NO170487B - Analogifremgangsmaate til fremstilling av terapeutisk aktive vannloeselige camptothecin-analoger - Google Patents

Description

Denne oppfinnelsen vedrører en analogifremgangsmåte ved fremstilling av terapeutisk aktive, vannløselige camptothecinanaloger. Disse hemmer veksten av tumorceller.

Strukturen av DNA-heliksen i eukaryote celler medfører visse topologiske problemer som celleapparatet må løse, for å bruke sitt genetiske materiale som templat. Separasjonen av DNA-trådene er fundamental for celleprosessene som DNA-replika-sjon og transkripsjon. Da eukaryot DNA organiseres til kromatin ved kromosomale proteiner, blir endene hindret, og trådene kan ikke vikles seg ut uten ved hjelp av enzymer som forandrer topologien. Det har lenge vært anerkjent at gjennomføringen av transkripsjons- eller replikasjonskomplekset langs DNA-heliksen ville gjøres lettere ved hjelp av et svivelpunkt som kunne fjerne den torsjonspåkjenningen som skapes ved disse prosessene. Topoisomeraser er enzymer som er i stand til å forandre DNA-topologien i eukaryote celler. De er kritiske for viktige cellefunksjoner og for cellenes fruktbarhet.

Det er to klasser av topoisomeraser i eukaryote celler, type I og type II. Topoisomerase I er et monomert enzym med en molekylvekt på om lag 100.000. Enzymet binder seg til DNA og fører til et transient enkelt-trådet brudd, vikler ut dobbelt-heliksen (eller tillater den å vikle seg ut), og heler deretter bruddet igjen før det fjerner seg fra DNA-tråden.

Topoisomerase II består av to identiske underenheter med en molekylvekt på 170.000. Topoisomerase II kutter transient begge trådene i heliksen, og plasserer et annet dobbelt-trådet segment i bruddstedet.

Camptothecin er et vannuløselig, cytotoksisk alkaloid som finnes i Camptotheca accuminata-treet som er hjemmehørende i Kina og i Nothapodytes foetida-treet som er hjemmehørende i India. Camptothecin og et par nære kongenere derav er den eneste klassen av forbindelser som vites å hemme topoisomer-

ase I.

Hemming av topoisomerase II er hovedformålet for viktige kommersielle oncolytiske midler (f.eks. etoposid, doksorubicin og mitoxantron) så vel som andre oncolytiske midler som fremdeles er under utvikling. Camptothecin (og dets kjente kongenere) har ingen vikrning på topoisomerase II, og ingen av de kjente topoisomerase II inhibitorene har noen signifikant virkning på topoisomerase I.

Camptothecin og dets kjente topoisomerase I inhibiterende kongenere har ikke vist seg å være attraktive for klinisk medi-kamentutvikling som cytolytiske midler fordi de mangler klinisk effektivitet, har ikke-akseptabel dosebegrensende toksisitet, uforutsigbar toksisitet, lav løselighet i vann, og/eller uaksep-tabel lagringsstabilitet. Det er derfor et behov for topoisomerase I inhibiterende midler som ikke har de uønskede egenska-pene ved camptothecin og dets kjente beslektede topoisomerase I inhibiterende kongenere. Forbindelsene ifølge denne oppfinnelsen fyller et slikt behov.

Denne oppfinnelsen vedrører fremstilling av en forbindelse med formelen

hvori:

X er hydroksy; hydrogen; cyano; -CH2NH2; eller -CHO;

R er hydrogen når X er cyano; CH2NH2 eller -CHO;

eller R er -CHO eller -CH^1 når X er hydrogen eller hydroksy;

R<1> er -O-R<2>; -S-R<2>; -N-R<2>(R<3>) ;-CH2N-R2(R3) , eller -N<+->R2(R3)(R*), forutsatt at når R<1> er -N+-R2 (R3) (R<A>) er forbindelsen bundet til et farmasøytisk akseptabelt anion;

R<2>, R3 og R* er de samme eller forskjellige og velges fra H;

Ci.g-alkyl; C2.6-hydroksyalkyl; C^-dialkylamino; eller en fenyl eller cykloheksyl; og

når R<1> er -N-R2(R3) , kan R<2-> og R<3->gruppene kombineres sammen med nitrogenatomet som de er bundet til under dannelse av en morfolin- eller N-metylpiperazino- og 4'-piperidinopiperidinyl-ring;

eller et farmasøytisk akseptabelt salt, hydrat eller solvat derav.

Det erkjennes at p.g.a. det asymmetriske karbonatomet i E-ringen av forbindelsene med formelen (I) (dvs. karbonatom

nr. 20), vil det eksistere optiske isomerer. S-isomeren er den foretrukne isomeren, imidlertid omfattes R-isomeren og den racemiske blandingen (racematet) også innenfor rammen av forbindelsene med formelen (I).

Farmasøytisk akseptable salter og deres fremstilling er velkjent for spesialister på området. Foretrukne farmasøytisk akseptable salter av forbindelser med formel (I) omfatter acetat, metansulfonat og hydroklorid, såsom mono- og di-hydroklorid, så vel som alkalimetallsalter av forbindelsene med formel (I), såsom natrium, hvori E-ringlaktonet er blitt under-kastet basisk hydrolyse.

Farmasøytisk akseptable anioner av kvaternære salter er velkjent for spesialister på området. Foretrukne farmasøytisk akseptable salter av forbindelser med formel (I) hvor R<1> er

-N<+->R<2>(R<3>) (R<A>) omfatter metansulf onat og klorid.

Forbindelsene med formel (I) kan danne hydrater eller solvater. Det er kjent for spesialister på området at ladede forbindelser danner hydratiserte utgaver når de lyofiliseres med vann, eller danner solvatiserte utgaver når de konsentreres i en løsning med et egnet organisk løsningsmiddel.

Forbindelsene med formel (I) fremstilles ifølge oppfinnelsen fra 10-hydroksycamptothecin via en Mannich-reaksjon. Kondensasjon av 10-hydroksycamptothecin med formaldehyd og et primært eller sekundært amin (Mannich-reaksjon) gir alle forbindelsene med formelen (I) unntatt den forbindelsen hvor X er hydrogen; cyano; eller formyl, og R<1> er -N-R2 (R3) og R2 og R<3> er de samme og er H. Alternativt formyleres ifølge oppfinnelsen 10-hydroksycamptothecin (Duff-reaksjon) og gir 9-formyl-10-hydroksycamptothecin som deretter kan undergå kondensasjon med aminer etterfulgt av kjemisk reduksjon med natriumcyanoborhydrid eller katalytisk reduksjon (Pd/C, H2) for å gi produkter analoge med dem som er dannet via Mannich-reaksjonen, så vel som forbindelsen med formel (I) hvori R<1> er -N-R<2>(R<3>) og R<2> og R3 er de samme og er H. Forbindelser med formelen (I) hvor R<1> er -N<+->R<2>(R<3>) (R<A>) og R<2>, R3 og R4 ikke er H, kan oppnås ved behandling av de tilsvarende forbindelsene med formel (I) hvori R<1> er -N-R<2>(R<3>) med et alkyleringsmiddel. Mannich-reaksjonen er åpenbart av Magarian et al., J. Pharm. Sei., 56, 987 (1967). Duff-reaksjonen er åpenbart av Duff et al., J. Chem. Soc., 547 (1941).

Forbindelser med formel (I) hvor R<1> er O-R<2> eller S-R<2>, fremstilles ifølge oppfinnelsen fra 9-dimetylaminometyl-10-hydroksycamptothecin eller dets salt ved oppvarming med den passende alkoholen eller tiolen i et inert løsningsmiddel såsom dimetylformamid. Når den frie basen anvendes, tilsettes en liten mengde sterk syre, såsom saltsyre. Slike derivater kan også dannes direkte i Mannich-reaksjonen når alkoholen eller tiolen tilsettes til reaksjonsblandingen, og en sterk syre tilsettes, eller aminkomponenten er i form av et salt av en sterk syre.

Forbindelsene med formelen (I) hvor X er hydrogen, cyano, formyl eller aminometyl, fremstilles ifølge oppfinnelsen fra forbindelsen med formelen (II) ved palladium-katalysert karbonylering. Palladium-katalysert karbonylering av aryltriflater er åpenbart av Cacchi et al., Tetrahedron Letters, 27., 3931, 5541, (1986): Petrakis et al., J". Amer. Chem. Soc.. 109, 2831

(1987) og Chatani et al., J. Org. Chem.. 51, 4714 (1986).

Utgangsmaterialet for fremstillingen av forbindelsene med formelen (I), dvs. 10-hydroksycamptothecin, er et naturprodukt som finnes i den samme planten som camptothecin [se Wani et al., J. Org. Chem.. 34, 1364 (1969)]. 10-metoksycamptothecin er også blitt isolert fra den samme planten som camptothecin, og kan omdannes til 10-hydroksycamptothecin ved tilbakeløp med hydro-genbromid. Selve camptothecinet kan også omdannes til 10-hydroksycamptothecin ved reduksjon av pyridinringen etterfulgt av oksydasjon med blytetraacetat [se, Yakult Honsha K.K., japansk patentsøknad nr. 9005188, innlevert 30. juni 1982]. Racemisk 10-hydroksycamptothecin kan også fremstilles ved fremgangsmåten til Wani et al., J. Med. Chem. , 23., 554 (1980). Et stort antall fremgangsmåter for den totale syntesen av camptothecin er rap-portert. Se f.eks. Hutchinson, Tetrahedron. 37, 1047 (1981) og Suffness og Coldel, "The Alkaloids. Chemistry and Pharmacology", Brossi, A., utgiver, vol. 25, Academic Press, Orlando Florida, 73 (1985), for oversikter. Den mest praktiske veien (heretter referert til som Wani-metoden) for fremstilling av camptothecin som er racemisk ved karbonet i 20-stilling som er beskrevet av Wani et al., J Med Chem.. 23, 554 (1980).

Anvendelse av forbindelser med formel ( I)

a: Cvtotoksisitet

Acetatsaltet av forbindelsen med formelen (I) hvori R er dimetylaminometyl (S-isomeren) (heretter referert til som "Forbindelse nr. IS") demonstrerte kraftig antiproliferativ- aktivitet i flere forskjellige dyrkede cellelinjer (tabell 1). I en serie på 8 dyrkede humane kolontumorcellelinjer var forbindelse nr. IS ganske konsistent i sin cytotoksiske evne. Ved en kort eksponering (2 timer) for medikamentet var den 50% inhibiterende konsentrasjonen i området fra 0,12 - 2,1 ng/ ml. Dersom medikamentet ble etterlatt i kulturmediet for hele den 7-døgns perio-den som cellene fikk formere seg i, var IC50-verdiene i området fra 3,9 - 75 /xg/ml.

Tre tumorcellelinjer fra gnagere og to "normale" cellelinjer fra gnagere ble også evaluert for sensitivitet mot forbindelse nr. IS. K12/Tr koloncarcinomet og epiteliale cellelinjer fra nyre og innvoller hos rotte ble evaluert i det samme eksperimentet ved å anvende det endepunktet som ble brukt i de humane kolontumorcelleeksperimentene. Disse gnagercellene hadde en sensitivitet tilsvarende de minst sensitive humane kolontumorcellelinjene, CACO-2 og WiDR. Tumorcellelinjene hos mus, L1210 leukemi og B16 melanom, var ikke mere sensitive til forbindelsen nr. IS enn de humane kolontumorcellelinjene. I virkeligheten syntes B16 melanomcellelinjen å være betydelig mindre sensitiv enn de andre cellelinjene som ble testet. Spesielt er både B16 og L1210 ganske sensitive til forbindelse nr. IS in vivo ved terapeutiske forsøk i tumorbærende mus.

Den protokollen som ble brukt for å evaluere cytotoksi-siteten av forbindelse nr. IS i de cellelinjene som er listet opp i tabell 1, var vanligvis som følger:

Cellelinjene anvendes og vedlikeholdes som monolagkulturer 1 minimalt essensielt medium (Grand Island Biological Co., Grand Island, N.Y.) supplementert med 10% fetalt kalveserum i en 5% C02 fuktig inkubator ved 37°C. Forskjellige konsentrasjoner av en formel (I) forbindelse under sterile betingelser fikk reagere i 2 timer, etterfulgt av aspirasjon av mediet, eller ble eksponert kontinuerlig. Platene inkuberes i 7 døgn ved 37°C i en C02-inkubator. Mediet ble aspirert, og cellene ble fiksert og farget med etanol og Geisma-farge. Den overlevende cellebefolk-ningen ble bestemt ved scanning av platene med en bildeana-lysator. Prosenthemming av formeringen ble bestemt i forhold til de cellene som ble inkubert i fravær av medikamentet, og den 50% inhibiterende konsentrasjonen (IC50) ble bestemt ved interpolering.

Flere forskjellige forbindelser med formelen (I) ble evaluert for cytotoksisitet mot L1210 leukemi-celler som ble dyrket i suspensjonskultur (tabell 2). Celler ble eksponert kontinuerlig etter kloning i et medium som inneholdt 0,2% Nobel agar. Etter inkubering ved 37°C i C02-inkubator i 3 døgn, ble kolonier farget med levedyktig celle-spesifikk formazanfarge, og 24 timer senere ble de telt med en koloniteller (Biotran II, New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ) justert til å identifisere kolonier med mer enn 50 celler. Den konsentrasjonen som reduserte kloningsvirkningsgraden med 50% (IC50) ble bestemt ved interpolering. Formel (I) forbindelser hadde IC50-verdier på 12 til 690 nM, dvs. IC50-verdier som skulle innebære cytotoksisk aktivitet. Det beslektede naturproduktet, 10-hydroksy-camptothecin, hadde en IC50 på 18 nM. Cytotoksiske forbindelser med formel (I) er kraftige inhibitorer for renset topoisomerase I. Som vist i det følgende avsnittet som gjelder in vivo-aktivitet, hadde flere formel (I)-forbindelser, skjønt de vanligvis var mindre cytotoksiske enn 10-hydroksycamptothecin, en antitumoraktivitet mot L1210 leukemi in vivo som var likeverdig med eller overlegen i forhold til aktiviteten av 10-hydroksycamptothecin. F.eks. var forbindelse nr. IS om lag 3 ganger mindre kraftig enn 10-hydroksycamptothecin med hensyn til cytotoksisk evne mot L1210 leukemi-celler in vito, men utviste in vivo tumorcellevekst-inhibiterende aktivitet som vanligvis var bedre enn 10-hydroksy-camptothecin i flere forskjellige transplanterbare tumormodeller hos gnagere. For in vivo-studier ble L1210-celler implantert i.p. (IO<6> pr. mus) og medikamenter ble administrert i.p. på dag 1 og 5. Økning i levetid (ILS) ble basert på median-overlevingstiden for grupper av 6 mus behandlet med den maksimalt tolererte dosen av medikamentene.

<*>Høyeste dose som ble testet (grad av aktivitet sannsynligvis større ved et høyere dosenivå).

For in vitro-studier ble L1210-celler dyrket i suspensjonskultur og eksponert for medikamenter kontinuerlig ved kloning av celler i bløt agar. Kloningsvirkningsgraden ble bestemt. 50% inhibiterende konsentrasjon (IC50) ble bestemt ved interpolering.

Alle forbindelser listet ovenfor var effektive inhibitorer for topoisomerase I og renset for humane kolonkreftceller: 50% inhib itering av enzymaktiviteten ble observert ved konsentrasjoner på

< 3/iM.

b. In vivo- inhibiterina av tumorcellevekst

Forbindelser med formelen (I) ble til å begynne med evaluert for in vivo antitumor-aktivitet hos mus med intraperitonealt (ip)-implantert L1210 leukemi (tabell 2). Forbindelse nr. IS og forbindelsene nr. 4S-13S forlenget levetiden for tumor-bærende mus med >40% ved de respektive maksimalt tolererte dosenivåene. Tre forbindelser - forbindelser nr. IS, 6S og 11S - var spesielt aktive, og forlenget levetiden med >200%, og resulterte i langtids tumorfrie overlevende. Et antall forbindelser hadde en aktivitet som var overlegen i forhold til aktiviteten av det naturlige produktet, 10-hydroksycamptothecin, som formel (I) forbindelser er strukturelt beslektet med. For to av forbindelsene - forbindelse nr. 7S og 13S - var den høyeste testede dosen ikke toksisk, således kan disse forbindelsene ha større aktivitet ved høyere dosenivå. Allikevel var disse forbindelsene aktive ved de testede dosenivåene.

Basert på sin høye grad av aktivitet og potens in vivo (dvs. lav maksimalt tolerert dose) ble forbindelse nr. IS evaluert i flere"transplanterte murine tumormodeller. Forbindelse nr. IS har en høy grad av aktivitet ved sin maksimalt tolererte dose i flere forskjellige animalske tumormodeller, omfattende leukemier og faste tumorer av forskjellig histiotype. Aktivitetsspekteret for forbindelse nr. IS er satt sammen i tabell 3. Et høyt aktivitetsnivå ble observert i de fleste tumormodellene, mens bare én av modellene, ip kolon-carcinom 26, viste seg å være nesten fullstendig umedgjørlig for medikamentet. Også to av sc-modellene, kolon-carcinom 26 og Madison lunge-carcinom, viste seg å være noe umedgjørlige for medikamentet; dvs. i disse modellene viste det seg å være lav aktivitet, dvs. >70% inhibitering av tumorveksten, når mus med subkutane tumorer ble behandlet med forbindelse nr. IS. I de andre sc tumor-modellene viste det seg å være høy aktivitet (mer enn 90% inhibitering). Spesielt forbindelse nr. IS administrert ip viste seg å ha høy aktivitet ikke bare mot ip tumor-modeller, men i mus inokulert med tumorer intravenøst (iv) eller subkutant (sc). Kurativ aktivitet var åpenbar i visse tumormodeller omfattende ip- og iv-implantert P388 og L1210 leukemi og iv- og sc-implantert Lewis lungecarcinom. Nivået og aktivitetsspekteret for forbindelse nr. IS i animalske tumormodeller kan sammenlignes fordel-aktig med de bredest effektive av de kjente antitumormedikamentene, såsom cyklofosfamid, cisplatin og doksorubicin.

Resultatene av disse transplanterte murine tumormodellstudi ene er sammensatt i større detalj i tabell 4, som viser forlen-gelsen av levetiden (ILS) eller % inhibitering av målbar (dvs. subkutan) fast tumorvekst som ble oppnådd med optimale doser og optimale administrasjonsprogram for forbindelse nr. IS. Også vist i tabell 4 er resultater som ble oppnådd i komparative studier av disse tumormodellene med de opprinnelige forbindelsene i naturlig form, camptothecin og 10-hydroksycamptothecin. Disse resultatene ble oppnådd med ip eller iv administrasjon av forbindelse nr. IS med et intermittent program (dvs. hver fjerde eller syvende dag). I noen tilfeller ble resultatene oppnådd med et optimalt behandlingsregime, hvori forbindelse nr. IS ble administrert med et oppsplittet doseregime (hver 3. time x 4) på hver dag av behandlingen, hvilket er beskrevet i mere detalj nedenfor. Camptothecin og 10-hydroksycamptothecin ble alltid administrert som suspensjoner ip, p.g.a. sin uløselighet i vandige bærere.

Det fremgår av tabell 4 at alle tre forbindelsene har et bredt aktivitetsspektrum i animalske tumormodeller. Overlegen aktivitet for forbindelse nr. IS er åpenbar i flere tumormodeller inklusive: ip L1210 leukemi, ip B16 melanom, iv P388 leukemi, iv L1210 leukemi, sc Lewis lungecarcinom, sc B16 melanom, sc B16 melanom/F10 subline, sc koloncarcinom 51, og sc Madison lungecarcinom. 10-hydroksycamptothecin er ganske aktiv i ip implanterte tumormodeller, men har dårligere aktivitet i tumor-modeller, hvor tumoren er implantert på et sted langt fra det stedet hvor medikamentet administreres; dette medikamentet har, i beste fall, minimal aktivitet i sc-implanterte faste tumor-modeller. Dette er sannsynligvis ikke p.g.a. den dårlige løse-ligheten av 10-hydroksycamptothecin, da camptothecin er like uløselig, men er ganske aktiv i visse sc tumormodeller. Det er mulig at den aromatiske hydroksylgruppen i 10-hydroksycamptothec in er tilbøyelig til konjugasjon i første passering og utskil-ling i gallen, og at forbindelsen således ikke oppnår tilstrek-kelige konsentrasjoner i den systemiske sirkulasjonen. Spesielt er forbindelse nr. IS, som også har en 10-hydroksylgruppe, høyst aktiv i sc og iv tumormodeller. Dette kan skyldes nærværet av den basiske sidekjeden i 9-stillingen i forbindelse nr. IS som kan hemme metabolismen av 10-hydroksylgruppen ved sterisk hind-ring, hydrogenbinding eller indre saltdannelse. 10-hydroksy-camptothecin er høyst aktiv i ip-koloncarcinom 26 som er insens-itiv for forbindelse nr. IS og minimalt sensitiv for camptothecin. Den samme tumoren lar seg imidlertid ikke påvirke av 10-hydroksycamptothecin når den implanteres sc, men har dog svak sensitivitet for forbindelse nr. IS ved denne plasseringen.

I tillegg til den høye graden og det brede spektrum av aktivitet for forbindelse nr. IS som demonstrert i tabell 4, synes forbindelsen også å beholde sin fulle antitumoraktivitet når den administreres oralt. Dette ble demonstrert i mus med sc-implantert Lewis-lungecarcinom, og er beskrevet i detalj nedenfor. Et annet karakteristisk trekk ved forbindelse nr. IS er dens retensjon av aktivitet i underlinjer av P388 leukemi, som utviser resistens mot multiple antitumormedikamenter som beskrevet nedenfor. Da et større problem i kreftkjemoterapien er at det oppstår resistente cellepopulasjoner som ikke vil respondere på medikamentregimer som til å begynne med er effektive, så vel som behandlingsregimer i andre linje, bør tilgjen-geligheten av medikamenter som resistente celler ikke er kryss-resistente mot, ha en betydelig innvirkning på kreftterapien.

Aktiviteten av forbindelse nr. IS i hver av tumormodellene som er blitt testet, er beskrevet i mere detalj i de følgende avsnitt.

ip Tumormodeller

Aktiviteten av forbindelse nr. IS administrert ip eller sc etter forskjellige behandlingsprogram til mus med ip-implanterte tumorer, er vist i tabell 5. Disse data demonstrerer doseavheng igheten av antitumoreffekten av forbindelse nr. IS i seks ip-implanterte tumormodeller.

P388 Leukemi: Når forbindelse nr. IS ble gitt ip på dagene 1 og 5 til mus med ip P388 leukemi, frembrakte den >200% ILS med 4/6 langtids overlevende (helbredede) ved den maksimalt tolererte dosen på 15 mg/kg. Lavere doser var også høyst effektive med en økning i levetiden på 125 og 92%. Denne høye aktivitetsgrad ble bekreftet i et annet eksperiment beskrevet senere (se tabell 8) hvori den maksimalt tolererte dosen frembrakte 228% ILS med 2/6 langtids overlevende. Forbindelse nr. IS hadde således kurativ ativitet i mus med ip P388 leukemi.

L1210 Leukemi: Når forbindelse nr. IS ble gitt ip på dagen e 1 og 5, var den reproduserbart aktiv i mus med ip L1210 leukemi. I det representative eksperimentet vist i tabell 5 var det 219% ILS med 2/6 helbredelser ved den maksimalt tolererte dosen på 15 mg/kg. God aktivitet ble likeså observert ved to lavere doser. Forbindelse nr. IS ble evaluert med dette programmet i åtte ytterligere studier over doseresponsen. Prosenten ILS og langtids overlevende som ble oppnådd ved de maksimalt tolererte dosene i disse eksperimentene var: 44% (0/6), >300% (5/6), 119%

(0/6), 156% (1/6), 138% (0/6), 156% (2/6), 350% (2/6) og 138%

(1/6). I 8/9 eksperimenter frembrakte således forbindelse nr. IS >100% ILS, og i 6/9 eksperimenter var det langtids overlevende.

Bl6 Melanom: I denne tumormodellen, hvori forbindelse nr. IS var markert overlegen i forhold til camptothecin og 10-hydroksycamptothecin (se tabell 4), frembrakte medikamentet 152% ILS ved sin maksimalt tolererte dose på 15 mg/kg, når det ble gitt ip på dagene 1, 5, 9 og 13. Dette resultatet ble bekreftet i et andre eksperiment hvori den høyeste dosen som ble testet, 9,6 mg/kg, frembrakte 130% ILS.

B16 Melanom/ F10 underlinne: F10 underlinjen av B16 melanom er en svært metastatisk underlinje av denne tumoren, som ble selektert ved kloning. Forbindelse nr. IS frembrakte 105% ILS ved sin maksimalt tolererte dose på 15 mg/kg, når den ble gitt ip på dagene 1, 5, 9 og 13. Aktivitet, som vist ved en økning i levetiden på >40%, var åpenbar ved ytterligere to lavere doser.

M5076 Sarcom: M5076 sarcomet er et metastatisk retikulum-cellesarcom som fremkom i eggstokken hos en C57B1/6 mus, og ble etablert som en transplantert tumor. Denne tumoren, implantert ip, var sensitiv for forbindelse nr. IS når medikamentet ble administrert sc så vel som ved medikamentadministrasjon ip. Aktivitetsgraden var i virkeligheten identisk, 98% ILS og 105% ILS, ved de to administrasjonsmåtene med splittdoseringsprogram-met hver 3. time x 4 på dagene 1, 5 og 9. Dette programmet, som beskrevet nedenfor, synes å være optimalt for forbindelse nr. IS i flere tumormodeller. Forbindelse nr. IS ble evaluert i 3 ytterligere studier over doseresponsen hos mus med ip M5076 sarcom; i disse studiene ble medikamentet gitt som en enkelt dose på dagene 1, 5 og 9 ip (75% ILS med 1/8 helbredelser), som en enkelt dose på dagene 1, 5, 9 og 13 ip (71% ILS med 1/8 helbredelser), og som en enkelt dose på dagene 1, 5 og 9 sc (57% ILS). Som i iv og sc tumormodeller (som beskrevet nedenfor), synes forbindelse nr. IS å være mest effektiv i ip M5076 sarcom, når den administreres etter et behandlingsregime med oppdelt dosering. Uten hensyn til administrasjonsprogrammet er forbindelse nr. IS allikevel reproduserbart aktiv i denne tumormodellen.

Koloncarcinom 26: Koloncarcinom 26 er en svært aggresiv og metastatisk udifferensiert kolon tumormodell. I det programmet den ble utprøvet i, viste denne tumoren seg å være upåvirkelig for en maksimalt tolerert dose av forbindelse nr. IS.

iv Tumormodeller

Aktiviteten av forbindelse nr. IS administrert ip eller iv til mus med systemiske (iv-inokulerte) leukemier eller Lewis lungecarcinom er vist i tabell 6. Doseresponsen og programavhen gigheten for forbindelse nr. IS demonstreres klart ved disse studiene. I hver av de tre tumormodellene viste forbindelse nr. IS kurativ aktivitet.

P388 Leukemi: P388 leukemi er vanligvis mye mindre medika-mentsensitv når den implanterers iv enn når den inokuleres ip. Forbindelse nr. IS var imidlertid sterkt aktiv mot iv P388 leukemi enten den ble gitt ved sin maksimalt tolererte dose på dagene 1 og 5 ip (279% ILS med 2/6 helbredelser) eller iv (250% ILS med 2/6 helbredelser). I et tredje eksperiment i denne tumormodellen frembrakte forbindelse nr. IS 125% ILS med 1/6 helbredelser ved en maksimalt tolerert dose på 15 mg/kg gitt ip på dagene 1 og 5.

L1210 Leukemi: Forbindelse nr. IS viste seg å være repro-duserbar og sterk aktiv mot iv-implantert L1210 leukemi. Ut-strakte programavhengighetsstudier ble utført i denne tumormodellen med medikamentet administrert iv. Som vist i tabell 6 resulterte administrasjon i et oppdelt doseregime i en høyere aktivitetsgrad over et bredere doseringsområde. Kurativ aktivitet ble observert når medikamentet ble administrert iv på dagene 2 og 6 som en enkelt dose eller som 4 doser med 3 timers mellomrom. I tillegg til de data som er vist i tabell 6, er det 10 doseresponsstudier med iv-administrert forbindelse nr. IS i mus med iv L1210 leukemi. Resultatene er som følger: dagene 2 og 6, 171% ILS med 2/6 helbredelser; 4 behandlinger med 3 timers mellomrom på dagene 2 og 6, >300% ILS med 6/6 helbredelser; tre behandlinger med 6 timers mellomrom på dagene 2 og 6, 200% ILS med 2/7 helbredelser; 2 behandlinger med 12 timers mellomrom på dagene 2 og 6, 229% ILS med 2/7 helbredelser, enkeltbehandlinger på dagene 2 til 6; 143% ILS og 129% ILS; 2 behandlinger med 12 timers mellomrom på dagene 2 til 6, 193% ILS og 171% ILS; en enkelt dose på dag 2, 114% ILS; og 4 behandlinger med 3 timers mellomrom på dag 2, 244% ILS med 1/6 helbredelser. Forbindelse nr. IS syntes å være mest effektiv når den ble administrert etter et program hver 3. time. Den er mindre effektiv når den gis daglig enn når den gis hver 4. dag. Det optimale programmet fra disse studiene ble anvendt for visse faste tumorer som disku tert ovenfor for ip M5076 sarcom og som beskrevet nedenfor. I flere forskjellige tumorsystemer økes aktivitetsgraden og det effektive doseringsområdet er bredere, når forbindelse nr. IS gis etter et program med oppdelt dose (dvs. hver 3. time ganger 4) •

Lewis lungecarcinom: Lewis lungecarcinom er en svært metas tatisk, udifferensiert lungekreft som er blitt anvendt i stor utstrekning for evaluering av medikamenter. Denne tumormodellen er upåvirkelig for mange av de etablerte antitumormedikamentene, og når den ble anvendt som screeningssystem, identifiserte den svært få forbindelser som aktive. Forbindelse nr. IS er kurativ i denne kjemorefraktære tumormodellen, hvori tumoren inokuleres iv, hvilket resulterer i tumorknuter i lungene. Kurativ aktivitet i denne tumormodellen er et uvanlig resultat.

Som det fremgår av alle tre av de iv-inokulerte tumormodellene, er forbindelse nr. IS ganske effektiv mot systemiske tumorer når den administreres ip så vel som iv.

sc Tumormodeller

Forbindelse nr. IS ble evaluert i 10 faste tumormodeller, hvori tumorene ble implantert sc, og medikamentet ble administrert ip, iv eller oralt (po). I disse modellene bestemmes antitumoraktiviteten ved graden av hemming av tumorveksten på stedet for tumorimplanteringen. Tumorene måles vanligvis 2 til 3 uker etter tumorimplanteringen da store tumorer (>500 mm<3>) er åpenbare i ubehandlede kontrolldyr. For svært metastatiske faste tumorer kan overlevingstiden også anvendes som et mål på medikamentaktiviteten. For mindre metastatiske tumormodeller er overlevingstiden for ubehandlede dyr svært variabel, og dyrene kan overleve i lange perioder med ekstremt svære tumorer som ofte danner sår og blir infisert. Forbindelse nr. IS var svært effektiv i 8 av de 10 sc faste tumormodellene, idet den hemmet tumorveksten med over 90% ved sin maksimalt tolererte dose (tabe 11 7). Fullstendig hemming av tumorveksten i de svært metastatiske tumorene omfattende Lewis lungecarcinom, B16 melanom, B16 melanom/F10 underlinje, og M507 6 sarcom ble etterfulgt av en forlengelse av levetiden. Selv i de mindre responsive tumor-modellene, Madison lungecarcinom og koloncarcinom 26, hadde forbindelse nr. IS en viss tumorveksthemmende aktivitet med >7 0% inhibitering åpenbart ved den maksimalt tolererte dosen.

Lewis lungecarcinom: Denne svært metastatiske lungetumoren var mest sensitiv for forbindelse nr. IS av de tumormodellene som ble undersøkt. Dette er et uvanlig resultat, da Lewis lunge-carcinom er blitt bredt anvendt ved studiet av antitumormedikamenter, og lar seg ikke påvirke av de fleste av de kjente antitumormedikamentene. Når den ble gitt ip på dagene 1, 5, 9 og 13, viste det seg at forbindelse nr. IS fullstendig hemmet veksten av Lewis lungecarcinom i praktisk talt alle mus som ble behandlet med 15 eller 9 mg/kg. Ved den maksimalt tolererte dosen ble 4 av 8 mus helbredet. På tidspunktet for tumormål-ingen (dag 14) var tumorene i ubehandlede kontroller i gjennomsnitt 1685 mm<3> i volum. I et andre eksperiment ble forbindelse nr. IS administrert iv og po på dagene 1, 5 og 9. Ved begge administreringsmåtene var det 99% hemming av tumorveksten (TGI), idet halvparten eller flere av dyrene ikke viste noe tegn til tumor ved tidspunktet for målingen (dag 13). Dessuten var den maksimalt tolererte dosen ved begge administrasjonsmåtene praktisk talt den samme, hvilket antyder at forbindelse nr. IS har utmerket biotilgjengelighet ved oral administrasjon. I dette eksperimentet viste det seg at tumorene vokste på implanterings-stedet, hvilket viste enten at ip-behandlingen er optimal i denne tumormodellen, eller at lengre varighet av behandlingen er nødvendig for kurativ aktivitet.

B16 melanom: Denne metastatiske melanommodellen er blitt bredt anvendt for å evaluere og screene for antitumormedikamente r. Når den implanteres sc, er denne tumoren upåvirkelig for de fleste antitumormedikamenter. Forbindelse nr. IS ble evaluert i mus med sc B16 melanom i tre studier over doseresponsen. Når den ble gitt som en enkelt dose på dagene 1, 5 og 9, frembrakte en maksimalt tolerert dose av forbindelse nr. IS administrert ip eller iv, 99% tumorvekstinhibitering (TGI), idet de fleste av dyrene ikke hadde noen målbare tumorer på dag 16 eller 14, mens kontrollmusene hadde tumorer på gjennomsnittlig 864 og 758 mm<3> i de to eksperimentene. Når den ble gitt etter det optimale behan dlingsprogrammet med oppdelt dose, som er beskrevet ovenfor, frembrakte forbindelse nr. IS fullstendig tumorvekstinhibitering over et bredere doseringsområde. Dette er i samsvar med de resultatene som ble oppnådd i andre tumormodeller. I sc B16 melanommodellen vokste tumorene til slutt i alle de behandlede dyrene, og det var ingen helbredelser. I denne metastatiske tumormodellen var det allikevel en forlengelse av levetiden, som forekom med den fullstendige inhibiteringen av tumorveksten. Etter regimet med oppdelt dosering var det 52% ILS, mens en eneklt ip-dose på 24 mg/kg på dagene 1, 5 og 9 forlenget levetiden med 39%. Etter dette siste programmet resulterte iv-administrasjon i 53% ILS.

Bl6 Melanom/ Fl0 underlinne: Denne underlinjen av B16 melan om, utvalgt for økte metastatiske egenskaper, var lik det opprinnelige B16 melanom i sin respons på forbindelse nr. IS. Behandling ip på dagene 1, 5, 9 og 13 førte til fullstendig inhibitering av tumorveksten ved den maksimalt tolererte dosen. Behandling iv på dagene 1, 5 og 9 inhibiterte tumorveksten med 97% ved to doseringsnivå. I disse eksperimentene ble tumorene målt på dag 16, og tumorene i kontrollmusene var svært store, gjennomsnittlig 1927 og 1196 mm<3>. Tumorene i alle behandlede gruppene viste seg til slutt å vokse, og det var ingen helbredelser, ip-behandling ved 25 mg/kg resulterte imidlertid i 70% økning i levetid (ILS); iv-behandling ved det samme doserings-nivået ga 38% ILS.

ADJ- PC6 Plasmacytom: Denne tumormodellen, som er mest beslektet med humankreft i multippelmyeloma, var høyst sensitiv for forbindelse nr. IS administrert ip på dagene 1, 5, 9 og 13. Tumorene ble målt på dag 19 og var i gjennomsnitt 828 mm<3> i volum i kontrollmusene. Forbindelse nr. IS frembrakte >90% inhibiteri ng av tumorveksten ved fire dosenivåer ved eller under den maksi malt tolererte dosen. Det var 1 av 8 langtidstumorfrie overlevende ved hvert av de tre høyeste dosenivåene. Da denne tumoren ikke er svært metastatisk, ble medianoverlevingstiden ikke bestemt.

M5076 Sarcom: M5076 sarcomet implantert sc var ganske sensitivt for forbindelse nr. IS med >90% TGI ved tre dosenivåer ved eller under en maksimalt tolerert dose. Tumorene ble målt på dag 17, da kontrolltumorene gjennomsnittlig var 1045 mm<3>. Medikamentet ble administrert ip på dagene 1, 5, 9 og 13. Medik amentet var ikke kurativt i denne modellen, men forlenget levetiden med 31%.

Mamma- adenocarcinom 16/ C: Denne brysttumormodellen er en transplanterbar underlinje av den spontane brysttumoren i C3H-musen. Forbindelse nr. IS inhibiterte tumorveksten med 96% ved den maksimalt tolererte dosen på 10 mg/kg når den ble gitt ip på dagene 1, 5, 9 og 13. Tumorene ble målt på dag 19, da det gjennomsnittlige tumorvolumet i kontrollmusene var 63 0 mm<3>. I et andre eksperiment under det samme behandlingsprogrammet frembrakte forbindelse nr. IS 73% tumorvekstinhibitering (TGI) i mammaadenocarcinom 16/C. Da denne tumoren ikke er svært metastatisk, ble dyrene ikke holdt i live.

Kolon- adenocarcinom 38: Denne ikkemetastiske kolon tumormodellen er blitt svært meget anvendt til evaluering av medikamenter, og ansees å være én av de mere medikamentupåvirkelige tumormodellene. Forbindelse nr. IS ble administrert ip som enkeltdose eller i et regime med oppdelt dose på dagene 3, 10, 17 og 24. Det mere forlengede behandlingsregimet ble valgt p.g.a. den langsomme veksten av denne faste tumoren. Tumorene ble målt på dag 31, og var gjennomsnittlig bare 349 mm3 i ubehandlede kontroller. Som i andre tumormodeller var forbindelse nr. IS mere effektiv i programmet med oppdelt dose, som frembrakte >90% inhibitering ved to dosenivå. God aktivitet (89% TGI) ble observert også i enkeltdoseregimet. Kolon- adenocarcinom 51: Dette er en annen langsomtvoksende kolontumormodell som har vist seg å være upåvirkelig av de flest e antitumormedikamentene. Den protokollen som ble brukt for denne tumoren var lik den for kolon-adenocarcinom 38. Forbindelse nr. IS var aktiv mot kolon-adenocarcinom 51, idet den frembrakte 88% TGI med enkeltdoseregime, og 92% TGI med en behandling med oppdelt dose. Som i andre tumorer var forbindelse IS effektiv over et bredere doseringsområde, når den ble gitt etter det oppdelte doseregimet. Kolon-adenocarcinom 51 ble målt på dag 24, da kontrolltumorene var i gjennomsnitt 766 mm<3>.

Madison lun<g>ecarcinom: Madison lungecarcinom, lik Lewis lungecarcinomet, er en hurtigvoksende udifferensiert tumormodell med høy metastatisk aktivitet. I motsetning til Lewis lungetumoren er Madison lungetumoren ikke svært sensitiv for forbindelse nr. IS. Med et enkelt doseregime gitt iv på dagene 1, 5 og 9, er det praktisk talt ingen tumorvekstinhibitering (28% TGI) ved en maksimalt tolerert dose. I to ytterligere eksperimenter med det samme behandlingsprogrammet med medikamentet gitt ip, frembrakte forbindelse nr. IS bare 50% og 23% TGI. Med det optimale regimet med oppdelt dose viste imidlertid forbindelse nr. IS, administrert iv, aktivitet mot Madison lungecarcinom med 85% TGI ved den maksimalt tolererte dosen. Medikamentet var noe mindre effektivt i dette behandlingsprogrammet, når det ble gitt ip (74% TGI ved den maksimalt tolererte dosen). Madison lunge-tumorene ble målt på dag 12 eller 13 i to adskilte eksperimenter, da tumorene i kontrollmusene var i gjennomsnitt henholdsvis 1571 og 942 mm<3>, hvilket gjenspeiler den høye veksthastigheten for denne tumoren. Endog i en upåvirkelig tumor kan administrasjon av forbindelse nr. IS i sitt optimale behandlingsregime således føre til en signifikant tumorvekstinhibitering.

Koloncarcinom 26: I denne høyst aggresive og metastatiske udifferensierte kolontumoren, frembrakte forbindelse nr. IS bare marginal tumorvekstinhibitering (72% TGI) når den ble gitt ip i sin maksimalt tolererte dose på dagene 1, 5, 9 og 13. Tumorene ble målt på dag 19, da kontrolltumorene var i gjennomsnitt 1052 mm<3>. Det er ukjent hvorvidt forbindelse nr. IS ville vist god aktivitet i denne tumormodellen, dersom den var blitt administre rt etter sitt optimale regime med oppdelt dose.

Multimedikamentresistente underlinn er

Selv om det mest signifikante problemet i kreftbehandlingen er den inherente ufølsomheten hos de vanlige neoplasma for alle de tilgjengelige midlene eller kombinasjonsregimene, er et annet betydelig problem fremveksten av resistente tumorceller fra tidligere responsive tumroer. De fleste pasienter med "kjemosensitive" tumorer såsom ikkeliten cellelungekreft, ovarie-adenocarcinom, akutt ikkelymfocyttisk leukemi, brystcarcinom og visse lymfoma kan bringes til delvis bedring ved kombinasjons-regimer som er blitt etablert som frontlinjeterapi for disse forskjellige sykdommene. I de fleste tilfellene blir imidlertid pasienter med tilbakevendende sykdom og evnen til å fremkalle påfølgende meningsfull forbedring, selv med høyst intensive kombiansjonsregimer, sterkt redusert. Disse tilbakevendende tumorene viser seg karakteristisk å være upåvirkelige av medikamenter som er strukturelt og/eller mekanistisk ubeslektet med de medikamentene som opprinnelig ble anvendt for å fremkalle be-dringen. Dette fenomenet med multimedikamentresistens blir for tiden intensivt etterforsket i flere laboratorier. Ny erkjenn-else antyder at oppformering og ekspresjon av det multimedika-mentelle resistensgenet (mdr) og nærværet av mdr-genproduktet, P170 membranglykoprotein, har sammengeng med multimedikament-resistensen. P170 tjener angivelig som en ustrømningstransport-pumpe med et utrolig mangfold av substratspesifisitet. En fersk publikasjon antyder at sterk ekspresjon av mdr-genet i visse tidligere ubehandlede tumorer såsom feokromocytom og kolon-adenocarcinom kan være ansvarlige, i det minste delvis for den inherent medikamentupåvirkelige fenotypen i disse tumorene.

Det er derfor viktig å identifisere nye midler som beholder en høy aktivitetsgrad mot tumorer som uttrykker fenotypen for multimedikamentresistens. Slike midler kan bære løfter om vider e fremskritt i behandlingen av kjemosensitive tumorer (dvs. ved å vise effektivitet i tidligere behandlede pasienter eller ved å drepe mdr-subpopulasjonen som en komponent av frontlinje-kom-binasjonsregimer) så vel som for nåværende ikkeresponsive tumorer som er insensitive for tilgjengelige medikamenter p.g.a. naturlig ekspresjon av mdr-genet. Camptothecin har vist seg å være uvanlig ved at det er ett av de få naturlige cytotoksiske midlene som ikke har demonstrert kryssresistens i de godt karak-teriserte tumorunderlinjene som viser mdr-fenotypen, dvs. P388 underlinjer som er resistente mot doxorubicin, vincristin, amsacrin, ellipticin eller mitoxantron. Siden de fleste av medikamentene som viser kryssresistens i multimedikament-resistente cellelinjer er basiske, var det ventet at addisjonen av en basisk sidekjede til camptothecinmolekylet, som i forbindelse nr. IS, ville resultere i en forbindelse som ville bli transpor-tert ut av cellene av P170 glykoprotein, og således vise seg å være ineffektiv i tumorer som uttrykker mdr-genet.

Forbindelse nr. IS ble evaluert i mus med P388 og dets doxorubicin- og mitoxantron-resistente underlinjer (tabell 8). Doxorubicin og mitomycin c ble inkludert for sammenligning . P388/doxorubicin og P388/mitoxantron beholdt sensitiviteten for forbindelse nr. IS. Disse multimedikament-resistente cellelinje ne utviste den forventede resistensen mot doxorubicin. P388/- doxorubicin var også resistent mot mitomycin c. Forbindelse nr. IS beholder således antitumoraktiviteten i multimedikamentresistente cellelinjer som er et karakteristisk trekk ved camptothecin.

Racemisk form av forbindelse nr. 1

Alle de biologiske studiene beskrevet i det foregående ble utført med S-isomeren av forbindelse nr. 1, dvs., den konfigura-sjonen ved C-20 som eksisterer i naturlig forekommende camptothecin og 10-hydroksycamptothecin. En racemisk form av forbindelse nr. 1 ble fremstilt ved total syntese, og ble evaluert for antitumoraktivitet i mus med ip P388 leukemi (tabell 9). Den racemiske formen av forbindelse nr. IS, heretter referert til som forbindelse nr. IRS, er svært aktiv i P388 leukemi, idet den gir 165% ILS med 1/6 langtids overlevende ved en dose på 29 mg/kg administrert ip på dagene 1 og 5. Skjønt ikke helt så aktiv som forbindelse nr. IS (konferer tabellene 5 og 8), har forbindelse nr. IRS utmerket aktivitet i denne tumormodellen.

Forskjellige saltformer av forbindelse nr. IS

Forbindelse nr. IS er vannløselig p.g.a. nærværet av den basiske sidekjeden i stilling 9 som danner salter med syrer såsom eddiksyre, saltsyre og metansulfonsyre. Eksperimentene beskrevet i tabellene 2 til 9 ble utført med enten acetat- eller hydrokloridsaltene av forbindelse nr. IS. En løselig form av forbindelse nr. IS kan også fremstilles ved basisk hydrolyse av E-ringlaktonet av forbindelse nr. IS med dannelse av vannløse-lige alkalimetallsalter av karboksylatformen av forbindelsen.

En direkte sammenligning av acetat-, hydroklorid-, dihydroklo-rid- og natriumsaltene av forbindelse nr. IS ble utført i mus med iv L1210 leukemi (tabell 10). Forbindelsene ble administrert som løsninger i 5% dextrose iv på dagene 1 og 5. Dihydro-kloridsaltet ble dannet ved tilsetning av overskudd av saltsyre, og skriver seg sannsynligvis fra protonering av kinolinnitro-genet i ring B, så vel som nitrogenet i dimetylaminometyl-gruppen. Alle saltformene var aktive i denne tumormodellen med 100% ILS for acetatet, 175% ILS for hydrokloridet, 13 3% ILS for dihydrokloridet og 208% ILS for natriumsaltet. De tre syre-saltene var ekvipotente, dvs. de hadde identiske maksimalt tolererte dosenivå på 15 mg/kg. Natriumsaltet var imidlertid om lag 3,5 ganger mindre potent med en maksimalt tolerert dose på 54 mg/kg.

II. Syntese av forbindelser med formelen ( I)

I de følgende syntetiske eksemplene er temperaturen i grader celsius (°C). Dersom intet annet er sagt, ble alle utgangsmaterialene skaffet fra kommersielle kilder.

EKSEMPEL I

Fremstilling av ( 20 S ) 1 . 2 . 6, 7- tetrahydrocamptothecin Camptothecin (32,0 g, 0,092 mol) levert fra Tainjain-SK&F Ltd., Tainjain, China, ble sammenslått med Pt<0> [fremstilt ved for-reduksjon av 8,0 g amorft Pt02 i 800 ml HOAc i 1,5 timer (h) under 1 atmosfære (atm.) H2] og HOAc (1,6 1). Reduksjonen ble utført ved 1 atm. H2 i 8,5 timer under kraftig omrøring av blandingen. Ved slutten av dette tidsrommet var den teoretiske mengden av H2 absorbert (litt mer enn 4,1 1) og opptaket av H2 hadde gått ned betydelig. Reaksjonen ble avgasset med en strøm av Ar i om lag 10 minutter (min.) og deretter filtrert gjennom en celitmatte som var vasket med HOAc (200 ml).

Den resulterende løsningen ble brukt umiddelbart i de følgende reaksjonene beskrevet i eksempel II.

EKSEMPEL II

Fremstilling av ( 20 S) 10- hydroksycamptothecin

Til den kraftige omrørte løsningen av 1,2,6,7-tetrahydrocamptothecin, fremstilt som beksrevet ovenfor i eksempel 1, ble tilsatt Pb(OAc)A (64 g, 0,144 mol) i én porsjon. Reaksjonen ble omrørt under Ar i 30 min., og hele mengden av Pb(0Ac)A var blitt oppløst. Oppkonsentrering ga en gummirest som ble gnidd ut med iskaldt H20 (1 1) for å gi et lyst brunt fast stoff som ble filtrert fra, vasket med ytterligere iskaldt H20 (200 ml) , presset tørt med et gummistempel og lufttørket over natten. Det resulterende delvis våte produktet inneholdt 44,3% 10-hydroksy-camptothecin, 26,9% 10-acetoksycamptothecin, og 2 3,1% camptothecin basert på høytrykks væskekromatografi (HPLC) analyse (Whatman Partisil 5 ODS3 Rac II 60% CH3OH/H20) .

Den rå blandingen ble slått sammen med 1,7 1 50% vandig HOAc og oppvarmet med tilbakeløp over natten. Reaksjonen ble avkjølt og konsentrert til om lag 50-100 ml. Iskaldt H20 (1 1) ble tilsatt, og bunnfallet ble filtrert fra, vasket med ytterligere iskaldt H20 (200 ml), presset tørt med et gummistempe1, og tørket under høyvakuum i 2 dager for å gi 21,16 g materiale som inneholdt 70,9% 10-hydroksycamptothecin, 1,2% 10-acetoksycamptothecin, og 21,3% camptothecin basert på HPLC-analyse.

EKSEMPEL III

Fremstilling av ( 20 S) 9- dimetvlaminometyl- 10-hvdroksvcamptothecinacetatsalt

10-hydroksycamptothecin (20 g med en analyse på 62% 10-hydroksycamptothecin og som derfor inneholdt 12,4 g, 34,1 mmol 10-hydroksycamptothecin), fremstilt som beskrevet i eksempel 2, ble kombinert med HOAc (620 ml), 37% vandig CH20 (12,4 ml, om lag 149 mmol) og 40% vandig dimetylamin (12,4 ml, om lag 109 mmol) og omrørt i om lag 18 timer, og tynnsjiktskromatografi (tic) indikerte noe gjenværende utgangsmateriale (tic i 9 : 1 CH2CL2, CH3OH på silikagel). Dette systemet er egnet til å følge for-svinningen av 10-hydroksycamptothecin, men ikke for å regulere dannelsen av produktet. Ytterligere 37% vandig CH20 (6 ml, om lag 72 mmol), og 40% vandig dimetylamin (6 ml, om lag 53 mmol) ble tilsatt, og røringen ble forsatt i ytterligere 24 timer. Reaksjonen ble konsentrert til tørrhet, gnidd ut med 0,5% vandig HOAc (1 1), filtrert, og det faste stoffet ble vasket med ytterligere 0,5% vandig HOAc (500 ml). Det tørkede faste stoffet veide 6,3 g, og var 94% oppnådd camptothecin ved HPLC (Whatman Partisil 10 ODS 3 50% CH3OH/H20, retensjonstid 9 min.). De sammenslåtte vandige filtratene ble ekstrahert med EtOAc (3 x 600 ml), og petroleumeter (600 ml) og deretter lyofilisert.

Kromatografi av det rå residuet ble oppnådd ved å injisere materialet i løsningsmiddel A (løsningsmiddel A = 99% H20, 1% HOAc) (600 ml) og eluering ved 350 ml/min. gjennom en 50 mm x 600 mm stålkolonne pakket med 680 g Whatman Partisil 40 ODS 3 med en 34 min. lineær gradient fra 100 % løsningsmiddel A til 40% løsningsmiddel B (løsningsmiddel B = 99% CH30H, 1% HOAc). Kromatografien ble styrt ved 410 nirr, og 1 1 fraksjoner ble oppsamlet, og de som ga > 99% renhet ved analytisk HPLC (Whatman Partisil 10 ODS 3 50% CH3OH/H20, retensjonstid 9 min.) ble slått sammen, konsentrert og løst igjen i et minimum av 0,5% vandig HOAc og lyofilisert for å gi 10,58 g (62%) av det nevnte produktet.

IR (KBr) 3400, 2960, 1740, 1650, 1590 cm"<1.><X>H NMR (CDCI3/CD3OD) 1,04 (t,3,J=7Hz,C18),

l,96(q,2, J=7HZ,C19) , 2 , 01 (s , 3 , CH3C02)

2,50(s,6, (CH3)2NH) , 4 , 20 (s, 2 , ArCH2N) , 5,28

(d,l,J=19Hz,C17), 5,29(s,2,C5), 5,50(d,1,J=19Hz,C17), 7,42(d,J=9HZ,C11), 7,67(s,l,C14), 8,05(d,J=9Hz,C12),

8,51(s,C7). Beregnet for C23H23N305 1 HOAc 1 H20

(molekylvekt = 515,5) : C,58,24; H,5,67; N,8,15.

Funnet: C,58,55; H5,22; N,8,54. Pb analyse < 14,5 ppm.

Ytterligere materiale av det nevnte produktet som var >90% rent ved HPLC (se ovenfor) ble konsentrert til tørrhet, og senere omkromatografert med lignende materiale isolert fra andre omganger.

EKSEMPEL 1

Fremstilling av ( 20 S) 9- morfolinometvl- 10-hvdroksycamptothecinacetatsalt

10-hydroksycamptothecin (100 mg, 0,27 mmol), fremstilt som beskrevet i eksempel 2, 37% vandig CH20 (0,5 ml), morfolin (0,1 ml) og 2:1 HOAc/EtOH (10 ml) ble slått sammen og omrørt over natten. 10-hydroksycamptothecin hadde reagert (tic, silikagel, 9:1 CH2Cl2/CH3OH) og reaksjonen ble konsentrert til tørr-het, løst i ca. 5 ml H20 inneholdende flere dråper HOAc, og det uløselige materialet ble filtrert fra. Filtratet ble lyofilisert, og lyofilisatet ble kromatografert (15 mm x 250 mm silika mellomtrykksvæskekromatografi (MPLC), og eluert med CH2C12 inneholdende 0-2% CH30H for å gi et residuum som ble løst i fortynnet vandig HOAc og lyofilisert for å gi 53 mg (38%) av tittelforbindelsen .

IR (KBr) 3400, 3100, 2960, 2920, 2840, 1740, 1650, 1590 cm"<1>. <X>H NMR (CDC13/CD30D) 6 1.12 (t, 3 , J=7Hz , C18) ,

1,94 (q,2,J=7Hz,C19), 2,73(m,4,mofilino-CH2N) , 3,83 (m,4,mor-filino-CH20) 4,19 (s,2,ArCH2N) , 5,26(s,2,C5) , 5,25(d,1,J=16Hz,

C17), 576(dl,J=16Hz,C17), 7,27(s,1,C14), 7,40(d,1,J=8Hz,Cll), 8,07(dl,J=8Hz,C12), 8,36(s,l,C7).

Beregnet for C25H25N306 CH3C02H (molekylvekt=525,6): Cf 61,71; H,5,9 5; N,8,00. Funnet: C,61,30; H,5,44; N,8,35.

EKSEMPEL 2

Fremstilling av ( 20 S) 9- N- metylpiperazinylmetyl- lO-hydroksycamptothecinacetatsalt

10-hydroksycamptothecin (100 mg, 0,27 mmol), fremstilt som beskrevet i eksempel 2, 2:1 HOAc/EtOH (10 ml), 37% vandig CH20 (0,5 ml) og N-metylpiperazin (0,1 ml) ble kombinert og omrørt i 2 0 timer. 10-hydroksycamptothecin hadde reagert (tic 9:1 CH2C12/CH30H) og reaksjonen ble konsentrert, løst i H20 (50 ml) og vasket med EtOAc (5 x 20 ml) og petroleumeter (20 ml), og den vandige fasen ble lyofilisert. Residuet ble løst igjen i fortynnet vandig HOAc og kromatografert med MPLC (Whatman Partisil 40 0DS3, 9 mm x 250 mm kolonne) og eluert med 0-20% CH30H i H20 inneholdende 0,02% HOAc. Det ønskede materialet ble slått sammen og konsentrert, og residuet ble lyofilisert for å gi 67 mg (46%) av tittelforbindelsen.

IR (KBr) 3400, 2960, 2910, 1740, 1650, 1590 cm"<1>. <X>H NMR (CDC13/CD30D) S 1,03(t,3,J=7Hz,C18),

1,89 (q,2,J=7Hz), 2 , 02 (s, >3 , CH3C02H) , 2 , 37 (s, 3 ,NCH3) , 2,65(m,8, piperazino-CH2) , 4 , 21 (s, 2 , ArCH2) , 5, 26 (s, 2 , C5) ,

5,30(d,l,J=16Hz,C17), 5,71(d,l,J=16Hz,C17), 7,45(d,1,J=7Hz,Cll), 8,05(d,l,J=7Hz,C12), 8,47(s,1,C7).

Beregnet for C26H28N405 1 1/2 HOAc 1/4 H20 (molekylvekt=528,1) ; C,61,41; H,6,01, N,10,61.

Funnet: C,61,62; H,5,74; N,10,93.

EKSEMPEL 3

Fremstillin<g> av ( 20 S) 9-( 4'- piperidinopiperidinvl)-metyl- 10- hvdroksycamptothecinacetatsalt

10-hydroksycamptothecin (100 mg, 0,27 mmol), fremstilt som beskrevet i eksempel 2, 4-piperidinopiperidin (100 mg,

0,60 mmol), 37% vandig CH20 (0,5 ml) og 2:1 HOAc/EtOH (10 ml) ble omrørt i 20 timer. 10-hydroksycamptothecinet hadde reagert (tic, silikagel, 9:1 CH2C12/CH30H) og reaksjonen ble konsentrert, løst i 1% vandig eddiksyre, filtrert, og lyofilisert. MPLC (Whatman Partisil 40 0DS3, 9 x 250 mm kolonne) eluering med H20 (100 ml) og deretter 0 - 80% CH3OH i 0,02% vandig HOAc, ga 44 mg (30%) av tittelforbindelsen etter lyofilisering. IR (KBr) 3400, 2940, 1745, 1660, 1590 cm"<1>.XH NMR (CDCl3/CD3OD)

(t,3,J=7Hz,C18), 1,3-3,3 (m,19, piperidin, C19), 4,11

(s,2,CH2N), 5,21 (s,2,C5), 5,25 (d,l,J=16Hz, C17), 5,70 (d,1,J=16Hz,C17), 7,85 (d,1,J=7Hz,Cll), 7,59 (s,l,C14),

8,00 (d,1,J=7Hz,C12), 8,35 (s,l,C7).

Beregnet for C31H36N405 1 1/2 H20 (molekylvekt=631, 7) : C, 58 , 94 ; H,6,22; N,8,81.

Funnet C,59,01; H,6,44; N,8,53.

EKSEMPEL 4

Fremstillin<g> av ( 20 S) 9-( 2 '- hvdroksvetylamino)-metyl- 10- hvdroksvcamptothecinacetatsalt

10-hydroksycamptothecin (200 mg, 0,55 mmol), fremstilt som beskrevet i eksempel 2, paraformaldehyd (16 mg, 0,55 mmol), etanolamin (61 mg, 1,1 mmol), og HOAc (6 ml) ble omrørt i 48 timer, hvoretter mesteparten av 10-hydroksycamptothecinet hadde reagert. Reaksjonen ble konsentrert, løst igjen i fortynnet HOAc (2 00 ml) og vasket med EtOAc (4 x 3 0 ml) og petroleumeter (30 ml), og den resulterende vandige løsningen ble lyofilisert. Det rå lyofilisatet ble løst i H20 (50 ml) . MPLC (Whatman Partisil 40 ODS3, 15 mm x 250 mm kolonne) eluering med HzO (100 ml) etterfulgt av 0 - 10% CH30H i 0,02% HOAc i H20, ga 88 mg (33%) av tittelforbindelsen etter lyofilisering. IR (KBr) 3400, 2980, 2940, 1750, 1570 cm"<1>.

<X>H NMR (CDC13/CD30D) S 1, 03 (t, 3 , J=7Hz , C18) , 1, 89 (q, 2 , J=7Hz , C19) ,

2 , 00 (s ,3,HOAc),

3,03(m,2,CH2NH) , 3,75 (m,2,CH20H), 4 , 49 (s, ArCH2NH) , 5,24(8,2,05), 5,30(d,l,J=16,C17), 5,70(d,1,J=16Hz,C17), 7,41(d,l,J=8Hz,Cll), 7,61(s,l,C14), 8,00 (d,1,J=)8Hz,C12), 8,48(s,l,C7).

Beregnet for C23H23N306 HOAc 1 7/8 H20 (molekylvekt=531,3): C,56,52; H,5,83; N,7,91.

Funnet: C,56,07; H, 5,40; N, 8,27.

EKSEMPEL 5

Fremstilling av ( 20 S) 9- trimetvlammoniummetyl- lO-hydroksycam<p>tothecinmetansulfonatsalt

9- dimetylaminometyl-10-hydroksycamptothecinacetatsalt (65 m g, 0,14 mmol), fremstilt som beskrevet i eksempel 3, ble løst i CH2C12 (ca. 70 ml) og filtrert. Filtratet ble kombinert med metylmetansulfonat (1 ml), avkjølt og delvis konsentrert under en strøm av argon (Ar). Etter 4 timer ble løsningsmidlet konsentrert til halvparten av volumet og avkjølt. Bunnfallet ble filtrert, løst i H20 (10 ml) , vasket med EtOAc (3 x 10 ml) og deretter petroleumeter (10 ml) og lyofilisert for å gi 50 mg (60%) av tittelforbindelsen. IR (KBr) 3400, 2950, 2900, 1760, 1660, 1600 cm"<1>. <X>H NMR (CDC13/CD30D) S 1, 03 (d, 3 , J=7Hz , C18) , 2,01(q,2, J=7HZ,C19) , 2,78 (s, >3 , CH3S03) ,

2,94 (s,9,N(CH3)3) , 4 , 7 2 (s, 2 , Ar CH2N) , 5,20 (s, 2,C5) , 5,22(d,l,J=16Hz,C17), 5,67(d,1,J=16Hz,C17),

7,62(d,J=7Hz,Cll), 7,71(s,C14), 8,16(d,1,J=7Hz,C12), 8,89(s,l,C7).

Beregnet for C2<,H25N305 »1 1/2

CH3S03H»2 H20 (mw=615.7): C,49.74;H,5.72;N,6.82.

Funnet: C,49,36; H,5,15; N,7,53.

EKSEMPEL 6

Fremstillin<g> av ( 20 S ) 9- formyl- 10- hvdroksycamptothecin

10- hydroksycamptothecin (100 mg, 0,27 mmol), fremstilt som beskrevet i eksempel 2, heksametylentetraamin (0,80 g, 5,5 mmol) og trifluoreddiksyre (TFA) (15 ml) ble oppvarmet med tilbakeløp under argon i 20 timer. Reaksjonen ble konsentrert, kombinert

med H20 (15 ml) og omrørt i 1 time. H20 (75 ml) ble tilsatt, og pH ble justert til 8,4 ved tilsetning av NaHC03. Den vandige fasen ble vasekt med EtOAc (3 x 75 ml), surgjort til pH 1,5 med 3 N HC1 og deretter ekstrahert med EtOAc (5 x 75 ml). De sammenslåtte organiske ekstraktene ble vasket med IN HCl (5 x 75 1) , H20 (75 ml), og mettet vandig NaCl (25 ml), og konsentrert. Residuet ble deretter renset ved flashkromatografi (1 cm x 15 cm silika med det rå materialet forabsorbert på en 1 cm x 1 cm. plugg av Na2S04) . Produktet ble eluert med 1% CH3OH i CH2C12 for å gi 50 mg (47%) av tittelforbindelsen. En analytisk ren prøve ble oppnådd ved fraksjonert utfelling fra om lag 25% CH30H i CH2C12 ved langsom avkjøling og konsentrering under en strøm av nitrogen. IR (KBr) 3400, 3100, 2950, 1755,

1660, 1600 cm"<1>. <X>H NMR (CC13D/CD30D) S 1,04

(t,3,J=7Hz,C18), 1,96 (d,2,J=7Hz,C19), 5,32 (d,1,J=14Hz,C17), 5,33 (s,2,C5), 5,68 (d,l,J=14Hz, C17), 7,50 (d,1,J=9Hz,Cll), 7,67 (s,l,C14), 8,33 (d,1,J=9Hz,C12), 9,34 (s,l,C7), 10,85 (s,l,

CHO) .

Beregnet for C21H16N2061 H20 (molekylvekt = 410,38): C,61,46; H,4,4 2; N,6,83.

Funnet: C,61,09; H,4,17; N,6,52.

EKSEMPEL 7

Fremstilling av ( 20 S) 9- cvklopropylaminometvl-10- hydroksycamtothecinhydrokloridsalt

En blanding av 10-hydroksycamptothecin (254 mg, 0,7 mmol), fremstilt som beskrevet i eksempel 2, 37% vandig formaldehyd (1,0 ml), cyklopropylamin (400 mg, 0,7 mmol) i iseddiksyre (16 m 1) og etanol (8 ml) ble omrørt over natten ved omgivende temperatur og konsentrert in vacuo til tørrhet. Residuet ble gnidd ut med vann, filtrert og tørket for å gi 260 mg (75% utbytte) av den navngitte forbindelsen som et acetatsalt som ble omdannet til det nevnte hydrokloridsaltet ved utgnidning med 0,1 N HCl. Analyse (C2AH23N305»HC1-3H20) .

Beregnet: C, 55,01; H, 5,57; N, 8,02.

Funnet: C, 54,94; H, 5,18, N,8,18. <l>H NMR (D20) S 0.96 (m,7),2.1

(111,2) ,2,8

(m, 1), 4,6 (s, 2), 4,8 (s, 2), 5,2 (s, 2), 7,2 (s, 1), 7,5 (q, 2) , 8,6 (s, 1) .

EKSEMPEL 8

Fremstilling av ( 20 S) 9- etoksvmetyl- 10- hydroksycamptothecin

En blanding av 10-hydroksycamptothecin (3 64 mg 1,0 mmol), fremstilt som beskrevet i eksempel 2, dimetylaminhydroklorid (90 mg, 1,1 mmol) og 37% vandig formaldehyd (1,5 ml) ble oppvarmet under tilbakeløp i 95% etanol (25 ml) i 5,5 timer. Reaksjonen ble konsentrert til et lite volum, og det utfelte produktet ble oppsamlet og tørket. Rensing ved silikagelkromatografi, eluering med 3% MeOH i CH2C12 ga 85 mg (20% utbytte) av den nevnte forbindelsen. Analyse (C23H22N206) .

Beregnet: C, 62,08; H, 5,27; N, 6,29.

Funnet: C, 61,80; H, 5,22; N, 6,12. FAB massespektrum: m/e 423 (MH+) . 4i NMR (DMSO) 0,85 (t, 3), 1,1 (t, 3), 1,9 (m, 2), 3,5 (s, 2), 4,8 (s, 2), 5,2 (s, 2), 5,4 (s, 2), 7,2 (s, 1), 7,7 (m, 2), 8,6 (s, 1).

EKSEMPEL 9

Fremstillin<g> av ( 20 S) 9-( N- metylanilinometyl)-10- hydroksvcamptothecin

En blanding av 10-hydroksycamptothecin (254 mg, 0,7 mmol), fremstilt som beskrevet i eksempel 2, 37% vandig formaldehyd (1,0 ml), N-metylanilin (0,75 ml, 0,7 mmol) i iseddiksyre (16 ml) og etanol (8 ml) ble omrørt ved omgivende temperatur i 40 timer. Etter konsentrering til en olje, ble delvis rensing oppnådd ved silikagelkromatografi, eluering med 1,2 og 3% MeOH i CH2C12. Produktfraksjonene inneholdt fremdeles N-metylanilin. Ytterligere rensing ble oppnådd ved å bruke en silikagel MPLC-kolonne, og produktet ble eluert med 2% MeOH i CH2C12. Produktfraksjonene ble slått sammen og konsentrert in vacuo for å gi 77 mg (24%) av den nevnte forbindelsen som et gult fast stoff. Analyse av (C28H25N305»1, 2 H20) .

Beregnet C, 66.58; H, 5,47; N, 8,32.

Funnet: C, 66,97; H, 5,69; N, 7,91. DCI massespektrum: m/e 484 (MH+) . <2>H NMR (CDCL3) S 1, 0 (t,3), 1.9 (m,2), 2.8 (s,3),5.0

(s,2), 5.2 (s,2), 5,5 (q, 2), 6,9 (irt, 5), 7,5 (s, 1), 7,9 (q, 2), 8,4 (s, 1).

EKSEMPEL 10

Fremstilling av ( 20 S ) 9- cvkloheksylaminometyl-10- hvdroksvcamptothecinhvdrokloridsalt

En blanding av 10-hydroksycamptothecin (364 mg, 1,0 mmol), fremstilt som beskrevet i eksempel 2, 37% vandig formaldehyd (1,5 ml), cykloheksylamin (1,3 ml, 10 mmol) i iseddiksyre (25 ml) og etanol (12 ml) ble omrørt over natten ved omgivende temperatur, og konsentrert in vacuo til tørrhet. Residuet ble renset på en reversert fasekolonne (MPLC) ved eluering med 15% vandig MeOH som inneholdt 0,02% iseddiksyre. Den nevnte for-binddelsen som et acetatsalt ble oppnådd etter konsentrering til et lite volum og lyofilisering (250 mg, 47%). Acetatsaltet ble omdannet til det nevnte hydrokloridsaltet ved tilsetning av 0,1 N HCl, og saltet ble oppsamlet ved filtrering.

Analyse av (C27H29N305«HC1« 1 1/8 H20) .

Beregnet: C, 60,93; H, 6,11, N, 7,89.

Funnet: C,60,83, H, 5,98; N, 7,75. <X>H NMR (DMSO) S 0,9 (t, 3), 1,0-2,0 (m, 10), 3,1 (S,l), 4,5 (s, 2), 5,2 (s, 2), 5,4

(s, 2), 7,2 (s, 1), 7,9 (q, 2), 8,9 (s, 1).

EKSEMPEL 11

Fremstilling av ( 20 S) 9- N. N- dimetylaminoetvloksymetvl-10- hydroksvcamptothecinhvdrokloridsalt

En blanding av 9-dimetylaminometyl-10-hydroksycamptothecin-fri base (100 mg, 0,2 mmol), fremstilt som beskrevet i eksempel 21, i 2-dimetylaminoetanol (4 ml) som inneholdt 3 dråper 3N HCl, ble oppvarmet under argon ved 80°C i 24 timer. Den halvfaste reaksjonsblandingen ble behandlet med H20 (5 ml) og isopropanol (10 ml), omrørt og filtrert for å gi 60 mg (59%) av tittelforbindelsen.

Analyse av (C25H27N306» HCl«0,5 H20) .

Beregnet: C,58,77; H, 5,72, N, 8,25.

Funnet: C,58,94; H, 4,92; N, 7,90. <X>H NMR (DMSO) S 0,9 (t,3), 1,85 (m,2),2,3 (s,6),3,3(s,2), 4,1 (s,2), 5,2 (s,2), 5,4 (s,2)

7,3 (s,l), 7,4(d,l), 8,0 (d,l), 8,7 (s,l).

EKSEMPEL 12

Fremstilling av ( 20 S) 9- N. N- dimetylaminoetyltiometyl-10- hvdroksvcam<p>tothecinhydrokloridsalt

En blanding av 9-dimetylaminometyl-10-hydroksycamptothecin-hydrokloridsalt (100 mg, 0,2 mmol), fremstilt i det vesentlige som beskrevet i eksempel 18, og 2-dimetylaminoetantiol (13 ml) ble oppvarmet ved 85°C under argon i 5 timer. Det uløselige faste stoffet (overskudd av tiol) ble fjernet ved filtrering, og filtratet ble konsentrert in vacuo til et oljeaktig residuum som ble renset ved å bruke reversert fase MPLC. Produktet ble eluert med 5% og 10% MeOH i H20, for å gi 45 mg (41%) av tittelforbindelsen som et gult fast stoff.

Analyse av (C25H28N305S«HC1»3H20) .

Beregnet: C, 49,34; H, 5,79; N, 6,90.

Funnet: C, 48,98; H, 5,82; N

6,54. <X>H NMR (D20) S 1,0 (t,3), 1,9 (m,2), 2,8

(s,6), 4,4 (s,2), 5,3 (s,2), 7,1 (d,l), 7,2 (s,l), 7,6 (d,l), 8,2 (s,l).

EKSEMPEL 13

Fremstillin<g> av ( 2 0 S ) 9- N. N- dimetylaminoetylaminometvl-10- hvdroksvcamptothecindihydrokloridsalt

En blanding av 10-hydroksycamptothecin (364 mg, 1,0 mmol), fremstilt som beskrevet i eksempel 2, N,N-dimetyletylendiamin (100 mg, 1,1 mmol), 37% vandig formaldehyd (1,5 ml) i iseddiksyre (25 ml) og etanol (10 ml) ble omrørt ved romtemperatur i 64 timer. Løsningsmidlene ble fjernet in vacuo, og det faste residuet ble behandlet med vann (10 ml) og isopropanol (10 ml) inneholdende 3N HCl (3 ml). Det fint utfelte faste stoffet ble oppsamlet, vasket med isopropanol og tørket for å gi 218 mg (40% utbytte) av tittelforbindelsen. Analyse av (C25H28N405»2HC1) . Beregnet: C, 55,87; H, 5,63; N, 10,42.

Funnet: C, 55,91; H, 5,72; N, 9,86. <X>H NMR (CD3OD)

S 1,0 (t,3), 1,9 (m,2), 2,9 (s,6), 4,5 (s,2),

5,1 (m,4), 5,4 (q,2), 7,3 (d,l), 7,5 (s,l), 7,8 (d,l), 8,4 (s,l) .

EKSEMPEL 14

Fremstilling av ( 20 R. S)- 9- dimetylaminometvl- 10-hvdroksycamptothecinacetatsalt

Tittelforbindelsen fremstilles som beskrevet i eksempel 3, unntatt at utgangsmaterialet er racemisk 10-hydroksycamptothecin fremstilt ifølge fremgangsmåten etter Wani et al., J. Med. Chem. , 23, 554 (1980).

EKSEMPEL 15

Fremstilling av ( 20 S ) 9- dimetylaminoetvl- 10-hvdroksvcamptothecinmonohydrokloridsalt

9-dimetylaminometyl-10-hydroksycamptothecinacetatsalt, fremstilt som beskrevet i eksempel 3, som ved analyse hadde 2,5 ekvivalenter eddiksyre og 0,75 ekvivalenter vann (8,5 g,

14,5 mmol basert på en molekylvekt på 585) ble løst i 0,1 N saltsyre (170 ml, 17 mmol), lyofilisert og pumpet under høyt vakuum i 3 døgn for å gi 8,3 g av tittelforbindelsen <X>H NMR (CDCI3/CD3OD) S 1,05 (t,3,

J= 7,5), 1,98 (q, 2, J = 7,5), 2,95 (s, 6), 4,77 (s, 2),

5,33 (s, 2), 5,36 (d, 1, J = 16), 5,62 (d, 1, J = 16), 7,59 (d, 1, J = 9), 7,66 (s, 1), 8,20 (d, 1, J = 9), 8,86 (s, 1).

Anal. (C23H23<N>305»1HC1»3 H20) .

Beregnet: C, 53,96; H, 5,91; N, 8,21; Cl, 6,92...

Funnet: C, 53,68; H, 5,61; N, 8,16; Cl, 6,84.

EKSEMPEL 16

Fremstilling av ( 20 S ) 9- dimetvlaminoetvl- 10-hvdroksvcam<p>tothecindihydrokloridsalt

9-dimetylaminometyl-10-hydroksycamptothecinacetatsalt (0,38 9 g, 1,07 mmol ved HPLC-analyse), fremstilt som beskrevet i eksempel 3, ble løst i 0,4 N HCl (6 ml, 2,4 mmol), lyofilisert og pumpet under høyt vakuum i 40 timer for å gi 0,269 g av tittelforbindelsen.

1H NMR (CDCI3/CD3OD) S 1,05 (t,3, J= 7,5), 1,92

(q, 2 J = 7,5), 3,01 (s, 6), 4,85 (s, 2), 5,31 (d, 1, J = 16), 5,36 (s, 2), 5,65 (d, 1, J = 16), 7,64 (d, 1, J = 9), 7,73 (s, 1), 8,23 (d, 1, J = 9), 9,07 (s, 1).

Anal. (C23H23<N>305»2HC1»3 H20) .

Beregnet: C, 50,37; H, 5,70; N, 7,66; Cl, 12,93.

Funnet: C, 50,76; H, 5,64; N, 7,57; Cl, 12,61.

EKSEMPEL 17

Fremstilling av ( 20 S) 9- dimetylaminoetyl- 10-hydroksycamptothecinnatriumsalt

9-dimetylaminometyl-10-hydroksycamptothecinacetatsalt (100 mg, 0,2 mmol), fremstilt som beskrevet i eksempel 3, ble behandlet med 0,1 N natriumhydroksyd (4,5 ml, 0,45 mmol) og løsningen ble passert gjennom en HP-20 harpikskolonne (2 x 22 cm). Har-piksen ble vasket med vann (250 ml) og produktet ble eluert med en 1:1 blanding av vann og metanol. Fraksj oner som inneholdt produktet ble slått sammen, konsentrert til et lite volum og lyofilisert for å gi 98 mg (98%) av tittelforbindelsen. IR (nujol) 1600 cm"<1> (carboksylat) . <X>H NMR (D20)

S 0,65 (m, 3) , 1,8 (m, 2), 2,8 (s, 6), 3,0 (m, 2), 4,21 (s, 2), 4,5 (s, 2), 7,1 (q, 2), 7,2 (s, 1), 7,8 (s, 1).

Analyse for (C23H2AN306Na»l,5 H20) .

Beregnet: C, 56,55; H, 5,57; N, 8,60.

Funnet: C, 56,21; H, 5,65; N, 8,44.

EKSEMPEL 18

Fremstillin<g> av ( 20 S) 9- dimetylaminometyl- 10 hvdroksvcamptothecinfri base

En blanding av 10-hydroksycamptothecin (728 mg, 2,0 mmol), fremstilt som beskrevet i eksempel 2, i iseddiksyre (50 ml), etanol (20 ml), 37% vandig formaldehyd (3 ml) og 4 0% vandig dimetylamin (3 ml) ble omrørt ved romtemperatur i 2 0 timer. Løsningsmidlene ble fjernet under redusert trykk; residuet ble oppvarmet ved 50°C under høyt vakuum i 2 timer og gnidd ut med isopropanol (10 ml) for å felle ut tittelforbindelsen (561 mg, 64%) som et gult fast stoff. FAB massespektrum: m/e 422 (MH+) . <X>H NMR (CDCI3/CD3OD) S 1,0 (t, 3), 1,9 (m, 2), 2,5

(s, 6), 4,3 (s, 2), 5,2 (s, 2), 5,4 (q, 2), 7,6 (s, 1), 7,7 (q, 2), 8,5 (s, 1).

EKSEMPEL 19

Fremstilling av ( 20 S) 9- dimetylaminometvlcamptothecin Trifluormetansulfonatet av (20 S) 9-dimetylaminometyl-10-hydroksycamptothecinacetatsaltet ble fremstilt in situ som følge r: En blanding av 9-dimetylaminometyl-10-hydroksycamptothecin-acetatsalt, fremstilt som beskrevet i eksempel 3, (482 mg, 1 mmol) i N,N-dimetylformamid (DMF) under argon (40 ml) ble behandlet med 2,6-lutidin (268 mg, 2,5 mmol) og N-fenyltrifluor-metansulf onimid (0,54 g, 1,5 mmol). Reaksjonsblandingen ble omrørt over natten ved romtemperatur. Til det ovenfor dannede triflatet ble deretter tilsatt trietylamin (0,4 ml, 3,0 mmol), palldiumacetat (8 mg, 0,04 mmol), trifenylfosfin (20 mg, 0,08 mmol) og konsentrert maursyre (0,08 ml, 2 mmol). Reaksjonen ble oppvarmet ved 60°C i 8 timer. Løsningsmidlet ble fjernet in vacuo og residuet ble gnidd ut med en liten mengde H20 og filtrert. Det tørkede, rå uløselige faste stoffet veide 550 mg. Det ble renset ved flashkromatografi på silikagelkolonne ved å eluere noe av det opprinnelige triflatet med trifenylfosfat for å gi 25 mg (7%) av 9-metylcamptothecin, 88 mg (20%) av tittelforbindelsen som fri base (4% MeOH i CH2C12) , og noe trifluor-metylsulfonat av 10-hydroksycamptothecin med 10% MeOH i CH2C12. Noe av tittelforbindelsen ble omdannet til acetatsaltet ved behandling med fortynnet eddiksyre.

Analyse av (C25H27N306 . 2,5H20).

Beregnet: C, 58,81; H, 6,12; N, 8,23.

Funnet: C, 58,60, H, 5,88, N, 7,88;

<X>HNMR (CDCI3) S 0,9 (t,3), 1,8 (m,2), 2,2 (s,6), 3,7

(s, 2), 5,2 (s, 2), 5,4 (q, 2), 7,3 (d, 1), 7,5 (d, 1) 7,6 (2,1) , 8,0 (d, 1), 3,3 (S, 1)

Massespektrum m/e 406 (MH<+>)

EKSEMPEL 2 0

Fremstilling av 10- cyanocamptothecin

En løsning av tributyltinncyanid (444 mg, 1,4 mmol) og tetrakistrifenylfosfinpalladium (276 mg, 0,6 mmol) i 1,2-diklor-etan (20 ml) ble oppvarmet til tilbakeløp under argon i 2 timer for å danne et palladium-tinn-cyanidkompleks. Deretter ble trifluormetylsulfonatet av 10-hydroksycamptothecin, fremstilt som beskrevet i eksempel 22, (266 mg, 0,6 mol) tilsatt og til-bakeløpet ble fortsatt i 3,5 timer. Reaksjonen ble konsentrert til 1/3 av sitt opprinnelige volum og gnidd ut med et like stort volum av dietyleter. Det utfelte gule faste stoffet ble oppsamlet og tørket. Tittelforbindelsen ble oppnådd i 82% rått utbytte, 183 mg. Etter rensing ved flashkromatografi, ble tittelforbindelsen eluert med 2% MeOH i CH2C12 og 115 mg (67%) ble oppnådd.

Analyse av (C21H15N30A . 1/2H20

Beregnet: C, 65,96; H, 4,22; N, 10,99.

Funnet: C, 65, 89; H, 4,06; N, 10,66.

<X>HNMR (CDCl3-MeOD4) S 1,0 (t,3), 1,9 (m,2), 5,4 (s,2), 5,5

(q, 2), 7,7 (s, 1), 7,7-8,4 (m, 3), 8,6 (s, 1).

Massespektrum m/e 374 (MH+)

EKSEMPEL 21

Fremstilling av ( 20 S) 10- formylcamptothecin

En flammetørket flaske ble fylt med trifluormetylsulfonatet av 10-hydroksycamptothecin, fremstilt som beskrevet i eksempel 22, (100 mg, 0,22 mmol), friskt destillert tetrahydrofuran (THF)

(10 ml) og tetrakistrifenylfosfinpalladium (10 mg, 9 mmol). Karbonmonoksyd (CO) ble boblet inn i reaksjonen i 3 min., og deretter ble reaksjonsblandingen lukket igjen med en CO ballong, og neddykket i oljebad ved 50°C. Under omrøring og ved bruk av en stempelpumpe ble tilsatt dråpevis en løsning av Bu3SnH (0,73 ml) i tørr THF (3 ml) i løpet av en 4 timers periode. Etter dette tidsrommet ble løsningsmidlet fjernet in vacuo. og residuet ble renset ved f lashkromatograf i (1-2% CH30H, CH2C12) etterfulgt av endelig rensing i en Chromatotron (Harrison Research, Palo Alto, California). Tittelforbindelsen ble eluert med 2%

MeOH i CH2C12/ 20 mg (24%) .

Analyse av (C21, H16, N205- 1- 1/ 3 H20) .

Beregnet: C, 61,84; H, 4,69; N, 6,86.

Funnet: C, 61,83; H, 4,53; N, 6,37.

<X>H NMR (CDCI3) S 0,9 (t,3), 1,9 (m,2), 5,3 (split s, 2), 5,4 (q, 2), 7,7 (d, 1), 7,8-8,3 (m, 3), 8,5 (s, 1), 9,9 (s, 1). Massespektrum m/e 377 (MH+) .

EKSEMPEL 22

Fremstilling av ( 20 S) 10- aminometvlcamptothecinacetatsalt En løsning av 10-cyanocamptothecin, fremstilt som beskrevet i eksempel 24, (160 mg, 0,4 mmol) i iseddiksyre (45 ml) ble behandlet med aktivert Raney-nikkel og hydrogenert ved 10 psi (1785,8 g/cm) i 7 timer. Katalysatoren ble fjernet ved filtrering gjennom supercel, og filtratet ble konsentrert in vacuo. Det faste residuet ble renset ved mellomtrykkskromatografi på revers fasekolonne ved eluering av produktet med 10% MeOH i vann. Etter frysetørring ble oppnådd 25 mg (15%) av den hygro-skopiske tittelforbindelsen.

Analyse av (C23H23N306.6 H20) .

Beregnet: C, 50,63; H, 6,46; N, 7,73.

Funnet: C, 50,11; H, 6,57; N, 7,64.

<X>H NMR (D20) S 1,0 (t, 3), 1,9 (m, 2), 4,3 (s, 2),

5,2 (s, 2), 5,4 (s, 2), 7,5 (s, 1), 7,7-8,1 (m, 3), 8,6 (s, 1).

EKSEMPEL 23

Fremstillin<g> av ( 20 S) 10- aminometylcamptothecinacetatsalt En løsning av 10-cyanocamptothecin, fremstilt som beskrevet i eksempel 24, (160 mg, 0,42 mmol) i iseddiksyre (45 ml) ble behandlet med aktivert Raney® nikkel og hydrogenert ved 1785,8 gram/m<2> i 7 timer. Katalysatoren ble filtrert gjennom supercel (95% Si02) , konsentrert in vacuo og renset på en reversert fasekolonne. Produktet ble eluert i 10% MeOH i H20 (inneholdende 0,02% eddiksyre). Etter sammenslåing av fraksjonene, konsentrering til et lite volum og lyofilisering, ble oppnådd tittelforbindelsen, 26 mg (14%).

Analyse: (C23H23N306» 6H20) .

Beregnet: C, 50,53; H, 6,46; N, 7,73.

Funnet: C, 50,11; H, 6,57; N, 7,64.

<1>HNMR (D20/MeODJ S 1,0 (t,3), 2,0 (m,2), 4,3 (s,2),

5,2 (s, 2), 5,5 (s, 2), 7,5 (s, 1), 8,0 (m, 3), 8,6 (s, 1).

EKSEMPEL 24

Fremstilling av ( 20 S) 9- irtorfolinoroetylcamptothecin

En 1 mmol løsning av trifluormetylsulfonatet av 10-hydroksy-9-morfolinometylcamptothecin, fremstilt som beskrevet i eksempel 23, i tørr DMF (25 ml) ble behandlet med trietylamin (0,4 ml), Pd (eddiksyre)2 (8 mg, 0,04 mmol), P3 (20 mg,

0,08 mmol) og 99% maursyre (0,08 ml, 2 mmol). Reaksjonen ble oppvarmet under argon ved 60°C i 6 timer, konsentrert in vacuo og behandlet med vann. Både den ønskede tittelforbindelsen og det vesentlige biproduktet, 9-metylcamptothecin, ble utfelt (3 00 mg) og ble oppsamlet ved filtrering på silikagel og rensing ved flashkromatografi. 9-metylcamptothecin ble isolert ved eluering med 1% MeOH i CH2C12 (45 mg, 13%). Eluering med 2% MeOH i CH2C12 ga tittelforbindelsen (93 mg, 20%).

Analyse: (C25H25N305« 1/2 H20) .

Beregnet: C 65,78, H, 5,74; N, 9,20.

Funnet: C, 65,87; H, 5,96; N, 9,00.

Massespektrum m/e 448 (MH<+>)

<X>HNMR (CDCl3/MeODA) S 1,0 (t,3), 2,0 (m,2), 2,5

(m, 4), 3,7 (m, 4), 4,0 (s, 2), 5,3 (3,2), 5,6 (q, 2), 7,5

(d, 1), 7,6 (s, 1), 7,7 (d, 1), 8,2 (d, 1), 9,0 (s, 1).

EKSEMPEL 25

AJ.

Fremstilling av ( 20 S) 10- hvdroksy- 9- cvanometylcamptothecin En blanding av 9-trimetylammoniummetyl-lO-hydroksycampto-thecinmetansulfonatsalt, fremstilt som beskrevet i eksempel 8, (0,42 g, 0,8 mmol) i 95% EtOH (35 ml) og natriumcyanid (1,26 g, 25 mmol) ble oppvarmet med tilbakeløp under argon i 3 timer. Løsningsmidlet ble fjernet in vacuo, vann ble tilsatt (20 ml) og pH justert til 1,5 med 3N HCl. Det utfelte rå faste stoffet ble oppsamlet og tørket.

Rensing ble utført ved silikagelkolonne-flashkromatografi. Produktet ble eluert med 4% og 5% MeOH i CH2C12 som ga 110 mg (33%) av tittelforbindelsen.

Analyse (C22H17N305» 13/4 H20) .

Beregnet: 60,75; H, 4,58; N, 9,66.

Funnet: C, 60,63; H, 4,64; N, 9,60.

<1>HNMR (CDCl3/MeODJ S 0,9 (t, 3), 1,8 (m, 2), 4,2

(s, 2), 5,2 (s, 2), 5,3 (q, 2), 7,5 (d, 1), 7,6 (s, 1), 7,9 (d,l), 8,4 (s, 1).

B) Fremstilling av ( 20 S ) 10- hvdroksy-9- aminometylcamptothecinacetatsalt

En løsning av 60 mg (0,15 mmol) av 10-hydroksy-9-cyanometyl camptothecin, fremstilt som beskrevet i eksempel 29, i iseddiksyre (30 ml) ble behandlet med om lag 1 g (våt vekt) av aktivert Raney® nikkel og hydrogenert ved 1785,8 gram/cm<2> i 6 timer. Katalysatoren ble fjernet ved filtrering, og filtratet ble konsentrert in vacuo til et fast residuum. Det konsentrerte filtratet ble deretter løst i vann og renset ved reversfase-kolonnekromatografi ved å eluere produktet med 10% MeOH i vann (inneholdende 0,02% iseddiksyre). De aktuelle fraksjonene ble oppsamlet, konsentrert til et lite volum og frysetørket over natten, og ga 23 mg (33%) av tittelforbindelsen.

Analyse. : C2AH25N307» 10 H20) .

Beregnet: C, 43,90; H, 6,90; N 6,38.

Funnet: C, 43,82; H, 6,89; N, 5,79.

<X>H NMR (DMSO-d6) 6 0,9 (t,3),. 1,9 (m,2), 3,2 (s,2),

5,0 (3,2), 5,1 (s, 2), 5,4 (s, 2), 7,2 (s, 1), 7,5 (q, 2)-, 8,4 (s, 1).

Claims (11)

1. Analogifremgangsmåte for fremstilling av en terapeutisk aktiv forbindelse med formelen: hvori: X er hydroksy; hydrogen; cyano; -CH2NH2; eller -CHO; R er hydrogen når X er cyano; CH2NH2 eller -CHO; eller R er -CHO eller -CHzR<1> når X er hydrogen eller hydroksy; Ri er -o-R<2>; -S-R2; -N-R2 (R3) ;-CH2N-R2 (R3) , eller -N<+->R2(R3)(RA), forutsatt at når R<1> er -N<+->R<2>(R<3>) (R<*>) er forbindelsen bundet til et farmasøytisk akseptabelt anion;R<2>, R3 og RA er de samme eller forskjellige og velges fra H; Ci-e-alkyl; C2.6-hydroksyalkyl; C^-dialkylamino; eller-en - f enyl eller cykloheksyl; og når R<1> er -N-R2(R3) , kan R<2-> og R<3->gruppene kombineres sammen med nitrogenatomet som de er bundet til under dannelse av en morfolin- eller N-metylpiperazino- og 4'-piperidinopiperidinyl-ring; eller et farmasøytisk akseptabelt salt, hydrat eller solvat derav, karakterisert ved at denne fremgangsmåten omfatter: (a) kondensasjon av 10-hydroksycamptothecin med formaldehyd og det tilsvarende primære eller sekundære aminet for å gi alle forbindelsene ifølge formel (I) unntatt forbindelsen hvor X er hydrogen, cyano eller -CHO og R<1> er -N-R<2>(R<3>) og R<2> og R<3> er de samme og er H; eller (b) formylering av 10-hydroksycamptothecin for å gi 9-formyl-10-hydroksycamptothecin som deretter underkastes kondensasjon med de tilsvarende aminene etterfulgt av reduksjon med natriumcyanoborhydrid eller katalytisk reduksjon; eller (c) behandling av de tilsvarende forbindelsene med formel (I) hvori R<1> er -N-R<2>(R<3>) med et alkyleringsmiddel under dannelse av de tilsvarende forbindelsene med formel (I) hvori R<1> er -N<+->R<2>(R3) (R<4>) og R<2>, R3 og R4 ikke er H; eller (d) oppvarming av 9-dimetylaminometyl-10-hydroksycamptothecin eller dets salt med den tilsvarende alkoholen eller tiolen i et ihert løsningsmiddel under dannelse av forbindelser med formelen (I) hvori R<1> er O-R<2>; eller (e) trifluormetylsulfonatet av 10-hydroksycamptothecin underkastes palladium-katalysert karbonylering, og, om ønsket, fremstilles salter, hydrater og solvater derav på i og for seg kjent måte.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, ved fremstilling av forbindelser med formel I hvor X er hydroksy og R er dimetylaminometyl, karakterisert ved at man anvender tilsvarende substituerte utgangsmaterialer.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1, ved fremstilling av forbindelser med formel I hvor X er hydroksy og R er trimetylam-moniummetyl, karakterisert ved at man anvender tilsvarende substituerte utgangsmaterialer.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 1, ved fremstilling av forbindelser med formel I hvor X er hydroksy og R er N-metyl-pipereazinylmetyl, karakterisert ved at man anvender tilsvarende substituerte utgangsmaterialer.

5. Fremgangsmåte ifølge krav 1, ved fremstilling av forbindelser med formel I hvor X er hydroksy og R er N-metylani-lino-metyl, karakterisert ved at man anvender tilsvarende substituerte utgangsmaterialer.

6. Fremgangsmåte ifølge krav 1, ved fremstilling av forbindelser med formel I hvor X er hydroksy og R er cyklo-heksylaminometyl, karakterisert ved at man anvender tilsvarende substituerte utgangsmaterialer.

7. Fremgangsmåte ifølge krav 1, ved fremstilling av forbindelser med formel I hvor X er hydroksy og R er 9-N,N-dimetylaminoetyloksymetyl, karakterisert ved at man anvender tilsvarende substituerte utgangsmaterialer.

8. Fremgangsmåte ifølge krav 1, ved fremstilling av forbindelser med formel I hvor X er hydroksy og R er N-cyanometyl, karakterisert ved at man anvender tilsvarende substituerte utgangsmaterialer.

9. Fremgangsmåte ifølge krav 1, ved fremstilling av forbindelser med formel I hvor X er hydroksy og R er morfolinometyl, karakterisert ved at man anvender tilsvarende substituerte utgangsmaterialer.

10. Fremgangsmåte ifølge krav 1, ved fremstilling av forbindelser med formel I hvor X er aminometyl og R er hydrogen, karakterisert ved at man anvender tilsvarende substituerte utgangsmaterialer.

11. Fremgangsmåte ifølge krav 1, ved fremstilling av forbindelser med formel I hvor X er hydroksy og R er N-cyklopropylaminometyl, karakterisert ved at man anvender tilsvarende substituerte utgangsmaterialer.