado e as células foram incubadas por duas horas a 37°C. Em seguida, adicionou-se rHRG31 (1 nM) ou meio isolado e as células foram incubadas por quatro dias. As monocamadas foram lavadas e manchadas/fixadas com violeta de cristal a 0,5%. Para determinar a proliferação celular, a absorção foi medida a 540 nm.

[031] As Figuras 5A e 5B exibem o efetor do anticorpo monoclonal 2C4, anticorpo Herceptin^® ou um anticorpo anti-EGFR sobre associação dependente de heregulina (HRG) de ErbB2 com ErbB3 em células

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MCF7 que expressem níveis baixos/normais de ErbB2 (Fig. 5A) e células SKBR-3 que expressem altos níveis de ErbB2 (Fig. 5B); vide Exemplo 2 abaixo.

[032] As Figuras 6A e 6B comparam as atividades de anticorpo monoclonal de murino intacto 2C4 (mu 2C4) e um fragmento de 2C4 Fab quimérico. A Fig. 6A exibe inibição de ¹²⁵I-HRG que se liga a células MCF7 através de 2C4 Fab quimérico ou anticorpo monoclonal 2C4 de murino intacto. Células MCF7 foram semeadas em placas com 24 cavidades (1 x 10⁵ células/cavidade) e cultivadas até confluência de cerca de 85% por dois dias. Foram conduzidos experimentos de ligação conforme descrito em Lewis et al., Cancer Research, 56:1457-1465, 1996. A Fig. 6B ilustra a inibição de ativação por rHRG31 de fosforilação de p180 tirosina em células de MCF7 realizada conforme descrito em Lewis et al., Cancer Research, 56:1457-1465, 1996.

[033] As Figuras 7A e 7B ilustram alinhamentos das seqüências de aminoácidos dos domínios leve variáveis (VL) (Fig. 7A) e pesado variável (Vh) (Fig. 7B) de anticorpo monoclonal 2C4 de murino (SEQ ID N^o 1 e 2, respectivamente); domínios VL e VH de 2C4 versão 574 humanizado (SEQ ID N^o 3 e 4, respectivamente) e estruturas de consenso de Vl e Vh humano (hum κ1, subgrupo I do tipo Kappa leve; humIII, subgrupo III pesado) (SEQ ID N^o 5 e 6, respectivamente). Os asteriscos identificam as diferenças entre anticorpo monoclonal de murino e 2C4 versão 574 humanizado, ou entre 2C4 versão 574 humanizado e a estrutura humana. Regiões de Complementaridade Determinante (CDRs) encontram-se entre parênteses.

[034] As Figuras 8A a C exibem a ligação de Fab 2C4 quimérico (Fab. v1) e diversas variantes de 2C4 humanizadas a domínio extracelular de ErbB2 (ECD), conforme determinado por ELISA no Exemplo 3.

[035] A Figura 9 é um diagrama de fita dos domínios Vl e Vh de anticorpo monoclonal 2C4 com estrutura de CDR branco marcada (L1, L2, L3, H1, H2, H3). Cadeias laterais de Vh avaliadas através de mutagênese durante

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13/135 a humanização (vide Exemplo 3, Tabela 2) também são exibidas.

[036] A Figura 10 ilustra o efetor do anticorpo monoclonal 2C4 ou Herceptin® sobre a ativação mediada por HRG, EGF ou TGF-α de proteína quinase ativada por mitógeno (MAPK).

[037] A Figura 11 é um gráfico de barras que exibe o efetor de anticorpos anti-ErbB2 (isoladamente ou em combinações) sobre xenoenxertos de adenocarcinoma pulmonar Calu3 (sobre-expresso de ErbB2 3+). Observação: o tratamento foi suspenso no dia 24.

[038] A Figura 12 ilustra o efetor de anticorpo monoclonal humanizado recombinante 2C4 (rhuMAb 2C4) ou Herceptin^® sobre o crescimento de células MDA-175 conforme determinado em um ensaio Azul de Alamar.

[039] A Figura 13 ilustra a eficácia de rhuMAB 2C4 contra xenoenxertos de MCF7.

Descrição Detalhada da Invenção

I - Definições [040] Um “receptor de ErbB” é uma tirosina quinase de proteína receptora que pertence à família de receptores de ErbB e inclui receptores de EGFR, ErbB2, ErbB3 e ErbB4 e outros membros dessa família a serem identificados no futuro. O receptor de ErbB compreenderá geralmente um domínio extracelular que pode se ligar a um ligante de ErbB; um domínio de transmembrana lipofílico; um domínio de tirosina quinase intracelular conservado; e um domínio de sinalização de terminal carboxila que abriga diversos resíduos de tirosina que podem ser fosforilados. O receptor de ErbB pode ser um receptor de ErbB de “seqüência nativa” ou uma de suas “variantes de seqüência de aminoácidos”. Preferencialmente, o receptor de ErbB é um receptor de ErbB humano de seqüência nativa.

[041] As expressões “ErbB1”, “receptor de fator de crescimento

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14/135 epidérmico” e “EGFR” são utilizadas de forma intercambiável no presente e refere-se a EGFR conforme descrito, por exemplo, em Carpenter et al., Ann. Rev. Biochem., 56:881-914, 1987, incluindo suas formas mutantes de ocorrência natural (por exemplo, EGFR mutante de deleção como em Humphrey et al., PNAS (USA), 87:4207-4211, 1990). O erbB1 refere-se ao gene codificador do produto de proteína EGFR.

[042] As expressões “ErbB2” e “HER2” são utilizadas de forma intercambiável no presente e referem-se à proteína HER2 humana descrita, por exemplo, em Semba et al., PNAS (USA), 82:6497-6501, 1985 e Yamamoto et al., Nature, 319:230-234, 1986 (número de acesso Genebank - Base de Dados de Seqüências - X03363). O termo “erbB2” refere-se ao gene codificador de ErbB2 humano e “neu” refere-se ao gene codificador de p185^neu de rato. O ErbB2 preferido é um ErbB2 humano de seqüência nativa.

[043] “ErbB3” e “HER3” designam o polipeptídeo receptor descrito, por exemplo, nas patentes US 5.183.884 e 5.480.968, bem como em Kraus et al., PNAS (USA), 86:9193-9197, 1989.

[044] Os termos “ErbB4” e “HER4” designam no presente o polipeptídeo receptor descrito, por exemplo, no pedido de patente EP 599.274; Plowman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 90:1746-1750, 1993; e Plowman et al., Nature, 366:473-475, 1993, incluindo suas isoformas, conforme descrito, por exemplo, em WO 99/19488, publicado em 22 de abril de 1999.

[045] “Ligante de ErbB” indica um polipeptídeo que se liga a um receptor de ErbB e/ou o ativa. O ligante de ErbB de interesse específico no presente é um ligante de ErbB humano de seqüência nativa, tal como fator de crescimento epidérmico (EGF) (Savage et al., J. Biol. Chem., 247:7612-7621, 1972); fator alfa de crescimento de transformação (TGF-α) (Marquardt et al., Science, 223:1079-1082, 1984); anfirregulina, também conhecida como fator de crescimento de autocrina queratinócita ou schwanoma (Shoyab et al., Science,

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243:1074-1076, 1989; Kimura et al., Nature, 348:257-260, 1990; e Cook et al., Mol. Cell. Biol., 11:2547-2557, 1991); betacelulina (Shing et al., Science, 259:1604-1607, 1993; e Sasada et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 190:1173, 1993); fator de crescimento epidérmico ligado a heparina (HB-EGF) (Higashiyama et al., Science, 251:936-939, 1991); epirregulina (Toyoda et al., J. Biol. Chem., 270:7495-7500, 1995; e Komurasaki et al., Oncogene, 15:28412848, 1997); heregulina (vide abaixo); neurregulina-2 (NRG-2) (Carraway et al., Nature, 387:512-516, 1997); neurregulina-3 (NRG-3) (Zhang et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 94:9562-9567, 1997); neurregulina-4 (NRG-4) (Harari et al., Oncogene, 18:2681-89, 1999) ou cripto (CR-1) (Kannan et al., J. Biol. Chem., 272(6):3330-3335, 1997). Ligantes de ErbB que ligam EGFR incluem EGF, TGF-α, anfirregulina, betacelulina, HB-EGF e epirregulina. Ligantes de ErbB que se ligam ao ErbB3 incluem heregulinas. Ligantes de ErbB capazes de se ligarem ao ErbB4 incluem betacelulina, epirregulina, HB-EGF, NRG-2, NRG-3, NRG-4 e heregulinas.

[046] “Heregulina” (HRG), quando utilizada no presente, referese a um polipeptídeo codificado pelo produto genético heregulina, conforme descrito na patente US 5.641.869 ou Marchionni et al., Nature, 361:312-318, 1993. Exemplos de heregulinas incluem heregulina-α, heregulina-p1, heregulina-32 e heregulina-33 (Holmes et al., Science, 256:1205-1210, 1992; e patente US 5.641.869; fator de diferenciação neu (NDF) (Peles et al., Cell, 69:205-216, 1992); atividade indutora de receptor de acetilcolina (ARIA) (Falls et al., Cell, 72:801-815, 1993); fatores de crescimento glial (GGFs) (Marchionni et al., Nature, 362:312-318, 1993), fator derivado de neurônio de motor e sensorial (SMDF) (Ho et al., J. Biol. Chem., 270:14523-14532, 1995); γheregulina (Schaefer et al., Oncogene, 15:1385-1394, 1997). O termo inclui fragmentos biologicamente ativos e/ou variantes de seqüências de aminoácidos de um polipeptídeo de HRG de seqüência nativa, tal como um de

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16/135 seus fragmentos de domínios similares a EGF (por exemplo, HRGpi 177-244)· [047] Um “hétero-oligômero de ErbB” no presente é um oligômero associado de forma não covalente que compreende pelo menos dois receptores de ErbB diferentes. Esses complexos podem formar-se quando uma célula que expresse dois ou mais receptores de ErbB forem expostas a um ligante de ErbB e puderem ser isolados através de imunoprecipitação e analisados por SDS-PAGE, conforme descrito em Sliwkowski et al·, J. Biol. Chem., 269(20):14661-14665, 1994, por exemplo. Exemplos desses héterooligômeros de ErbB incluem complexos de EGFR-ErbB2, ErbB2-ErbB3 e ErbB3-ErbB4. Além disso, o hétero-oligômero de ErbB pode compreender dois ou mais receptores de ErbB2 combinados com um receptor de ErbB diferente, tal como ErbB3, ErbB4 ou EGFR. Outras proteínas, tais como uma subunidade receptora de citocina (por exemplo, gp130) podem ser incluídas no héterooligômero.

[048] Por “ativação de ligante de um receptor de ErbB”, designase transdução de sinal (causada, por exemplo, por um domínio de quinase intracelular de um receptor de ErbB que sofra fosforilação nos resíduos de tirosina no receptor de ErbB ou um polipeptídeo de substrato) mediado pela ligação de ligantes de ErbB a um hétero-oligômero de ErbB que compreende o receptor de ErbB de interesse. Geralmente, isso envolverá a ligação de um ligante de ErbB a um hétero-oligômero de ErbB que ative um domínio de quinase de um ou mais dos receptores de ErbB no hétero-oligômero e, portanto, resulta na fosforilação de resíduos de tirosina em um ou mais dos receptores de ErbB e/ou fosforilação de resíduos de tirosina em polipeptídeo(s) de substratos adicionais. A ativação de receptor de ErbB pode ser quantificada através da utilização de diversos ensaios de fosforilação de tirosina.

[049] Um polipeptídeo de “seqüência nativa” é aquele que possui a mesma seqüência de aminoácidos de um polipeptídeo (por exemplo, receptor

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17/135 de ErbB ou ligante de ErbB) derivado da natureza. Esses polipeptídeos de seqüências nativas podem ser isolados da natureza ou ser produzidos através de meios sintéticos ou recombinantes. Assim, um polipeptídeo de seqüência nativa pode ter a seqüência de aminoácido do polipeptídeo humano de ocorrência natural, polipeptídeo de murinos ou polipeptídeo de qualquer outra espécie de mamíferos.

[050] A expressão “variante de seqüência de aminoácido” referese a polipeptídeos que possuem seqüências de aminoácidos que diferem até certo ponto de um polipeptídeo de seqüência nativa. Normalmente, variantes de seqüência de aminoácido possuirão homologia de pelo menos cerca de 70% com pelo menos um domínio de ligação de receptores de um ligante de ErbB nativo ou com pelo menos um domínio de ligação de ligante de um receptor de ErbB nativo e, preferencialmente, serão de pelo menos mais cerca de 80%, de maior preferência pelo menos cerca de 90% homólogos com esses domínios de ligação de ligantes ou receptores. As variantes de seqüências de aminoácidos possuem substituições, exclusões e/ou inserções em certas posições na seqüência de aminoácido da seqüência de aminoácido nativa.

[051] “Homologia” é definida como o percentual de resíduos na variante de seqüência de aminoácidos que são idênticos após o alinhamento das seqüências e introdução de lacunas, se necessário, para atingir o percentual máximo de homologia. Métodos e programas de computador para o alinhamento são bem conhecidos na técnica. Um desses programas de computador é “Align 2”, de autoria da Genentech, Inc., que foi depositado com documentação de usuário no Escritório de Direitos Autorais dos Estados Unidos, Washington, DC 20559, Estados Unidos, em dez de dezembro de 1991.

[052] O termo “anticorpo”, da forma utilizada no presente, é empregado no sentido mais amplo e cobre especificamente anticorpos

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18/135 monoclonais intactos, anticorpos policlonais, anticorpos multiespecíficos (por exemplo, anticorpos biespecíficos) formados a partir de pelo menos dois anticorpos intactos e fragmentos de anticorpos, desde que exibam a atividade biológica desejada.

[053] A expressão “anticorpo monoclonal”, da forma utilizada no presente”, designa um anticorpo obtido a partir de uma população de anticorpos substancialmente homogêneos, ou seja, os anticorpos individuais que compreendem a população são idênticos, exceto por possíveis mutações de ocorrência natural que possam estar presentes em pequenas quantidades. Os anticorpos monoclonais são altamente específicos e dirigidos a um local antigênico isolado. Além disso, ao contrário das preparações de anticorpos policlonais que incluem anticorpos diferentes direcionados contra determinantes diferentes (epítopos), cada anticorpo monoclonal é dirigido a um determinante isolado sobre o antígeno. Além da sua especificidade, os anticorpos monoclonais são vantajosos por poderem ser sintetizados de forma não contaminada por outros anticorpos. O adjetivo “monoclonal” indica a característica do anticorpo como sendo obtida de uma população substancialmente homogênea de anticorpos e não deve ser interpretada como exigindo a produção do anticorpo através de qualquer método específico. Os anticorpos monoclonais a serem utilizados de acordo com a presente invenção podem ser fabricados através do método de hibridoma descrito em primeiro lugar por Kohler et al., Nature, 256:495, 1975, ou podem ser fabricados através de métodos de DNA recombinante (vide, por exemplo, patente US 4.816.567). Os “anticorpos monoclonais” podem também ser isolados a partir de bibliotecas de anticorpos de fagos, utilizando-se as técnicas descritas em Clackson et al., Nature, 352:624-628, 1991 e Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597, 1991, por exemplo.

[054] Os anticorpos monoclonais do presente incluem

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19/135 especificamente anticorpos “quiméricos”, em que uma parte da cadeia leve e/ou pesada é idêntica ou homóloga a seqüências correspondentes em anticorpos derivados de uma espécie específica ou que pertencem a uma classe ou subclasse específica de anticorpos, enquanto o restante da(s) cadeia(s) é idêntico ou homólogo a seqüências correspondentes em anticorpos derivados de outra espécie ou que pertençam à outra classe ou subclasse de anticorpos, bem como fragmentos desses anticorpos, desde que exibam a atividade biológica desejada (patente US 4.816.567; e Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 81:6851-6855, 1984). Os anticorpos quiméricos de interesse no presente incluem anticorpos “primatizados” que compreendem seqüências de ligação de antígenos de domínios variáveis derivadas de um primata não humano (por exemplo, macaco do velho mundo, macaco mono, etc.) e seqüências de região constante humana.

[055] “Fragmentos de anticorpos” compreendem uma parte de um anticorpo intacto, que compreende preferencialmente a ligação de antígenos ou sua região variável. Exemplos de fragmentos de anticorpos incluem fragmentos de Fab, Fab', F(ab')2 e Fv; diacorpos; anticorpos lineares; moléculas de anticorpos de cadeia simples; e anticorpos multiespecíficos formados a partir de fragmento(s) de anticorpos.

[056] Um anticorpo “intacto” é aquele que compreende uma região variável de ligação de antígenos, bem como um domínio constante de cadeia leve (CL) e domínios constantes de cadeia pesada, CH1, CH2 e CH3. Os domínios constantes podem ser domínios constantes de seqüências nativas (por exemplo, domínios constantes de seqüências nativas humanas) ou sua variante de seqüência de aminoácidos. Preferencialmente, o anticorpo intacto possui uma ou mais funções de efetores.

[057] “Funções de efetor” de anticorpos referem-se às atividades biológicas atribuíveis à região Fc (região Fc de seqüência nativa ou região Fc

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20/135 variante de seqüência de aminoácidos) de um anticorpo. Exemplos de funções de efetores de anticorpos incluem ligação C1q; citotoxicidade dependente de complemento; ligação de receptores de Fc; citotoxicidade mediada por células dependentes de anticorpos (ADCC); fagocitose; regulagem baixa de receptores de superfície celular (por exemplo, receptor de célula B; BCR), etc.

[058] Dependendo da seqüência de aminoácidos do domínio constante das suas cadeias pesadas, os anticorpos intactos podem ser atribuídos a diferentes “classes”. Existem cinco classes principais de anticorpos intactos: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, com diversos destes podendo ser adicionalmente divididos em “subclasses” (isotipos), tais como IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA e IgA2. Os domínios constantes de cadeia pesada que correspondem às diferentes classes de anticorpos são denominados α, δ, ε, γ e μ, respectivamente. As estruturas de subunidades e configurações tridimensionais de diferentes classes de imunoglobulinas são bem conhecidas.

[059] “Citotoxicidade mediada por células dependentes de anticorpos” e “ADCC” referem-se a uma reação mediada por células em que células citotóxicas não específicas que expressam receptores de Fc (FcRs) (por exemplo, células do tipo Natural Killer (NK), neutrófilos e macrófagos) reconhecem o anticorpo ligado em uma célula alvo e causa subseqüentemente lise da célula alvo. As células principais para a mediação de ADCC, células NK, expressam apenas FcyRIII, enquanto monócitos expressam FcyRI, FcyRII e FcyRIII. A expressão de FcR sobre células hematopoiéticas é resumida na Tabela 3 da página 464 de Ravetch e Kinet, Annu. Rev. Immunol., 9:457-92, 1991. Para determinar a atividade de ADCC de uma molécula de interesse, pode-se realizar um ensaio de ADCC in vitro, tal como o descrito na patente US 5.500.362 ou 5.821.337. Células efetoras úteis para esses ensaios incluem células mononucleares sangüíneas periféricas (PBMC) e células Natural Killer (NK). Alternativa ou adicionalmente, a atividade de ADCC da molécula de

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21/135 interesse pode ser determinada in vivo, por exemplo, em um modelo animal, tal como o descrito em Clynes et al., PNAS (USA), 95:652-656, 1998.

[060] “Células efetoras humano” são leucócitos que expressam um ou mais FcRs e realizam funções de efetor. Preferencialmente, as células expressam pelo menos FcyRIII e realizam função de efetor de ADCC. Exemplos de leucócitos humanos que mediam ADCC incluem células mononucleares sangüíneas periféricas (PBMC), células natural killer (NK), monócitos, células T citotóxicas e neutrófilos; com PBMCs e células de NK sendo preferidas. As células efetoras podem ser isoladas a partir de uma de suas fontes nativas, por exemplo a partir de sangue ou PBMCs, conforme descrito no presente.

[061] As expressões “receptor de Fc” ou “FcR” são utilizadas para descrever um receptor que se liga à região Fc de um anticorpo. O FcR preferido é um FcR humano de seqüência nativa. Além disso, um FcR preferido é aquele que se liga a um anticorpo de IgG (receptor gama) e inclui receptores das subclasses de FcyRI, FcyRII e FcyRIII, incluindo variantes alélicas e, alternativamente, formas divididas desses receptores. Os receptores de FcyRII incluem FcyRIIA (“receptor de ativação”) e FcyRIIB (“receptor de inibição”), que possuem seqüências de aminoácidos similares que diferem principalmente nos seus domínios citoplasmáticos. O receptor de ativação FcyRIIA contém um motivo de ativação com base em tirosina imunoreceptora (ITAM) em seu domínio citoplasmático. A inibição de receptor FcyRIIB contém um motivo de inibição com base em tirosina imunoreceptor (ITIM) no seu domínio citoplasmático (vide análise M. em Daeron, Annu. Rev. Immunol., 15:203-234, 1997). FcRs são analisados em Ravetch e Kinet, Annu. Rev. Immunol., 9:45792, 1991; Capel et al., Immunomethods, 4:25-34, 1994; e de Haas et al., J. Lab. Clin. Med., 126:330-41, 1995. Outros FcRs, incluindo aqueles a serem identificados no futuro, são englobados pelo termo “FcR” no presente. O termo

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22/135 também inclui o receptor neonatal, FcRn, que é responsável pela transferência de IgGs maternos para o feto (Guyer et al., J. Immunol., 117:587, 1976 e Kim et al., J. Immunol., 24:249, 1994).

[062] “Citotoxicidade complemento-dependente” ou “CDC” designa a capacidade de lise de um objetivo na presença de complemento de uma molécula. O processo de ativação de um complemento é iniciado pela ligação do primeiro componente do sistema de complemento (C1q) a uma molécula (por exemplo, um anticorpo) em complexo com um antígeno cognato. Para determinar a ativação do complemento, pode ser realizado um ensaio de CDC, por exemplo conforme descrito em Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods, 202:163, 1996.

[063] “Anticorpos nativos” são normalmente glicoproteínas heterotetraméricas de cerca de 150.000 daltons, compostos de duas cadeias leves (L) idênticas e duas cadeias pesadas (H) idênticas. Cada cadeia leve é ligada a uma cadeia pesada por uma ligação de dissulfeto covalente, enquanto o número de ligações de dissulfeto varia entre as cadeias pesadas de diferentes isotipos de imunoglobulina. Cada cadeia leve e pesada também possui pontes de dissulfeto intra-cadeias regularmente espaçadas. Cada cadeia pesada possui, em uma extremidade, um domínio variável (VH) seguido por uma série de domínios constantes. Cada cadeia leve possui um domínio variável em uma extremidade (VL) e um domínio constante na sua outra extremidade. O domínio constante da cadeia leve é alinhado com o primeiro domínio constante da cadeia pesada e o domínio variável de cadeia leve é alinhado com o domínio variável da cadeia pesada. Acredita-se que os resíduos de aminoácidos específicos formem uma camada intermediária entre os domínios variáveis de cadeia leve e de cadeia pesada.

[064] O termo “variável” refere-se ao fato de que certas partes dos domínios variáveis diferem extensamente de seqüência entre anticorpos e

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23/135 são utilizadas na ligação e especificidade de cada anticorpo específico para seu antígeno particular. Entretanto, a variabilidade não é regularmente distribuída ao longo dos domínios variáveis dos anticorpos. Ela é concentrada em três segmentos denominados regiões hiper-variáveis, tanto nos domínios variáveis de cadeia leve como de cadeia pesada. As partes mais altamente conservadas de domínios variáveis são denominadas regiões estruturais (FRs). Os domínios variáveis de cadeias pesadas e leves nativas compreendem quatro FRs cada, adotando em grande parte uma configuração β-pregueada, conectada por três regiões hiper-variáveis, que formam laços que conectam e, alguns casos, fazem parte da estrutura β-pregueada. As regiões hiper-variáveis de cada cadeia são mantidas juntas em boa proximidade pelos FRs e, com as regiões hiper-variáveis da outra cadeia, contribuem para a formação do local de ligação de antígenos de anticorpos (vide Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, quinta edição, Serviço de Saúde Pública, Institutos Nacionais de Saúde, Bethesda MD, Estados Unidos, 1991). Os domínios constantes não são diretamente envolvidos na ligação de um anticorpo a um antígeno, mas exibem diversas funções de efetor, tais como a participação do anticorpo em citotoxicidade celular anticorpo-dependente (ADCC).

[065] A expressão “região hiper-variável”, quando utilizada no presente, refere-se aos resíduos de aminoácidos de um anticorpo que sejam responsáveis pela ligação de antígenos. A região hiper-variável geralmente compreende resíduos de aminoácidos de uma “região de determinação de complementaridade” ou “CDR” (por exemplo, resíduos 24-34 (L1), 50-56 (L2) e 89-97 (L3) no domínio variável de cadeia leve e 31-35 (H1), 50-65 (H2) e 95102 (H3) no domínio variável de cadeia pesada; Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, quinta edição, Serviço de Saúde Pública, Institutos Nacionais de Saúde, Bethesda MD, Estados Unidos, 1991) e/ou os resíduos de um “circuito hiper-variável” (por exemplo, resíduos 26-32 (L1), 50

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24/135 (L2) e 91-96 (L3) no domínio variável de cadeia leve e 26-32 (H1), 53-55 (H2) e 96-101 (H3) no domínio variável de cadeia pesada; Chothia e Lesk, J. Mol. Biol., 196:901-917, 1987). Resíduos de “Região Estrutural” ou “FR” são os resíduos de domínios variáveis diferentes dos resíduos da região hipervariável, conforme definido no presente.

[066] A digestão de papaína de anticorpos produz dois fragmentos idênticos de ligação de antígenos, denominados fragmentos “Fab”, cada qual com um único local de ligação de antígenos, e um fragmento “Fc” residual, cujo nome reflete sua capacidade de cristalização rápida. O tratamento de pepsina gera um fragmento de F(ab')2 que contém dois sítios de ligação de antígenos e ainda é capaz da ligação cruzada ao antígeno.

[067] “Fv” é o fragmento de anticorpo mínimo que contém um local de reconhecimento de antígeno e ligação de antígeno completo. Esta região consiste de um dímero de um domínio variável de cadeia leve e um de cadeia pesada em associação firme e não covalente. É nesta configuração que as três regiões hiper-variáveis de cada domínio variável interagem para definir um local de ligação de antígeno sobre a superfície do dímero VH-VL. Coletivamente, as seis regiões hiper-variáveis conferem especificidade de ligação de antígenos ao anticorpo. Entretanto, mesmo um domínio variável isolado (ou metade de um Fv que compreende apenas três regiões hipervariáveis específicos para um antígeno) que possui a capacidade de reconhecimento e ligação de antígenos, embora em afinidade menor que todo o local de ligação.

[068] O fragmento Fab também contém o domínio constante da cadeia leve e o primeiro domínio constante (CH1) da cadeia pesada. Os fragmentos de Fab’ diferem de fragmentos de Fab pela adição de alguns resíduos no terminal carbóxi do domínio CH1 de cadeia pesada que incluem uma ou mais cisteínas da região suspensa do anticorpo. Fab’-SH é a

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25/135 designação no presente para Fab' em que o(s) resíduo(s) de cisteína dos domínios constantes apresenta(m) pelo menos um grupo de tiol livre. Os fragmentos de anticorpos F(ab')2 foram originalmente produzidos na forma de pares de fragmentos Fab' que possuem cisteínas suspensas entre elas. Outros acoplamentos químicos de fragmentos de anticorpos também são conhecidos.

[069] As “cadeias leves” de anticorpos de qualquer espécie vertebrada podem ser atribuídas a um dentre dois tipos claramente distintos, denominados kappa (κ) e lambda (λ), com base nas seqüências de aminoácidos dos seus domínios constantes.

[070] Os fragmentos de “Fv de cadeia simples” ou “scFv” compreendem os domínios VH e VL de anticorpo, em que esses domínios estão presentes em uma cadeia simples de polipeptídeo. Preferencialmente, o polipeptídeo Fv compreende adicionalmente um ligante de polipeptídeo entre os domínios VH e VL que permite que o scFv forme a estrutura desejada para ligação de antígenos. Para análise de scFv, vide Plückthun em The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg e Moore eds., Springer-Verlag, Nova Iorque, Estados Unidos, págs. 269-315, 1994. Fragmentos de scFv de anticorpos anti-ErbB2 são descritos em WO 93/16185; patente US 5.571.894; e patente US 5.587.458.

[071] O termo “diacorpos” refere-se a pequenos fragmentos de anticorpos com dois sítios de ligação de antígenos, com os fragmentos compreendendo um domínio pesado variável (VH) conectado a um domínio leve variável (VL) na mesma cadeia de polipeptídeos (VH - VL). Através da utilização de uma ligação que seja curta demais para permitir o emparelhamento entre os dois domínios sobre a mesma cadeia, os domínios são forçados a emparelhar-se com os domínios complementares de outra cadeia e criar dois sítios de ligação de antígenos. Os diacorpos são descritos mais completamente, por exemplo, em EP 404.097; WO 93/11161; e Hollinger

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26/135 et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 90:6444-6448, 1993.

[072] Formas “humanizadas” de anticorpos não humanos (por exemplo, de roedores) são anticorpos quiméricos que contêm seqüências mínimas derivadas de imunoglobulina não humana. Na maior parte, os anticorpos humanizados são imunoglobulinas humanas (anticorpos receptores) em que resíduos de uma região hiper-variável do receptor são substituídos por resíduos de uma região hiper-variável de uma espécie não humana (anticorpo doador), tal como camundongo, rato, coelho ou primata não humano que possui a especificidade, afinidade e capacidade desejada. Em alguns casos, resíduos de região estrutural (FR) da imunoglobulina humana são substituídos por resíduos não humanos correspondentes. Além disso, os anticorpos humanizados podem compreender resíduos que não são encontrados no anticorpo receptor ou no anticorpo doador. Essas modificações são feitas para refinar adicionalmente o desempenho do anticorpo. De forma geral, o anticorpo humanizado compreenderá substancialmente todos ou pelo menos um, tipicamente dois, domínios variáveis, nos quais todos ou substancialmente todos os circuitos hiper-variáveis correspondem aos de uma imunoglobulina não humana e todos ou substancialmente todos os FRs são os de uma seqüência de imunoglobulina humana. O anticorpo humanizado também compreenderá opcionalmente pelo menos uma parte de uma região constante de imunoglobulina (Fc), tipicamente o de uma imunoglobulina humana. Para detalhes adicionais, vide Jones et al., Nature, 321:522-525, 1986; Riechmann et al., Nature, 332:323-329, 1988; e Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2:593-596, 1992.

[073] Anticorpos anti-ErbB2 humanizados incluem huMAb4D5-1, huMAb4D5-2, huMAb4D5-3, huMAb4D5-4, huMAb4D5-5, huMAb4D5-6, huMAb4D5-7 e huMAb4D5-8 (Herceptin^®), conforme descrito na Tabela 3 da patente US 5.821.337, expressamente incorporada ao presente como

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27/135 referência; 520C9 humanizado (WO 93/21319) e anticorpos 2C4 humanizados conforme descrito abaixo.

[074] Um anticorpo “isolado” é aquele que foi identificado e separado e/ou recuperado de um componente do seu ambiente natural. Os componentes contaminantes do seu ambiente natural são materiais que interfeririam com utilizações diagnósticas ou terapêuticas para o anticorpo e podem incluir enzimas, hormônios e outros solutos proteináceos ou não proteináceos. Em realizações preferidas, o anticorpo será purificado (1) até mais de 95% em peso de anticorpo, conforme determinado através do método de Lowry, e, de maior preferência, mais de 99% em peso, (2) em grau suficiente para a obtenção de pelo menos quinze resíduos de seqüência de aminoácidos interna ou de N-terminal, através da utilização de um seqüenciador de copos de rotativo, ou (3) até homogeneidade através de SDSPAGE sob condições de redução ou não redução, utilizando azul de Coomassie ou preferencialmente, manchas de prata. O anticorpo isolado inclui o anticorpo in situ em células recombinantes, já que pelo menos um componente do ambiente natural do anticorpo não estará presente. Normalmente, entretanto, o anticorpo isolado será preparado através de pelo menos uma etapa de purificação.

[075] Um anticorpo “que se liga” a um antígeno de interesse, tal como antígeno ErbB2, é aquele capaz de se ligar ao antígeno com afinidade suficiente, de tal forma que o anticorpo seja útil como agente terapêutico para direcionar uma célula que expresse o antígeno. Quando o anticorpo for um que se liga ao ErbB2, ele normalmente ligará de preferência ao ErbB2, em oposição a outros receptores de ErbB e pode ser um que não apresente reação cruzada significativa com outras proteínas, tais como EGFR, ErbB3 ou ErbB4. Nessas realizações, a extensão de ligação do anticorpo a essas proteínas não-ErbB2 (por exemplo, ligação de superfície celular a receptor endógeno) será de

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28/135 menos de 10%, conforme determinado por análise de ordenamento celular ativado por fluorescência (FACS) ou radioimunoprecipitação (RIA). Algumas vezes, o anticorpo anti-ErbB2 não apresentará reação cruzada significativa com a proteína neu de rato, conforme descrito, por exemplo, em Schecter et al., Nature, 312:513, 1984 e Drebin et al., Nature, 312:545-548, 1984.

[076] Um anticorpo que “bloqueia” a ativação de ligantes de um receptor de ErbB é aquele que reduz ou evita essa ativação conforme definido acima, em que o anticorpo é capaz de bloquear a ativação de ligantes do receptor de ErbB de forma substancialmente mais eficaz que o 4D5 de anticorpo monoclonal, por exemplo, de forma aproximadamente tão eficaz quanto anticorpos monoclonais 7F3 ou 2C4 ou seus fragmentos de Fab e, preferencialmente, de forma aproximadamente tão eficaz conforme anticorpo monoclonal 2C4 ou um de seus fragmentos de Fab. O anticorpo que bloqueia a ativação de ligantes de um receptor de ErbB, por exemplo, pode ser aquele que é cerca de 50 a 100% mais eficaz que 4D5 no bloqueio da formação de um hétero-oligômero de ErbB. O bloqueio da ativação de ligantes de um receptor de ErbB pode ocorrer através de qualquer meio, através, por exemplo, de interferência com: ligação de ligante a um receptor de ErbB, formação de complexo de ErbB, atividade de tirosina quinase de um receptor de ErbB em um complexo de ErbB e/ou fosforilação de resíduo(s) de tirosina quinase em ou por um receptor de ErbB. Exemplos de anticorpos que bloqueiam a ativação de ligantes de um receptor de ErbB incluem os anticorpos monoclonais 2C4 e 7F3 (que bloqueiam a ativação por HRG de ErbB2/ErbB3 e hétero-oligômeros de ErbB2/ErbB4; e ativação por epirregulina, EGF, TGF-α, anfirregulina e/ou HBEGF de um hétero-oligômero de EGFR/ErbB2); e anticorpos L26, L96 e L288 (Klapper et al., Oncogene, 14:2099-2109, 1997), que bloqueiam a ligação de EGF e NDF a células T47D que expressam EGFR, ErbB2, ErbB3 e ErbB4.

[077] Um anticorpo que possui “característica biológica” de um

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29/135 anticorpo designado, tal como o anticorpo monoclonal designado 2C4, é aquele que possui uma ou mais características biológicas daquele anticorpo que o distingue de outros anticorpos que se ligam ao mesmo antígeno (por exemplo, ErbB2). Um anticorpo com uma característica biológica de 2C4, por exemplo, pode bloquear a ativação de HRG de um hétero-oligômero de ErbB que compreende ErbB2 e ErbB3 ou ErbB4; bloquear a ativação por anfirregulina, EGF, TGF-α, HB-EGF e/ou epirregulina de um receptor de ErbB que compreende EGFR e ErbB2; bloquear a ativação mediada por HRG, EGF e/ou TGF-α de MAPK; e/ou ligar o mesmo epítopo no domínio extracelular de ErbB2 que o ligado por 2C4 (que bloqueia, por exemplo, a ligação de anticorpo monoclonal 2C4 a ErbB2).

[078] A menos que indicado em contrário, a expressão “anticorpo monoclonal 2C4” designa um anticorpo que contenha resíduos de ligação de antígenos do anticorpo 2C4 de murino dos Exemplos abaixo ou dele derivados. O anticorpo monoclonal 2C4 pode ser, por exemplo, anticorpo 2C4 monoclonal de murinos ou uma de suas variantes, tais como anticorpo 2C4 humanizado, que possui resíduos de aminoácidos de ligação de antígenos de anticorpo monoclonal 2C4 de murinos. Exemplos de anticorpos 2C4 humanizados são fornecidos no Exemplo 3 abaixo. A menos que indicado em contrário, a expressão “rhuMAb 2C4”, quando utilizada no presente, designa um anticorpo que compreende a seqüência leve variável (Vl) e pesada variável (Vh) de SEQ ID N^o 3 e 4, respectivamente, fundidas a seqüências de região constante IgGI leve e pesado humano (alótipo não-A) expressas opcionalmente por uma célula de Ovário de Hamster Chinês (CHO).

[079] A menos que indicado em contrário, a expressão “anticorpo monoclonal 4D5” refere-se a um anticorpo que contém resíduos de ligação de antígenos do anticorpo 4D5 de murinos (ATCC CRL 10463), ou dele derivados. O anticorpo monoclonal 4D5 pode ser, por exemplo, anticorpo monoclonal 4D5

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30/135 de murinos ou uma de suas variantes, tais como 4D5 humanizado, que possui resíduos de ligação de antígenos de anticorpo monoclonal 4D5 de murino. Exemplos de anticorpos 4D5 humanizados incluem huMAb4D5-1, huMAb4D52, huMAb4D5-3, huMAb4D5-4, huMAb4D5-5, huMAb4D5-6, huMAb4D5-7 e huMAb4D5-8 (Herceptin®), como na patente US 5.821.337, com huMAb4D5-8 (Herceptin^®) sendo um anticorpo 4D5 humanizado preferido.

[080] Um “agente inibidor do crescimento”, quando utilizado no presente, designa um composto ou composição que inibe o crescimento de uma célula, especialmente uma célula cancerosa que expressa ErbB, seja in vitro ou in vivo. Assim, o agente inibidor do crescimento pode ser um que reduza significativamente o percentual de células de expressão de ErbB em fase S. Exemplos de agentes inibidores do crescimento incluem agentes que bloqueiem o andamento do ciclo celular (em local diferente da fase S), tais como agentes que induzam a interrupção de G1 e a interrupção da fase M. Bloqueadores clássicos da fase M incluem as vincas (vincristina e vinblastina), taxanos e inibidores de topo II, tais como doxorubicina, epirubicina, daunorubicina, etoposida e bleomicina. Os agentes que interrompem G1 também influem na interrupção da fase S, por exemplo, agentes alquilantes de DNA, tais como tamoxifeno, prednisona, dacarbazina, mecloretamina, cisplatina, metotrexato, 5-fluorouracil e ara-C. Informações adicionais podem ser encontradas em The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn e Israel, eds., Capítulo 1, intitulado Cell Cycle Regulation, Oncogenes and Antineoplastic Drugs, por Murakami et al. (WB Saunders: Filadélfia, Estados Unidos, 1995), especialmente pág. 13.

[081] Exemplos de anticorpos “inibidores do crescimento” são aqueles que se ligam a ErbB2 e inibem o crescimento de células cancerosas que sobre-expressem ErbB2. Os anticorpos anti-ErbB2 inibidores do crescimento preferidos inibem o crescimento de células tumorais mamárias SK

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BR-3 em cultivo celular em mais de 20% e, preferencialmente, mais de 50% (por exemplo, cerca de 50% a cerca de 100%) em concentração de anticorpos de cerca de 0,5 a 30 pg/ml, em que a inibição do crescimento é determinada em seis dias após a exposição das células SK-BR-3 ao anticorpo (vide patente US 5.677.171 concedida em 14 de outubro de 1997). O ensaio de inibição do crescimento da célula SK-BR-3 é descrito em mais detalhes naquela patente e a seguir. O anticorpo inibidor do crescimento preferido é anticorpo monoclonal 4D5, tal como 4D5 humanizado.

[082] Um anticorpo que “induz a morte celular” é um que faz com que uma célula viável torne-se inviável. A célula é geralmente uma que expresse o receptor de ErbB2, especialmente quando a célula sobre-expresse o receptor de ErbB2. Preferencialmente, a célula é uma célula cancerosa, tal como uma célula da mama, ovário, estômago, endométrio, glândula salivar, pulmão, rim, cólon, tiróide, pâncreas ou bexiga. In vitro, a célula pode ser uma célula SK-BR-3, BT474, Calu 3, MDA-MB-453, MDA-MB-361 ou SKOV3. A morte celular in vitro pode ser determinada na ausência de complemento e células efetoras imunológicas para distinguir a morte celular induzida por citotoxicidade mediada por célula anticorpo-dependente (ADCC) ou citotoxicidade complemento-dependente (CDC). Assim, o ensaio de morte celular pode ser realizado através da utilização de soro desativado por calor (ou seja, na ausência de complemento) e na ausência de células efetoras imunológicas. Para determinar se o anticorpo é capaz de induzir a morte celular, a perda da integridade da membrana é avaliada pela retirada de iodeto de propídeo (PI) e azul de tripano (vide Moore et al., Cytotechnology, 17:1-11, 1995) ou 7AAD pode ser determinado com relação a células não tratadas. Os anticorpos preferidos que induzem a morte celular são aqueles que induzem a retirada de PI no ensaio de retirada de PI em células de BT474 (vide abaixo).

[083] Um anticorpo que “induz a apoptose” é aquele que induza a

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32/135 morte celular programada conforme determinado pela ligação de anexina V, fragmentação de DNA, contração celular, dilatação de retículo endoplasmático, fragmentação celular e/ou formação de bolhas membranosas (denominados corpos apoptóticos). A célula é normalmente aquela que sobre-expressa o receptor de ErbB2. Preferencialmente, a célula é uma célula tumoral, tal como uma célula de mama, ovário, estômago, endométrio, glândula salivar, pulmão, rim, cólon, tiróide, pâncreas ou bexiga. In vitro, a célula pode ser uma célula SK-BR-3, BT474, Calu 3, MDA-MB-453, MDA-MB-361 ou SKOV3. Diversos métodos são disponíveis para a avaliação dos eventos celulares associados com apoptose. A translocação de fosfatidil serina (PS), por exemplo, pode ser medida por ligação de anexina; a fragmentação de DNA pode ser avaliada através de escadas de DNA; e a condensação de cromatina/nuclear juntamente com fragmentação de DNA pode ser avaliada por qualquer aumento das células hipodiplóides. Preferencialmente, o anticorpo que induz a apoptose é aquele que resulta em indução em cerca de 2 a 50 vezes, preferencialmente cerca de 5 a 50 vezes e, de maior preferência, cerca de 10 a 50 vezes, de ligação de anexina com relação à célula não tratada em um ensaio de ligação de anexina, através da utilização de células BT474 (vide abaixo). Algumas vezes, o anticorpo pró-apoptótico será aquele que bloqueie adicionalmente a ativação de ligante ErbB de um receptor de ErbB (por exemplo, anticorpo 7F3); ou seja, o anticorpo compartilha uma característica biológica com anticorpo monoclonal 2C4. Em outras situações, o anticorpo é aquele que não bloqueia significativamente a ativação de ligantes de ErbB de um receptor de ErbB (por exemplo, 7C2). Além disso, o anticorpo pode ser um similar a 7C2 que, embora induza a apoptose, não induz uma redução grande no percentual de células em fase S (por exemplo, um que induza apenas redução de cerca de 0 a 10% do percentual dessas células com relação ao controle).

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33/135 [084] O “epítopo 2C4” é a região do domínio extracelular de ErbB2 à qual se liga o anticorpo 2C4. A fim de selecionar anticorpos que se ligam ao epítopo 2C4, pode-se realizar um ensaio de bloqueio cruzado de rotina, tal como o descrito em Antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow e David Lane, 1988. Alternativamente, pode-se realizar mapeamento de epítopos para determinar se o anticorpo se liga ao epítopo 2C4 de ErbB2 (por exemplo, qualquer um ou mais resíduos da região próxima do resíduo 22 até perto do resíduo 584 de ErbB2, inclusive; vide Figs. 1A e B).

[085] O “epítopo 4D5” é a região no domínio extracelular de ErbB2 à qual se liga o anticorpo 4D5 (ATCC CRL 10463). Este epítopo fica próximo ao domínio trans-membranoso de ErbB2. Para selecionar os anticorpos que se ligam ao epítopo 4D5, pode-se realizar um ensaio de bloqueio cruzado de rotina, tal como o descrito em Antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow e David Lane, 1988. Alternativamente, pode-se realizar o mapeamento de epítopos para determinar se o anticorpo se liga ao epítopo 4D5 de ErbB2 (por exemplo, qualquer um ou mais resíduos na região próxima do resíduo 529 até perto do resíduo 625, inclusive; vide Figs. 1A e B).

[086] O “epítopo 3H4” é a região do domínio extracelular de ErbB2 à qual se liga o anticorpo 3H4. Este epítopo inclui resíduos de cerca de 541 a cerca de 599, inclusive, na seqüência de aminoácidos do domínio extracelular de ErbB2; vide Figs. 1A e B.

[087] O “epítopo 7C2/7F3” é a região no N-terminal do domínio extracelular de ErbB2 à qual se ligam os anticorpos 7C2 e/ou 7F3 (cada qual depositado no ATCC, vide abaixo). Para selecionar os anticorpos que se ligam ao epítopo de 7C2/7F3, pode-se realizar um ensaio de bloqueio cruzado de rotina, tal como o descrito em Antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring

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Harbor Laboratory, Ed Harlow e David Lane, 1988. Alternativamente, pode-se realizar o mapeamento de epítopos para determinar se o anticorpo se liga ao epítopo 7C2/7F3 sobre ErbB2 (por exemplo, qualquer um ou mais dos resíduos na região próxima do resíduo 22 até perto do resíduo 53, inclusive; vide Figs. 1A e B).

[088] “Tratamento” designa o tratamento terapêutico e medidas profiláticas ou preventivas. Os necessitados de tratamento incluem aqueles que já possuem a disfunção, bem como aqueles em que a disfunção deva ser evitada. Portanto, o mamífero a ser tratado no presente pode ter sido diagnosticado como portador da disfunção ou pode ser predisposto ou suscetível à disfunção.

[089] “Mamífero”, para os propósitos do tratamento, designa qualquer animal classificado como mamífero, incluindo seres humanos, animais domésticos e de fazenda, e animais de zoológico, esportivos ou domésticos, tais como cães, cavalos, gatos, vacas, etc. Preferencialmente, o mamífero é um ser humano.

[090] Uma “disfunção” é qualquer condição que se beneficiaria do tratamento com o anticorpo anti-ErbB2. Isso inclui disfunções ou doenças crônicas e agudas, que incluem as condições patológicas que predispõem o mamífero à disfunção em questão. Exemplos não limitadores de disfunções a serem tratadas no presente incluem tumores benignos e malignos; leucemias e malignidades linfóides; disfunções neurais, gliais, astrocitais, hipotalâmicos e outras glandulares, macrofagais, epiteliais, estromais e blastocoélicas; e disfunções inflamatórias, angiogênicas e imunológicas.

[091] A expressão “quantidade terapeuticamente eficaz” designa uma quantidade de droga eficaz para o tratamento de uma doença ou disfunção em mamíferos. No caso de câncer, a quantidade terapeuticamente eficaz da droga pode reduzir o número de células cancerosas; reduzir o

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35/135 tamanho do tumor; inibir (ou seja, reduzir a velocidade até certo ponto e, preferencialmente, parar) a infiltração de células cancerosas em órgãos periféricos; inibir (ou seja, reduzir a velocidade até certo ponto e, preferencialmente, parar) metástase tumoral; inibir, até certo ponto, o crescimento tumoral; e/ou liberar até certo ponto um ou mais dos sintomas associados com o câncer. Até o ponto em que a droga pode evitar o crescimento e/ou matar células cancerosas existentes, ela pode ser citostática e/ou citotóxica. Para a terapia de câncer, a eficácia pode ser medida, por exemplo, através da determinação do tempo para o avanço da doença (TTP) e/ou determinação da velocidade de reação (RR).

[092] Os termos “câncer” e “canceroso” designam ou descrevem a condição fisiológica em mamíferos que é tipicamente caracterizada por crescimento celular desregulado. Os exemplos de câncer incluem, mas sem limitar-se a carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma e leucemia ou malignidades de linfóide. Exemplos mais específicos desses cânceres incluem câncer celular escamoso (por exemplo, câncer celular escamoso epitelial), câncer pulmonar que inclui câncer pulmonar de células pequenas, câncer pulmonar de células não-pequenas, adenocarcinoma pulmonar e carcinoma escamoso pulmonar, câncer do peritônio, câncer hepatocelular, câncer gástrico ou estomacal que inclui câncer gastrintestinal, câncer pancreático, glioblastoma, câncer cervical, câncer do ovário, câncer do fígado, câncer da bexiga, hepatoma, câncer de mama, câncer do cólon, câncer retal, câncer colo-retal, carcinoma endometrial ou uterino, carcinoma da glândula salivar, câncer renal ou dos rins, câncer da próstata, câncer da vulva, câncer da tiróide, carcinoma hepático, carcinoma anal e carcinoma peniano, bem como câncer do cérebro e da garganta.

[093] Um “câncer de expressão de ErbB” é um que compreende células que possuem proteína de ErbB presente na sua superfície celular. Um “câncer de expressão de ErbB2” é um que produza níveis suficientes de ErbB2

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36/135 na superfície das suas células, de forma que um anticorpo anti-ErbB2 possa ligar-se a ela e apresentar um efeito terapêutico com relação ao câncer.

[094] Um câncer “caracterizado por ativação excessiva” de um receptor de ErbB é aquele em que a extensão da ativação do receptor de ErbB em células cancerosas excede significativamente o nível de ativação daquele receptor em células não cancerosas do mesmo tipo de tecido. Essa ativação excessiva pode resultar da sobre-expressão do receptor de ErbB e/ou níveis maiores que os normais de um ligante de ErbB disponível para a ativação do receptor de ErbB nas células cancerosas. Essa ativação excessiva pode causar e/ou ser causada pelo estado maligno de uma célula cancerosa. Em algumas realizações, o câncer será submetido a um ensaio de diagnóstico ou prognóstico para determinar se está ocorrendo à amplificação e/ou sobreexpressão de um receptor de ErbB, o que resulta nessa ativação excessiva do receptor de ErbB. Alternativa ou adicionalmente, o câncer pode ser submetido a um ensaio de diagnóstico ou prognóstico para determinar se está ocorrendo no câncer amplificação e/ou sobre-expressão de um ligante de ErbB que seja atribuída a excesso de ativação do receptor. Em um subconjunto desses cânceres, o excesso de ativação do receptor pode resultar de um processo estimulador autócrino.

[095] Em um processo estimulador “autócrino”, a autoestimulação ocorre em virtude do fato da célula cancerosa produzir um ligante de ErbB e seu receptor de ErbB cognato. O câncer pode, por exemplo, expressar ou sobre-expressar EGFR e também expressar ou sobre-expressar um ligante de EGFR (por exemplo, EGF, TGF-α ou HB-EGF). Em outra realização, o câncer pode expressar ou sobre-expressar ErbB2 e também expressar ou sobre-expressar uma heregulina (por exemplo, γ-HRG).

[096] Um câncer que “sobre-expressa” um receptor de ErbB é um que contenha níveis significativamente mais altos de um receptor de ErbB,

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37/135 tal como ErbB2, na sua superfície celular, em comparação com uma célula não cancerosa do mesmo tipo de tecido. Essa sobre-expressão pode ser causada pela amplificação genética ou pelo aumento da transcrição ou tradução. A sobre-expressão do receptor de ErbB pode ser determinada em um ensaio de diagnóstico ou prognóstico, através de avaliação dos níveis maiores da proteína de ErbB presentes sobre a superfície de uma célula (por exemplo, através de um ensaio de imunohistoquímica; IHC). Alternativa ou adicionalmente, podem-se medir os níveis de ácido nucléico codificador de ErbB na célula, por exemplo, através de técnicas de hibridação in situ fluorescente (FISH; vide WO 98/45479, publicado em outubro de 1998), Southern Blot ou reação em cadeia de polimerase (PCR), tais como PCR quantitativa em tempo real (RT-PCR). Pode-se também estudar a sobreexpressão de receptor de ErbB através da medição do antígeno derramado (domínio extracelular de ErbB, por exemplo) em um fluido biológico, tal como soro (vide, por exemplo, patente US 4.933.294 concedida em 12 de junho de 1990; WO 91/05264, publicada em 18 de abril de 1991; patente US 5.401.638, concedida em 28 de março de 1995; e Sias et al., J. Immunol. Methods, 132:73-80, 1990). Além dos ensaios acima, diversos ensaios in vivo são disponíveis para os técnicos no assunto. Pode-se, por exemplo, expor células no interior do corpo do paciente a um anticorpo, que é opcionalmente marcado com um marcador detectável, por exemplo um isótopo radioativo, e pode-se avaliar a ligação do anticorpo as células do paciente, por exemplo, através da varredura externa em busca de radioatividade ou de análise de uma biópsia tomada de um paciente exposto anteriormente ao anticorpo.

[097] Por outro lado, um câncer que “não é caracterizado por sobre-expressão do receptor de ErbB2” é aquele que, em um ensaio de diagnóstico, não expressa níveis mais altos que o normal de receptor de ErbB2 em comparação com uma célula não cancerosa do mesmo tipo de tecido.

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38/135 [098] Um câncer que “sobre-expressa” um ligante de ErbB é um que produza níveis significativamente mais altos do ligante em comparação com uma célula não cancerosa do mesmo tipo de tecido. Essa sobreexpressão pode ser causada pela amplificação genética ou por maior transcrição ou tradução. A sobre-expressão do ligante de ErbB pode ser determinada na forma de diagnóstico através da avaliação dos níveis do ligante (ou ácido nucléico que o codifica) no paciente, por exemplo, em uma biópsia de tumor ou através de diversos ensaios de diagnóstico, tais como IHC, FISH, Southern Blot, PCR ou ensaios in vivo descritos acima.

[099] Um câncer “independente de hormônios” é aquele em que a sua proliferação não é dependente da presença de um hormônio que se liga a um receptor expresso por células no câncer. Esses cânceres não passam por regressão clínica mediante administração de estratégicas cirúrgicas ou farmacológicas que reduzam a concentração de hormônios no tumor ou perto dele. Exemplos de cânceres independentes de hormônios incluem câncer da próstata independente de androgêneos, câncer de mama independente de estrogêneos, câncer endometrial e câncer ovariano. Esses cânceres podem iniciar-se na forma de tumores dependentes de hormônios e progridem de um estágio sensível a hormônios para um tumor refratário a hormônios, seguindose terapia hormonal.

[0100] A expressão “agente citotóxico”, da forma utilizada no presente, designa uma substância que iniba ou evite a função das células e/ou cause a destruição das células. A expressão destina-se a incluir isótopos _radi_oati_vos (_{por exemp}l_o At²¹¹ I¹³¹ I¹²⁵ Y⁹⁰ Re¹⁸⁶ Re¹⁸⁸ Sm¹⁵³ Bi²¹² P³² e radioativos (por exemplo, At , I , I , Y , Re , Re , Sm , Bi , P e isótopos radioativos de Lu), agentes quimioterapêuticos e toxinas, tais como toxinas de molécula pequena ou toxinas enzimaticamente ativas de origem bacteriana, fúngica, vegetal ou animal, incluindo seus fragmentos e/ou variantes.

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39/135 [0101] Um “agente quimioterapêutico” é um composto químico útil no tratamento de câncer. Exemplos de agentes quimioterapêuticos incluem agentes alquilantes, tais como tiotepa e ciclosfosfamida (Cytoxan^®); sulfonatos alquila, tais como busulfam, improsulfam e piposulfam; aziridinas, tais como benzodopa, carboquona, meturedopa e uredopa; etileniminas e metilamelaminas, que incluem altretamina, trietileno melamina, trietileno fosforamida, trietilenotio fosforamida e trimetilol melamina; mostardas de nitrogênio tais como clorambucil, clornafazina, colofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, cloridrato óxido de mecloretamina, melfalan, novembiquina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostarda de uracila, nitrosuréias tais como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina, ranimustina; antibióticos, tais como aclacinomisinas, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, caliqueamicina, carabicina, carminomicina, carzinofilina, cromomicinas, dactinomicina, daunorubicina, detorubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, doxorubicina, epirubicina, esorubicina, idarubicina, marcelomicina, mitomicinas, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorubicina; anti-metabólitos tais como metotrexato e 5fluorouracil (5-FU); análogos de ácido fólico, tais como denopterina, metotrexato, pteropterina, trimetrexato; análogos de purina tais como fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamipurina, tioguanina, análogos de pirimidina, tais como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, dideoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina, 5-FU; androgêneos tais como calusterona, propionato de dromostanolona, epitiostanol, mepitiostana, testolactona; anti-adrenais tais como aminoglutetimida, mitotana, trilostana, repositor de ácido fólico tal como ácido frolínico; aceglatona; glicosídeo de aldofosfamida; ácido aminolevulínico; amsacrina; bestrabucil; bisantreno;

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40/135 edatraxato; defofamina; demecolcina; diaziquona; elfornitina; acetato de eliptínio; etoglucid; nitrato de gálio; hidroxi uréia; lentinan; lonidamina; mitoguazona; mitoxantrona; mopidamol; nitracrina; pentostatin; fenamet; pirarubicin; ácido podofilínico; hidrazida de 2-etila; procarbazina; PSK®; razoxana; sizofiran; espirogermânio; ácido tenuazônico; triaziquona; 2,2’,2”triclorotrietilamina; uretano; vindesina; dacarbazina; manomustina; mitobronitol; mitolactol; pipobroman; gacitosina; arabinosida (“Ara-C”); ciclofosfamida; tiotepa; taxanos, tais como paclitaxel (Taxol®, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton NJ, Estados Unidos) e doxetaxel (Taxotere®, Rhône-Poulenc Rorer, Antony, França); clorambucil, gemcitabina; 6-tioguanina; mercaptopurina; metotrexato; análogos de platina, tais como cisplatina e carboplatina; vinblastina; platina; etoposida (VP-16); ifosfamida; mitomicina C; mitoxantrona; vincristina; vinorelbina; navelbina; novantrona; teniposídeo; daunomicina; aminopterina; xeloda; ibandronato; CPT-11; inibidor de topoisomerase RFS2000; difluoro metil ornitina (DMFO); ácido retinóico; esperamicinas; capecitabina; e sais, ácidos ou derivados farmaceuticamente aceitáveis de quaisquer dos acima. Também estão incluídos nesta definição os agentes antihormonais que agem para regular ou inibir a ação hormonal sobre tumores, tais como anti-estrógenos, incluindo, por exemplo, 4(5)-imidazóis inibidores de tamoxifeno, raloxifeno e aromatase, 4-hidroxi tamoxifeno, trioxifeno, queoxifeno, LY117018, onapristona e toremifeno (Fareston); e antiandrogêneos tais como flutamida, nilutamida, bicalutamida, leuprolida e goserelina; e sais, ácidos ou derivados farmaceuticamente aceitáveis de quaisquer dos acima.

[0102] Da forma utilizada no presente, a “droga desejada por EGFR” refere-se a um agente terapêutico que se liga a EGFR e, opcionalmente, inibe a ativação de EGFR. Exemplos desses agentes incluem anticorpos e moléculas pequenas que se ligam a EGFR. Exemplos de

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41/135 anticorpos que se ligam a EGFR incluem MAb 579 (ATCC CRL HB 8506), MAb 455 (ATCC CRL HB8507), MAb 225 (ATCC CRL 8508), MAb 528 (ATCC CRL 8509) (vide patente US 4.943.533, Mendelsohn et al.) e suas variantes, tais como 225 quimérico (C225) e 225 humano remodelado (H225) (vide WO 96/40210, Imclone Systems Inc.); anticorpos que se ligam a EGFR mutante do tipo II (patente US 5.212.290); antibióticos quiméricos e humanizados que ligam EGFR, conforme descrito na patente US 5.891.996; e anticorpos humanos que ligam EGFR (vide WO 98/50433, Abgenix). O anticorpo antiEGFR pode ser conjugado com um agente citotóxico, de forma a gerar um imunoconjugado (vide, por exemplo, EP 659.439 A2, Merck Patent GmbH). Exemplos de moléculas pequenas que se ligam a EGFR incluem ZD1839 (Astra Zeneca), CP-358774 (OSI/Pfizer) e AG1478.

[0103] Um “agente anti-angiogênico” designa um composto que bloqueia ou interfere até certo grau no desenvolvimento de vasos sangüíneos. O fator anti-angiogênico pode, por exemplo, ser uma molécula pequena ou anticorpo que se liga a um fator de crescimento ou receptor de fator de crescimento envolvido na promoção de angiogênese. O fator anti-angiogênico preferido no presente é um anticorpo que se liga ao Fator de Crescimento Endotelial Vascular (VEGF).

[0104] O termo “citocina” é um termo genérico para proteínas liberadas por uma população celular que atua sobre outra célula como mediadores intercelulares. Exemplos dessas citocinas são linfocinas, monocinas e hormônios de polipeptídeos tradicionais. Inclui-se entre as citocinas o hormônio do crescimento, tal como hormônio do crescimento humano, hormônio do crescimento humano N-metionil e hormônio do crescimento bovino; hormônio paratireóide; tiroxina; insulina; pró-insulina; relaxina; pró-relaxina; hormônios de glicoproteína tais como hormônio estimulante de folículos (FSH), hormônio estimulante da tiróide (TSH) e

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42/135 hormônio luteinizante (LH); fator de crescimento hepático; fator de crescimento de fibroblastos; prolactina; lactogênio da placenta; fator α e β de necrose tumoral; substância inibidora muleriana; peptídeo associado com gonadotropina de camundongo; inibina; activina; fator de crescimento endotelial vascular; integrina; trombopoietina (TPO); fatores de crescimento dos nervos tais como NGF-β; fator de crescimento de plaquetas; fatores de crescimento de transformação (TGFs) tais como TGF-α e TGF-β; fatores I e II de crescimento similar à insulina; eritropoietina (EPO); fatores ósteoindutivos; interferons, tais como interferon α, β e γ; fatores estimulantes de colônia (CSFs), tais como macrófago-CSF (M-CSF); granulócito-macrófago-CSF (GM-CSF); e granulócito-CSF (G-CSF); interleucinas (ILs), tais como IL-1, IL-1a, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12; um fator de necrose tumoral, tal como TNF-α ou TNF-β; e outros fatores de polipeptídeos, que incluem LIF e kit ligante (KL). Da forma utilizada no presente, o termo citocina inclui proteínas de fontes naturais ou de cultivo celular recombinante e equivalentes biologicamente ativos das citocinas seqüenciais nativas.

[0105] O termo “pró-droga”, da forma utilizada no presente pedido, designa uma forma precursora ou derivada de uma substância farmaceuticamente ativa que seja menos citotóxica a células tumorais em comparação com a droga original e que seja capaz de ser enzimaticamente ativada ou convertida na forma original mais ativa. Vide, por exemplo, Wilman, Prodrugs in Cancer Chemotherapy, Biochemical Society Transactions, 14, págs. 375-382, 615^a Meeting de Belfast, 1986 e Stella et al., Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery, Directed Drug Delivery, Borchardt et al., (ed.), págs. 247-267, Humana Press, 1985. As pró-drogas da presente invenção incluem, mas sem limitar-se à pró-drogas que contenham fosfato, pró-drogas que contenham tiofosfato, pró-drogas que contenham sulfato, pró-drogas que contenham peptídeos, pró-drogas modificadas por D

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43/135 aminoácidos, pró-drogas glicosilados, pró-drogas contendo β-lactamas, pródrogas contendo fenoxi acetamida opcionalmente substituídas ou pró-drogas contendo fenil acetamida opcionalmente substituídas, 5-fluorocitosina e outras pró-drogas de 5-fluorouridina que podem ser convertidas que podem ser convertidas na droga livre citotóxica mais ativa. Exemplos de drogas citotóxicas que podem ser derivadas em uma forma de pró-droga para utilização na presente invenção incluem, mas sem limitar-se aos agentes quimioterapêuticos descritos acima.

[0106] Um “lipossoma” é uma pequena bolha composta de vários tipos de lipídios, fosfolipídios e/ou tensoativo que é útil para o fornecimento de uma droga (tal como os anticorpos anti-ErbB2 descritos no presente e, opcionalmente, um agente quimioterapêutico) a um mamífero. Os componentes do lipossoma são comumente dispostos em formação de duas camadas, similar à disposição de lipídios de membranas biológicas.

[0107] A expressão “inserção de pacote” é utilizada para designar instruções costumeiramente incluídas em pacotes comerciais de produtos terapêuticos, que contêm informações sobre as indicações, utilização, dosagem, administração, contra-indicações e/ou avisos referentes à utilização desses produtos terapêuticos.

[0108] Um “cardioprotetor” é um composto ou composição que evita ou reduz as disfunções do miocárdio (ou seja, cardiomiopatia e/ou congestão cardíaca) associadas à administração de uma droga, tal como um antibiótico de antraciclina e/ou um anticorpo anti-ErbB2, a um paciente. O cardioprotetor pode, por exemplo, bloquear ou reduzir um efetor cardiotóxico mediado por radicais livres e/ou evitar ou reduzir danos por tensão oxidativa. Exemplos de cardioprotetores englobados pela presente definição incluem o agente quelante de ferro dexrazoxano (ICRF-187) (Seifert et al., The Annals of Pharmacotherapy, 28:1063-1072, 1994); um agente redutor de lipídios e/ou

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44/135 antioxidante, tal como probucol (Singal et al., J. Mol. Cell. Cardiol., 27:10551063, 1995); amifostina (éster fosfato de 2-[(3-aminopropil)amino]etanotioldiidrogênio aminotiol, também denominado WR-2721, e a sua forma retirada celular desfosforilada denominada WR-1065) e ácido S-3-(3metilaminopropilamino)propilfosforotióico (WR-151327), vide Green et al., Cancer Research, 54:738-741, 1994; digoxina (Bristow, M. R. em Bristow M.

R., ed, Drug-Induced Heart Disease, Nova Iorque, Estados Unidos: Elsevier 191-215, 1980); bloqueadores beta, tais como metoprolol (Hjalmarson et al., Drugs, 47: Supl. 4:31-9, 1994; e Shaddy et al., Am. Heart J., 129:197-9, 1995); vitamina E; ácido ascórbico (vitamina C); varredores de radicais livres, tais como ácido oleanólico, ácido ursólico e N-acetil cisteína (NAC); compostos de captura de centrifugação, tais como alfa-fenil-terc-butil nitrona (PBN); (Paracchini et al., Anticancer Res., 13:1607-1612, 1993); compostos selênio orgânicos, tais como P251 (Elbesen); e similares.

[0109] Uma molécula de ácido nucléico “isolada” é uma molécula de ácido nucléico que é identificada e separada a partir de pelo menos uma molécula de ácido nucléico contaminante com a qual é normalmente associada na fonte natural do ácido nucléico do anticorpo. Uma molécula de ácido nucléico isolado é diferente na forma do ambiente em que é encontrada na natureza. As moléculas de ácido nucléico isolado são, portanto, distintas da molécula de ácido nucléico por existir em células naturais. Entretanto, uma molécula de ácido nucléico isolado inclui uma molécula de ácido nucléico contida em células que normalmente expressam o anticorpo em que, por exemplo, a molécula de ácido nucléico é um local cromossômico diferente das células naturais.

[0110] A expressão “seqüências de controle” designa seqüências de DNA necessárias para a expressão de uma seqüência de codificação conectada operacionalmente em um organismo hospedeiro específico. As

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45/135 seqüências de controle que são apropriadas para procariontes incluem, por exemplo, um promotor, opcionalmente uma seqüência operadora, e um local de ligação de ribossomos. As células eucarióticas são conhecidas por utilizarem promotores, sinais de poliadenilação e amplificadores.

[0111] O ácido nucléico é “operacionalmente ligado” quando colocado em relacionamento funcional com outra seqüência de ácido nucléico. DNA para uma pré-seqüência ou líder de secreção, por exemplo, é operacionalmente ligado ao DNA para um polipeptídeo caso seja expresso na forma de pré-proteína que participe da secreção do polipeptídeo; um promotor ou amplificador é operacionalmente ligado a uma seqüência codificadora caso afete a transcrição da seqüência; ou um local de ligação de ribossomos é operacionalmente ligado a uma seqüência codificadora caso seja posicionada de forma a facilitar a tradução. Geralmente, “operacionalmente ligado” indica que as seqüências de DNA que são conectadas são contíguas e, no caso de um líder de secreção, contíguos e em fase de leitura. Entretanto, os amplificadores não necessitam ser contíguos. A conexão é conseguida através de ligação em sítios de restrição convenientes. Caso esses sítios não existam, as ligações ou os adaptadores de oligonucleotídeos sintéticos são utilizados de acordo com a prática convencional.

[0112] Da forma utilizada no presente, as expressões “célula”, “linhagem celular” e “cultura celular” são utilizadas de forma intercambiável e todas essas designações incluem a progênie. Assim, as expressões “transformantes” e “células transformadas” incluem a célula objeto primária e os cultivos dela derivados, sem considerar o número de transferências. Também se compreende que toda a progênie pode não ser precisamente idêntica em teor de DNA, devido a mutações inadvertidas ou deliberadas. Inclui-se progênie mutante que possui a mesma função ou atividade biológicas selecionada para a célula originalmente transformada. Será claro a partir do contexto quando

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46/135 forem desejadas designações distintas.

II - Produção de Anticorpos ANTi-ErbB2 [0113] Segue-se uma descrição de exemplos de técnicas para a produção dos anticorpos utilizados de acordo com a presente invenção. O antígeno de ErbB2 a ser utilizado para a produção de anticorpos pode ser, por exemplo, uma forma solúvel do domínio extracelular de ErbB2 ou uma de suas partes, que contenha o epítopo desejado. Alternativamente, as células que expressem ErbB2 na sua superfície celular (por exemplo, células NIH-3T3 transformadas para sobre-expressar ErbB2; ou uma linhagem celular de carcinoma, tal como células de SK-BR-3, vide Stancovski et al., PNAS (USA), 88:8691-8695, 1991), pode ser utilizada para gerar anticorpos. Outras formas de ErbB2 úteis para a geração de anticorpos serão evidentes para os técnicos no assunto.

(i) Anticorpos policlonais:

[0114] Os anticorpos policlonais são preferencialmente elevados em animais através de injeções subcutâneas (sc) ou intraperitoneais (ip) do antígeno relevante e um adjuvante. Pode ser útil conjugar o antígeno relevante a uma proteína que seja imunogênica na espécie a ser imunizada, tal como hemocianina do tipo buraco de fechadura, albumina de soro, tiroglobulina bovina ou inibidor de tripsina de soja, utilizando-se um agente bifuncional ou derivatizante, tal como éster maleimido benzoil sulfosuccinimida (conjugação através de resíduos de cisteína), N-hidróxi succinimida (através de resíduos de lisina), glutaraldeído, anidrido succínico, SOCl2 ou R1N=C=NR, em que R e R¹ são grupos alquilas diferentes.

[0115]Os animais são imunizados contra o antígeno, conjugados imunogênicos ou derivados através de combinação, por exemplo, de 100 ,ug ou 5 ,ug da proteína ou conjugado (para coelhos ou camundongos, respectivamente) com três volumes de adjuvante completo de Freund e injeção

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47/135 da solução de forma intradérmica em diversos sítios. Um mês mais tarde, os animais são injetados com 1/5 a 1/10 da quantidade original de peptídeo ou conjugado em adjuvante completo de Freund através de injeção subcutânea em diversos sítios. Sete a 14 dias mais tarde, os animais são sangrados e o soro é testado para o título do anticorpo. Os animais são injetados até os patamares do título. Preferencialmente, o animal é injetado com o conjugado do mesmo antígeno, mas conjugado a uma proteína diferente e/ou através de um reagente de ligação cruzada diferente. Os conjugados também podem ser feitos em cultivo celular recombinante na forma de fusões de proteínas. Além disso, agentes de agregação tais como alumínio é utilizado apropriadamente para amplificar a reação imunológica.

(II) Anticorpos monoclonais:

[0116] Os anticorpos monoclonais são obtidos a partir de uma população de anticorpos substancialmente homogêneos, ou seja, os anticorpos individuais que compreendem a população são idênticos, exceto por possíveis mutações de ocorrência natural que podem estar presentes em pequenas quantidades. Assim, o modificador “monoclonal” indica o caráter do anticorpo como não sendo uma mistura de anticorpos distintos.

[0117] Os anticorpos monoclonais podem ser produzidos, por exemplo, através da utilização do método de hibridoma descrito pela primeira vez por Kohler et al., Nature, 256:495, 1975, ou podem ser produzidos através de métodos de DNA recombinantes (patente US 4.816.567).

[0118] No método de hibridoma, um camundongo ou outro animal hospedeiro apropriado, tal como um hamster, é imunizado na forma descrita acima para gerar linfócitos que produzam ou sejam capazes de produzir anticorpos que se ligarão especificamente à proteína utilizada para imunização. Alternativamente, linfócitos podem ser imunizados in vitro. Os linfócitos são então fundidos com células de mieloma, através da utilização de um agente de

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48/135 fusão apropriado, tal como polietileno glicol, para formar uma célula de hibridoma (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, págs. 59103, Academic Press, 1986).

[0119] As células de hibridoma assim preparadas são semeadas e cultivadas em meio de cultivo apropriado que contém preferencialmente uma ou mais substâncias que inibem o crescimento ou sobrevivência das células de mieloma parentais não fundidas. Caso as células de mieloma parentais não contenham a enzima fosforibosil transferase de hipoxantina guanina (HGPRT ou HPRT), por exemplo, o meio de cultivo para os hibridomas incluirá tipicamente hipoxantina, aminopterina e timidina (meio HAT), substâncias essas que evitam o crescimento de células com deficiência de HGPRT.

[0120] Células de mieloma preferidas são aquelas que se fundem eficientemente, suportam a produção de anticorpos de alto nível estável pelas células produtoras de anticorpos selecionadas, e são sensíveis a um meio tal como meio HAT. Dentre eles, as linhagens celulares de mieloma preferidas são linhagens de mieloma de murinos, tais como as derivadas de tumores de camundongos MOPC-21 e MPC-11 disponíveis através da Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, Califórnia, Estados Unidos, e as células SP-2 ou X63-Ag8-653 disponíveis através da American Type Culture Collection, (Coleção Norte-Americana de Tipos de Culturas - ATCC), Rockville, Maryland, Estados Unidos. Linhagens celulares de mieloma humano e hetero-mieloma de camundongo-humano também foram descritas para a produção de anticorpos monoclonais humanos (Kozbor, J. Immunol., 133:3001, 1984; e Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, págs. 51-63, Marcel Dekker Inc., Nova Iorque, Estados Unidos, 1987).

[0121] Os meios de cultura em que são desenvolvidas células de hibridoma é testado para determinação da produção de anticorpos monoclonais dirigidos ao antígeno. Preferencialmente, a especificidade de ligação de

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49/135 anticorpos monoclonais produzidos por células de hibridoma é selecionada através de imunoprecipitação ou de um ensaio de ligação in vitro, tais como radioimunoensaio (RIA) ou ensaio imunoabsorvente ligado a enzimas (ELISA).

[0122] A afinidade de ligação do anticorpo monoclonal pode ser determinada, por exemplo, através da análise de Scatchard de Munson et al., Anal. Biochem., 107:220, 1980.

[0123] Após a identificação de células de hibridoma que produzem anticorpos com a especificidade, afinidade e/ou atividade desejada, os clones podem ser subclonados através da limitação de procedimentos de diluição e cultivados através de métodos padrão (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, págs. 59-103, Academic Press, 1986). Meios de cultivo apropriados para este propósito incluem, por exemplo, meio D-MEM ou RPMI1640. Além disso, as células de hibridoma podem ser desenvolvidas in vivo na forma de tumores de ascites em um animal.

[0124] Os anticorpos monoclonais segregados pelos subclones são apropriadamente separados do meio de cultivo, fluido de ascites ou soro através de procedimentos de purificação convencional de anticorpos, tais como proteína A sepharose, cromatografia de hidroxilapatita, eletroforese de gel, diálise ou cromatografia de afinidade.

[0125] O DNA codificador dos anticorpos monoclonais é facilmente isolado e seqüenciado através da utilização de procedimentos convencionais (através, por exemplo, da utilização de sondas de oligonucleotídeos que sejam capazes de se ligar especificamente a genes codificadores das cadeias pesada e leve de anticorpos de murinos). As células de hibridoma servem de fonte preferida desse DNA. Uma vez isolado, o DNA pode ser colocado em vetores de expressão, que são então transfectados para células hospedeiras, tais como células de E. coli, células de símios COS, células de ovário de hamster chinês (CHO) ou células de mieloma que, de

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50/135 outra forma, não produzem proteína de anticorpos, para obter a síntese de anticorpos monoclonais nas células hospedeiras recombinantes. Os artigos de análise sobre a expressão recombinante em bactérias de DNA que codifiquem o anticorpo incluem Skerra et al., Curr. Opinion in Immunol., 5:256-262, 1993 e Plückthun, Immunol. Revs., 130:151-188, 1992.

[0126] Em realização adicional, anticorpos monoclonais ou fragmentos de anticorpos podem ser isolados a partir de bibliotecas de fagos geradas através de utilização das técnicas descritas em McCafferty et al., Nature, 348:552-554, 1990, Clackson et al., Nature, 352:624-628, 1991 e Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597, 1991, descrevem o isolamento de anticorpos de murinos e humanos, respectivamente, utilizando-se bibliotecas de fagos. Publicações subseqüentes descrevem o isolamento de anticorpos humanos de alta afinidade (faixa nM) através de embaralhamento de cadeias (Marks et al., Bio/Technology, 10:779-783, 1992), bem como infecções combinatórias e recombinação in vivo, como estratégia para a construção de bibliotecas de fagos muito grandes (Waterhouse et al., Nuc. Acids. Res., 21:2265-2266, 1993). Desta forma, essas técnicas são alternativas viáveis a técnicas de hibridoma de anticorpos monoclonais tradicionais para o isolamento de anticorpos monoclonais.

[0127] O DNA também pode ser modificado, por exemplo, através de substituição da seqüência de codificação para domínios constantes de cadeia pesada e leve humanos no lugar das seqüências de murinos homólogas (patente US 4.816.567; e Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 81:6851, 1984), ou através de ligação covalente à seqüência de codificação de imunoglobulina no todo ou em parte da seqüência de codificação para um polipeptídeo que não seja de imunoglobulina,.

[0128] Tipicamente, esses polipeptídeos que não são de imunoglobulina são substituídos pelos domínios constantes de um anticorpo,

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51/135 ou são substituídos pelos domínios variáveis de um sítio de combinação de antígeno de um anticorpo para criar um anticorpo bivalente quimérico que compreende um local de combinação de antígeno que possui especificidade para um antígeno e outro local de combinação de antígeno para um antígeno diferente.

(iii) Anticorpos humanizados:

[0129] Métodos de humanização de anticorpos não humanos foram descritos na técnica. Preferencialmente, um anticorpo humanizado possui um ou mais resíduos de aminoácidos nele introduzidos a partir de uma fonte que não é humana. Esses resíduos de aminoácidos não humanos são muitas vezes denominados resíduos de “importação”, que são simplesmente retirados de um domínio variável de “importação”. A humanização pode ser essencialmente realizada seguindo-se o método de Winter e colaboradores (Jones et al., Nature, 321:522-525, 1986; Riechmann et al., Nature, 332:323327, 1988; Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536, 1988), através de substituição de seqüências de regiões hiper-variáveis pelas seqüências correspondentes de um anticorpo humano. Conseqüentemente, esses anticorpos “humanizados” são anticorpos quiméricos (patente US 4.816.567), em que substancialmente menos de um domínio variável humano intacto tenha sido substituído pela seqüência correspondente a partir de uma espécie não humana. Na prática, os anticorpos humanizados são tipicamente anticorpos humanos, em que alguns resíduos de regiões hiper-variáveis e possivelmente alguns resíduos de FR são substituídos por resíduos de sítios análogos em anticorpos de roedores.

[0130] A escolha de domínios variáveis humanos, tanto leves como pesados, a serem utilizados na fabricação dos anticorpos humanizados é muito importante para reduzir a antigenicidade. De acordo com o chamado método de “melhor adequação”, a seqüência do domínio variável de um

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52/135 anticorpo de roedor é filtrada em comparação com toda a biblioteca de seqüências humanas de domínio variável conhecidas. A seqüência humana mais próxima da do roedor é então aceita como região de estrutura humana (FR) para o anticorpo humanizado (Sims et al., J. Immunol., 151:2296, 1993; Chothia et al., J. Mol. Biol., 196:901, 1987). Outro método utiliza uma região estrutural específica derivada da seqüência de consenso de todos os anticorpos humanos de um subgrupo específico de cadeias leves ou pesadas. A mesma estrutura pode ser utilizada para vários anticorpos humanizados diferentes (Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 89:4285, 1992; Presta et al., J. Immunol., 151:2623, 1993).

[0131] É adicionalmente importante que os anticorpos sejam humanizados com retenção de alta afinidade para o antígeno e outras propriedades biológicas favoráveis. Para atingir este objetivo, de acordo com um método preferido, os anticorpos humanizados são preparados através de um processo de análise das seqüências parentais e diversos produtos humanizados conceituais, utilizando-se modelos tridimensionais das seqüências parental e humanizada. Modelos de imunoglobulina tridimensionais são comumente disponíveis e familiares para os técnicos no assunto. São disponíveis programas de computador que ilustram e exibem estruturas de conformação tridimensional de possíveis seqüências de imunoglobulina candidatas selecionadas. A inspeção dessas exibições permite a análise do papel provável dos resíduos no funcionamento da seqüência de imunoglobulina candidata, ou seja, a análise dos resíduos que influenciam a capacidade da imunoglobulina candidata para se ligar ao seu antígeno. Desta forma, os resíduos de FR podem ser selecionados e combinados a partir das seqüências do receptor e de importação, de forma que seja atingida a característica desejada do anticorpo, tal como maior afinidade para o(s) antígeno(s) desejado(s). Geralmente, os resíduos da região hiper-variável são direta e mais

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53/135 substancialmente envolvidos na influência da ligação de antígenos.

[0132] O Exemplo 3 abaixo descreve a produção de exemplos de anticorpos anti-ErbB2 humanizados que ligam ErbB2 e bloqueiam a ativação de ligantes de um receptor de ErbB. O anticorpo humanizado de interesse específico no presente bloqueia a ativação mediada por EGF, TGF-α e/ou HRG de MAPK, essencialmente de forma tão eficaz quanto o anticorpo monoclonal de murinos 2C4 (ou um de seus fragmentos Fab) e/ou liga ErbB2, essencialmente de forma tão eficaz quanto o anticorpo monoclonal de murinos 2C4 (ou um de seus fragmentos Fab). O anticorpo humanizado do presente pode compreender, por exemplo, resíduos da região hiper-variável não humana incorporado em um domínio pesado variável humano e podem compreender adicionalmente uma substituição de região de estrutura (FR) em posição selecionada a partir do grupo que consiste de 69H, 71H e 73H, utilizando-se o sistema de numeração de domínio variável estabelecido em Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, quinta edição, Serviço de Saúde Pública, Institutos Nacionais de Saúde, Bethesda MD, Estados Unidos, 1991. Em uma realização, o anticorpo humanizado compreende substituições de FR em duas ou todas as posições 69H, 71H e 73H.

[0133] Um exemplo de anticorpo humanizado de interesse compreende no presente resíduos determinantes de complementaridade de domínio pesado variável GFTFTDYTMX, em que X é preferencialmente D ou S (SEQ ID N^o 7); DVNPNSGGSIYNQRFKG (SEQ ID N^o 8) e/ou NLGPSFYFDY (SEQ ID N^o 9), que compreende opcionalmente modificações de aminoácidos desses resíduos de CDR, por exemplo, em que as modificações essencialmente mantêm ou aumentam a afinidade do anticorpo. A variante de anticorpo de interesse pode conter, por exemplo, cerca de um a cerca de sete ou cerca de cinco substituições de aminoácidos nas seqüências de CDR pesadas variáveis acima. Esses variantes de anticorpos podem ser preparados

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54/135 através de maturação de afinidade, por exemplo, conforme descrito abaixo. O anticorpo humanizado de maior preferência compreende a seqüência de aminoácido de domínio pesado variável de SEQ ID N^o 4.

[0134] O anticorpo pode compreender resíduos de determinação de complementaridade de domínio leve variável KASQDVSIGVA (SEQ ID N^o 10); SASYX1X2X³, em que X¹ é preferencialmente R ou L, X2 é preferencialmente Y ou E, e X³ é preferencialmente T ou S (SEQ ID N^o 11); e/ou QQYYIYPYT (SEQ ID N^o 12), além, por exemplo, dos resíduos de CDR de domínio pesado variável no parágrafo anterior. Esses anticorpos humanizados compreendem opcionalmente modificações de aminoácidos dos resíduos de CDR acima, por exemplo, em que as modificações essencialmente mantêm ou aumentam a afinidade do anticorpo. O variante de anticorpo de interesse pode conter, por exemplo, cerca de uma a cerca de sete ou cerca de cinco substituições de aminoácidos nas seqüências de CDR leve variável acima. Esses variantes de anticorpos podem ser preparados através de maturação de afinidade, por exemplo, conforme descrito abaixo. O anticorpo humanizado de maior preferência compreende a seqüência de aminoácidos de domínio leve variável de SEQ ID N^o 3.

[0135] A presente invenção também contempla anticorpos maduros por afinidade que ligam ErbB2 e bloqueiam a ativação de ligantes de um receptor de ErbB. O anticorpo parental pode ser um anticorpo humano ou um anticorpo humanizado, por exemplo, um que compreenda as seqüências leves e/ou pesadas variáveis de SEQ ID N^o 3 e 4, respectivamente (ou seja, variante 574). O anticorpo maduro por afinidade liga-se preferencialmente a receptor de ErbB2 com afinidade superior à de 2C4 de murinos ou variante 574 (aumento de afinidade de, por exemplo, cerca de duas ou cerca de quatro vezes a cerca de cem vezes a cerca de mil vezes, conforme determinado, por exemplo, através da utilização de um domínio extracelular de ErbB2 (ECD)

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ELISA). Exemplos de resíduos de CDR pesados variáveis para substituição incluem H28, H30, H34, H35, H64, H96, H99 ou combinações de dois ou mais (por exemplo, dois, três, quatro, cinco, seis ou sete desses resíduos). Exemplos de resíduos de CDR leves variáveis para alteração incluem L28, L50, L53, L56, L91, L92, L93, L94, L96, L97 ou combinações de dois ou mais (por exemplo, dois a três, quatro, cinco ou até cerca de dez desses resíduos).

[0136]São contempladas diversas formas do anticorpo humanizado ou anticorpo madura por afinidade. O anticorpo humanizado ou anticorpo maduro por afinidade pode ser, por exemplo, um fragmento de anticorpo, tal como Fab, que é opcionalmente conjugado com um ou mais agentes citotóxicos a fim de gerar um imunoconjugado. Alternativamente, o anticorpo humanizado ou anticorpo maduro por afinidade pode ser um anticorpo intacto, tal como um anticorpo de IgG1 intacto.

(iv) Anticorpos humanos:

[0137] Como alternativa à humanização, podem ser gerados anticorpos humanos. É agora possível produzir, por exemplo, animais transgênicos (por exemplo, camundongos) que são capazes, mediante imunização, de produzir um repertório completo de anticorpos humanos na ausência de produção endógena de imunoglobulina. Descreveu-se, por exemplo, que a deleção homozigótica da região de ligação de cadeia pesada de anticorpos (JH) em camundongos mutantes de linhagem germinativa e em quiméricos resulta na inibição completa da produção endógena de anticorpos. A transferência do conjunto de genes da imunoglobulina de linhagem germinativa humana nesses camundongos mutantes de linhagem germinativa resultará na produção de anticorpos humanos mediante estímulo dos antígenos. Vide, por exemplo, Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 90:2551, 1993; Jakobovits et al., Nature, 362:255-258, 1993; Bruggermann et

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56/135 al., Year in Immuno., 7:33, 1993; e patentes US 5.591.669, 5.589.369 e 5.545.807.

[0138] Alternativamente, pode-se utilizar tecnologia de exibição de fago (McCafferty et al., Nature, 348:552-553, 1990) para produzir anticorpos humanos e fragmentos de anticorpos in vivo a partir de repertórios de genes de domínio variável de imunoglobulina (V) de doadores não imunizados. De acordo com esta técnica, os genes de domínio de anticorpos V são clonados na estrutura como um gene de proteína de revestimento maior ou menor de um bacteriófago filamentoso, tal como M13 ou fd, e exibidos na forma de fragmentos de anticorpos funcionais sobre a superfície da partícula de fago. Como a partícula filamentosa contém uma cópia de DNA de cadeia simples do genoma de fago, as seleções baseadas nas propriedades funcionais do anticorpo também resultam na seleção do gene codificador do anticorpo que exibe essas propriedades. Assim, o fago imita algumas das propriedades da célula B. A exibição de fago pode ser realizada em uma série de formatos; para sua análise, vide, por exemplo, Johnson, Kevin S. e Chiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology, 3:564-571, 1993. Diversas fontes de segmentos de gene V podem ser utilizadas para exibição do fago. Clackson et al., Nature, 352:624-628, 1991, isolaram um conjunto diverso de anticorpos de antioxazolona a partir de uma pequena biblioteca combinatória aleatória de genes V derivados de baços de camundongos imunizados. Um repertório de genes V de doadores humanos não imunizados pode ser construído e anticorpos para um conjunto diverso de antígenos (incluindo auto-antígenos) podem ser isolados essencialmente seguindo-se as técnicas descritas por Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597, 1991, ou Griffith et al., EMBO J., 12:725-734, 1993. Vide também as patentes US 5.565.332 e 5.573.905.

[0139] Conforme discutido acima, os anticorpos humanos podem também ser gerado por células B ativadas in vitro (vide patentes US 5.567.710

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57/135 e 5.229.275).

[0140] Anticorpos anti-ErbB2 humanos são descritos na patente US 5.772.997 concedida em 30 de junho de 1998 e WO 97/00271 publicada em 3 de janeiro de 1997.

(v) Fragmentos de anticorpos:

[0141] Foram desenvolvidas diversas técnicas para a produção de fragmentos de anticorpos. Tradicionalmente, esses fragmentos foram derivados através de digestão proteolítica de anticorpos intactos (vide, por exemplo, Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods, 24:107-117, 1992; e Brennan et al., Science, 229:81, 1985). Entretanto, esses fragmentos podem ser agora produzidos diretamente por células hospedeiras recombinantes. Os fragmentos de anticorpos podem ser isolados, por exemplo, a partir das bibliotecas de fagos de anticorpos discutidas acima. Alternativamente, fragmentos de Fab’-SH podem ser recuperados diretamente de E. coli e acoplados quimicamente para formar fragmentos de F(ab’)2 (Carter et al., Bio/Technology, 10:163-167, 1992). De acordo com outra abordagem, fragmentos de F(ab’)2 podem ser isolados diretamente a partir de cultura de células hospedeiras recombinantes. Outras técnicas para a produção de fragmentos de anticorpos serão evidentes para os técnicos no assunto. Em outras realizações, o anticorpo selecionado é um fragmento de Fv de cadeia simples (scFv). Vide WO 93/16185; patente US 5.571.894; e patente US 5.587.458. O fragmento de anticorpo também pode ser um “anticorpo linear”, conforme descrito, por exemplo, na patente US 5.641.870. Esses fragmentos de anticorpos lineares podem ser monoespecíficos ou biespecíficos.

(VI) Anticorpos biespecíficos:

[0142] Os anticorpos biespecíficos são anticorpos que possuem especificidades de ligação para pelo menos dois epítopos diferentes. Exemplos de anticorpos biespecíficos podem se ligar a dois epítopos diferentes da

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58/135 proteína ErbB2. Outros desses anticorpos podem combinar um local de ligação ErbB2 com local(is) de ligação para EGFR, ErbB3 e/ou ErbB4. Alternativamente, um braço anti-ErbB2 pode ser combinado com um braço que se liga a uma molécula ativadora sobre um leucócito, tal como uma molécula receptora de célula T (por exemplo, CD2 ou CD3) ou receptores de Fc para IgG (FcyR), tais como FcyRI (CD64), FcyRII (CD32) e FcyRIII (CD16), de forma a concentrar-se em mecanismos de defesa celular para a célula de expressão de ErbB2. Anticorpos biespecíficos podem também ser utilizados para localizar agentes citotóxicos para células que expressem ErbB2. Esses anticorpos possuem um braço de ligação de ErbB2 e um braço que se liga ao agente citotóxico (tal como saporina, anti-interferon-α, vinca alcalóide, cadeia de ricina A, metotrexato ou isótopo radioativo hapteno). Anticorpos biespecíficos podem ser preparados na forma de anticorpos de comprimento total ou fragmentos de anticorpos (tais como anticorpos biespecíficos F(ab')2).

[0143] WO 96/16673 descreve um anticorpo anti-ErbB2/antiFcyRIII e a patente US 5.837.234 descreve um anticorpo biespecífico antiErbB2/anti-FcyRI. Um anticorpo biespecífico anti-ErbB2/Fca é exibido em WO 98/02463. A patente US 5.821.337 ensina um anticorpo biespecífico antiErbB2/anti-CD3.

[0144] Métodos de fabricação de anticorpos biespecíficos são conhecidos no estado da técnica. A produção tradicional de anticorpos biespecíficos de comprimento total baseia-se na co-expressão de dois pares de cadeia leve-cadeia pesada de imunoglobulina, em que as duas cadeias possuem especificidades diferentes (Millstein et al., Nature, 305:537-539, 1983). Devido à disposição aleatória de cadeias leve e pesada de imunoglobulina, esses hibridomas (quadromas) produzem uma mistura potencial de dez moléculas de anticorpos diferentes, das quais apenas uma possui a estrutura biespecífica correta. A purificação da molécula correta, que é

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59/135 normalmente feita através de etapas de cromatografia de afinidade, é um tanto problemático e os rendimentos do produto são baixos. Procedimentos similares são descritos em WO 93/08829 e em Traligacker et al., EMBO J., 10:36553659, 1991.

[0145] De acordo com uma abordagem diferente, os domínios variáveis de anticorpos com as especificidades de ligação desejadas (sítios de combinação de antígeno e anticorpo) são fundidos as seqüências de domínios constantes de imunoglobulina. A fusão é feita preferencialmente com um domínio constante de cadeia pesada de imunoglobulina, que compreende pelo menos parte das regiões de articulação, CH2 e CH3. Prefere-se ter a primeira região constante de cadeia pesada (CH1) contendo o local necessário para ligação de cadeia leve, presente em pelo menos uma das fusões. Os DNAs codificadores das fusões de cadeia pesada de imunoglobulina e, se desejado, a cadeia leve de imunoglobulina, são inseridos em vetores de expressão separados e são co-transfectados em um organismo hospedeiro apropriado. Isso proporciona grande flexibilidade de ajuste das proporções mútuas dos três fragmentos de polipeptídeos em realizações em que razões desiguais das três cadeias de polipeptídeos utilizadas na construção proporcionam rendimentos ótimos. É possível, entretanto, inserir as seqüências de codificação para duas ou todas as três cadeias de polipeptídeos em um vetor de expressão, quando a expressão de pelo menos duas cadeias de polipeptídeos em razões iguais resultar em altos rendimentos ou quando as razões não forem de significação particular.

[0146] Em realização preferida desta abordagem, os anticorpos biespecíficos são compostos de uma cadeia pesada de imunoglobulina híbrida com primeira especificidade de ligação em um braço, e um par de cadeia levecadeia pesada de imunoglobulina híbrida (que proporciona uma segunda especificidade de ligação) no outro braço. Concluiu-se que essa estrutura

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60/135 assimétrica facilita a separação do composto biespecífico desejado de combinações de cadeia de imunoglobulina indesejadas, como a presença de uma cadeia leve de imunoglobulina em apenas uma metade da molécula biespecífica proporciona uma forma fácil de separação. Esta abordagem é descrita em WO 94/04690. Para detalhes adicionais de geração de anticorpos biespecíficos, consulte, por exemplo, Suresh et al., Methods in Enzymology, 121:210, 1986.

[0147] De acordo com outra abordagem descrita na patente US 5.731.168, a interface entre um par de moléculas de anticorpo pode ser construída de forma a maximizar o percentual de heterodímeros que são recuperados da cultura de células recombinantes. A interface preferida compreende pelo menos uma parte do domínio CH3 de um domínio constante do anticorpo. Neste método, uma ou mais cadeias pequenas laterais de aminoácidos da interface da primeira molécula de anticorpo são substituídas com cadeias laterais maiores (tais como tirosina ou triptofano). “Cavidades” compensatórias de tamanho idêntico ou similar à(s) cadeia(s) lateral(is) grande(s) são criadas na interface da segunda molécula de anticorpo, através da substituição de grandes cadeias laterais de aminoácidos por cadeias menores (tais como alanina ou treonina). Isso proporciona um mecanismo de aumento do rendimento do heterodímero sobre outros produtos finais indesejados, tais como homodímeros.

[0148] Os anticorpos biespecíficos incluem anticorpos de ligação cruzada ou “heteroconjugados”. Um dos anticorpos no heteroconjugado pode ser acoplado, por exemplo, a avidina e o outro a biotina. Esses anticorpos foram propostos, por exemplo, visem células do sistema imunológico em células indesejadas (patente US 4.676.980) e para o tratamento de infecção por HIV (WO 91/00360, WO 92/200373 e EP 03089). Anticorpos heteroconjugados podem ser fabricados através da utilização de qualquer

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61/135 método de ligação cruzada conveniente. Os agentes de ligação cruzada apropriados são bem conhecidos na técnica e descritos na patente US 4.676.980, juntamente com uma série de técnicas de ligação cruzada.

[0149] As técnicas de geração de anticorpos biespecíficos a partir de fragmentos de anticorpos também foram descritas na literatura. Anticorpos biespecíficos podem ser preparados, por exemplo, através da utilização de ligações químicas. Brennan et al., Science, 229:81, 1985, descrevem um procedimento em que anticorpos intactos são divididos proteoliticamente para gerar fragmentos de F(ab’)2. Estes fragmentos são reduzidos na presença do agente formador de complexo de ditiol arsenito de sódio, para estabilizar ditióis vicinais e evitar a formação de bissulfeto inter-molecular. Os fragmentos de Fab’ gerados são então convertidos em derivados de tionitrobenzoato (TNB). Um dos derivados de Fab’-TNB é então re-convertido no Fab'-tiol através da redução com mercapto etil amina e é misturado com uma quantidade equimolar do outro derivado de Fab'-TNB para formar o anticorpo biespecífico. Os anticorpos biespecíficos produzidos podem ser utilizados como agentes para a imobilização seletiva de enzimas.

[0150] O progresso recente possibilitou a recuperação direta dos fragmentos de Fab’-SH de E. coli, que podem ser acoplados quimicamente para formar anticorpos biespecíficos. Shalaby et al., J. Exp. Med., 175:217-225, 1992, descrevem a produção de uma molécula de anticorpo biespecífico F(ab’)2 totalmente humanizado. Cada fragmento Fab’ foi segregado separadamente de E. coli e submetido ao acoplamento químico dirigido in vitro para formar o anticorpo biespecífico. O anticorpo biespecífico assim formado foi capaz de se ligar às células que sobre-expressem o receptor de ErbB2 e as células T humanas normais, bem como iniciar a atividade lítica de linfócitos citotóxicos humanos contra alvos do tumor de mama humano.

[0151] Diversas técnicas de produção e isolamento de fragmentos

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62/135 de anticorpos biespecíficos diretamente a partir de cultura celular recombinante também foram descritas. Anticorpos biespecíficos foram produzidos, por exemplo, através da utilização de zíperes de leucina. Kostelny et al., J. Immunol., 148(5):1547-1553, 1992. Os peptídeos de zíper de leucina das proteínas Fos e Jun foram ligados às porções Fab' de dois anticorpos diferentes através de fusão genética. Os homodímeros de anticorpos foram reduzidos na região de articulação para formar monômeros e, em seguida, reoxidados para formar os heterodímeros de anticorpos. Este método pode também ser utilizado para a produção de homodímeros de anticorpos. A tecnologia de “diacorpos” descrita por Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.

S. A., 90:6444-6448, 1993, forneceu um mecanismo alternativo para a fabricação de fragmentos de anticorpos biespecíficos. Os fragmentos compreendem um domínio variável de cadeia pesada (VH) conectado a um domínio variável de cadeia leve (VL) por um ligante que é curto demais para permitir o emparelhamento entre os dois domínios na mesma cadeia. Conseqüentemente, os domínios VH e VL de um fragmento são forçados a emparelhar-se com os domínios VH e VL complementares de outro fragmento, de maneira a formar dois sítios de ligação de antígenos. Outra estratégia de fabricação de fragmentos de anticorpos biespecíficos através da utilização de dímeros Fv de cadeia simples (sFv) também foi relatada. Vide Gruber et al., J. Immunol., 152:5368, 1994.

[0152] São contemplados anticorpos com mais de duas valências. Podem ser preparados, por exemplo, anticorpos triespecíficos. Tutt et al., J. Immunol., 147:60, 1991.

(vii) Outras modificações de seqüências de aminoácidos:

[0153] É (são) contemplada(s) modificação(ões) de seqüência de aminoácido dos anticorpos anti-ErbB2 descritos no presente. Pode ser desejável, por exemplo, aprimorar a afinidade de ligação e/ou outras

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63/135 propriedades biológicas do anticorpo. Variantes de seqüências de aminoácidos do anticorpo anti-ErbB2 são preparadas através da introdução de trocas de nucleotídeos apropriadas no ácido nucléico de anticorpo anti-ErbB2, ou através de síntese de peptídeos. Essas modificações incluem, por exemplo, exclusões e/ou inserções e/ou substituições de resíduos nas seqüências de aminoácidos do anticorpo anti-ErbB2. Qualquer combinação de deleção, inserção ou substituição é feita para chegar à construção final, desde que a construção final possua as características desejadas. As mudanças de aminoácidos também podem alterar o processo pós-translacional do anticorpo anti-ErbB2, tais como a mudança do número ou posição dos sítios de glicosilação.

[0154] Um método útil de identificação de certos resíduos ou regiões do anticorpo anti-ErbB2 que são sítios preferidos para mutagênese é denominado “mutagênese de varredura de alanina”, conforme descrito por Cunningham e Wells, Science, 244:1081-1085, 1989. Aqui, um resíduo ou grupo de resíduos alvos são identificados (por exemplo, resíduos carregados, tais como arg, asp, his, lis e glu), e substituído por um aminoácido neutro ou carregado negativamente (de maior preferência alanina ou polialanina) para afetar a interação dos aminoácidos com antígeno ErbB2. Esses sítios de aminoácidos que demonstram sensibilidade funcional às substituições são então refinados pela introdução de mais variantes ou outras variantes nos sítios de substituição ou para os sítios de substituição. Assim, embora o sítio para introdução de uma variação de seqüência de aminoácido seja predeterminado, a natureza intrínseca da mutação não necessita ser predeterminada. Para analisar o desempenho de uma mutação em um dado local, por exemplo, a varredura de ala ou mutagênese aleatória é conduzida no códon ou região alvo e as variantes de anticorpos anti-ErbB2 são selecionadas para a atividade desejada.

[0155] As inserções de seqüências de aminoácidos incluem

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64/135 fusões de terminais carboxila e/ou amino que variam de comprimento de um resíduo até polipeptídeos que contenham cem ou mais resíduos, bem como inserções entre as seqüências de resíduos de aminoácidos isolados ou múltiplos. Exemplos de inserções terminais incluem um anticorpo anti-ErbB2 com um resíduo metionil N-terminal ou do anticorpo fundido a um polipeptídeo citotóxico. Outras variantes de inserção da molécula de anticorpos anti-ErbB2 incluem a fusão ao N- ou C-terminal do anticorpo anti-ErbB2 a uma enzima (para ADEPT, por exemplo) ou um polipeptídeo que aumenta a meia vida de soro do anticorpo.

[0156] Outro tipo de variante é uma variante de substituição de aminoácido. Estas variantes contêm pelo menos um resíduo de aminoácido na molécula de anticorpo anti-ErbB2 substituída por um resíduo diferente. Os sítios de maior interesse para mutagênese substitucional incluem as regiões hiper-variáveis, mas também são contempladas alterações de FR. Substituições conservadoras são exibidas na Tabela 1 sob o título de “substituições preferidas”. Caso essas substituições resultem em mudança da atividade biológica, mudanças mais substanciais, denominadas “substituições exemplificadas” na Tabela 1 ou conforme descrito adicionalmente abaixo com referência a classes de aminoácidos, podem ser introduzidas e os produtos são selecionados.

Tabela 1

Resíduo Original	Substituições Exemplificadas	Substituições Preferidas
Ala (A)	val; leu; ile	val
Arg (R)	lys; gln; asn	lys
Asn (N)	gln; his; asp, lys; arg	gln
Asp (D)	glu; asn	glu
Cys (C)	ser; ala	ser
Gln (Q)	asn; glu	asn

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Resíduo Original	Substituições Exemplificadas	Substituições Preferidas
Glu (E)	asp; gln	asp
Gly (G)	ala	ala
His (H)	asn; gln; lys; arg	arg
Ile (I)	leu; val; met; ala; phe; norleucina	leu
Leu (L)	norleucine; ile; val; met; ala; phe	ile
Lys (K)	arg; gln; asn	arg
Met (M)	leu; phe; ile	leu
Phe (F)	leu; val; ile; ala; tyr	tyr
Pro (P)	ala	ala
Ser (S)	thr	thr
Thr(T)	ser	ser
Trp (W)	tyr; phe	tyr
Tyr (Y)	trp; phe; thr; ser	phe
Val (V)	ile; leu; met; phe; ala; norleucina	leu

[0157] Modificações substanciais das propriedades biológicas do anticorpo são atingidas através da seleção de substituições que diferem significativamente em seu efeito sobre a manutenção de (a) estrutura da cadeia principal de polipeptídeo na área da substituição, por exemplo, na forma de folha ou conformação helicoidal; (b) carga ou hidrofobicidade da molécula no sítio desejado; ou (c) volume da cadeia lateral. Resíduos de ocorrência natural são divididos em grupos com base nas propriedades comuns da cadeia lateral:

(1) hidrófobos: norleucina, met, ala, val, leu, ile;

(2) hidrofílicos neutros: cys, ser, thr;

(3) ácidos: asp, glu;

(4) básicos: asn, gln, his, lis, arg;

(5) resíduos que influenciam a orientação de cadeia: gly, pro; e (6) aromáticos: trp, tyr, phe.

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66/135 [0158] Substituições não conservadoras causarão a substituição de um membro de uma dessas classes por outra classe.

[0159] Qualquer resíduo de cisteína não envolvido na manutenção da conformação adequada do anticorpo anti-ErbB2 também pode ser substituído, geralmente com serina, para aprimorar a estabilidade oxidativa da molécula e evitar a ligação cruzada aberrante. Por outro lado, ligação(ões) de cisteína pode(m) ser adicionada(s) ao anticorpo para aprimorar sua estabilidade (particularmente quando o anticorpo for um fragmento de anticorpo, tal como um fragmento de Fv).

[0160] Um tipo particularmente preferido de variante de substituição envolve a substituição de um ou mais resíduos da região hipervariável de um anticorpo progenitor (tal como um anticorpo humano ou humanizado). Geralmente, a(s) variante(s) resultante(s) selecionada(s) para o desenvolvimento adicional terá(ão) propriedades biológicas aprimoradas com relação ao anticorpo progenitor do qual é (são) gerado(s). Uma forma conveniente de geração dessas variantes de substituição envolve a maturação de afinidade através da utilização de exibição de fago. Resumidamente, diversos sítios de regiões hiper-variáveis (por exemplo, seis a sete sítios) são mudados para gerar todas as substituições amino possíveis em cada sítio. As variantes de anticorpos geradas desta forma são exibidas de forma monovalente a partir de partículas de fagos filamentosos na forma de fusões para o produto de gene III de M13 embalado em cada partícula. As variantes exibidas por fago são então selecionadas de acordo com sua atividade biológica (por exemplo, afinidade de ligação), da forma descrita no presente. A fim de identificar possíveis sítios de regiões hiper-variáveis para modificação, mutagênese de varredura de alanina pode ser realizada para identificar resíduos de regiões hiper-variáveis que contribuem significativamente para a ligação de antígenos. Alternativa ou adicionalmente, pode ser vantajoso

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67/135 analisar uma estrutura de cristal do complexo antígeno-anticorpo para identificar pontos de contato entre o anticorpo e ErbB2 humano. Esses resíduos de contato e resíduos vizinhos são candidatos para substituição de acordo com as técnicas elaboradas no presente. Uma vez que essas variantes sejam geradas, o quadro de variantes é submetido à seleção conforme descrito no presente, e os anticorpos com propriedades superiores em um ou mais ensaios relevantes podem ser selecionados para desenvolvimento adicional.

[0161] Outro tipo de variante de aminoácido do anticorpo altera o padrão de glicosilação original do anticorpo. Por alteração, designa-se a deleção de uma ou mais porções carboidrato encontradas no anticorpo e/ou adição de um ou mais sítios de glicosilação que não estejam presentes no anticorpo.

[0162] A glicosilação de anticorpos é tipicamente ligada por Nligada ou O-ligada. N-ligada designa a ligação da porção de carboidrato à cadeia lateral de um resíduo de asparagina. As seqüências de tripeptídeos asparagina-X-serina e asparagina-X-treonina, em que X é qualquer aminoácido, com exceção de prolina, são as seqüências de reconhecimento para a ligação enzimática da porção carboidrato à cadeia lateral de asparagina. Por essa razão, a presença de qualquer dessas seqüências de tripeptídeos em um polipeptídeo cria um local de glicosilação potencial. Glicosilação O-ligada refere-se à ligação de um dos açúcares N-acetil galactosamina, galactose ou xilose em um hidroxi aminoácido, mais comumente serina ou treonina, embora também possam ser utilizadas 5-hidroxi prolina ou 5-hidroxi lisina.

[0163] A adição de sítios de glicosilação ao anticorpo é convenientemente conseguida através da alteração da seqüência de aminoácido, de tal forma que contém uma ou mais das seqüências de tripeptídeos descritas acima (para sítios de glicosilação N-ligados). A alteração pode também ser feita através da adição ou substituição de um ou mais

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68/135 resíduos de serina ou treonina à seqüência do anticorpo original (para sítios de glicosilação O-ligados).

[0164] Moléculas de ácidos nucléicos que codificam variantes da seqüência de aminoácido do anticorpo anti-ErbB2 são preparadas através de uma série de métodos conhecidos no estado da técnica. Estes métodos incluem, mas sem limitar-se ao isolamento a partir de uma fonte natural (no caso de ocorrência natural de variantes de seqüências de aminoácidos) ou preparação através de mutagênese mediada por oligonucleotídeo (ou sítio dirigida), mutagênese por PCR e mutagênese de cassete de uma variante preparada anteriormente ou versão não variante do anticorpo anti-ErbB2.

[0165] Pode ser desejável modificar o anticorpo da presente invenção com relação à função de efetor, por exemplo, de forma a aumentar a citotoxicidade mediada por célula antígeno-dependente (ADCC) e/ou citotoxicidade complemento-dependente (CDC) do anticorpo. Isso pode ser atingido através da introdução de uma ou mais substituições de aminoácidos em uma região Fc do anticorpo. Alternativa ou adicionalmente, resíduo(s) de cisteína pode(m) ser introduzido(s) na região de Fc, de forma a permitir a formação de ligação de bissulfeto inter-cadeias nessa região. O anticorpo homodimérico assim gerado pode possuir capacidade de internalização aprimorada e/ou morte celular mediada por complemento aprimorado e citotoxicidade celular anticorpo-dependente (ADCC). Vide Caron et al., J. Exp. Med., 176:1191-1195, 1992 e Shopes, B., J. Immunol., 148:2918-2922, 1992. Anticorpos homodiméricos com atividade anti-tumoral aprimorada podem também ser preparados através da utilização de ligação cruzada heterobifuncionais, conforme descrito em Wolf et al., Cancer Research, 53:2560-2565, 1993. Alternativamente, pode ser construído um anticorpo que possui regiões Fc duplas e pode, portanto, apresentar lise complementar aprimorada e capacidades de ADCC. Vide Stevenson et al., Anti-Cancer Drug

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Design, 3:219-230, 1989.

[0166] Para aumentar a meia vida do anticorpo em soro, pode-se incorporar um epítopo de ligação de receptor selvagem no anticorpo (especialmente um fragmento de anticorpo), conforme descrito, por exemplo, na patente US 5.739.277. Da forma utilizada no presente, a expressão “epítopo de ligação de receptor selvagem” designa um epítopo da região Fc de uma molécula de IgG (por exemplo, IçGi, IgG2, IgG3 ou IgG4) que é responsável pelo aumento da meia vida em soro in vivo da molécula de IgG.

(viii) Seleção de anticorpos com as propriedades desejadas:

[0167] Foram descritas acima técnicas de geração de anticorpos. Podem-se selecionar adicionalmente anticorpos com certas características biológicas, conforme o desejado.

[0168] Para identificar um anticorpo que bloqueie a ativação de ligante de um receptor de ErbB, pode-se determinar a capacidade do anticorpo bloquear a ligação do ligante ErbB a células que expressem o receptor de ErbB (em conjugação, por exemplo, com outro receptor de ErbB com o qual o receptor de ErbB de interesse forma um hétero-oligômero de ErbB). Células que expressam naturalmente ou são transfectadas para expressar receptores de ErbB do hétero-oligômero de ErbB podem ser incubadas com o anticorpo e expostos em seguida a ligante de ErbB marcado. A capacidade do anticorpo anti-ErbB2 em bloquear a ligação de ligante ao receptor de ErbB no héterooligômero de ErbB pode ser então avaliada.

[0169] A inibição de ligação de HRG a linhagens celulares de tumor de mama MCF7 por anticorpos anti-ErbB2, por exemplo, pode ser realizada através da utilização de culturas de MCF7 monocamada sobre gelo em um formato de placa de 24 cavidades, essencialmente conforme descrito no Exemplo 1 abaixo. Anticorpos monoclonais anti-ErbB2 podem ser adicionados a cada recipiente e incubados por trinta minutos. O rHRG31 177-224

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70/135 marcado por ¹²⁵I (25 pm) pode ser então adicionado e a incubação pode prosseguir por quatro a 16 horas. Podem ser preparadas curvas de reação à dosagem e um valor IC50 pode ser calculado para o anticorpo de interesse. Em uma realização, o anticorpo que bloqueia a ativação de ligante de um receptor de ErbB terá IC50 para a inibição da ligação de HRG a células MCF7 neste ensaio de cerca de 50 nM ou menos, de maior preferência 10 nM ou menos. Quando o anticorpo for um fragmento de anticorpo tal como um fragmento Fab, o IC50 para a inibição de ligação de HRG a células MCF7 neste ensaio pode ser, por exemplo, de cerca de 100 nM ou menos, de maior preferência 50 nM ou menos.

[0170] Alternativa ou adicionalmente, pode-se determinar a capacidade do anticorpo anti-ErbB2 em bloquear a fosforilação de tirosina estimulada pelo ligante ErbB de um receptor de ErbB presente em um héterooligômero de ErbB. Células endógenas ou transfectadas que expressem os receptores de ErbB, por exemplo, podem ser incubadas com o anticorpo e, em seguida, testadas para determinação da atividade de fosforilação de tirosina ligante-dependente de ErbB, através da utilização de um monoclonal antifosfotirosina (que é opcionalmente conjugado com um marcador detectável). O ensaio de ativação de receptor de quinase descrito na patente US 5.766.863 também é disponível para determinação da ativação de receptor de ErbB e do bloqueio daquela atividade por um anticorpo.

[0171] Em uma realização, pode-se selecionar um anticorpo que iniba o estímulo de HRG de fosforilação tirosina de p180 em células de MCF7 essencialmente conforme descrito no Exemplo 1 abaixo. As células de MCF7 podem ser colocadas, por exemplo, em placas de 24 cavidades e anticorpos monoclonais para ErbB2 podem ser adicionados a cada cavidade e incubados por trinta minutos à temperatura ambiente; em seguida, pode-se adicionar rHRG31 177-244 a cada cavidade até concentração final de 0,2 nM e a incubação

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71/135 pode prosseguir por oito minutos. Os meios podem ser aspirados de cada cavidade e as reações podem ser suspensas através da adição de 100 gl de tampão de amostra de SDS (5% SDS, 25 mM DTT e 25 mM Tris-HCl, pH 6,8). Cada amostra (25 gl) pode sofrer eletroforese sobre um gel de grau a 4 até 12% (Novex) e, em seguida, transferida por eletroforese para membrana de difluoreto de polivinilideno. Imunotransferência de anti-fosfotirosina (a 1 gg/ml) podem ser desenvolvidas e a intensidade da faixa reativa predominante a Mr 180.000 pode ser quantificada através de densitometria de reflexão. O anticorpo selecionado preferencialmente inibirá de forma significativa o estímulo de HRG de fosforilação de tirosina p180 em cerca de 0 a 35% de controle neste ensaio. Pode-se preparar uma curva de reação à dosagem para inibição do estímulo por HRG de fosforilação de tirosina p180 conforme determinado através de densitometria de reflexão e pode ser calculado um IC50 para o anticorpo de interesse. Em uma realização, o anticorpo que bloqueia a ativação de ligante de um receptor de ErbB terá IC50 para a inibição do estímulo de HRG de fosforilação de tirosina p180 neste ensaio de cerca de 50 nM ou menos, de maior preferência 10 nM ou menos. Quando o anticorpo for um fragmento de anticorpo tal como um fragmento Fab, o IC50 para a inibição do estímulo de HRG de fosforilação de tirosina p180 neste ensaio pode ser, por exemplo, de cerca de 100 nM ou menos, de maior preferência 50 nM ou menos.

[0172] Podem-se também determinar os efeitos inibidores do crescimento do anticorpo sobre células MDA-MB-175, por exemplo, essencialmente conforme descrito em Schaefer et al., Oncogene, 15:13851394, 1997. De acordo com este ensaio, células de MDA-MB-175 podem ser tratadas com um anticorpo monoclonal anti-ErbB2 (10 gg/ml) por quatro dias e manchadas com violeta de cristal. Incubação com um anticorpo anti-ErbB2 pode exibir um efeito inibidor do crescimento sobre essa linhagem celular,

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72/135 similar à exibida por anticorpo monoclonal 2C4. Em uma realização adicional, HRG exógeno não reverterá significativamente esta inibição. Preferencialmente, o anticorpo será capaz de inibir a proliferação celular de células MDA-MB-175 até um ponto maior que o anticorpo monoclonal 4D5 (e opcionalmente até um ponto maior que o anticorpo monoclonal 7F3), ambos na presença e ausência de HRG exógeno.

[0173] Em uma realização, o anticorpo anti-ErbB2 de interesse pode bloquear a associação dependente de heregulina de ErbB2 com ErbB3 em células de MCF7 e SK-BR-3 conforme determinado em um experimento de co-imunoprecipitação, tal como o descrito no Exemplo 2, de forma substancialmente mais eficaz que o anticorpo monoclonal 4D5 e, preferencialmente, de forma substancialmente mais eficaz que o anticorpo monoclonal 7F3.

[0174] Para identificar anticorpos anti-ErbB2 inibidores do crescimento, pode-se selecionar anticorpos que inibam o crescimento de células cancerosas que sobre-expressem ErbB2. Em uma realização, o anticorpo inibidor do crescimento selecionado é capaz de inibir o crescimento de células SK-BR-3 em cultura celular em cerca de 20 a 100% e, preferencialmente, cerca de 50 a 100% em concentração de anticorpos de cerca de 0,5 a 30 pg/ml. Para identificar esses anticorpos, pode-se realizar o ensaio de SK-BR-3 descrito na patente US 5.677.171. De acordo com este ensaio, as células SK-BR-3 são cultivadas em uma mistura 1:1 de F12 e meio DMEM suplementado com soro bovino fetal a 10%, glutamina e estreptomicina de penicilina. As células de SK-BR-3 são colocadas em 20.000 células em um disco de cultivo celular de 35 mm (2 ml/disco de 35 mm). 0,5 a 30 pg/ml do anticorpo anti-ErbB2 são adicionados por disco. Após seis dias, o número de células, em comparação com células não tratadas, é contado através da utilização de um contador celular eletrônico Coulter^TM Esses anticorpos que

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73/135 inibem o crescimento das células SK-BR-3 por cerca de 20 a 100% ou cerca de 50 a 100% podem ser selecionados na forma de anticorpos inibidores do crescimento.

[0175] Para selecionar anticorpos que induzam a morte celular, perda de integridade da membrana conforme indicado, por exemplo, por PI, azul de tripano ou tomada de 7AAD pode ser determinada com relação ao controle. O ensaio preferido é o ensaio de tomada de PI através da utilização de células BT474. De acordo com este ensaio, células BT474 (que podem ser obtidas através da Coleção Norte-Americana de Tipos de Culturas, Rockville MD, Estados Unidos) são cultivadas em Meio Eagle modificado da Dulbecco (D-MEM):F-12 de Ham (50:50) suplementado com FBS desativado por calor a 10% (Hyclone) e 2 mM de L-glutamina. (Desta forma, o ensaio é realizado na ausência de complemento e células efetoras imunológicas). As células BT474 são semeadas em densidade de 3 x 106 por disco em discos de 100 x 20 mm e mantidas em crescimento por uma noite. O meio é então removido e substituído com meio novo isolado ou meio que contenha 10 pg/ml do anticorpo monoclonal apropriado. As células são incubadas por um período de tempo de três dias. Em seguida a cada tratamento, as monocamadas são lavadas com PBS e separadas através de tripsina. As células são então centrifugadas a 1200 rpm por cinco minutos a 4°C, o pellet foi novamente suspenso em 3 ml de tampão de ligação de Ca²⁺ resfriado com gelo (10 mM de Hepes, pH 7,4, 140 mM de NaCl, 2,5 mM de CaCl₂) e dividida em 12 x 75 tubos de 35 mm com tampa de coador (1 ml por tubo, três tubos por grupo de tratamento) para a remoção dos conjuntos de células. Os tubos recebem então PI (10 pg/ml). Amostras podem ser analisadas através da utilização de um citômetro de fluxo Facscan^® e software CellQuest Facsconvert^® (Becton Dickinson). Estes anticorpos que induzem níveis estatisticamente significativos de morte celular, conforme determinado pela retirada de PI, podem ser selecionados como

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74/135 anticorpos indutores de morte celular.

[0176] A fim de selecionar anticorpos que induzam a apoptose, é disponível um ensaio de ligação de anexina que utiliza células BT474. As células BT474 são cultivadas e semeadas em discos, conforme discutido no parágrafo anterior. O meio é então removido e substituído com meio novo isolado ou meio contendo 10 pg/ml do anticorpo monoclonal. Após um período de incubação de três dias, as monocamadas são lavadas com PBS e separadas através de tripsina. As células são então centrifugadas, resuspensas em tampão de ligação de Ca²⁺ e divididas em tubos conforme discutido acima para o ensaio de morte celular. Os tubos recebem então anexina marcada (por exemplo, V-FTIC de anexina) (1 pg/ml). Amostras podem ser analisadas através da utilização de um citômetro de fluxo Facscan^® e software CellQuest Facsconvert^® (Becton Dickinson). Estes anticorpos que induzem níveis estatisticamente significativos de ligação de anexina com relação ao controle são selecionados como anticorpos indutores de apoptose.

[0177] Além do ensaio de ligação de anexina, é disponível um ensaio de manchas de DNA utilizando-se células BT474. A fim de realizar este ensaio, células BT474 que foram tratadas com o anticorpo de interesse conforme descrito nos dois parágrafos anteriores são incubadas com 9 pg/ml de Hoechst 33342® por duas horas a 37°C, analisadas em seguida sobre um citômetro de fluxo Epics Elite^TM (Coulter Corporation), utilizando o software Modfit Lt^TM (Verity Software House). Anticorpos que induzem modificação do percentual de células apoptóticas que seja de duas vezes ou mais (e, preferencialmente, três vezes ou mais) que as células não tratadas (até 100% de células apoptóticas) podem ser selecionadas na forma de anticorpos próapoptóticos, utilizando este ensaio.

[0178] Para selecionar anticorpos que se ligam a um epítopo sobre ErbB2 ligado por um anticorpo de interesse, um ensaio de bloqueio

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75/135 cruzado tal como o descrito em Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow e David Lane, 1988, pode ser realizado. Alternativa ou adicionalmente, pode-se efetuar mapeamento de epítopos através de métodos conhecidos no estado da técnica (vide, por exemplo, Figs. 1A e 1B do presente).

(IX) IMUNOCONJUGADOS:

[0179] A presente invenção também se refere a imunoconjugados que compreendem um anticorpo conjugado a um agente citotóxico, tal como na forma de um agente quimioterapêutico, toxina (por exemplo, uma toxina de molécula pequena ou uma toxina enzimaticamente ativa de origem bacteriana, fúngica, vegetal ou animal, que inclui seus fragmentos e/ou variantes) ou um isótopo radioativo (ou seja, um radioconjugado).

[0180] Os agentes quimioterapêuticos úteis na geração desses imunoconjugados foram descritos acima. Conjugados de um anticorpo e uma ou mais toxinas de moléculas pequenas, tais como caliqueamicina, uma maitansina (patente US 5.208.020), um tricoteceno e CC1065, também são contemplados no presente.

[0181] Em realização preferida da presente invenção, o anticorpo é conjugado a uma ou mais moléculas de maitansina (por exemplo, cerca de 1 a cerca de dez moléculas de maitansina por molécula de anticorpo). A maitansina pode ser convertida, por exemplo, em May-SS-Me, que pode ser reduzido em May-SH3 e reagido com anticorpo modificado (Chari et al., Cancer Research, 52:127-131, 1992) para gerar um imunoconjugado de anticorpo e maitansinóide.

[0182] Outro imunoconjugado de interesse compreende um anticorpo anti-ErbB2 conjugado a uma ou mais moléculas de caliqueamicina. A família caliqueamicina de antibióticos é capaz de produzir quebras de DNA de cadeia dupla em concentrações sub-picomolares. Análogos estruturais de

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76/135 caliqueamicina que podem ser utilizados incluem, mas sem limitar-se a γι¹, «2¹, «3¹, N-acetil-Y11, PSAG e θ¹ (Hinman et al., Cancer Research, 53:3336-3342, 1993 e Lode et al, Cancer Research, 58:2925-2928, 1998). Vide também as Patentes US 5.714.586; 5.712.374; 5.264.586 e 5.773.001, incorporadas expressamente ao presente como referência.

[0183] As toxinas enzimaticamente ativas e seus fragmentos que podem ser utilizados incluem cadeia de difteria A, fragmentos ativos de nãoligação de toxina de difteria, cadeia de exotoxina A (de Pseudomonas aeruginosa), cadeia de ricina A, cadeia de abrina A, cadeia de modeccina A, alfa-sarcina, proteínas de Aleurites fordii, proteínas de diantina, proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII e PAP-S), inibidor de Momordica charantia, curcina, crotina, inibidor de Sapaonaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina e os tricotecenos. Vide, por exemplo, WO 93/21232 publicada em 28 de outubro de 1993.

[0184] A presente invenção contempla adicionalmente um imunoconjugado formado entre um anticorpo e um composto com atividade nucleolítica (por exemplo, ribonuclease ou uma endonuclease de DNA, tal como desoxirribonuclease; DNase).

[0185] Uma série de isótopos radioativos é disponível para a produção de anticorpos radioconjugados anti-ErbB2. Exemplos incluem At²¹¹, I131 H25 y90 r-186 0^188 Qm153 Bi212 p32 _ icótnnnc mdinotivne di I ii

I , I , Y , Re , Re , Sm , Bi , P e isótopos radioativos de Lu.

[0186] Conjugados do anticorpo e agente citotóxico podem ser feitos através da utilização de uma série de agentes acopladores de proteína bifuncionais, tais como propionato de N-succinimidil-3-(2-piridilditiol) (SPDP), ciclohexano-1-carboxilato de succinimidil-4-(N-maleimidometila), iminotiolano (IT), derivados bifuncionais de imido ésteres (tais como adipimidato de dimetila HCl), ésteres ativos (tais como suberato de dissuccinimidila), aldeídos (tais como glutaraldeído), compostos bis-azido (tais como bis (p-azidobenzoil)

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77/135 hexanodiamina), derivados de bis-diazônio (tais como bis-(p-diazoniobenzoil)etilenodiamina), diisocianatos (tais como 2,6-diisocianato de tolueno) e compostos de flúor bis-ativos (tais como 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzeno). Uma imunotoxina de rícino pode ser preparada, por exemplo, conforme descrito em Vitetta et al., Science, 238:1098, 1987. Ácido 1-isotiocianatobenzil-3metildietileno triaminopentacético marcado com carbono 14 (MX-DTPA) é um exemplo de agente quelante para a conjugação de radionucleotídeo no anticorpo. Vide WO 94/11026. O ligante pode ser um “ligante divisível” que possibilita a liberação da droga citotóxica na célula. Pode-se utilizar uma ligação instável com ácidos, uma ligação sensível à peptidase, ligação dimetila ou ligação contendo dissulfeto, por exemplo (Chari et al., Cancer Research, 52:127-131, 1992).

[0187] Alternativamente, uma proteína de fusão que compreende o agente citotóxico e anticorpo anti-ErbB2 pode ser feita, por exemplo, através de técnicas recombinantes ou síntese de peptídeos.

[0188] Em ainda outra realização, o anticorpo pode ser conjugado a um “receptor” (tal como estreptavidina) para utilização em definição prévia do tumor alvo, em que o conjugado receptor de anticorpos é administrado ao paciente, seguido por remoção de conjugado desunido da circulação, utilizando-se um agente de liberação e, em seguida, a administração de um “ligante” (tal como avidina) que é conjugado a um agente citotóxico (por exemplo, um radionucleotídeo).

(x) Terapia de Pró-Drogas Mediada por Enzima Dependente de Anticorpos (ADEPT):

[0189] Os anticorpos da presente invenção podem também ser utilizados em ADEPT conjugando-se o anticorpo a uma enzima ativadora de pró-droga que converte uma pró-droga (por exemplo, um agente quimioterapêutico de peptidila, vide WO 81/01145) a uma droga antiPetição 870160050461, de 09/09/2016, pág. 89/149

78/135 cancerígena ativa. Vide, por exemplo, WO 88/07378 e patente US 4.975.278.

[0190] O componente de enzima do imunoconjugado útil para ADEPT inclui qualquer enzima capaz de atuar sobre uma pró-droga de forma a cobri-la em sua forma citotóxica mais ativa.

[0191] As enzimas que são úteis no método da presente invenção incluem, mas sem limitar-se a fosfatase alcalina útil para a conversão de pródrogas contendo fosfato em drogas livres; a aril sulfatase é útil para a conversão de pró-drogas contendo sulfato em drogas livres; a deaminase de citosina útil para a conversão de 5-fluorocitosina não tóxica na droga anticâncer, 5-fluorouracil; proteases, tais como protease de Serratia, termolisina, subtilisina, carboxipeptidases e catepsinas (tais como catepsinas B e L), que são úteis para a conversão de pró-drogas contendo peptídeos em drogas livres; D-alanil carboxipeptidases, úteis para a conversão de pró-drogas que contenham substituintes D-aminoácidos; enzimas de divisão de carboidratos, tais como β-galactosidase e neuraminidase úteis para a conversão de pródrogas glicosiladas em drogas livres; β-lactamase útil para a conversão de drogas derivadas com β-lactamas em drogas livres; e amidases de penicilina, tais como amidase de penicilina V ou amidase de penicilina G, úteis para a conversão de drogas derivadas em seus nitrogênios amina com grupos fenoxiacetila ou fenilacetila, respectivamente, em drogas livres. Alternativamente, anticorpos com atividade enzimática, também conhecida na técnica como “abzimas”, podem ser utilizados para converter as pró-drogas da presente invenção em drogas ativas livres (vide, por exemplo, Massey, Nature, 328:457-458, 1987). Conjugados de abzima e anticorpo podem ser preparados conforme descrito no presente para fornecimento da abzima a uma população de células tumorais.

[0192] As enzimas da presente invenção podem ser unidas covalentemente aos anticorpos anti-ErbB2 através de métodos bem

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79/135 conhecidos na técnica, tais como a utilização dos reagentes de ligação cruzada heterobifuncionais discutidos acima. Alternativamente, proteínas de fusão que compreendem pelo menos a região de união de antígenos de um anticorpo da presente invenção ligado à pelo menos uma parte funcionalmente ativa de uma enzima da presente invenção, podem ser construídas através da utilização de técnicas de DNA recombinante bem conhecidas no estado da técnica (vide, por exemplo, Neuberger et al., Nature, 312; 604-608, 1984.

(XI) Outras modificações de anticorpos:

[0193] Outras modificações do anticorpo são contempladas no presente. O anticorpo pode ser ligado, por exemplo, a um dentre uma série de polímeros não proteináceos, tais como polietileno glicol, polipropileno glicol, polioxialquilenos ou copolímeros de polietileno glicol e polipropileno glicol. O anticorpo também pode ser aprisionado em microcápsulas preparadas, por exemplo, através de técnicas de acumulação ou através de polimerização interfacial (por exemplo, microcápsulas de gelatina ou hidroximetilcelulose e microcápsulas de poli(metilmetacrilato), respectivamente), em sistemas de fornecimento de drogas coloidais (por exemplo, lipossomas, microesferas de albumina, microemulsões, nanopartículas e nanocápsulas) ou em macroemulsões. Essas técnicas são descritas em Remington’s Pharmaceutical Sciences, 16^â edição, Oslo, A., ed., 1980.

[0194] Os anticorpos anti-ErbB2 descritos no presente podem também ser formulados na forma de imunolipossomas. Lipossomas que contêm o anticorpo são preparados através de métodos conhecidos na técnica, tais como os descritos em Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 82:3688, 1985; Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 77:4030, 1980; patentes US 4.485.045 e 4.544.545; e WO 97/38731 publicada em 23 de outubro de 1997. Lipossomas com tempo de circulação aumentado são descritos na patente US 5.013.556.

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80/135 [0195] Lipossomas particularmente úteis podem ser gerados através do método de evaporação de fase reversa com uma composição de lipídio que compreende fosfatidilcolina, colesterol e fosfatidiletanolamina derivada de PEG (PEG-PE). Os lipossomas são extrudados através de cargas de tamanho de poro definido para gerar lipossomas com o diâmetro desejado. Fragmentos de Fab' do anticorpo da presente invenção podem ser conjugados aos lipossomas conforme descrito em Martin et al., J. Biol. Chem., 257:286288, 1982, através de reação de intercâmbio de dissulfeto. Um agente quimioterapêutico é opcionalmente contido no lipossoma. Vide Gabizon et al., J. National Cancer Inst., 81 (19)1484, 1989.

III - Vetores, Células Hospedeiras e Métodos Recombinantes [0196] A presente invenção também fornece ácido nucléico isolado que codifica o anticorpo anti-ErbB2 humanizado, vetores e células hospedeiras que compreendem o ácido nucléico e técnicas recombinantes para a produção do anticorpo.

[0197] Para a produção recombinante do anticorpo, o ácido nucléico que o codifica é isolado e inserido em um vetor reproduzível para clonagem adicional (amplificação do DNA) ou para expressão. O DNA que codifica o anticorpo monoclonal é facilmente isolado e seqüenciado através da utilização de procedimentos convencionais (utilizando-se, por exemplo, sondas de oligonucleotídeos que sejam capazes de ligar-se especificamente a genes que codifiquem as cadeias leve e pesada do anticorpo). Diversos vetores são disponíveis. Os componentes do vetor geralmente incluem, mas sem limitar-se a um ou mais dos seguintes: uma seqüência de sinal, uma origem de replicação, um ou mais genes marcadores, um elemento amplificador, um promotor e uma seqüência de término de transcrição.

(I) Componente de seqüência de sinal:

[0198] O anticorpo anti-ErbB2 da presente invenção pode ser

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81/135 produzido de forma recombinante, não apenas diretamente, mas também como polipeptídeo de fusão com um polipeptídeo heterólogo, que é preferencialmente uma seqüência de sinal ou outro polipeptídeo que contém sítio de divisão específico no N-terminal da proteína madura ou polipeptídeo. A seqüência de sinal heterólogo selecionada é preferencialmente uma que seja reconhecida e processada (ou seja, dividida por uma peptidase de sinal) pela célula hospedeira. Para células hospedeiras procarióticas que não reconheçam e processem a seqüência de sinal de anticorpo anti-ErbB2 nativa, a seqüência de sinal é substituída por uma seqüência de sinal procariótica selecionada, por exemplo, a partir do grupo de fosfatase alcalina, penicilinase, lpp, ou líderes de enterotoxina II estáveis ao calor. Para secreção de levedura, a seqüência de sinal nativa pode ser substituída, por exemplo, pelo líder de invertase de levedura, líder de fator α (incluindo os líderes de fator α Saccharomyces e Kluyveromyces) ou líder de fosfatase ácida, líder de glicoamilase C. albicans ou o sinal descrito em WO 90/13646. Para expressão celular em mamíferos, são disponíveis seqüências de sinal em mamíferos, bem como os líderes de secreção viral, por exemplo, tais como o sinal gD simplex de herpes.

[0199] O DNA para essa região precursora está ligado na estrutura de leitura para o DNA codificador do anticorpo anti-ErbB2.

(II) Origem do componente de replicação:

[0200] Tanto os vetores de clonagem como de expressão contêm uma seqüência de ácido nucléico que permite que o vetor se replique em uma ou mais células hospedeiras selecionadas. Geralmente, em vetores de clonagem, esta seqüência é uma que permite que o vetor se replique independentemente do DNA cromossômico hospedeiro e inclui origens de replicação ou seqüências de replicação autônoma. Essas seqüências são bem conhecidas para uma série de bactérias, leveduras e vírus. A origem de replicação do plasmídeo pBR322 é apropriada para a maioria das bactérias

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82/135 gram-negativas, a origem de 2μ de plasmídeo é apropriada para levedura e diversas origens virais (SV40, polioma, adenovírus, VSV ou BPV) são úteis para a clonagem de vetores em células de mamíferos. Geralmente, a origem do componente de replicação não é necessária para vetores de expressão de mamíferos (a origem SV40 pode ser tipicamente utilizada por conter o promotor inicial).

(III) Seleção de componente genético:

[0201] Vetores de clonagem e de expressão podem conter um gene de seleção, também denominado marcador selecionável. Os genes de seleção típicos codificam proteínas que (a) conferem resistência a antibióticos ou outras toxinas, tais como ampicilina, neomicina, metotrexato ou tetraciclina;

(b) deficiências auxotróficas complementares; ou (c) fornecimento de nutrientes fundamentais não disponíveis a partir de meios complexos, tais como o gene codificador de racemase de D-alanina para Bacillus.

[0202] Um exemplo de esquema de seleção utiliza uma droga para interromper o crescimento de uma célula hospedeira. As células que são transformadas de forma bem sucedida com um gene heterólogo produzem uma proteína que confere resistência a drogas e, portanto, sobrevivem ao regime de seleção. Exemplos dessa seleção dominante utilizam as drogas neomicina, ácido micofenólico e higromicina.

[0203] Outro exemplo de marcadores selecionáveis apropriados para células de mamíferos são os que permitem a identificação de células competentes para a tomada do ácido nucléico do anticorpo anti-ErbB2, tais como DHFR, quinase de timidina, metalotioneína I e II, preferencialmente genes de metalotioneína de primatas, deaminase de adenosina, descarboxilase de ornitina, etc.

[0204] Células transformadas com o gene de seleção de DHFR, por exemplo, são primeiramente identificadas através de cultura de todos os

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83/135 transformantes em um meio que contenha metotrexato (Mtx), um antagonista competitiva de DHFR. Uma célula hospedeira apropriada quando for empregado DHFR do tipo selvagem é a linhagem celular de ovário de hamster chinês (CHO) com atividade de DHFR deficiente.

[0205] Alternativamente, as células hospedeiras (particularmente hospedeiros do tipo selvagem que contenham DHFR endógeno) transformadas ou co-transformadas com seqüências de DNA que codifiquem anticorpo antiErbB2, proteína de DHFR do tipo selvagem e outro marcador selecionável, tal como 3'-fosfotransferase de aminoglicosídeo (APH), podem ser selecionadas através de crescimento celular em meio que contenha um agente de seleção para o marcador selecionável, tal como um antibiótico aminoglicosídico, por exemplo canamicina, neomicina ou G418. Vide a patente US 4.965.199.

[0206] Um gene de seleção apropriado para utilização na levedura é o gene trp1 presente no plasmídeo de levedura YRp7 (Stinchcomb et al., Nature, 282:39, 1979). O gene trp1 proporciona um marcador de seleção para uma linhagem mutante de levedura que não tenha a capacidade de crescimento em triptofano, tal como ATCC 44076 ou PEP4-1. Jones, Genetics, 85:12, 1977. A presença da lesão trp1 no genoma da célula hospedeira de levedura proporciona então um ambiente eficaz para a detecção de transformação através do crescimento na ausência de triptofano. De forma similar, linhagens de levedura com deficiência de Leu2 (ATCC 20.622 ou 38.626) são complementadas por plasmídeos conhecidos que apresentam o gene Leu2.

[0207] Além disso, vetores derivados do plasmídeo circular de 1,6 um pKD1 podem ser utilizados para a transformação de leveduras de Kluyveromyces. Alternativamente, um sistema de expressão para a produção em larga escala de quimosina de bezerros recombinante foi relatada para K. lactis. Van den Berg, Bio/Technology, 8:135, 1990. Também foram descritos

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84/135 vetores de expressão de múltiplas cópias estáveis para a secreção de albumina de soro humano recombinante madura por linhagens industriais de Kluyveromyces. Fleer et al., Bio/Technology, 9:968-975, 1991.

(iv) Componente de promotor:

[0208] Vetores de expressão e de clonagem normalmente contêm um promotor que é reconhecido pelo organismo hospedeiro e é ligado operacionalmente ao ácido nucléico do anticorpo anti-ErbB2. Promotores apropriados para utilização com hospedeiros procarióticos incluem o promotor phoA, sistemas promotores de lactose e β-lactamase, fosfatase alcalina, um sistema promotor de triptofano (trp) e promotores híbridos, tais como o promotor de tac. Entretanto, outros promotores bacterianos conhecidos são apropriados. Promotores para utilização em sistemas bacterianos também conterão uma seqüência Shine-Dalgarno (S. D.) ligada de forma operacional ao DNA codificador do anticorpo anti-ErbB2.

[0209] São conhecidas seqüências promotoras para eucariontes. Virtualmente todos os genes eucarióticos possuem uma região rica em AT localizada a cerca de 25 a 30 bases anteriores ao sítio em que é iniciada a transcrição. Outra seqüência concluiu que 70 a 80 bases anteriores a partir do início da transcrição de vários genes é uma região CNCAAT, em que N pode ser qualquer nucleotídeo. Na extremidade 3' da maioria dos genes eucarióticos, encontra-se uma seqüência AATAAA que pode ser o sinal para a adição da extremidade poli A a extremidade 3' da seqüência de codificação. Todas essas seqüências são inseridas de forma apropriada em vetores de expressão eucarióticos.

[0210] Exemplos de seqüências promotoras apropriadas para utilização com hospedeiros de leveduras incluem os promotores de quinase de

3-fosfoglicerato e outras enzimas glicolíticas, tais como enolase, desidrogenase de gliceraldeído-3-fosfato, hexoquinase, descarboxilase de piruvato,

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85/135 fosfofrutoquinase, isomerase de glicose-6-fosfato, mutase de 3-fosfoglicerato, quinase de piruvato, isomerase de triosefosfato, isomerase de fosfoglicose e glicoquinase.

[0211] Outros promotores de leveduras, que são promotores induzidos que apresentam a vantagem adicional de transcrição controlada por condições de crescimento, são as regiões promotoras para desidrogenase 2 de álcool, isocitocromo C, fosfatase ácida, enzimas degradativas associadas com metabolismo de nitrogênio, metalotioneína, desidrogenase 3-fosfato de gliceraldeído e enzimas responsáveis pela utilização de maltose e galactose. Promotores e vetores apropriados para utilização na expressão em levedura são descritos adicionalmente em EP 73.657. Amplificadores de levedura também são utilizados com vantagens em promotores de levedura.

[0212] A transcrição de anticorpos anti-ErbB2 de vetores em células hospedeiras de mamíferos é controlada, por exemplo, por promotores obtidos a partir dos genomas de vírus tais como polioma, vírus, vírus da varicela, adenovírus (como Adenovírus 2), vírus de papiloma bovino, vírus de sarcoma das aves, citomegalovírus, um retrovírus, vírus da hepatite B e, de maior preferência Vírus Símio 40 (SV 40), a partir de promotores de mamíferos heterólogos, tais como o promotor actina ou um promotor de imunoglobulina, a partir de promotores de choque por calor, desde que esses promotores sejam compatíveis com os sistemas celulares hospedeiros.

[0213] Os promotores iniciais e posteriores do vírus SV40 são obtidos convenientemente na forma de fragmento de restrição de SV40 que também contém a origem viral de replicação de SV40. O promotor inicial imediato do citomegalovírus humano é convenientemente obtido na forma de fragmento de restrição de HindIII E. Um sistema de expressão de DNA em hospedeiros mamíferos que utiliza o vírus de papiloma bovino como vetor é descrito na patente US 4.419.446. Uma modificação desse sistema é descrita

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86/135 na patente US 4.601.978. Vide também Reyes et al., Nature, 297:598-601, 1982, sobre a expressão de cDNA de β-interferon humano em células de camundongos sob controle de um promotor de quinase de timidina a partir de vírus simplex de herpes. Alternativamente, pode-se utilizar a repetição do terminal longo do vírus de sarcoma de rous como promotor.

(v) Componente de elemento amplificador:

[0214] A transcrição de um DNA codificador do anticorpo antiErbB2 da presente invenção por eucariontes superiores é muitas vezes aumentada através da inserção de uma seqüência amplificadora no vetor. Muitas seqüências amplificadoras são agora conhecidas a partir de genes de mamíferos (globina, elastase, albumina, α-fetoproteína e insulina). Tipicamente, entretanto, utilizar-se-ia um amplificador de um vírus celular eucariótico. Exemplos incluem o amplificador SV40 do último lado da origem de replicação (bp 100-270), o amplificador promotor inicial do citomegalovírus, o amplificador de polioma do último lado da origem de replicação e amplificadores de adenovírus. Vide também Yaniv, Nature, 297:17-18, 1982, sobre a amplificação dos elementos para ativação de promotores eucarióticos. O amplificador pode ser dividido no vetor na posição 5' ou 3' para a seqüência codificadora do anticorpo anti-ErbB2, mas é preferencialmente localizada no sítio 5' do promotor.

(vi) Componente de término de transcrição:

[0215] Vetores de expressão utilizados em células hospedeiras eucarióticas (leveduras, fungos, insetos, plantas, animais, seres humanos ou células nucleadas de outros organismos multicelulares) também conterão as seqüências necessárias para o término da transcrição e/ou estabilização do mRNA. Essas seqüências são comumente disponíveis a partir das regiões não traduzidas 5' e, ocasionalmente 3', de DNAs ou cDNAS eucarióticos ou virais. Estas regiões contêm segmentos de nucleotídeos transcritos na forma de

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87/135 fragmentos poliadenilados na parte não traduzida do mRNA que codifica o anticorpo anti-ErbB2. Um componente terminal de transcrição útil é a região de poliadenilação do hormônio de crescimento bovino. Vide WO 94/11026 e o vetor de expressão ali descrito.

(vii) Seleção e transformação de células hospedeiras:

[0216] As células hospedeiras apropriadas para a clonagem ou expressão do DNA nos vetores do presente são as células eucarióticas superiores, de levedura ou procarióticas descritas acima. Procariontes apropriados para este propósito incluem eubactérias, tais como organismos gram-negativos ou gram-positivos, por exemplo, enterobactérias tais como Escherichia, por exemplo E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, por exemplo Salmonella typhimurium, Serratia, por exemplo Serratia marcescans, e Shigella, bem como Bacillus, tais como B. subtilis e B. licheniformis (por exemplo, B. licheniformis 41P descrito em DD 266.710, publicada em 12 de abril de 1989), Pseudomonas, tais como P. aeruginosa, e Streptomyces. Um hospedeiro de clonagem de E. coli preferido é E. coli 294 (ATCC 31.446), embora outras linhagens, tais como E. coli B, E. coli X1776 (ATCC 31.537) e, E. coli W3110 (ATCC 27.325) sejam apropriadas. Estes exemplos são ilustrativos, e não limitadores.

[0217] Além dos procariontes, micróbios eucarióticos, tais como fungos ou leveduras filamentosas, são hospedeiros de clonagem ou expressão apropriados para vetores codificadores de anticorpos anti-ErbB2. Saccharomyces cerevisiae, ou fermento comum de padaria, é o mais comumente utilizado dentre os microorganismos hospedeiros eucarióticos inferiores. Entretanto, uma série de outros gêneros, espécies e linhagens são comumente disponíveis e úteis no presente, tais como Schizosaccharomyces pombe; hospedeiros Kluyveromyces, tais como K. lactis, K. fragilis (ATCC 12.424), K. bulgaricus (ATCC 16.045), K. wickeramii (ATCC 24.178), K. waltii

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88/135 (ATCC 56.500), K. drosophilarum (ATCC 36.906), K. thermotolerans e K. marxianus: yarrowia (EP 402.226); Pichia pastoris (EP 183.070); Candida: Trichoderma reesia (EP 244.234); Neurospora crassa; Schwanniomyces, tais como Schwanniomyces occidentalis; e fungos filamentosos, tais como hospedeiros Neurospora, Penicillium, Tolypocladium e Aspergillus, tais como A. nidulans e A. niger.

[0218] Células hospedeiras apropriadas para a expressão de anticorpo anti-ErbB2 glicosilado são derivadas de organismos multicelulares. Exemplos de células de invertebrados incluem células de insetos e vegetais. Foram identificadas numerosas variantes e linhagens baculovirais e células hospedeiras de insetos permissivos correspondentes de hospedeiros tais como Spodoptera frugiperda (lagarta), Aedes aegypti (mosquito), Aedes albopictus (mosquito), Drosophila melanogaster (mosca das frutas) e Bombyx mori. Uma série de linhagens virais para transfecção é disponível publicamente, como a variante L-1 de Autographa californica NPV e a linhagem Bm-5 de Bombyx mori NPV e esses vírus podem ser utilizados como o vírus de acordo com a presente invenção, particularmente para a transfecção de células de Spodoptera frugiperda.

[0219] Cultivos de células vegetais de algodão, milho, batata, soja, petúnia, tomate e tabaco também podem ser utilizados como hospedeiros.

[0220] Tem havido interesse maior, entretanto, em células de vertebrados e a propagação de células de vertebrados em cultivo (cultivo de tecido) tornou-se um procedimento rotineiro. Exemplos de linhagens de células hospedeiras de mamíferos úteis são as linhagens CV1 de rim de macaco transformado por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); linhagem de rim embriônico humano (293 ou 293 células subclonadas para crescimento em cultivo de suspensão, Graham et al., J. Gen. Virol., 36:59, 1977); células de rim de filhote de hamster (BHK, ATCC CCL 10); células de ovário de hamster chinês/-DHFR

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89/135 (CHO, Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 77:4216, 1980); células de sertoli de camundongo (TM4, Mather, Biol. Reprod., 23:243-251, 1980); células de rim de macaco (CV1 ATCC CCL 70); células de rim de macaco verde africano (VERO-76, ATCC CRL-1587); células de carcinoma cervical humano (HELA, ATCC CCL 2); células de rim canino (MDCK, ATCC CCL 34); células de fígado de rato búfalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); células de pulmão humano (W138, ATCC CCL 75); células de fígado humano (Hep G2, HB 8065); tumor mamário de camundongo (MMT 060562, ATCC CCL 51), células de TRI (Mather et al., Annals N. Y. Acad. Sci., 383:44-68, 1982); células MRC 5; células FS4; e uma linhagem de hepatoma humano (Hep G2).

[0221] As células hospedeiras são transformadas com os vetores de expressão ou de clonagem descritos acima para a produção de anticorpos anti-ErbB2 e cultivadas em meios nutrientes convencionais modificados conforme apropriado para a indução de promotores, seleção de transformantes ou amplificação dos genes que codifiquem as seqüências desejadas.

(viii) Cultura de células hospedeiras:

[0222] As células hospedeiras utilizadas para a produção do anticorpo anti-ErbB2 da presente invenção podem ser cultivadas em uma série de meios. Meios disponíveis comercialmente, tais como F10 da Ham (Sigma), Meio Essencial Mínimo (MEM, Sigma), RPMI-1640 (Sigma) e Meio Eagle Modificado da Dulbecco (DMEM, Sigma) são apropriados para o cultivo de células hospedeiras. Além disso, qualquer dos meios descritos em Ham et al., Meth. Enz., 58:44, 1979, Barnes et al., Anal. Biochem., 102:255, 1980, patentes US 4.767.704, 4.657.866, 4.927.762, 4.560.655 ou 5.122.469; WO 90/03430; WO 87/00195; ou patente RE US 30.985 pode ser utilizado como meio de cultivo para as células hospedeiras. Qualquer desses meios pode ser suplementado conforme o necessário com hormônios e/ou outros fatores de crescimento (tais como insulina, transferrina ou fator de crescimento

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90/135 epidérmico), sais (tais como cloreto de sódio, cálcio, magnésio e fosfato), tampões (tais como HEPES), nucleotídeos (tais como adenosina e timidina), antibióticos (tais como droga Gentamycin^®), elementos de traço (definidos como compostos inorgânicos normalmente presentes em concentrações finais na faixa micro-molar) e glicose ou fonte de energia equivalente. Quaisquer outros suplementos necessários podem também ser incluídos em concentrações apropriadas que seriam conhecidas dos técnicos no assunto. As condições da cultura, tais como temperatura, pH e similares, são as utilizadas anteriormente com a célula hospedeira selecionada para expressão e serão evidentes para os técnicos comuns no assunto.

(ix) Purificação do anticorpo anti-ErbB2:

[0223] Ao utilizarem-se técnicas recombinantes, o anticorpo pode ser produzido de forma intracelular, no espaço periplasmático, ou diretamente segregado para o meio. Caso o anticorpo seja produzido de forma intracelular, como primeira etapa, os fragmentos particulados, sejam eles células hospedeiras ou fragmentos lisados, são removidos, por exemplo, através de centrifugação ou ultra-filtragem. Carter et al., Bio/Technology, 10:163-167, 1992, descrevem um procedimento de isolamento de anticorpos que são segregados para o espaço periplasmático de E. coli. Resumidamente, a pasta celular é derretida na presença de acetato de sódio (pH 3,5), EDTA e sulfonil fluoreto de fenil metila (PMSF) por cerca de trinta minutos. Fragmentos celulares podem ser removidos através de centrifugação. Quando o anticorpo for segregado para o meio, os sobrenadantes desses sistemas de expressão são geralmente concentrados em primeiro lugar através da utilização de um filtro de concentração de proteína disponível comercialmente, tal como uma unidade de ultra-filtragem Amicon ou Pellicon Millipore. Pode-se incluir um inibidor de protease, tal como PMSF, em qualquer das etapas anteriores para inibir a proteólise e podem-se incluir antibióticos para evitar o crescimento de

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91/135 contaminantes imprevistos.

[0224] A composição de anticorpo preparada a partir das células pode ser purificada através da utilização, por exemplo, de cromatografia de hidroxilapatita, eletroforese de gel, diálise e cromatografia de afinidade, com a cromatografia de afinidade sendo a técnica de purificação preferida. A adequação da proteína A como ligante de afinidade depende da espécie e isotipo de qualquer domínio Fc de imunoglobulina que esteja presente no anticorpo. A proteína A pode ser utilizada para purificar anticorpos que se baseiem em cadeias pesadas γ1, γ2 ou γ4 humanas (Lindmark et al., J. Immunol. Meth., 62:1-13, 1983). Recomenda-se proteína G para todos os isotipos de camundongos e para γ3 humano (Guss et al., EMBO J., 5:15671575, 1986). A matriz à qual é ligada o ligante de afinidade é mais freqüentemente agarose, mas outras matrizes são disponíveis. Matrizes mecanicamente estáveis, tais como vidro de poros controlados ou poli(estirenodivinil)benzeno, permitem velocidades de fluxo maiores e tempos de processamento mais curtos que podem ser alcançados com agarose. Quando o anticorpo compreender um domínio CH3, a resina Bakerbond ABX^TM (J. T. Baker, Phillipsburg NJ, Estados Unidos) é útil para purificação. Outras técnicas de purificação de proteína, tais como fracionamento sobre coluna de intercâmbio de íons, precipitação de etanol, HPLC de fase reversa, cromatografia sobre sílica, cromatografia sobre heparina, cromatografia de Sepharose^TM sobre uma resina de intercâmbio de ânions ou cátions (tal como uma coluna de ácido poliaspártico), cromato-concentração, SDS-PAGE e precipitação de sulfato de amônio também são disponíveis, dependendo do anticorpo a ser recuperado.

[0225] Seguindo-se qual(is)quer etapa(s) de purificação preliminar(es), a mistura que compreende o anticorpo de interesse e contaminantes pode ser submetida à cromatografia de interação hidrófoba sob

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92/135 baixo pH, utilizando-se um tampão de eluição em pH de cerca de 2,5 a 4,5, preferencialmente realizada sob baixas concentrações de sal (por exemplo, cerca de 0 a 0,25 M de sal).

IV - Formulações Farmacêuticas [0226] Formulações terapêuticas dos anticorpos utilizados de acordo com a presente invenção são preparadas para armazenagem através de mistura de um anticorpo que possua o grau desejado de pureza com veículos, excipientes ou estabilizantes farmaceuticamente aceitáveis opcionais (Remington’s Pharmaceutical Sciences, 16^â edição, Osol, A. Ed., 1980), na forma de formulações liofilizadas ou soluções aquosas. Estabilizantes, excipientes ou veículos aceitáveis são atóxicos para os pacientes nas dosagens e concentrações empregadas e incluem tampões tais como fosfato, citrato e outros ácidos orgânicos; antioxidantes, que incluem ácido ascórbico e metionina; conservantes (tais como cloreto de octadecil metil benzil amônio; cloreto de hexametônio; cloreto de benzalcônio; cloreto de benzetônio; álcool fenólico, butílico ou benzílico; alquil parabenos, tais como metil ou propil parabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol e m-cresol); polipeptídeos de baixo peso molecular (menos de cerca de dez resíduos); proteínas, tais como albumina de soro, gelatina ou imunoglobulinas; polímeros hidrofílicos, tais como polivinilpirrolidona; aminoácidos tais como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina ou lisina; monossacarídeos, dissacarídeos e outros carboidratos que incluem glicose, manose ou dextrinas; agentes quelantes, tais como EDTA; açúcares tais como sacarose, manitol, trealose ou sorbitol; contra-íons formadores de sal, tais como sódio; complexos metálicos (por exemplo, complexos de Zn-proteína); e/ou tensoativos não iônicos tais como Tween®, Pluronics^TM ou polietileno glicol (PEG). Formulações de anticorpos anti-ErbB2 liofilizados preferidas são descritas em WO 97/04801, expressamente incorporada ao presente como referência.

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93/135 [0227] A formulação do presente pode também conter mais de um composto ativo, conforme o necessário para a indicação específica sendo tratada, preferencialmente os que tenham atividades complementares que não se prejudiquem entre si. Pode ser desejável, por exemplo, proporcionar anticorpos que se liguem a EGFR, ErbB2 (por exemplo, um anticorpo que se liga a um epítopo diferente sobre ErbB2), ErbB3, ErbB4 ou fator endotelial vascular (VEGF) em uma formulação única. Alternativa ou adicionalmente, a composição pode compreender adicionalmente um agente quimioterapêutico, agente citotóxico, citocina, agente inibidor do crescimento, agente antihormonal, droga destinada a EGFR, agente anti-angiogênico e/ou cardioprotetor. Essas moléculas são adequadamente presentes em combinação, em quantidades que sejam eficazes para o propósito desejado.

[0228] Os ingredientes ativos também podem ser aprisionados em microcápsulas preparadas, por exemplo, através de técnicas de acumulação ou polimerização interfacial, tais como hidroximetilcelulose ou microcápsulas de gelatina e microcápsulas de poli(metilmetacrilato), respectivamente, em sistemas de fornecimento de drogas coloidais (por exemplo, lipossomas, microesferas de albumina, microemulsões, nanopartículas e nanocápsulas) ou em macroemulsões. Essas técnicas são descritas em Remington’s Pharmaceutical Sciences, 16^â edição, Osol, A. Ed., 1980.

[0229] Podem ser fabricadas preparações de liberação prolongada. Exemplos apropriados de preparações de liberação prolongada incluem matrizes semi-permeáveis de polímeros hidrófobos sólidos que contenham o anticorpo, com essas matrizes estando na forma de artigos moldados, tais como filmes ou microcápsulas. Exemplos de matrizes de liberação prolongada incluem poliésteres, hidrogéis (tais como metacrilato de poli(2-hidroxietila) ou álcool poli(vinílico)), polilactidas (patente US 3.773.919), copolímeros de ácido L-glutâmico e L-glutamato de γ etila, acetato etileno-vinil

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94/135 não degradável, copolímeros de ácido glicólico-ácido láctico degradáveis, tais como Depot^TM da Lupron (microesferas injetáveis compostas de copolímero de ácido láctico-ácido glicólico e acetato de leuprolida) e ácido poli-D-(-)-3-hidroxi butírico.

[0230] As formulações a serem utilizadas para administração in vivo devem ser estéreis. Isso é facilmente conseguido por filtragem através de membranas de filtragem estéreis.

V - Tratamento com os Anticorpos Anti-ErbB2 [0231] Contempla-se que, de acordo com a presente invenção, os anticorpos anti-ErbB2 podem ser utilizados para o tratamento de diversas doenças ou disfunções. Exemplos de condições ou disfunções incluem tumores benignos ou malignos; leucemias e malignidades linfóides; outras disfunções, tais como disfunções neurais, gliais, astrocitais, hipotalâmicos, glandulares, macrofagais, epiteliais, estromais, blastocoélicas, inflamatórias, angiogênicas e imunológicas.

[0232] Geralmente, a doença ou disfunção a ser tratada é câncer. Exemplos de câncer a serem tratados no presente incluem, mas sem limitar-se a carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma e leucemia ou malignidades linfóides. Exemplos mais específicos desses cânceres incluem câncer celular escamoso (por exemplo, câncer celular escamoso epitelial), câncer pulmonar, incluindo câncer pulmonar de células pequenas, câncer pulmonar de células nãopequenas, adenocarcinoma pulmonar e carcinoma escamoso pulmonar, câncer do peritônio, câncer hepatocelular, câncer do estômago ou gástrico, incluindo câncer gastrintestinal, câncer pancreático, glioblastoma, câncer cervical, câncer do ovário, câncer do fígado, câncer da bexiga, hepatoma, câncer de mama, câncer do cólon, câncer retal, câncer colo-retal, carcinoma endometrial ou uterino, carcinoma das glândulas salivares, câncer renal, câncer da próstata, câncer da vulva, câncer da tiróide, carcinoma hepático, carcinoma anal e

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95/135 carcinoma peniano, bem como câncer do cérebro e garganta.

[0233] O câncer compreenderá geralmente células de expressão de ErbB2, de tal forma que o anticorpo anti-ErbB2 do presente seja capaz de ligar-se ao câncer. Embora o câncer possa ser caracterizado pela sobreexpressão do receptor de ErbB2, o presente pedido proporciona adicionalmente um método de tratamento de câncer que não é considerado câncer de sobre-expressão de ErbB2. Para determinar a expressão de ErbB2 no câncer, são disponíveis diversos ensaios de diagnóstico/prognóstico. Em uma realização, a sobre-expressão de ErbB2 pode ser analisada através de IHC, utilizando-se, por exemplo, o Herceptest® (Dako). Seções de tecido embebidas em parafina de uma biópsia tumoral podem ser submetidas ao ensaio de IHC e foi estabelecido um critério de intensidade de manchas de proteína ErbB2, conforme segue:

Nota 0: não se observam manchas ou observa-se mancha da membrana em menos de 10% das células tumorais.

Nota 1+: é detectada mancha da membrana fraca/mal perceptível em mais de 10% das células tumorais. As células somente são manchadas em parte da sua membrana.

Nota 2+: observam-se manchas da membrana completas de fracas a moderadas em mais de 10% das células tumorais.

Nota 3+: observam-se manchas da membrana completas de moderadas a fortes em mais de 10% das células tumorais.

[0234] Os tumores com notas 0 ou 1+ para a determinação da sobre-expressão de ErbB2 podem ser caracterizados como não sobreexpressando ErbB2, enquanto os tumores com notas 2+ ou 3+ podem ser caracterizados como sobre-expressando ErbB2.

[0235] Alternativa ou adicionalmente, ensaios de FISH tais como o Inform^TM (vendido pela Ventana, Arizona, Estados Unidos) ou Pathvision^TM

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96/135 (Vysis, Illinois, Estados Unidos) podem ser conduzidos sobre o tecido tumoral fixado por formalina e embebido em parafina, para determinar a extensão (se houver) da sobre-expressão de ErbB2 no tumor.

[0236] Em uma realização, o câncer será um que sobre-expresse (e possa sobre-expressar) EGFR. Exemplos de cânceres que podem expressar/sobre-expressar EGFR incluem câncer celular escamoso (por exemplo, câncer celular escamoso epitelial), câncer pulmonar que inclui câncer pulmonar de células pequenas, câncer pulmonar de células não-pequenas, adenocarcinoma pulmonar e carcinoma escamoso pulmonar, câncer do peritônio, câncer hepatocelular, câncer gástrico ou do estômago que inclui câncer gastrintestinal, câncer pancreático, glioblastoma, câncer cervical, câncer do ovário, câncer do fígado, câncer da bexiga, hepatoma, câncer de mama, câncer do cólon, câncer retal, câncer colo-retal, carcinoma endometrial ou uterino, carcinoma das glândulas salivares, câncer renal, câncer da próstata, câncer da vulva, câncer da tiróide, carcinoma hepático, carcinoma anal e carcinoma peniano, bem como câncer do cérebro e da garganta.

[0237] O câncer a ser tratado no presente pode ser caracterizado pelo excesso de ativação de um receptor de ErbB, tal como EGFR. Esse excesso de ativação pode ser atribuído à sobre-expressão ou maior produção do receptor de ErbB ou um ligante de ErbB. Em uma realização da presente invenção, será realizado um ensaio de diagnóstico ou prognóstico para determinar se o câncer do paciente é caracterizado pelo excesso da ativação de um receptor de ErbB. Pode ser determinada a amplificação do gene ErbB e/ou sobre-expressão de um receptor de ErbB no câncer. Diversos ensaios de determinação dessa amplificação/sobre-expressão são disponíveis na técnica e incluem o IHC, FISH e ensaios de antígeno derramado descritos acima. Alternativa ou adicionalmente, níveis de um ligante de ErbB, tais como TGF-α, no tumor ou a ele associados, podem ser determinados de acordo com

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97/135 procedimentos conhecidos. Esses ensaios podem detectar proteína e/ou ácido nucléico que o codifica na amostra a ser testada. Em uma realização, os níveis de ligante ErbB no tumor podem ser determinados através da utilização de imunohistoquímica (IHC); vide, por exemplo, Scher et al., Clin. Cancer Research, 1:545-550, 1995. Alternativa ou adicionalmente, pode-se avaliar níveis de ácido nucléico codificador de ligante ErbB na amostra a ser testada; por exemplo, através de FISH, Southern Blot ou técnicas de PCR.

[0238] Além disso, a amplificação ou sobre-expressão de ligante ErbB ou receptor de ErbB pode ser avaliada através da utilização de um ensaio diagnóstico in vivo, através, por exemplo, da administração de uma molécula (tal como um anticorpo) que liga a molécula a ser detectada e é marcada com um marcador detectável (por exemplo, um isótopo radioativo) e através da varredura externamente do paciente para localização do marcador.

[0239] Quando o câncer a ser tratado for um câncer independente de hormônio, a expressão do hormônio (por exemplo, androgênio) e/ou seu receptor cognato no tumor pode ser determinado através da utilização de qualquer dos diversos ensaios disponíveis, por exemplo, conforme descrito acima. Alternativa ou adicionalmente, o paciente pode ser diagnosticado como portador de câncer independente de hormônio por não reagir mais à terapia de anti-androgênios.

[0240] Em certas realizações, um imunoconjugado que compreende o anticorpo anti-ErbB2 conjugado com um agente citotóxico é administrado ao paciente. Preferencialmente, o imunoconjugado e/ou proteína de ErbB2 ao qual é ligado é (são) internalizado(s) pela célula, resultando em maior eficácia terapêutica do imunoconjugado na morte da célula cancerosa à qual se liga. Em realização preferida, o agente citotóxico objetiva ou interfere no ácido nucléico na célula cancerosa. Exemplos desses agentes citotóxicos incluem maitansinóides, caliqueamicinas, ribonucleases e endonucleases de

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DNA.

[0241] Os anticorpos anti-ErbB2 ou imunoconjugados são administrados a um paciente humano de acordo com métodos conhecidos, tais como administração intravenosa, por exemplo, na forma de bolus ou através de infusão contínua ao longo de um período de tempo, através de vias intramusculares, intraperitoneais, intracerebrospinhal, subcutâneas, intraarticulares, intrasinovial, intratecal, orais, tópicos ou inalações. Prefere-se administração intravenosa ou subcutânea do anticorpo.

[0242] Outros regimes terapêuticos podem ser combinados com a administração do anticorpo anti-ErbB2. A administração combinada inclui a coadministração, através da utilização de formulações separadas ou uma formulação farmacêutica única e administração consecutiva em qualquer ordem, em que existe preferencialmente um período de tempo em que ambos (ou todos) os agentes ativos exercem simultaneamente suas atividades biológicas.

[0243] Em realização preferida, o paciente é tratado com dois anticorpos anti-ErbB2 diferentes. O paciente pode ser tratado, por exemplo, com um primeiro anticorpo anti-ErbB2 que bloqueia a ativação de ligantes de um receptor de ErbB ou um anticorpo que possui característica biológica de anticorpo monoclonal 2C4, bem como um segundo anticorpo anti-ErbB2 que seja inibidor do crescimento (por exemplo, Herceptin®) ou um anticorpo antiErbB2 que induz a apoptose de uma célula de sobre-expressão de ErbB2 (por exemplo, 7C2, 7F3 ou suas variantes humanizadas). Preferencialmente, essa terapia combinada resulta em efeito terapêutico sinérgico. Pode-se, por exemplo, tratar o paciente com Herceptin^® e, em seguida, tratá-lo com rhuMAb 2C4, por exemplo, quando o paciente não reagir à terapia com Herceptin®. Em outra realização, o paciente pode ser tratado primeiramente com rhuMAb 2C4 e receber em seguida terapia com Herceptin®. Em ainda uma realização

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99/135 adicional, o paciente pode ser tratado com ambos, rhuMAb 2C4 e Herceptin®, simultaneamente.

[0244] Pode também ser desejável combinar a administração do(s) anticorpo(s) anti-ErbB2 com a administração de um anticorpo dirigido ao antígeno associado a tumores. Neste caso, o outro anticorpo pode, por exemplo, ligar-se a EGFR, ErbB3, ErbB4 ou fator de crescimento endotelial vascular (VEGF).

[0245] Em uma realização, o tratamento da presente invenção envolve a administração combinada de um ou mais anticorpos anti-ErbB2 e um ou mais agentes quimioterapêuticos ou agentes inibidores do crescimento, que incluem a co-administração de misturas de diferentes agentes quimioterapêuticos. Os agentes quimioterapêuticos preferidos incluem taxanos (tais como paclitaxel e docetaxel) e/ou antibióticos de antraciclina. A preparação e programas de dosagem para esses agentes quimioterapêuticos podem ser utilizados de acordo com as instruções dos fabricantes ou conforme determinado empiricamente pelo técnico no assunto. A preparação e programas de dosagem para essa quimioterapia também são descritos em Chemotherapy Service, Ed., M. C. Perry, Williams & Wilkins, Baltimore MD, Estados Unidos, 1992.

[0246] O anticorpo pode ser combinado com um composto antihormonal; por exemplo, um composto anti-estrogênio tal como tamoxifeno; um anti-progesterona, tal como onapristona (vide EP 616.812) ou um antiandrogênio, tal como flutamida, em dosagens conhecidas para essas moléculas. Quando o câncer a ser tratado for um câncer independente de hormônios, o paciente pode haver sido submetido anteriormente à terapia antihormonal e, após o câncer tornar-se independente de hormônios, o anticorpo anti-ErbB2 (e, opcionalmente, outros agentes descritos no presente) pode ser administrado ao paciente.

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100/135 [0247] Algumas vezes, pode também ser benéfico co-administrar um cardioprotetor (para evitar ou reduzir disfunções do miocárdio associadas com a terapia) ou uma ou mais citocinas ao paciente. Pode-se também coadministrar uma droga destinada a EGFR ou um agente anti-angiogênico. Além dos regimes terapêuticos acima, o paciente pode ser submetido à remoção cirúrgica de células cancerosas e/ou terapia de radiação.

[0248] Os anticorpos anti-ErbB2 do presente podem também ser combinados com uma droga destinada a EGFR, tal como as discutidas acima na seção de definições, resultando em efeito terapêutico complementar e potencialmente sinérgico.

[0249] Dosagens apropriadas para qualquer dos agentes coadministrados acima são as utilizadas no presente e podem ser reduzidas devido à ação combinada (sinergia) do agente e anticorpo anti-ErbB2.

[0250] Para a prevenção ou tratamento da doença, a dosagem apropriada de anticorpo dependerá do tipo de doença a ser tratada, conforme definido acima, a severidade e andamento da doença, se o anticorpo for administrado para fins preventivos ou terapêuticos, terapia anterior, histórico clínico do paciente e resposta ao anticorpo, e critério do médico atendente. O anticorpo é apropriadamente administrado ao paciente por uma vez ou ao longo de uma série de tratamentos. Dependendo do tipo e da severidade da doença, cerca de 1 pg/kg a 15 mg/kg (por exemplo, 0,1 a 20 mg/kg) de anticorpo é uma dosagem inicial possível para administração ao paciente se através, por exemplo de uma ou mais administrações separadas, ou através de infusão contínua. A dosagem diária típica pode variar de cerca de 1 pg/kg a 100 mg/kg ou mais, dependendo dos fatores mencionados acima. Para administrações repetidas ao longo de vários dias ou mais, dependendo da condição, o tratamento é mantido até que ocorra supressão desejada dos sintomas da doença. A dosagem preferida do anticorpo estará na faixa de

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101/135 cerca de 0,05 mg/kg a cerca de 10 mg/kg. Assim, uma ou mais dosagens de cerca de 0,5 mg/kg, 2,0 mg/kg, 4,0 mg/kg ou 10 mg/kg (ou qualquer de suas combinações) podem ser administradas ao paciente. Essas doses podem ser administradas intermitentemente, por exemplo a cada semana ou a cada três semanas (de forma, por exemplo, que o paciente receba de cerca de duas a cerca de vinte, por exemplo, cerca de seis doses do anticorpo anti-ErbB2). Pode-se administrar uma dosagem de carga mais alta inicial, seguida por uma ou mais doses menores. Um exemplo de regime de dosagem compreende a administração de uma dosagem de carga inicial de cerca de 4 mg/kg, seguida por dose de manutenção semanal de cerca de 2 mg/kg do anticorpo antiErbB2. Entretanto, outros regimes de dosagem podem ser úteis. O andamento dessa terapia é facilmente monitorado através de técnicas e ensaios convencionais.

[0251] Além da administração da proteína de anticorpo ao paciente, o presente pedido contempla a administração do anticorpo através da terapia genética. Essa administração de ácido nucléico que codifica o anticorpo é englobada pela expressão “administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo”. Vide, por exemplo, WO 96/07321, publicada em 14 de março de 1996, referente à utilização de terapia genética para gerar anticorpos intracelulares.

[0252] Existem duas abordagens principais para a obtenção do ácido nucléico (opcionalmente contido em um vetor) nas células do paciente; in vivo e ex vivo. Para fornecimento in vivo, o ácido nucléico é injetado diretamente no paciente, normalmente no sítio em que é necessário o anticorpo. Para tratamento ex vivo, as células do paciente são removidas, o ácido nucléico é introduzido nessas células isoladas e as células modificadas são administradas ao paciente, seja diretamente ou, por exemplo, encapsuladas em membranas porosas que são implantadas no paciente (vide,

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102/135 por exemplo, patentes US 4.892.538 e 5.283.187). Existe uma série de técnicas disponíveis para a introdução de ácidos nucléicos em células viáveis. As técnicas variam, dependendo se o ácido nucléico é transferido para células cultivadas in vitro ou in vivo nas células do hospedeiro pretendido. As técnicas apropriadas para a transferência de ácido nucléico para células de mamíferos in vitro incluem a utilização de lipossomas, eletroporação, micro-injeção, fusão celular, DEAE-dextran, método de precipitação de fosfato de cálcio, etc. Um vetor comumente usado para o fornecimento ex vivo do gene é um retrovírus.

[0253] As técnicas de transferência de ácido nucléico in vivo atualmente preferidas incluem transfecção com vetores virais (tais como adenovírus, vírus simplex I do herpes ou vírus adeno-associado) e sistemas com base em lipídios (lipídios úteis para a transferência mediada por lipídios do gene são DOTMA, DOPE e DC-Chol, por exemplo). Em algumas situações, é desejável fornecer à fonte de ácido nucléico um agente que se destine às células desejadas, tais como um anticorpo específico para uma proteína da membrana da superfície celular ou a célula desejada, um ligante para um receptor sobre a célula desejada, etc. Ao empregar-se lipossomas, proteínas que se ligam a uma proteína de membrana da superfície celular com endocitose podem ser utilizadas para objetivar e/ou facilitar a retirada, por exemplo, de proteínas de capsídeo ou seus fragmentos trópicos para um tipo de célula específico, anticorpos para proteínas que sofrem internalização em ciclização e proteínas que objetivem a localização intracelular e aumentem a meia vida intracelular. A técnica de endocitose mediada por receptor é descrita, por exemplo, por Wu et al., J. Biol. Chem., 262:4429-4432, 1987; e Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 87:3410-3414, 1990. Para análise da marcação genética atualmente conhecida e protocolos de terapia genética, vide Anderson et al., Science, 256:808-813, 1992. Vide também WO 93/25673 e as referências mencionadas no presente.

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VI - Artigos Industrializados [0254] Em outra realização da presente invenção, é fornecido um artigo industrializado contendo materiais úteis para o tratamento das disfunções descritas acima. O artigo industrializado compreende um recipiente e uma etiqueta ou uma bula sobre o recipiente ou com ele associado. Os recipientes apropriados incluem, por exemplo, garrafas, frascos, seringas, etc. Os recipientes podem ser formados a partir de uma série de materiais, tais como vidro ou plástico. O recipiente contém uma composição que seja eficaz para o tratamento da condição e pode conter uma porta de acesso estéril (o recipiente pode ser, por exemplo, uma bolsa de solução intravenosa ou um frasco que possui vedação que pode ser furada por uma agulha de injeção hipodérmica). Pelo menos um agente ativo da composição é um anticorpo anti-ErbB2. O etiqueta ou bula indica que a composição é utilizada para o tratamento da condição selecionada, tal como câncer. Em uma realização, a etiqueta ou bula indica que a composição que compreende o anticorpo que se liga ao ErbB2 pode ser utilizada para o tratamento de câncer que expressa um receptor de ErbB selecionado a partir do grupo que consiste do receptor de fator de crescimento epidérmico (EGFR), ErbB3 e ErbB4, preferencialmente EGFR. Além disso, a etiqueta ou bula pode indicar que o paciente a ser tratado é um que tenha câncer caracterizado pelo excesso de ativação de um receptor de ErbB selecionado a partir de EGFR, ErbB3 ou ErbB4. O câncer pode ser, por exemplo, um que sobre-expresse um desses receptores e/ou que sobreexpresse um ligante de ErbB (tal como TGF-α). A etiqueta ou bula pode também indicar que a composição pode ser utilizada para o tratamento de câncer, em que o câncer não é caracterizado pela sobre-expressão do receptor de ErbB2. Embora a bula do presente para Herceptin^® indique que o anticorpo é utilizado para o tratamento de pacientes com câncer de mama metastático cujos tumores sobre-expressem a proteína ErbB2, por exemplo, a bula do

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104/135 presente pode indicar que o anticorpo ou composição é utilizado para o tratamento de câncer, independentemente da extensão da sobre-expressão de ErbB2. Em outras realizações, a bula pode indicar que o anticorpo ou composição pode ser utilizado para o tratamento de câncer de mama (por exemplo, câncer de mama metastático); câncer independente de hormônios; câncer da próstata (por exemplo, câncer da próstata independente de androgênios); câncer pulmonar (por exemplo, câncer pulmonar de células não-pequenas); câncer do cólon, reto ou colo-retal; ou qualquer das outras doenças ou disfunções descritas no presente. Além disso, o artigo industrializado pode compreender (a) um primeiro recipiente com uma composição nele contida, em que a composição compreende um primeiro anticorpo que liga ErbB2 e inibe o crescimento de células cancerosas que sobre-expressem ErbB2; e (b) um segundo recipiente com uma composição nele contida, em que a composição compreende um segundo anticorpo que liga ErbB2 e bloqueia a ativação de ligante de um receptor de ErbB. O artigo industrializado nesta realização da presente invenção pode compreender adicionalmente uma bula que indique que as primeiras e segundas composições de anticorpos podem ser utilizadas para o tratamento de câncer. Além disso, a bula pode instruir o usuário da composição (que compreende um anticorpo que liga ErbB2 e bloqueia a ativação de ligante de um receptor de ErbB) a combinar a terapia com o anticorpo e qualquer das terapias adjuntas descritas no capítulo precedente (por exemplo, um agente quimioterapêutico, uma droga dirigida a EGFR, um agente anti-angiogênico, um composto anti-hormonal, um cardioprotetor e/ou uma citocina). Alternativa ou adicionalmente, o artigo industrializado pode compreender adicionalmente um segundo (ou terceiro) recipiente que compreende um tampão farmaceuticamente aceitável, tal como água bacteriostática para injeção (BWFI), solução salina tamponada com fosfato, solução de Ringer e solução

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105/135 de dextrose. Ela pode incluir adicionalmente outros materiais desejáveis do ponto de vista comercial e do usuário, incluindo outros tampões, diluentes, filtros, agulhas e seringas.

VII - Usos Não Terapêuticos para o Anticorpo Anti-ErbB2 [0255] Os anticorpos (por exemplo, os anticorpos anti-ErbB2 humanizados) da presente invenção apresentam aplicações não terapêuticas adicionais.

[0256] Os anticorpos podem ser utilizados, por exemplo, como agentes de purificação de afinidade. Neste processo, os anticorpos são imobilizados sobre uma fase sólida, tal como resina Sephadex ou papel filtro, através da utilização de métodos bem conhecidos na técnica. O anticorpo imobilizado é colocado em contato com uma amostra que contenha a proteína ErbB2 a ser purificada (ou seu fragmento) e, em seguida, o suporte é lavado com um solvente apropriado que removerá substancialmente todo o material da amostra, com exceção da proteína ErbB2, que é unida ao anticorpo imobilizado. Por fim, o suporte é lavado com outro solvente apropriado, tal como tampão de glicina, pH 5,0, que liberará a proteína ErbB2 do anticorpo.

[0257] Os anticorpos anti-ErbB2 também podem ser úteis em ensaios de diagnóstico para proteína ErbB2, detectando, por exemplo, sua expressão em células específicas, tecidos ou soro.

[0258] Para aplicações de diagnóstico, o anticorpo será tipicamente marcado com uma porção detectável. São disponíveis diversos marcadores que podem ser agrupados de forma geral nas categorias a seguir:

(a) Radioisótopos, tais como ³⁵S, ¹⁴C, ¹²⁵I, ³H e ¹³¹I. O anticorpo pode ser marcado com o radioisótopo, através da utilização das técnicas descritas em Current Protocols in Immunology, volumes 1 e 2, Coligen et al, Ed. Wiley-Interscience, Nova Iorque NY, Estados Unidos, pubs., 1991, por exemplo, e a radioatividade pode ser medida através da utilização de contagem

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106/135 de cintilação.

(b) Marcadores fluorescentes tais como quelatos terrosos raros (quelatos de európio) ou fluoresceína e seus derivados, rodamina e seus derivados, dansila, lissamina, ficoeritrina e vermelho do Texas são disponíveis. Os marcadores fluorescentes podem ser conjugados ao anticorpo, através da utilização das técnicas descritas em Current Protocols in Immunology, acima, por exemplo. Pode-se quantificar a fluorescência através da utilização de um fluorímetro.

(c) Diversos marcadores de substratos de enzima são disponíveis e a patente US 4.275.149 proporciona uma análise de alguns deles. A enzima geralmente catalisa uma alteração química do substrato cromogênico que pode ser medida através da utilização de diversas técnicas. A enzima pode, por exemplo, catalisar uma mudança de cor em um substrato, que pode ser medida espectrofotometricamente. Alternativamente, a enzima pode alterar a fluorescência ou quimiluminescência do substrato. As técnicas de quantificação de uma mudança da fluorescência são descritas acima. O substrato quimiluminescente torna-se eletronicamente excitado por uma reação química e pode então emitir luz que pode ser medida (utilizando-se um quimiluminômetro, por exemplo) ou doa energia a um aceitador fluorescente. Exemplos de marcadores enzimáticos incluem luciferases (por exemplo, luciferase de vaga-lume e luciferase bacteriana; patente US 4.737.456), luciferina, 2,3-diidroftalazinadionas, malato desidrogenase, urease, peroxidase tal como peroxidase de rabanete selvagem (HRPO), fosfatase alcalina, βgalactosidase, glicoamilase, lisozima, oxidases de sacarídeo (por exemplo, oxidase de glicose, oxidase de galactose e desidrogenase 6-fosfato de glicose), oxidases heterocíclicas (tais como uricase e oxidase de xantina), lactoperoxidase, microperoxidase e similares. Técnicas de conjugação de enzimas em anticorpos são descritas em O'Sullivan et al., Methods for the

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Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay, em Methods in Enzym., (ed. J. Langone e H. van Vunakis), Academic Press, Nova Iorque, Estados Unidos, 73:147-166, 1981.

[0259] Exemplos de combinações de enzima e substrato incluem, por exemplo:

(i) peroxidase de rabanete selvagem (HRPO) com peroxidase de hidrogênio como substrato, em que a peroxidase de hidrogênio oxida um precursor de tingimento (por exemplo, orto-fenileno diamina (OPD) ou cloridrato de 3,3’,5,5’-tetrametil benzidina (TMB));

(ii) fosfatase alcalina (AP) com fosfato de para-nitrofenil como substrato cromogênico; e (iii) β-D-galactosidase (β-D-Gal) com um substrato cromogênico (por exemplo, β-D-galactosidase de p-nitrofenil) ou substrato fluorogênico β-Dgalactosidase de 4-metilumbeliferil.

[0260] Diversas outras combinações de enzima e substrato são disponíveis para os técnicos no assunto. Para uma análise geral destas, vide as patentes US 4.275.149 e 4.318.980.

[0261] Algumas vezes, o rótulo é conjugado indiretamente com o anticorpo. Os técnicos no assunto terão conhecimento de diversas técnicas de atingir isso. O anticorpo pode ser conjugado, por exemplo, com biotina e qualquer das três categorias amplas de marcadores mencionados acima, pode ser conjugado com avidina ou vice-versa. Biotina liga-se seletivamente a avidina e, portanto, o marcador pode ser conjugado com o anticorpo desta maneira indireta. Alternativamente, para atingir a conjugação indireta do rótulo com o anticorpo, o anticorpo é conjugado com um hapteno pequeno (por exemplo, digoxina) e um dos tipos diferentes de rótulos mencionados acima é conjugado com um anticorpo anti-hapteno (por exemplo, anticorpo antidigoxina). Assim, pode-se atingir a conjugação indireta do rótulo com o

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108/135 anticorpo.

[0262] Em outra realização da presente invenção, o anticorpo antiErbB2 não necessita ser marcado e a sua presença pode ser detectada através da utilização de um anticorpo marcado que se liga ao anticorpo ErbB2.

[0263] Os anticorpos da presente invenção podem ser empregados em qualquer método de ensaio conhecido, tal como ensaios de união competitiva, ensaios de sanduíche direto e indireto e ensaios de imunoprecipitação. Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, págs. 147-158 (CRC Press, Inc. 1987).

[0264] Para imunohistoquímica, a amostra de tumor pode ser nova ou congelada, ou pode ser embebida em parafina e fixada com um conservante, tal como formalina, por exemplo.

[0265]Os anticorpos podem também ser utilizados para ensaios de diagnóstico in vivo. Geralmente, o anticorpo é rotulado com um radionucleotídeo (tal como ¹¹¹In, ⁹⁹Tc, ¹⁴C, ¹³¹I, ¹²⁵I, ³H, ³²P ou ³⁵S), de forma que o tumor possa ser localizado através da utilização de imunocintilografia. Por questão de conveniência, os anticorpos da presente invenção podem ser fornecidos em um kit, ou seja, uma combinação embalada de reagentes em quantidades previamente determinadas, com instruções para a realização do ensaio de diagnóstico. Quando o anticorpo for marcado com uma enzima, o kit incluirá substratos e co-fatores exigidos pela enzima (por exemplo, um precursor de substrato que proporciona o cromóforo ou fluóforo detectável). Além disso, podem-se incluir outros aditivos, tais como estabilizantes, tampões (por exemplo, um tampão de bloqueio ou tampão de lise) e similares. As quantidades relativas dos diversos reagentes podem ser amplamente variadas para proporcionar concentrações em solução dos reagentes que otimizam substancialmente a sensibilidade do ensaio. Particularmente, os reagentes podem ser fornecidos na forma de pós secos,

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109/135 normalmente liofilizados, que incluem excipientes que, mediante dissolução, proporcionarão uma solução de reagente que contém a concentração apropriada.

VIII - Depósito de Materiais [0266] As linhagens celulares de hibridoma a seguir foram depositadas na Coleção Norte-Americana de Tipos de Culturas, 10801 University Boulevard, Manassas VA 20110-2209, Estados Unidos (ATCC):

Designação do anticorpo	ATCC no	Data de depósito
7C2	ATCC HB-12215	17 de outubro de 1996
7F3	ATCC HB-12216	17 de outubro de 1996
4D5	ATCC CRL 10463	24 de maio de 1990
2C4	ATCC HB-12697	8 de abril de 1999

[0267] Detalhes adicionais da presente invenção são ilustrados pelos Exemplos não limitativos a seguir. As revelações de todas as citações no relatório descritivo são incorporadas expressamente ao presente como referência.

Exemplo 1

Produção e Caracterização do Anticorpo Monoclonal 2C4 [0268] Os anticorpos monoclonais de murinos 2C4, 7F3 e 4D5, que ligam especificamente o domínio extracelular de ErbB2, foram produzidos conforme descrito em Fendly et al., Cancer Research, 50:1550-1558, 1990. Resumidamente, células NIH 3T3/HER2-3400 (que expressam cerca de 1 x 10⁵ moléculas de ErbB2/célula) produzidas conforme descrito em Hudziak et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 84:7158-7163, 1987, foram colhidas com solução salina tamponada com fosfato (PBS) contendo 25 mM de EDTA e utilizadas para imunizar camundongos BALB/c. Os camundongos receberam injeções intraperitoneais de 10⁷ células em 0,5 ml de PBS nas semanas 0, 2, 5 e 7. Os camundongos com anti-soros que imunoprecipitaram ErbB2 marcados por ³²P

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110/135 receberam injeções intraperitoneais de um extrato de membrana de ErbB2 purificado com sefarose-aglutinina de gérmen de trigo (WGA) nas semanas 9 e

13. Isso foi seguido por uma injeção intravenosa de 0,1 ml da preparação de ErbB2 e os esplenócitos foram fundidos com linhagem de mieloma de camundongo X63-Ag8,653.

[0269] Os sobrenadantes de hibridoma foram selecionados por ligação de ErbB2 através de ELISA e radioimunoprecipitação.

[0270] Os epítopos de ErbB2 ligados por anticorpos monoclonais 4D5, 7F3 e 2C4 foram determinados através de análise de união competitiva (Fendly et al., Cancer Research, 50:1550-1558, 1990). Estudos de bloqueio cruzado foram realizados sobre anticorpos através de fluorescência direta sobre células intactas, utilizando-se a Máquina de Seleção Pandex^TM para quantificar a fluorescência. Cada anticorpo monoclonal foi conjugado com isotiocianato de fluoresceína (FITC), através da utilização de procedimentos estabelecidos (Wofsy et al., Selected Methods in Cellular Immunology, pág. 287, Mishel e Schiigi (eds.), San Francisco, Estados Unidos, W. J. Freeman Co., 1980). Monocamadas confluentes de células NIH 3T3/HER 2-3400 foram colocadas em tripsina, lavadas por uma vez e re-suspensas a 1,75 x 10⁶ células/ml em PBS frio contendo albumina de soro bovino a 0,5% (BSA) e NaN3 a 0,1%. Adicionou-se concentração final de partículas de látex a 1% (IDC, Portland OR, Estados Unidos) para reduzir a obstrução das membranas de placas Pandex^TM Das células em suspensão, 20 pl, e 20 pl de anticorpos monoclonais purificados (100 pg/ml a 0,1 pg/ml) foram adicionados às cavidades da placa Pandex^TM e incubados sobre gelo por trinta minutos. Uma diluição previamente determinada de anticorpos monoclonais marcados por FITC em 20 pl foi adicionada a cada cavidade, incubada por trinta minutos, lavada e a fluorescência foi quantificada através do Pandex^TM. Considerou-se que os anticorpos monoclonais compartilhariam um epítopo se cada um

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111/135 bloqueasse o outro em 50% ou mais em comparação com um controle de anticorpo monoclonal irrelevante. Neste experimento, os anticorpos monoclonais 4D5, 7F3 e 2C4 receberam os epítopos I, G/F e F, respectivamente.

[0271] As características de inibição do crescimento de anticorpos monoclonais 2C4, 7F3 e 4D5 foram avaliadas através da utilização da linhagem de células tumorais da mama, SK-BR-3 (vide Hudziak et al., Molec. Cell. Biol., 9(3):1165-1172, 1989). Resumidamente, as células SK-BR-3 foram separadas através da utilização de tripsina a 0,25% (vol/vol) e suspensas em meio completo sob densidade de 4 x 10⁵ células por ml. Parcelas de 100 gl (4 x 104 células) foram colocadas em placas de micro-diluição de 96 cavidades, as células foram mantidas em aderência e 100 gl de meios isolados ou meios contendo anticorpos monoclonais (concentração final de 5 gg/ml) foram então adicionados. Após 72 horas, as placas foram lavadas por duas vezes com PBS (pH 7,5), manchadas com violeta de cristal (0,5% em metanol) e analisadas para determinação da proliferação celular relativa, conforme descrito em Sugarman et al., Science, 230:943-945, 1985. Os anticorpos monoclonais 2C4 e 7F3 inibiram a proliferação celular relativa de SK-BR-3 em cerca de 20% e cerca de 38%, respectivamente, em comparação com a inibição de cerca de 56% atingida com o anticorpo monoclonal 4D5.

[0272] Os anticorpos monoclonais 2C4, 4D5 e 7F3 tiveram avaliada sua capacidade de inibição de proteínas de fosforilação de tirosina estimulada por HRG na faixa Mr de 180.000 a partir de lisados de células inteiras de células MCF7 (Lewis et al., Cancer Research, 56:1457-1465, 1996). Relata-se que as células MCF7 expressam todos os receptores de ErbB conhecidos, mas em níveis relativamente baixos. Como ErbB2, ErbB3 e ErbB4 possuem tamanhos moleculares praticamente idênticos, não é possível discernir qual proteína está se tornando fosforilada por tirosina quando os

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112/135 lisados de células inteiras são avaliados através da análise por Western Blot.

[0273] Entretanto, estas células são ideais para ensaios de fosforilação de tirosina de HRG pois, sob as condições de ensaio utilizadas, na ausência de HRG adicionado de forma exógena, elas exibem níveis baixos a imperceptíveis de proteínas de fosforilação de tirosina na faixa Mr de 180.000.

[0274] As células MCF7 foram colocadas em placas de 24 cavidades e anticorpos monoclonais para ErbB2 foram adicionados a cada cavidade e incubados por trinta minutos à temperatura ambiente, rHRG31177-244 foi então adicionado a cada cavidade até concentração final de 0,2 nM e a incubação prosseguiu por oito minutos. Os meios foram cuidadosamente aspirados de cada cavidade e as reações foram suspensas através da adição de 100 gl de tampão de amostra de SDS (5% SDS, 25 mM DTT e 25 mM TrisHCl, pH 6,8). Cada amostra (25 gl) foi colocada em eletroforese sobre um gel de grau 4 a 12% (Novex) e, em seguida, transferida por eletroforese para a membrana de difluoreto de polivinilideno. Imunotransferência de antifosfotirosina (4G10, de UBI, utilizado a 1 gg/ml) foram desenvolvidas e a intensidade da faixa reativa predominante a Mr de cerca de 180.000 foi quantificada através de densitometria de reflexão, conforme descrito anteriormente (Holmes et al., Science, 256:1205-1210, 1992; Siwkowski et al., J. Biol. Chem., 269:14661-14665, 1994).

[0275] Os anticorpos monoclonais 2C4, 7F3 e 4D5 inibiram significativamente a geração de um sinal de fosforilação de tirosina induzido por HRG a Mr de 180.000. Na ausência de HRG, nenhum desses anticorpos foi capaz de estimular as proteínas de fosforilação de tirosina na faixa de Mr de 180.000. Além disso, esses anticorpos não apresentam reação cruzada com EGFR (Fendly et al, Cancer Research, 50:1550-1558, 1990), ErbB3 ou ErbB4. Os anticorpos 2C4 e 7F3 inibiram significativamente o estímulo de HRG de fosforilação de p180 tirosina a < 25% do controle. O anticorpo monoclonal 4D5

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113/135 foi capaz de bloquear o estímulo de HRG de fosforilação de tirosina em cerca de 50%. A Fig. 2A exibe curvas de resposta à dosagem para inibição por 2C4 ou 7F3 de estímulo de HRG de fosforilação de p180 tirosina, conforme determinado através de densitometria de reflexão. A avaliação dessas curvas de inibição utilizando um ajuste de quatro parâmetros gerou IC50 de 2,8 ± 0,7 nM e 29,0 ± 4,1 nM para 2C4 e 7F3, respectivamente.

[0276] A inibição da ligação de HRG a linhagens celulares de tumor de mama MCF7 por anticorpos anti-ErbB2 foi realizada com cultivos monocamadas sobre gelo em formato de placa com 24 cavidades (Lewis et al., Cancer Research, 56:1457-1465, 1996). Anticorpos monoclonais anti-ErbB2 foram adicionados a cada cavidade e incubados por trinta minutos. Adicionouse rHRG31 177-224 marcado por ¹²⁵I (25 ppm) e a incubação prosseguiu por 4 a 16 horas. A Fig. 2B proporciona curvas de resposta à dosagem para inibição por 2C4 ou 7F3 de ligação de HRG a células MCF7. Concentrações variáveis de 2C4 ou 7F3 foram incubadas com células MCF7 na presença de rHRG31 marcado por ¹²⁵I e as curvas de inibição são exibidas na Fig. 2B. A análise destes dados gerou IC50 de 2,4 ± 0,3 nM e 19,0 ± 7,3 nM para 2C4 e 7F3, respectivamente. Inibição máxima de cerca de 74% para 2C4 e 7F3 esteve de acordo com os dados de fosforilação de tirosina.

[0277]Para determinar se o efeito dos anticorpos anti-ErbB2 observados em células MCF7 foi um fenômeno geral, linhagens de células de tumores humanos foram incubadas com 2C4 ou 7F3 e foi determinado o grau de ligação de rHRG31 marcada por ¹²⁵I específico (Lewis et al., Cancer Research, 56:1457-1465, 1996). Os resultados deste estudo são exibidos na Fig. 3. A ligação de rHRG31 marcado por ¹²¹I pôde ser significativamente inibida por 2C4 ou 7F3 em todas as linhagens celulares, com exceção da linhagem de célula cancerosa de mama MDA-MB-468, que foi relatada como expressando pouco ou nenhum ErbB2. As linhagens celulares

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114/135 remanescentes são relatadas como expressando ErbB2, com o nível de expressão de ErbB2 variando amplamente entre essas linhagens celulares. De fato, a faixa de expressão de ErbB2 nas linhagens celulares testadas varia em mais de duas ordens de magnitude. BT-20, MCF7 e Caov3, por exemplo, expressam cerca de 10⁷ receptores de ErbB2 por célula, enquanto BT-474 e SK-BR-3 expressam cerca de 106 receptores de ErbB2 por célula. Dada a ampla faixa de expressão de ErbB2 nessas células e os dados acima, concluiu-se que a interação entre ErbB2 e ErbB3 ou ErbB4 foi uma interação de alta afinidade que tem lugar sobre a superfície da membrana de plasma.

[0278]Os efeitos inibidores do crescimento de anticorpos monoclonais 2C4 e 4D5 sobre células MDA-MB-175 e SK-BR-3 na presença ou ausência de rHRG31 exógeno foram determinados (Schaefer et al., Oncogene, 15:1385-1394, 1997). Os níveis de ErbB2 em células MDA-MB175 são de quatro a seis vezes mais altos que o nível encontrado em células epiteliais mamárias normais e o receptor de ErbB2-ErbB4 é constitutivamente fosforilado por tirosina em células de MDA-MB-175. As células MDA-MB-175 foram tratadas com anticorpos monoclonais anti-ErbB2 2C4 e 4D5 (10 pg/ml) por quatro dias. Em um ensaio de manchas violetas de cristal, a incubação com 2C4 demonstrou forte efeito inibidor do crescimento sobre essa linhagem celular (Fig. 4A). HRG exógeno não reverteu significativamente essa inibição. Por outro lado, 2C4 não revelou nenhum efeito inibidor sobre a linhagem celular de sobre-expressão de ErbB2 SK-BR-3 (Fig. 4B). O anticorpo monoclonal 2C4 foi capaz de inibir a proliferação celular de células MDA-MB-175 até um ponto maior que o anticorpo monoclonal 4D5, tanto na presença como na ausência de HRG exógeno. A inibição da proliferação celular por 4D5 é dependente do nível de expressão de ErbB2 (Lewis et al., Cancer Immunol. Immunother., 37:255

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263, 1993). Inibição máxima de 66% em células SK-BR-3 poderá ser detectada (Fig. 4B). Este efeito, entretanto, poderá ser superado por HRG exógeno.

Exemplo 2

Associação Dependente de HRG de ErbB2 com ErbB3 é Bloqueada pelo Anticorpo Monoclonal 2C4 [0279] A capacidade de associação de ErbB3 com ErbB2 foi testada em um experimento de co-imunoprecipitação. 1,0 x 10⁶ células MCF7 ou SK-BR-3 foram semeadas em placas de cultura de tecido de seis cavidades em 50:50 DMEM/meio F12 de Ham contendo soro bovino fetal a 10% (FBS) e 10 mM de HEPES, pH 7,2 (meio de crescimento) e mantidas em crescimento por uma noite. As células foram privadas de alimento por duas horas em meio de crescimento sem soro antes de iniciar-se o experimento.

[0280] As células foram lavadas rapidamente com solução salina tamponada por fosfato (PBS) e incubadas em seguida com 100 nM do anticorpo indicado diluído em albumina de soro bovino a 0,2% p/v (BSA), meio RPMI com 10 mM de HEPES, pH 7,2 (tampão de ligação) ou somente com tampão de ligação (controle). Após uma hora à temperatura ambiente, adicionou-se HRG até concentração final de 5 nM até metade das cavidades (+). Adicionou-se volume similar de tampão de ligação às outras cavidades (-). A incubação foi mantida por cerca de dez minutos.

[0281] Os sobrenadantes foram removidos através de aspiração e as células foram lisadas em RPMI, 10 mM de HEPES, pH 7,2, 1,0% v/v de Triton X-100^®, 1,0% p/v de CHAPS (tampão de lise), contendo 0,2 mM de PMSF, 10 pg/ml de leupeptina e 10 TU/ml de aprotinina. Os lisados foram retirados do material insolúvel através de centrifugação.

[0282] ErbB2 foi imunoprecipitado através da utilização de um anticorpo monoclonal acoplado covalentemente a um gel de afinidade (Affi

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Prep 10, Bio-Rad). Este anticorpo (Ab-3, Oncogene Sciences) reconhece um epítopo de domínio citoplasmático. A imunoprecipitação foi realizada através da adição de 10 gl de calda de gel contendo cerca de 8,5 gg de anticorpo imobilizado a cada lisado e as amostras foram mantidas em mistura à temperatura ambiente por duas horas. Os géis foram então recolhidos através de centrifugação. Os géis foram lavados em bateladas por três vezes com tampão de lise para remover o material não ligado. Adicionou-se então tampão de amostra de SDS e as amostras foram aquecidas rapidamente em um banho de água fervente.

[0283] Os sobrenadantes foram conduzidos sobre géis de poliacrilamida de 4 até 12% e eletro-transferido sobre membranas de nitrocelulose. A presença de ErbB3 foi determinada através de sondas de transferência com um anticorpo policlonal contra um de seus epítopos de domínio citoplasmático (c-17, Santa Cruz Biotech). As transferências foram visualizadas através da utilização de um substrato quimiluminescente (ECL, Amersham).

[0284] Conforme exibido nas linhagens de controle das Figs. 5A e 5B para células MCF7 e SK-BR-3, respectivamente, ErbB3 esteve presente em um imunoprecipitado de ErbB2 somente quando as células foram estimuladas com HRG. Quando as células foram primeiramente incubadas com anticorpo monoclonal 2C4, o sinal ErbB3 foi abolido em células MCF7 (Fig. 5A, linhagem 2C4+) ou substancialmente reduzido em células SK-BR-3 (Fig. 5B, linhagem 2C4+). Conforme exibido nas Figs. 5A e B, o anticorpo monoclonal 2C4 bloqueia a associação dependente de herregulina de ErbB3 com ErbB2 em células MCF7 e SK-BR-3 de forma substancialmente mais eficaz que Herceptin^®. Incubação prévia com Herceptin^® reduziu o sinal de ErbB3 em lisados de MCF7, mas apresentou pouco ou nenhum efeito sobre a quantidade de ErbB3 co-precipitado a partir de lisados de SK-BR-3. Incubação prévia com

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117/135 um anticorpo contra o receptor de EGF (Ab-1, Oncogene Sciences) não apresentou nenhum efeito sobre a capacidade de co-imunoprecipitação de ErbB3 com ErbB2 em cada linhagem celular.

Exemplo 3

Anticorpos 2C4 Humanizados [0285] Os domínios variáveis de anticorpo 2C4 monoclonal de murinos foram primeiramente clonados em um vetor que permite a produção de um fragmento Fab quimérico humano/camundongo. O RNA total foi isolado das células de hibridoma, através da utilização de um kit de extração de RNA Stratagene, seguindo-se os protocolos do fabricante. Os domínios variáveis foram amplificados através de RT-PCR, purificados por gel e inseridos em um derivado de um plasmídeo com base em pUC119 que contém domínio constante kappa humano e domínio CH1 humano, conforme descrito anteriormente (Carter et al., PNAS (USA), 89:4285, 1992; e patente US 5.821.337). O plasmídeo resultante foi transformado em linhagem 16C9 de E. coli para expressão do fragmento Fab. O crescimento de culturas, indução da expressão de proteína e purificação do fragmento Fab foram os descritos anteriormente (Werther et al., J. Immunol., 157:4986-4995, 1996; Presta et al., Cancer Research, 57:4593-4599, 1997).

[0286] O fragmento Fab 2C4 quimérico purificado foi comparado com o anticorpo original de murinos 2C4 com relação à sua capacidade de inibir a ligação de ¹²⁵I-HRG a células de MCF7 e inibem a ativação de rHRG de fosforilação de p180 tirosina em células de MCF7. Conforme exibido na Fig. 6A, o fragmento Fab 2C4 quimérico é muito eficaz na interrupção da formação do sítio de ligação de ErbB2-ErbB3 de alta afinidade sobre a linhagem de células de câncer de mama humano, MCF7. O valor IC50 relativo calculado para 2C4 de murino intacto é de 4,0 ± 0,4 nM, enquanto o valor para o fragmento Fab é de 7,7 ± 1,1 nM. Conforme ilustrado na Fig. 6B, o fragmento

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Fab 2C4 quimérico monovalente é muito eficaz na interrupção da ativação de ErbB2-ErbB3 dependente de HRG. O valor de IC50 calculado para o anticorpo monoclonal de murino intacto 2C4 é de 6,0 ± 2 nM, enquanto o valor para o fragmento Fab é de 15,0 ± 2 nM.

[0287] O seqüenciamento de DNA do clone quimérico permitiu a identificação dos resíduos de CDR (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, quinta edição, Serviço de Saúde Pública, Institutos Nacionais de Saúde, Bethesda MD, Estados Unidos, 1991) (Figs. 7A e B). Através da utilização de mutagênese sítio-dirigida de oligonucleotídeo, todas as seis regiões de CDR foram introduzidas em uma estrutura humana completa (subgrupo I kappa Vl e subgrupo III Vh) contida no plasmídeo VX4, conforme descrito anteriormente (Presta et al., Cancer Research, 57:4593-4599, 1997). Proteína da “troca de CDR” resultante foi expressa e purificada conforme acima. Foram realizados estudos de ligação para comparar as duas versões. Resumidamente, uma placa Nunc Maxisorp^TM foi revestida com um micrograma por ml de domínio extracelular ErbB2 (ECD; produzido conforme descrito em WO 90/14357) em 50 mM de tampão de carbonato, pH 9,6, por uma noite a 4°C e, em seguida, bloqueado com diluente ELISA (0,5% de BSA, 0,05% de polissorbato 20, PBS) à temperatura ambiente por uma hora. Diluições em série de amostras em diluente ELISA foram incubadas sobre as placas por duas horas. Após lavagem, o fragmento Fab ligado foi detectado com anticorpo kappa anti-humano de murinos biotinilado (ICN 634771), seguido por peroxidase de rabanete selvagem conjugado por estreptavidina (Sigma) e utilizando-se 3,3’,5,5’-tetrametil benzidina (Kirkegaard & Perry Laboratories, Gaithersburg MD, Estados Unidos) na forma de substrato. A absorção foi lida em 450 nm. Conforme exibido na Fig. 8A, toda a ligação foi perdida sobre a construção do fragmento Fab humano com troca de CDR.

[0288] Para restaurar a ligação do Fab humanizado, foram

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119/135 construídos mutantes através da utilização de DNA a partir da troca de CDR como modelo. Utilizando-se um modelo gerado por computador (Fig. 9), essas mutações foram projetadas para modificar resíduos da região de estrutura humana para seus parceiros de murinos, em que a mudança poderá afetar as conformações de CDR ou a superfície intermediária antígeno-anticorpo. Os mutantes são exibidos na Tabela 2.

Tabela 2

Designação de Mutações 2C4 FR Humanizadas

Mutante no	Substituições da região de estrutura (FR)
560	ArgH71Val
561	AspH73Arg
562	ArgH71Val, AspH73Arg
568	ArgH71Val, AspH73Arg, AlaH49Gly
569	ArgH71Val, AspH73Arg, PheH67Ala
570	ArgH71Val, AspH73Arg, AsnH76Arg
571	ArgH71Val, AspH73Arg, LeuH78Val
574	ArgH71Val, AspH73Arg, IleH69Leu
56869	ArgH71Val, AspH73Arg, AlaH49Gly, PheH67Ala

[0289] As curvas de ligação para os diversos mutantes são exibidas nas Figs. 8A a C. A versão Fab humanizada 574, com as modificações ArgH71Val, AspH73Arg e IleH69Leu, parece apresentar ligação restaurada à do fragmento Fab 2C4 quimérico original. Resíduos de CDR e/ou FR adicionais, tais como L2, L54, L55, L56, H35 e/ou H48, podem ser modificados (por exemplo, substituídos conforme segue: IleL2Thr; ArgL54Leu; TyrL55Glu; ThrL56Ser; AspH35Ser; e ValH48Ile) a fim de refinar adicionalmente ou ampliar a ligação do anticorpo humanizado. Alternativa ou adicionalmente, o anticorpo humanizado pode ser maturado por afinidade (vide acima) a fim de ampliar adicionalmente ou refinar sua afinidade e/ou outras atividades biológicas.

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120/135 [0290] A 2C4 versão 574 humanizada foi maturada por afinidade, através da utilização de um método de exibição de fago. Resumidamente, 2C4.574 Fab humanizado foi clonado em um vetor de exibição do fago na forma de fusão de geneIII. Quando partículas do fago forem induzidas através de infecção com fago de auxílio M13KO7, essa fusão permite que o Fab seja exibido sobre o N-terminal do geneIII da proteína de fibra terminal do fago (Baca et al., J. Biol. Chem., 272:10678, 1997).

[0291] Bibliotecas individuais foram construídas para cada um dos 6 CDRs identificados acima. Nessas bibliotecas, os aminoácidos nos CDRs que foram identificados através da utilização de um modelo gerado por computador (Fig. 9) como sendo potencialmente significativo na ligação ao ErbB2 foram selecionados aleatoriamente através da utilização de oligos contendo “NNS” como seus códons. As bibliotecas foram então garimpadas contra ErbB2 ECD revestido sobre placas de Nunc Maxisorp^TM com leite em pó a 3% em PBS com 0,2% de Tween 20® (MPBST) utilizado no lugar de todas as soluções de bloqueio. A fim de selecionar o fago com afinidades mais altas que a de 2C4.574, nas rodadas de garimpagem 3, 4 e 5, adicionou-se ErbB2 ECD solúvel ou Fab 2C4.574 solúvel durante as etapas de lavagem como concorrente. Os tempos de lavagem foram estendidos para uma hora à temperatura ambiente.

[0292] Após cinco rodadas de garimpagem, clones individuais foram novamente analisados através de ELISA de fago. Clones individuais foram cultivados em placas de cultura de tecido com fundo em “U” de 96 cavidades Costar e o fago foi induzido através da adição do fago de auxílio. Após crescimento por uma noite, células de E. coli foram peletizadas e os sobrenadantes contendo fago foram transferidos para placas de 96 cavidades, em que o fago foi bloqueado com MPBST por uma hora à temperatura ambiente. Placas de Nunc Maxisorp^TM revestidas com ErbB2 ECD também

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121/135 foram bloqueadas com MPBST, conforme acima. O fago bloqueado foi incubado sobre as placas por duas horas. Após lavagem, o fago ligado foi detectado através da utilização de anticorpo monoclonal anti-M13 conjugado com peroxidase de rabanete selvagem (Amersham Pharmacia Biotech, Inc. 279421-01) diluído a 1:5000 em MPBST, seguido por 3,3’,5,5’-tetrametil benzidina como substrato. A absorção foi lida a 450 nm.

[0293] Os 48 clones de cada biblioteca que geraram os sinais mais altos foram seqüenciados por DNA. Os clones cujas seqüências ocorreram mais freqüentemente foram subclonados no vetor descrito acima, que permite a expressão de Fabs solúveis. Esses Fabs foram induzidos, as proteínas foram purificadas e os Fabs purificados foram analisados para determinação de ligação por ELISA conforme descrito acima e a ligação foi comparada à da versão 2C4.574 humanizada inicial.

[0294] Após a identificação das mutações interessantes em CDRs individuais, os mutantes adicionais que foram gerados de diversas combinações destes, foram construídos e testados conforme acima. Os mutantes que geraram ligação aprimorada com relação ao 574 são descritos na Tabela 3.

Tabela 3

Designação de Mutantes Derivados da Maturação de Afinidade de 2C4.574

Nome do mutante	Modificação de 574	Mutante/574*
H3.A1	serH99trp, metH34leu	0,380
L2.F5	serL50trp, tyrL53gly, metH34leu	0,087
H1.3.B3	thrH28gln, thrH30ser, metH34leu	0,572
L3.G6	tyrL92pro, ileL93lys, metH34leu	0,569
L3.G11	tyrL92ser, ileL93arg, tyrL94gly, metH34leu	0,561
L3.29	tyrL92phe, tyrL96asn, metH34leu	0,552
L3.36	tyrL92phe, tyrL94leu, tyrL96pro, metH34leu	0,215

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Nome do mutante	Modificação de 574	Mutante/574*
654	serL50trp, metH34leu	0,176
655	metH34ser	0,542
659	serL50trp, metH34ser	0,076
L2.F5.H3.A1	serL50trp, tyrL53gly, metH34leu, serH99trp	0,175
L3G6.H3.A1	tyrL92pro, ileL93lys, metH34leu, serH99trp	0,218
H1.3.B3.H3.A1	thrH28gln, thrH30ser, metH34leu, serH99trp	0,306
L3.G11.H3.A1	tyrL92ser, ileL93arg, tyrL94gly, metH34leu, serH99trp	0,248
654.H3.A1	serL50trp, metH34leu, serH99trp	0,133
654.L3.G6	serL50trp, metH34leu, tyrL92pro,ileL93lys	0,213
654.L3.29	serL50trp, metH34leu, tyrL92phe, tyrL96asn	0,236
654.L3.36	serL50trp, metH35leu, tyrL92phe, tyrL94leu, tyrL96pro	0,141

* Razão da quantidade de mutante necessária para gerar o OD intermediário da curva-padrão para a quantidade de 574 necessária para gerar o OD intermediário da curva-padrão em um ELISA ErbB2 ECD. Um número menor que 1,0 indica que o mutante se liga ao ErbB2 melhor que 574.

[0295] Os seguintes mutantes também foram construídos e encontram-se atualmente sob avaliação:

659.L3.G6	serL50trp, metH34ser, tyrL92pro, ileL93lys
659.L3.G11	serL50trp, metH34ser, tyrL92ser, ileL93arg, tyrL94gly
659.L3.29	serL50trp, metH34ser, tyrL92phe, tyrL96asn
659.L3.36	serL50trp, metH34ser, tyrL92phe, tyrL94leu, tyrL96pro
L2F5.L3G6	serL50trp, tyrL53gly, metH34leu, tyrL92pro, ileL93lys
L2F5.L3G11	serL50trp, tyrL53gly, metH34leu, tyrL92ser, ileL93arg, tyrL94gly
L2F5.L29	serL50trp, tyrL53gly, metH34leu, tyrL92phe, tyrL96asn
L2F5.L36	serL50trp, tyrL53gly, metH34leu, tyrL92phe, tyrL94leu, tyrL96pro
L2F5.L3G6.655	serL50trp, tyrL53gly, metH35ser, tyrL92pro, ileL93lys
L2F5.L3G11.655	serL50trp, tyrL53gly, metH34ser, tyrL92ser, ileL93arg, tyrL94gly

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L2F5.L29.655	serL50trp, tyrL53gly, metH34ser, tyrL92phe, tyrL96asn
L2F5.L36.655	serL50trp, tyrL53gly, metH34ser, tyrL92phe, tyrL94leu, tyrL96pro

[0296] Os mutantes a seguir, sugeridos por varredura de homologia, estão atualmente sendo construídos:

678	thrH30ala
679	thrH30ser
680	lysH64arg
681	leuH96val
682	thrL97ala
683	thrL97ser
684	tyrL96phe
685	tyrL96ala
686	tyrL91phe
687	thrL56ala
688	glnL28ala
689	glnL28glu

[0297] O aminoácido preferido em H34 seria metionina. Uma modificação para leucina poderia ser feita caso se encontrasse oxidação existente nessa posição.

[0298] Concluiu-se que asnH52 e asnH53 são fortemente preferidos para ligação. A modificação desses resíduos para alanina ou ácido aspártico reduziu dramaticamente a ligação.

[0299] Foi preparado um anticorpo intacto que compreende os domínios leve e pesado variáveis da versão 574 humanizada com uma região constante de cadeia pesada de IgG humano (vide patente US 5.821.337). O anticorpo intacto é produzido por células de Ovário de Hamster Chinês (CHO). Essa molécula é denominada no presente rhuMAb 2C4.

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Exemplo 4

Anticorpo Monoclonal 2C4 Bloqueia a Ativação de MAPK Mediada por EGF, TGF-α OU HRG [0300] Muitos receptores de fator de crescimento assinalam através do processo de proteína quinase ativado por mitógeno (MAPK). Estas quinases de especificidade dupla são um dos objetivos fundamentais em processos de transdução de sinal que, por fim, inicia a divisão das células cancerosas. A capacidade de inibição de ativação de MAPK por EGF, TGF-α ou HRG de anticorpo monoclonal 2C4 ou Herceptin^® foi determinada da forma a seguir.

[0301] Células MCF7 (10⁵ células/cavidade) foram colocadas em meios contendo soro em placas de cultura celular de 12 cavidades. No dia seguinte, o meio celular foi removido e adicionou-se meio novo contendo 0,1% de soro a cada cavidade. Este procedimento foi então repetido no dia seguinte e, antes do teste do meio, foi substituído com tampão de ligação livre de soro (Jones et al., J. Biol. Chem., 273:11667-74, 1998; e Schaefer et al., J. Biol. Chem., 274:859-66, 1999). As células foram mantidas em equilíbrio à temperatura ambiente e incubadas em seguida por trinta minutos com 0,5 ml de 200 nM de Herceptin^® ou anticorpo monoclonal 2C4. As células foram então tratadas com 1 nM EGF, 1 nM TGF-α ou 0,2 nM de HRG por quinze minutos. A reação foi suspensa através de aspiração do meio celular e, em seguida, adição de 0,2 ml de tampão de amostra SDS-PAGE contendo 1% de DTT. A ativação de MAPK foi determinada através da técnica de Western Blot, utilizando-se um anticorpo de MAPK anti-ativo (Promega) conforme descrito anteriormente (Jones et al., J. Biol. Chem., 273:11667-74, 1998).

[0302] Conforme exibido na Fig. 10, anticorpo monoclonal 2C4 bloqueia significativamente a ativação de MAPK mediada por EGF, TGF-α e HRG até um ponto maior que Herceptin^®. Estes dados sugerem que o

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125/135 anticorpo monoclonal 2C4 se ligue a uma superfície de ErbB2 que é utilizada para sua associação com EGFR ou ErbB3 e, desta forma, evita a formação do complexo receptor de sinalização.

[0303] Também se demonstrou que o anticorpo monoclonal 2C4 inibe a ativação de AKT dependente-(HRG) de herregulina. A ativação do processo de transdução de sinal da quinase PI3 é importante para a sobrevivência celular (Carraway et al., J. Biol. Chem., 270:7111-6, 1995). Em células tumorais, a ativação de quinase PI3 pode desempenhar um papel no fenótipo invasivo (Tan et al., Cancer Research, 59:1620-1625, 1999). O processo de sobrevivência é mediado principalmente pelo AKT de treonina/serina quinase (Bos et al., Trends Biochem Sci., 20:441-442, 1995). Complexos formados entre ErbB2 e ErbB3 ou EGFR podem iniciar esses processos em reação a herregulina ou EGF, respectivamente (Olayioye et al., Mol. & Cell. Biol., 18:5042-51, 1998; Karunagaran et al., EMBO Journal, 15:254-264, 1996; e Krymskaya et al., Am. J. Physiol., 276:L246-55, 1999). A incubação de células de câncer de mama MCF7 com 2C4 inibe a ativação de AKT mediada por herregulina. Além disso, o nível básico de ativação de AKT presente, na ausência de adição de herregulina, é adicionalmente reduzida através da adição de 2C4. Estes dados sugerem que 2C4 pode inibir a ativação do ligante de ErbB de quinase PI3 e que essa inibição pode gerar apoptose. A maior sensibilidade a apoptose pode manifestar-se com maior sensibilidade nas células tumorais aos efeitos tóxicos da quimioterapia.

[0304] Assim, o anticorpo monoclonal 2C4 inibe a sinalização de ErbB iniciada por ligante através de dois processos importantes de transdução de sinal quinase MAP (importante processo de proliferação) e quinase PI3 (importante processo de sobrevivência/anti-apoptótico).

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Exemplo 5

Combinação de Anticorpo Monoclonal 2C4 e Herceptin® in vivo [0305] Um modelo de xenoenxerto utilizando a linhagem celular de adenocarcinoma pulmonar, Calu-3, foi utilizado para determinar a eficácia de anticorpos monoclonais anti-HER2, seja isoladamente ou em combinação, para suprimir o crescimento tumoral. Fêmeas de camundongos nuas NCR foram inoculadas de forma subcutânea com 20 x 10⁶ células em 0,1 ml. Medições do tumor foram tomadas duas vezes por semana e, quando os nódulos do tumor atingiram volume de 100 mm³, os animais foram selecionados aleatoriamente em sete grupos de tratamento. Os grupos de tratamento foram:

(a) anticorpo monoclonal controle, MAb 1766;

(b) Herceptin®, 10 mg/kg;

(c) anticorpo monoclonal 7C2, 10 mg/kg;

(d) anticorpo monoclonal 2C4, 10 mg/kg;

(e) Herceptin® e 7C2, cada qual a 10 mg/kg;

(f) Herceptin® e 2C4, cada qual a 10 mg/kg; e (g) anticorpos monoclonais 2C4 e 7C2, cada qual a 10 mg/kg.

[0306] Os animais foram tratados duas vezes por semana até o dia 24. Os volumes de tumor foram medidos duas vezes por semana até o dia

38.

[0307] Conforme exibido no gráfico de barras da Fig. 11, o tratamento dos camundongos portadores de tumor Calu-3 com 2C4 ou Herceptin^® inibiu significativamente o crescimento dos tumores. A combinação de Herceptin^® e 2C4 ou Herceptin^® e 7C2 foi superior a qualquer dos anticorpos monoclonais administrados isoladamente.

Exemplo 6

Tratamento de Câncer Colo-Retal com Anticorpo Monoclonal 2C4 [0308] Linhagens celulares colo-retais humanas, tais como HCA-7,

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127/135

LS174T ou CaCo-2, são implantadas de forma subcutânea em camundongos nus atímicos conforme descrito em Sheng et al., J. Clin. Invest., 99:2254-2259, 1997. Uma vez que sejam estabelecidos tumores com cerca de 100 mm³ de volume, grupos de animais são tratados com 10 a 50 mg/kg de anticorpo monoclonal 2C4 administrados duas vezes por semana através de injeção na cavidade intraperitoneal. Anticorpo monoclonal 2C4 suprime o crescimento de xenoenxertos colo-retais in vivo.

Exemplo 7

Tratamento de Câncer de Mama com 2C4 Humanizado [0309] O efeito de rhuMAb 2C4 ou Herceptin® sobre células de câncer de mama humano que não sobre-expressam ErbB2 foi determinado em um ensaio de Azul de Alamar de três dias (Ahmed, S. A., J. Immunol. Methods, 170:211-224, 1994; e Page et al., Int. J. Oncol., 3:473-476, 1994). As células utilizadas neste ensaio foram células de câncer de mama humano MDA-175 que expressam ErbB2 em nível 1+. Conforme exibido na Fig. 12, o crescimento da linhagem celular de câncer de mama, MDA-175, é significativamente inibido de modo dose-dependente através da adição de rhuMAb 2C4, em comparação com tratamento de Herceptin^®.

[0310] Foi determinada a eficácia de rhuMAb 2C4 contra xenoenxertos de MCF7 que são receptores de estrogênio positivos (ER+) e expressam baixos níveis de ErbB2. Foram utilizadas fêmeas de camundongos suplementadas com estrogênio. Administrou-se rhuMAb 2C4 a uma dosagem de 30 mg/kg semanalmente. Conforme exibido na Fig. 13, rhuMAb 2C4 foi eficaz na inibição do crescimento tumoral de câncer de mama in vivo, em que o câncer de mama não se caracterizou pela sobre-expressão de ErbB2.

Exemplo 8

Fármaco-cinética, Metabolismo e Toxicologia de 2C4 [0311] O rhuMAb 2C4 foi estável em soro humano. Não foi

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128/135 observada nenhuma evidência ou agregados de formação de complexos em matrizes biológicas. Em camundongos, rhuMAb 2C4 desapareceu mais rapidamente do que Herceptin®. Estudos fármaco-cinéticos indicam que a administração semanal de cerca de 2 a 6 mg/kg de rhuMAb 2C4 deverá resultar em concentrações de soro similares a Herceptin^®, da forma dosada no presente. A exposição de soro 2C4 resultante deverá exceder grandemente o IC50 determinado in vitro.

[0312]Foi conduzido um estudo toxicológico em macacos Cynomolgus (dois machos e duas fêmeas por grupo). Administrou-se rhuMab 2C4 de forma intravenosa a 0, 10, 50 ou 100 mg/kg duas vezes por semana, por quatro semanas. As medições do estudo toxicológico incluíram pesos do corpo (semanas -2, -1 e semanalmente em seguida); consumo de alimentos (qualitativo, diário); exames físicos com determinação da pressão sangüínea, eletrocardiograma (ECG) e temperatura do corpo (semanas -2, -1 e semanas 2 e 4, quatro horas após a dosagem em seguida à segunda dose daquela semana); avaliações ultrasônicas cardíacas (em seguida à primeira dose da semana 1 e ao final do estudo, na semana 4); patologia clínica (linhagem básica e final das semanas 2 e 4); urinálise (linhagem básica e final das semanas 2 e 4); amostragem de análise de anticorpos (linhagem básica e final das semanas 2 e 4); bem como análise de histopatologia e necropsia.

[0313] Todos os animais em todos os grupos sobreviveram ao final do estudo. Nenhuma observação clínica significativa ou diferença entre os grupo foi observada. Os resultados da necropsia não exibiram nenhuma anormalidade grosseira nos órgãos de qualquer animal. Nenhuma anormalidade microscópica significativa foi observada em tecidos de qualquer um dos animais. Nenhuma mudança significativa de ECG foi observada do início ao término do estudo. Além disso, não foi observada nenhuma diferença

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129/135 entre os grupos.

Exemplo 9

Escala de Dosagem [0314] Pacientes com câncer recebem uma primeira dose de rhuMAb 2C4 em um de cinco níveis de dosagem (0,05, 0,5, 2,0, 4,0 ou 10 mg/kg; seis pacientes por nível de dosagem), seguida por lavagem de quatro semanas. Na semana 5, os pacientes recebem a mesma dose semanal por quatro vezes, seguida por uma lavagem adicional de quatro semanas. Os pacientes com uma resposta completa, resposta parcial ou doença estável são escolhidos para estudos de extensão.

Exemplo 10

Terapia de Câncer da Próstata Metastático Refratário ou Decadente [0315] O rhuMAb 2C4 é um anticorpo monoclonal humanizado de comprimento total (produzido em células de CHO) dirigido a ErbB2. O rhuMab 2C4 bloqueia a associação de ErbB2 com outros membros da família de ErbB, de forma a inibir a sinalização intracelular através do processo de ErbB. Ao contrário de Herceptin^®, o rhuMAb 2C4 não apenas inibe o crescimento de tumores que sobre-expressem ErbB2, mas também bloqueia o crescimento de tumores que necessitem de sinalização ligante-dependente de ErbB.

[0316] O rhuMAb 2C4 é indicado como agente isolado para o tratamento de pacientes com câncer de próstata refratário a hormônios (independente de androgênios). Objetivos primários de eficácia incluem a sobrevivência geral em comparação com o melhor tratamento disponível (Mitoxantrona/Prednisona), quando utilizado na forma de agente isolado, e segurança. Objetivos secundários de eficácia incluem: tempo para o avanço da doença, velocidade da resposta, qualidade de vida, dor e/ou duração da resposta. O rhuMAb 2C4 é administrado de forma intravenosa (IV) semanalmente ou a cada três semanas a 2 ou 4 mg/kg, respectivamente, até o

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130/135 avanço da doença. O anticorpo é fornecido como formulação líquida de múltipla dosagem (20 ml de carga sob concentração de 20 mg/ml ou uma concentração mais alta).

[0317] O rhuMAb 2C4 também é indicado em combinação com quimioterapia para o tratamento de pacientes com câncer de próstata refratário a hormônios (independente de androgênios). Objetivos primários para eficácia incluem sobrevivência geral em comparação com quimioterapia e segurança. Objetivos secundários de eficácia incluem: tempo para o avanço da doença, velocidade da resposta, qualidade de vida, dor e/ou duração da resposta. O rhuMAb 2C4 é administrado semanalmente de forma intravenosa (IV) ou a cada três semanas a 2 ou 4 mg/kg, respectivamente, até o avanço da doença. O anticorpo é fornecido na forma de formulação líquida de múltiplas dosagens (20 ml de carga sob concentração de 20 mg/ml ou uma concentração mais alta).

[0318] Exemplos de drogas que podem ser combinadas com o anticorpo anti-ErbB2 (que bloqueia a ativação de ligante de um receptor de ErbB2) para o tratamento de câncer da próstata (por exemplo, câncer de próstata independente de androgênios) incluem um inibidor de transferase de farnesila; um agente anti-angiogênico (por exemplo, um anticorpo anti-VEGF); uma droga destinada a EGFR (por exemplo, C225 ou ZD1839); outro anticorpo anti-ErbB2 (por exemplo, um anticorpo anti-ErbB2 inibidor do crescimento tal como Herceptin^® ou um anticorpo anti-ErbB2 que induz apoptose tal como 7C2 ou 7F3, que inclui suas variantes maduras por afinidade e/ou humanizadas); uma citocina (por exemplo, IL-2, IL-12, G-CSF ou GM-CSF); um antiandrogênio (tal como flutamida ou acetato de ciproterona); leuprolida; suramina; um agente quimioterapêutico tal como vinblastina, estramustina, mitoxantrona, liarozol (um agente bloqueador do metabolismo de ácido retinóico), ciclofosfamida, antibióticos de antraciclina tais como doxorubicina,

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131/135 um taxano (por exemplo, paclitaxel ou docetaxel) ou metotrexato, ou qualquer combinação do acima, tal como vinblastina/estramustina ou ciclofosfamida/doxorubicina/metotrexato; prednisona; hidrocortisona; ou suas combinações. Podem ser administradas doses padrão para essas diversas drogas, tais como 40 mg/mg²/semana de docetaxel (Taxotere®); 6 (AUC) carboplatina; e 200 mg/mg² de paclitaxel (Taxol^®).

Exemplo 11

Terapia de Câncer de Mama Metastático [0319] O rhuMAb 2C4 é indicado na forma de agente isolado para o tratamento de pacientes com câncer de mama metastático, cujos tumores não sobre-expressam ErbB2. Objetivos primários para eficácia incluem velocidade de resposta e segurança. Objetivos de eficácia secundários incluem: sobrevivência geral, tempo para o avanço da doença, qualidade de vida e/ou duração da resposta. O rhuMAb 2C4 é administrado de forma intravenosa (IV) semanalmente ou a cada três semanas a 2 ou 4 mg/kg, respectivamente, até o avanço da doença. O anticorpo é fornecido como formulação líquida de múltipla dosagem (20 ml de carga sob concentração de 20 mg/ml ou uma concentração mais alta).

[0320] O rhuMAb 2C4 também é indicado em combinação com quimioterapia para o tratamento de pacientes com câncer de mama metastático cujos tumores não sobre-expressam ErbB2. Objetivos primários de eficácia incluem sobrevivência geral em comparação com a quimioterapia isoladamente, e segurança. Objetivos de eficácia secundários incluem: tempo para o avanço da doença, velocidade de resposta, qualidade de vida e/ou duração da resposta. O rhuMAb 2C4 é administrado de forma intravenosa (IV) semanalmente ou a cada três semanas a 2 ou 4 mg/kg, respectivamente, até o avanço da doença. O anticorpo é fornecido como formulação líquida de múltipla dosagem (20 ml de carga sob concentração de 20 mg/ml ou uma concentração

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132/135 mais alta).

[0321] Exemplos de drogas que podem ser combinadas com o anticorpo anti-ErbB2 (que bloqueia a ativação de ligantes de um receptor de ErbB2) para o tratamento de câncer de mama (por exemplo, câncer de mama metastático que não é caracterizado por sobre-expressão de ErbB2) incluem agentes quimioterapêuticos, tais como antibióticos de antraciclina (por exemplo, doxorubicina), ciclofosfamida, um taxano (por exemplo, paclitaxel ou docetaxel), navelbina, xeloda, mitomicina C, um composto de platina, oxaliplatina, gemcitabina ou combinações de dois ou mais destes, tais como doxorubicina/ciclofosfamida; outro anticorpo anti-ErbB2 (por exemplo, um anticorpo anti-ErbB2 inibidor de crescimento tal como Herceptin^® ou um anticorpo anti-ErbB2 que induz apoptose, tal como 7C2 ou 7F3, incluindo suas variantes maduras por afinidade ou humanizadas); um anti-estrogênio (por exemplo, tamoxifeno); um inibidor de transferase de farnesila; um agente antiangiogênico (por exemplo, um agente anti-VEGF); uma droga destinada a EGFR (por exemplo, C225 ou ZD1839); uma citocina (por exemplo, IL-2, IL-12, G-CSF ou GM-CSF); ou as combinações acima. Podem-se utilizar dosagens padrão para essas drogas adicionais.

[0322] O rhuMAb 2C4 é adicionalmente indicado em combinação com Herceptin^® para o tratamento de pacientes com câncer de mama metastático cujos tumores sobre-expressam ErbB2. Objetivos primários de eficácia incluem velocidade de resposta e segurança. Objetivos de eficácia secundários incluem: tempo para o avanço da doença, sobrevivência geral em comparação com Herceptin^® isoladamente, qualidade de vida e/ou duração da resposta. O rhuMAb 2C4 é administrado de forma intravenosa (IV) semanalmente ou a cada três semanas a 2 ou 4 mg/kg, respectivamente, até o avanço da doença. O anticorpo é fornecido como formulação líquida de dosagem múltipla (20 ml de carga sob concentração de 20 mg/ml ou uma

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133/135 concentração mais alta). O Herceptin® é administrado de forma intravenosa como dosagem de carga inicial de 4 mg/kg, seguida por dose de manutenção semanal de 2 mg/kg. O Herceptin® é fornecido na forma de pó liofilizado. Cada ampola de Herceptin® contém 440 mg de Herceptin®, 9,9 mg de HCl L-histidina,

6,4 mg de L-histidina, 400 mg de diidrato de α-α-trealose e 1,8 mg de polissorbato 20. Reconstituição com 20 ml de Água Bacteriostática para Injeção (BWFI) contendo 1,1% de álcool benzílico na forma de conservante gera 21 ml de uma solução de dosagem múltipla contendo 21 mg/ml de Herceptin^® sob pH de cerca de 6,0.

Exemplo 12

Terapia de Câncer do Pulmão [0323] O rhuMAb 2C4 é indicado na forma de agente isolado para o tratamento de câncer do pulmão de células não-pequenas em estágio IIIb ou IV (NSCLC). Objetivos primários para eficácia incluem velocidade de resposta e segurança. Objetivos de eficácia secundários incluem: sobrevivência geral, tempo para o avanço da doença, qualidade de vida e/ou duração da resposta. O rhuMAb 2C4 é administrado de forma intravenosa (IV) semanalmente ou a cada três semanas a 2 ou 4 mg/kg, respectivamente, até o avanço da doença. O anticorpo é fornecido como formulação líquida de múltipla dosagem (20 ml de carga sob concentração de 20 mg/ml ou uma concentração mais alta).

[0324] O rhuMAb 2C4 também é indicado em combinação com quimioterapia para o tratamento de pacientes com câncer do pulmão de células não-pequenas metastático. Objetivos primários de eficácia incluem sobrevivência geral em comparação com a terapia padrão e segurança. Objetivos de eficácia secundários incluem: tempo para o avanço da doença, velocidade de resposta, qualidade de vida e/ou duração da resposta. O rhuMAb 2C4 é administrado de forma intravenosa (IV) semanalmente ou a cada três semanas a 2 ou 4 mg/kg, respectivamente, até o avanço da doença. O

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134/135 anticorpo é fornecido como formulação líquida de múltipla dosagem (20 ml de carga sob concentração de 20 mg/ml ou uma concentração mais alta).

[0325] Exemplos de drogas que podem ser combinadas com o anticorpo (que se liga ao ErbB2 e bloqueia a ativação de ligantes de um receptor de ErbB2) para o tratamento de câncer de pulmão incluem agentes quimioterapêuticos, tais como carboplatina, um taxano (por exemplo, paclitaxel ou docetaxel), gemcitabina, navelbina, cisplatina, oxaliplatina ou combinações de quaisquer destes, tais como carboplatina/docetaxel; outro anticorpo antiErbB2 (por exemplo, um anticorpo anti-ErbB2 inibidor de crescimento tal como Herceptin® ou um anticorpo anti-ErbB2 que induz apoptose, tal como 7C2 ou 7F3, incluindo suas variantes maduras por afinidade ou humanizadas); um inibidor de transferase de farnesila; um agente anti-angiogênico (por exemplo, um anticorpo anti-VEGF); uma droga destinada a EGFR (por exemplo, C225 ou ZD1839); uma citocina (por exemplo, IL-2, IL-12, G-CSF ou GM-CSF); ou as combinações acima.

Exemplo 13

Terapia de Câncer Colo-Retal [0326] O rhuMAb 2C4 é indicado na forma de agente isolado para o tratamento de câncer colo-retal metastático. Objetivos primários para eficácia incluem velocidade de resposta e segurança. Objetivos de eficácia secundários incluem: sobrevivência geral, tempo para o avanço da doença, qualidade de vida e/ou duração da resposta. O rhuMAb 2C4 é administrado de forma intravenosa (IV) semanalmente ou a cada três semanas a 2 ou 4 mg/kg, respectivamente, até o avanço da doença. O anticorpo é fornecido como formulação líquida de múltipla dosagem (20 ml de carga sob concentração de 20 mg/ml ou uma concentração mais alta).

[0327] O rhuMAb 2C4 também é indicado em combinação com quimioterapia para o tratamento de pacientes com câncer colo-retal

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135/135 metastático. Objetivos primários de eficácia incluem sobrevivência geral em comparação com a terapia padrão e segurança. Objetivos de eficácia secundários incluem: tempo para o avanço da doença, velocidade de resposta, qualidade de vida e/ou duração da resposta. O rhuMAb 2C4 é administrado de forma intravenosa (IV) semanalmente ou a cada três semanas a 2 ou 4 mg/kg, respectivamente, até o avanço da doença. O anticorpo é fornecido como formulação líquida de múltipla dosagem (20 ml de carga sob concentração de 20 mg/ml ou uma concentração mais alta).

[0328] Exemplos de agentes quimioterapêuticos utilizados para o tratamento de câncer colo-retal, que podem ser combinados com o anticorpo que se liga ao ErbB2 e bloqueia a ativação de ligantes de um receptor de ErbB2, incluem 5-fluorouracil (5-FU), leucovorina (LV), CPT-11, levamisol ou combinações de quaisquer dois destes ou mais, tais como 5-FU/LV/CPT-11. Podem ser administradas dosagens padrão desses agentes quimioterapêuticos. Outras drogas que podem ser combinadas com o anticorpo anti-ErbB2 para o tratamento de câncer colo-retal incluem um inibidor de transferase de farnesila; um agente anti-angiogênico (por exemplo, um anticorpo anti-VEGF); uma droga destinada a EGFR (por exemplo, C225 ou ZD1839); uma citocina (por exemplo, IL-2, IL-12, G-CSF ou GM-CSF); outro anticorpo anti-ErbB2 (por exemplo, um anticorpo anti-ErbB2 inibidor do crescimento, tal como Herceptin^® ou um anticorpo anti-ErbB2 que induz apoptose, tal como 7C2 ou 7F3, incluindo suas variantes maduras por afinidade ou humanizadas); ou as combinações acima.

Claims (2)

1. ARTIGO INDUSTRIALIZADO, caracterizado por compreender (a) um primeiro recipiente com uma composição nele contida, em que a composição compreende huMAb4D5-8 (trastuzumab); e (b) um segundo recipiente com uma composição nele contida, em que a composição compreende rhuMAb 2C4 compreendendo as sequências variável leve e variável pesada de SEQ ID NOs: 3 e 4, respectivamente.

2. ARTIGO INDUSTRIALIZADO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreender adicionalmente uma bula indicando que huMAb4D5-8 e rhuMAb 2C4 podem ser utilizados para o tratamento de câncer.