MXPA06014684A - Novedosos polipeptidos de enlace antigeno y sus usos. - Google Patents

Abstract

Se proporcionan novedosos polipeptidos de enlace de antigeno (ABP=antigen-binding polypeptides) y sus usos.

Description

NOVEDOSOS POLIPEPTIDOS DE ENLACE DE ANTIGENO Y SUS USOS REFERENCIA CRUZADA A SOLICITUDES RELACIONADAS Esta solicitud reclama prioridad de la Solicitud de patente provisional de los E.U.A. No. de Serie 60/581,334, presentada en junio 18, 2004, Solicitud de patente provisional de los E.U.A. No. de Serie 60/648,222, presentada en enero 28, 2005, y Solicitud de patente provisional de los E.U.A. No. de Serie 60/654,018 presentada en febrero 17, 2005, las especificaciones de las cuales aquí se incorporan en su totalidad. CAMPO DE LA INVENCIÓN Esta invención se refiere a novedosos polipéptidos de enlace de antígeno que comprenden al menos un amino ácido no naturalmente codificado. La presente invención se refiere en general al campo de producción y selección de polipéptidos de enlace de antígeno por los métodos de biología molecular, utilizando tanto química y ADN recombinante. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Un anticuerpo (Ab) producido naturalmente es una estructura tetramérica que consiste de dos cadenas pesadas inmunoglobulina (Ig) idénticas y dos cadenas ligeras idénticas. Las cadenas pesada y ligera de un Ab consisten de diferentes dominios. Cada cadena ligera tiene un dominio variable (VL) y un dominio constante (CL) , mientras que cada cadena pesada tiene un dominio variable (VH) y tres o cuatro dominios constantes (CH) .

Cada dominio, consiste de aproximadamente 110 residuos amino ácido, se pliega en una estructura emparedada ß característica formada de dos hojas- ß empacadas una contra otra, el pliegue de inmunoglobulina. Los dominios VL tienen cada uno tres regiones de determinación de complementariedad (CDRl-3) y los dominios VH tienen cada uno hasta 4 regiones determinantes de complementariedad (CDRl -4) , que son bucles, o giros, que conectan hebras-ß en un extremo de los dominios. Las regiones variables tanto de las cadenas ligeras como pesadas en general contribuyen a especificidad de antígeno, aunque la contribución de las cadenas individuales a la especificidad no es necesariamente igual . Moléculas de anticuerpo han evolucionado para ligar a un número grande de moléculas al utilizar bucles CDR aleatorizados. Subestructuras funcionales de Abs pueden prepararse por proteólisis y por métodos recombinantes. Incluyen el fragmento Fab, que comprende los dominios VH-CH1 de la cadena pesada y los dominios Vl-CLl de la cadena ligera unidos por un solo enlace disulfuro entrecadenas, y el fragmento Fv, que comprende solo los dominios VH y VL, y la porción Fe que comprende la región de enlace sin antígeno de la molécula. En algunos casos, un solo dominio VH retiene afinidad significante por antígeno ( ard et al., 1989, Nature 341, 554-546). También se ha mostrado que una cierta cadena ligera K monomérica ligará específicamente a su antígeno. (L. Masat et al., 1994, PNAS 91:893-896). Cadenas ligeras o pesadas separadas en ocasiones se han encontrado que retienen algo de actividad de enlace de antígeno por igual (Ward et al., 1989, Nature 341, 554-546). Otra subestructura funcional es una Fv de cadena sencilla (scFv) , que comprende las regiones variables de las cadenas ligera y pesada de inmunoglobulina, conectadas covalentemente por un enlazador péptido (S-z Hu et al., 1996, Cáncer Research, 56, 3055-3061). Estas pequeñas proteínas (Mr 25,000) en general retienen especificidad y afinidad por antígeno en un solo polipéptido y pueden proporcionar un bloque de construcción conveniente para moléculas específicas de antígeno más grandes. La vida media corta de scFvs en la circulación limita su utilidad terapéutica en muchos casos . Un andamio de pequeña proteína denominado un "mini cuerpo" se diseñó utilizando una parte del dominio Ig VH como la plantilla (Pessi et al., 1993, Nature 362, 367-369) . Mini cuerpos con alta afinidad (constante de disociación (Kd) de aproximadamente 10"7 M) a interleucina-6 se identificaron al aleatorizar bucles correspondientes a CDR1 y CDR2 de VH y después seleccionar mutantes utilizando el método de exhibición fago (Martin et al., 1994, EMBO J. 13, 5303-5309). Los camellos a menudo carecen de dominios de cadena ligera variable cuando material tipo IgG de su suero se analiza, sugiriendo que suficiente especificidad y afinidad de anticuerpo puede derivarse de dominios VH (tres o cuatro bucles CDR) sólo. Dominios VH "camelizados" con alta afinidad se han elaborado, y puede generarse alta especificidad por aleatorización solo del CDR3. Una alternativa al "mini cuerpo" es el "diacuerpo." Los diacuerpos son pequeños fragmentos de anticuerpos bivalentes y biespecífieos, que tienen dos sitios de enlace de antígeno. Los fragmentos comprenden un dominio variable de cadena pesada (VH) conectado a un dominio variable de cadena ligera (VL) en la misma cadena polipéptido (VH-VL) . Los diacuerpos son similares en tamaño al fragmento Fab. Al utilizar un enlazador que es muy corto para permitir apareado entre los dos dominios en la misma cadena, los dominios se fuerzan para aparear con los dominios complementarios de otra cadena y crear dos sitios de enlace de antígeno. Estos fragmentos de anticuerpos diméricos, o "diacuerpos", son bivalentes y biespecíficos. Ver, P. Holliger et al., PNAS 90:6444-6448 (1993) . Péptidos CDR y miméticos CDR orgánicos se han elaborado (Dougall et al., 1994, Trends Biotechnol . 12, 372-379) . Péptidos CDR son péptidos cortos, típicamente cíclicos, que corresponden a las secuencias amino ácido de los bucles CDR de anticuerpo. Bucles CDR son responsables por interacciones de anticuerpo-antígeno. Péptidos CDR y miméticos CDR orgánicos se ha mostrado que retienen cierta afinidad de enlace (Smyth & von Itzstein, 1994, J. Am. Chem. Soc. 116, 2725-2733) . CDRs de ratón se han injertado en el marco Ig humano sin pérdida de afinidad (Jones et al., 1986, Nature 321, 522-525; Riechmann et al., 1988). En el cuerpo, Abs específicos se eligen y amplifican a partir de una gran biblioteca (maduración de afinidad) . Los procesos pueden reproducirse in vitro utilizando tecnologías de biblioteca combinatoria. La exhibición exitosa de fragmentos Ab en la superficie de bacteriófago ha hecho posible generar y clasificar una vasta cantidad de mutaciones CDR (McCafferty et al., 1990, Nature 348, 552-554; Barbas et al., 1991, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 88,7978-7982; Winter et al., 1994, Annu. Rev. Immunol . 12, 433-455) . Un número creciente de Fabs y Fvs (y sus derivados) se producen por esta técnica. La técnica combinatoria puede combinarse con mímicos o imitadores de Ab. Una cantidad de dominios de proteína que pueden servir potencialmente como andamios de proteínas se han expresado como fusiones con proteínas de cápsido fago. Revisión en Clackson & Wells, Trends Biotechnol . 12:173-184 (1994) . Varios de estos dominios de proteínas ya se han empleado como andamios para exhibir secuencias péptido aleatorias, incluyendo inhibidor de tripsina pancreática bovina (Roberts et al., PNAS 89:2429-2433 (1992)), hormona de crecimiento humano (Lowman et al., Biochemistry 30:10832-10838 (1991)), Venturini et al., Protein Peptide Letters 1:70-75 (1994)), y el dominio de enlace IgG de Streptococcus (O'Neil et al., Techniques in Protein Chemistry V (Crabb, L, . ed.) pp . 517-524, Academic Press, San Diego (1994)). Estos andamios han exhibido una sola región o bucle aleatorizado. Tendamistat se ha empleado como un andamio de presentación en el fago filamentoso M 13 (McConnell and Hoess, 1995, J. Mol. Biol. 250:460-470). Tirosina cinasas de receptor de la familia ErbB juegan papeles pivotales en crecimiento celular y diferenciación. Activación aberrante de estos receptores se asocia con cánceres humanos. La dimerización (el apareado de receptores) es esencial para la actividad de señalización de todos los receptores ErbB. El bloquear la actividad dimerización de ErbB2 se ha mostrado que inhibe directamente la capacidad de ErbB2 para dimerizar con otras proteínas receptores ErbB. Inhibir la dimerización de receptor evita la activación de rutas de señalización ErbB. Una molécula antagonista que regula en forma descendente señalización ErbB puede funcionar como un agente anti tumor. La red de señalización ErbB actualmente es una diana principal en el desarrollo de drogas anti tumor. ErbB-1 es un receptor específico de EGF, mientras que ErbB-2 no tiene ligando natural conocido. ErbB2 es capaz de formar heterodímeros con ErbB-1 ante adición de EGF. ErbB2 también funciona como el socio de dimerización preferido para el ErbB-3 de cinasa-muerte y para ErbB-4, ambos que son receptores para las neuroregulinas . La red de señalización ErbB también puede activarse en una forma indirecta durante señalización por citosinas y ligandos de receptores de proteína acopladas G, indicando que juega un papel central en el control de crecimiento de muchos tipos de células diferentes. El proto-oncogén c-ErbB-1 codifica el receptor de factor de crecimiento epidérmico. Su nombre se origina del homólogo viral v-erbB que se aisló de un virus de eritroblastosis aviar (AEV) en donde estaba contenido como un fragmento del gen c-ErbB-1 de pollo que carece del dominio de enlace de ligando amino-terminal . Sobre-expresión de genes erbB-1 ocurre en un amplio intervalo de tumores, incluyendo carcinomas escamosos de diversos sitios y adenocarcinoma. El gen c-erbB-1 se ubica en la región cromosomal 7pl4 y 7pl2. El proto-oncogén ErbB-2 (también referido como Neu, EGFR-2 o HER-2) es un miembro de la familia tirosina cinasa de receptor transmembrana, que también incluye el receptor EGF y EGFR-3 (HER-3 o ErbB-3) . ErbB-2 codifica una glicoproteína tipo receptor transmembrana de 185 kDa con actividad de tirosina cinasa intrínseca. Aunque, ErbB-2 no tiene ningunos ligandos de alta afinidad conocidos, su actividad de cinasa puede activarse sin ligando ya sea por sobre expresión o heteroasociación con otros miembros de la familia ErbB de receptores. Amplificación del gen ErbB-2 y sobre expresión de su producto se ha detectado en casi 40 por ciento de los tumores de pecho humano primarios. La sobre expresión de ErbB-2 también se observa en carcinomas de ovarios gástricos de saliva y pulmonar sin células pequeñas. ErbB-2 se activa por las neuregulinas en heterodímeros con los receptores neoregulina ErbB- 3 y ErbB- 4. El anticuerpo monoclonal anti-ErbB-2 humanizado Herceptina (de 4D5 monoclonal) ha recibido aprobación de la FDA para tratamiento de cánceres que sobre expresan ErbB-2. Otro anticuerpo anti-ErbB2 en desarrollo es Pertuzumab (de 2C4 monoclonal) . Inhibidores específicos de la actividad tirosina cinasa de ErbB-1 (receptor EGF) también están en pruebas clínicas. Anticuerpos anti-ErbB2 se conocen en la técnica e incluyen pero no están limitados a las patentes de los E.U.A Números: 4,753,894; 5,169,774; 5,677,171 5,720,937; 5,720,954; 5,725,856; 5,770,195 5,772,997 5,783,186; 6,054,561; 6,165,464; 6,333,169 6,015,567 6,387,371; 6,399,063; 6,441,143; 6,458,356 6,627,196, cada una de las cuales aquí se incorpora por referencia. Conexión covalente del polímero hidrofílico (etilen glicol) , abreviado PEG, es un método para incrementar solubilidad en agua, biodisponibilidad, aumentar la vida media en suero, aumentar la vida media terapéutica, modular la inmunogenecidad, modular actividad biológica o extender el tiempo de circulación de muchas moléculas biológicamente activas, incluyendo proteínas péptidos y particularmente moléculas hidrofóbicas . PEG se ha empleado extensamente en productos farmacéuticos, en implantes artificiales y en otras aplicaciones en donde la biocompatibilidad, falta de toxicidad y falta de inmunogenecidad son de importancia. A fin de llevar al máximo las propiedades deseadas de PEG, el peso molecular total y estado de hidratación del polímero PEG o polímeros conectados a la molécula biológicamente activa debe ser suficientemente alto para impartir las características ventajosas típicamente asociadas con la conexión de polímero PEG, tal como aumentada solubilidad en agua y vida media en circulación, mientras que no impacta adversamente la bioactividad de la molécula padre. Derivados PEG frecuentemente están enlazados con moléculas biológicamente activas a través de funcionalidades químicas reactivas, tales como residuos cisteína e istidina, el extremo N y porciones carbohidrato. Proteínas de otras moléculas a menudo tienen una cantidad limitada de sitios reactivos disponibles para conexión de polímero. A menudo, los sitios más adecuados para modificación por conexión de polímero juegan un papel significante en enlace de receptor y son necesarios para retención de la actividad biológica de la molécula. Como resultado, una conexión indiscriminada de cadenas de polímero a estos sitios reactivos en una molécula biológicamente activa a menudo lleva a una reducción significante o incluso pérdida total de actividad biológica de la molécula modificada con polímero. R. Clark et al., (1996), J. Biol. Chem., 271:21969-21977. Para formar conjugados que tienen suficiente peso molecular de polímero para impartir las ventajas deseadas a una molécula diana, enfoques de la técnica previa han involucrado típicamente conexión aleatoria de numerosos brazos de polímero a la molécula, incrementando de esta manera el riesgo de una reducción o incluso pérdida total en bioactividad de la molécula padre . Sitios reactivos que forman los lugares para conectar los derivados PEG a proteínas están dictados por la estructura de la proteína. Proteínas incluyendo enzimas, están compuestas de diversas secuencias de alfa amino ácidos que tienen la estructura general H2N--CHR--COOH. La porción alfa amino (H2N--) de un amino ácido se une a la porción carboxilo (--COOH) de un amino ácido adyacente para formar enlaces amida, que pueden representarse como -- (NH--CHR--CO)n-- , en donde el subíndice "n" puede ser igual a cientos o miles. El fragmento representado por R puede contener sitios reactivos para actividad biológica de proteína y para conectar derivados PEG. Por ejemplo, en el caso del amino ácido lisina, existe una porción --NH2 en la posición épsilon así como en la posición alfa. El --NH2 épsilon está libre para reacción bajo condiciones de pH básico. Gran parte en la técnica en el campo de derivatización de proteína con PEG se ha dirigido a desarrollar derivados PEG para conectar a la porción --NH2 épsilon de residuos nicina presentes en proteínas. "Polyethylene Glycol and Derivatives for Advanced PEGylation" , Nektar Molecular Engineering Catalog, 2003, pp. 1-17. Estos derivados PEG todos tienen la limitación común, sin embargo que no pueden instalarse selectivamente entre los residuos lisina a menudo numerosos presentes en las superficies de las proteínas. Esto puede ser una limitación significante en casos en donde en un residuo lisina es importante para actividad de proteínas, existiendo en un sitio activo de enzima por ejemplo, o en casos en donde un residuo lisina juega un papel para mediar la interacción de la proteína con otras moléculas biológicas como en el caso de sitios de enlace de receptor. Una complicación segunda e igualmente importante de métodos existentes para modificación con polietilen glicol es que los derivados PEG pueden someterse a reacciones secundarias indeseables con residuos diferentes a aquellos deseados. Histidina contiene una porción imino reactiva, representada estructuralmente como --N(H)--, pero muchas especies químicamente reactivas que reaccionan con épsilon --NH2 también pueden reaccionar con --N(H)--. Similarmente, la cadena lateral del amino ácido cisteína contiene un grupo sulfidrilo libre, representado estructuralmente como --SH. En algunos casos, los derivados PEG dirigidos al grupo --NH2 épsilon de lisina también reaccionan con los residuos cisteína, histidina u otros. Esto puede crear mezclas complejas, heterogéneas de moléculas bioactivas derivatizadas PEG y riesgos que destruyen la actividad de la molécula bioactiva que se hace diana. Sería conveniente el desarrollar derivados PEG que permiten un grupo funcional químico sea introducido en un solo sitio dentro de la proteína que entonces permitirá el acoplamiento selectivo de uno o más polímeros PEG a la molécula bioactiva en sitios específicos en la superficie de proteína que son tanto bien definidos como pronosticables . Además de los residuos lisina, se ha dirigido esfuerzo considerable en la técnica hacia el desarrollo de reactivos PEG activados que hacen diana a otras cadenas laterales amino ácido, incluyendo cisteína, histidina y el extremo N. Ver, por ejemplo la patente de los E.U.A. No. 6,610,281 que se incorpora aquí por referencia, y "Polyethylene Glycol and Derivatives for Advanced PEGylation", Nektar Molecular Engineering Catalog, 2003, pp. 1-17. Un residuo cisteína puede introducirse selectivamente en sitio en la estructura de proteínas utilizando mutagénesis dirigida por sitio y otras técnicas conocidas en la especialidad, y la porción sulfidrilo libre resultante puede reaccionarse con derivados PEG que contienen grupos funcionales tiol-reactivos. Este enfoque se complica, sin embargo ya que la introducción de un grupo sulfidrilo libre puede complicar la expresión, plegado y estabilidad de la proteína resultante. De esta manera, sería conveniente el tener un medio para introducir un grupo funcional químico en moléculas bioactivas que permiten el acoplamiento selectivo de uno o más polímeros PEG a la proteína mientras que son simultáneamente compatibles con (es decir, no acoplan en reacciones laterales indeseadas con) sulfidrilos y otros grupos funcionales químicos encontrados típicamente en proteínas. Como puede verse de un muestreado de la técnica, muchos de estos derivados que se han desarrollado para conectar a las cadenas laterales de proteínas, en particular la porción --NH2 en la cadena lateral amino ácido lisina y la porción --SH en la cadena lateral de cisteína, han demostrado ser problemáticos en sus síntesis y uso. Algunos forman enlaces inestables con la proteína sujetos a hidrólisis y por lo tanto a descomposición, degradación o de otra forma son inestables en ambientes acuosos, tales como en la corriente sanguínea. Algunos forman enlaces más estables, pero están sujetos a hidrólisis antes de que se forme el enlace, lo que significa que el grupo reactivo en el derivado PEG puede inactivarse antes que se conecte la proteína. Algunos son algo tóxicos, y por lo tanto menos adecuados para uso in vivo. Algunos son muy lentos para reaccionar para ser prácticamente útiles. Algunos resultan en una pérdida de actividad de proteína al conectar en sitios responsables para la actividad de proteína. Algunos no son específicos en los sitios a los cuales se conectan, lo que también puede resultar en una pérdida de actividad conveniente y una falta de reproducibilidad de resultados. A fin de superar los retos asociados con modificar proteínas con porciones poli (etilen glicol), se han desarrollado derivados PEG que son más estables (por ejemplo la patente de los E.U.A. No. 6,602,498, que se incorpora aquí por referencia) o que reaccionan selectivamente con porciones tiol en moléculas y superficies (por ejemplo patente de los E.U.A. No. 6,610,281, que se incorpora aquí por referencia) . Claramente hay necesidad en la técnica por derivados PEG que sean químicamente inertes en ambientes fisiológicos hasta que se requieran para reaccionar selectivamente para formar enlaces químicos estables. Recientemente, una tecnología totalmente nueva en la ciencia de proteínas se ha reportado, que promete superar muchas de las limitaciones asociadas con modificaciones específicas de sitio en proteínas. Específicamente, se han agregado nuevos componentes a la maquinaria biosintética de proteínas del procariota Escherichia coli (E. coli ) (por ejemplo, L. Wang, et al., (2001), Science 292:498-500) y el eucariota Sacchromyces cerevisiae ( S. cerevisiae) (por ejemplo, J. Chin et al., Science 301:964-7 (2003)), que han permitido la incorporación de amino ácidos no genéticamente codificados en proteínas in vivo . Una cantidad de nuevos amino ácidos con novedosas propiedades químicas, físicas o biológicas, incluyendo etiquetas de fotoafinidad y amino ácidos fotoisomerizables, ceto amino ácidos y amino ácidos glicosilados se han incorporado eficientemente y con alta fidelidad en proteínas en E. coli y en levadura en respuesta al codón ámbar, TAG, utilizando esta metodología. Ver, por ejemplo, J. W. Chin et al., (2002), Journal of the American Chemical Society 124:9026-9027; J. W. Chin, & P. G. Schultz, (2002), ChemBioChem 11:1135-1137; J. W. Chin, et al., (2002), PNAS United States of America 99:11020-11024; y, L. Wang, & P. G. Schultz, (2002), Chem. Comm., 1-10. Estos estudios han demostrado que es posible introducir en forma selectiva y rutinaria grupos funcionales químicos tales como grupos cetona, grupos alquino y porciones azida, que no se encuentran en proteínas, químicamente inertes a todos los grupos funcionales encontrados en los 20 amino ácidos, genéticamente codificados comunes y que pueden utilizarse para reaccionar eficiente y selectivamente para formar enlaces covalentes estables. La capacidad por incorporar amino ácidos no genéticamente codificados en proteínas, permite la introducción de grupos funcionales químicos que puedan proporcionar alternativas valiosas a los grupos funcionales de origen natural, tales como el épsilon -NH2 de lisina, el -SH sulfidrilo de cisteína, el grupo imino de histidina, etc. Ciertos grupos funcionales químicos se conocen inertes a los grupos funcionales que se encuentran en los 20 amino ácidos genéticamente codificados comunes, pero reacciona, limpia y eficientemente para formar enlaces estables. Grupos azida y acetileno, por ejemplo se conocen en la técnica para someterse a una reacción de cicloadición Huisgen [3+2] en condiciones acuosas en la presencia de una cantidad catalítica de cobre. Ver, por ejemplo, Tornoe, et al., (2002) Org. Chem. 67:3057-3064; and, Rostovtsev, et al., (2002) Angew. Chem. Int. Ed. 41:2596-2599. Al introducir una porción azida en una estructura de proteína, por ejemplo se puede incorporar un grupo funcional que es químicamente inerte a aminas, sulfidrilos, ácidos carboxílicos, grupos hidroxilo encontrados en proteínas, pero que también reaccionan en forma uniforme y eficiente con una porción acetileno para formar un producto de cicloadición. De manera importante, en la ausencia de la porción acetileno, la azida permanece químicamente inerte y sin reaccionar en la presencia de otras cadenas laterales de proteína y bajo condiciones fisiológicas. La presente invención se dirige, entre otras cosas, problemas asociados con la actividad y producción de polipéptidos de enlace de antígeno y sus fragmentos, y también se dirige a la producción de polipéptidos de enlace de antígeno con mejoradas propiedades biológicas o farmacológicas, tales como vida media terapéutica mejorada. BREVE COMPENDIO DE LA INVENCIÓN Esta invención proporciona polipéptidos de enlace de antígeno (ABP) que comprenden uno o más amino ácidos no naturalmente codificados. En algunas modalidades, el ABP comprende una cadena pesada de anticuerpo completa. En algunas modalidades, el ABP comprende una cadena ligera de anticuerpo completa. En algunas modalidades, el ABP comprende una región variable de una cadena ligera de anticuerpo. En algunas modalidades, el ABP comprende una región variable de una cadena pesada de anticuerpo. En algunas modalidades, el ABP comprende al menos un CDR de una cadena ligera de anticuerpo. En algunas modalidades, el ABP comprende al menos un CDR de una cadena pesada de anticuerpo. En algunas modalidades, el ABP comprende al menos un CDR de una cadena ligera y al menos un CDR de una cadena pesada. En algunas modalidades, el ABP comprende un Fab. En algunas modalidades, el ABP comprende dos o más Fab ' s . En algunas modalidades, el ABP comprende un scFv. En algunas modalidades, el ABP comprende dos o más scFv. En algunas modalidades, el ABP comprende un minicuerpo. En algunas modalidades, el ABP comprende dos o más minicuerpos. En algunas modalidades, el ABP comprende un diacuerpo. En algunas modalidades, el ABP comprende dos o más diacuerpos. En algunas modalidades, el ABP comprende una región variable de una cadena ligera y una región variable de una cadena pesada. En algunas modalidades, el ABP comprende una cadena ligera completa y una cadena pesada completa. En algunas modalidades, el ABP comprende uno o más dominios Fe o una porción de los mismos. En algunas modalidades, el ABP comprende una combinación de cualquiera de las modalidades anteriores. En algunas modalidades, el ABP comprende un homodímero, heterodímero, homomultímero o heteromultímero de cualquiera de las modalidades anteriores. En algunas modalidades, el ABP comprende un polipéptido que liga a un socio de enlace en donde el socio de enlace comprende un antígeno, un polipéptido, una molécula de ácido nucleico, un polímero u otra molécula o substancia. En algunas modalidades, el ABP se asocia con una molécula o substancia de andamio sin anticuerpo. En algunas modalidades, el ABP comprende una o más modificaciones de post-traducción. En algunas modalidades, el ABP se enlaza a un enlazador, polímero o molécula biológicamente activa. En algunas modalidades, el ABP se enlaza a un polímero bifuncional, enlazador bifuncional, o al menos un ABP adicional. En algunas modalidades, el ABP se enlaza con un polipéptido que no es ABP. En algunas modalidades, el polipéptido de enlace de antígeno comprende un amino ácido no-naturalmente codificado está enlazado con uno o más polipéptidos de enlace de antígeno adicionales que también pueden comprender un amino ácido no naturalmente codificado. En algunas modalidades, el amino ácido no-naturalmente codificado se enlaza a un polímero soluble en agua. En algunas modalidades, el polímero soluble en agua comprende una porción poli (etilen glicol) . En algunas modalidades, la molécula de poli (etilen glicol) es un polímero bifuncional. En algunas modalidades, el polímero bifuncional se enlaza con un segundo polipéptido. En algunas modalidades, el segundo polipéptido es un polipéptido de enlace de antígeno. En algunas modalidades, el polipéptido de enlace de antígeno comprende al menos dos amino ácidos enlazados a un polímero soluble en agua que comprende una porción poli (etilen glicol). En algunas modalidades, al menos un amino ácido es un amino ácido no naturalmente codificado. En algunas modalidades, el polipéptido de enlace de antígeno comprende una substitución, adición o eliminación que modula la afinidad del polipéptido de enlace de antígeno por un antígeno cuando se compara con al afinidad del polipéptido de enlace de antígeno correspondiente sin la substitución, adición o eliminación. En algunas modalidades, el polipéptido de enlace de antígeno comprende una substitución, adición o eliminación que aumenta la estabilidad del polipéptido de enlace de antígeno cuando se compara con la estabilidad del polipéptido de enlace de antígeno correspondiente sin la substitución, adición o eliminación. En algunas modalidades, el polipéptido de enlace de antígeno comprende una substitución, adición o eliminación que modulan la inmunogenicidad del polipéptido de enlace de antígeno cuando se compara con la inmunogenicidad del polipéptido de enlace de antígeno correspondiente sin la substitución, adición o eliminación. En algunas modalidades, el polipéptido de enlace de antígeno comprende una substitución, adición o eliminación que modula la vida media en suero o tiempo de circulación del polipéptido de enlace de antígeno cuando se compara con la vida media en suero o tiempo de circulación del polipéptido de enlace de antígeno correspondiente sin la substitución, adición o eliminación. En algunas modalidades, el polipéptido de enlace de antígeno comprende una substitución, adición o eliminación que aumenta la solubilidad acuosa del polipéptido de enlace de antígeno correspondiente cuando se compara con la solubilidad acuosa del polipéptido de enlace de antígeno correspondiente sin la substitución, adición o eliminación, en algunas modalidades, el polipéptido de enlace de antígeno comprende una substitución, adición o eliminación que aumenta la solubilidad del polipéptido de enlace de antígeno producido en una célula huésped o anfitriona cuando se compara con la solubilidad del polipéptido de enlace de antígeno correspondiente sin la substitución, adición o eliminación. En algunas modalidades, el polipéptido de enlace de antígeno comprende una substitución, adición o eliminación que aumenta la expresión del polipéptido de enlace de antígeno en una célula anfitriona o síntesis in vi tro cuando se compara con la expresión del polipéptido de enlace de antígeno correspondiente sin la substitución, adición o eliminación. En algunas modalidades, el polipéptido de enlace de antígeno comprende una substitución, adición o eliminación que aumenta la resistencia a proteasa del polipéptido de enlace de antígeno cuando se compara con resistencia a proteasa del polipéptido de enlace de antígeno correspondiente sin la substitución, adición o eliminación. En algunas modalidades, las substituciones de amino ácido en el ABP pueden ser con amino ácidos de origen natural o no de origen natural, siempre que al menos una substitución sea con un amino ácido no naturalmente codificado. En algunas modalidades, el amino ácido no naturalmente codificado comprende un grupo carbonilo, un grupo acetilo, un grupo aminooxi, un grupo hidrazina, un grupo hidrazida, un grupo semicarbazida, un grupo azida, o un grupo alquino. En algunas modalidades, el amino ácido no-naturalmente codificado comprende un grupo carbonilo. En algunas modalidades, el amino ácido no-naturalmente codificado tiene la estructura: en donde n es 0-10; Ri es un alquilo, arilo, alquilo sustituido, o arilo sustituido; R2 es H, un alquilo, arilo, alquilo sustituido y arilo sustituido; y R3 es H, un amino ácido, un polipéptido, o un grupo de modificación de extremo amino, y R4 es H, un amino ácido, un polipéptido, o un grupo de modificación de extremo carboxi . En algunas modalidades, el amino ácido no-naturalmente codificado comprende un grupo aminooxi. En algunas modalidades, el amino ácido no-naturalmente codificado comprende un grupo hidrazida. En algunas modalidades, el amino ácido no-naturalmente codificado comprende un grupo hidrazina. En algunas modalidades, el residuo amino ácido no-naturalmente codificado comprende un grupo semicarbazida. En algunas modalidades, el residuo amino ácido no-naturalmente codificado comprende un grupo azida. En algunas modalidades, el amino ácido no-naturalmente codificado tiene la estructura: en donde n es 0-10; Ri es un alquilo, arilo, alquilo substituido, arilo substituido o no está presente; X es O, N, S o no está presente; m es 0-10; R2 es H, un amino ácido, un polipéptido, o un grupo de modificación de extremo amino y R3 es H, un amino ácido, un polipéptido, o un grupo de modificación de extremo carboxi. En algunas modalidades, un amino ácido no-naturalmente codificado comprende un grupo alquino. En algunas modalidades, el amino ácido no-naturalmente codificado tiene la estructura: en donde n es 0-10; R-¡_ es alquilo, arilo, alquilo sustituido, o arilo sustituido; X es 0, N, S o no está presente; m es 0-10, R2 es H, un amino ácido, un polipéptido o un grupo de modificación de extremo amino y R3 es H, un amino ácido, un polipéptido, o un grupo de modificación de extremo carboxi. En algunas modalidades, el polipéptido es un agonista, agonista parcial, antagonista, antagonista parcial, o agonista inverso de al menos una actividad del antígeno. En algunas modalidades; el agonista, agonista parcial, antagonista, antagonista parcial, o agonista inverso comprende un amino ácido no-naturalmente codificado enlazado con un polímero soluble en agua. En algunas modalidades, el polímero soluble en agua comprende una porción poli (etilen glicol). En algunas modalidades, el agonista, agonista parcial, antagonista, antagonista parcial o agonista inverso comprende un amino ácido no-naturalmente codificado y uno o más modificaciones post-traducción, enlazador, polímero o molécula biológicamente activa. La presente invención también proporciona ácidos nucleicos aislados que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido de enlace de antígeno en donde el polinucleótido comprende cuando menos un codón selector que incluye pero no está a SEQ ID NO: 18, 20, 22, 25, 27, 29. En algunas modalidades, el codón selector se elige del grupo que consiste de un codón ámbar, codón ocre, codón ópalo, un codón único, un codón raro y un codón de cuatro bases. La presente invención también proporciona métodos para producir un polipéptido de enlace de antígeno enlazado a un polímero soluble en agua. En algunas modalidades, el método comprende contactar un polipéptido de enlace de antígeno aislado que comprende un amino ácido no-naturalmente codificado con un polímero soluble en agua que comprende una porción que reacciona con el amino ácido no naturalmente codificado. En algunas modalidades, el amino ácido no-naturalmente codificado incorporado en el polipéptido de enlace de antígeno es reactivo hacia un polímero soluble en agua que de otra forma no es reactivo hacia ninguno de los 20 amino ácidos comunes. En algunas modalidades, el amino ácido no-naturalmente codificado incorporado en el polipéptido de enlace de antígeno es reactivo hacia un enlazador, polímero o molécula biológicamente activa que de otra forma no es reactiva hacia ninguno de los 20 amino ácidos comunes. En algunas modalidades, el polipéptido de enlace de antígeno enlazado con el polímero soluble en agua se elabora al reaccionar un polipéptido de enlace de antígeno que comprende un amino ácido que contiene carbonilo con una molécula de poli (etilen glicol) que comprende un grupo aminooxi, hidrazina, hidrazida o semicarbazida. En algunas modalidades, el grupo aminooxi, hidrazina, hidrazida o semicarbazida se enlaza a la molécula de poli (etilen glicol) a través de un enlace amida. En algunas modalidades, el polipéptido de enlace de antígeno enlazado con el polímero soluble en agua se elabora al reaccionar una molécula de poli (etilen glicol) que comprende un grupo carbonilo con un polipéptido que comprende un amino ácido no-naturalmente codificado que comprende un grupo aminooxi, hidrazina, hidrazida o semicarbazida. En algunas modalidades, el polipéptido de enlace de antígeno enlazado al polímero soluble en agua se elabora al reaccionar un polipéptido de enlace de antígeno que comprende un amino ácido que contiene alquino una molécula de polietilen glicol que comprende una porción azida. En algunas modalidades, el grupo azida o alquino se enlaza a la molécula de poli (etilen glicol) a través de un enlace amida. En algunas modalidades, el polipéptido de enlace de antígeno enlazado con el polímero soluble en agua se elabora al reaccionar un polipéptido de enlace de antígeno que comprende un amino ácido que contiene azida con una molécula de poli (etilen glicol) que comprende una porción alquino. En algunas modalidades, el grupo azida o alquino se enlaza a la molécula de poli (etilen glicol) a través de un enlace amida. En algunas modalidades, la molécula de poli (etilen glicol) tiene un peso molecular de entre aproximadamente 0.1 kDa y aproximadamente 100 kDa. En algunas modalidades, la molécula de poli (etilen glicol) tiene un peso molecular de entre 0.1 kDa y 50 kDa. En algunas modalidades, la molécula de polietilen glicol es un polímero ramificado. En algunas modalidades, cada ramificación del polímero ramificado con poli (etilen glicol) tiene un peso molecular de entre 1 kDa y 100 kDa, o entre 1 kDa y 50 kDa. En algunas modalidades, el polímero soluble en agua enlazado al polipéptido de enlace de antígeno comprende una porción polialquilen glicol. En algunas modalidades, el residuo amino ácido no naturalmente codificado incorporado en el polipéptido de enlace de antígeno comprende un grupo carbonilo, un grupo aminooxi, un grupo hidrazida, un grupo hidrazina, un grupo semicarbazida, un grupo azida o un grupo alquino. En algunas modalidades, el residuo amino ácido no naturalmente codificado incorporado en el ABP comprende una porción carbonilo y el polímero soluble en agua comprende una porción aminooxi, hidrazida, hidrazina o semicarbazida. En algunas modalidades, el residuo amino ácido no-naturalmente codificado incorporado en el polipéptido de enlace de antígeno comprende una porción alquino y el polímero soluble en agua comprende una porción azida. En algunas modalidades, el residuo amino ácido no-naturalmente codificado incorporado en el polipéptido de enlace de antígeno comprende una porción azida y el polímero soluble en agua comprende una porción alquino. La presente invención también proporciona composiciones que comprenden un polipéptido de enlace de antígeno que comprende un amino ácido no naturalmente codificado y un portador farmacéuticamente aceptable. En algunas modalidades, el amino ácido no-naturalmente codificado se enlaza a un a polímero soluble en agua. La presente invención también proporciona células que comprenden un polinucleótido que codifica el polipéptido de enlace de antígeno que comprende un codón selector. En algunas modalidades, las células comprenden una RNA sintetasa ortogonal y/o una tRNA ortogonal para substituir un amino ácido no-naturalmente codificado en el polipéptido de enlace de antígeno. La presente invención también proporciona métodos para producir un polipéptido de enlace de antígeno que comprende un amino ácido no naturalmente codificado. En algunas modalidades, los métodos comprenden cultivar células que comprenden un polinucleótido o polinucleótidos que codifican un polipéptido de enlace de antígeno, una RNA sintetasa ortogonal y/o un tRNA ortogonal bajo condiciones para permitir expresión del polipéptido de enlace de antígeno; y purificar el polipéptido de enlace de antígeno de células y/o medio de cultivo. La presente invención también proporciona métodos paras incrementar la vida media terapéutica, vida media en suero o tiempo de circulación de los polipéptidos de enlace de antígeno. La presente invención también proporciona métodos para modular inmunogenicidad de los polipéptidos de enlace de antígeno. En algunas modalidades, los métodos comprenden substituir un amino ácido no-naturalmente codificado por cualquiera uno o más amino ácidos en los polipéptidos de enlace de antígeno de origen natural y/o enlazar el polipéptido de enlace de antígeno a un enlazador, un polímero, un polímero soluble en agua o una molécula biológicamente activa. La presente invención también proporciona métodos para tratar a un paciente que requiere este tratamiento con una cantidad efectiva de un polipéptido de enlace de antígeno de la presente invención. En algunas modalidades, los métodos comprenden administrar al paciente una cantidad terapéuticamente efectiva de una composición farmacéutica que comprende un polipéptido de enlace de antígeno que comprende un amino ácido no naturalmente codificado y un portador farmacéuticamente aceptable. En algunas modalidades, el amino ácido no-naturalmente codificado se enlaza a un polímero soluble en agua . La presente invención también proporciona polipéptidos de enlace de antígeno que comprenden una secuencia mostrada en SEQ ID NO: 19, 21, 23, 24, 26, 28, 30, 31 y sus fragmentos, o cualquier otra secuencia polipéptido de enlace de antígeno, excepto que al menos un amino ácido se substituye por un amino ácido no naturalmente codificado. En algunas modalidades, el amino ácido no-naturalmente codificado se enlaza con un polímero soluble en agua. En algunas modalidades, el polímero soluble en agua comprende una porción poli (etilen glicol). En algunas modalidades, el amino ácido no-naturalmente codificado comprende un grupo carbonilo, un grupo aminooxi, un grupo hidrazida, un grupo hidrazina, un grupo semicarbazida, un grupo azida, o un grupo alquino. La presente invención también proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden un portador farmacéuticamente aceptable y un polipéptido de enlace de antígeno que comprende la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 19, 21, 23, 24, 26, 28, 30, 31 y sus fragmentos, o cualquier otra secuencia de polipéptido de enlace de antígeno, en donde al menos un amino ácido se substituye por un amino ácido no naturalmente codificado. En algunas modalidades, el amino ácido no-naturalmente codificado comprende una porción sacárido, en algunas modalidades, el polímero soluble en agua se enlaza al polipéptido mediante una porción sacárido. En algunas modalidades, un enlazador, polímero o molécula biológicamente activa se enlaza al polipéptido de enlace de antígeno mediante una porción sacárido. La presente invención también proporciona un polipéptido de enlace de antígeno que comprende un polímero soluble en agua enlazado por un enlace covalente al polipéptido de enlace de antígeno en un solo amino ácido. En algunas modalidades, el polímero soluble en agua comprende una porción poli (etilen glicol) . En algunas modalidades, el amino ácido enlazado covalentemente con el polímero soluble en agua es un amino ácido no-naturalmente codificado presente en el polipéptido . La presente invención proporciona un polipéptido de enlace de antígeno que comprende cuando menos un enlazador, un polímero, o molécula biológicamente activa, en donde el enlazador, polímero o molécula biológicamente activa se conecta al polipéptido a través de un grupo funcional de un amino ácido no-naturalmente codificado incorporado ribosomalmente en el polipéptido, en algunas modalidades, el polipéptido está mono-modificado con polietilen glicol. La presente invención también proporciona un polipéptido ABP que comprende un enlazador, polímero o molécula biológicamente activa que se conecta a uno o más amino ácidos no-naturalmente codificados en donde el amino ácido no-naturalmente codificado se incorpora ribosomalmente en el polipéptido en sitios previamente selectos . En otra modalidad, la conjugación del polipéptido de enlace de antígeno que comprende uno o más amino ácidos de origen no natural a otra molécula, incluyendo pero no limitados a PEG, proporciona polipéptido de enlace de antígeno substancialmente purificado debido a la reacción química única utilizada para conjugación con el amino ácido no natural. La conjugación del polipéptido de enlace de antígeno que comprende uno o más amino ácidos no naturalmente codificados a otra molécula, tal como PEG, puede realizarse con otras técnicas de purificación realizadas antes de o siguiendo la etapa de conjugación para proporcionar un polipéptido de enlace de antígeno substancialmente puro. BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Figura 1 - Un diagrama de la estructura general de la molécula de anticuerpo (IgG) y sus porciones de enlace de antígeno se ilustra. Los CDR están contenidos dentro del sitio de reconocimiento de antígeno. Figura 2 - Construcciones empleadas para expression/suppresión periplásmica (Figura 2, Panel A) y citoplásmica (Figura 2, Panel B) de scFv-108 se ilustran.

Ubicaciones de los codones de parada ámbar se indican. Cassette Bicistronic empleado para expresión/supresión del fragmento Fab-108 (Figura 2, Panel C) se ilustra. Las construcciones empleadas para expresión/supresión periplásmica de fragmentos scFv-4D5 se ilustran (Figura 2, Panel D y Panel E) . Un cistron para expresión/supresión de fragmento Fab-4D5 se ilustra (Figura 2, Panel F) . Figura 3 - Supresión (Figura 3, Panel A) de mutaciones ámbar en la segunda serina del enlazador GlySer (S131Am) y análisis de purificación IMAC del scFv que contiene pAcF correspondiente (Figura 3, Panel B) se ilustran. Figura 4 - Supresión de una mutación ámbar en la cadena VL (L156) durante expresión citoplásmica de un scFv se ilustra. Figura 5 - Modificación con polietilen glicol y dimerización de fragmentos pAcF-scFv-108 se muestra en la Figura 5, Panel A. Posición de scFv mono-modificado con polietilen glicol y el dímero se indica por las cabezas de flecha sencillas y dobles respectivamente. Figura 5, Panel B muestra modificación con polietilen glicol de fragmento pAcF-scFv-108 (S136) . La Figura 5 Panel C muestra que no se observó modificación con polietilen glicol de fragmentos WT scFv.

Figura 6 - Un gel muestra fracciones tomadas durante purificación de homodímeros scFv-108 se ilustra. Figura 7 - Enlace de pAcF o proteínas scFv que contienen pAcF-PEG a células A431 que expresan receptores EGF se ilustra en la Figura 7, Paneles A-C. Figura 8 - Un gel que muestra fragmentos Fab que contienen pAcF y pAcF-PEG de mAb 108 se ilustra como Figura 8, Panel A. Enlace de fragmentos Fab de mAb 108 a células A431 que expresan receptores EGF se ilustra en Figura 8, Paneles B-D. Figura 9 - Un ejemplo de un ABP hetero-bifuncional de la presente invención se ilustra. Figura 10 - Geles que muestran la supresión de una mutación ámbar en la segunda serina del enlazador GlySer de fragmentos C-terminal (Figura 10, Panel A) o scFv-4D5 N-terminal se ilustran. Figura 11 - análisis SDS-PAGE se ilustra de pAcF-Fab-4D5- (K139) y Fab-4D5-cys tanto bajo condiciones reductoras como no reductoras (Figura 11, Panel A) . La Figura 11, Panel B muestra una técnica Western de muestras ilustradas en la Figura 11, Panel A con anticuerpo anti-His. Figura 12 - Fab 4E10 humano que neutraliza HIV-1 enlazado al péptido T20 se ilustra. Figura 13 - Un diagrama de un procedimiento de dimerización se ilustra. Figura 14 - Análisis SDS-PAGE sin reducción (Figura 14, Panel A) y reducción (Figura 14, Panel B) de formación de dímero scFv se ilustra. Figura 15 - Análisis SDS-PAGE de dímero scFv purificado se ilustra. DEFINICIONES Habrá de entenderse que esta invención no se limita a las particulares metodología, protocolos, líneas celulares, construcciones y reactivos aquí descritos y como tal puede variar. También habrá de entenderse que la terminología empleada aquí es con el propósito de describir modalidades particulares solamente, y no se pretende que limite el alcance de la presente invención, que se limitará solo por las reivindicaciones anexas. Como se emplea aquí y en las reivindicaciones anexas, las formas singulares "un", "uno", y "el/la" incluyen referencias en plural a menos de que lo indique de otra forma claramente el contexto. De esta manera, por ejemplo, la referencia a un "polipéptido de enlace de antígeno" o "ABP" es una referencia a una o más de estas proteínas e incluye sus equivalentes conocidos por aquellos con destreza en la técnica y así en adelante. A menos que de otra forma se defina, todos los términos técnicos y científicos aquí empleados tienen el mismo significado como se entiende comúnmente por una persona con destreza ordinaria en la especialidad a la cual pertenece esta invención. Aunque cualesquiera métodos, dispositivos y materiales similares o equivalentes a aquellos aquí descritos pueden utilizarse en la práctica o prueba de la invención, ahora se describen los preferidos métodos, dispositivos y materiales . Todas las publicaciones y patentes aquí mencionadas se incorporan por referencia con el propósito de describir e ilustrar por ejemplo las construcciones y metodologías que se describen en las publicaciones, que pueden emplearse en conexión con la invención actualmente descrita. Las publicaciones aquí discutidas se proporcionan solamente para su descripción antes de la fecha de presentación de la presente solicitud. Nada aquí habrá de considerarse como una admisión de que los inventores no tienen derecho a anteponer fecha a esta descripción en virtud de invención previa o por ninguna otra razón. El término "substancialmente purificado" se refiere a un ABP que puede estar substancial o esencialmente libre de componentes que normalmente acompañan o interactúan con la proteína como se encuentra en su ambiente de origen natural, es decir una célula nativa o célula anfitriona en el caso de ABP producidos en forma recombinante . ABP que puede estar substancialmente libre de material celular incluye preparaciones de proteína que tiene menos de aproximadamente 30 por ciento, menos de aproximadamente 25 por ciento, menos de aproximadamente 20 por ciento, menos de aproximadamente 15 por ciento, menos de aproximadamente 10 por ciento, menos de aproximadamente 5 por ciento, menos de aproximadamente 4 por ciento, menos de aproximadamente 3 por ciento, menos de aproximadamente 2 por ciento, o menos de aproximadamente 1 por ciento (en peso seco de proteína contaminante) . Cuando ABP o su variante se produce en forma recombinante por las células anfitrionas, la proteína puede estar presente a aproximadamente 30 por ciento, aproximadamente 25 por ciento, aproximadamente 20 por ciento, aproximadamente 15 por ciento, aproximadamente 10 por ciento, aproximadamente 5 por ciento, aproximadamente 4 por ciento, aproximadamente 3 por ciento, aproximadamente 2 por ciento, o aproximadamente 1 por ciento o menos del peso seco de la célula. Cuando la ABP o su variante se produce recombinantemente por las células anfitrionas, la proteína puede estar presente en el medio de cultivo a aproximadamente 5g/L, aproximadamente 4g/L, aproximadamente 3g/L, aproximadamente 2g/L, aproximadamente lg/L, aproximadamente 750mg/L, aproximadamente 500mg/L, aproximadamente 250mg/L, aproximadamente lOOmg/L, aproximadamente 50mg/L, aproximadamente lOmg/L, o aproximadamente lmg/L o menos del peso seco de la célula. De esta manera, ABP "substancialmente purificada" como se produce por los métodos de la presente invención puede tener un nivel de pureza de al menos aproximadamente 30 por ciento, al menos aproximadamente 35 por ciento, al menos aproximadamente 40 por ciento, al menos aproximadamente 45 por ciento, al menos aproximadamente 50 por ciento, al menos aproximadamente 55 por ciento, al menos aproximadamente 60 por ciento, al menos aproximadamente 65 por ciento, al menos aproximadamente 70 por ciento, específicamente un nivel de pureza de al menos aproximadamente 75 por ciento, 80 por ciento, 85 por ciento, y más específicamente, un nivel de pureza de al menos aproximadamente 90 por ciento, un nivel de pureza de al menos aproximadamente 95 por ciento, un nivel de pureza de al menos aproximadamente 99 por ciento o mayor, como se determina por métodos apropiados tales como análisis SDS/PAGE, RP-HPLC, SEC, y electroforesis capilar. Una "célula anfitriona recombinante" o "célula anfitriona" se refiere a una célula que incluye un polinucleótido exógeno, independientemente del método empleado para inserción, por ejemplo absorción directa, transducción, acoplamiento F u otros métodos conocidos en la especialidad para crear células anfitrionas recombinantes. El polinucleótido exógeno puede mantenerse como un vector no integrado, por ejemplo un plásmido o en forma alterna puede integrarse en el genoma anfitrión. Como se emplea aquí, el término "medio" o "medios" incluyen cualquier medio de cultivo, solución, sólido, semisólido o soporte rígido que puede soportar o contener cualquier célula anfitriona, incluyendo células anfitrionas bacterianas, células anfitrionas de levadura, células anfitrionas de insecto, células anfitrionas de planta, células anfitrionas eucarióticas, células anfitrionas de mamíferos, células CHO o E. coli , y contenido de célula. De esta manera, el término puede abarcar medio en donde la célula anfitriona se ha desarrollado, por ejemplo medio en el cual se ha secretado ABP, incluyendo medio ya sea antes o después de una etapa de proliferación. El término también puede abarcar amortiguadores o reactivos que contienen Usados de células anfitrionas, tales como en el caso en donde el ABP se produce intracelularmente y las células anfitrionas se lisan o rompen para liberar el ABP.

"Agente reductor" como se emplea aquí, respecto a plegamiento de proteína, se define como cualquier compuesto o material que mantiene grupos sulfhidrilo en el estado reducido y reduce enlaces disulfuro intra- o intermoleculares . Agentes reductores convenientes incluyen pero no están limitados a ditiotritol (DTT) , 2-mercaptoetanol , ditioeritritol , cisteína, cisteamina (2-aminoetanetiol) , y glutationa reducida. Es fácilmente aparente para aquellos con destreza en la técnica que una amplia variedad de agentes reductores son adecuados para utilizar en el método y composiciones de la presente invención. "Agente oxidante", como se emplea aquí respecto a plegado de proteína se define como cualquier compuesto o material que sea capaz de retirar un electrón de un compuesto que se oxida. Agentes oxidantes convenientes incluyen pero no están limitados a glutationa oxidada, cistina, cistamina, ditiotreitol oxidado, eritreitol oxidado, y oxígeno. Es fácilmente aparente para aquellos con destreza en la técnica que una amplia variedad de agentes oxidantes son adecuados para utilizar en los métodos de la presente invención. "Agente desnaturalizante" o "desnaturalizante" como se emplea aquí, se define como cualquier compuesto material que provocará un desdoblado reversible de una proteína. La fuerza de un agente desnaturalizante o desnaturalizante se determinará tanto por las propiedades como la concentración del agente desnaturalizante o desnaturalizante particular. Adecuados agentes desnaturalizantes o desnaturalizantes pueden ser caótropos, detergentes, solventes orgánicos, solventes miscibles en agua, fosfolípidos o una combinación de dos o más de estos agentes. Caótropos convenientes incluyen pero no están limitados a urea, guanidina y tiocianato de sodio. Detergentes útiles pueden incluir pero no están limitados a fuertes detergentes tales como dodecil sulfato de sodio, o polioxietilén éteres (por ejemplo detergentes Tween o Trito) , sarcosilo, detergentes no iónicos suaves (por ejemplo digitonina) , detergentes catiónicos suaves tales como N->2 , 3- (Dioleioxi) -propil-N,N,N-trimetilamonio, detergentes iónicos suaves (colato de sodio o deoxicolato de sodio) o detergentes zwitteriónicos incluyendo pero no limitados a sulfobetaínas (Zwittergent) , 3- (3-clolamidopropil) dimetilamonio-1 -propan sulfato (CHAPS) , y 3- (3-clolamidopropil) dimetilamonio-2-hidroxi-l-propan sulfonato (CHAPSO) . Solventes orgánicos miscibles en agua tales como acetonitrilo, alcandés inferiores (en especial C2 - C4 alcanoles tales como etanol o isopropanol) o alcandioles inferiores (en especial C2 - C4 alcandioles tales como etilén glicol) puedan emplearse como desnaturalizantes. Fosfolípidos útiles en la presente invención pueden ser fosfolípidos de origen natural tales como fosfatidil etanol amina, fosfatidil colina, fosfatidil serina y fosfatidil inositol o derivados fosfolípidos sintéticos o variantes tales como dihexanoilfosfatidilcolina o diheptanoilfosfatidilcolina. "Plegado" como se emplea aquí, describe cualquier proceso reacción o método que transforma polipéptidos que contienen enlaces disulfuro de un estado inadecuadamente plegado o desplegado a una conformación nativa o adecuadamente plegada respecto a enlaces disulfuro. "Co-legado" como se emplea aquí, se refiere específicamente a procesos de plegado, reacciones o métodos que emplean al menos dos polipéptidos que interactúan entre sí y resultan en la transformación de polipéptidos no plegados o inadecuadamente plegados a polipéptidos nativos, adecuadamente plegados. Los anticuerpos son proteínas, que exhiben especificidad de enlace a un antígeno específico. Anticuerpos nativos usualmente son glicoproteínas eterotetraméricas de aproximadamente 150,000 daltons, compuestas por dos cadenas ligeras (L) idénticas y dos cadenas pesadas (H) idénticas. Cada cadena ligera se enlaza a una cadena pesada por un enlace disulfuro covalente mientras que el número de enlaces disulfuro varía entre las cadenas pesadas de diferentes isotipos inmunoglobulina. Cada cadena pesada y ligera también tiene fuentes disulfuro intracadena espaciadas regularmente. Cada cadena pesada tiene cuando menos en un extremo un dominio variable (VH) seguido por una cantidad de dominios constantes. Cada cadena ligera tiene un dominio variable en un extremo (VL) y un dominio constante en su otro extremo; el dominio constante de la cadena ligera se alinea con el primer dominio constante de la cadena pesada y el dominio variable de cadena ligera se alinea con el dominio variable de la cadena pesada. Residuos amino ácido particulares se considera que forman una interfase entre los dominios variables de cadena ligera y pesada. El término "variable" se refiere al hecho de que ciertas porciones de los dominios variables difieren extensamente en secuencia entre anticuerpos y son responsables por la especificidad de enlace de cada anticuerpo particular por su antígeno particular. Sin embargo, la variabilidad, no está distribuida uniformemente a través de los dominios variables de anticuerpos. Se concentra en tres segmentos denominados regiones para determinación de complementareidad (CDRs = Complementarity Determining Regions) tanto en los dominios variables de cadena ligera y de cadena pesada. Las porciones más altamente conservadas de los dominios variables se denominan las regiones marco (FR) . Los dominios variables de cadenas pesada y ligera nativas comprenden cada uno cuatro regiones FR, substancialmente adoptando una configuración de hoja ß , conectada por tres o cuatro CDRs, que forman bucles que conectan, y en algunos casos forman parte de la estructura de hoja ß . Las CDRs en cada cadena se mantienen en conjunto en proximidad cercana por las regiones FR, y con las CDRs de la otra cadena, contribuyen a la formación del sitio de enlace de antígeno de anticuerpos (ver Kabat et al., Sequences of Proteins of Inmunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)). Los dominios constantes no están involucrados directamente en el enlace de un anticuerpo con un antígeno, pero exhiben diversas funciones efectoras. Dependiendo de la secuencia de amino ácido de la región constante de sus cadenas pesadas, anticuerpos o inmunoglobulinas pueden asignarse a diferentes clases. Hay cinco clases principales de inmunoglobulina: IgA, IgD, IgE, IgG y IgM, y varias de estas pueden además ser divididas en subclases (isotipos) , por ejemplo IgGl, IgG2 , IgG3 , y IgG4 ; IgAl y IgA2. Las regiones constantes de cadena pesada que corresponden a las diferentes clases de inmunoglobulina se denominan [ a ] , [ d ] , [ e ] , [ ? ] y [ µ ] , respectivamente. De las diversas clases de inmunoglobulinas humanas, solo IgGl, IgG2 , IgG3 y IgM humana se conoce que activan complemento. Maduración de afinidad de anticuerpos in vivo está dirigida por la selección de antígeno de variantes de anticuerpo de afinidad superior que se elaboran primordialmente por hipermutagénesis somática. Un "cambio de repertorio" también a menudo ocurre en donde los genes de línea germinal predominantes de la respuesta secundaria o terciaria se ve que difieren de aquellos de la respuesta primaria o secundaria. El proceso de maduración definida del sistema inmune puede replicarse al introducir mutaciones en genes de anticuerpo in vitro y utilizando selección de afinidad para aislar mutantes con afinidad mejorada. Estos anticuerpos mutantes pueden exhibirse en la superficie de bacteriófagos filamentosos o microorganismos tales como levadura y anticuerpos pueden seleccionarse por su afinidad para antígeno o por su cinética de diisociación (reducción) del antígeno. Hawkins et al. J. Mol. Biol. 226:889-896 (1992). Mutagénesis de desplazamiento CDR se ha empleado para madurar por afinidad anticuerpos humanos que ligan la glicoproteína envolvente humana gpl20 del virus de inmunodeficiencia humana tipo 1 (HIV-I) (Barbas III et al. PNAS (USA) 91: 3809-3813 (1994); y Yang et al. J. Mol. Biol. 254:392-403 (1995)); y un fragmento Fv de cadena sencilla anti-c-erbB-2 (Schier et al. J. Mol. Biol. 263:551567 (1996)). Entremezclado de cadena de anticuerpo y mutagénesis CDR se emplearon para madurar por afinidad un anticuerpo humano de alta afinidad dirigido contra el tercer bucle hipervariable de HIV (Thompson et al. J. Mol. Biol. 256:77-88 (1996)). Balint y Larrick Gene 137:109-118 (1993) describe una mutagénesis de exploración dirigida por oligodeoxiribonucleótido asistida por computadora en donde todas las CDRs de un gen de región variable son buscadas simultáneas y acusiosamente por variantes mejoradas. Un anticuerpo humanizado específico de [ a ] v [ ß ] 3 fue madurado por afinidad utilizando una estrategia de mutagénesis limitada inicial en donde toda posición de todas las 6 CDRs se mutó seguido por la expresión y supervisión de una biblioteca combinatoria incluyendo los mutantes de más alta afinidad (Wu et al . PNAS (USA) 95: 6037-6-42 (1998)). Anticuerpos fago exhibidos se revisan por Chiswell y McCafferty TIBTECH 10:80-84 (1992); y Rader y Barbas III Current Opinión in Biotech. 8:503-508 (1997). En cada caso fueron anticuerpos mutantes con afinidad mejorada en comparación con un anticuerpo padre se reportan en las referencias anteriores, el anticuerpo mutante tiene sustituciones de amino ácido en un CDR. Por "maduración de afinidad" aquí se entiende el proceso de mejorar la afinidad de un anticuerpo por su antígeno. Métodos para maduración de afinidad incluyen pero no están limitados a métodos de clasificación computacional y métodos experimentales. Por "anticuerpo" aquí se entiende una proteína que consiste de uno o más polipéptidos substancialmente codificados por todo o parte de los genes de anticuerpo. Los genes de inmunoglobulina incluyen pero no están limitados a los genes de región constante kappa, lamda, alfa, gamma (IgGl, IgG2, IgG3 , y IgG4) , delta, épsilon, y mu así como la miríada de genes de región variable de inmunoglobulina. Aquí anticuerpos se pretende que incluya anticuerpos de longitud íntegra y fragmentos de anticuerpo, e incluyen anticuerpos que existen naturalmente en cualquier organismo o son de ingeniería (por ejemplo son variantes) . Por "fragmento de anticuerpo" se entiende cualquier forma de un anticuerpo diferente a la forma de longitud íntegra. Fragmentos de anticuerpos aquí incluyen anticuerpos que son componentes más pequeños que existen dentro de los anticuerpos de longitud íntegra, y anticuerpos que se han sometido a ingeniería. Fragmentos de anticuerpo incluyen pero no están limitados a Fv, Fe, Fab, y (Fab')2, Fv de cadena sencilla (scFv) , diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos, anticuerpos híbridos difuncionales, CDR1, CDR2 , CDR3 , combinaciones de CDR1 s, regiones variables, regiones marco, regiones constantes y semejantes (Maynard & Georgiou, 2000, Annu. Rev. Biomed. Eng. 2:339-76; Hudson, 1998, Curr. Opin. Biotechnol . 9:395-402) . Por "método de clasificación computacional" aquí se entiende cualquier método para diseñar una o más mutaciones en una proteína, en donde el método utiliza una computadora para evaluar las energías de las interacciones de substituciones de cadena lateral amino ácido potenciales entre si y/o con el resto de la proteína. Por "Fe" aquí se entiende las porciones de un anticuerpo que comprenden dominios de inmunoglobulina C/2 y C^3 (C/2 y C/3). Fe también puede incluir cualesquiera residuos que existen en la bisagra N-terminal entre C? 1 y C? \ (C l). Fe puede referirse a esta región en aislamiento, o esta región en el contexto de un anticuerpo o fragmento de anticuerpos. Fe también incluye cualesquiera formas modificadas de Fe, incluyendo pero no limitadas al monómero nativo, el dímero nativo (enlace disulfuro enlazado) , dímeros modificados (de enlace disulfuro y/o no covalentemente enlazado) y monómeros modificados (es decir derivados) . Por "anticuerpo de longitud íntegra" aquí se entiende la estructura que constituye la forma biológica natural de una cadena H y/o L de anticuerpo. En la mayoría de los mamíferos, incluyendo humanos y ratones, esta forma es un tetrámetro y constituye dos pares idénticos de dos cadenas de inmunoglobulina, cada par tiene una cadena ligera y una pesada, cada cadena ligera comprende dominios de inmunoglobulina VL y CL, y cada cadena pesada comprende dominios de inmunoglobulina VH, C^l, C 2 y C/3. En cada par, las regiones variables de cadena ligera y pesada (V y VH) en conjunto son responsables por enlace con un antígeno, y las regiones constantes (CL, C^l, C^2 y C^3, particularmente C/2 y C?3 son responsables por funciones efectoras de anticuerpo. En algunos mamíferos, por ejemplo en camellos y llamas, anticuerpos de longitud íntegra pueden consistir de solo dos cadenas pesadas, cada cadena pesada comprende dominios de inmunoglobulina VH, C 2 y C^3. Por "inmunoglobulina (Ig) " aquí se entiende una proteína que consiste de uno o más polipéptidos substancialmente codificados por genes de inmunoglobulina. Las inmunoglobulinas incluyen pero no están limitadas a anticuerpos. Inmunoglobulinas pueden tener una cantidad de formas estructurales, incluyendo pero no limitadas a anticuerpos de longitud íntegra, fragmentos de anticuerpos y dominios de inmunoglobulina individuales incluyendo pero no limitados a VH, C^l, C/2, C?3, VL, y CL. Por "dominio de inmunoglobulina (Ig) " aquí se entiende un dominio de proteína que consiste de un polipéptido substancialmente codificado por un gen de inmunoglobulina. Dominios Ig incluyen pero no están limitados a VH, C^l, C/2, C 3, V y CL como se ilustra en la Figura 1. Por "secuencia de proteína variante" como se emplea aquí, se entiende una secuencia de proteína que tiene uno o más residuos que difieren en identidad de amino ácido de otra secuencia de proteína similar. La secuencia de proteína similar puede ser la secuencia de proteína de tipo silvestre natural, u otra variante de la secuencia de tipo silvestre. En general, una secuencia de partida se refiere como una secuencia "padre", y ya puede ser una secuencia de tipo silvestre o variante. Por ejemplo, modalidades preferidas de la presente invención pueden utilizar secuencias padre humanizadas en las cuales se realiza análisis computacional para producir variantes. Por "región variable" de un anticuerpo aquí se entiende un polipéptido o polipéptidos compuestos del dominio de inmunoglobulina VH, los dominios de inmunoglobulina VL, o los dominios de inmunoglobulina VH y VL como se ilustra en la Figura 1 (incluyendo variantes) . Región variable puede referirse a este o estos polipéptidos en aislamiento, como un fragmento Fv, como un fragmento scFv, como esta región en el contexto de un fragmento de anticuerpo más grande, o como esta región en el contexto de un anticuerpo de longitud íntegra o una molécula de andamio sin anticuerpo alterna. La presente invención puede aplicarse a anticuerpos obtenidos de un amplio rango de fuentes. El anticuerpo puede codificarse substancialmente por un gen de anticuerpo o genes de anticuerpo de cualquier organismo, incluyendo pero no limitados a humanos, ratones, ratas, conejos, camellos, llamas, dromedarios, monos, particularmente mamíferos y en particular humanos y en particular ratones y ratas. En una modalidad, el anticuerpo puede ser totalmente humano, obtenido por ejemplo de un paciente o un sujeto, al utilizar ratones transgénicos u otros animales (Bruggemann & Taussig, 1997, Curr. Opin. Biotechnol . 8:455-458) o bibliotecas de anticuerpos humanos acoplados con métodos de selección (Griffiths & Duncan, 1998, Curr. Opin. Biotechnol . 9:102-108) . El anticuerpo puede ser de cualquier fuente, incluyendo de origen natural o artificial. Por ejemplo, la presente invención puede utilizar un anticuerpo de ingeniería, incluyendo pero no limitado a anticuerpos quiméricos y anticuerpos humanizados (Clark, 2000, Immunol . Today 21:397-402) o derivados de una biblioteca combinatoria. Además, el anticuerpo optimizado puede ser una variante de ingeniería de un anticuerpo que se codifica substancialmente por una o más genes de anticuerpos naturales. Por ejemplo, en una modalidad, el anticuerpo que se optimiza es un anticuerpo que se ha identificado por maduración de afinidad. Con respecto a ABP ' s de la invención, el término "antigénicamente específico" o "que liga específicamente" se refiere a ABP que liga con uno o más epítopes de un antígeno o socio de enlace de interés, pero que no reconoce substancialmente y liga otras moléculas en una muestra que contiene una población mixta de antígenos. El término "ABP biespecífico" o "ABP multiespecífico" como se emplea aquí se refiere a un ABP que comprende dos o más sitios de enlace de antígeno o sitios de enlace o socio de enlace, un primer sitio de enlace tiene afinidad para un primer antígeno o epítope y un segundo sitio de enlace tiene afinidad de enlace para un segundo antígeno o epítope distinto al primero. El término "epítope" como se emplea aquí, se refiere a un sitio en un antígeno o socio de enlace que se reconoce por un ABP. Un epítope puede ser una secuencia formada lineal o conformacional o forma de amino ácidos, si el antígeno comprende un polipéptido. Un epítope puede estar en cualquier sitio en cualquier tipo de antígeno en donde un ABP liga al antígeno. Como se emplea aquí, "polipéptido de enlace de antígeno" o "ABP" habrá de incluir aquellos polipéptidos y proteínas que tienen al menos la actividad biológica de enlace específico con un socio de enlace particular tal como antígeno, así como análogos ABP, isoformas ABP, miméticos o imitadores de ABP, fragmentos ABP, proteínas ABP híbridas, proteínas de fusión, oligómeros y multímeros, homólogos, variantes de patrón de glicosilación, y muteínas, de los mismos, independientemente de la actividad biológica del mismo, y además independientemente del método de síntesis o fabricación incluyendo pero no limitados a recombinante (ya sea producido a partir de cDNA, DNA genómico, DNA sintético u otra forma de ácido nucleico), in vi tro, in vivo, por microinyección de moléculas de ácido nucleico, sintéticos, transgénicos, y métodos activados por gen.

Ejemplos específicos de ABP incluyen pero no están limitados a, moléculas de anticuerpo, cadena pesada, cadena ligera, región variable, CDR, Fab, scFv, moléculas sin anticuerpo de andamio alterno, ligandos, receptores péptidos, o cualquier secuencia de amino ácidos que liga a un antígeno. El término "ABP" o "polipéptido de enlace de antígeno" se refiere a un ABP como se describió anteriormente, así como un polipéptido que retiene al menos una actividad biológica de un anticuerpo de origen natural, incluyendo pero no limitado a, actividades diferentes a enlace de antígeno. Actividades diferentes al enlace de antígeno incluyen pero no están limitados a cualquiera una o más de las actividades asociadas con Fe. Polipéptidos de enlace de antígeno incluyen las sales farmacéuticamente aceptables y prodrogas, y prodrogas de las sales, polimorfos, hidratos, solvatos, fragmentos biológicamente activos, variantes biológicamente-activas y estereoisómeros del ABP humano de origen natural así como variantes agonistas, miméticas y antagonistas del ABP humano de origen natural y sus fusiones de polipéptido. Fusiones que comprenden amino ácidos adicionales en <-el extremo amino, extremo carboxilo o ambos, se abarcan por el término "polipéptido de enlace de antígeno". Fusiones ejemplares incluyen pero no están limitados a por ejemplo, metionil ABP en donde una metionina se enlaza con el extremo N del ABP resultando de la expresión recombinante, fusiones con el propósito de purificación (incluyendo pero no limitadas a, poli-histidina o epítopes de afinidad) , fusiones con el propósito de enlazar ABP con otras moléculas biológicamente activas, fusiones con péptido de enlace de albúmina de suero, y fusiones con proteínas de suero tales como albúmina de suero. El término "antígeno" o "socio de enlace" se refiere a una substancia que es la diana para la actividad de enlace exhibida por el ABP. Virtualmente cualquier substancia puede ser un antígeno o socio de enlace para un ABP. Ejemplos de antígenos o socios de enlace incluyen pero no están limitados a, Alfa-1 antitripsina, Angiostatina, factor Antihemolítico, anticuerpos, Apolipoproteína, Apoproteína, factor natriurético Atrial, Polipéptido natriuretic Atrial, Péptidos atriales, quimiocinas C-X-C (por ejemplo, T39765, NAP-2, ENA-78, Gro-a, Gro-b, Gro-c, IP-10, GCP-2, NAP-4, SDF-1, PF4, MIG) , Calcitonina, CC quimiocinas (por ejemplo Proteína quimioatrayente de monocitos-1, Proteína quimioatrayente de monocitos-2, Proteína quimioatrayente de monocitos-3, Proteína inflamatoria de monocitos-1 alfa, Proteína inflamatoria de monocitos-1 beta, RANTES, 1309, R83915, R91733, HCCl , T58847, D31065, T64262), ligando CD40, ligando de equipo C, Colágeno, factor de estímulo de colonia (CSF = Colony stimulating factor) , Factor de complemento 5a, Inhibidor de complemento, Receptor de complemento 1, citocinas, (por ejemplo, Péptido de Activación de Neutrófilo Epitelial - 78, GROD/MGSA, GRO, GRO, MIP-1, MIP-1, MCP-1) , Factor de Crecimiento Epidérmico (EGF = Epidermal Growth Factor) , Eritropoyetina ("EPO"), Toxinas Exfoliantes A y B, Factor IX, Factor VII, Factor VIII, Factor X, Factor de Crecimiento de Fibroblastos (FGF - Fibroblast Growth Factor) , Fibrinógeno, Fibronectina, G-CSF, GM-CSF, Glucocerebrosidasa, Gonadotropina, factores de crecimiento, proteínas de Cuerpo espín (por ejemplo, Sonic, Indian, Desert) , Hemoglobin, Factor de Crecimiento de Hepatocitos (HGF - Hepatocyte Growth Factor) , Hirudina, Albúmina de suero humano, Insulina, Factor de Crecimiento Tipo Insulina (IGF - Insulin-like Growth Factor), interferonas (por ejemplo, IFN- a , IFN-/?, IFN-? ) , interleucinas (por ejemplo, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-IO, IL-ll, IL-12, etc.), Factor de Crecimiento de Queratinocitos (KGF Keratinocyte Growth Factor) , Lactoferrina, factor inhibitoria de leucemia, Luciferasa, Neurturina, Factor inhibitorio de neutrófilos (NIF - Neutrophil inhibitory factor) , oncostatina M, Proteína Osteogénica, Hormona Paratiroide, PD-ECSF, PDGF, hormonas de péptidos (por ejemplo, Hormona de Crecimiento Humano) , Pleiotropina, Proteína A, Proteína G, Exotoxinas pirogénicas A, B y C, Relaxina, Renina, SCF, Receptor de complemento soluble I, I-CAM soluble, receptores de interleucina soluble (IL-1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15), receptor de TNF soluble, Somatomedina, Somatostatina, Somatotropina, Estreptocinasa, Superantígenos, es decir, Enterotoxinas de Estafilococos (SEA, SEB, SEC1 , SEC2 , SEC3 , SED, SEE), Superóxido dismutasa, Toxina de síndrome de choque tóxico (TSST-I) , Timosina alfa 1, Activador de plasminógeno de tejido, Factor de necrosis de tumor beta (TNF beta), Receptor de factor de necrosis de tumor (TNFR - Tumor necrosis factor receptor) , Factor de necrosis factor-alfa (TNF alfa) , Factor de Crecimiento Endotelial Vascular (VEGEF - Vascular Endothelial Growth Factor) , Urocinasa y muchos otros. Muchas de estas proteínas están comercialmente disponibles (Ver, por ejemplo el catálogo de Sigma BioSciences 2002 y la lista de precios) , y las secuencias de proteínas y genes correspondientes y típicamente muchas de sus variantes, son bien conocidas (por ejemplo ver Genbank) . Antígenos adicionales o socios de enlace incluyen pero no están limitados a activadores de expresión y transcripción. Activadores de transcripción y expresión ejemplares incluyen genes y proteínas que modulan crecimiento de células, diferenciación, regulación, o semejantes. Activadores de expresión y transcripción se encuentran en procariotas, virus y eucariotas, incluyendo hongos, plantas y animales, incluyendo mamíferos, proporcionando un amplio intervalo de dianas terapéuticas. Se apreciará que los activadores de expresión y transcripción regulan la transcripción por muchos mecanismos, por ejemplo al ligar a receptores, estimular una cascada de transducción de señal, regular la expresión de factores de transcripción, ligar a promotores y mejoradores, ligar a proteínas que ligan a promotores y mejoradotes, desembobinar DNA, combinar pre-mRNA, poliadenilar RNA y degradar RNA. Antígenos o socios de enlace incluyen pero no están limitados a, activadores de expresión tales como citocinas, moléculas inflamatorias, factores de crecimiento, sus receptores, y productos de oncogen, por ejemplo interleucinas (por ejemplo, IL-1, IL-2, IL-8, etc.), interferonas, FGF, IGF-I, IGF-II, FGF, PDGF, TNF, TGF-a: , TGF-/?, EGF, KGF, SCF/c-Kit, CD40L/CD40, VLA-4/VCAM-1 , ICAM-l/LFA-I , e hialurina/CD44 ; moléculas de transducción de señal y productos de oncogen correspondientes, por ejemplo, Mos, Ras, Raf y Met; y activadores y supresores de transcripción, por ejemplo, p53, Tat, Fos, Myc, Jun, Myb, Reí, y receptores de hormona esferoide tales como aquellos para estrógeno, progesterona, testosterona, aldosterona, el ligando receptor LDL y corticosterona. Proteínas de vacuna pueden ser antígenos o socios de enlace incluyendo pero no limitados a proteínas de hongos infecciosos, por ejemplo especies Aspergillus, Candida ; bacterias, particularmente E. coli , que sirven como un modelo para bacterias patogénicas, así como bacterias médicamente importantes tales como Staphylococci (es decir, aureus) , o Streptococci (es decir, pneumoniae) ; protozoarios tales como esporozoa (es decir, Plasmodia) , rizópodos (por ejemplo, Entamoeba) y flagelados ( Trypanosoma, Leishmania, Trichomonas, Giardia, etc.); virus tales como virus (+) RNA (ejemplos incluyen virus de erupciones o viruela, por ejemplo vaccinia ; Picornaviruses, por ejemplo polio; Togavirus, por ejemplo rubéola ; Flavivirus, por ejemplo HCV; y Coronavirus) , virus (-) RNA (por ejemplo, Rhabdovirus, por ejemplo, VSV; Paramixovirus, por ejemplo RSV; Ortomixovirus, por ejemplo influenza; Bunyavirus; y Arenavirus) , virus de dsDNA (Reovirus, por ejemplo) , virus RNA a DNA, es decir Retrovirus, por ejemplo HIV y HTLV, y ciertos virus de DNA a RNA tales como Hepatitis B. Antígenos o socios de enlace pueden ser enzimas que incluyen pero no están limitadas a, amidasas, amino ácido racemasas, acilasas, deshalogenasas, dioxigenasas, diarilpropano peroxidasas, epimerasas, epóxido hidrolasas, esterasas, isomerasas, cinasas, glucosa isomerasas, glicosidasas, glicosil transferasas, haloperoxidasas, monooxigenasas (por ejemplo p450s) , lipasas, lignina peroxidasas, nitrilo hidratasas, nitrilasas, proteasas, fosfatasas, subtilisinas, transaminasa y nucleasas. Proteínas relacionadas en forma agrícola tales como las proteínas de resistencia a insectos (por ejemplo las proteínas Cry) , enzimas de producción de almidón y lípidos, toxinas de plantas e insectos, proteínas de resistencia a toxina, proteínas de desintoxicación de Micotoxinas, enzimas de crecimiento de plantas (por ejemplo Ribulosa 1, 5-Bisfosfato Carboxilasa/Oxigenasa, "RUBISCO"), lipoxigenasa (LOX), y Fosfoenolpiruvato (PEP) carboxilasa también pueden ser antígenos o socios de enlace . Por ejemplo, el antígeno o socio de enlace puede ser una molécula asociada con la enfermedad, tal como un antígeno de superficie de tumor, tales como idiotipos de células B, CD20 en células B malignas, CD33 en blastos leucémicos, y HER2/neu en cáncer de pecho. En forma alterna, el antígeno o socio de enlace puede ser un receptor de factor de crecimiento. Ejemplos de los factores de crecimiento incluyen, pero no están limitados a, factores de crecimiento epidérmico (EGFs = epidermal growth factors) , transferina, factor de crecimiento tipo insulina, factores de crecimiento de transformación (TGFs = transforming growth factors), interleucina-1 , e interleucina-2. Por ejemplo, una alta expresión de receptores EGF se ha encontrado en una amplia variedad de tumores primarios epiteliales humanos. TGF-[a] se ha encontrado que media una ruta de estimulación autócrina en células de cáncer. Varios anticuerpos monoclonales murinos se han demostrado que son capaces de ligar receptores EGF, bloquear el enlace de ligando a receptores EGF, e inhibir la proliferación de una variedad de líneas de células de cáncer humano, en cultivo y en modelos de xeno-injerto. Mendelsohn and Basalga (1995) Antibodies to growth factors and receptors, in Biologic Therapy of Cáncer, 2nd Ed. , JB Lippincott, Philadelphia, pp 607-623. De esta manera, los ABPs de la invención pueden emplearse para tratar una variedad de cánceres . El antígeno o socio de enlace también puede ser una proteína de superficie celular o receptor asociado con enfermedad de arteria coronaria, tal como receptor Iib/lIIa de glicoproteína de plaquetas, enfermedades autoinmunes tales como CD4 , como CAMPATH-I y región de lípido A del lipopolisacárido bacteriano gram negativo. Anticuerpos humanizados contra CD4 se han sometido a pruebas clínicas en el tratamiento de pacientes con micosis fungoide, soriasis postular generalizada, soriasis severa, y artritis reumatoide. Anticuerpos contra región lípido A del lipopolisacárido bacteriano gram-negativo, se han probado clínicamente en el tratamiento de choque séptico. Anticuerpos contra CAMPATH-I también se han probado clínicamente en el tratamiento contra artritis reumatoide refractaria. De esta manera, ABPs de la invención pueden emplearse para tratar una variedad de enfermedades autoinmunes. Vaswani et al. (1998) "Humanized antibodies as potential therapeutic drugs" Annals of Allergy, Asthma and Immunology 81:105-115. El antígeno o socio de enlace también pueden ser proteínas o péptidos asociados con enfermedades alérgicas humanas, tales como proteínas mediadoras inflamatorias, por ejemplo Interleucina-1 (IL-1) , factor de necrosis de tumor (TNF) , receptor de leucotrieno y 5-lipoxigenasa, y moléculas de adhesión tales como V-CAM/VLA-4. Además, IgE también puede servir como el antígeno o socio de enlace debido a que IgE juega un papel pivotal en reacciones alérgicas hipersensibles inmediatas de tipo I tales como asma. Estudios han mostrado que el nivel de IgE en suero total tiende a correlacionarse con la severidad de enfermedades, en especial en asma. Burrows et al. (1989) "Association of asthma with serum IgE levéis and skin-test reactivity to allergens" New Engl . L. Med. 320:271-277. De esta manera, ABPs seleccionados contra IgE pueden emplearse para reducir el nivel de IgE o bloquear el enlace de IgE a mastocitos y basófilos en el tratamiento de enfermedades alérgicas sin tener impactos substancial en las funciones inmune normales. El antígeno o socio de enlace también puede ser una superficie viral o proteína núcleo que puede servir como un antígeno para activar la inmuno respuesta del anfitrión. Ejemplos de estas proteínas virales incluyen pero no están limitadas a glicoproteínas (o antígenos de superficie, por ejemplo GP120 y GP41) y proteínas cápsido (o proteínas estructurales, por ejemplo proteína P24) ; antígenos de superficie o proteínas núcleo de virus de hepatitis A, B, C, D o E (por ejemplo antígeno de superficie de hepatitis B pequeña (SHBsAg) o virus de hepatitis B y las proteínas núcleo de virus de hepatitis C, antígeno sNS3 , NS4 y NS5) ; glicoproteína (proteína G) o la proteína de fusión (proteína F) de virus sincitial respiratorio (RSV = respiratory syncytial virus) ; proteínas de superficie y núcleo de virus de herpes simplex HSV-1 y HSV-2 (por ejemplo glicoproteína D de HSV-2) . El antígeno o socio de enlace también puede ser un producto de gen supresor de tumor mutado que ha perdido su función supresora de tumor, y puede hacer a las células más susceptibles a cáncer. Genes supresores de tumor son genes que funcionan para inhibir el crecimiento celular y ciclos de división, evitando de esta manera el desarrollo de neoplasia. Mutaciones en genes supresores de tumor provocan que la célula ignore uno o más de los componentes de la red de señales inhibitorias, superando los puntos de verificación de ciclo celular y resultando en una velocidad superior de crecimiento celular controlado-cáncer. Ejemplos de genes supresores de tumor incluyen pero no están limitados a, DPC-4, NF-I, NF-2, RB, p53 , WT1 , BRCA1 y BRCA2. DPC-4 está involucrado en cáncer pancreático y participa en una ruta citoplásmica que inhibe la división celular. NF-I codifica una proteína que inhibe Ras, una proteína inhibitoria citoplásmica. NF-I está involucrado en neurofibroma y feocromocitomas del sistema nervioso y leucemia mieloide. NF-2 codifica una proteína nuclear que está involucrada en meningioma, schwanoma, y ependimoma del sistema nervioso. RB codifica la proteína pRB, una proteína nuclear que es un inhibidor mayor de ciclo celular. RB está involucrado en retinoblastoma al igual que cáncer de huesos, vejiga, pulmonar de células pequeñas y de pecho. p53 codifica proteína p53 que regula la división celular y puede inducir apoptosis. Mutación y/o inacción de p53 se encuentra en un amplio intervalo de cánceres. WT1 está involucrado en tumor de Wilms de los ríñones. BRCA1 está involucrado en cáncer de pecho y ovarios, y BRCA2 está involucrado en cáncer de pecho. De esta manera, ABPs pueden emplearse para bloquear las interacciones del producto de gen con otras proteínas o bioquímicos en las rutas de inicio y desarrollo de tumor. El antígeno o socio de enlace puede ser una molécula CD incluyendo pero no limitada a, CDIa, CDIb, CDIc, CDId, CD2, CD3 ? , CD3 d , CD3 e , CD4 , CD5 , CD6, CD7, CD8a, CD8/?, CD9, CDlO, CDlla, CDllb, CDllc, CDwl2, CD13, CD14, CD15, CD15s, CD16a, CD16b, CD18, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD24, CD25, CD26, CD27, CD28, CD29, CD30, CD31, CD32, CD33, CD34, CD35, CD36, CD37, CD38, CD39, CD40, CD41, CD42a, CD42b, CD42c, CD42d, CD43, CD44, CD45, CD45R, CD46, CD47, CD48, CD49a, CD49b, CD49c, CD49d, CD49e, CD49f, CD50, CD51, CD52 , CD53, CD54, CD55, CD56, CD57, CD58, CD59, CDw60, CD61, CD62E, CD62L, CD62P, CD63, CD64, CD65, CD66a, CD66b, CD66c, CD66d, CD66e, CD66f, CD67, CD68, CD69, CDw70, CD71, CD72 , CD73, CD74 , CDw75, CDw76, CD77, CD79a, CO19 ß , CD80, CD81, CD82, CD83, CD84, CD85, CD86, CD87, CD88, CD89, CD90, CD91, CDw92, CD93 , CD94, CD95, CD96, CD97, CD98, CD99, CDlOO, CDlOl, CD102, CD103, CD104, CD105, CD106, CD107a, CD107b, CDwl08, CDwl09, CD110-113, CD114, CD115, CD116, CD117, CD118, CD119, CD120a, CD120b, CD121a, CD121b, CD122, CD123, CDwl24, CD125, CD126, CDwl27, CDwl28a, CDwl28b, CD129, CDwl30, CD131, CD132, CD133, CD134, CD135, CD136, CDwl37, CD138, CD139, CD140a, CD140b, CD141, CD142, CD143, CD144, CDwl45, CD146, CD147, CD148, CDwl49, CD150, CD151, CD152, CD153, CD154, CD155, CD156, CD157, CD158a, CD158b, CD161, CD162, CD163, CD164, CD165, CD166, y TCR . El antígeno socio de enlace puede ser VEGF, receptor VEGF, EGFR, Her2, TNFa, receptor TNFRI , GPIIb/lIIa, cadena alfa IL-2R, cadena beta IL-2R, proteína RSV F, alfa 4 integrina, IgE, receptor IgE, digoxina, veneno de gariba, complemento C5, OPGL, antígeno de tumor CA-125, proteínas de estafilococos, proteínas de estafilococos epidermidis, proteínas de estafilococos aureus, proteínas involucradas en infección de estafilococos (incluyendo pero no limitadas a, Staphylococcus aureus y Staphylococcus epidermidis), receptor IL-6, CTLA-4, RSV, sub-unidad Tac de receptor IL-2, IL-5 y EpCam. El antígeno o socio de enlace puede ser un fragmento de una molécula. Ejemplos de ABPs biespecífieos incluyen pero no están limitados a, aquellos con una ABP dirigido contra un antígeno de célula de tumor y el otro ABP dirigido contra una molécula de activación citotóxica tal como anti-Fc/Rl/anti-CD 15, anti-pl85HER2/Fc/ RUI (CD 16), célula B anti-maligna/anti-CD3 (1D10) , anti-CD3/anti-pl85 HER2, anti-CD3/anti-p97, carcinoma de célula anti renal/anti-CD3, anti-CD3/anti-OVCAR-3 , anti-CD3/L-Dl (carcinoma anti-colon) , análogo de hormona de estímulo anti-CD3/anti-melanocitos, receptor anti-EGF/anti-CD3 , anti-CD3/anti-CAMAl, anti-CD3/anti-CD19, anti-CD3/MoV18 , molécula de adhesión de célula anti-neural (NCAM) /anti-CD3 , proteína enlace anti-folato (FBP) /anti-CD3 , antígeno asociado a anti -pan carcinoma (AMOC-31) /anti-CD3 ; ABPs biespecíficos con un ABP que liga específicamente a un antígeno de tumor y otro ABP que liga a una toxina tal como anti-saporina/anti-Id-1, anti-CD22/anti-saporina, anti-CD7/anti-saporina, anti-CD38/anti-saporina, cadena anti-CEA/anti-ricina A, anti-interferona- a (IFN-a)/idiotipo anti-hibridoma, anti- CEA/anti-vinca alcaloide; ABPs biespecíficos para prodrogas activadas por enzimas convergentes tales como anti-CD30/anti -fosfatasa alcalina (que cataliza la conversión de prodroga mitomicina fosfato en mitomicina alcohol) ; ABPs biespecíficos que pueden utilizarse como agentes fibrinolíticos tales como activador de plasminógeno anti-fibrina/anti-tejido (tPA) , activador de plasminógeno tipo anti-fibrina/anti-urocinasa (uPA) ; ABPs biespecíficos para hacer diana en complejos inmunes a receptores de superficie celular tales como receptor anti-Fc/anti-lipoproteína de baja densidad (LDL) (por ejemplo Fc RI, Fc/RII o FcyRIII); ABPs biespecíficos para utilizar en terapias de enfermedades infecciosas tales como anti-CD3/anti-virus herpes simplex (HSV) , receptor anti-célula T: complejo CD3/anti-influenza, anti-Fc/ R/anti-HIV; ABPs biespecíficos para detección de tumor in vi tro o in vivo tales como anti-CEA/anti- EOTUBE, anti-CEA/anti-DPTA, anti-pl85 HER2/anti-hapteno; ABPs biespecíficos como adyuvantes de vacuna (ver Fanger, MW et al., Crit Rev. Immunol . 1992 ; 12 (3-4) : 101-24 , que se incorpora aquí por referencia) ; y ABPs biespecíficos como herramientas de diagnóstico tales como anti-conejo IgG/anti-ferritina, anti-peroxidasa de rábano (HRP) /anti-hormona, anti-so atostatina/anti-substancia P, anti-HRP/anti-FITC, anti-CEA/anti- ?-galactosidasa (ver Nolan, O et R.

O'Kennedy, Biochim Biophys Acta. 1990 Aug 1; 1040(1) :1- 11, que se incorpora aquí por referencia) . Ejemplos de ABPs triespecíficos incluyen anti-CD3/anti-CD4/anti-CD37, anti-CD3/anti-CD5/anti-CD37 y anti-CD3/anti-CD8/anti-CD37. Diversas referencias describen modificación de los polipéptidos por conjugación de polímero o glicosilación. El término "ABP" o "polipéptido de enlace de antígeno" incluye pero no está limitado a, polipéptidos conjugados a un polímero tal como PEG y puede comprender uno o más derivitizaciones adicionales de cisteina, lisinam, amino ácidos N o C-terminales, u otros residuos. Además, el ABP puede comprender un enlazador, polímero o molécula biológicamente activa, en donde el amino ácido al cual se conjuga el enlazador, polímero o molécula biológicamente activa, puede ser un amino ácido no natural de acuerdo con la presente invención, o puede conjugarse con un amino ácido codificado naturalmente utilizando técnicas conocidas en la especialidad tales como acoplamiento a lisina o cisteína. La patente de los E.U.A. No. 4,904,584 describe polipéptidos agotados en lisina modificada con polietilen glicol, en donde al menos un residuo lisina se ha eliminado o reemplazado con cualquier otro residuo amino ácido. WO 99/67291 describe un proceso para conjugar una proteína con PEG, en donde al menos un residuo amino ácido en la proteína se elimina y la proteína se contacta con PEG bajo condiciones suficientes para lograr conjugación a la proteína. WO 99/03887 describe variantes modificadas con polietilen glicol de polipéptidos que pertenecen a la superfamilia de hormonas de crecimiento, en donde un residuo cisteina se ha substituido por un residuo amino ácido no esencial ubicado en una región especificado del polipéptido. WO 00/26354 describe un método para producir una variante de polipéptido glicosilado con alergenicidad reducida, como se compara con un polipéptido padre correspondiente que comprende al menos un sitio de glicosilación adicional. El término "polipéptido de enlace de antígeno" también incluye ABP glicosilados, tales como pero no limitados a, polipéptidos glicosilados en cualquier posición amino ácido, formas N-enlazadas u 0-enlazadas glicosiladas del polipéptido. Variantes que contienen cambios de nucleótido sencillo también se consideran como variantes biológicamente activas de ABP. Además, variantes de combinación también se incluyen. El término "polipéptido de enlace de antígeno" también incluye heterodímeros ABP, homodímeros, heteromultímeros u homomultímeros ABP de cualquiera o uno o más de ABP o cualquier otro polipéptido, proteína, carbohidrato, polímero, pequeña molécula, enlazador, ligando u otra molécula biológicamente activa de cualquier tipo, enlazada por medios químicos o expresada como una proteína de fusión, así como análogos polipéptido que contienen por ejemplo, eliminaciones específicas u otras modificaciones que sin embargo mantienen actividad biológica . En algunas modalidades, los polipéptidos de enlace de antígeno además comprenden una adición, substitución o eliminación que modula actividad biológica del ABP. Por ejemplo, las adiciones, substituciones o eliminaciones pueden modular una o más propiedades o actividades del ABP, incluyendo pero no limitado a, modular afinidad para el antígeno, modular (incluyendo pero no limitado a, incrementos o disminuciones) de antígeno conformacional u otros cambios estructurales secundarios, terciarios o cuaternarios, estabilizar antígeno conformacional u otros cambios estructurales secundarios, terciarios o cuaternarios, inducir o provocar antígeno conformacional u otros cambios estructurales secundarios, terciarios o cuaternarios, modular vida media en circulación, modular vida media terapéutica, modular estabilidad del polipéptido, modular dosis, modular liberación o bio-disponibilidad, facilitar la purificación o mejorar o alterar una ruta particular de administración. Similarmente, polipéptidos de enlace de antígeno pueden comprender secuencias de escisión de proteasa, grupos reactivos, dominios de enlace de anticuerpo (incluyendo pero no limitados a, FLAG o poli-His) u otras secuencias basadas en afinidad (incluyendo pero no limitadas a, FLAG, poli-His, GST, etc.) o moléculas enlazadas (incluyendo pero no limitado a, biotina) que mejora la detección (incluyendo pero no limitado a, GFP) , purificación u otros rasgos típicos del polipéptido. El término "polipéptido enlace de antígeno" también abarca homodímeros ABP, heterodímeros, homomultímeros, y heteromultímeros que están enlazados, incluyendo pero no limitados a aquellos enlazados directamente mediante cadenas laterales aminoácido no naturalmente codificadas, ya sea a la misma o diferentes cadenas laterales aminoácido no naturalmente codificado, con cadenas laterales de aminoácido naturalmente codificado, como fusiones o indirectamente mediante un enlazador. Enlazadores ejemplares incluyen pero no están limitados a compuestos orgánicos pequeños, polímeros solubles en agua de una variedad de longitudes tales como polietilen glicol o polidextrano o polipéptidos de diversas longitudes. Aquellos con destreza en la técnica apreciarán que posiciones de aminoácido correspondientes a posiciones en una secuencia polipéptido de enlace antígeno particular pueden identificarse fácilmente en un fragmento del polipéptido de enlace antígeno o polipéptido de enlace antígeno relacionado, etc. Por ejemplo, programas de alineamiento de secuencia tales como BLAST pueden emplearse para alinear e identificar una posición particular en una proteína que corresponde con una posición en una secuencia relacionada. El término " polipéptido de enlace antígeno" abarca polipéptidos de enlace antígeno que comprenden una o más sustituciones, adiciones o eliminaciones de aminoácido. Polipéptidos de enlace antígeno de la presente invención pueden comprender modificaciones con uno o más aminoácidos naturales en conjunto con una o más modificaciones de aminoácido no natural . Sustituciones ejemplares en un amplia variedad de posiciones de aminoácido en polipéptidos ABP de origen natural se han descrito, incluyendo pero no limitadas a sustituciones que modulan una o más de las actividades biológicas del polipéptido de enlace antígeno, tales como pero no limitadas a, incrementada actividad agonista, incrementada solubilidad del polipéptido, convertir el polipéptido en antagonista, etc. y se abarcan por el término "ABP" . Un "aminoácido no naturalmente codificado" se refiere a un aminoácido que no es uno de los 20 aminoácidos comunes o pirolisina o selenocisteína. Otros términos que pueden emplearse en forma sinónima con el término "aminoácido no naturalmente codificado" son "aminoácido no natural", "aminoácido innatural", "aminoácido que no es de origen natural" y diversas versiones separadas con guiones o no separadas con guiones de los mismos. El término "aminoácido no naturalmente codificado" también incluye pero no está limitado a aminoácidos que ocurren por modificación (por ejemplo modificaciones post-traducción) de un aminoácido naturalmente codificado (incluyendo pero no limitado a los 20 aminoácidos comunes o pirolisina y selenocisteína) pero ellos mismos no están naturalmente incorporados en una cadena polipéptido creciente por el complejo de traducción. Ejemplos de estos aminoácidos que no son de origen natural incluyen pero no están limitados a N-acetilglucosaminil-L-serina, N-acetilglucosaminil-L-treonina, y O-fosfotirosina. Un "grupo de modificación de extremo amino" se refiere a cualquier molécula que puede conectarse al extremo amino de un polipéptido. Similarmente, un "grupo de modificación de extremo carboxi" se refiere a cualquier molécula que puede conectarse al extremo carboxi de un polipéptido. Grupos de modificación de extremo incluyen pero no están limitados a diversos polímeros solubles en agua, péptidos o proteínas tales como albúmina de suero u otras porciones que aumentan la vida media en suero de péptidos. Los términos "grupo funcional", "porción activa", "grupo de activación", "grupo saliente", "grupo reactivo", "grupo químicamente reactivo" y "porción químicamente reactiva" se emplean en la técnica y aquí se refieren a distintas porciones o unidades definibles de una molécula. Los términos son algo sinónimos en las técnicas químicas y aquí se emplean para indicar las porciones de moléculas que realizan alguna función o actividad y son reactivas con otras moléculas. El término "enlace" o "enlazador" se emplea aquí para referirse a grupos o uniones que normalmente se forman como resultado de una reacción química y típicamente son enlaces covalentes. Enlaces hidrolíticamente estables significa que los enlaces son sustancialmente estables en agua y no reaccionan con agua a valores de pH útiles, incluyendo pero no limitados a, bajo condiciones fisiológicas por un periodo prolongado de tiempo, probablemente incluso en forma indefinida. Enlaces hidrolíticamente inestables o degradables significan que los enlaces son degradables en agua o en soluciones acuosas incluyendo por ejemplo sangre. Enlaces enzimáticamente inestables o degradables significan que le enlace puede degradarse por una o más enzimas. Como se entiende en la técnica, PEG y polímeros relacionados pueden incluir enlaces degradables en la estructura principal del polímero o en el grupo enlazador entre la estructura principal de polímero y uno o más de los grupos funcionales terminales de la molécula de políemro. POor ejemplo, enlaces éster formados por la reacción de ácidos PEG carboxílicos o ácidos PEG carboxílicos activados con grupos alcohol en un agente biológicamente activo, en general hidrolizan bajo condiciones fisiológicas para liberar el agente. Otros enlaces hidrolíticamente degradables incluyen pero no están limitados a enlaces carbonato; enlaces imina resultados de la reacción de una amina y un aldehido; enlaces fosfato éster formados al reaccionar un alcohol con un grupo fosfato; enlaces hidrazona que son el producto de reacción de una hidrazida y un aldehido; enlaces acetal que son el producto de reacción de un aldehido y un alcohol; enlaces ortoéster que son el producto de reacción de un formiato y un alcohol; enlaces péptido formados por un grupo amina, incluyendo pero no limitados a en un extremo de un polímero tal como PEG, y un grupo carboxilo de un péptido; enlaces oligonucleótido formados por un grupo fosforamidita, incluyendo pero no limitados a, en el extremo de un polímero, y un grupo 5' hidroxilo de un oligonucleótido. Enlazadores ramificados pueden emplearse en polipéptidos de enlace de antígeno de la invención. El término "molécula biológicamente activa", "porción biológicamente activa" o "agente biológicamente activo" cuando se emplean aquí, significan cualquier sustancia que puede afectar cualesquiera propiedades físicas o bioquímicas de un sistema biológico, ruta, molécula o interacción referente a un organismo, incluyendo pero no limitado a virus, bacterias, bacteriófagos, transposón prión, insectos, hongos, plantas, animales y humanos. En particular, como se emplea aquí, moléculas biológicamente activas incluyen pero no están limitadas a cualquier sustancia pretendida para diagnóstico, cura, mitigación, tratamiento o prevención de enfermedad en humanos u otros animales, o para de otra forma mejorar el bienestar físico o mental de humanos o animales. Ejemplos de moléculas biológicamente activas incluyen pero no están limitadas a péptidos, proteínas, enzimas, drogas de pequeñas moléculas, drogas fuertes, drogas ligeras, colorantes, lípidos, núcleosidos, oligonucleótidos, toxinas, células, virus, liposomas, micropartículas y micelios. Clases de agentes biológicamente activos que son adecuados para utilizar con la invención incluyen pero no están limitados a drogas, prodrogas, radionúclidos, agentes de formación de imagen, polímeros, antibióticos, fungicidas, agentes antivirales, agentes antiinflamatorios, agentes antitumor, agentes cardiovasculares, agentes antiansiedad, hormonas, factores de crecimiento, agentes esferoidales, toxinas microviralmente derivadas y semejantes . En ciertas modalidades, las moléculas ABP de ésta invención pueden utilizarse para dirigir moléculas biológicamente activas o etiquetas detectables a un sitio de tumor. Esto puede facilitar el exterminio del tumor, detección y/o localización u otro efecto. Sondas de diagnóstico o sondas de formación de imagen también pueden enlazarse a moléculas ABP de la invención. En ciertas modalidades particularmente preferidas, el componente de molécula biológicamente activa del ABP es una etiqueta "radio-opaca", por ejemplo una etiqueta que puede visualizarse fácilmente utilizando por ejemplo rayos X. Materiales radio-opacos son bien conocidos por aquellos con destreza en la técnica. Los materiales radio-opacos más conocidos incluyen sales de yodo, bromo o bario. Otros materiales radio-opacos son también conocidos e incluyen pero no están limitados a derivados de bismuto orgánico (ver por ejemplo la patente de los E.U.A. número 5,939,045), multiuretanos radio-opacos (ver la patente de los E.U.A. número 5,346,981), compuestos de organobismuto (ver por ejemplo la patente de los E.U.A. número 5,256,334), complejos de multímero de bario radio-opaco (ver por ejemplo la patente de los E.U.A. número 4,866,132), y semejantes. Los ABP de esta invención pueden acoplarse directamente a la porción radio-opaca o pueden conectarse a un "paquete" (por ejemplo un quelato, un liposoma, una microperla de multímero, etc.) que transporta o contiene el material radio-opaco. Además de etiquetas radio-opacas, otras etiquetas son también convenientes para utilizar en esta invención. Etiquetas detectables adecuadas para utilizar como el componente de molécula biológicamente activa de los ABP de esta invención incluyen cualquier composición detectable por medios espectroscópicos, fotoquímicos, bioquímicos, inmunoquímicos, eléctricos, ópticos o químicos. Etiquetas útiles en la presente invención incluyen perlas magnéticas (por ejemplo Dynabeads™) , colorantes fluorescentes (por ejemplo isotiocianato de fluoresceína, rojo texas, rodamina, proteína fluorescente verde, y semejantes) , radioetiquetas, por ejemplo 3H, 125I, 35S, 14C, o 32P, enzimas (por ejemplo peroxidasa de rábano, fosfatasa alcalina y otras comúnmente empleadas en un ELISA) , y etiquetas colorimétricas tales como oro coloidal o perlas de vidrio o plástico de color (por ejemplo multiestireno, muítipropileño, látex, etc.). Diversas radioetiquetas preferidas incluyen pero no están limitadas a 99Tc, 203Pb, 67Ga, 68Ga, 72As, ulln( 113mln, 97Ru, S2Cu, 64ICu, 5Fe, 52mMn, 51Cr, 186Re, 188Re, 77As, 90Y, S7Cu, 169Er, 121Sn, 127Te, 142Pr, 143Pr, 198Au, 199Au, 161Tb, 109Pd, 165Dy, 149Pm, 151Pm, 153Sm, 157Gd, 159Gd, 166Ho, 172Tm, 169Yb, 175Yb, 175Yb, 177Lu, 105Rh, y xllAg . Medios para detectar estas etiquetas son bien conocidos para aquellos con destreza en la técnica. De esta manera, por ejemplo, radioetiquetas pueden detectarse utilizando película fotográfica, detectores de destelleo y semejantes. Marcadores fluorescentes pueden detectarse utilizando un fotodetector para detectar la iluminación emitida. Etiquetas enzimáticas típicamente se detectan al proporcionar la enzima con un sustrato y detectar el producto de reacción producido por la acción de la enzima en el sustrato y etiquetas clorimétricas se detectan por simple visualización de la etiqueta de color. En ciertas modalidades específicas, esta invención contempla el uso de inmunoconjugados (porciones quiméricas) para la detección de tumores y otras células de cáncer. De esta manera, por ejemplo los anticuerpos bioespecífieos de esta invención pueden conjugarse a radioisótopos de emisión gamma (por ejemplo Na-22, Cr-51, Co-60, Tc-99, 1-125, 1-131, Cs-137, Ga-67, Mo- 99) para detección con una cámara gamma, a isótopos de emisión de positrones (por ejemplo C-ll, N-13, 0-15, F-18, y semejantes) para detección en un instrumento de tomografía de emisión de positrones (PET = Positrón Emission Tomography) , y a agentes de contraste de metal (por ejemplo reactivos que contienen Gd, reactivos que contienen Eu, y semejantes) para formación de imagen por resonancia magnética (MRI = magnetic resonance imaging) . Además, los anticuerpos bioespecífieos de esta invención pueden utilizarse en inmunohistoquímica tradicional (por ejemplo etiquetas fluorescentes, etiquetas de nanocristales, etiquetas enzimáticas y colorimétricas, etc . ) . En otra modalidad, la molécula biológicamente activa puede ser un radiosensibilizador que mejora el efecto citotóxico de radiación ionizante (por ejemplo tal como el que puede producirse por 60Co o una fuente rayos-X) en una célula. Numerosos agentes de radiosensibilización se conocen e incluyen, pero no están limitados a compuestos de derivado benzoporfirina (ver por ejemplo la patente de los E.U.A. número 5,945,439), 1, 2 , 4-benzotriazina óxidos (ver por ejemplo la patente de los E.U.A. número 5,849,738), compuestos que contienen ciertas diaminas (ver por ejemplo la patente de los E.U.A. número 5,700,825), BCNT (ver por ejemplo la patente de los E.U.A. número 5,872,107), derivados amida de ácido nitrobenzoico radiosensibilizantes (ver por ejemplo la patente de los E.U.A. número 4,474,814), diversos derivados heterocíclicos (ver por ejemplo la patente de los E.U.A. número 5,064,849), complejos de platino (ver por ejemplo la patente de los E.U.A. número 4,921,963), y semejantes. La molécula biológicamente activa también puede ser un ligando, una etiqueta de epítope, un péptido, una proteína u otro ABP. Ligando y anticuerpos pueden ser aquellos que ligan a marcadores de superficie en células inmunes. Moléculas quiméricas que utilizan estos anticuerpos como moléculas biológicamente activas actúan como enlazadores bifuncionales que establecen una asociación entre las células inmunes que contienen el socio de enlace para el ligando o ABP y las células de tumor que expresan el o los miembros de familia EGFR. Muchos de los productos farmacéuticos y/o radioetiquetas aquí descritos pueden proporcionarse como un quelato, particularmente cuando se utiliza una estrategia de pre-diana. La molécula quelante típicamente se acopla a una molécula (por ejemplo biotina, avidina, estreptavidina, etc.) que liga específicamente una etiqueta epítope conectada al ABP bioespecífico y/o multiespecífico . Grupos quelantes son bien conocidos por aquellos con destreza en la técnica. En ciertas modalidades, se derivan grupos quelantes de ácido etilen diamina tetra-acético (EDTA) , ácido dietien triamina penta-acético (DTPA) , ácido ciclohexil 1,2 -diamina tetra-acético (CDTA) , ácido etílenglicol-0,01 -bis (-2-aminoetil) -N,N,N' ,N' -tetra-acético (EGTA), ácido N,N-bis (hidroxibenzil) -etilendiamina-N,N' -diacético (HBED) , ácido trietilene tetramina hexa-acético (TTHA) , ácido 1,4,7, 10-tetraazaciclododecan-N,N' - ,N" ,N' "-tetra-acético (DOTA) , ácido hidroxietildiamina triacético (HEDTA) , 1,4,8, 11-tetra-azaciclotetradecan- N,N' ,N" ,N" ' -tetra-acético (TETA) , DTPA sustituido, EDTA sustituido, y semejantes. Ejemplos de ciertos quemadores preferidos incluyen 2-iminotiolanos y 2-iminotiaciclohexanos sin sustituir o sustituidos, en particular 2-imino-4-mercaptometiltiolane, y SAPS (N- (4- [211At] astatofenetil) succinimate) . Un agente quelante, ácido 1,4,7,10-tetraazaciclododecan-N,N,N" ,N' " -tetraacetic (DOTA), es de interés particular debido a su habilidad para quelar un número de metales importantes desde el punto de vista de diagnostico y terapéutico, tales como radionuclidos y radioetiquetas . Conjugados de DOTA y proteínas tales como anticuerpos se han descrito. Por ejemplo, la Patente de los E.U.A. No. 5,428,156 ilustra un método para conjugar DOTA con anticuerpos y fragmentos ABP. Para producir estos conjugados, un grupo de ácido carboxílico de DOTA se convierte a un éster activo que puede reaccionar con una mina o grupo sulfhídrico en el ABP o fragmento ABP. Lewis et al. (1994) Bioconjugante Chem. 5: 565-576, describe un método similar en donde un grupo carboxilo de DOTA se convierte en un éster activo, y el DOTA se mezcla con ABP, en lazando el ABP con DOTA mediante el grupo épsilon-amino de un residuo lisina de ABP, convirtiendo de esta manera un grupo carboxilo de DOTA en una porción amida . En forma alterna, el agente quelante puede acoplarse, directamente o a través de un enlazador, a una etiqueta epitope o a una porción que liga una etiqueta epitope. Conjugados de DOTA y biotina se han descrito (ver, por ejemplo, Su (1995) J. Nucí. Med., 36 (5 Suppl) : 154P, que describe el enlace de DOTA con biotina mediante derivados de biotina de cadena lateral amino disponibles tales como DOTA-LC-biotina o DOTA-benzil-4- (6-amino-caproamide) -biotina) . Yau et al., WO 95/15335, describe un método para producir compuestos nitro-benzil-DOTA que pueden conjugarse con biotina. El método comprende una reacción de ciclización mediante una proyección transitoria de un grupo hidroxi; tosilación de una amina; desprotección del grupo hidroxi protegido en forma transitoria; tosilación del grupo hidroxi desprotegido; y ciclización de tosilato intramolecular. Wu et al. (1992) Nucí. Med. Biol, 19(2): 239-244 describe una síntesis de agentes quelantes macrolíticos para radioetiquetar proteínas con 111IN y 90?. Wu et al, produce un conjugado DOTA-biotina etiquetado para estudiar la estabilidad y biodistribusión de conjugados con avidina, una proteína modelo para estudios. Este conjugado se elaboró utilizando una biotina hidrazida que contiene un grupo amino libre para reaccionar con un derivado DOTA activado generado in situ. ABP de esta invención pueden fusionarse con otras moléculas biológicamente activas, incluyendo pero no limitadas a drogas citotóxicas, toxina, péptidos, proteínas, enzimas y virus (Chester, (2000) Dis. Markers 16:53-62; Rippmann et al. Biochem J. (2000) Biochem J. 349 (Pt. 3) :805-812, Kreitman, RJ. (2001) Curr : Pharm. Biotechnol. 2:313-325; Rybak, S. M. (2001) Expert Opin. Biol. Ther. 1:995-1003; van Beusechem, V. W. et al. J. Virol. (2002) 76:2753-2762). Un agente citotóxico potente o de carga útil puede ligarse con ABP que hacen diana y ligan a antígenos que se encuentran predominantemente en células diana (incluyendo pero no limitadas a células de cáncer) . El agente de carga útil se enlaza al ABP mediante un enlace que es estable en la corriente sanguínea o puede ser susceptible a escisión bajo condiciones presentes por ejemplo en el sitio del tumor. Los agentes de carga útil tales como toxinas se suministran a células diana y de esta manera el exterminio de célula puede iniciarse mediante un mecanismo dependiente de la toxina. Ejemplos de estas toxinas incluyen pero no están limitados a moléculas pequeñas tales como calicheamicina de derivación fangal (Hinman et al. (1993) Cáncer Res. 53: 3336-3342) y maitansinoides (Liu et al. (1996) PNAS USA 93:8618-8623, Smith, S. (2001) Curr .

Opin. Mol. Ther. 3(2): 198-203), tricoteno, y CC 1065, o proteínas, por ejemplo cadena ricina A (Messman, et al. (2000) Clin. Cáncer Res. 6 (4) : 1302-1313) , exotoxina de Pseudomonas (Tur et al. (2001) Intl. J. Mol. Med. 8 (5) :579-584) , toxina difteria (LeMaistre et al. (1998) Blood 91 (2) :399-405) , y proteínas de inactivación de ribosoma (Tazzari, et al. (2001), J. Immunol . 167:4222-4229) . En una modalidad especifica, una o mas moléculas de calicheamicina pueden emplearse. Miembros de la familia calicheamicina de antibióticos son capaces de producir interrupciones de DNA de doble hebra en concentraciones sub-picomolar . Análogos estructurados de calicheamicina son también conocidos. Ver Hinman et al., Cáncer Research 53: 3336-42 (1993); Lode et al. (1998) Cáncer Research 58:2925-28. Un ejemplo de una inmunotoxina que logro aprobación de la FDA es Mylotarg® (Wyeth Ayerst) , un anti-CD33 conjugado con calichaemicina para leucemia mielogenosa aguda (Sievers et al. (1999) Blood 93 (11) : 3678-3684 ; Bernstein (2000) Leukemia 14:474-475). De manera similar, los ABP de esta invención pueden fusionarse a toxinas. De forma alterna, los ABP de la invención pueden fusionarse con la neurotoxina botulinum A, un complejo de proteína producido por la bacteria Clostridium botulinum. Todavía en otra modalidad, los ABP de la invención pueden comprender uno o más toxinas enzimaticamente activas y/o sus fragmentos. Ejemplos de esas toxinas incluyen fragmentos activos sin enlace de toxina difteria, cadena difteria A, cadena exotoxina A de (Pse domonas aeruginosa) , cadena ricina A, cadena abrina A, cadena modeccina A, alfa-sarcina, proteínas diantina, proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPAU, y PAP-S) , inhibidor de momordica charantia, curcina, crotina saponaria, inhibidor de oficinales, gelonina, mitogelina, restrictoeina, fenomicina, enomicina, y los tricotenos.

Ver por ejemplo, WO 93/21232. Citotoxinas particularmente preferidas incluyen las exotoxinas de Pseudomonas (PE) , toxinas de Difteria, resina y abrina. La exotoxina de Pseudomonas y la toxina de Difteria son bien conocidas. Como PE, la toxina difteria (DT) extermina células por factor de elongación ribosilante-ADP 2 y viendo de esta manera la síntesis de proteína. Citas adicionales respecto a inmunotoxinas incluyen Brinkmann, U. (2000) In Vivo 14:21-28, Niv et al. (2001) Curr . Pharm. Biotechnol . 2:19-46, Reiter et al. (2001) Adv. Cáncer Res. 81:93-124, Kreitman, R. J. (1999) Curr. Opin. Immunol . , 11:570-578; Hall (2001) Meth. Mol. Biol. 166:139-154; Kreitman (2001) Curr. Opin. Investig. Drugs 2(9): 1282-1293. Métodos para clonar genes que codifican PE o DT fusionado a diversos ligandos son bien conocidos por aquellos con destreza en la técnica (Ver, por ejemplo, Siegall et al. (1989) FASEB J., 3: 2647-2652; y Chaudliary et al. (1987) Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 84: 4538-4542). Todas las citas se incorporan aquí por referencia. Otras moléculas biológicamente activas convenientes incluyen agentes farmacológicos o sistemas encapsulantes que contienen diversos agentes farmacológicos. De esta manera, la molécula de diana de la molécula quimérica puede conectarse directamente a una droga que se va ha suministrar directamente al tumor.

Estas drogas son bien conocidas por aquellos con destreza en la técnica e incluyen pero no están limitadas a doxirubicina, vinblastina, genisteina, una molécula antisentido y semejantes. En forma alterna, la molécula biológicamente activa puede ser un sistema de encapsulación tal como un capsido viral, un liposoma, o micelio que contiene una composición terapéutica tal como una droga, un ácido nucleico (por ejemplo un ácido nucleico antisentido) u otra porción terapéutica que de preferencia esta protegida de exposición directa al sistema circulatorio. Medios para preparar liposomas conectados a anticuerpo son bien conocidos por aquellos con destreza en la técnica. Ver, por ejemplo, la Patente de los E.U.A. No. 4,957,735, Connor et al. (1985) Pharm. Ther., 28: 341-365. Debido a su especificidad a antígeno, los ABP de la invención pueden emplearse para dirigir liposomas cargados con droga a su objetivo o diana. Ver Park, J. W. et al. (2002) Clin. Cáncer Res. 8, 1172-1181 y Shi , N. et al (2001) Pharm. Res. 18, 1091-1095. Los ABP de la invención pueden conjugarse en moléculas tales como PEG para mejorar suministro in vivo y perfiles farmacocinéticas . Leong et al, describen modificación con polietilen glicol especifica de sitio de un fragmento Fab ' de un anticuerpo anti-IL-8 con una velocidad de liberación disminuida sobre la forma no modificada con polietilen glicol y poca o ninguna pérdida de actividad de enlace de antígeno (Leong, S. R. et al. (2001) Citoquina 16:106-119). Los ABP de la presente invención pueden enlazarse a una prodroga. El término "prodroga" como se emplea aquí, significa un derivado farmacológicamente inactivo o de actividad reducida de una droga activa. Prodrogas pueden diseñarse para modular la cantidad de una droga o molécula biológicamente activa que alcaza un sitio deseado de acción a través de la manipulación de las propiedades de una droga tales como propiedades físico química, biofarmacéuticas o farmacocinéticas . Prodroga se convierten en una droga activa dentro del cuerpo a través de reacciones enzimáticas o no enzimáticas. Prodrogas pueden proporcionar propiedades fisicoquímicas mejoradas tales como mejor solubilidad, características de suministro mejorado, tales como hacer diana específicamente a una célula tejido órgano o ligando particular y mejorado valor terapéutico de la droga. Los ABP de la invención pueden fusionarse a enzimas para activación de prodroga (Kousparou, C.A., et al. (2002) Int. J. Cáncer 99, 138-148). (2002) Moléculas recombinantes pueden comprender un ABP y una enzima que actúa sobre una prodroga para liberar una citotóxica tal como cianuro. Los agentes terapéuticos pueden administrarse como una prodroga y subsecuentemente activarse por una enzima de activación de prodroga que convierte una prodroga como un agente peptidil quimioterapéutico a una droga anticáncer activa. Ver, por ejemplo, WO 88/07378; WO 81/01145; Patente de los E.U.A No. 4,975,278. En general, el componente enzima incluye cualquier enzima capaz de actuar en una prodroga para convertirla en una forma más activa citotóxica. Enzimas que pueden ser útiles incluyen pero no están limitadas a, fosfatas alcalina útil para convertir prodrogas que contienen fosfato en drogas libres, arilsulfatasa útil para convertir prodrogas que contienen sulfato en drogas libres; citosina de aminasa útil para convertir 5-fluorocitosina no toxica en la droga anticáncer 5-fluorouracilo; proteasas tales como serratia proteasa, termolisina, subtilisina, carboxipeptidasas y catepsinas (tales como catepsinas B y L) , que son útiles para convertir prodrogas que contienen péptido en drogas libres; D-alanilcarboxipeptidasas, útiles para convertir prodrogas que contiene sustituyentes D-amino ácido; enzimas que escinden carbohidratos tales como ß -galactosidasa y neuraminidasa útiles para convertir prodrogas glicosiladas en drogas libres; ?-lactamasa útil para convertir drogas deribatizadas con ?-lactamas en drogas libres, y penicilina amidasas, tales como penicilina V amidasa o penicilina G amidasa, útiles para convertir drogas deribatizadas en sus nitrógenos amino con grupo fenoxiacetilo o fenilacetilo, respectivamente en drogas libres. En forma alterna, anticuerpos con actividad enzimática también conocidos en la técnica como "acismas", pueden ser utilizados para convertir las prodrogas de la invención en drogas activas libres. Ver por ejemplo, Massey, (1987) 328:457-48. Una persona con destreza apreciará que el ABP biespecifico y/o multiespecifico de esta invención y las porciones de molécula biológicamente activa pueden típicamente unirse en conjunto en cualquier orden. De esta manera, por ejemplo cuando la molécula diana es una proteína de una sola cadena, la molécula biológicamente activa puede unirse ya sea a los extremos amino o carboxi de la molécula diana. La molécula biológicamente activa también puede unirse a una región interna del ABP biespecífico o multiespecífico, o por el contrario. Similarmente, el ABP biespecifico y/o multiespecifico puede unirse a una ubicación interna o un extremo de una molécula biológicamente activa, en cualquier caso, puntos de conexión se eligen que no interfieran con las actividades respectivas del ABP biespecifico y/o multiespecifico o la molécula biológicamente activa. El ABP biespecifico y/o multiespecifico y la molécula biológicamente activa pueden conectarse por cualquiera de una cantidad de medios bien conocidos por aquellos con destreza en la especialidad. Típicamente, la molécula biológicamente activa se conjuga, ya sea directamente o a través de un enlazador (espaciador) , al ABP biespecifico. Sin embargo, cuando tanto la molécula biológicamente activa como el ABP biespecifico son ambos polipéptidos, puede ser conveniente el expresar de manera recombinante la molécula quimérica como una proteína de fusión de una sola cadena. En una modalidad, el ABP biespecifico y/o multiespecifico se conjuga químicamente con la molécula biológicamente activa (por ejemplo, una citotóxina, una etiqueta, un ligando, una droga, un ABP un liposoma, etc.) . Medios para conjugar químicamente moléculas son bien conocidos por aquellos con destreza en la técnica. El procedimiento para conectar un agente con un ABP u otra molécula que hace diana en polipéptido, variará de acuerdo con la estructura química del agente. Polipéptidos típicamente contiene una variedad de grupos funcionales; por ejemplo, grupos ácido carboxílico (COOH) o amina libre (--NH2) que están disponibles para reacción con un grupo funcional conveniente en una molécula biológicamente activa, para ligar la molécula biológicamente activa. En forma alterna, el ABP biespecifico y/o la molécula biológicamente activa pueden deribatizarse para exponer o conectar adicionales grupo funcionales reactivos. La derivatización puede involucrar conexión de cualquiera de una cantidad de moléculas enlazadoras tales como aquellas disponibles de Pierce Chemical Company, Rockford, 111. En algunas circunstancias, puede ser conveniente el liberar la molécula biológicamente activa del ABP bispecifico y/o multispecifico, o activar una prodroga, cuando la porción quimérica ha alcanzado su sitio objetivo. Por lo tanto, conjugados quimérico que comprenden enlaces que se escinden en la vecindad del sitio diana, pueden emplearse cuando la molécula biológicamente activa se va ha liberar en el sitio objetivo o diana. Escindir el enlace para liberar el agente del ABP puede señalarse por condiciones o actividad enzimática a las cuales está sujeto el inmunoconjugado ya sea dentro de la célula objetivo o en la vecindad de la célula diana objetivo o en la vecindad del sitio diana u objetivo. Cuando el sitio diana es un tumor, un enlazador que se escinde bajo condiciones presentes en el sitio de tumor (por ejemplo cuando se expone a enzimas asociadas con tumor o pH acídico) podrá emplearse . Una cantidad de diferentes enlazadores escindibles se conocen por aquellos con destreza en la técnica. Ver las patentes de los E.U.A. Nos. 4,618,492; 4,542,225, y 4,625,014. Los mecanismos para liberar un agente de estos grupos enlazadores incluyen por ejemplo, irradiación de un enlace fotolábil e hidrólisis catalizada por ácido. La patente de los E.U.A. No. 4,671,958, por ejemplo incluye una descripción de inmunoconjugados que comprenden enlazadores que se escinden en el sitio diana in vivo por las enzimas proteolíticas del sistema de complemento del paciente. La longitud del enlazador puede estar predeterminada o seleccionada dependiendo de una relación espacial deseada entre el ABP y la molécula que se enlaza a el . En vista de la gran cantidad de métodos que se han reportado para conectar una variedad de compuestos de radiodiagnóstico, compuestos radioterapéuticos, drogas, toxinas y otros agentes para anticuerpos, una persona con destreza en la técnica será capaz de determinar un método conveniente para conectar un agente determinado con un ABP u otro polipéptido. En ciertas modalidades, la molécula biológicamente activa comprende un quelato que se conecta a un ABP o a una etiqueta epítope. El ABP biespecífico y/o multiespecífico contiene una etiqueta epítope correspondiente o ABP de manera tal que el contacto simple del ABP biespecífico y/o multiespecífico con el quelato resulta en conexión del ABP con la molécula biológicamente activa. La etapa de combinación puede realizarse después de que la proporción se utiliza (estrategia de pre-diana) o el tejido diana puede ligarse al ABP biespecífico y/o multiespecífico antes de que se suministre el quelato. Métodos para producir quelatos adecuados para acoplar con diversas porciones diana son bien conocidos por aquellos con destreza en la técnica (ver, por ejemplo las patentes de los E.U.A. Nos. 6,190,923, 6,187,285, 6,183,721, 6,177,562, 6,159,445, 6,153,775, 6,149,890, 6,143,276, 6,143,274, 6,139,819, 6,132,764, 6,123,923, 6,123,921, 6,120,768, 6,120,751, 6,117,412, 6,106,866, 6,096,290, 6,093,382, 6,090,800, 6,090,408, 6,088,613, 6,077,499, 6,075,010, 6,071,494, 6,071,490, 6,060,040, 6,056,939, 6,051,207, 6,048,979, 6,045,821, 6,045,775, 6,030,840, 6,028,066, 6,022,966, 6,022,523, 6,022,522, 6,017,522, 6,015,897, 6,010,682, 6,010,681, 6,004,533 y 6,001,329). Cuando el ABP biespecífico y/o multiespecífico y/o la molécula biológicamente activa son ambas proteínas de cadena sencilla y relativamente cortas (es decir, menos de aproximadamente 50 amino ácidos) pueden sintetizarse utilizando técnicas de síntesis química de péptido estándar. Cuando ambos componentes son relativamente cortos, la porción quimérica puede sintetizarse como un solo polipéptido contiguo. En forma alterna, un ABP biespecífico y/o multiespecífico y la molécula biológicamente activa pueden sintetizarse por separado y después fusionarse por condensación del extremo amino de una molécula con el extremo carboxilo de la otra molécula formando de esta manera un enlace péptido. En forma alterna, el ABP biespecífico y/o multiespecífico y moléculas biológicamente activas cada una pueden condensarse con un extremo de una molécula espaciadora péptido formando de esta manera una proteína de fusión conjugada. Síntesis en fase sólida en donde el amino ácido C terminal de la secuencia se conecta a un soporte insoluble, seguido por adición secuencial de los amino ácidos restantes en la secuencia, es el método preferido para la síntesis química de los polipéptidos de esta invención. Técnicas para síntesis de fase sólida se describen por Barany y Merrifield, Solid-Phase Peptide Synthesis; pp. 3-284 in The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology. Vol. 2: Special Methods in Peptide Synthesis, Part A., Merrifield, et al. J. Am. Chem. Soc, 85: 2149-2156 (1963), y Stewart et al., Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd ed. Pierce Chem. Co., Rockford, 111. (1984) . Un "polímero bifuncional" se refiere a un polímero que comprende dos grupos funcionales discretos que son capaces de reaccionar específicamente con otras porciones (incluyendo pero no limitado a grupos laterales amino ácido) para formar enlaces covalentes o no-covalentes. Un enlazador bifuncional que tiene un grupo funcional reactivo con un grupo en un componente biológicamente activo particular, y otro grupo reactivo con un grupo en un segundo componente biológico, pueden emplearse para formar un conjugado que incluye el primer componente biológicamente activo, el enlazador bifuncional y el segundo componente biológicamente activo. Muchos procedimientos y moléculas enlazadoras para conectar diversos compuestos con péptidos son conocidos. Ver, por ejemplo la solicitud de patente europea No. 188,256; patente de los E.U.A. Nos. 4,671,958, 4,659,839, 4,414,148, 4,699,784; 4,680,338; 4,569,789; y 4,589,071 que se incorporan aquí por referencia. Un "polímero multi-funcional" se refiere a un polímero que comprende dos o más grupos funcionales discretos que son capaces de reaccionar específicamente con otras porciones (incluyendo pero no limitados a grupos laterales amino ácido) para formar enlaces covalentes o no-covalentes . Un polímero bi-funcional o polímero multi-funcional puede ser de cualquier longitud molecular o peso molecular deseados, y puede seleccionarse para proporcionar un espaciamiento o conformación deseada particular entre una de las moléculas enlazadas al ABP. Cuando grupos substituyentes se especifican por sus fórmulas químicas convencionales, escrito de izquierda a derecha, igualmente abarcan los substituyentes químicamente idénticos que resultarán de escribir la estructura de derecha a izquierda, por ejemplo la estructura -CH20- es equivalente a la estructura -OCH2- . El término "substituyentes" incluye pero no está limitado a "substituyentes no-interferentes" . "Substituyentes no-interferentes" son aquellos grupos que producen compuestos estables. Substituyentes o radicales no interferentes convenientes incluyen pero no están limitados a, halo, C?-C?0 alquilo, C2-C?0 alquenilo, C2-C10 alquinilo, C?-C?0 alcoxi, C?-C?2 aralquilo, C?-C?2 alcarilo, C3-C12 cicloalquilo, C3-C?2 cicloalquenilo, fenilo, fenilo substituido, toluoilo, xilenilo, bifenilo, C2-C?2 alcoxialquilo, C2-C?2 alcoxiarilo, C7-C?2 ariloxialquilo, C7-C?2 oxiarilo, C!-C6 alquilsulfinilo, C1-C10 alquilsulfonilo, (CH2)m -0--( C1-C10 alquilo) en donde m es de 1 a 8, arilo, arilo substituido, alcoxi substituido, fluoroalquilo, radical heterocíclico, radical heterocíclico substituido, nitroalquilo, -N02, -CN, NRC(O) - (Ci-Cio alquilo), -C (O) - (Ci-Cio alquilo), C2-C?0 alquil tioalquilo, --C (0) 0-- (Ci-Cio alquilo), --0H, --S02, =S, -COOH, -NR2, carbonilo, -C(0)-( Ci-Cio alquil) -CF3, -C(0)- CF3, --C(0)NR2, - (C?-C?0 aril) -S- - (C6-C10 arilo), --C(0)-(C?-C?o arilo), --(CH2)m --0-- (--CH2) m--0-- (C?-C10 alquilo) en donde cada m es de 1 a 8, --C(0)NR2, C(S)NR2, --S02NR2, --NRC(O) NR2, --NRC(S) NR2, sus sales y semejantes. Cada R como se emplea aquí, es H, alquilo o alquilo substituido, arilo o arilo substituido, aralquilo o alcarilo. El término "halógeno" incluye flúor, cloro, yodo y bromo . El término "alquilo" por si mismo o como parte de otro substituyente, significa, a menos que se establezca de otra forma una cadena recta o ramificada, o radical hidrocarburo cíclico, o combinación de los mismos, que puede estar totalmente saturado, mono- o poliinsaturado, y puede incluir radicales di- y multivalentes, que tienen el número de átomos de carbono designados (es decir C1-C10 significa uno a diez átomos de carbono) . Ejemplos de radicales hidrocarburo saturados incluyen pero no están limitados a grupos tales como metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, t-butilo, isobutilo, sec-butilo, ciciohexilo, (ciclohexil) metilo, ciclopropilmetilo, homólogos e isómeros por ejemplo, de n-pentilo, n-hexilo, n-heptilo, n-octilo, y semejantes. Un grupo alquilo insaturado es aquel que tiene uno o más dobles enlaces o triples enlaces. Ejemplos de grupos alquilo insaturados incluyen pero no están limitados a, vinilo, 2-propenilo, crotilo, 2-isopentenilo, 2- (butadienilo) , 2 , 4-pentadienilo, 3- (1, 4-pentadienilo) , etinilo, 1- y 3-propinilo, 3-butinilo, y los homólogos e isómeros superiores. El término "alquilo", a menos que se anote de otra forma también se pretende que incluya aquellos derivados de alquilo definidos con más detalle a continuación, tales como "heteroalquilo" . Grupos alquilo que están limitados a grupos hidrocarburos se denominan "homoalquilo" . El término "alquileno" por si mismo o como parte de otros substituyente significa un radical divalente derivado de un alcano, como se ejemplifica, pero no limitado por las estructuras -CH2CH2- y CH2CH2CH2CH2- , y además incluye aquellos grupos descritos a continuación como "heteroalquileno" . Típicamente, un grupo alquilo (o alquileno) tendrá de 1 a 24 átomos de carbono, con aquellos grupos que tienen 10 o menos átomos de carbono que se prefieren en la presente invención. Un "alquilo inferior" o "alquileno inferior" es un grupo alquilo o alquileno de cadena más corta, generalmente que tiene ocho o menos átomos de carbono. Los términos "alcoxi", "alquilamino" y "alquiltio" (o tioalcoxi) se emplean en su sentido convencional, y se refieren a aquellos grupos alquilo conectados al resto de la molécula mediante un átomo de oxígeno, un grupo amino o un átomo de azufre, respectivamente . El término "heteroalquilo", por si mismo o en combinación con otro término, significa, a menos que se establezca de otra forma, un radical hidrocarburo de cadena recta o ramificada o cíclico, estable, o sus combinaciones, que consiste del número establecido de átomos de carbono y al menos un heteroátomo seleccionado del grupo que consiste de O, N, Si y S, y en donde los átomos de nitrógeno y azufre pueden estar opcionalmente oxidados y el heteroátomo de nitrógeno puede opcionalmente estar cuaternizado. El o los heteroátomos O, N y S y Si pueden colocarse en cualquier posición interior del grupo heteroalquilo o en la posición en la cual el grupo alquilo se conecta al resto de la molécula. Ejemplos incluyen pero no están limitados a, -CH2-CH2-0-CH3, -CH2-CH2-NH-CH3, -CH2-CH2-N (CH3) -CH3, -CH2-S-CH2-CH3, -CH2-CH2-S(0) -CH3, -CH2-CH2-S(0)2-CH3, -CH=CH-0-CH3, Si(CH3)3, -CH2-CH=N-OCH3 y -CH=CH-N (CH3) -CH3. Hasta dos heteroátomos pueden ser consecutivos tales como por ejemplo -CH2-NH-OCH3 y -CH2-0- Si(CH3)3. Similarmente, el término "heteroalquileno" por si mismo o como parte de otro substituyente, significa un radical divalente derivado de heteralquilo, como se ejemplifica pero no limita por -CH2-CH2-S-CH2-CH2- y -CH2-S-CH2-CH2-NH-CH2- . Para grupos heteroalquileno, los mismos o diferentes heteroátomos también pueden ocupar cualquiera o ambos extremos de cadena (incluyendo pero no limitados a alquilenoxi, alquilendioxi, alquilenamino, alquilendiamino, aminooxialquileno y semejantes) . Aún más, para grupos de enlace alquileno y heteroalquileno, no se implica orientación del grupo de enlace por la dirección en la cual la fórmula del grupo de enlace se escribe. Por ejemplo, la fórmula -C(0)2R'- representa tanto -C(0)2R'- como -R'C(0)2-. Los términos "cicloalquilo" y "heterocicloalquilo", por si mismos o en combinación con otros términos, representan a menos que se establezca de otra forma, versiones cíclicas de "alquilo" y "heteroalquilo", respectivamente. De esta manera, un cicloalquilo o heterocicloalquilo incluye enlaces de anillo saturados e insaturados. Adicionalmente, para heterocicloalquilo, un heteroátomo puede ocupar la posición en la cual el heterociclo se conecta al resto de la molécula. Ejemplos de cicloalquilo incluyen pero no están limitados a, ciclopentilo, ciciohexilo, 1-ciclohexenilo, 3-ciclohexenilo, cicioheptilo, y semejantes. Ejemplos de heterocicloalquilo incluyen pero no están limitados a, 1- (1, 2 , 5 , 6-tetrahidroporidilo) , 1-piperidinilo, 2-piperidinilo, 3-piperidinilo, A-morfolinilo, 3-morfolinilo, tetrahidrofuran-2-ilo, tetrahidrofuran-3-ilo, tetrahidrotien-2-ilo, tetrahidrotien-3-ilo, 1-piperazinilo, 2-piperazinilo, y semejantes. Adicionalmente, el término abarca estructuras de anillo bicíclicas y tricíclicas. Similarmente, el término "heterocicloalquileno" por si mismo o como parte de otro substituyente significa un radical divalente derivado de heterocicloalquilo y el término "cicloalquileno" por si mismo o como parte de otro substituyente significa un radical divalente derivado de cicloalquilo. Como se emplea aquí, el término "polímero solbule en agua" se refiere a cualquier polímero que es soluble en solventes acuosos. Enlace de polímero solbules en aguas con ABP puede resultar en cambios incluyendo pero no limitados a, vida media en suero aumentada o modulada, o vida media terapéutica aumentada o modulada, respecto a la forma no modificada, inmunogenicidad modulada, características de asociación física moduladas tales como agregación y formación de multímero, enlace de receptor alterado y dimerización o multimerización de receptor alterado. El polímero soluble en agua puede o no tener su propia actividad biológica y puede utilizarse como un enlazador para conectar un ABP a otras substancias, incluyendo pero no limitado a uno o más ABP, o uno o más moléculas biológicamente activas. Polímeros convenientes incluyen pero no están limitados a, polietilen glicol, polietilen glicol propionaldehido, mono Cl-ClO alcoxi o ariloxi derivados de los mismos (descritos en la patente de los E.U.A. No. 5,252,714 que se incorpora aquí por referencia), monometoxi-polietilen glicol, polivinil pirrolidona, polivinil alcohol, poliamino ácidos, anhídrido diviniléter maleico, N- (2 -Hidroxipropil ) -metacrilamida, dextrano, derivados dextrano incluyendo dextran sulfato, polipropilen glicol, copolímero de polipropilen óxido/etilen óxido, poliol polioxietilado, heparina, fragmentos de heparina, polisacáridos, oligosacáridos, glicanos, celulosa y derivados de celulosa, incluyendo pero no limitados a metilcelulosa y carboximetil celulosa, almidón y derivados de almidón, polipéptidos, polialquilen glicol y sus derivados, copolímeros de polialquilen glicoles y sus derivados, polivinil etil éteres, y alfa-beta-poli [ (2-hidroxietil) -DL-aspartamida y semejantes o sus mezclas. Ejemplos de estos polímero solubles en agua incluyen pero no están limitados a polietilen glicol y albúmina de suero. Como se emplea aquí, el término "polialquilen glicol" o "poli (alquen glicol)" se refiere a polietilen glicol (poli (etilen glicol)), polipropilen glicol, polibutilen glicol y sus derivados. El término "polialquilen glicol" abarca tanto polímeros lineales como ramificados y pesos moleculares promedio entre 0.1 kDa y 100 kDa. Otras modalidades ejemplares se citan por ejemplo, en catálogos de proveedores comerciales tales como el catálogo de Shearwater Corporation "Polyethylen Glycol y Derivatives for Biomedical Applications" (2001) . El término "arilo" significa, a menos de que se establezca de otra forma, un substituyente hidrocarburo poliinsaturado, aromático, que puede ser de un solo anillo o múltiples anillos (de preferencia de 1 a 3 anillos) que se fusiona en conjunto o enlazan covalentemente. El término "heteroarilo" se refiere a grupos (o anillos) arilo que contienen de uno a cuatro heteroátomos seleccionados de N, 0, y S, en donde los átomos de nitrógeno y azufre se oxidan opcionalmente, y el o los átomos de nitrógeno se cuaternizan opcionalmente. Un grupo heteroarilo puede conectarse al resto de la molécula a través de un heteroátomo. Ejemplos no limitantes de grupos arilo y heteroarilo incluyen fenilo, 1-naftilo, 2-naftilo, 4-bifenilo, 1-pirrolilo, 2-pirrolilo, 3-pirrolilo, 3-pirazolilo, 2-imidazolilo, 4-imidazolilo, pirazinilo, 2-oxazolilo, 4-oxazolilo, 2-fenil-4-oxazolilo, 5-oxazolilo, 3-isoxazolilo, 4-isoxazolilo, 5-isoxazolilo, 2-tiazolilo, 4-tiazolilo, 5-tiazolilo, 2-furilo, 3-furilo, 2-tienilo, 3-tienilo, 2-piridilo, 3-piridilo, 4-piridilo, 2-pirimidilo, 4-pirimidilo, 5- benzotiazolilo, purinilo, 2-benzimidazolilo, 5-indolilo, 1-isoquinolilo, 5-isoquinolilo, 2- quinoxalinilo, 5-quinoxalinilo, 3-quinolilo y 6-quinolilo. Substituyentes para cada uno de los sistemas de anillo arilo y heteroarilo anteriormente anotados se eligen del grupo de substituyentes aceptables descritos a continuación. Por brevedad, el término "arilo" cuando se emplea en combinación con otros términos (incluyendo pero no limitado a, ariloxi, ariltioxi, arilalquilo) incluyen tanto anillos arilo como heteroarilo como se definió anteriormente. De esta manera, el término "arilalquilo" se pretende que incluya aquellos radicales en donde un grupo arilo se conecta a un grupo alquilo (incluyendo pero no limitado a, benzilo, fenetilo, piridilmetilo y semejantes) incluyendo aquellos grupos alquilo en donde un átomo de carbono (incluyendo pero no limitado a un grupo metileno) ha sido reemplazado por ejemplo mediante un átomo de oxígeno (incluyendo pero no limitado a fenoximetilo, 2-piridiloximetilo, 3- (1-naftiloxi) propilo y semejantes) . Cada uno de los términos anteriores (incluyendo pero no limitados a "alquilo", "heteroalquil" , "arilo" y "heteroarilo"), se entiende que incluyan tanto formas substituidas como sin substituir del radical indicado. Substituyentes ejemplares para cada tipo de radical se proporcionan a continuación. Substituyentes para los radicales alquilo y heteroalquilo (incluyendo aquellos grupos a menudo referidos como alquileno, alquenilo, heteroalquileno, heteroalquenilo, alquinilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, cicloalquenilo y heterocicloalquenilo) pueden ser uno o más de una variedad de grupos seleccionados, pero no limitados a: -OR1, -O, =NR', =N-0R', -NR'R", -SR', -halógeno, SiR'R"R"', -0C(0)R', -C(0)R', -C02R', -CONR'R" , OC(0)NR'R", -NR"C(0)R' -NR » -C (0) NR"R" • , -NR"C(0)2R', -NR-C(NR'R' 'R- ")=NR"", -NR-C(NR'R")=NR' ", -S(0)R', -S(0)2R', -S(0)2NR'R", -NRS02R', -CN y -N02 en un número en el intervalo de cero a (2m'+l), en donde m' es el número total de átomos de carbono en este radical. R', R" , R'" y R" " cada uno independientemente se refieren a hidrógeno, heteroarilo substituido o sin substituir, arilo substituido o sin substituir, incluyendo pero no limitado a arilo substituido con 1-3 halógenos, grupos alquilo, alcoxi o tioalcoxi substituido o sin substituir, o grupos arilalquilo. Cuando un compuesto de la invención incluye más de un grupo R, por ejemplo cada uno de los grupos R se elige independientemente como cada uno de los grupos R', R" , R,M y R" " cuando más de uno de estos grupos está presente. Cuando R' y R" se conectan al mismo átomo de nitrógeno, pueden combinarse con el átomo de nitrógeno para formar un anillo de 5-, 6- o 7-miembros. Por ejemplo, - NR'R" se pretende que incluya, pero no está limita a, 1-pirrolidinilo y 4-morfolinilo . De la discusión anterior de substituyentes, una persona con destreza en la técnica comprenderá que el término "alquilo" se pretende que incluya grupos incluyendo átomos de carbono ligados a grupos diferentes a grupos hidrógeno, tales como haloalquilo (incluyendo pero no limitados a -CF3 y -CH2CF3) y acilo (incluyendo pero no limitado a -C(0)CH3, -C(0)CF3, -C (O) CH2OCH3, y semejantes) . Similar a los substituyentes descritos para el radical alquilo, los substituyentes para los grupos arilo y heteroarilo son variados y se eligen de, pero no están limitados a: halógeno, -OR1, =0, =NR', =N-OR', -NR'R" , -SR', -halógeno, -SiR-R'-R'", -OC(0)R', -C(0)R', -C02R' , -CONR'R", -OC(0)NR'R", -NR"C(0)R', -NR' -C(0)NR"R'", NR"C(0)2R', -NR-C(NR,R"R"0=NR"", -NR-C (NR ' R" ) =NR" * , S(0)R', -S(0)2R', -S(0)2NR'R", -NRS02R ' , -CN y -N02, -R', -N3, -CH(Ph)2, fluoro (C?-C4) alcoxi y fluoro (C1-C4) alquilo, en una cantidad en el intervalo de cero al número total de valencias abiertas en el sistema de anillo aromático; y en donde R1, R" , R" ' y R" " se eligen independientemente de hidrógeno, alquilo, heteroalquilo, arilo y heteroarilo. Cuando un compuesto de la invención incluye más de un grupo R, por ejemplo, cada uno de los substituyentes R se eligen independientemente como cada uno de los grupos R', R" , R'" y R" " cuando más de uno de estos grupos está presente . Como se emplea aquí, el término "vida media en suero modulada" significa el cambio positivo o negativo en vida media de circulación de un ABP modificado respecto a su forma no modificada. Vida media en suero se mide al tomar muestras de sangre en diversos puntos en tiempo después de la administración de ABP, y determinar la concentración de esa molécula en cada muestra. La correlación de la concentración de suero con el tiempo permite cálculo de la vida media en suero. Una vida media en suero incrementada convenientemente tiene al menos aproximadamente el doble, pero un aumento más pequeño puede ser útil por ejemplo cuando permite un régimen de dosificación satisfactorio o evita un efecto tóxico. En algunas modalidades, el aumento es al menos aproximadamente tres veces, al menos aproximadamente cinco veces o al menos aproximadamente diez veces. El término "vida media terapéutica modulada" como se emplea aquí, significa el cambio positivo o negativo en vida media de la cantidad terapéuticamente efectiva de un ABP o ABP que comprende una molécula biológicamente activa modificada, respecto a su forma no modificada. Vida media terapéutica se mide al medir propiedades farmacocinéticas y/o farmacodinámicas de la molécula en diversos puntos en tiempo después de administración. Vida media terapéutica incrementada convenientemente permite un régimen de dosificación particular benéfico, una dosis total particular benéfica, o evita un efecto indeseable. En algunas modalidades, la vida media terapéutica incrementada resulta de potencia incrementada, enlace incrementado o disminuido de la molécula modificada a su diana, o un aumento o disminución en otro parámetro o mecanismo de acción de la molécula no modificada.

El término "aislado", cuando se aplica a un ácido nucleico o proteína, denota que el ácido nucleico o proteína está substancialmente libre de otros componentes celulares con los cuales se asocia en el estado natural. Puede estar en un estado homogéneo. Substancias aisladas pueden ya estar en un estado seco o semi-seco, o en solución, incluyendo pero no limitadas a solución acuosa. Pureza y homogeneidad típicamente se determinan utilizando técnicas de química analítica tales como electroforesis en gel de poliacrilamida o cromatografía de líquido de alto desempeño. Una proteína que es la especie predominante presente en una preparación está substancialmente purificada. En particular, un gen aislado se separa de marcos de lectura abiertos que flanquean al gen y codifican una proteína diferente al gen de interés. El término "purificado" denota que un ácido nucleico o proteína da lugar substancialmente a una banda en un gel electroforético. Particularmente, significa que el ácido nucleico o proteína está al menos 85 por ciento puro, al menos 90 por ciento puro, al menos 95 por ciento puro, al menos 99 por ciento o mayor de pureza. El término "ácido nucleico" se refiere a deoxiribonucleótidos , deoxiribonucleosidos , ribonucleósidos o ribonucleótidos y sus polímeros ya sea en forma de una sola o doble hebra. A menos que se limite específicamente, el término abarca ácidos nucleicos que contienen análogos conocidos de nucleótidos naturales que tienen propiedades de enlace similares al ácido nucleico de referencia y se metabolizan en una forma similar a nucleótidos de origen natural . A menos que se limite específicamente de otra forma, el término también se refiere a análogos oligonucleótido incluyendo ácido péptido nucleico (PNA = peptidenucleic acid) , análogos de DNA utilizados en tecnología anti-sentido (fosforotioatos, fosforoamidatos y semejantes) . A menos que se indique de otra forma, una secuencia de ácido nucleico particular también abarca implícitamente sus variantes modificadas en forma conservadora (incluyendo pero no limitado a, substituciones de codón degenerado) y secuencias complementarias así como la secuencia explícitamente indicada. Específicamente, substituciones de codón degeneradas pueden lograrse al generar secuencias en donde la tercer posición de uno o más codones selectos (o todos) se substituye con residuos de base mixta y/o deoxiinosina (Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991); Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985); y Cassol et al. (1992); Rossolini et al, Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994)). Los términos "polipéptido", "péptido" y "proteína" se emplean en forma intercambiable aquí para referirse a un polímero de residuos amino ácido. Esto es, una descripción dirigida a un polipéptido aplica igualmente a una descripción de un péptido y una descripción de una proteína y viceversa. El término aplica a polímeros de amino ácidos de origen natural así como polímeros de amino ácidos en donde uno o más residuos amino ácido es un amino ácido no naturalmente codificado. Como se emplea aquí, si los términos abarcan cadenas amino ácido de cualquier longitud incluyendo proteínas de longitud íntegra (es decir antígenos) , en donde los residuos amino ácido están enlazados por enlaces péptido covalentes. El término "amino ácido" se refiere a amino ácido de origen natural y que no son de origen natural, así como análogos amino ácidos y miméticos de amino ácido que funcionan en una forma similar a amino ácidos de origen natural . Amino ácidos naturalmente codificados son los 20 amino ácidos comunes (alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteina, glutamina, ácido glutámico, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptofan, tirosina, y valina) y pirolisina y selenocisteina. Análogos de amino ácidos se refieren a compuestos que tienen la misma estructura química básica que un amino ácido de origen natural, es decir un carbono alfa que está ligado a un hidrógeno, un grupo carboxilo, un grupo amino y un grupo R, tal como homoserina, norleucina, metionina sulfóxido, metionina metil sulfonio. Estos análogos tienen grupos R modificados (tales como, norleucina) o estructuras principales péptido modificadas, pero retiene la misma estructura química básica que un amino ácido de origen natural . Amino ácidos pueden ser referidos aquí ya sea por sus símbolos de tres letras comúnmente conocidos, o por los símbolos de tres letras recomendados por la Comisión de Nomenclatura Bioquímica de la IUPAC-IUB. Nucleótidos, igualmente pueden ser referidos por sus códigos de una sola letra comúnmente aceptados. "Variantes modificadas en forma conservadora" se aplican tanto a secuencias amino ácido como ácido nucleico. Con respecto a secuencias de ácido nucleico particulares, "variantes modificadas en forma conservadora" se refieren a aquellos ácidos nucleicos que codifican secuencias de amino ácido idénticas o esencialmente idénticas o cuando el ácido nucleico no codifica una secuencia amino ácido, a secuencias esencialmente idénticas. Debido a la degeneración del código genético, una gran cantidad de ácidos nucleicos funcionalmente idénticos codifican cualquier proteína determinada. Por ejemplo, los codones GCA, GCC, GCG y GCU todos codifican el amino ácido alanina. De esta manera, en toda posición en donde una alanina se especifica por un codón, el codón puede ser alterado a cualquiera de los codones correspondientes descritos sin alterar el polipéptido codificado. Estas variaciones de ácido nucleico son "variaciones silenciosas", que son una especie de variaciones modificadas conservadoramente . Toda secuencia de ácido nucleico aquí que codifica un polipéptido también describe toda variación silenciosa posible del ácido nucleico. Una persona con destreza reconocerá que cada codón en un ácido nucleico (excepto AUG, que ordinariamente es el único codón para metionina, y TGG, que ordinariamente es el único codón para triptofano) puede modificarse para producir una molécula funcionalmente idéntica. De acuerdo con esto, cada variación silenciosa de un ácido nucleico que codifica un polipéptido es implícita en cada secuencia descrita. En cuanto a secuencias de amino ácido, una persona con destreza reconocerá que las substituciones, eliminaciones o adiciones individuales a una secuencia de ácido nucleico, péptido, polipéptido o proteína que altera, agrega o elimina un amino ácido sencillo o un pequeño porcentaje de amino ácidos en la secuencia codificada es una "variante modificada en forma conservadora" en donde la alteración resulta en la substitución del amino ácido con un amino ácido químicamente similar. Tablas de substitución conservadoras proporcionan amino ácidos funcionalmente similares son bien conocidas en la especialidad. Estas variantes conservadoramente modificadas son además de y no exceden las variantes polimórficas, homólogos inter-especies y alelos de la invención. Los siguientes ocho grupos cada uno contienen amino ácidos que son substituciones conservadoras entre sí : 1 ) Alanina (A) , Glicina (G) ; 2) Ácido aspártico (D) , Ácido glutámico (E) ; 3) Asparagina (N) , Glutamina (Q) ; 4) Arginina (R) , Lisina (K) ; 5) Isoleucina (I) , Leucina (L) , Metionina (M) , Valina (V); 6) Fenilalanina (F) , Tirosina (Y) , Triptofan (W) ; 7) Serina (S) , Treonina (T) ; y 8) Cisteina (C) , Metionina (M) (ver, por ejemplo Creighton, Proteins: Structures y Molecular Properties (W H Freeman & Co . ; 2a edición (diciembre 1993) Los términos "idéntico" o por ciento de "identidad", en el contexto de dos o más secuencias de polipéptido o ácidos nucleicos, se refieren a dos o más secuencias o subsecuencias que son iguales. Secuencias son "substancialmente idénticas" si tienen un porcentaje de residuos amino ácido o nucleótidos que son iguales (es decir aproximadamente 60 por ciento de identidad, opcionalmente aproximadamente 65 por ciento, aproximadamente 70 por ciento, aproximadamente 75 por ciento, aproximadamente 80 por ciento, aproximadamente 85 por ciento, aproximadamente 90 por ciento, o aproximadamente 95 por ciento de identidad sobre una región especificada) , cuando se comparan y alinean para máxima correspondencia sobre una ventana de comparación, o región designada como se mide utilizando uno de los siguientes algoritmos de comparación de secuencia o por alineamiento manual e inspección visual. Esta definición también se refiere al complemento de una secuencia de prueba. La identidad puede existir sobre una región que es al menos aproximadamente 50 amino ácidos o nucleótidos de longitud, o sobre una región que es 75-100 amino ácidos o nucleótidos de longitud, o cuando no se especifica a través de toda la secuencia o un polinucleótido o polipéptido. Para comparación de secuencia, típicamente una secuencia actúa como una secuencia de referencia, a la cual se comparan secuencias de prueba. Cuando se utiliza un algoritmo de comparación de secuencia, secuencias de prueba y referencia se alimentan a una computadora, se designan coordenadas subsecuentes de ser necesario y se designan parámetros de programa de algoritmo de secuencia. Parámetros de programa predefinidos pueden emplearse, o pueden designarse parámetros alternos. El algoritmo de comparación de secuencia calcula entonces el por ciento de identidades de secuencia para las secuencias de prueba respecto a la secuencia de referencia, con base en los parámetros de programa. Una "ventana de comparación" , como se emplea aquí, incluye referencia a un segmento de cualquiera de la cantidad de posiciones contiguas seleccionadas del grupo que consiste de 20 a 600 usualmente de aproximadamente 50 aproximadamente 200, más usualmente aproximadamente 100 a aproximadamente 150 en donde una secuencia puede compararse con una secuencia de referencia del mismo número de posiciones contiguas después de que se alinean en forma óptima las dos secuencias. Métodos de alineamiento de secuencias para comparación son bien conocidos en la especialidad. Alineamiento óptimo de secuencias para comparación puede realizarse, incluyendo pero no limitado a, por el algoritmo de homología local de Smith y Waterman (1970) Adv. Appl. Math. 2:482c, por el algoritmo de alineamiento homología de Needleman y Wunsch (1970) J Mol. Biol. 48:443, por la búsqueda por el método de similaridad de Pearson y Lipman (1988) Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444, por implementaciones computarizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA, y TFASTA en el Paquete de Soporte Lógico de Wisconsin Genetics (Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group) , 575 Science Dr., Madison, WI) , o por alineamiento manual o inspección visual (ver, por ejemplo Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (1995 supplement) ) . Un ejemplo de un algoritmo que es adecuado para determinar por ciento de identidad de secuencia y similaridad de secuencia son los algoritmos BLAST y BLAST 2.0, que se describen en Altschul et al. (1977) Nuc . Acids Res. 25:3389-3402, y Altschul et al. (1990) J Mol. Biol. 215:403-410, respectivamente. Soporte lógico para revisar análisis BLAST está disponible públicamente a través del Centro Nacional para Información de Biotecnología (National Center for Biotechnology Information) . Los parámetros del algoritmo BLAST W, T, y X determinan la sensibilidad y velocidad del alineamiento. El programa BLASTN (para secuencias de nucleótido) utiliza como valores predefinidos una longitud de palabra (W) de 11, una expectativa (E) o 10, M=5, N=-4 y una comparación de ambas hebras. Para secuencias de amino ácido, el programa BLASTP utiliza como valores predefinidos una longitud de palabra de 3 y expectativa (E) de 10, y la matriz de calificación BLOSUM62 (ver Henikoff y Henikoff (1989) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 89:10915) alineamientos (B) de 50, expectativas (E) de 10, M=5, N=-4, y una comparación de ambas hebras. El algoritmo BLAST típicamente se realiza con el desactivado el filtro de "baja complejidad". El algoritmo de BLAST también realiza un análisis estadístico de la similaridad entre dos secuencias (ver, Karlin y Altschul (1993) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90:5873-5787) . Una medida de similaridad que se proporciona por el algoritmo BLAST es la probabilidad de suma más pequeña (P(N)), que proporciona una indicación de la probabilidad por la cual una correspondencia entre dos secuencias de nucleótido o amino ácido ocurriría al azar. Por ejemplo, un ácido nucleico se considera similar a una secuencia de referencia si la probabilidad es suma más pequeña en una comparación del ácido de prueba al ácido nucleico con referencia es menos que aproximadamente 0.2, más preferiblemente menos que aproximadamente 001, y más preferiblemente menos que aproximadamente 0.001. La frase "hibridiza selectivamente (o específicamente) a" se refiere al enlace, duplejado o hibridización de una molécula solo a una secuencia de nucleótido particular bajo estrictitas condiciones de hibridización, cuando esta secuencia está presente en una mezcla compleja (incluyendo pero no limitado a, DNA o RNA total celular o de biblioteca) . La frase "condiciones estrictas de hibridización" se refiere a condiciones de baja concentración iónica y alta temperatura como se conoce en la técnica. Típicamente, bajo condiciones estrictas una sonda hibridizará a su subsecuencia diana en una mezcla compleja de ácido nucleico (incluyendo pero no limitado a, DNA o RNA total celular o de biblioteca) , pero no hibridiza a otras secuencias en la mezcla compleja. Condiciones estrictas son dependientes de secuencia y serán diferentes en diferentes circunstancias. Secuencias más largas hibridizan específicamente a superiores temperaturas. Una guía extensa a la hibridización de ácidos nucleicos se encuentra en Tijssen, Techniques in Biochemistry y Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Probes, "Overview of principies of hybridization y the strategy of nucleic acid assays" (1993). En general, condiciones estrictas se eligen de aproximadamente 5-10 grados C menos que el punto de fusión térmico (Tm) para la secuencia específica a un pH de concentración iónica definida. La Tm es la temperatura (bajo las definidas concentración iónica, pH, y concentración nucleica) en las cuales 50 por ciento de las sondas complementarias a la diana hibridizan con la secuencia diana al equilibrio (ya que las secuencias diana están presentes en exceso, a Tm, 50 por ciento de las sondas están ocupadas en equilibrio) . Condiciones estrictas pueden ser aquellas en las que la concentración de sal es menos que aproximadamente 1.0 M de ion sodio, típicamente aproximadamente 0.01 a 1.0 M de concentración de ion sodio (u otras sales) a pH 7.0 a 8.3 y la temperatura es al menos aproximadamente 30 grados C para sondas más cortas (incluyendo pero no limitadas a 10 a 50 nucleótidos) y al menos aproximadamente 60 grados C para sondas largas (incluyendo pero no limitadas a, de más de 50 nucleótidos) . Condiciones estrictas también pueden lograrse con la adición de agentes desestabilizantes tales como formamida. Para hibridización selectiva o específica, una señal positiva puede ser al menos dos veces en fondo, opcionalmente 10 veces la hibridización de fondo. Condiciones de hibridización estrictas ejemplares pueden ser como sigue: 50 por ciento formamida, 5X SSC, y SDS al 1 por ciento, incubando a 42 grados C, o 5X SSC, SDS al 1 por ciento, incubar a 65 grados C, con lavado en 0.2X SSC, y SDS al 0.1 por ciento a 65 grados C. Estos lavados pueden realizarse por 5, 15, 30, 60, 120, o más minutos. Como se emplea aquí, el término "eucariota" se refiere a organismos que pertenecen al dominio filogenético Eucarya tales como animales (incluyendo pero no limitados a, mamíferos, insectos, reptiles, aves, etc.) ciliados, plantas (incluyendo pero no limitado a, monocotiledóneas, dicotiledóneas, algas, etc.) hongos, levadura, flageladas, microsporidios, protistas, etc. Como se emplea aquí, el término "no-eucariota" se refiere a organismos no-eucariótico. Por ejemplo, un organismo no-eucariótico puede pertenecer a la Eubacteria (incluyendo pero no limitado al dominio filogenético Escherichia coli , Thermi ts thermophilics, Bacillus stearothermophilus , Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas putida, etc.), o el dominio filogenético Archaea (incluyendo pero no limitado a, Methanococcus jannaschii , Methanobacterium thermoautotrophicum, Halobacteriu tales como Haloferax volcanii y las especies Halobacterium NRC-I, Archaeoglobus fulgidus, Pyrococcus furiosus, Pyrococcus horikoshii , Aeuropyrum pernix, etc.) . El término "sujeto", como se emplea aquí, se refiere a un animal, de preferencia un mamífero, más preferiblemente un humano, quien es el objeto del tratamiento, observación o experimento. El término "cantidad efectiva" como se emplea aquí, se refiere a la cantidad del polipéptido amino ácido no-natural (modificado) , que se administra y aliviará hasta cierto punto uno o más de los síntomas de la enfermedad, condición o desorden en tratamiento. Composiciones que contiene el polipéptido amino ácido no-natural (modificado) descrito aquí, puede administrarse para tratamientos profilácticos, de mejora, y/o terapéuticos . Los términos "mejora" o "mejoramiento" significan incrementar o prolongar ya sea en potencia o duración del efecto deseado. De esta manera, por lo que respecta a mejorar el efecto de agentes terapéuticos, el término "mejoramiento" se refiere a la habilidad para incrementar o prolongar, ya sea en potencia o duración, el efecto de otros agentes terapéuticos en un sistema. Una "cantidad de mejoramiento efectiva", como se emplea aquí, se refiere a la cantidad adecuada para mejorar el efecto de otro agente terapéutico en un sistema deseado. Cuando se emplean en un paciente, cantidades efectivas para este uso dependerán de la severidad y trayecto de la enfermedad, desorden o condición, previa terapia, el nivel de salud del paciente y su respuesta a las drogas, y el juicio del médico a cargo. El término "modificado", como se emplea aquí, se refiere a la presencia de una modificación post-traducción en un polipéptido. El término forma " (modificada) " se refiere a que los polipéptidos en discusión son modificados opcionalmente, esto es, los polipéptidos bajo discusión pueden ser modificados o no modificados . El término "modificado post-traducción" y modificado" se refieren a cualquier modificación de un amino ácido natural o no natural que ocurre a un amino ácido después de que se ha incorporado en la cadena polipéptido. El término abarca a manera de ejemplo únicamente, modificaciones co-traducción in vivo, modificaciones post- traducción in vivo, y modificaciones post-traducción in vi tro . En aplicaciones profilácticas, composiciones que contienen el polipéptido amino ácido no-natural (modificado) , se administran a un paciente susceptible a o en riesgo de una enfermedad, desorden o condición en particular. Esta cantidad se define como una "cantidad efectiva profilácticamente" . En este uso, las cantidades precisas también dependen del estado de salud del paciente, su peso, y semejantes. Se considera bien dentro de la destreza en la técnica que alguien determine dichas cantidades efectivas profilácticamente por experimentación de rutina (es decir, una prueba clínica de escalado de dosis) . El término "protegido" se refiere a la presencia de una porción o "grupo protector" que previene o evita la reacción del grupo funcional químicamente reactivo bajo ciertas condiciones de reacción. El grupo protector variará dependiendo del tipo de grupo químicamente reactivo protegido. Por ejemplo, si el grupo químicamente reactivo es un amino o un hidrácido, el grupo protector puede seleccionarse del grupo de ter-butiloxicarbonilo (t-Boc) y 9-fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc) . Si el grupo reactivo químico es un tiol, el grupo protector puede ser ortopiridildisulfuro. Si el grupo reactivo químicamente es un ácido carboxílico, tale como ácido butanoico o propiónico, o un grupo hidroxilo, el grupo protector puede ser bencilo o un grupo alquilo tal como metilo, etilo, o ter-butilo. Otros grupos protectores conocidos en la especialidad, también pueden usarse en o con los métodos y composiciones aquí descritas. A manera de ejemplo únicamente, grupos bloqueadores/protectores pueden seleccionarse de: H3C Cbz altoc Me H3C' Et t-but l TBDMS Teoc (CHa Otros grupos protectores, se describen en Greene and Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 3rd Ed., John Wiley & Sons, New York, NY, 1999, que se incorpora aquí por referencia en su totalidad. En aplicaciones terapéuticas, composiciones que contienen el polipéptido amino ácido no-natural (modificado) se administran a un paciente que ya está sufriendo de una enfermedad, condición o desorden, en una cantidad suficiente para curar o al menos disminuir parcialmente los síntomas de la enfermedad, desorden, o condición. Tal cantidad se define como una "cantidad terapéuticamente efectiva" y dependerá de la severidad y trayecto de la enfermedad, desorden o condición, previo a terapia, el estado de salud del paciente y respuesta a las drogas, y el juicio del médico a cargo. Se considera bien dentro de la destreza en la técnica, que alguien determine dichas cantidades terapéuticamente efectivas por experimentación de rutina (es decir, una prueba clínica de escalado de dosis) . El término "tratar" se emplea para referirse a tratamientos ya sea profilácticos y/o terapéuticos. A menos que se indique de otra manera, se emplean métodos convencionales de espectroscopia de masa, RMN, HPLC, química de proteína, bioquímica, técnicas de ADN (DNA) recombinante y farmacología, dentro de la destreza en la técnica. DESCRIPCIÓN DETALLADA I. Introducción Moléculas ABP que comprenden al menos un amino ácido no natural, se proporcionan en la invención. En ciertas modalidades de la invención, ABP con al menos un amino ácido no natural incluye al menos una modificación post-traducción. En una modalidad, al menos una modificación post-traducción comprende unir una molécula incluyendo pero no limitado a, una etiqueta, un colorante, un polímero, un polímero soluble en agua, un derivado de polietilen glicol, un fotoentrelazador, un compuesto citotóxico, un radionucleótido, una droga, una etiqueta de afinidad, una etiqueta de fotoafinidad, un compuesto reactivo, una resina, una segunda proteína o polipéptido o análogo de polipéptido, un anticuerpo o fragmento de anticuerpo, un quelante de metal, un cofactor, un ácido graso, un carbohidrato, un polinucleótido, un ADN, un ARN, un polinucleótido antisentido, un dendrímero soluble en agua, una ciclodextrina, un ácido ribonucleico inhibitorio, un biomaterial, una nanopartícula, una etiqueta de espín, un fluoróforo, una porción que contiene metal, un radical radioactivo, un grupo funcional novedoso, un grupo que interactúa covalente o no covalentemente con otras moléculas, una porción foto-enjaulada, un radical fotoisomerizable, biotina, un derivado de biotina, un análogo de biotina, una porción que incorpora un átomo pesado, un grupo químicamente escindible, un grupo foto-escindible, una cadena lateral alargada, un azúcar ligado a carbono, un agente activo-redox, un tioácido amino, una porción tóxica, una porción isotópicamente etiquetada, una sonda biofísica, un grupo fosforescente, un grupo quimioluminiscente, un grupo denso de electrones, un grupo magnético, un grupo intercalador, un cromóforo, un agente de transferencia de energía, un agente biológicamente activo, una etiqueta detectable, una molécula pequeña, o cualquier combinación de los anteriores o cualquier otro compuesto o substancia deseado, que comprende un segundo grupo reactivo para al menos un amino ácido no natural que comprende un primer grupo reactivo que utiliza la metodología química que es conocida por alguien con destreza ordinaria en la técnica que es conveniente para los grupos reactivos particulares. Por ejemplo, el primer grupo reactivo es una porción alquinilo (incluyendo pero no limitada a, en el amino ácido no natural p-propargiloxifenilalanina, donde el grupo propargilo es también a veces referido como un radical de acetileno) y el segundo grupo reactivo es una porción azido, y se utilizan metodologías químicas de cicloadición [3+2] . En otro ejemplo, el primer grupo reactivo es una porción azido (incluyendo pero no limitado a, en el amino ácido no natural p-azido-L-fenilalanina) y el segundo grupo reactivo es el radical alquinilo. En algunas modalidades del polipéptido ABP modificado de la presente invención, al menos un amino ácido no natural (incluyendo pero no limitado a amino ácido no natural que contiene un grupo ceto funcional) que comprende al menos una modificación post-traducción, se emplea en donde la modificación post- traducción comprende un radical sacárido. En algunas modalidades, la modificación post-traducción se hace in vivo en una célula eucariótica o en una célula no eucariótica.

En algunas modalidades, la proteína incluye al menos una modificación post-traducción que está hecha in vivo por una célula huésped o anfitriona, en donde la modificación post-traducción no está hecha por otro tipo de célula huésped. En algunas modalidades, la proteína incluye al menos una modificación post-traducción que está hecha in vivo por una célula eucariótica, en donde la modificación post-traducción no está normalmente hecha por una célula no-eucariótica. Ejemplos de modificaciones post-traducción incluyen, pero no están limitados a, acetilación, acilación, modificación de lípidos, palmitoilación, adición de palmitato, fosforilación, modificación de enlace-glicolípido, y semejantes. En una modalidad, la modificación post-traducción comprende unir un oligosacárido a una asparagina por un enlace ClcNAc-asparagina (incluyendo pero no limitado a, donde el oligosacárido comprende (GlcNAc-Man) 2-Man-GlcNAc-GlcNAc, y semejantes) . En otra modalidad, la modificación posttraducción comprende unir un oligosacárido (incluyendo pero no limitado a, Gal-GalNAc, Gal- GlcNAc, etc.) a una serina o treonina por un enlace GalNAc-serina, una GalNAc-treonina, una GlcNAc-serina, o GlcNAc-treonina . En algunas modalidades, una proteína o polipéptido de la invención puede comprender una secreción o secuencia de localización, una etiqueta epítope, una etiqueta FLAG, una etiqueta polihistidina, una fusión GST, y/o semejantes. Ejemplos de secuencias de señal de secreción incluyen pero no están limitadas a, una secuencia de señal de secreción procariótica, una secuencia de señal de secreción eucariótica, una secuencia de señal de secreción eucariótica 5 ' -optimizada para expresión bacterial, una novedosa secuencia de señal de secreción, una secuencia de señal de secreción pectato liasa, una secuencia de señal de secreción Omp A, y una secuencia de señal de secreción fago. Ejemplos de secuencias de señal de secreción, incluyen pero no están limitados a STII (procariótico) , Fd GIII y M13 (fago) , Bgl2 (levadura) , y la secuencia de señal bla derivada de un transposón. Un polipéptido de enlace de antígeno que comprende un amino ácido no natural, puede ser usado para modular la vida media terapéutica, vida media en suero, o el tiempo de circulación de moléculas biológicamente activas, incluyendo pero no limitado a, moléculas pequeñas, péptidos, y oligonucleótidos. Estas moléculas pequeñas, péptidos, y oligonucleótidos pueden tener actividades biológicas que incluyen pero no se limitan a, enlazar y/o reconocer una molécula objetivo o tipo de célula diana, anti-tumor, anti-angiogénesis, anti-viral, y actividades apoptóticas. Además, el polipéptido de enlace de antígeno que comprende un amino ácido no natural puede proporcionar una actividad deseada, incluyendo pero no limitada a, función efectora tal como ADCC, fagocitosis, o citotoxicidad dependiente-de complemento, activación de prodrogas, actividad enzimática, actividad catalítica, bloqueo de interacciones de proteína-proteína, enlace a un antígeno deseado, y hace objetivo o diana a la molécula pequeña a un sitio deseado. El bloqueo de las interacciones proteína-proteína de un ABP puede modular una o más actividades de la molécula biológicamente activa unida. Moléculas pequeñas pueden usarse como antagonistas para interferir con las actividades de enlace de otras proteínas o moléculas. El polipéptido de enlace de antígeno y la molécula pequeña pueden unirse por un enlazador, polímero o enlace covalente. El enlazador, polímero, o la propia molécula pequeña pueden comprender un grupo funcional que no es reactivo con los 20 amino ácidos comunes. El enlazador o polímero puede ser bifuncional. Uno o más enlaces involucrados en unir el polipéptido de enlace de antígeno a través del enlazador, polímero o enlace covalente con la molécula biológicamente activa, pueden ser irreversibles, reversibles o lábiles bajo las condiciones deseadas. Uno o más enlaces involucrados en unir el polipéptido de enlace de antígeno a través del enlazador, polímero o enlace covalente con la molécula, pueden permitir liberación modulada del polipéptido de enlace de antígeno u otra molécula. Una diversidad de moléculas pequeñas puede generarse por alguien con destreza en la especialidad por medios químicos, aislamiento como productos naturales, u otros medios. Rader et al. en Proc Nati Acad Sci U.S.A. 2003 Apr 29; 100 (9) : 5396-400 , que se incorpora aquí por referencia, describe un método para proporcionar función efectora y vida media en suero prolongada a moléculas sintéticas pequeñas al reaccionarlas con una molécula de anticuerpo genérico. El complejo descrito se creó por un enlace covalente reversible entre mAb 38C2, un anticuerpo catalítico que imita las enzimas aldolasa naturales, y un derivado dicetona de una integrina que hace blanco al peptidomimético Arg-Gly-Asp mediante un residuo lisina reactivo en el anticuerpo. Además de un aumento en vida media del peptidomimético, el complejo mostró re-direccionamiento selectivo del anticuerpo a la superficie de células que expresan integrina av?3 y oc vßs - La proteína o polipéptido de interés pueden contener al menos uno, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco, al menos seis, al menos siete, al menos ocho, al menos nueve o diez o más aminoácidos no naturales. Los aminoácidos no naturales pueden ser iguales o diferentes, por ejemplo puede haber 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más sitios diferentes en la proteína que comprenden 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más aminoácidos no naturales diferentes. En ciertas modalidades, al menos uno, pero menos que todos de un aminoácido particular presentes en una versión de origen natural de la proteína, se sustituyen con un aminoácido no natural . La presente invención proporciona métodos y composiciones con base en polipéptidos de enlace antígeno, o ABP, que comprende al menos un aminoácido no naturalmente codificado. La introducción de la menos un aminoácido no naturalmente codificado en un ABP puede permitir la aplicación de químicas de conjugación que involucran reacciones químicas específicas, incluyendo pero no limitadas a, con uno o más aminoácidos no naturalmente codificados mientras que no reacciona con los 20 aminoácidos de origen común. En algunas modalidades, la ABP que comprende el aminoácido no naturalmente codificado se enlaza a un polímero soluble en agua, tal como polietilen glicol (PEG) , mediante la cadena lateral del aminoácido no naturalmente codificado. Esta invención proporciona un método altamente eficiente para la modificación selectiva de las proteínas con derivados PEG, que involucra la incorporación selectiva de los aminoácidos no genéticamente codificados, incluyendo pero no limitados a, aquellos aminoácidos que contienen grupos o sustituyentes funcionales que no se encuentran en los 20 aminoácidos incorporados naturalmente, incluyendo pero no limitados a una porción cetona, una azida o acetileno, en proteínas en respuesta a un codón selector y la subsecuente modificación de aquellos aminoácidos con un derivado PEG convenientemente reactivo. Una vez incorporadas, las cadenas laterales aminoácido pueden ser modificadas al utilizar metodologías químicas conocidas por aquellos con destreza ordinaria en la técnica que son adecuadas para los grupos o sustituyentes funcionales particulares presentes en el aminoácido codificado naturalmente. Metodologías de química conocidas de una amplia variedad son adecuadas para utilizar en la presente invención para incorporar un polímero soluble en agua en la proteína. Esas metodologías incluyen pero no están limitadas a una reacción de cicloadición Huisgen [3+2] (ver Padwa, A. in Comprehensive Organic Synthesis, Vol. 4, (1991) Ed. Trost, B. M., Pergamon, Oxford, p. 1069-1109; y, Huisgen, R. in 1,3-Dipolar Cycloaddition Chemistry, (1984) Ed. Padwa, A., Wiley, New York, p. 1-176) incluyendo pero no limitado a, con derivados acetileno o azida, respectivamente.

Debido a que el método de cicloadición de Huisgen [3+2] involucra una cicloadición en vez de una reacción de sustitución nucleofílica, pueden modificarse proteínas con selectividad extremadamente alta. La reacción puede llevarse a cabo a temperatura ambiente en condiciones acuosas con excelente regioselectividad (1,4 > 1,5) por la adición de cantidades catalíticas de sales Cu (I) a la mezcla de reacción. Ver, Tornoe, et al., (2002) Org. Chem. 67:3057-3064; and, Rostovtsev, et al., (2002) Angew. Chem. Int. Ed. 41:2596-2599; y WO 03/101972. Una molécula que puede agregarse a una proteína de la invención a través de una cicloadición [3+2] incluye virtualmente cualquier molécula con un grupo o sustituyente funcional conveniente incluyendo pero no limitado a un derivado azido o acetileno. Estas moléculas pueden agregarse a un aminoácido no natural con un grupo acetileno incluyendo pero no limitado a, p-propargiloxifenilalanina, o grupo azido, incluyendo pero no limitado a, p-azido-fenilalanina, respectivamente. El anillo de cinco miembros que resulta de la cicloadición Huisgen [3+2] generalmente no es reversible en ambientes reductores y es estable contra hidrólisis por periodos prolongados en ambientes acuosos . Consecuentemente, las características físicas y químicas de una amplia variedad de sustancias pueden modificarse bajo condiciones acuosas demandantes con los derivados PEG activos de la presente invención. Aún más importante, debido a que las porciones azida y acetileno son específicas entre sí (y no por ejemplo reaccionan con cualquiera de los 20 aminoácidos genéticamente codificados comunes) , las proteínas pueden modificarse en uno o más sitios específicos con selectividad extremadamente alta. La invención también proporciona sales solubles en agua e hidrolíticamente estables de derivados PEG y polímeros hidrofílicos relacionados que tienen una o más porciones acetileno o azida. Los derivados de polímero PEG que contienen porciones acetileno son altamente selectivos para acoplar con porciones azida que se han introducido selectivamente en proteínas, en respuesta a un codón selector. Similarmente, derivados de polímero PEG que contienen porciones azida son altamente selectivos para acoplar con porciones acetileno que se han introducido selectivamente en proteínas, en respuesta a un codón selector. Más específicamente, las porciones azida comprenden pero no están limitadas a, alquil azidas, aril azidas y derivados de estas azidas. Los derivados de las alquil y aril azidas pueden incluir otros sustituyentes siempre que la reactividad específica de acetileno se mantenga. Las porciones acetileno comprenden alquil y aril acetilenos y derivados de cada uno. Los derivados de alquil y aril acetilenos pueden incluir otros sustituyentes siempre que se mantenga la reactividad específica de azida. ABP que comprenden un aminoácido no naturalmente codificado pueden emplearse en ensayos que utilizan la especificidad de anticuerpos. Por ejemplo, moléculas de ABP de la invención pueden emplearse para supervisar una población de antígenos potenciales. La presente invención proporciona conjugados de sustancias que tienen una amplia variedad de grupos funcionales, subunidades o porciones, con otras sustancias incluyendo pero no limitadas a una etiqueta; un colorante; un polímero; un polímero soluble en agua; un derivado de polietilen glicol; un fotoentrelazador; un compuesto citotóxico; un radionúclido; una droga; una etiqueta de afinidad; una etiqueta de fotoafinidad; un compuesto reactivo; una resina; una segunda proteína o polipéptido o análoga de polipéptido; un anticuerpo o fragmento de anticuerpo; un quemador de metal; un cofactor; un ácido graso, un carbohidrato; un polinucleótido; un DNA; un RNA; un polinucleótido antisentido; un dendrímero soluble en agua; una ciclodextrina; un ácido ribonucleico inhibitorio; un biomaterial; una nanopartícula; una etiqueta de espin; un fluoroforo; una porción que contiene metal; una porción radioactiva; un grupo funcional novedoso; un grupo que interactúa en forma covalente o no covalente con otras moléculas; una porción fotoenjaulada; una porción fotoisomerizable; biotina; un deirvado de biotina; un análogo de biotina; una porción que incorpora un átomo pesado; un grupo químicamente escindible; un grupo fotoescindible; una cadena lateral alargada; un azúcar enlazada con carbono; un agente redox-activ; un amino tioácido; una porción tóxica; una porción isotópicamente etiquetada; una sonda biofísica; un grupo fosforescente; un grupo quimioluminiscente; un grupo denso en electrones; un grupo magnético; un grupo de intercalado; un cromóforo; un agente de transferencia de energía; un agente biológicamente activo; una etiqueta detectable; una molécula pequeña; o cualquier combinación de los anteriores, o cualquier otro compuesto o sustancia deseable) . La presente invención también incluye conjugados de sustancias que tienen porciones azida o acetileno con derivados de polímero PEG que tienen las correspondientes porciones acetileno o azida. Por ejemplo, un polímero PEG que contiene una porción azida puede acoplarse a una molécula biológicamente activa en una posición en la proteína que contiene un aminoácido no genéticamente codificado que contiene una funcionalidad acetileno. El enlace por el cual el PEG y la molécula biológicamente activa se acoplan, incluye pero no está limitado al producto de cicloadición Huisgen [3+2] . Está bien establecido en la técnica que PEG puede emplearse para modificar las superficies de biomateriales (ver por ejemplo la patente de lo E.U.A. número 6,610,281; Mehvar, R. , J. Pharmaceut . Sci., 3(1):125-136 (2000) que aquí se incorpora por referencia) . La invención también incluye biomateriales que comprenden una superficie que tiene uno o más sitios azida o acetilenos reactivos y uno o más de los polímeros que contienen azida o acetileno de la invención acoplados a la superficie mediante un enlace de cicloadición Huisgen [3+2] . Biomateriales y otras sustancias también pueden acoplarse a los derivados polímero activados con azida o acetileno a través de un enlace diferente a el enlace azida o acetileno tal como a través de un enlace que comprende un ácido carboxílico, amina, alcohol o porción tiol, para dejar la porción azida o acetileno disponible para subsecuentes reacciones. La invención incluye un método para sintetizar los polímeros que contienen azida y acetileno de la invención. En el caso de derivado PEG que contiene azida, la azida puede unirse directamente a un átomo de carbono del polímero. En forma alterna, el derivado PEG que contiene azida puede prepararse al conectar un agente de enlace que tiene la porción azida en un extremo con un polímero activado convencional de manera tal que el polímero resultante tenga la porción azida en su extremo. En el caso del derivado PEG que contiene acetileno, el acetileno puede unirse directamente a un átomo de carbono del polímero. En forma alterna, el derivado PEG que contiene acetileno puede prepararse al conectar un agente de enlace que tiene la porción acetileno en un extremo con un polímero activado convencional de manera tal que el polímero resultante tiene la porción acetileno en su extremo. Más específicamente, en le caso del derivado PEG que contiene azida, un polímero soluble en agua que tiene al menos una porción hidroxilo activa se somete a una reacción para producir un polímero sustituido que tiene una porción más reactiva, tal como un grupo saliente mesilato, tresilato, tosilato o halógeno. La preparación y uso de los derivados PEG que contienen haluros de sulfonil ácido, átomos de halógeno y otros grupos salientes son bien conocidos por la persona con destreza. El polímero sustituido resultante se somete entonces a una reacción para sustituir la porción más reactiva de una porción azida en el extremo del polímero.

De forma alterna, un polímero soluble en agua que tiene al menos una porción electrofílica o nucleofílica activa, se somete a una reacción con un agente de enlace que tiene una azida en un extremo de manera tal que se forme un enlace covalente entre un polímero PEG y el agente de enlace y la porción azida se ubica en el extremo del polímero. Porciones nucleofílicas y electrofílicas, incluyendo aminas, tioles, hidrazidas, hidrazinas, alcoholes, carboxilatos aldehidos, cetona, bioésteres y semejantes son bien conocidos por la persona con destreza . Más específicamente, en el caso del derivado PEG que contiene acetileno, un polímero soluble en agua que tiene cuando menos una porción hidroxilo activa se somete a una reacción para desplazar un halógeno u otro grupo saliente activado de un precursor que contiene una porción acetileno. En forma alterna, un polímero soluble en agua que tiene al menos una porción nucleofílica o electrofílica activa se somete a una reacción con un agente de enlace que tiene un acetileno en un extremo de manera tal que un enlace covalente se forme entre el polímero PEG y el agente de enlace y la porción acetileno se ubica en el extremo del polímero. El uso de porciones halógeno, grupos salientes activados, porciones nucleofílicas y electrofílicas en el contexto de síntesis orgánica y la preparación y uso derivados PEG está bien establecido para los practicantes en la especialidad. La invención también proporciona un método para la modificación selectiva de proteínas para agregar otras sustancias a la proteína modificada, incluyendo pero no limitadas a polímeros solubles en agua tales como PEG y derivados PEG que contienen una porción azida o acetileno. Los derivados PEG que contienen azida y acetileno pueden emplearse para modificar las propiedades de superficies y moléculas en donde la biocompatibilidad, estabilidad, solubilidad y falta de inmunogenicidad son importantes, mientras que al mismo tiempo proporcionan medios más selectivos para conectar los deirvados PEG a proteínas previamente conocidas en la técnica. II. Polipéptidos de enlace de antígeno Hay una amplia variedad de ABP's. Los ABPs por sí mismos son específicos para una muy amplia variedad de antígenos. También hay una gran cantidad de una muy amplia variedad de fragmentos de ABP que son específicos de antígenos. ABP por lo tanto se pretende que incluyan cualquier polipéptido que demuestre una habilidad para ligar específicamente a un antígeno o molécula diana. Cualquier anticuerpo o fragmento de anticuerpo conocido es una ABP. Los ABP's de la invención pueden comprender una región Fe o región tipo Fe. El dominio Fe proporciona el enlace a funciones efectoras tales como células fagocíticas o de complemento. La porción Fe de una inmunoglobulina tiene prolongada vida media en plasma, mientras que Fab es de corta duración (Capón, et al. (1989), Nature, 337:525-531). Cuando se construyen en conjunto con una proteína terapéutica, un dominio Fe puede proporcionar una más prolongada vida media o incorporar estas funciones como enlace de receptor Fe, enlace de proteína A, fijación de complemento y probablemente incluso transferencia placentaria. Por ejemplo, la región Fe de un anticuerpo IgGl se ha fusionado al extremo N-terminal de CD30-L, una molécula que liga receptores CD30 expresados en células de tumor de la enfermedad de Hodgkin, células de linfoma anaplástico, células de leucemia de célula T y otros tipos de células malignas (patenete de los E.U.A. número 5,480,981). IL-10, un agente antiinflamatorio y antirrechazo se ha fusionado a Fc^2a murino a fin de incrementar la corta vida media en circulación de citosina. Zheng, X. et al. (1995), The Journal of Immunology, 154: 5590-5600. Estudios también han evaluado el uso del receptor de factor en necrosis de tumor enlazado con la proteína Fe de IgGl humano para tratar pacientes con choque séptico. Fisher, C. et al., N. Engl .

J. Med., 334: 1697-1702 (1996); Van Zee, K. et al., The Journal of Immunology, 156: 2221-2230 (1996) y artritis reumatoide (Moreland, et al. (1997), N. Engl . J. Med., 337(3): 141-147. Fe también se ha fusionado con un receptor CD4 para producir una proteína terapéutica para el tratamiento de SIDA (AIDS) (Capón et al. (1989), Nature, 337:525- 531) . Además, el extremo N de interleucina 2 también se ha fusionado a la porción Fe de Igl o IgG3 para superar la corta vida media de interleucina 2 y su toxicidad sistémica (Harvill et al. (1995), Immunotechnology, 1: 95-105). Es bien conocido que las regiones Fe de anticuerpos están constituidas por segmentos de polipéptidos monoméricos que pueden enlazarse en formas bioméricas o multiméricas por enlaces disulfuro o por asociación no covalente. El número de enlaces disulfuro intermoleculares entre subunidades monoméricas de molécula Fe nativas está en el intervalo de 1 a 4 dependiendo de la clase (por ejemplo, IgG, IgA, IgE) o subclase (por ejemplo, IgGl, IgG2 , IgG3 , IgAl , IgGA2) de anticuerpo involucrado. El término "Fe" como se emplea aquí, es genérico para las formas monomérica, dimérica y multimérica de moléculas Fe. Habrá de notarse que monómeros FC dimerizarán espontáneamente cuando están presentes residuos Cys apropiados a menos de que estén presentes condiciones particulares que eviten dimerización a través de enlace de disulfuro. Incluso si los residuos Cys que normalmente forman enlaces disulfuro en el dímero Fe se retiran o reemplazan por otros residuos, las cadenas monoméricas en general dimerizarán a través de interacciones no covalentes. El término "Fe" aquí se pretende que signifique cualquiera de estas formas: el monómero nativo, el dímero nativo (enlazado a enlace disulfuro) dímeros modificados (disulfuro y/o enlazado no covalente) y monómeros modificados (es decir derivados) . Variantes análogos o derivados de la porción Fe pueden construirse por ejemplo al hacer diversas sustituciones de residuos o secuencias incluyendo aminoácidos no naturalmente codificados. Polipéptidos variantes (o análogos) incluyen variantes de inserción, en donde uno o más residuos aminoácidos suplementan una secuencia de aminoácido Fe. Inserciones pueden ubicarse en cualquiera o ambos extremos de la proteína, o pueden disponerse dentro de las regiones internas de la secuencia de aminoácidos Fe. Variantes de inserción con residuos adicionales en cualquiera o ambos extremos pueden incluir por ejemplo proteínas de fusión y proteínas que incluyen etiquetas de aminoácidos. Por ejemplo, la molécula Fe opcionalmente puede contener un Met N-terminal, especialmente cuando la molécula se expresa en forma recombinante en una célula bacteriana tal como E. coli . En variantes de eliminación Fe, uno o más residuos aminoácido en un polipéptido Fe se retiran. Eliminaciones pueden efectuarse en uno o ambos extremos del polipéptido Fe o con remoción de uno o más residuos dentro de la secuencia de aminoácidos Fe. Variantes de eliminación, por lo tanto incluyen todos los fragmentos de una secuencia de polipéptido Fe. En variantes de sustitución Fe, uno o más residuos aminoácido de un polipéptido Fe se retiran y reemplazan con residuos alternos. En un aspecto, las sustituciones son conservadoras en naturaleza, sin embargo, la invención abarca sustituciones que también son no conservadoras. Por ejemplo, residuos cisteína pueden eliminarse o remplazarse con otros aminoácidos para evitar formación de algunos o todos los entrelazamientos disulfuro de las secuencias Fe. Una proteína puede tener uno o más residuos cisteína y uno puede retirar cada uno de estos residuos cisteína o sustituir uno o más de estos residuos cisteína con otros aminoácidos tales como Ala o Ser, o un aminoácido no naturalmente codificado. Como otro ejemplo, también pueden realizarse modificaciones para introducir sustituciones de aminoácido para (1) ablación del sitio de enlace receptor Fe; (2) ablación del sitio de enlace (Clq) de complemento; y/o (3) ablación de el sitio de cito toxicidad mediada por células dependientes de anticuerpo (ADCC) . Estos se conocen en la técnica y cualesquiera sustituciones conocidas están dentro del alcance de Fe como aquí se emplea. Por ejemplo ver Molecular Immunology, Vol. 29, No. 5, 633-639 (1992) respecto a sitios ADCC en IgGl . Igualmente, uno o más residuos tirosina puede ser reemplazado por residuos fenilananina por igual, además, otras inserciones variantes de aminoácido, eliminaciones (por ejemplo de 1 a 25 aminoácidos) y/o sustituciones también se contemplan y están dentro del alcance de la presente invención. Sustituciones de aminoácido conservadoras en general se preferirán. Además, las alteraciones pueden estar en la forma de aminoácidos alterados, tales como péptido miméticos o B-aminoácidos . Secuencias Fe también pueden derivatizarse, es decir contener modificaciones diferentes a inserción, eliminación o sustitución de residuos aminoácidos. De preferencia, las modificaciones son covalentes en naturaleza e incluyen por ejemplo unión química con polímeros lípidos u otras porciones orgánicas y porciones inorgánicas. Derivados de la invención pueden prepararse para aumentar la vida media de circulación, o pueden diseñarse para mejorar la capacidad para hacer blanco para el polipéptido a células, tejidos u órganos deseados. También es posible el utilizar el dominio de enlace de receptor de recuperación de la molécula Fe intacta como la parte Fe de los compuestos de la invención, tal como se describe en WO 96/32478, con título "Altered Polypeptides with Increased Half-Life". Miembros adicionales de la clase de moléculas designados como Fe aquí son aquellos que se describen en WO 97/34631, con título "Immunoglobulin- Like Domains with Increased Half- Lives". Ambas de las solicitudes PCT publicadas citadas en este párrafo aquí se incorporan por referencia. ABPs adicionales probablemente se descubrirán en el futuro. Nuevos ABPs pueden identificarse a través de análisis de estructura secundaria y terciaria auxiliado por computadora de las secuencias de proteína pronosticadas y por técnicas de selección diseñadas para identificar moléculas que ligan a una diana particular. Estos ABPs descubiertos posteriormente también se incluyen dentro de esta invención. De esta manera, la descripción de ABPs se proporciona para propósitos ilustrativos y a manera de ejemplo solamente y no como limitación en el alcance de los métodos composiciones estrategias y técnicas aquí descritas. Además, referencia a ABPs en esta solicitud se pretende utilizar el término genérico como un ejemplo de cualqµier ABP. De esta manera, se entiende que las modificaciones y químicas aquí descritas con referencia a proteína o polipéptido de enlace antígeno específico, pueden igualmente aplicarse a cualquier polipéptido de enlace antígeno, incluyendo aquellos citados aquí específicamente . JJJ. Métodos de ácido nucleico recombinantes generales para utilizar con la invención En numerosas modalidades de la presente invención, ácidos nucleicos que codifican ABP de interés se aislarán, clonarán y a menudo alterarán utilizando métodos recombinantes. Estas modalidades se emplean, incluyendo pero no limitadas a, para expresión de proteínas o durante la generación de variantes derivados, casetes de expresión u otras secuencias derivadas de un polipéptido de enlace antígeno. En algunas modalidades, las secuencias que codifican los polipéptidos de la invención están enlazados operativamente a un promotor heterólogo. Una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de enlace antígeno, comprende un aminoácido no naturalmente codificado, puede sintetizarse en base a la secuencia de aminoácido del polipéptido padre y después cambiar la secuencia de nucleótidos para efectuar introducción (es decir incorporación o sustitución) o remoción (es decir eliminación o sustitución) de el o los residuos aminoácidos relevantes. La secuencia de nucleótidos puede modificarse convenientemente por muta génesis dirigida por sitio de acuerdo con métodos convencionales. En forma alterna, la secuencia de nucleótidos puede prepararse por síntesis química, incluyendo pero no limitada a, al utilizar un sintetizador oligonucleótido, en donde los oligonucleótidos se designan con base en la secuencia de aminoácidos del polipéptido deseado, y de preferencia seleccionar aquellos codones que se favorecen en la célula anfitriona en donde el polipéptido recombinante será producido. Por ejemplo, varios pequeños oligonucleótidos que codifican porciones del polipéptido deseado pueden sintetizarse y ensamblarse por PCR, ligación o reacción de cadena-ligación. Ver Barany, et al, Proc. Nati. Acad. Sci. 88: 189-193 (1991); patente de los EUA número 6,521,427, que aquí se incorpora por referencia. Esta invención utiliza técnicas rutinarias en el campo de genética recombinante. Textos básicos que describen los métodos generales de uso en esta invención incluyen Sambrook et al, Molecular Cloning, A Laboratory Manual (3rd ed. 2001) ; Kriegler, Gene Transfer y Expression: A Laboratory Manual (1990) ; y Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al, eds., 1994) ) . Textos generales que describen técnicas biológicas moleculares incluyen Berger y Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzvmology volume 152 Academic Press, Inc., San Diego, CA (Berger); Sambrook et al . , Molecular Cloninfi - A Laboratory Manual (2nd Ed.), Vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1989 ("Sambrook") y Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel et al., eds., Current Protocols, una empresa conjunta entre Greene Publishing Associates, Inc. y John Wiley & Sons, Inc., (suplementada hasta 1999) ("Ausubel")). Estos textos describen muta génesis, el uso de vectores, promotores y muchos otros tópicos relevantes relacionados con, incluyendo pero no limitados a, la generación de genes que incluyen codones selectores para producción de proteínas que incluyen aminoácidos no naturales, tRNAs ortogonales, sintetasas ortogonales y sus pares. Diversos tipos de muta génesis se emplean en la invención para una variedad de propósitos, incluyendo pero no limitado a producir bibliotecas de tRNAs, para producir bibliotecas de sintetasas, para producir codones selectores, para insertar codones selectores que codifican aminoácidos no naturales en una proteína o polipéptido de interés. Incluyen pero no están limitados a muta génesis punto aleatoria de sitio, la recombinación homologa, entremezclado de DNA u otros métodos de muta génesis recursiva, construcción quimérica, muta génesis utilizando plantillas que contienen uracilo, muta génesis dirigida por oligonucleótido, muta génesis de DNA modificado con fosforotioato, muta génesis utilizando DNA dúplex con espacios o semejantes o cualquier combinación de las mismas. Métodos convenientes adicionales incluyen reparación de discrepancia punto, muta génesis que utiliza cepas anfitrionas deficientes de reparación, la restricción-selección y restricción-purificación, muta génesis de eliminación, muta génesis por síntesis de genes totales, reparación de ruptura de doble hebra, y semejantes. Muta génesis incluyendo pero no limitada a, que involucra construcciones de quiméricas, también se incluye en la presente invención. En una modalidad, la muta génesis puede guiarse por información conocida de la molécula de origen natural o molécula de origen natural alterada o mutada, incluyendo pero no limitado a secuencia, comparaciones de secuencia, propiedades físicas, estructura secundaria, terciaria o cuaternaria, estructura de cristal o semejantes. Los textos y ejemplos que aquí se encuentran describen estos procedimientos. Información adicional se encuentra en las siguientes publicaciones y las referencia ahí citadas: Ling et al., Approaches to DNA mutagenesis: an overview, Anal Biochem. 254(2): 157-178 (1997); Dale et al., Oligonucleotide-directed random mutagenesis using the phosphorothioate method, Methods Mol. Biol. 57:369-374 (1996); Smith, In vitro mutagenesis, Ann. Rev. Genet. 19:423-462 (1985); Botstein & Shortle, Strategies y applications of in vitro mutagenesis, Science 229:1193-1201 (1985); Cárter, Site-directed mutagenesis, Biochem. J. 237:1-7 (1986); Kunkel, The efficiency of oligonucleotide directed mutagenesis, in Nucleic Acids & Molecular Biology (Eckstein, F. y Lilley, D.M.J, eds., Springer Verlag, Berlín) (1987); Kunkel, Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 82:488-492 (1985); Kunkel et al., Rapid y efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection, Methods in EnzyMol . 154, 367-382 (1987); Bass et al., Mutant Trp repressors with new DNA-binding specificities, Science 242:240-245 (1988); Methods in EnzyMol. 100: 468-500 (1983); Methods in Enzymol . 154: 329-350 (1987); Zoller & Smith, Oligonucleotide-directed mutagenesis using M13-derived vectors: an efficient and general procedure for the production of point mutations in any DNA fragment, Nucleic Acids Res. 10:6487-6500 (1982); Zoller & Smith, Oligonucleotide-directed mutagenesis of DNA fragments cloned into M13 vectors, Methods in Enzy ol. 100:468-500 (1983); Zoller & Smith, Oligonucleotide-directed mutagenesis: a simple method using two oligonucleotide primers and a single-stranded DNA témplate, Methods in Enzymol. 154:329- 350 (1987); Taylor et al., The use of phosphorothioate-modified DNA in restriction enzyme reactions to prepare nicked DNA, Nucí. Acids Res. 13: 8749-8764 (1985); Taylor et al., The rapid generation of oligonucleotide-directed mutations at high frequency using phosphorothioate-modified DNA, Nucí. Acids Res. 13: 8765-8787 (1985); Nakamaye & Eckstein, Inhibition of restriction endonuclease Nci I cleavage by phosphorothioate groups and its application to oligonucleotide-directed mutagenesis, Nucí. Acids Res. 14: 9679-9698 (1986); Sayers et al . , 5 '-3 ' Exonucleases in phosphorothioate-based oligonucleotide-directed mutagenesis, Nucí. Acids Res. 16:791-802 (1988); Sayers et al., Strand specific cleavage of phosphor othioate-containing DNA by reaction with restriction endonucleases in the presence of ethidium bromide, (1988) Nucí. Acids Res. 16: 803-814; Kramer et al., The gapped dúplex DNA approach to oligonucleotide-directed mutation construction, Nucí. 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Acids Res. 13: 3305-3316 (1985); Mandecki, Oligonucleotide-directed double-strand break repair in plasmids of Escherichia coli: a method for site-specific mutagenesis, Proc. Nati. Acad. Sci. USA. 83:7177-7181 (1986) ; Arnold, Protein engineering for unusual environments, Current Opinión in Biotechnology 4:450-455 (1993); Sieber, et al., Nature Biotechnology, 19:456-460 (2001); W. P. C. Stemmer, Nature 370, 389-91 (1994); and, I. A. Lorimer, I. Pastan, Nucleic Acids Res. 23, 3067-8 (1995) . Detalles adicionales de muchos de los métodos anteriores pueden encontrarse en Methods in Enzymology Volume 154, que también describe controles útiles para solución de problemas con diversos métodos de muta génesis . La invención también se refiere a células anfitrionas eucarióticas, células anfitrionas no eucarióticas y organismos para la incorporación in vivo de un aminoácido no natural mediante pares tRNA/RS ortogonales. Células anfitrionas se someten a ingeniería genética (incluyendo pero no limitadas a transformadas, transducidas o trasnfectadas) con los polinucleótidos de la invención o construcciones que incluyen un polinucleótido de la invención, incluyendo pero no limitado a, un vector de la invención, que puede ser por ejemplo un vector de clonación o un vector de expresión. El vector puede estar por ejemplo en la forma de un plásmido, una bacteria, un virus, un polinucleótido desnudo o un polinucleótido conjugado. Los vectores se introducen en células y/o microorganismos por métodos estándar incluyendo electroporación (From et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 82, 5824 (1985), infección por vectores virales, penetración balística de alta velocidad por pequeñas partículas con el ácido nucleico ya sea dentro de la matriz desde pequeñas perlas o partículas, o en la superficie (Klein et al., Nature 327, 70-73 (1987) ) . Las células anfitrionas de ingeniería pueden cultivarse en medio nutriente convencional modificado según sea apropiado para estas actividades, tal como por ejemplo etapas de supervisión, promotores de activación o transformantes de selección. Estas células pueden opcionalmente cultivarse en organismos transgénicos . Otras referencias útiles, incluyendo pero no limitadas para aislamiento y cultivo celular (por ejemplo para subsecuente aislamiento de ácido nucleico) incluye Freshney (1994) Culture of Animal Cells, a Manual of Basic Technique, tercera edición Wiley- Liss, New York y las referencias ahí citadas; Payne et al. (1992) Plant Cell y Tissue Culture in Liquid Systems John Wiley & Sons, Inc. New York, NY; Ga borg y Phillips (eds.) (1995) Plant Cell, Tissue y Organ Culture; Fundamental Methods Springer Lab Manual, Springer-Verlag (Berlín Heidelberg New York) y Atlas y Parks (eds.) The Handbook of Microbiological Media (1993) CRC Press, Boca Ratón, FL. Varios métodos bien conocidos para introducir ácidos nucleicos diana en células están disponibles, a cualquiera de los cuales puede emplearse en la invención. Estos incluyen: fusión de las células de recipiente con protoplastos bacterianos que contienen el DNA, electroporación, bombardeo de proyectiles e infección con vectores virales (discutido más a continuación), etc. Pueden emplearse células bacterianas para amplificar el número de plásmidos que contienen construcciones de DNA de esta invención. Las bacterias se desarrollan a fase log y los plásmidos dentro de las bacterias pueden aislarse por una variedad de métodos conocidos en la especialidad (ver por ejemplo Sambrook) . Además, una plétora de equipos están comercialmente disponibles para la purificación de plásmidos de bacterias (ver por ejemplo EasyPrepR, FlexiPrepMR, ambos de Farmacia Biotech; StrataCleanMR de Stratagene; y, QIAprepMR de Qiagen) . Los plásmidos aislados y purificados después se manipulan adicionalmente para producir otros plásmidos, empleados para tranfectar células o incorporados en vectores relacionados para infectar organismos. Vectores típicos contienen terminadores de transcripción y traducción, secuencias de inicio de transcripción y traducción, y promotores útiles para regular la expresión del ácido nucleico diana particular. Los vectores opcionalmente comprenden casetes de expresión genérica que contienen cuando menos una secuencia terminadora independiente, secuencias que permiten replicación del cásete en eucariotas, o procariotas, o ambos (incluyendo pero no limitado a vectores lanzadera) y marcadores de selección tanto para sistemas procarióticos como eucarióticos. Son convenientes vectores para replicación e integración en procariotas, eucariotas o de preferencia ambos. Ver, Giliman & Smith, Gene 8:81 (1979); Roberts, et al., Nature, 328:731 (1987); Schneider, B., et al, Protein Expr. Purif. 6435:10 (1995); Ausubel, Sambrook, Berger {all supra) . Un catálogo de bacterias y bacteriófagos útil para clonar se proporciona por ejemplo mediante la ATCC, e.g., The ATCC Catalogue of Bacteria and Bacteriophage (1992) Gherna et al. (eds) publicado por la ATCC. Procedimientos básicos adicionales para secuenciado, clonación y otros aspectos de biología molecular y consideraciones teóricas subyacentes también se encuentran en Watson et al. (1992) Recombinant DNA Second Edition Scientific American Books, NY. Además, esencialmente cualquier ácido nucleico (y virtualmente cualquier ácido nucleico etiquetado, ya sea estándar o no estándar) puede ordenarse a la medida o estándar de cualquiera de una variedad de fuentes comerciales tales como Midland Certified Reagent Company (Midland, TX disponible en la red mundial en mcrc.com), The Great American Gene Company (Ramona, CA disponible en la red mundial en genco.com), ExpressGen Inc. (Chicago, IL disponible en la red mundial en expressgen.com), Operon Technologies Inc. (Alameda, CA) y muchos otros. CODONES SELECTORES [246] Codones selectores de la invención expanden el marco de codones genético de la maquinaria biosintética de proteínas. Por ejemplo, un codón perfecto selector incluye, pero no está limitado a, un codón de tres bases único, un codón sin sentido, tal como codón de parada, incluyendo pero no limitado a un codón ámbar (UAG) , o un codón ópalo (UGA) , un codón no natural, un codón de 4 o más bases, un codón raro o semejantes. Es fácilmente aparente para aquellos con destreza ordinaria en la especialidad que hay un amplio intervalo o un amplio rango en el número de codones selectores que pueden introducirse en un gen deseado, incluyendo pero no limitados a uno o más, dos o más, más de tres, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más en un solo polinucleótido que codifica al menos una porción del ABP. En una modalidad, los métodos involucran el uso de un codón selector que es un codón de parada para la incorporación de amino ácidos no naturales in vivo en una célula eucariótica. Por ejemplo, un O-tRNA se produce que reconoce el codón de parada, incluyendo pero no limitado a, UAG, y se aminoacila por un 0-RS con un amino ácido no natural deseado. Este O-tRNA no se reconoce por las aminoacil-tRNA sintetasas del anfitrión de origen natural. Mutagénesis dirigida por sitio convencional puede emplearse para introducir el codón de parada, incluyendo pero no limitado a, TAG, en el sitio de interés en un polipéptido de interés. Ver por ejemplo, Sayers, J.R., y colaboradores, (1988), 5', 3' Exonuclease in phosphorothioate-based oligonucleotide-directed mutagenesis. Nucleic Acids Res, 791-802. Cuando el ORS, O-tRNA y el ácido nucleico que codifica el polipéptido de interés se combinan in vivo, el amino ácido no natural se incorpora en respuesta al codón UAG para dar un polipéptido que contiene el amino ácido no natural en la posición especificada. La incorporación de amino ácidos no naturales in vivo puede realizarse sin perturbación significante de la célula anfitrión eucariótica. Por ejemplo, debido a que la eficiencia de supresión para el codón UAG depende de la competencia entre el O-tRNA, incluyendo pero no limitado al tRNA supresor ámbar, y un factor de liberación eucariótico (incluyendo pero no limitado a, eRF) (que liga a un codón de parada e inicia liberación del péptido de crecimiento del ribosoma) , la eficiencia de supresión puede modularse por, incluyendo pero no limitado, a incrementar el nivel de expresión de O-tRNA, y/o el tRNA supresor. Codones selectores también comprenden codones extendidos, incluyendo pero no limitados a, cuatro o más codones base, tales como cuatro, cinco, seis o más codones base. Ejemplos de cuatro codones base incluyen, pero no están limitados a AGGA, CUAG, UAGA, CCCU y semejantes. Ejemplos de cinco codones base incluyen pero no están limitados a AGGAC, CCCCU, CCCUC, CUAGA, CUACU, UAGGC y semejantes. Una característica de la invención incluye el utilizar codones extendidos con base en supresión de cambio del marco de lectura. Cuatro o más codones base pueden insertar, incluyendo pero limitado a, uno o múltiples amino ácidos no naturales en la misma proteína. Por ejemplo, en la presencia de 0-tRNAs mutado, incluyendo pero no limitado a un tRNAs supresor de cambio de marco de lectura, con bucles anticodones, por ejemplo, con al menos bucles anticodones de 8-10 nt los cuatro o más codones base se leen como un solo amino ácido. En otras modalidades, los bucles anti-codón pueden descodificar, incluyendo pero no limitados a, al menos un codón de cuatro bases, al menos un codón de cinco bases o al menos un codón de seis bases o más. Ya que hay 256 posibles codones de cuatro bases, múltiples amino ácidos no naturales pueden ser codificados en la misma célula utilizando un codón de cuatro o más bases. Ver, Anderson y colaboradores, (2002) Exploring the Limits of Codon y Anticodon Size, Chemistry y Biology, 9:237-244; Magliery, (2001) Expanding the Genetic Code : Selection of Efficient Suppressors of Four-base Codons and Identification of "Shifty" Four-base Codons with a Library Approach in Escherichia coli, J. Mol. Biol. 307: 755-769. Por ejemplo, codones de cuatro bases se han empleado para incorporar amino ácidos no naturales en proteínas utilizando métodos biosintéticos in vitro. Ver, por ejemplo, Ma et al., (1993) Biochemistry, 32:7939; y Hohsaka y colaboradores, (1999) J. Am. Chem.

Soc. 121 :34. CGGG y AGGU se emplearon para incorporar simultáneamente 2-naftilalanina y un derivado NBD de lisina en estreptavidina in vitro con dos tRNAs supresores de cambio de marco de lectura químicamente acilados. Ver, por ejemplo, Hohsaka y colaboradores, (1999) J. Am. Chem. Soc. 121:12194. En un estudio in vivo, Moore y colaboradores, examinaron la capacidad de derivados tRNALeu con anticodones NCUA para supresores UAGN (N puede ser U, A, G, o C) , y encontraron que el cuadruplete UAGA puede ser descodificado por un UCUA con un anticodón con una eficiencia de 13 a 26 por ciento con poca descodificación en el marco 0 o -1. Ver, Moore y colaboradores, (2000) J. Mol. Biol. 298:195. En una modalidad, en una modalidad, codones extendidos con base en codones raros o codones sin sentido pueden emplearse en la presente invención que puede reducir lectura de sentido equivocado falso o alterado y supresión de cambio de marco de lectura en otros sitios indeseados. Para un sistema determinado, un codón selector también puede incluir uno de los codones de tres bases naturales, en donde el sistema endógeno no utiliza (o raramente utiliza) el codón base natural. Por ejemplo, esto incluye un sistema que carece de un tRNA que reconoce el codón de tres bases natural y/o un sistema en donde el codón de tres bases es un codón raro.

Codones selectores opcionalmente incluyen pares base no naturales. Estos pares base no naturales además se expanden en el alfabeto genético existente. Un par base extra aumenta el número de codones triples de 64 a 125. Propiedades de pares de tercer base incluyen apareo de base estable selectivo, incorporación enzimática eficiente en DNA con alta fidelidad por una polimerasa, y extensión de cebador continúo eficiente después de síntesis del par base no natural naciente. Descripciones de los pares base no naturales que pueden adaptarse para métodos y composiciones incluyen por ejemplo, Hirao, y colaboradores, (2002) An unnatural base pair for incorporating amino acid analogues into protein, Nature Biotechnology, 20:177-182. Otras publicaciones relevantes se citan a continuación. Para uso in vivo, el nucleosido no natural es permeable a membrana y se fosforila para formar el trifosfato correspondiente. Además, la información genética incrementada es estable y no es destruida por enzimas celulares. Esfuerzos previos por Benner y otros aprovecharon patrones de enlaces de hidrógeno que son diferentes de aquellos en pares canónicos Watson-Crick, el ejemplo más notable de los cuales es el par iso-C:-iso-G pair. Ver por ejemplo, Switzer y colaboradores, (1989) J. Am. Chem. Soc. 111:8322; y Piccirilli y colaboradores, (1990) Nature, 343:33; Kool , (2000) Curr. Opin. Chem. Biol., 4:602. Estas bases en general mal aparean en cierto grado con bases naturales y no pueden replicarse enzimáticamente. Kool y colaboradores demostraron que interacciones de empaque hidrofóbico entre bases pueden reemplazar uniones de hidrógeno para dirigir la formación de par base. Ver Kool, (2000) Curr. Opin. Chem. Biol., 4:602; y Guckian y Kool, (1998) Angew. Chem. Int. Ed. Engl . 36, 2825. En un esfuerzo por dsarrollar un par base no natural que satisfaga todos los requerimientos anteriores, Schultz, Romesberg y colaboradores han sintetizado y estudiado esquemáticamente una serie de bases hidrofóbicas no naturales. Un auto-par PICS:PICS se encuentra que es más estable que los pares base naturales, y pueden incorporarse eficientemente en DNA por fragmento Klenow de DNA polimerasa I de Escherichia coli (KF) . Ver por ejemplo, McMinn y colaboradores , (1999) J. Am. Chem. Soc, 121:11586; y Ogawa y colaboradores, (2000) J. Am. Chem. Soc, 122:3274. Un auto-par 3MN:3MN puede sintetizarse por KF con eficiencia y selectividad suficiente para función biológica. Ver por ejemplo Ogawa y colaboradores, (2000) Jl Am. Chem. Soc, 122:8803. Sin embargo, ambas bases actúan como un terminador de cadena para mayor replicación. Una DNA polimerasa mutante se ha desarrollado recientemente que puede utilizarse para replicar el auto par PICS. Además, un auto-par 7AI puede replicarse. Ver por ejemplo, Tae y colaboradores, (2001) J. Am. Chem. Soc, 123:7439. Un par metalobase novedoso, Dipic:Py, también se ha desarrollado que forma un par estable al ligar Cu (II). Ver, Meggers y colaboradores, (2000) J. Am. Chem. Soc, 122:10714. Debido a que codones extendidos y codones no naturales son intrínsecamente ortogonales a codones naturales, los métodos de la invención pueden aprovechar esta propiedad para generar ortogonales tRNAs para ellos. Un sistema de derivación de traducción también puede emplearse para incorporar un amino ácido no natural en un polipéptido deseado. En un sistema de derivación de traducción, una gran secuencia se incorpora en un gen, pero no se traduce en proteínas. La secuencia contiene una estructura que sirve como una guía para inducir que el ribosoma salte sobre la secuencia y reanude la traducción corriente debajo de la inserción. En ciertas modalidades, la proteína polipéptido de interés (o su porción) en los métodos y/o composiciones de la invención se codifica por un ácido nucleico. Típicamente, el ácido nucleico comprende al menos un codón selector, al menos dos codones selectores, al menos tres codones selectores, al menos cuatro codones selectores, al menos cinco codones selectores y al menos seis codones selectores, al menos siete codones selectores, al menos ocho codones selectores, al menos nueve codones selectores, diez o más codones selectores. Genes que codifican proteínas o polipéptidos de interés pueden mutagenizarse utilizando métodos bien conocidos por una persona con destreza en la técnica y descritos aquí que incluyen por ejemplo uno o más codones selectores para incorporación en un amino ácido no natural. Por ejemplo, un ácido nucleico para una proteína de interés se mutageniza para incluir uno o más codones selectores, proporcionando la incorporación de uno o más amino ácidos no naturales. La invención incluye cualquier variante semejante, incluyendo pero no limitados a, mutante, versiones de cualquier proteína, por ejemplo, incluyendo al menos un amino ácido no natural. Similarmente, la invención también incluye ácidos nucleicos correspondientes, es decir cualquier ácido nucleico con uno o más codones selectores que codifican uno o más amino ácidos no naturales. Moléculas de ácido nucleico que codifican una proteína de interés tal como ABP pueden mutarse fácilmente para introducir una cisteina en cualquier posición deseada del polipéptido. Cisternas se emplea ampliamente para introducir moléculas reactivas, polímeros solubles en agua, proteínas o una amplia variedad de otras moléculas en una proteína de interés. Métodos adecuados para incorporación de cisteina en una posición deseada del polipéptido de enlace de antígenos son bien conocidos en la técnica tales como aquellos descritos en la Patente de los E.U.A. No. 6,608,183, que se incorpora aquí por referencia y técnicas de mutagénesis estándar. IV. Amino ácidos no naturalmente codificados Una muy amplia variedad de amino ácidos no naturales son adecuados para utilizar en la presente invención. Cualquier cantidad de amino ácidos no naturalmente codificados puede introducirse en ABP. En general, los amino ácidos no naturalmente codificados introducidos son substancialmente inertes químicamente hacia los 20 amino ácidos genéticamente codificados comunes (es decir, alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteina, glutamina, ácido glutámico, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptofano, tirosina, y valina) . En algunas modalidades, Los amino ácidos no naturalmente codificados incluyen grupos funcionales de cadena lateral que reaccionan eficiente y selectivamente con grupos funcionales no encontrados en los 20 amino ácidos comunes (incluyendo pero no limitados a, a grupos azido, cetona, aldehido y aminooxi) para formar conjugados estables. Por ejemplo, polipéptido de enlace de antígeno que incluye un amino ácido no-naturalmente codificado que contiene un grupo funcional azido, puede reaccionarse con un polímero (incluyendo pero no limitado a, poli (etilen glicol) o, en forma alterna un segundo polipéptido que contiene una porción alquilo para formar un conjugado estable que resulta de la reacción selectiva de los grupos funcionales azida y alquilo para formar un producto de cicloadición Huisgen [3+2] . La estructura genérica de un alfa-amino ácido se ilustra como sigue (Formula I) : Un amino ácido no-naturalmente codificado típicamente es cualquier estructura que iene la formula anteriormente citada en donde el grupo R es cualquier substituyente diferente al empleado en los veinte amino ácidos no naturales, y puede ser adecuado para utilizar en la presente invención. Debido a que los amino ácidos no naturalmente codificados de la invención típicamente difieren de los amino ácidos naturales solo en la estructura de la cadena lateral, los amino ácidos no naturalmente codificados forman enlaces amidas con otros amino ácidos, incluyendo pero no limitados a, natural o no-naturalmente codificados, en la misma manera en la que se forman en polipéptidos de origen natural. Sin embargo, los amino ácidos no naturalmente codificados tienen grupos de cadena lateral que los distinguen de los amino ácidos naturales. Por ejemplo, R comprende opcionalmente un grupo alquil-, aril-, acil-, ceto-, azido- , hidroxil-, hidrazina, ciano-, halo-, hidrazida, alquenilo, alquinilo, éter, tiol, seleno-, sulfonil-, borato, boronato, fosfo, fosfono, fosfino, heterocíclico, enona, inlina, aldehido, éster, tioácido, hidroxilamina, amino, o semejantes o cualquier combinación de los mismos. Otros amino ácidos que no son de origen natural de interés que pueden ser convenientes para utilizar en la presente invención incluyen pero no están limitados a, amino ácidos que comprenden un entrelazador fotoactivable, amino ácidos etiquetados por espin, amino ácidos fluorescentes, amino ácidos de enlace de metal, amino ácidos que contienen metal, amino ácidos radioactivos, amino ácidos con grupos funcionales novedosos, amino ácidos que interactúan en forma covalente o no covalente con otras moléculas, amino ácidos foto enjaulados y/o fotoisomerizables, amino ácidos que comprenden biotina o un análogo de biotina, amino ácidos glicosilados tales como serina substituida con azúcar, otros amino ácidos modificados con carbohidrato, amino ácidos que contienen ceto, amino ácidos que comprenden polietilen glicol o poliéter, amino ácidos substituidos con átomos pesados, amino ácidos I químicamente escindibles y/o foto-escindibles, amino ácidos con cadenas laterales alargadas en comparación con I amino ácidos naturales, incluyendo pero no limitados a poliéteres o hidrocarburos de cadena larga, incluyendo pero no limitados a mayor que aproximadamente 5 o mayor que aproximadamente 10 átomos de carbono, amino ácidos que contienen azúcar enlazada a carbono, amino ácidos I redox activos, amino tioácidos que contienen amino ácidos, y amino ácidos que comprenden una o más porciones i tóxicas. ii Aminoácidos no naturalmente codificados i ejemplares que pueden ser adecuados para utilizar en; la i presente invención y que son útiles para reacciones ¡con polímeros solubles en agua incluyen pero no están I limitados a aquellos con grupos carbonilo aminodxi , hidrazina, hidrazida, semicarbazida, azida y alquino reactivos. En algunas modalidades, aminoácidos , no naturalmente codificados comprenden una porción sacáridb. Ejemplos de estos aminoácidos incluyen N-acetil-L-glucosaminil-L-serina, N-acetil-L-galactosaminil-L-serina, iV-acetil-L-glucosaminil-L- treonina, N-acetil-L-glucosaminil-L-asparagina y O-mannosaminil -L-serina . Ejemplos de estos aminoácidos también incluyen ejemplos en donde el enlace N u O de origen natural entre ¡el aminoácido y el sacárido se reemplaza por un enlace covalente que comúnmente no se encuentra en la naturaleza - incluyendo pero no limitado a un alqueno, una oxima, ¡un tioéter, una amida y semejantes. Ejemplos de estos aminoácidos también incluyen sacáridos que no ¡se I encuentran comúnmente en proteínas de origen natural tales como 2 -deoxi-glucosa, 2-deoxigalactosa , y semejantes. I Muchos de los aminoácidos no naturalmenite I codificados que se proporcionan aquí están comercialmerite i disponibles, por ejemplo de Sigma- Aldrich (St. Louis, MO, USA), Novabiochem (una división de EMD Biosciences, Darmstadt, Alemania) , o Peptech (Burlington, MA, USA ¡) .

Aquellos que no están comercialmente disponibles i se i sintetizan opcionalmente como aquí se dispone I o utilizando métodos estándar conocidos por aquellos con i destreza en la técnica. Para técnicas de síntestis orgánica, ver por ejemplo Organic Chemistry por Fessendon y Fessendon, (1982, segunda edición, Willard Grant Press, Boston Mass . ) ; Advanced Organic Chemistry por March (tercera edición, 1985, Wiley y Sons, New York) ; ¡ y Advanced Organic Chemistry por Carey y Sundberg (tercera edición, partes A y B, 1990, Plenum Press, New York) . Ver también las publicaciones de solicitud de patente de ljos I E.U.A. números 2003/0082575 y 2003/0108885, que aquí |se incorporan por referencia. Además de aminoácidos no naturales que contienen cadenas l aminoácidos no naturales que pueden utilizar en la presente invención opcionalmente estructuras principales modificada's, incluyendo pero no limitadas a, como se ilustra por ljas estructuras de las fórmulas II y III.

II ni en donde Z típicamente comprende OH, NH2, SH, NH-R' , o |s-R' ; X e Y, que pueden ser iguales o diferentes, comprenden típicamente S u 0, y R y R' , que son i opcionalmente iguales o diferentes, se eligen típicamente de la misma lista de constituyentes para el grupo i R descrito anteriormente para los aminoácidos no naturales i que tienen la fórmula II así como hidrógeno. Por ejemplo, aminoácidos no naturales de la invención opcionalmente comprenden sustituciones en el grupo amino o carboxilo i como se ilustra por las fórmulas II y III. Aminoácidos | no i naturales de este tipo inlcuyen pero no están limitados a i « -hidroxiácidos, «-tioácidos, a -aminotiocarboxilatos, incluyendo pero no limitados a, con cadenas laterales que corresponden a los veinte aminoácidos naturales comunes o cadenas laterales no naturales. Además, sustituciones ' en el carbono- a opcionalmente incluyen pero no están i limitadas a, L, D, o aminoácidos «-«-disustituidos tales como D-glutamato, D-alanina, D-metil-O-tirosina, ácido aminobutírico y semejantes. Otras alternativas estructurales incluyen aminoácidos cíclicos tales como I análogos de prolina de 3, 4 , 6, 7, 8, y 9 miembrosi de i anillo, ß y ? aminoácidos tales como ácido ß -alanina y ? -amino butírico sustituido. j Muchos aminoácidos no naturales se basanii en i aminoácidos naturales, tales como tirosina, glutamina, I fenilalanina y semejantes, y son adecuados para utilizar en la presente invención. Análogos tirosina incluyen pero no están limitados a tirosinas para-sustituidas, tirosinas orto-sustituidas, y tirosinas meta-sustituidas, en donde la tirosina sustituida comprende, incluyendo pero no limitado a, un grupo ceto (incluyendo pero no limitado a un grupo acetilo) un grupo benzoilo, un grupo amino, una hidrazina, una hidroxiamina, un grupo tiol, un grupo carboxi, un grupo isopropilo, un grupo metilo, un hidrocarburo de cadena recta o ramificada C6-C20 (un hidrocarburo saturado o insaturado, un grupo O-metilo, un grupo poliéster, un grupo nitro, un grupo alquinilo! o semejantes. Además, múltiples anillos arilo sustituidos también se contemplan. Análogos glutamina que pueden ser adecuados para utilizar en la presente invención incluyen pero no están limitados a, derivados «-hidroxi, j derivados ? -sustituidos, derivados cíclicos y derivados glutamina sustituida con amida. Análogos de fenilalanina ejemplares que pueden ser adecuados para utilizar en , la I presente invención incluyen pero no están limitados ¡ a, i fenilalaninas para-sustituidas, fenilalaninas orto- i sustituidas y fenilalaninas meta-sustituidas, en dondeiel sustituyente comprende, incluyendo pero no limitado a¡un grupo hidroxi, un grupo metoxi, un grupo metilo, un grupo alilo, un aldehido, un azido, un grupo yodo, un grupo bromo, un grupo ceto (incluyendo pero no limitado a un i grupo acetilo) , un grupo benzoilo, uno alquinilo, ! o semejantes. Ejemplos específicos de aminoácidos ho I naturales que pueden ser adecuados para utilizar en la presente invención incluyen pero no están limitados a p--acetil-L-fenilalanina, una O-metil-L-tirosina, una L-3- (2-naftil) alanina, una 3-metil-fenilalanina, una 0-4-alil-L-tirosina, una 4-propil-L-tirosina, una tri-p-acetil-GlcNAc 7 -serina, una L-Dopa, una fenilalaniha fluorada, una isopropil-L-fenilalanina, una p-azido-L-fenilalanina, una p-acil-L-fenilalanina, una p-benzoil-L-fenilalanina, una L-fosfoserina, una fosfonoserina, una fosfonotirosina, una p-yodo-fenilalanina, una p-bromofenilalanina, una p-amino-L-fenilalanina, una isopropil-L-fenilalanina, y una p-propargiloxi-fenilalanina, y semejantes. Ejemplos de estructuras de una variedad de aminoácidos no naturales que pueden s'er adecuados para utilizar en la presente invención ¡se proporcina por ejemplo en, por ejemplo, WO 2002/0859,23 I con título "In vivo incorporation of unnatural ami'no ácidos". Ver también Kiick et al., (2002) Incorporati'on I ofazides into recombinant proteins for chemoselective i modification by the Staudinger ligation, PNAS 99:19-2^, para adicionales análogos de metionina. ¡ En una modalidad, composiciones de ABP que i incluyen un aminoácido no natural (tal como p- (propargiloxi) -fenialanina) se proporcionan. Diversas i composiciones que comprenden p- (propargyloxi) -fenialanina e incluyendo pero no limitado a, proteínas y/o células, también se proporcionan. En un aspecto, una composición que incluye el aminoácido no natural p- (propargiloxi') -fenialanina, además incluye un tRNA ortogonal. !E1 i aminoácido no natural puede unirse (incluyendo pero no limitado a, covalentemente) al tRNA ortogonal, incluyendo pero no limitado a, unido covalentemente al tRNA I ortogonal a través de un enlace amino-acilo, unido covalentemente a un 3 ' OH o un 2 'OH de un azúcar riboisa terminal del tRNA ortogonal, etc. j Las porciones químicas mediante aminoácidos i no naturales que pueden incorporarse en proteínas, ofrecen una variedad de ventajas y manipulaciones de la proteína. i Por ejemplo, la reactividad única de un grupo funcional ceto permite modificación selectiva de proteínas con cualquiera de una cantidad de reactivos que contienen hidrazina o hidroxilamina in vitro e in vivo. , Un ¡ aminoácido no natural con átomo pesado por ejemplo puede ser útil para datos de estructura de rayos X en fase.1 La introducción específica de sitio de átomos pesados I utilizando aminoácidos no naturales también proporciona selectividad y flexibilidad para seleccionar posiciones i para átomos pesados. Aminoácidos no naturales fotoreactivos (incluyendo pero no limitados a aminoácidos con cadenas laterales benzofenona y arilazidas (incluyendo pero no limitadas a, fenilazida) ) , por ejemplo, permiten fotoentrelazamiento eficiente in vivo e in vitro de proteínas. Ejemplos de aminoácidos Ino naturales fotoreactivos incluyen pero no están limitados a, p-azido-fenilalanina y p-benzoil-fenilalanina. La proteína con los aminoácidos no naturales fotoreactivos pueden entonces entrelazarse a voluntad por excitación del grupo fotoreactivo que proporciona control En un ejemplo, el grupo metilo de un amino no natural i puede sustituirse con un grupo isotópicamente etiquetado, incluyendo pero no limitado a metilo, como una sonda, de i estructura y dinámica local, incluyendo pero no limitada a, con el uso de resonancia magnética nuclear y espectroscopia de vibración. Grupos funcionales alquinilo o azido por ejemplo permiten la modificación selectiva de proteínas con moléculas a través de una reacción ¡ de cicloadición [3+2] . I Un aminoácido no natural incorporado eni Un péptido en el extremo amino puede estar compuesto de1 un grupo R que es cualquier sustituyente diferente al i empleado en los veinte aminoácidos naturales y un segundo t grupo reactivo diferente del grupo NH2 normalmente i presente en «-aminoácidos (ver Fórmula I). Un aminoácido no natural similar puede incorporarse en el extremo carboxilo con un segundo grupo reactivo diferente del grupo COOH normalmente presente en «-aminoácidos (ver Fórmula I) . SÍNTESIS QUÍMICA DE AMINOÁCIDOS NO NATURALES { Muchos de los aminoácidos no natural Ies ¡ adecuados para utilizar en la presente invención esfán comercialmente disponibles, por ejemplo de Sigma (USA): o I Aldrich (Milwaukee, WI, USA). Aquellos que no están I comercialmente disponibles se sintetizan opcionalmente í como aquí se dispone o como se proporciona en diversas I publicaciones o utilizando métodos estándar conocidos por aquellos con destreza en la técnica. Para técnicas de síntesis orgánica, ver por ejemplo Organic Chemistry por Fessendon y Fessendon, (1982, segunda edición, Willárd Grant Press, Boston Mass.); Advanced Organic Chemistry I por March (tercera edición, 1985, Wiley y Sons, New I York) ; y Advanced Organic Chemistry por Carey y Sundberg (tercera edición, partes A y B, 1990, Plenum Press, New York) . Publicaciones adicionales que describen I la síntesis de aminoácidos no naturales incluyen por ejemplo WO 2002/085923 con título "In vivo incorporation I of Unnatural Amino ácidos"; Matsoukas et al., (1995) J. Med. Chem., 38, 4660-4669; King, F.E. & Kidd, D.A.A. (1949) A New Synthesis of Glutamine y de ? -Dipeptides of Glutamic i Acid from Phthylated Intermediates . J. Chem. Soc, 331¡5-3319; Friedman, O.M. & Chatterrji, R. (1959) Synthesis ¡of Derivatives of Glutamine as Model Substrates for Anti Ii-Tumor Agents. J. Am. Chem. Soc. 81, 3750-3752; Craig, ¡J.

C. et al. (1988) Absolute Configuration of tihe Enantiomers of 7-Chloro-4 [[4- (diethylamino) -1-methylbutyl] amino] quinoline (Chloroquine) . J. Org.

Chem. 53, 1167-1170; Azoulay, M. , Vilmont, M. & Frappier, F. (1991) Glutamine analogues as Potenti ¡al Antimalarials, . Eur. J. Med. Chem. 26, 201-5; Koskinén, A.M.P. & Rapoport, H. (1989) Synthesis of 4-Substituted Prolines as Conformationally Constrained Amino ácido I Analogues. J. Org. Chem. 54, 1859-1866; Christie, B.D: & Rapoport, H. (1985) Synthesis of Optically Puré Pipecolates from L-Asparagine . Application to the Total Synthesis of (+) - Apovincamine through Amino Acid Decarbonylation y Iminium Ion Cyclization. J. Org. Chém. i 1989:1859-1866; Barton et al., (1987) Synthesis of Novel « -Amino-Acids y Derivatives Using Radical Chemistry: i Synthesis of L- y D- « -Amino-Adipic Acids, L-«-aminopimelic Acid y Appropriate Unsaturated Derivatives. ! Tetrahedron Lett. 43:4297- 4308; and, Subasinghe et al., i (1992) Quisqualic acid analogues: synthesis of be'ta- i heterocyclic 2-aminopropanoic acid derivatives y their activity at a novel quisqualate- sensitized site. J. Med.

Chem. 35:4602-7. Ver también solicitudes de patente con i título "Protein Arrays," presentadas en diciembre 22, 2003, número de serie 10/744,899 y número de serie 60/435,821 presentada en diciembre 22, 2002. ¡ A. Grupos carbonilo reactivos ' Aminoácidos con un grupo reactivo carbonilo permiten que una variedad de reacciones enlacen moléculas (incluyendo pero no limitadas a, PEG u otras moléculas solubles en agua) mediante reacciones de adición I nucleofílica o condensación aldol entre otras. i Aminoácidos que contienen carbonilo ejemplares pueden representarse como sigue: ¡ í en donde n es 0-10; R1 es un alquilo, arilo, alquilo sustituido, o arilo sustituido; R2 es H, alquilo, arijlo, alquilo sustituido, y arilo sustituido; y R3 es H, ' un I aminoácido, un polipéptido, o un grupo de modificación! de I I extremo amino; y R4 es H, un aminoácido, un polipéptido, o un grupo de modificación de extremo carboxi. En algunas modalidades, n es 1, R es fenilo y R2 es un alquilo simple (es decir, metilo, etilo, o propilo) y la porción i cetona se ubica en la posición para respecto a la cadenas lateral alquilo. En algunas modalidades, n es 1, R?¡ es fenilo y R2 es un alquilo simple (es decir, metilo, etilo, o propilo) y la porción cetona se ubica en la posición meta respecto a la cadena lateral alquilo. i La síntesis de p-acetil- (+/-) -fenilalanina' y i m-acetil- (+/-) -fenilalanina se describe por Zhang, Z., et al., Biochemistry 42: 6735-6746 (2003), que aquí ¡se incorpora por referencia. Otros aminoácidos que contienen i carbonilo pueden prepararse similarmente por una persona con destreza en la técnica. i En algunas modalidades, un polipéptido que i comprende un aminoácido no naturalmente codificado ' se i modifica químicamente para generar un grupo funcional carbonilo reactivo. Por ejemplo, una funcionalidad aldehido útil para reacciones de conjugación puede generarse a partir de una funcionalidad que tiene grupos amino e hidroxilo adyacente. Cuando la molécula biológicamente activa es un polipéptido, por ejemplo una serina o trionina N-terminal (que puede normalmente estar i presente o puede exponerse mediante digestión enzimática o química) puede utilizarse para generar luna funcionalidad aldehido bajo condiciones de escisión i oxidativa ligeras utilizando peryodato. Ver por ejemplo Gaertner, et al., Bioconjug. Chem. 3: 262-268 (19^2); Geoghegan, K. & Stroh, J. , Bioconjug. Chem. 3:138-146 I (1992); Gaertner et al., J. Biol Chem. 269:7224-7230 I (1994) . Sin embargo, métodos conocidos en la técnica se restringen al aminoácido en el extremo N del péptidoj o proteína. En la presente invención, un aminoácido 'no naturalmente codificado que contiene grupos hidroxiloi y amino adyacentes puede incorporarse en el polipéptido como una funcionalidad aldehido "enmascarada" . Por ejemplo, 5-hidroxilisina contiene un grupo hidroxilo i adyacente al épsilon amina. Condiciones de reacción para generar el aldehido típicamente involucra una adición i de exceso molar de metaperyodato de sodio bajo condiciones ligeras para evitar oxidación en otros sitios dentro del polipéptido. El pH de la reacción de oxidación típicamente es de aproximadamente 7.0. una reacción ! típica involucra la adición de aproximadamente 1.5 exceso molar de metaperyodato de sodio a una solución amortiguada del polipéptido, seguido por incubación por aproximadamente 10 minutos en la oscuridad. Ver por ejemplo la patente de los E.U.A. número 6,423,685, quei se incorpora aquí por referencia. ' La funcionalidad carbonilo puede reaccionarse selectivamente con un reactivo que contiene hidrazina, hidrazida, hidroxilamina o semicarbazida bajo condiciones I ligeras en solución acuosa para formar los correspondientes enlaces hidrazona, oxima ¡ o semicarbazona, respectivamente que son estables b jo condiciones fisiológicas. Ver, Jencks, W. P., J. Am. Chem. Soc. 81, 475-481 (1959); Shao, J. y Tam, J. P., |j. Am. Chem. Soc. 117:3893-3899 (1995). Aún más, 'la reactividad única del grupo carbonilo permite modificación selectiva en la presencia de otras cadenas laterales aminoácido. Ver, Cornish, V. W. , et al, J. Am. Chem. Soc. 118:8150-8151 (1996); Geoghegan, K. F.¡ & Stroh, J. G., Bioconjug. Chem. 3:138-146 (1992); Mahal , L. K., et al, Science 276:1125-1128 (1997). ¡ I B. Grupos reactivos hidrazina, hidrazida o semicarbazida Aminoácidos no naturalmente codificados que contienen un grupo nucleofílico tales como hidrazina, hidrazida o semicarbazida permiten reacción con una I variedad de grupos electrofílicos para formar conjugados (incluyendo pero no limitados a, con PEG u otros I polímeros solubles en agua) . ' Aminoácidos que contienen hidrazina, hidraz'ida o semicarbazida ejemplares pueden representarse como I sigue: ' en donde n es 0-10; R? es un alquilo, arilo, alquilo sustituido, o arilo sustituido o no está presente; X, es 0, N, o S o no está presente; R2 es H, un aminoácido, un I I polipéptido, o un grupo de modificación de extremo amino, y R3 es H, un aminoácido, un polipéptido, o un grupo de modificación de extremo carboxi. I En algunas modalidades, n es 4 , Rx no está I presente, y X es N. En algunas modalidades, n es 2 , i Ri no está presente, y X no está presente. En algunas I modalidades, n es 1, Ri es fenilo, X es O, y el átomo |de oxígeno está ubicado para respecto al grupo alfático 'en el anillo arilo. i I Amino ácidos que contienen hidrazida, hidrazina y semicarbazida están disponibles de fuentes comerciales. I Por ejemplo, L-glutamato- [ ? ] -hidrazida está disponible de Sigma Chemical (St. Louis, MO) . Otros amino ácidos' no I disponibles comercialmente pueden prepararse por una persona con destreza en la técnica. Ver, por ejemplo' la i patente de los E.U.A. No. 6,281,211, que se incorpora aquí por referencia. ! Polipéptidos que contienen amino ácidos ' no naturalmente codificados que contienen funcionalidades hidrazida, hidrazina o semicarbazida pueden reaccionarse I eficiente y selectivamente con una variedad de moléculas I que contienen aldehidos u otros grupos funcionales ¡con i reactividad química similar. Ver, por ejemplo Shao, J. y Tarn, J., J. Am. Chern. Soc. 117:3893-3899 (1995). ' La I I reactividad única de grupos funcionales hidrazida, I hidrazina y semicarbazida los hace significativamente más reactivos hacia aldehidos, cetonas y otros grup'os I electrofílicos en comparación con los grupos nucleofílicos presentes en los 20 amino ácidos comunes (incluyendo pero no limitados a, el grupo hidroxilo de i serina o treonina o los grupos amino de lisina y ,el extremo N) . | C. Amino ácidos gue contienen aminooxi. i Amino ácidos no naturalmente codificados que I contienen un grupo aminooxi (también denominado un grupo I hidroxilamina) permiten reacción con una variedad ¡ de grupos electrofílicos para formar conjugados (incluyendo i pero no limitados a, con PEG u otros polímeros solubles en agua) . Como hidrazinas, hidrazidas y semicarbazidas, la nucleofilicidad mejorada del grupo aminooxi permite que reaccione eficiente y selectivamente con una variejdad i de moléculas que contienen aldehidos u otros grupos I I funcionales con reactividad química similar. Ver, por ejemplo, Shao, J. y Tarn, J. , J. Am. Chem. Soc. 117:38,93- i 3899 (1995); H. Hang y C. Bertozzi, Ace . Chem. Res. ¡34: 727-736 (2001) . Mientras que el resultado de reacción con un grupo hidrazina es la hidrzona correspondiente, í sin embargo una oxima resulta generalmente de la reacción de un grupo aminooxi con un grupo que contiene carboriilo I I tal como una cetona.

[0280] Amino ácidos ejemplares que contienen I grupos aminooxi pueden representarse como sigue: En donde n es 0-10; R? es alquilo, arilo, alquilo sustituido, o arilo sustituido o no está presente; X es O, N, S o no está presente; m es 0-10; Y = C (0) o no está i presente; R2 es H, un amino ácido, un polipéptido o ¡un I grupo de modificación de extremo amino, y R3 es H, ¡un amino ácido, un polipéptido, o un grupo de modificación de extremo carboxi. En algunas modalidades, n es 1, Rx es fenilo, X es O, m es 1, e Y está presente. En modalidades, n es 2 , Ri y X no están presentes, m Y no está presente. i Amino ácidos que contienen aminooxi pueden prepararse a partir de precursores de amino ácido fácilmente disponibles (homoserina, serina y treonina) .

Ver, por ejemplo M. Carrasco y R. Brown, J. Org. Chem. 68: 8853-8858 (2003). Ciertos amino ácidos que contienen aminooxi tales como ácido L-2-amino-r4- (aminooxi) butírico) , se han aislado de fuentes naturales (Rosenthal, G. et al., Life Sci. 60: 1635-1641 (1997).

Otros amino ácidos que contienen aminooxi pueden prepararse por una persona con destreza en la técnica.

D. Grupos reactivos azida y alquino j La reactividad única de grupos funcionales azida y alquino les hace extremadamente útiles para modificación selectiva de polipéptidos y otras moléculas biológicas. Azidas orgánicas, particularmente azidas alifáticas y alquinos en general son estables hacia condiciones químicas reactivas comunes. En particular, tanto los grupos funcionales azida como alquino son inertes hacia las cadenas laterales (es decir grupos I R) de los 20 amino ácidos comunes que se encuentran ¡ en polipéptidos de origen natural. Cuando se ponen en proximidad íntima, sin embargo la naturaleza "cargada a i resorte" de los grupos azida y alquino se revela y reacciona selectiva y eficientemente mediante una reacción de cicloadición Huisgen [3+2] para generar i el triazol correspondiente. Ver, por ejemplo Chin J. , j et al, Science 301:964-7 (2003); Wang, Q., et al, J. Am.

Chem. Soc. 125, 3192-3193 (2003); Chin, J. W. , et al,¡ J.

Am. Chem. Soc. 124:9026-9027 (2002). I Debido a que la reacción de cicloadi ión Huisgen involucra una reacción de cicloadición selectiva (ver, por ejemplo Padwa, A., in COMPREHENSIVE ORGA^TIC I SYNTHESIS, Vol. 4, (ed. Trost, B. M. , 1991), p. 1069- i 1109; Huisgen, R. in 1,3-DIPOLAR CICLOADDITION CHEMISTRY, I (ed. Padwa, A., 1984), p. 1-176), en vez de una I substitución nucleofílica, la incorporación de amino ácidos no naturalmente codificados que contienen cadenas ¡ laterales con azida y alquino permiten a los polipéptidos resultantes ser modificados selectivamente en la posición del amino ácido no naturalmente codificado. Reacción I de cicloadición involucra ABP que contiene azida y alquino puede llevarse a cabo a temperatura ambiente bajo condiciones acuosas por la adición de Cu (II) (incluyendo i pero no limitado a, en la forma de una cantidad i catalítica de CuS04) en la presencia de un agente I reductor para reducir Cu(II) a Cu(I), in si tu, en cantidad catalítica. Ver, por ejemplo, Wang, Q., et al, J. Am. Chem. Soc. 125, 3192-3193 (2003); Tornoe, C. W., et al, J. Org. Chem. 67:3057-3064 (2002); Rostovtsev, I et al, Angew. Chem. Int. Ed. 41:2596-2599 (2002). Agentes reductores ejemplares incluyen, incluyendo pero j no ! limitados a, ascorbato, cobre metálico, quinina, hidroquinona, vitamina K, glutationa, cisteina, Fe2+, 7 . i Co , y un potencial eléctrico aplicado. | En algunos casos, cuajjido se desea una reacción de cicloadición Huisgen [3+2] entre una azida y i un ! alquino, el polipéptido de enlace antígeno comprende, un amino ácido no-naturalmente codificado que comprende una porción alquino y el polímero soluble en agua sean conectados al amino ácido que comprende una porción azida. En forma alterna, la reacción inversa (es decir, con una porción azida en el amino ácido y la porción alquino presente en el polímero soluble en agua) también puede realizarse. ¡ El grupo funcional azida también puede reaccionarse selectivamente con un polímero soluble ?en agua que contiene un aril éster y apropiadamente funcionalizado con una porción aril fosfina para generar i un enlace amida. El grupo aril fosfina reduce la azida i in situ y la amina resultante reacciona entonces eficientemente con un enlace éster próximo para generar la amida correspondiente. Ver, por ejemplo, E. Saxon y C. Bertozzi, Science 287, 2007-2010 (2000) . El amino ácido que contiene azida puede ya ser un alquil azida (incluyendo pero no limitada a ácido 2-amino-6-azido¡-l- I hexanoico) o un aril azida (p-azido-fenilalanina) . | Polímeros solubles en agua ejemplares que I contienen un aril éster y una porción fosfina pueden I representarse como sigue: ' . ' en donde X puede ser 0, N, S o no está presente, pH¡ es I fenilo, W es un polímero soluble en agua y R puede ser¡ H, I alquilo, arilo, alquilo substituido y grupos arilo substituido. Grupos R ejemplares incluyen pero no están limitados a -CH2, -C(CH3) 3, -0R' , -NR'R", -SR', | -halógeno, -C(0)R', - CONR'R", -S(0)2R', -S(0)2NR'R", -CN y -N02. R1 , R" , R'" y R"" cada uno independientemente se refiere a hidrógeno, heteroalquilo substituido o sin substituir, arilo substituido o sin substituir, incluyendo pero no limitado a, arilo substituido con 1-3 halógenos, grupos alquilo, alcoxi o .tioalcoxi substituidos o sin substituir, o grupos arilalquilo. I Cuando un compuesto de la un grupo R, por ejemplo, cada uno de los grupos R se elige i independientemente como cada uno de los grupos R', R" , R'" y R"" cuando más de uno de estos grupos está presente. Cuando R' y R" se conectan al mismo átomo , de nitrógeno, pueden combinarse con el átomo de nitrógeno para formar un anillo de 5-, 6-o 7-miembros. Por ejemplo, -NR'R" se pretende que incluya pero no está limitado a 1-pirrolidinilo y 4 -morfolinilo. De , la i discusión anterior de substituyentes, una persona con destreza en la técnica comprenderá que el término "alquilo" se pretende que incluya grupos incluyendo i átomos de carbono ligados a grupos diferentes a grupos hidrógeno, tales como haloalquilo (incluyendo pero ' no limitado a -CF3 y -CH2CF3) y acilo (incluyendo pero' no limitado a -C(0)CH3, -C(0)CF3, -C (0) CH2OCH3, i y semejantes) . , El grupo funcional azida también puede I reaccionarse selectivamente con un polímero soluble en I agua que contiene un tioéster y funcionalizado apropiadamente con una porción aril fosfina para generar I I un enlace amida. El grupo aril fosfina reduce la azida in si tu y la amina resultante reacciona entonces eficientemente con el enlace tioéster para generar la amida correspondiente. Polímeros solubles en agua ejemplares que contienen un tioéster y una porción fosfina pueden representarse como sigue: en donde n es 1-10; X puede ser O, N, S o no está presente, pH es fenilo y W es un polímero soluble] en agua . ! I Amino ácidos que contienen alquino ejemplares I pueden representarse como sigue: ' i en donde n es 0-10; Ri es un alquilo, arilo, alquilo sustituido o arilo sustituido o no está presente; X es 0, I N, S o no está presente; m es 0-10, R2 es H, un amino I ácido, un polipéptido, o un grupo de modificación de extremo amino, y R3 es H, un amino ácido, un polipéptido, o un grupo de modificación de extremo carboxi. 'En j algunas modalidades, n es 1, Ri es fenilo, X no está presente, m es 0 y la porción acetileno se ubica en lia posición para respecto a la cadena lateral alquilo. , En i algunas modalidades, n es 1, Rx es fenilo, X es O, m es 1 y el grupo propargiloxi se ubica en la posición para respecto a la cadena lateral alquilo (es decir, i 0- I propargil-tirosina) . En algunas modalidades, n es 1,| Ri y X no están presentes y m es 0 (es decir proparilglicina) . Amino ácidos que contienen alquino esjtán comercialmente disponibles. Por ejemplo, propargilglicina está comercialmente disponible de Peptech (Burlington, MA) . En forma alterna, amino ácidos que contienen alquino pueden prepararse de acuerdo ¡con I métodos estándar. Por ejemplo, , p-propargiloxifenilalanina puede sintetizarse, por ejemplo como se describe en Deiters, A., et al, J. Am. Chem. Soc. 125: 11782-11783 (2003), y 4-alquinil-L-fenilalariina puede sintetizarse como se describe en Kayser, B., et ¡al, Tetrahedron 53(7): 2475-2484 (1997). Otros amino ácidos que contienen alquino pueden prepararse por una persona í con destreza en la técnica. !

[0290] Amino ácidos que contienen azida ejemplares pueden representarse como sigue i en donde n es 0-10; R es alquilo, arilo, alquilo substituido, arilo substituido o no está presente; X i es O, N, S o no esta presente; m es 0-10; R2 es H, un amino ácido, un polipéptido, o un grupo de modificación j de I extremo amino, y R3 es H, un amino ácido, un polipéptido, I o un grupo de modificación de extremo carboxi. i En algunas modalidades, n es 1, Rx es fenilo, X no está presente, m es 0 y la porción azida está ubicada respecto a la cadena lateral alquilo. En algunas modalidades, n es 0-4 y Rx y X no están presentes y m=0. En algunas modalidades, n es 1, Ri es fenilo, X es 0! I, m es 2 y la porción [ ß ] -azidoetoxi se ubica en la posición para respecto a la cadena lateral alquilo. Amino ácidos que contienen azida están I disponibles de fuentes comerciales. Por ejemplo, 4- i azidofenilalanina puede obtenerse de Chem-Impex International, Inc. (Wood Dale, IL) . Para aquellos amino ácidos que contienen azida que no están comercialmente disponibles, el grupo azida puede prepararse en forma relativamente fácil utilizando metodología estándar i conocida por aquellos con destreza en la técnica, incluyendo pero no limitados a, por desplazamiento de ¡un grupo saliente conveniente (incluyendo pero no limitado a haluro, mesilato, tosilato) o por abertura de una lactóna convenientemente protegida. Ver, por ejemplo Advanced Orfianic Chemistry by March (Third Edition, 1985, Wiley- y Sons, New York) . E. Grupos reactivos aminotiol I La reactividad única de grupos funcionales amino tiol beta-substituidos les hace extremadamente i útiles para la modificación selectiva de polipéptidos y i otras moléculas biológicas que contienen grupos aldehido por formación de la tiazolidina. Ver, por ejemplo! J. Shao y J. Tam, J. Am. Chem. Soc. 1995, 117 (14) 38©3-3899. En algunas modalidades, amino ácidos aminot?ol beta-substituidos pueden incorporarse en polipéptidos ABP y después reaccionarse con polímeros solubles en agua ¡que comprenden una funcionalidad aldehido. En algunas modalidades, un polímero soluble en agua, conjugado! de droga u otra carga útil puede acoplarse a un polipépt'ido ABP que comprende un amino ácido aminotiol beta-substituido mediante formación de la tiazolidina. ABSORCIÓN CELULAR DE AMINO ÁCIDOS NO NATURALES I Absorción de amino ácidos no naturales por una célula eucariótica es un aspecto que típicamente, se considera cuando se diseñan y eligen amino ácidos ,no naturales, incluyendo pero no limitados a, para incorporar en una proteína. Por ejemplo, la alta densidad de carga de [ ] -amino ácidos sugiere que estos compuestos sean poco probables en su permeabilidad a , la célula. Amino ácidos naturales se absorben en la célula I eucariótica mediante una colección de sistemas j de transporte basados en proteína. Puede realizarse una supervisión rápida que estime que amino ácidos i no naturales, de haber son absorbidos por las células. Ver, por ejemplo los ensayos de toxicidad por ejemplo en la solicitudes con títulos "Protein Arrays", presentada en diciembre 22, 2003, número de serie de los E.U I.A. 10/744,899 y número de serie de los E.U.A. 60/435,?821 presentada en diciembre 22, 2002; y Liu, D.R. & Schultz, P.G. (1999) Progress toward the evolución of an organism I with an expanded genetic code . PNAS United St tes 96:4780-4785. Aunque la absorción se analiza fácilmente con diversos ensayos, una alternativa a diseñar amino I ácidos no naturales que son susceptibles a rutas ' de absorción celular, es proporcionar rutas biosintéticas para crear amino ácidos in vivo . I BIOSÍNTESIS DE AMINO ÁCIDOS NO NATURALES ¡ Muchas rutas biosintéticas ya existen ' en células para la producción de amino ácidos y otros I compuestos. Mientras que un método biosintético para un amino ácido no natural particular puede no existir en , la naturaleza, incluyendo pero no limitado a, en una célula eucariotica, la invención proporciona estos métodos. Por ejemplo, rutas biosintéticas para amino ácidos 'no i naturales se generan opcionalmente en la célula anfitriona al agregar nuevas enzimas o modificar rutas! de células anfitrionas existentes. Nuevas enzim Ias adicionales son enzimas de origen natural opcionalmente o enzimas evolucionadas artificialmente. Por ejemplo, i la biosíntesis de p-aminofenilalanina (como se presenta | en un ejemplo de WO 2002/085923 con título "In v'ivo i incorporación of unnatural amineo acids") se basa en I la adición de una combinación de enzimas conocidas de otaros organismos. Los genes para estas enzimas pue'den introducirse en una célula eucariótica al transformar) la célula con un plásmido que comprende los genes . ¡Los genes, cuando se expresan en la célula, proporcionan ¡una ruta enzimática para sintetizar el compuesto deseajdo. Ejemplos de los tipos de enzimas que se agregan opcionalmente, se proporcionan en los siguientes ejemplos. Secuencias de enzimas adicionales i se encuentran por ejemplo, en Genbank. Enzimas evolucionadas artificialmente también se agregan opcionalmente en una célula en la misma forma. De ésta manera, la maquinaria celular y recursos de una célula se i manipulan para producir amino ácidos no naturales. , I Una variedad de métodos están disponibles para producir enzimas novedosas para utilizar en rutas biosintéticas o para evolución de rutas existentes. Por I ejemplo, recombinación recursiva, incluyendo pero no limitada a, como se desarrolló por Maxygen, Inc. (disponible en la Red Mundial en maxygen.com), se emplea opcionalmente para desarrollar enzimas novedosas y rutas. Ver, por ejemplo Stemmer (1994) , Rapid evolution of¡ a protein in vitro by DNA shuffling, Nature 370 (4) : 389-391 ; and, Stemmer, (1994) , DNA shuffling by ranclom fragmentation and reassembly: In vitro recombination for molecular evolution, Proc. Nati. Acad. Sci. USA., 91:10747-10751. Similarmente DesignPath®, desarrollado por Genencor (disponible en la Red Mundial en genencor.com) se emplea opcionalmente para ingeniería! de ruta metabólica, incluyendo pero no limitado I a, i ingeniería de una ruta para crear 0-metil-L-tírosina| en una célula. Esta tecnología reconstruye rutas existentes en organismos anfitriones utiilzando una combinación) de i nuevos genes, incluyendo pero limitado a, identificados a través de genómica funcional, y evolución y diseño molecular. Diversa Corporation (disponible en la 'Red Mundial en diversa.com) también proporciona tecnología para bibliotecas de supervisión rápida de genes y rutas de genes, incluyendo pero no limitadas a, crear para crear nuevas rutas . I Típicamente, el amino ácido no natural producido con una ruta biosintética de ingeniería de , la I invención se produce en una concentración suficiente para biosíntesis eficiente de proteína, incluyendo pero no limitada a, una cantidad celular natural, pero no en | un grado tal que afecte la concentración de los otros amino ácidos o agote los recursos celulares. Concentraciones típicas producidas in vivo de esta manera son aproximadamente 10 mM a aproximadamente 0.05 niM. Una vez que una célula se transforma con un plásmido que comprende los genes empleados para producir enzimas deseadas para una ruta específica y se genera un amino ¡ ácido no natural, selecciones in vivo se emplean i opcionalmente para optimizar además la producción 'del amino ácido no natural tanto para síntesis de proteína I ribosomal como crecimiento celular. POLIPÉPTIDOS CON AMINO ÁCIDOS NO NATURALES ' La incorporación de un amino ácido no natural puede realizarse para una variedad de propósitos, incluyendo pero no limitados a, ajustar a la medida cambios en estructura de proteína y/o función, cambiar tamaño, acidez, nucleofilicidad, enlace de hidrógeno, hidrofobicidad, accesibilidad de sitios diana proteasa, hacer blanco a una porción (incluyendo pero no limitada ! a, para un arreglo de proteína) , agregar una molécula biológicamente activa, conectar un polímero, conectar |un radionúclido, modular vida media en suero, modular penetración de tejido (por ejemplo tumores), modular transporte activo, modular especificidad de tejid Io, célula u órgano, modular inmunogenicidad, modular resistencia a proteasa, etc. Proteínas que incluyen i un amino ácido no natural pueden tener propiedades biofísicas o catalíticas mej Joradas o incluso totalmenite I nuevas. Por ejemplo, las siguientes propiedades j se modifican opcionalmente por inclusión de un amino ácido no natural en una proteína: toxicidad, biodistribución, propiedades estructurales, propiedades espectroscópicas, propiedades químicas y/o fotoquímicas, habilidad ! catalítica, vida media (incluyendo pero no limitada! a, i vida media en suero) , habilidad para reaccionar con otras moléculas, incluyendo pero no limitadas a forma covalénte o no covalente, y semejantes. Las composiciones I incluyendo proteínas que incluyen al menos un amino ácido i no natural son útiles para, incluyendo pero no limitado i a, agentes terapéuticos novedosos, agentes I de diagnósticos, enzimas catalíticas, enzimas industriales, I proteínas de enlace (incluyendo pero no limitadas, a, I anticuerpos) e incluyendo pero no limitado a el estudio de estructura y función de proteína. Dougherty, (2000) Unnatural Amino Acids Protein Structure y Function, Current Opinión in Chemical Biology, 4:645-652. | En un aspecto de la invención, una composición incluye al menos una proteína con al menos uno, pero.no limitado a, cuando menos dos, cuando menos tres, cuando menos cuatro, cuando menos cinco, cuando menos seis, I cuando menos siete, cuando menos ocho, cuando menos i nueve, o al menos diez o más amino ácidos no naturales. I Los amino ácidos no naturales pueden ser igualesj o diferentes, incluyendo pero no limitados a, puede haber 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ó 10 o más sitios diferentes en la proteína que comprenden 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8,' 9, ó 10 o más amino ácidos no naturales diferentes. En o,tro i aspecto, una composición incluye una proteína con ! al menos una, pero menos que todo de un amino ácido particular presente en la proteína, se substituye con el i amino ácido no natural. Para una proteína determinada, i con más de un amino ácido no natural, los amino ácidos no i naturales pueden ser idénticos o diferentes (incluyendo pero no limitados a, la proteína que incluye dos o ¡más tipos diferentes de amino ácidos no naturales, o puede incluir dos del mismo amino ácido no natural). Para , una proteína determinada, con más de dos amino ácidos no naturales, los amino ácidos no naturales pueden ser iguales o diferentes o una combinación de múltiples amino ácidos no naturales del mismo tipo con al menos un amino ácido no natural diferente. I i ABP's de interés con al menos un amino ácido ino natural son una característica de la invención. ¡La I invención también incluye polipéptidos o proteínas con ¡al i menos un amino ácido no natural producido utilizando las composiciones y métodos de la invención. Un excipiente i (incluyendo pero no limitado a, un excipiente farmacéuticamente aceptable) también puede estar presente con la proteína. I Al producir proteínas o polipéptidos de interés con al menos un amino ácido no natural en céluljas eucarióticas, proteínas o polipéptidos, típicamente i incluirá modificaciones post-traducción eucariótica. En ciertas modalidades, una proteína incluye al menos un i amino ácido no natural y al menos una modificación pos't- I traducción que se realiza in vivo por una célula eucariótica, en donde la modificación post-traducción no I se hace por una célula procariótica. Por ejemplo, la modificación post-traducción incluye, incluyendo pero no I limitado a, acetilación, acilación, modificación ele lípidos, palmitoilación, adición de palmitato, fosforilación, modificación de enlace glicolípido, glicosilación, y semejantes En un aspecto, lia modificación post-traducción incluye conexión de un oligosacárido (incluyendo pero no limitado a, (GlcNAc- Man) 2-Man-GlcNAc-GlcNAc) ) a una asparagina por un enlace i GIcNAc. Ver Tabla 1 que cita algunos ejemplos ,de oligosacáridos N-enlazados de proteínas eucarióticas (residuos adicionales también pueden estar presentes, que ! no se muestran) . En otro aspecto, la modificación post- I I traducción incluye conexión de un oligosacárido i (incluyendo pero no limitado a, Gal-GalNAc, Gal-GIcNAc, etc.) a una serina o treonina por un enlace GalNAc-serina o GalNAc-treonina, o un enlace GlcNAc-serina o GlcNÁc- i treonina. , i TABLA 1: EJEMPLOS DE OLIGOSACÁRIDOS A TRAVÉS DE ENLACE GlcNAc ' Todavía en otro aspecto, la modificación post-traducción incluye procesamiento proteolítico i de precursores (incluyendo pero no limitados a precursor i de calcitonina, precursor de péptido relacionado a gen I calcitonina, hormona preproparatiroide, preproinsulina, proinsulina, prepro-opiomelanocortina, proopiomelanocortina y semejantes) , ensamblado en una proteína de múltiples sub-unidades o conjunto macromolecular, traducción a otro sitio en la célula (incluyendo pero no limitado a organelos, tales como i el retículo endoplásmico, el aparato de Golgi, el núcleo, i lisosomas, peroxisomas, mitocondrios, cloroplastbs, vaculas, etc., o a través de la ruta secretoria), ¡ en ciertas modalidades, la proteína comprende una secuencia de secreción o localización, una etiqueta epítope, juna etiqueta FLAG, una etiqueta polihistidina, una fusión I GST, o semejantes. i Una ventaja de un amino ácido no natural es 'que presenta porciones químicas ad Ji.ci.onales que pueId,en emplearse para agregar moléculas adicionales. Es'tas modificaciones pueden realizarse in vivo en una célula eucariótica o no eucariótica, o in vi tro. De esta manera, en ciertas modalidades, la modificación posttraducción es a través del amino ácido no natural. ¡Por ' 0 ejemplo, la modificación post-traducción puede ser a I través de una reacción nucleofílica-electrofílica. | La i mayoría de las reacciones actualmente empleadas para , la modificación selectiva de proteínas involucran formación de enlace covalente entre socios de reacción nucleofílicos y electrofílicos, incluyendo pero no limitados a la reacción de -halocetonas con cadenas laterales histidina o cisteína. La selectividad en estos casos se determina por el numero y accesibilidad de los i residuos nucleofílicos en la proteína. En proteínas ¡de la invención, otras reacciones más selectivas pueden emplearse tales como la reacción de un ceto-amino ácido i no natural con hidrazidas o compuestos aminooxi, in vitro e in vivo . Ver, e.g., Cornish, et al., (1996) Am. Chem. Soc, 118:8150-8151; Mahal , et al., (1997) Science, 276:1125-1128; Wang, et al., (2001) Science 292:498-500; Chin, et al., (2002) Am. Chem. Soc. 124:9026-9027; Chin, et al., (2002) Proc. Nati. Acad. Sci. 99:11020-11024; Wang, et al., (2003) Proc. Nati. Acad. Sci. 100:56-61; Zhang, et al., (2003) Biochemistry, 42:6735-6746; y, Chin, et al., (2003) Science, en impresión. Esto permite el etiquetado selectivo virtualmente de cualquier proteína con un conjunto- de reactivos que incluyen I fluoróforos, agentes de entrelazamiento, derivados sacárido y moléculas citotóxicas. Ver también, ¡la solicitud de patente de los E.U.A. No. de Serie 10/686,944 con título "Glycoprotein synthesis" presentada ! en octubre 15, 2003 con base en la solicitud de patente provisional de los E.U.A. No. de Serie 60/419,265, presentada en octubre 16, 2002, la solicitud de patente provisional de los E.U.A. No. de Serie 60/420,990, presentada en octubre 23, 2002, y la solicitud de patente provisional de los E.U.A. No. de Serie 60/441,450, presentada en enero 16, 2003, que aquí se incorporan por referencia. Modificaciones post-traducción, incluyendo I pero no limitadas a, a través de un azido amino ácido, también pueden realizarse a través de la ligación i de Staudinger (incluyendo pero no limitado a, con reactivos i triarilfosfina) . Ver, por ejemplo Kiick et al., (2002) Incorporation of azides into recombinant proteins for Esta invención proporciona otro método altamente eficiente para la modificación selectiva de I proteínas, que involucra la incorporación genética > de amino ácidos no naturales, incluyendo pero no limitados a, que contiene una porción azida o alquinilo en proteínas en respuesta a un codón selector. Estas cadenas laterales amino ácido pueden entonces modificarse I a, incluyendo pero no limitado a, una reacción j de cicloadición Huisgen [3+2] (ver, e.g., Padwa, A. in Comprehensive Organic Synthesis, Vol. 4, (1991) Ed.

Trost, B. M., Pergamon, Oxford, p. 1069-1109; y, Huisgén, R. in 1,3-Dipolar Cicloaddition Chemistry, (1984) Ed.

Padwa, A., Wiley, New York, p. 1-176) con, incluyendo pero no limitado a, derivados alquinilo o azicla, respectivamente. Debido a que este método involucra una cicloadición en vez de una substitución nucleofílica, proteínas pueden modificarse con extremadamente alta selectividad. Esta reacción puede llevarse a cabo a temperatura ambiente en condiciones acuosas con excelente regioselectividad (1,4 > 1,5) por la adición | de cantidades catalíticas de sales de Cu (I) a la mezcla' de reacción. Ver, e.g., Tornoe, et al., (2002) Org. Ch'em. 67:3057-3064; y, Rostovtsev, et al., (2002) Angew. Ch¡em. Int. Ed. 41:2596-2599. Otro método que puede emplearse es el intercambio de ligandos en un compuesto bisarsé?ico con un motivo tetracisteína, ver, e.g., Griffin, et ál . , i (1998) Science 281:269-272. , Una molécula que puede agregarse a una protéína de la invención a través de una cicloadición [3+2] í incluye virtualmente cualquier molécula con un derivado azida o alquinilo. Moléculas incluyen pero no están limitadas a, colorantes, fluoróforos, agentes ¡ de entrelazamiento, derivados sacárido, polímeros (incluyendo pero no limitados a, derivados de polietilen glicol) , fotoentrelazadores, compuestos citotóxicos, etiquetas de afinidad, derivados de biotina, resinas, perlas, una segunda proteína o polipéptido (o más) , polinucleótido (s) (incluyendo pero no limitados a, DNA, RNA, etc.), quelantes de metal, cofactores, ácidos grasos, carbohidratos, y semejantes. Estas moléculas pueden agregarse a un amino ácido no natural con un gr?po alquinilo, incluyendo pero no limitado a, p-propargiloxifenilalanina o grupo azido, incluyendo pero i no limitado a, p-azido-fenilalanina, respectivamente. ¡ V. Generación in vivo de ABP gue comprende amino ácidos i no-genéticamente-codificados ' Los polipéptidos de enlace de antígeno de j la invención pueden generarse in vivo utilizando tRNA y tRNA sintetasas modificadas para agregar a o substituir amino ácidos que no se codifican en sistemas de origen natural . Métodos para generar tRNAs y tRNA sinteta¡sas i que utilizan amino ácidos no codificados en sistemas! de origen natural se describen por ejemplo en ¡las i publicaciones de solicitud de patente de los E.U.A. ¡No. i 2003/0082575 (Número de Serie 10/126,927) y 2003/0108885 i (Número de Serie 10/126,931) que aquí se incorporan ¡por referencia. Estos métodos involucran generar una maquinaria de traducción que funciona independientemente i de las sintetasas y tRNAs endógenos al sistema de i traducción (y por lo tanto en ocasiones referidos como "ortogonales"). Típicamente, el sistema de traducción i comprende un tRNA ortogonal (O-tRNA) y una aminoacil tRNA sintetasa ortogonal (ORS) . Típicamente, la ORS ¡ de preferencia aminoacila el O-tRNA con al menos un amino ácido que no es de origen natural en el sistema | de traducción y el O-tRNA reconoce al menos un codón selector que no se reconoce por otras tRNAs en ¡ el sistema. El sistema de traducción de esta manera inserta i el amino ácido no-naturalmente-codificado en una protelína producida en el sistema, en respuesta a un codon selector codificado, de esta manera "substituyendo" un amino ácido en una posición en el polipéptido codificado. , Una amplia variedad de tRNAs ortogonales y específicas/aminoacil-tRNA sintetasas se describen por Wang, L. , et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 100:56-61 (2003) y Zhang, Z. et al., Biochem. 42 (22) : 6735-6746 (2003). ORS ejemplares o sus porciones se codifican ' por secuencias polinucleótido e incluyen secuencias amino ácido descritas en las publicaciones de solicitud1 de patente de los E.U.A. No. 2003/0082575 y 2003/0108885, cada uno incorporadas aquí por referencia. Correspondientes moléculas de O-tRNA para utilizar con las O-RSs también se describen en las publicaciones de la solicitud de patente de los E.U.A. No. 2003/0082575 (Número de Serie 10/126,927) y 2003/0108885 (Número de Serie 10/126,931) que se incorporan aquí por referencia. Un ejemplo de un sistema O-tRNA específico ' de azida/aminoacil-tRNA sintetasa se describe en Chin, J. W., et al, J. Am. Chem. Soc. 124:9026-9027 (2002). Ejemplares secuencias de O-RS para p-azido-L-Phe incluyen pero no están limitadas a, secuencias nucleótido SEQi ID NOs: 14-16 y 29-32 y secuencias de amino ácido SEQ1 ID NOs: 46-48 y 61-64 como se describe en la publicación' de solicitud de patente de los E.U.A. No. 2003/0108885 (Número de Serie 10/126,931) que se incorpora aquí por referencia. Secuencias O-tRNA ejemplares adecuadas para utilizar en la presente invención incluyen pero no están limitadas a, secuencias nucleótido SEQ ID NOs: 1-3 como se describe en la publicación de solicitud de patente de los E.U.A. No. 2003/0108885 (Número de Serie 10/126,931) que se incorpora aquí por referencia. Otros ejemplos de pares O-tRNA/aminoacil-tRNA sintetasa específicos a los amino ácidos no naturalmente codificados particulares se describen en la publicación de la solicitud de patente de los E.U.A. No. 2003/0082575 (Número de Serie 10/126,927) I que aquí se incorporan por referencia. O-RS y O-tRNA que ¡ incorporan tanto amino ácidos que contienen ceto y azicla en S . cerevisiae se describe en Chin, J. W., et a 1, Science 301:964- 967 (2003). El uso de O-tRNA/aminoacil-tRNA sintetas.as i involucra selección de un codón específico que codifica I el amino acido no naturalmente codificado. Mientras que I cualquier codón puede emplearse, en general 'es I I conveniente el seleccionar un codón que es raramente usado o nunca usado en la célula en donde la O- ! tRNA/aminoacil-tRNA sintetasa se expresa. Por ejemplo, codones ejemplares incluyen codón sin sentido tal como codones de parada (ámbar, ocre y ópalo), codones 'de cuatro o más bases y otros codones de tres bases naturales que son raramente empleados o no empleados. I Uno o varios codones selectores específicos i pueden introducirse en posiciones apropiadas en ' la secuencia de codificación polinucleótido ABP utilizando métodos de mutagénesis conocidos en la especialildad i (incluyendo pero no limitados a, mutagénesis específica de sitio, mutagénesis de cassette, mutagénesis I de I i selección de restricción, etc.) . ¡ Métodos para generar componentes de ' la i maquinaria biosintética de proteínas, tales como O-RSs, O-tRNAs y pares O-tRNA/O-RS ortogonales pueden emplearse para incorporar un amino ácido no-naturalmente codificado ¡ como se describe en Wang, L., et al , Science 292: 498-500 (2001); Chin, J. W., et al, J. Am. Chem. Soc. 124:9026- i 9027 (2002); Zhang, Z. et al, Biochemistry 42: 6735-6746 (2003) . Métodos y composiciones para la incorporación in vivo de amino ácidos no naturalmente codificados, se I describen en la publicación de solicitud de patente de los E.U.A. No. 2003/0082575 (Número de Serie 10/126,927) que aquí se incorpora por referencia. Métodos para i seleccionar un par de tRNA ortogonal -tRNA sintetasa para utilizar en sistema de traducción in vivo de un organismo, también se describen en las publicaciones Ide i solicitudes de patente de los E.U.A. No. 2003/0082575 (Número de Serie 10/126,927) y No. 2003/0108885 (Número I de Serie 10/126,931) que aquí se incorporan por referencia. ' i Métodos para producir cuando menos una aminoacil-tRNA sintetasa ortogonal recombinante (O-RS) i comprenden: (a) generar una biblioteca de RSs (opcionalmente mutantes) derivadas de al menos una I aminoacil-tRNA sintetasa (RS) de un primer organismo, incluyendo pero no limitado a, un organismo procariota, I tal como Methanococcus jannaschii , Methanobacterium 1 thermoautotrophicum, Halobacterium, Escherichia coli , ' A . I fulgidus, P. furiosus, P. horikoshii , A . pernix, , T. i I i i I I I thermophilics, o semejantes, o un organismo eucariótico; (b) seleccionar (y/o supervisar) la biblioteca de RSs (RSs opcionalmente mutantes) por miembros que aminoacilan una tRNA ortogonal (O-tRNA) en la presencia de un amino i ácido no-naturalmente codificado y un amino ácido natural, de esta manera proporcionando un conjunto de RSs activos (opcionalmente mutantes) ; y/o, (c) seleccionar (opcionalmente a través de selección negativa) el conjunto de RSs activos (incluyendo pero no limitados a, RSs mutantes) que aminoacilan preferencialmente la O-tRNA en la ausencia de un amino ácido no naturalmente codificado, de esta manera proporcionando la O-RS recombinante como mínimo; en donde al menos una O-RS recombinante de preferencia aminoacila la O-tRNA con el amino ácido no naturalmente codificado. En una modalidad, la RS es una RS inactiva. La RS inactiva puede generarse por mutación de una RS activa. Por ejemplo, una RS inactiva puede generarse al I mutar al menos aproximadamente 1 , al menos aproximadamente 2, al menos aproximadamente 3, al menos i aproximadamente 4, al menos aproximadamente 5, al menos aproximadamente 6, o al menos aproximadamente 10 o más amino ácidos a diferentes amino ácidos, incluyendo pero no limitados a alanina. Bibliotecas de RSs mutantes pueden generarse utilizando diversas técnicas conocidas en ila especialidad, incluyendo pero no limitadas a diseño racional con base en estructura RS tri-dimensional ¡de proteína, o mutagénesis de nucleótidos RS en una técnica de diseño aleatoria o racional. Por ejemplo, la RSs mutante puede generarse por mutaciones específicas de sitio, mutaciones aleatorias, mutaciones recombinantes I generadoras de diversidad, construcciones quiméricas, I diseño racional y por otros métodos descritos aquí' o conocidos en la técnica. En una modalidad, la selección (y/o supervisión) de la biblioteca de RSs (opcionalmente RSs I mutantes) por miembros que son activos, incluyendo pero no limitados a, que aminoacilan una tRNA ortogonal (OtRNA) en la presencia de un amino ácido no-naturalmente i codificado, y un amino ácido natural, incluye: introducir un marcador de supervisión o selección positiva, incluyendo pero no limitado a, un gen de resistencia i antibióticos, o semejantes, y la biblioteca de RSs (opcionalmente mutantes) en una pluralidad de células,1 en donde el marcador de supervisión y/o selección positiva, i comprende al menos un codón selector, incluyendo pero, no I limitado a, un codón ámbar, ocre, u ópalo; desarrollar! la pluralidad de células en la presencia de un agente ¡ de i selección; identificar células que sobreviven (o muestran I una respuesta específica) en la presencia de un agente de selección y/o supervisión al suprimir el codón selector I como mínimo en el marcador de supervisión o selección I positivo, proporcionando de esta manera un subconjunto ¡de células selectas positivamente que contienen el conjunto de RSs activas (opcionalmente mutantes) . Opcionalmente, la concentración del agente de supervisión y/o selección puede variar. i En un aspecto, el marcador de selección I positivo es un gen de cloranfenicol acetiltransferasa (CAT) y el codón selector es un codón de parada ámbar ' en I el gen CAT. Opcionalmente, el marcador de selección positiva es un gen de -lactamasa y el codón selector i es un codón de parada ámbar en el gen /3-lactamasa . En otro i aspecto el marcador de supervisión positivo comprende I un i marcador de supervisión luminiscente o fluorescente o| un i marcador basado en afinidad (incluyendo pero no limitado a, un marcador de superficie celular) . En una modalidad, la supervisión o selección i negative del conjunto para RSs activos (opcionalmente i mutantes) que preferencialmente aminoacilan la O-tRNA en la ausencia del amino ácido no naturalmente codificado i incluye: introducir un marcador de supervisiónl o selección negativa con el conjunto de RSs activos (opcionalmente mutantes) de la supervisión o selección positiva en una pluralidad de células de un segundo I organismo, en donde el marcador de supervisión , o selección negativa comprende al menos un codón selector (incluyendo pero no limitado a, un gen de resistencia a antibióticos, incluyendo pero no limitado a, un gen I cloranfenicol acetiltransferasa (CAT) ) ; e identificar células que sobreviven o muestran una respuesta ' de i supervisión específica en un primer medio suplementado con el amino ácido no-naturalmente codificado y un agente de supervisión o selección, pero fallan en sobrevivir o mostrar la respuesta específica en un segundo medio ¡ no i suplementado con el amino ácido no-naturalmente codificado y el agente de supervisión o selección, proporcionando de esta manera células supervivientes o células supervisadas con al menos una O-RS recombinanite.

Por ejemplo, un protocolo de identificación ¡CAT opcionalmente actúa como una supervisión negativa ¡y/o i selección positiva para determinar las recombinantes O-RS i apropiadas. Por ejemplo, un conjunto de ciónos se replica opcionalmente en placas de crecimiento que contienen CAT (que comprende al menos un codón selector) i ya sea con o sin un amino ácido no naturalmente i codificado. Colonias que crecen exclusivamente en ilas placas que contienen amino ácidos no naturalmente codificados de esta manera se considera que contienen O- i RS recombinante. En un aspecto, la concentración del agente de selección (y/o supervisión) se varía. En alguos aspectos, el primero y segundo organismos son diferentes. De esta manera, el primer y segundo i organismos comprenden opcionalmente: un procariota, 'un I eucariota, un mamífero, una Escherichia coli , un hongo, una levadura, una arqueobacteria, una eubacteria, una planta, un insecto, un protista, etc. En otras modalidades, el marcador de supervisión comprende ¡un agente de supervisión fluorescente o luminiscente o un marcador de supervisión basado en afinidad. En otra modalidad, la supervisión o selección ¡ (incluyendo pero no limitada a, selección negativa) del conjunto de RSs activas (opcionalmente mutantes) incluyen: aislar el conjunto de RSs mutantes activas de un gen de ribonucleasa barnasa, que comprende al menos ' un codón selector) , y el conjunto de RSs activas (opcionalmente mutantes) en una pluralidad de células j de i un segundo organismo; e identificar células que sobreviven o muestran una respuesta de supervisión específica en un primer medio, no suplementado con | el amino ácido no naturalmente codificado, pero que fallan en sobrevivir o mostrar una respuesta de supervisión específica en un segundo medio suplementado con el amino ácido no naturalmente codificado, proporcionando de esta manera células supervivientes o supervisadas con la O-RS recombinante como mínimo, en donde la O-RS recombinante como mínimo es específica para el amino ácido ( no naturalmente codificado. En un aspecto, el co'dón selector como mínimo comprende aproximadamente dos o imás i codones selectores. Estas modalidades opcionalmente pueden incluir en donde el codón selector como mínimo i comprende dos o más codones selectores, y en donde I el primer y segundo organismos son diferentes (incluyendo pero no limitados a, cada organismo está opcionalmeiite, incluyendo pero no limitado a, un procariota, ¡ un I eucariota, un mamífero, un Escherichia coli , un hongo,' un I levadura, una arqueobacteria, una eubacteria, una planta, I un insecto, un protista, etc.) . También, algunos i aspectos incluyen cuando el marcador de selección I negativa comprende un gen ribonucleasa barnasa (que comprende al menos un codón selector) . Otros aspectos incluyen en donde el marcador de supervisión opcionalmente comprende un marcador de supervisión luminiscente o fluorescente o un marcador de supervisión I basado en afinidad. En las presentes modalidades, las supervisiones y/o selecciones opcionalmente incluyen i variación de la severidad de supervisión y/o selección., En una modalidad, los métodos para producir al i menos una aminoacil ortogonal -tRNA sintetasa recombinahte (O-RS) además pueden comprender: (d) aislar la Oj-RS recombinante; (e) generar un segundo conjunto de 0,-RS (opcionalmente mutada) derivada de al menos una 0¡-RS recombinante; y (f) repetir las etapas de (b) y (c) hasta que una O-RS mutada se obtiene que comprende una capacidad para aminoacilar preferencialmente la O-tRNA.

Opcionalmente, se repiten las etapas (d) - (f) , incluyendo pero no limitado a, cuando menos aproximadamente dos veces. En un aspecto, el segundo juego de O-RS mutadas derivadas de al menos una O-RS recombinante puede generarse por mutagénesis, incluyendo pero no limitada a, mutagénesis aleatoria, mutagénesis específica de sitio, recombinación o una combinación de las mismas. I La severidad de las etapas I de selección/supervisión, incluyendo pero no limitadas a,, la etapa de selección/supervisión positiva (b) , al etapa de supervisión/selección negativa (c) o tanto las etapas¡ de selección/supervisión positivas y negativas (b) y (c) ,¡ en i los métodos anteriormente descritos, opcionalmente incluyen variar la severidad de selección/supervisión.

En otra modalidad, la etapa de selección/supervisión I positiva (b) , la etapa de selección/supervisión negativa (c) o ambas etapas de supervisión/selección positivas y negativas (b) y (c) comprenden utilizar un reportero, ' en I donde el reportero se detecta por clasificación | de i células activada por fluorescencia (FACS = fluorescence-activated cell sorting) o en donde el reportero , se detecta por luminiscencia. Opcionalmente, el reportero se exhibe en una superficie celular, en una exhibición I fago o semejantes y se elige con base en afinidad o actividad catalítica que involucra el amino ácido no-naturalmente codificado o un análogo. En una modalidad, la sintetasa mutada se exhibe en una superficie celular, en un exhibidor fago o semejantes. Métodos para producir un tRNA ortogonal I recombinante (O-tRNA) incluyen: (a) generar ¡una biblioteca de tRNAs mutantes derivados de al menos ¡ un tRNA, incluyendo pero no limitado a, un tRNA supresor,? de i un primer organismo; (b) seleccionar (incluyendo pero no I limitado a, seleccionar negativamente) o supervisar, la biblioteca para tRNAs (opcionalmente mutantes) que' se i aminoacilan por una aminoacil -tRNA sintetasa (RS) de1 un segundo organismo en la ausencia de una RS del primer organismo, proporcionando de esta manera un conjuntd de tRNAs (opcionalmente mutantes) ; y, (c) seleccionar o I supervisar el conjunto de tRNAs (opcionalmente mutantes) por miembros que están aminoacilados por una RS ortogonal (O-RS) introducida, proporcionando de esta manera cuando i menos un O-tRNA recombinante; en donde el O-tRNA recombinante como mínimo reconoce un codón selector y i no I se reconoce eficientemente por la RS del segundo organismo y se aminoacila preferencialmente por la O-RS. En algunas modalidades el tRNA como mínimo es un tRNA supresor y/o comprende un codón de tres bases único ' de I bases naturales y/o no naturales, o es un codón sin sentido, un codón raro, un codón no natural, un codón que I comprende al menos 4 bases, un codón ámbar, un codón ocre, o un codón de parada ópalo. En una modalidad, 'la OtRNA recombinante posee una mejora de ortogonalidad. ' Se apreciará que algunas modalidades, O-tRNA se importa opcionalmente en un primer organismo de un segundo i organismo sin necesidad por modificación. En diversas modalidades, el primero y segundo organismos ya son i iguales o diferentes y se eligen opcionalmente de, incluyendo pero no limitado a, procariotas (incluyendo I pero no limitado a, Methanococcus jannaschii , Methanobacteium thermoautotrophicum, Escherichia coli , Halobacterium, etc. ) , eucariotas, mamíferos, hongos, I levaduras, arqueobacterias, eubacterias, plantas, insectos, protistas, etc. Adicionalmente, el tRNA I recombinante se aminoacila opcionalmente por un amino ácido no naturalmente codificado, en donde el amino ácido no-naturalmente codificado se biosintetiza in vivo ya sea naturalmente o a través de manipulación genética. El amino ácido no-naturalmente codificado se agrega opcionalmente a un medio de crecimiento para al menos el primero o segundo organismos. En un aspecto, la selección (incluyendo pero ¡ no limitado a selección negativa) o supervisión de biblioteca para tRNAs (opcionalmente mutantes) que ¡se aminoacilan por una aminoacil-tRNA sintetasa (etapa (b) ) incluye: introducir un gen marcador tóxico, en donde el I gen marcador toxico comprende cuando menos uno de los codones selectores (o un gen que lleva a la producción ¡ de un agente tóxico o estático o un gen esencial al I organismo en donde este margen marcador comprende cuando menos un codón selector) y la biblioteca de tRNAs (opcionalmente mutantes) en una pluralidad de células del segundo organismo; y seleccionar células supervivientes, en donde las células supervivientes contienen el conjunto i de tRNAs (opcionalmente mutantes) que comprenden cuando menos un tRNA ortogonal o tRNA no funcional. Por ejemplo, células supervivientes pueden seleccionarse al utilizar un ensayo de densidad celular de proporción ¡de i comparación.

I i En otro aspecto, el gen marcador tóxico puede incluir dos o más codones selectores. En otra modalid Iad de los métodos, el gen marcador tóxico es un gen I ribonucleasa barnasa, en donde el gen ribonucleasa barnasa comprende al menos un condón ámbar. Opcionalmente, el gen ribonucleasa barnasa puede incluir dos o más codones ámbar. En una modalidad, la selección o supervisión I del conjunto de tRNAs (opcionalmente mutantes) para I miembros que son aminoacilados por una RS ortogonal ¡(O- i RS) introducida pueden incluir: introducir un gen i marcador de supervisión o selección positiva, en donde) el gen marcador positivo comprende un gen de resistencia a droga (incluyendo pero no limitado a gen /?-lactamasa, que comprende cuando menos uno de los codones selectores, I tal como al menos un codón de parada ámbar) o un ¡gen i esencial al organismo, o un gen que lleva a ' la I desintoxicación de un agente tóxico, junto con la O-RS, y el conjunto de tRNAs (opcionalmente mutantes) en una pluralidad de células del segundo organismo; ' e i identificar células supervivientes o supervisadas qué se desarrollan en la presencia de un agente de selección o supervisión, incluyendo pero no limitado a ¡ un antibiótico, de esta manera proporcionando un conjunto de células que poseen el tRNA recombinante como mínimo,i en i donde el tRNA recombinante como mínimo se aminoacila por el O-RS e inserta un aminoácido en un producto j de traducción codificado por el gen marcador positivo, ¡en respuesta a los codones selectores como mínimo. En otra modalidad, la concentración del agente de selección y/o supervisión se varía. i Métodos para generar pares 0-tRNA/0LRS específicos se proporcionan. Métodos incluyen: ¡(a) generar una biblioteca de tRNAs mutantes derivada dei al i menos un tRNA de un primer organismo; (b) seleccionar negativamente o supervisar la biblioteca para tRNAs (opcionalmente mutantes) que se aminoacilan por ¡una aminoacil -tRNA sintetasa (RS) de un segundo organismo! en la ausencia de un RS del primer organismo, de esta manera proporcionando un conjunto de tRNAs (opcionalmente I mutantes) ; (c) seleccionar o supervisar el conjunto de I tRNAs (opcionalmente mutantes) para miembros que ' se I aminoacilan por una RS ortogonal (O-RS) introducida, de esta manera proporcionando cuando menos un O-tRNA ! recombinante. El O-tRNA recombinante como mínimo recon Ioce un codón selector y no se reconoce eficiencia por la RS del segundo organismo y de preferencia se aminoacila | por la O-RS. El método también incluye (d) generar ¡una biblioteca de RSs (opcionalmente mutantes) derivados1 de al menos una aminoacil -tRNA sintetasa (RS) de un tercer i I organismo; (e) seleccionar o supervisar la biblioteca de RSs mutantes para miembros que aminoacilan I preferencialmente el O-tRNA recombinante en la presencia de un aminoácido no naturalmente codificado y i un aminoácido natural de esta manera proporcionando i un conjunto de RSs activos (opcionalmente mutantes) ; y, (f) seleccionar o supervisar en forma negativa el conjunto para RSs (opcionalmente mutantes) activas que ¡ de preferencia aminoacilan el O-tRNA recombinante como I mínimo en la ausencia de aminoácido no naturalmente I codificado, de esta manera proporcionando el par i 0-tRNA/0- RS específico como mínimo, en donde el par ¡ 0-tRNA/0-RS específico como mínimo comprende cuando menos una O-tRNA recombinante que se especifica para el aminoácido no naturalmente codificado y el O-tRNA recombinante como mínimo. Pares O-tRNA/0-RS específicos I producidos por los métodos se incluyen. Por ejemplo el par 0-tRNA/O-RS específico puede incluir, incluyendo p¡ero i no limitado al par mutRNATyr-mutTyrRS, tal como un ¡par rnutRNATyr-SS12TyrRS, un par mutRNALeu- mutLeuRS, un par mutRNAThr-mutThrRS, un par mutRNAGlu-mutGluRS, ' o I semejantes. Adicionalmente, estos métodos incluyen, cuando el primer y tercer organismos son iguales i (incluyendo pero limitados a Methanococcus jannaschii ) '. Métodos para seleccionar un par iRNA-tRNA i i sintetasa ortogonal para utilizar en un sistema de traducción in vivo de un segundo organismo, también ' se incluyen en la presente invención. Los métodos incluyen: introducir un gen marcador, un tRNA y una aminoacil -tRNA sintetasa (RS) aislada o derivada del primer organismo! en un primer conjunto de células del segundo organismo; ¡ introducir el gen marcador y el tRNA en un conjunto ¡ de células duplicado de un segundo organismo; y seleccionar las células supervivientes en el primer conjunto que I fallan en sobrevivir en el conjunto de células duplicado ¡ o supervisar células que muestran una respuesta I de supervisión específica que fallan en dar esta respuesta i en el conjunto de células duplicado, en donde el primer I conjunto y el conjunto de células duplicado | se i desarrollan en la presencia de un agente de selección o supervisión, en donde las células supervivientes) o supervisadas comprenden el par tRNA-tRNA sintetasa i ortogonal para utilizar en le sistema de traducciónl in i vivo del segundo organismo. En una modalidad, comparar y seleccionar o supervisar incluye un ensayo ( de complementación in vivo . La concentración del agentej de selección o supervisión puede variarse. I Los organismos de la presente invención comprenden una variedad de organismos y una variedad de combinaciones. Por ejemplo, el primer y segundo organismos de los métodos de la presente invención pueden I ser iguales o diferentes. En una modalidad, los organismos son opcionalmente un organismo procariótico, incluyendo pero no limitados a Methanococcus jannaschii , Methanobacte ium t ermoautotrop icu/n, ííalojbacteri?ín, Escherichia coli , A . fulgidus, P. furiosus, P. horikoshii , A . pernix, T. thermophilus, o semejantes. En I forma alterna, los organismos opcionalmente comprenden ¡ un organismo eucariótico, incluyendo pero no limitado1 a plantas (incluyendo pero no limitado a, plantas complejas tales como monocotiledóneas, o dicotiledóneas), algas, i protistas, hongos (incluyendo pero no limitados ¡ a, levadura, etc.), animales (incluyendo pero no limitado' a, mamíferos, insectos, artrópodos, etc.), o semejantes.. En otra modalidad, el segundo organismo es un organi'smo i procariótico, incluyendo pero no limitado J a, Methanococcus jannaschii , Methanobacterium ! thermoautotrophicum, Halobacterium, Escherichia coli , \ A . fulgidus, Halobacterium, P. furiosus, P. horikoshii , A . I pernix, T. thermophilus, o semejantes. En forma alterna, el segundo organismo puede ser un organismo eucariótico, I incluyendo pero no limitado a, una levadura, una célula de animal, una célula de planta, un hongo, una célula1 de i mamífero o semejantes. En diversas modalidades el primer y segundo organismo son diferentes. i I VI. Ubicación de los aminoácidos que no son de origen natural en ABP \ La presente invención contempla incorporar uno o más aminoácidos que no son de origen natural en ABP. Uno o más aminoácidos que no son de origen natural pueden incorporarse en una función particular que no interrumpe la actividad del polipéptido. Esto puede lograrse al hacer sustituciones "conservadoras", incluyendo pero (no limitado a, sustituir a aminoácidos hidrofóbicos cion | aminoácidos hidrofóbicos, aminoácidos voluminosos por aminoácidos voluminosos, aminoácidos hidrofílicos por aminoácidos hidrofílicos y/o insertar el aminoácido que no es de origen natural en un sitio que no se requiere para actividad. Una variedad de enfoques bioquímicos I estructurales puede emplearse para seleccionar los sitios deseados para sustitución con un aminoácido ' no i naturalmente codificado dentro del polipéptido de enlace I antígeno. Es fácilmente aparente para aquellos con destreza en la técnica que cualquier posición de ! la cadena polipéptido es adecuada para selección para incorporar un aminoácido no naturalmente codificado, y, la selección puede basarse en un diseño racional o por I selección aleatoria para cualquiera o ningún propósito I deseado particular. La selección de los sitios deseados puede ser para producir una molécula ABP que tiene cualquier propiedad o actividad deseada, incluyendo pero no limitada a, agonistas, super-agonistas, agonistas inversos, antagonistas, moduladores de enlace receptor, moduladores de actividad de receptor, formación de dímero o multímero, sin cambio de actividad o propiedad en comparación con la molécula nativa, o manipular cualquier propiedad física o química del polipétido tal como solubilidad, agregación o estabilidad. Por ejemplo, ubicaciones en le polipéptido recibido para actividad biológica de ABP pueden identificarse utilizando métodos de exploración de homólogo o exploración de alanina conocidos en la técnica. Residuos diferentes a aquellos identificados como críticos para actividad biológica por mutagénesis de exploración o de homólogo o alanina pueden ser buenos candidatos para sustitución con un aminoácido no naturalmente codificado dependiendo de la actividad deseada que se busca para el polipéptido. En forma alterna, los sitios identificados como críticos para actividad biológica también pueden ser buenos candidatos para sustitución con un aminoácido no naturalmente codificado, de nuevo dependiendo de la actividad deseada que se busca para el polipéptido. Otra alternativa sería simplemente hacer sustituciones en serie en cada posición en la cadena polipéptido con un aminoácido no naturalmente codificado y observar el efecto en las actividades del polipéptido. Es fácilmente aparente para I aquellos con destreza en la técnica que cualesquiera I medios, técnica o método para seleccionar una posición para sustitución con un aminoácido no natural ¡en cualquier polipéptido, es adecuado para utilizar en ,1a presente invención. | Una vez que los residuos son probables sean intolerantes a sustitución con aminoácidos ' no i naturalmente codificados se han eliminado, el impacto | de I sustituciones propuestas en cada una de las posiciones restantes puede examinarse de la estructura secundaria, terciaria o cuaternaria, o la estructura de cristal I de tres dimensiones del polipéptido de enlace de antígen? y sus socios de enlace. De esta manera, aquellos con destreza en la técnica pueden identificar fácilmente i posiciones que pueden sustituirse con aminoácidos I no naturalmente codificados. i i Residuos ejemplares de incorporación de ¡ un i aminoácido no natural incluyen pero no están limitados a I aquellos que se excluyen de regiones de enlace i de i antígeno potenciales, pueden ser total o parcialmente I expuestos a solvente, tienen interacciones de enlace,1 de I hidrógeno mínimas o nulas con residuos cercanos, pueden ser expuestos en forma mínima a residuos reactivos I cercanos, pueden estar en una o más de las caras i expuestas del ABP, pueden ser un sitio o sitios de ABP que se yuxtaponen a un segundo ABP u otra molécula o su fragmento, pueden estar en regiones que son altamente flexibles o estructuralmente rígidas, como se pronostica por la estructura tridimensional secundaria, terciaria o I cuaternaria de ABP, ligados o sin ligar a su antígeno, o acoplados o no acoplados a otro ABP u otra molécµla I biológicamente activa, o pueden modular la conformación del propio ABP o un dímero o multímero que comprende uno o más ABP, alterando la flexibilidad o rigidez de la i estructura completa según se desee. Residuos para incorporación de aminoácidos no naturales pueden ser parte de una secuencia de escisión, secuencia enlazadpra que une fragmentos de anticuerpo o ABPs, dominio de enlace anticuerpo (incluyendo pero no limitado a, etiqueta myc, FLAG o poly-His) u otra secuencia basada¡ en afinidad (incluyendo pero no limitado a, FLAG, poly-His, i GST, etc.) . Residuos para incorporación de un aminoácido no natural pueden ser residuos N-terminales o C-terminales de un ABP, residuos sin enlace de antígeno de i un ABP. ¡ i Una amplia variedad de aminoácidos ¡ no naturalmente codificados puede sustituirse por, o incorporarse en una posición determinada en ABP. En general, un aminoácido no naturalmente codificado ¡se i elige para incorporación con base en un examen de I la estructura de cristal tridimensional de ABP con j su antígeno o la estructura secundaria, terciaria : o cuaternaria de ABP determinada por cualesquiera otros medios, una preferencia para sustituciones conservadoras i (es decir aminoácidos no naturalmente codificados basados en arilo, tales como p-acetilfenilalanina o ¡ 0-propargiltirosina que sustituyen Phe, Tyr o Trp), y ' la química de conjugación específica que se desea introducir I en el polipéptido de enlace de antígeno (por ejemploj la introducción de 4- azidofenilalanina si se desea efectuar una cicloadición Huisgen [3+2] con un polímero solublel en agua que tiene una porción alquino o una formación I de enlace amida con un polímero soluble en agua que contiene un arilo éster que a su vez incorpora una porción I fosfina) . ! i En una modalidad, el método además incluye incorporar en la proteína el aminoácido no natural, j en donde el aminoácido no natural comprende un primer grupo reactivo, y contactar la proteína con una molécula I (incluyendo pero no limitado a, una etiqueta, ¡ un colorante, un polímero, un polímero soluble en agua,¡ un derivado de polietilen glicol, un fotoentrelazador,' un radionúclido, un compuesto citotóxico, una droga, una I etiqueta de afinidad, una etiqueta de fotoafinidad, un compuesto reactivo, una resina, una segunda proteína1 o polipéptido o análogo polipéptido, un anticuerpo ¡ o fragmento de anticuerpo, un quelador de metal, ! un cofactor, un ácido graso, un carbohidrato, , un polinucleótido, un DNA, un RNA, una polinucleótido antisentido, un dendrímero soluble en agua, µna ciclodextrina, un ácido ribonucleico inhibitorio, , un biomaterial, una nano partícula, una etiqueta espín, ¡un fluoróforo, una porción que contiene metal, una porción I radioactiva, un grupo funcional novedoso, un grupo que interactúa en forma covalente o no covalente con otras moléculas, una porción fotoenjaulada, una porción fotoisomerizable, biotina, un derivado de biotina, un análogo de biotina, una porción que incorpora un átomo pesado, un grupo de escisión química, un grupo fotoescindible, una cadena lateral alargada, un azúcar enlazado con carbono, un agente redox activo, un amino tioácido, una porción tóxica, una porción isotópicamente etiquetada, una sonda biofísica, un grupo fosforescente, un grupo quimioluminiscente, un grupo denso ' en electrones, un grupo magnético, un grupo intercalado, ' un i cromóforo, un agente de transferencia de energía, . un i agente biológicamente activo, una etiqueta detectadle, i una molécula pequeña o cualquier combinación de ¡los I i I I I I I I anteriores, o cualquier otro compuesto o sustancia deseable) que comprenda un segundo grupo reactivo. ¡ El primer grupo reactivo reacciona con el segundo grupo i reactivo para conectar la molécula al aminoácido | no natural a través de una cicloadición [3+2] . En una modalidad, el primer grupo reactivo es una porción alquinilo o azido y el segundo grupo reactivo es una porción azido o alquinilo. Por ejemplo, el primer grµpo reactivo es la porción alquinilo (incluyendo pero ' no limitada a, un aminoácido no natural ' p-propargiloxifenilalanina) y el segundo grupo reactivoj es la porción azido. En otro ejemplo, el primer grupo reactivo es la porción azido (incluyendo pero a, en el aminoácido no natural p-azido-L-fenilalanina) y el segundo grupo reactivo es la porción alquinilo. j En algunos casos, la o las sustituciones I aminoácido no naturalemnte codificado se combinarán ¡con otras adiciones sustituciones o eliminaciones dentro del polipéptido de enlace de antígeno para afectar otras características biológicas de ABP. En algunos casos, ¡las i otras adiciones, sustituciones o eliminaciones pueden aumentar la estabilidad (incluyendo pero no limitado¡ a, i resistencia a degradación proteolítica) del ABP' o incrementar la afinidad del ABP para un receptor o antígeno de ABP. En algunos casos, las otras adiciones, i I sustituciones o eliminaciones pueden aumentar | la solubilidad (incluyendo pero no limitado a, cuando se i expresa en E. coli u otras células anfitrionas) del polipéptido de enlace de antígeno. En algunas modalidades, adiciones, sustituciones o eliminaciones pueden aumentar la solubilidad de polipéptido después , de expresión en E. coli u otras células anfitrionas recombinantes. En algunas modalidades, se eligen sitios i para sustitución con un aminoácido naturalmente i codificado o no natural además de otro sitio para i i incorporación del aminoácido no natural que resulta j en aumentar la solubilidad de polipéptido expresión en E. coli u otras células recombinantes. En algunas modalidades, los polipéptijdos de enlace de antígeno comprenden otra adición sustitución o eliminación que modula la afinidad para el receptor i ABP, modula (incluyendo pero no limitado a, aumenta o disminuye) la dimerización de receptor, estabiliza i dímeros receptores, modula vida media en circulación, modula liberación o biodisponibilidad, facilita purificación o mejora o altera una ruta de administración i particular. Similarmente, polipéptidos de enlace de i I antígeno pueden comprender secuencias de escisión \ de enzimas o química, secuencias de escisión de proteasa, grupos reactivos, dominios de enlace de anticuerpo (incluyendo pero no limitados a, FLAG o poly-His) u otras i secuencias basadas en afinidad (incluyendo pero no limitadas a, FLAG, poly-His, GST, etc.) o moléculas I enlazadas (incluyendo pero no limitadas a, biotina) que I mejoran la detección (incluyendo pero no limitadas ¡a , GFP) , purificación, transporte a través de tejidos( o i membranas celulares, liberación o activación de prodroga, I reducción de tamaño de ABP u otros rasgos del i polipéptido. ¡ En algunos casos, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, ¡9, 10, o más aminoácidos se sustituyen con uno o más aminoácidos no naturalmente codificados. En algunos casos, el Abp además incluye 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, o más sustituciones de uno o más aminoácidos I no naturalmente codificados para aminoácidos de origen I natural. En algunas modalidades, al menos dos residuos) en las siguientes regiones de ABP se sustituyen con uno o i más aminoácidos no naturalmente codificados. En algunos casos, los dos o más residuos no naturalmente codificados i se enlazan a uno o más PEGs lineales o ramificados' de i menor peso molecular (aproximadamente 5 a 20 kDa en mas o menos) mejorando de esta manera la afinidad de enlace y i vida media en suero comparable respecto a las especies conectadas a un PEG de peso molecular superior, sencillo. En algunas modalidades, hasta dos de 'los residuos de un polipéptido de enlace de antígeno se substituyen con uno o más amino ácidos no naturalmente codificados . VII. Expresión en No-eucariotas y Eucariotas Para obtener expresión de alto nivel de un polinucleótido ABP clonado, típicamente se sub-clonan polinucleótidos que codifican un polipéptido de enlace de i antígeno de la invención en un vector de expresión que contiene un fuerte promotor a transcripción directa, un terminador de transcripción/traducción, y si un ácido nucleico que codifica una proteína, un sitio de enlace de ribosoma para inicio de traducción. Promotores bacterianos convenientes son bien conocidos en ' la especialidad y descritos por ejemplo en Sambrook et al . y Ausubel et al . Sistemas de expresión bacteriana para expresar polipéptidos ABP de la invención están disponibles en, incluyendo pero no limitado a, E. coli , Bacillus sp . , I Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas putida, y Salmonella (Palva et al., Gene 22:229- 235 (1983); Mosbach et al., Nature 302:543-545 (1983) ) . Equipos para estos sistemas de expresión están comercialmente disponibles. Sistemas de expresión eucarióticos para células de mamífero, levadura y células de insecto son bien conocidos en la especialidad y también están comercialmente disponibles. En casos en donde los tRNAs ortogonales y aminoacil tRNA sintetasas (descritas anteriormente) se emplean para expresar los polipéptidos de enlace de antígeno de la invención, células anfitrionas para expresión se eligen con base¡ en su habilidad para utilizar los componentes ortogonales. Células anfitrionas ejemplares incluyen bacterias Gr¡am-positivas (incluyendo pero no limitadas a B . Jbrevis, , B . subtilis, or Streptomyces) y bacterias Gram-negativas '(£*. i coli , Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas aerugin?sa, Pseudomonas putida) , así como levadura y otras células eucarióticas. Células que comprenden pares O-tRNA/ -RS pueden emplearse como aquí se describe. I Una células anfitriona eucariótica o una céliula anfitriona no-eucariótica de la presente invención proporciona la capacidad para sintetizar proteínas ¡que comprenden amino ácidos no naturales en grandes cantidades útiles. En un aspecto, la composición opcionalmente incluye, incluyendo pero no limitado, a, I cuando menos 10 microgramos, al menos 50 microgramos, al menos 75 microgramos, al menos 100 microgramos, al menos 200 microgramos, al menos 250 microgramos, al menos 1500 microgramos, al menos 1 miligramo, al menos ¡ 10 miligramos, al menos 100 miligramos, al menos un gramo, o más de la proteína que comprenden un amino ácido! no natural, o una cantidad que puede lograrse con los métodos de producción de proteínas in vivo (detalles ¡de la producción de protema recombinante y purificación aquí se proporcionan) . En otro aspecto, la proteína está opcionalmente presente en la composición a una concentración de, incluyendo pero no limitada a cuando menos 10 microgramos de proteína por litro, a cuando menos 50 microgramos de proteína por litro, a cuando I menos 75 microgramos de proteína por litro, a cuando menos 100 microgramos de proteína por litro, a cuando menos 200 microgramos de proteína por litro, a cuando menos 250 microgramos de proteína por litro, a cuando i menos 500 microgramos de proteína por litro, a cuando menos 1 miligramo de proteína por litro, o cuando menos I I 10 miligramos de proteína por litro o más en, incluyendo pero no limitado a un lisado celular, un amortiguador,' un amortiguador farmacéutico u otra suspensión líquida (incluyendo pero no limitado a, en un volumen ¡de, incluyendo pero no limitado a, en cualquier punto desde aproximadamente 1 ni a aproximadamente 100 L) . La producción de grandes cantidades (incluyendo pero i no limitado a, mayor que lo típicamente posible con otros métodos, incluyendo pero no limitado a, traducción! in vitro) de una proteína en una célula eucariótica, incluyendo al menos un amino ácido no natural es i una i i I característica de la invención. i Una célula anfitriona eucariótica o célu 1la anfitriona no eucariótica de la presente invención proporciona la capacidad para biosintetizar proteínas que comprenden amino ácidos no naturales en grandes cantidades útiles. Por ejemplo, proteínas que comprenden un amino ácido no natural pueden producirse a una concentración incluyendo pero no limitada cuando menosi 10 µg/litro, al menos 50 µg/litro, al menos 75 µg/litro, ¡ al menos 100 µg/litro, al menos 200 µg/litro, al menos ¡250 µg/litro, o al menos 500 µg/litro, al menos 1 mg/litro, al menos 2 mg/litro, al menos 3 mg/litro, al menos 4 mg/litro, al menos 5 mg/litro, al menos 6 mg/litro, ! al menos 7 mg/litro, al menos 8 mg/litro, al menos 9 mg/litro, al menos 10 mg/litro, al menos 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 8,00, 900 mg/litro, 1 g/litro, 5 g/litro, 10 g/litro o más¡ de proteína en un extracto celular, lisado celular, medio de cultivo, un amortiguador y/o semejantes. ¡ I I . Sistemas de Expresión, Cultivo y Aislamiento ¡ ABP puede expresarse en cualquier cantidad] de sistemas de expresión convenientes, incluyendo ipor I ejemplo, levadura, células de insecto, células , de i mamífero y bacterias. Una descripción de los sistemas de expresión ejemplares se proporciona a continuación. ¡ I I Levadura Como se emplea aquí, el término "levadura" incluye cualquiera de las diversas levaduras I capaces de expresar un gen que codifica ABP. Estas levaduras incluyen pero no están limitadas a, levaduras ascosporogenas (Endomycetales) , levaduras basidiosporogenas y levaduras que pertenecen al grupo de hongos imperfectos (Blastomycetes) . Las levaduras ascosporogenas se dividen en dos familias, Spermophthoraceae y Saccharomycetaceae . La última i comprende cuatro sub-familias, Schizosaccharomycoideae I (por ejemplo género Schizosaccharomyces) , Nadsonioideae, Lipomycoideae y Saccharomycoideae (e.g., genera Pichia, Kluyveromyces y Saccharomyces) . Las levaduras I basidiosporogenas incluyen los géneros Leucosporidium, Rhodosporidium, Sporidiobolus, Filobasidium, ' y Filobasidiella . Levaduras que pertenecen al grupo, de Hongos Imperfectos (Blastomycetes) se dividen en ¡dos i familias, Sporobolomycetaceae (e.g., genera Sporobolomyces y Bullera) y Cryptococcaceae (e.g., génus Candida) . De interés particular para utilizar con ' la presente invención están especies dentro de los géneros Pichia, Kluyveromyces, Saccharomyces, i Schizosaccharomyces, Hansenula, Torulopsis, y Candida, I incluyendo pero no limitados a, P. pastoris, < P. I I I guillerimondii, S. cerevisiae, S. carlsbergensis, ¡S. diastaticus, S. douglasii, S. kluyveri, S, norbensis, ¡ S . oviformis, K. lactis, K. fragilis, C. albicans, ?C. maltosa, y H. polimorpha. I La selección de levadura conveniente para expresión de ABP está dentro de la destreza de una persona con destreza ordinaria en la especialidad. Para seleccionar huéspedes o anfitriones de lavadura para expresión, anfitriones convenientes pueden incluir aquellos mostrados que tienen por ejemplo, buena capacidad de secreción, baja actividad proteolítica, I buena capacidad de secreción, buena producción ¡ de proteína soluble, y robustez total. Las levaduras ¡ en general están disponibles de una variedad de fuentes, incluyendo pero no limitadas a, Yeast Genetic St'ock Center, Department of Biophysics y Medical Physics, i University of California (Berkeley, CA) , y the American Type Culture Collection ("ATCC") (Manassas, VA). iI I El término "anfitrión de levadura" o "célula I anfitriona de levadura" incluye levadura que puede ser o se ha empleado como un recipiente para vectoires i recombinantes u otro DNA de transferencia. El término incluye la progenie de la célula anfitriona de levadura i original que ha recibido los vectores recombinantes u otro DNA de transferencia. Se entiende que la progenie de una sola célula parental o padre puede no necesariamente ser completamente idéntica en morfología o en complemento DNA genómico o total al padre original, debido a mutación accidental o deliberada. La progenie de la célula padre que son suficientemente similares a los padres, a caracterizarse por la propiedad relevante, tal como la presencia de una secuencia nucleótido que codifica ABP, se incluyen en la progenie pretendida por esta definición. Vectores de expresión y transformación, incluyendo replicones extracromosomales o vectores de integración, se han desarrollado para transformar en muchos anfitriones de levadura. Por ejemplo, se han desarrollado vectores de expresión para S . cerevisiae (Sikorski et al., GENETICS (1998) 112:19; Ito et al., BACTERIOL. (1983) 153:163; Hinnen et al., PROC NATL . ACAD. SCI. USA (1978) 75:1929); C. albicans (Kurtz ¡ et al., MOL. CELL. BIOL. (1986) 6:142); C. maltosa (Kunze et al., J. BASIC MICROBIOL. (1985) 25:141); H. polimorpha (Gleeson et al., J. GEN. MICROBIOL. (1986) 132:34 59; Roggenkamp et al., MOL. GEN. GENET. (1986) 202:302); K. fragilis (Das et al., J. BACTERIOL. (1984) 158:1165); K. lactis (De Louvencourt et al., J. BACTERIOL. (1983) 154:737; Van den Berg et al., BIO/TECHNOLOGY (1990) 8:135); P. guillerimondii (Kunze et al., J. BASIC MICROBIOL. (1985) 25:141); P. pastoris (Patentes de los E.U.A. Nos. 5,324,639; 4,929,555; y 4,837,148; Cregg ' et al., MOL. CELL. BIOL. (1985) 5:3376); Schizosaccharomyces pombe (Beach y Nurse, NATURE (1981) 300:706); y lipolitica (Davidow et al., CURR. GENET. (1985) 10:380 (1985); Gaillardin et al., CURR. GENET. (1985) 10:49); I A. nidulans (Ballance et al., BIOCHEM. BIOPHYS. RES. COMMON. (1983) 112:284-89; Tilburn et al. 221; y Yelton et al., PROC. NATL. 81:1470-74); A. niger (Kelly y Hynes, EMBO J. (1985) 4:475479); T. reesia (EP 0 244 234); y hongos I filamentosos tales como Neurospora, Penicillium, Tolypocladium (WO 91/00357) , cada uno incorporada aquí por referencia. Secuencias de control para vectores de levadura i son bien conocidas por aquellos con destreza ordinaria' en la especialidad e incluyen pero no están limitados a regiones promotoras de genes tales como alcohol i dehidrogenasa (ADH) (EP 0 284 044) ; enolasa; glucocinasa; glucosa-6-fosfato isomerasa; gliceraldehidos-3-fosfato-dehidrogenasa (GAP o GAPDH) ; hexoquinasa; fosfofructocinasa; 3-fosfoglicerato mutasa; y piruvato cinasa (PyK) (EP 0 329 203) . El gen PH05 de levadura, que codifica fosfatasa acida, también puede proporcionar i secuencias promotoras útiles (Myanohara et al, PRÓC.

NATL. ACAD. SCI. USA (1983) 80:1). Otras secuencias promotoras convenientes para utilizar con los anfitriones de levadura pueden incluir los promotores para 3-fosfoglicerato cinasa (Hitzeman et al., J. BIOL. CHEM. (1980) 255:2073); y otras enzimas glicolíticas, tales como piruvato decarboxilasa, triosefosfato isomerasa1 y fosfoglucosa isomerasa (Holland et al., BIOCHEMISTRY (1978) 17:4900; Hess et al., J. ADV. ENZYME REG. (19¡68) 7:149). Promotores de levadura inducibles que tienen¡ la ventaja adicional de transcripción controlada por lias condiciones de crecimiento pueden incluir las regiones promotoras alcohol dehidrogenasa 2; isocitocromo C; fosfatasa acida; metalotioneina; gliceraldehido-3-fosfato I dehidrogenasa; enzimas degradativas asociadas con metabolismo de nitrógeno; y enzimas responsables por I utilización de maltosa y galactosa. Vectores i y | promotores convenientes para utilizar en expresión j de i levadura se describen adicionalmente en EP 0 073 657. < Mejoradores de levadura también pueden i emplearse con promotores de levadura. Además, promotores sintéticos también pueden funcionar como promotores1 de levadura. Por ejemplo, las secuencias de activasión corriente arriba (UAS = upstream activating sequences)? de i un promotor de levadura pueden unirse con la regiónj de activación de transcripción de otro promotor de levadura, i creando un promotor híbrido sintético. Ejemplos de estos promotores híbridos incluyen la secuencia regulatoria ADH enlazada con la región de activación de transcripción GAP. Ver las patentes de los E.U.A. Nos. 4,880,734 y 4,876,197, que se incorporan aquí por referencia. Otros i ejemplos de promotores híbridos incluyen promotores que capacidad por ligar RNA polimerasa de levadura e iniciar la transcripción. Otros elementos de control que pueden comprender parte de los vectores de expresión de levadura incluyen terminadores, por ejemplo de GAPDH o los genes enolasa (Holland et al., J. BIOL. CHEM. (1981) 256:1385).

Además, el origen de replicación del origen plásmido 2 µ i es adecuado para levadura. Un gen de selección conveniente para utilizar en levadura es el gen tirpl I presente en el plásmido de levadura. Ver Tschemper ¡ et i al., GENE (1980) 10:157; Kingsman et al., GENE (19¡79) 7:141. El gen trpl proporciona un marcador de selección para una cepa mutante de levadura que carece de ¡ la capacidad para desarrollar en triptofano. Similarmente, cepas de levadura deficiente Leu2 (ATCC 20,622 o 38,626) se complementan por plásmidos conocidos que tienen el gen Leu2. I Métodos para introducir DNA exógeno ! en anfitriones de levadura son bien conocidos por aquellos con destreza ordinaria en la especialidad, y típicamente incluyen pero no están limitados, a cualquiera de ! la i transformación de esferoplastos o de células anfitrionas de levadura intactas tratadas con cationes alcalinos. i Por ejemplo, la transformación de levadura puede llevarse a cabo de acuerdo con el método descrito en Hsiao et al, I PROC. NATL. ACAD. SCI. USA (1979) 76:3829 y Van Solingen ¡ et al, J. BACT. (1977) 130:946. Sin embargo, otros métodos para introducir DNA en células tales como por inyección nuclear, electroporación, o fusión ¡de [ protoplastos también pueden emplearse como se describe generalmente en SAMBROOK ET AL . , MOLECULAR CLONING : i A LAB. MANUAL (2001) . Células anfitrionas de levadura pueden entonces cultivarse utilizando técnicas estándar conocidas por aquellos con destreza ordinaria en ¡la especialidad. ¡ Otros métodos para expresar proteínas heterólogas en células anfitrionas de levadura son bien conocidos por aquellos con destreza ordinaria en la especialidad. Ver en general la publicación de patente de los E.U.A. No. 20020055169, las patentes de los E.ULA. Nos. 6,361,969; 6,312,923; 6,183,985; 6,083,723; 6,017,731; 5,674,706; 5,629,203; 5,602,034; y 5,089,398; las patentes re-examinadas de los E.U.A. Nos. RE37,343 y RE35,749; las solicitudes de patentes publicadas PCT ¡ WO I 99/078621; WO 98/37208; y WO 98/26080; solicitudes ! de patentes europeas EP 0 946 736; EP 0 732 403; EP 0 480 i 480; EP 0 460 071; EP 0 340 986; EP 0 329 203; EP 0 324 I 274; y EP 0 164 556. Ver también Gellissen et al., ANTONIE VAN LEEUWENHOEK (1992) 62 (1-2 ): 79-93 ; Romanos l et al., YEAST (1992) 8 (6) : 423 -488 ; Goeddel , METHODS [ IN I ENZYMOLOGY (1990) 185:3-7, cada una incorporada aquí por I referencia. ¡ I Las cepas anfitrionas de levadura pueden desarrollarse en fermentadores durante la etapa : de amplificación utilizando métodos de fermentación por i lotes de alimentación estándar bien conocidos por aquellos con destreza ordinaria en la especialidad. Los I métodos de fermentación pueden adaptarse para tomar , en cuenta diferencias en una ruta de utilización de carbono de anfitrión de levadura particular o modo de control j de I expresión. Por ejemplo, fermentación de un anfitrión ¡ de levadura Saccharomyces puede requerir una sola alimentación de glucosa, fuente de nitrógeno complejo i I i (por ejemplo, hidrolizados de caseína) y suplemento ¡de múltiples vitaminas. En contraste, la levadura metilotrófica P. pastoris puede requerir alimentación en glicerol, metanol y mineral en trazas, pero solo sales ¡de amonio simples (nitrógeno) para óptimo crecimiento! y expresión. Ver, por ejemplo la patente de los E.U.A. o. 5,324,639; Elliott et al., J. PROTEIN CHEM. (1990) 9:95; y Fieschko et al., BIOTECH. BIO. ENG. (1987) 29:1113, aquí incorporada por referencia, Estos métodos de fermentación, sin embargo pueden tener ciertas características comunes independientes de la cepa anfitriona de levadura I empleada. Por ejemplo, un nutriente limitante ' de crecimiento, típicamente carbono, puede agregarse i al fermentador durante la fase de amplificación p¡ara permitir crecimiento máximo. Además, métodos de fermentación en general emplean un medio de fermentación diseñado para contener cantidades adecuadas de carbono, nitrógeno, sales básales, fósforo y otros nutrientes menores (vitaminas, minerales en trazas y sales, etc.).

Ejemplos de medios de fermentación adecuados para i utilizar con Pichia se describen en las patentes de los E.U.A. Nos. 5,324,639 y 5,231,178, que aquí se incorp ran I por referencia. i i Células de Insecto Infectadas con Baculovirus.

El término "anfitrión de insecto" o "célula anfitriona de insecto" se refiere a un insecto que puede ser, o ha sido empleado como un recipiente para vectores recombinantes u otro DNA de transferencia. El término incluye la progenie de la célula anfitriona de insecto original que se ha transfectado. Se entiende que la progenie de una sola célula padre puede no necesariamente ser completamente idéntica en morfología o en complemento DNA total o genómico al padre original, debido a mutación i accidental o deliberada. La progenie de la célula pa'dre que son suficientemente similares al padre para caracterizarse por la propiedad relevante, tal como la presencia de una secuencia nucleótido que codifica ABP, se incluyen en la progenie pretendida para esta definición. La selección de células de insecto convenientes ! para expresión de ABP es bien conocida por aquellos ¡con I destreza ordinaria en la técnica. Varias especiesj de insectos están bien descritas en la técnica comercialmente disponibles incluyendo Aedes aegypt , Bombyx mori , Drosophila melanogastler, Spodopterafrugiperda, y Trichoplusia ni. Para seleccionar anfitriones de insecto para expresión, anfitriones convenientes pueden incluir aquellos que muestran tener, entre otros, buena capacidad de secreción, baja actividad proteolítica y robustez total. Insectos en general están disponibles de una variedad de fuentes incluyendo pero no limitadas a, el Insect Genetic Stock Center, Department of Biophysics y Medical Physics, University of California (Berkeley, CA) ; y the American Type Culture Collection ("ATCC") (Manassas, VA) . [356] En general, los componentes de un sistema de expresión de insectos infectado c Ion baculovirus, incluyen un vector de transferencia, usualmente un plásmido bacteriano, que contiene tanto ! un I fragmento del genoma de baculovirus como un sitio | de restricción conveniente para inserción del gen heterólogo a expresar; un baculovirus de tipo silvestre con secuencias homologas al fragmento específico i de i baculovirus en el vector de transferencia (esto permite la recombinación homologa del gen heterólogo al genbma baculovirus) ,- y células anfitrionas de insecto apropiadas y medio de crecimiento. Los materiales, métodos y técnicas empleadas para construir vectores, células de transfección, placas de preparación, desarrollar células en cultivo y semejantes, se conocen en la técnica y están i disponibles manuales que describen estas técnicas. i Después de insertar el gen heterólogo en ¡ el vector de transferencia, el vector y el genoma viral t¡ipo silvestre se transfectan en una célula anfitriona ' de insecto en donde el vector y el genoma viral ' se recombinan. El virus recombinante empacado se expresan y la placa recombinante se identifican y purifican.

Materiales y métodos para sistemas de expresión de células de insecto/baculovirus están comercialmente disponibles en forma de equipo por ejemplo de Invitrogen I Corp. (Carlsbad, CA) . Estas técnicas en general se conocen por aquellos con destreza en la especialidad y( se describen completamente en SUMMERS y SMITH, TEXAS AGRICULTURAL EXPERIMENT STATION BULLETIN No. 1555 (1987) , aquí incorporado por referencia. Ver también, RICHARDSON, 39 METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY: BÁCULO VIRUS EXPRESSION PROTOCOLS (1995); AUSUBEL ET AL., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY 16.9-16.11 (1994); KING y POSSEE, THE BÁCULO VIRUS SYSTEM: A LABORATORY GUIDE i (1992); y O'REILLY ET AL., BACULOVIRUS EXPRESSÍON VECTORS: A LABORATORY MANUAL (1992). ¡ Sin duda, la producción de diversas proteínas I heterólogas que utilizan sistemas de expresión de células de insecto/baculovirus es bien conocida en la técnica.

Ver, por ejemplo las patentes de los E.U.A. Nos . 6,368,825 6,342,216 6,338,846 6,261,805 6,245,528, i 6,225,060 6,183,987 6,168,932 6,126,944 6,096,304 6,013,433 5,965,393 5,939,285 5,891,676 5,871,906 ¡ 5,861,279 5,858,368 5,843,733 5,762,939 5,753,220 5,605,827; 5,583,023; 5,571,709; 5,516,657; 5,290,686; WO 02/06305 WO 01/90390; WO 01/27301; WO 01/05956; , WO 00/55345 WO 00/20032 WO 99/51721; WO 99/45130; I WO 99/31257 WO 99/10515 WO 99/09193, WO 97/26332; ' WO 96/29400 WO 96/25496 WO 96/06161, WO 95/20672 WO 93/03173 WO 92/16619 WO 92/03628, WO 92/01801 I WO 90/14428 WO 90/10078 WO 90/02566, WO 90/02186 WO 90/01556 WO 89/01038; WO 89/01037; WO 88/07082, que , se incorporan aquí por referencia. ' i Vectores que son útiles en sistemas | de expresión de células de insecto/baculovirus se conocen en la técnica e incluyen por ejemplo vectores ¡ de transferencia y expresión de insectos derivados del baculovirus, virus de polihedrosis nuclear Autographacal i fornica (AcNPV) , que es un vector de expresión viral auxiliar independiente. Vectores ¡ de expresión viral derivados de este sistema usualmente utilizan el fuerte promotor de gen polihedrina viral para dirigir expresiones de genes heterológos . Ver i en general, Reilly ET AL., BACULOVIRUS EXPRESSION VECTORS¡: A LABORATORY MANUAL (1992) . Antes de insertar el gen ajeno o extraño en el genoma de baculovirus, los componentes anteriormente i descritos, que comprenden un promotor, líder (si i se desea) , secuencia de codificación de interés y secuencia de terminación de transcripción, típicamente se ensamblan I en una construcción de transcolocación (vector ¡de transferencia) . Construcciones de transcolocación intermedias a menudo se mantienen en un replicón, tal i como un elemento cromosomal extra (por ejemplo, i plásmidos) capaces de mantenimiento estable en ¡un anfitrión, tal como una bacteria. El replicón tendrá I un sistema de replicación, permitiendo de esta manera que se I mantenga en un anfitrión conveniente para clonar' y i amplificación. Más específicamente, el plásmido puede contener la señal de poliadenilación polihedrina (Miller et al., ANN. REV. MICROBIOL. (1988) 42:177) y un gen ¡ de resistencia a ampicilina procariótico (amp) y origen de replicación para selección y propagación en E. coli . I Un vector de transferencia comúnmente empleado para introducir genes extraños en AcNPV es pAc373.

Muchos otros vectores, conocidos por aquellos ¡con destreza en la técnica, también se I incluyendo por ejemplo, pVL985, que altera el codón | de partida polihedrina de ATG a ATT, y que introduces, un I sitio de clonación BamHI de 32 pares base corriente abajo i del ATT. Ver Luckow y Summers, 17 VIROLOGY 31 (198¡9) . I Otros vectores comercialmente disponibles incluyen Ipor ejemplo, PBlueBac4.5/V5-HÍS; pBlueBacHis2 ; pMelBac; pBlueBac4.5 (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA) .

Después de inserción del gen heterólogo, el vector de transferencia y genoma baculoviral de tipo silvestre se co-transfectan en un anfitrión de célula de insecto. Métodos para introducir DNA heterólogo en el sitio deseado en el virus baculovirus se conocen en la especialidad. Ver SUMMERS y SMITH, TEXAS AGRICULTURAL EXPERIMENT STATION BULLETIN NO. 1555 (1987); Smith \ et al., MOL. CELL. BIOL. (1983) 3:2156; Luckow y Summers, I VIROLOGY (1989) 17:31. Por ejemplo, la inserción puede ser en un gen tal como el recombinación de cruce doble también puede ser en un sitio de ingeniería en el gen baculovirus deseado. Ver Millerjet al., BIOESSAYS (1989) 4:91. ¡ La transfección puede lograrse por electroporación. Ver TROTTER AND WOOD, 39 METHODS ' IN MOLECULAR BIOLOGY (1995) ; Mann y King, J. GEN. VIROL. (1989) 70:3501. En forma alterna, pueden emplearse liposomas para transfectar las células de insecto con ¡el vector de expresión recombinante y el baculovirus. Ver, e.g., Liebman et al., BIOTECHNIQUES (1999) 26(1) :36; Graves et al., BIOCHEMISTRY (1998) 37:6050; Nomura |et I al., J. BIOL. CHEM. (1998) 273 (22) : 13570 ; Schmidt et al., I PROTEIN EXPRESSION AND PURIFICATION (1998) 12:323; Siffert et al., NATURE GENETICS (1998) 18:45; TILKINS ¡ET AL., CELL BIOLOGY: A LABORATORY HANDBOOK 145-154 (1998); Caí et al., PROTEIN EXPRESSION AND PURIFICATION (1997) 10:263; Dolphin et al., NATURE GENETICS (1997) 17:491; i Kost et al., GENE (1997) 190:139; Jakobsson et al., ', J. BIOL. CHEM. (1996) 271:22203; Rowles et al., J. BIOL.

CHEM. (1996) 271 (37) : 22376 ; Reversey et al., J. BIOL.

CHEM. (1996) 271 (39) : 23607- 10; Stanley et al., J. BIOL.

CHEM. (1995) 270:4121; Sisk et al., J. VIROL. (1994) | 68(2) :766; y Peng et al., BIOTECHNIQUES (1993) 14.2:274. Liposomas ejemplo, Carlsbad, fosfato de calcio. Ver TROTTER y WOOD, 39 METHODS | IN i MOLECULAR BIOLOGY (1995); Kitts, NAR (1990) 18(19) :5667; y Mann y King, J. GEN. VIROL. (1989) 70:3501. ¡ ¡ Vectores de expresión baculovirus usualmerite contienen un promotor de baculovirus. Un promoter ,de baculovirus es cualquier secuencia de DNA capaz de ligar i una RNA polimerasa de baculovirus e iniciar ¡la transcripción corriente abajo (3 ' ) de una secuencia |de codificación (por ejemplo gen estructural) en mRNA. ¡Un I promotor tendrá una región de inicio de transcripción que usualmente se coloca próxima al extremo 5 ' de ila secuencia de codificación. Esta región de inicio de transcripción típicamente incluye un sitio de enlace RNA polimerasa y un sitio de inicio de transcripción. Un promotor de baculovirus también puede tener un segundo dominio denominado mejorador, que de estar presente, usualmente es distante al gen estructural. Aún más, la expresión ya puede ser regulada o constitutiva. Genes estructurales, transcritos en forma I abundante en tiempos posteriores en el ciclo < de infección, proporcionan secuencias promotoras (1986) ; EP 0 127 839 y 0 155 476) y el gen que codifica la proteína plO (Vlak et al, J. GEN. VIROL. (1988) 69:765) . El vector de expresión recientemente formado se empaca en recombinante infeccioso y placas desarrolladas pueden purificarse por técnicas conocidas por aquellos con destreza en la especialidad. Ver Miller et al., BIOESSAYS (1989) 4:91; SUMMERS y SMITH, TEXAS AGRICULTURAL EXPERIMENT STATION BULLETIN NO. 1555 (1987) . Vectores de expresión baculovirus recombinantes se han desarrollado para infección en varias células de insectos. Por ejemplo, baculovirus recombinante se han desarrollado inter alia, Aedes aegypti (ATCC No. CCL-125), Bombyx mori (ATCC No. CRL-8910) , Drosophila I melanogaster (ATCC No. 1963) , Spodoptera frugiperda,1 y I Trichoplusia ni. See WO 89/046,699; Wright, NATURE (1986) 321:718; Carbonell et al., J. VlROL. (1985) 56:153; Smíth et al., MOL. CELL. BIOL. (1983) 3:2156. Ver en general, Fraser et al., IN VITRO CELL. DEV. BIOL. (1989) 25:225.

Más específicamente, las líneas celulares empleadas para sistemas de vector de expresión de baculovirus incluyen, pero no están limitadas a, Sf9 frugiperda) (ATCC No. CRL-1711) , Sf21 { Spodoptéra frugiperda) (Invitrogen Corp., Cat. No. 11497-0 I13 I (Carlsbad, CA) ) , Tri-368 ( Trichopulsia ni ) , y High-Five(TM) BTI- TN-5B1-4 ( Trichopulsia ni ) . \ Células y medio de cultivo están comercialmente ¡ disponibles tanto para expresión directa como infusión ¡de polipéptidos heterólogos en baculovirus/expresión, j y tecnología de cultivo celular, generalmente se conoce por aquellos con destreza en la técnica. E. Coli , especies pseudomonas y otrps procariotas . Técnicas de expresión bacteriana son bien ¡ conocidas en la especialidad. Una amplia variedad de vectores están disponibles para utilizar en anfitriones bacterianos. Los vectores pueden ser de una sola copia, o t vectores de bajas o altas múltiples copias. Los vectores pueden servir para clonación y/o expresión. En vista ¡de la amplia literatura referente a vectores, ¡la disponibilidad comercial de muchos vectores e incluso manuales que describen vectores y sus mapas ¡ de restricción y características, no se requiere discusión extensa aquí. Como es bien conocido, los vectores normalmente involucran marcadores que permiten selección, estos marcadores pueden proporcionar resistencia a agente i citotóxico, prototrofia o inmunidad. Frecuentemente, una i pluralidad de marcadores está presente, lo que proporciona diferentes características. i Un promotor bacteriano es cualquier secuencia de DNA capaz de ligar RNA polimerasa bacteriana e iniciar I la transcripción corriente abajo (3') de una secuencia ¡de codificación (por ejemplo gen estructural) en mRNA. ¡Un promotor tendrá una región de inicio de transcripción que I usualmente se coloca próxima al extremo 5 ' de ila i secuencia de codificación. Esta región de inicio ¡de transcripción típicamente incluye un sitio de enlace !de RNA polimerasa y un sitio de inicio de transcripción. Un promotor bacteriano también puede tener un segundo dominio denominado un operador, que puede superponer a un sitio de enlace RNA polimerasa adyacente el cual empieza í la síntesis de RNA. El operador permite transcripción regulada negativa (inducible) , como una proteíha represora de gen puede ligar el operador y de esta manera inhibir transcripción de un gen específico. Expresión constitutiva puede ocurrir en la ausencia de elementos regulatorios negativos, tales como el operador. Además, regulación positiva puede lograrse por una secuencia de enlace de proteína de activador de gen, presente usualmente es próxima (5') a la enlace RNA polimerasa. Un ejemplo de activadora de gen es la proteína activadora de catabolito t (CAP) , que ayuda a iniciar la transcripción del operon lac en Escherichia coli (E. coli) [Raibaud et al., ANNU. I REV. GENET. (1984) 18:173]. Expresión regulada por ¡ lo i tanto puede ya ser positiva o negativa, de esta manera mejorando o reduciendo la transcripción. Secuencias que codifican enzimas de ruta metabólica proporcionan secuencias promotoras particularmente útiles. Ejemplos incluyen secuencias I promotoras derivadas de enzimas que metabolizan azúcar, tales como galactosa, lactosa (lac) [Chang et al., NATURE (1977) 198:1056], y maltosa. Ejemplos adicionales incluyen secuencias promotoras derivadas de enzimas biosintéticas tales como triptofano (trp) [Goeddel i et al., Nuc. ACIDS RES. (1980) 8:4057; Yelvertonet al., NUCL. ACIDS RES. (1981) 9:731; Patente de los E.U.A. No. 4,738,921; Publicaciones EP Nos. 036 776 y 121 775, aquí se incorporan por referencia] . El sistema promotor ?-galactosidasa (bla) [Weissmann (1981) "The cloning I of interferon y other mistakes". In Interferon 3 (Ed. ¡I. I Gresser) ] , bacteriophage lambda PL [Shimatake et al . , i NATURE (1981) 292:128] y sistemas promotores T5 [patente I de los E.U.A. No. 4,689,406, que aquí se incorpora por ! referencia] también proporcionan secuencias promotoras útiles. Métodos preferidos de la presente invención utilizan fuertes promotores, tales como el promotor i T7 I para inducir ABP a altos niveles. Ejemplos de esfos vectores son bien conocidos en la especialidad e incluyen I la serie pET29 de Novagen, y los vectores pPOP descritos en WO99/05297, que se incorpora aquí por referenqia. I Estos sistemas de expresión producen altos niveles de ABP en el anfitrión sin comprometer la viabilidad de j la célula anfitriona o parámetros de crecimiento, pÉT19 (Novagen) es otro vector conocido en la técnica. i Además, promotores sintéticos que no ocurren en la naturaleza también funcionan como promotores ! bacterianos. Por ejemplo, secuencias de activación1 de transcripción de un promotor bacteriano o bacteriófago pueden unirse con las secuencias operón de otro promotor bacterial o bacteriófago, creando un promotor híbrido sintético [patente de los E.U.A. No. 4,551,433, que1 se incorpora aquí por referencia] . Por ejemplo, el promotor I I tac es un promotor trp-lac híbrido que se comprende tanto secuencias promotoras trp como operón lac que se regula por el represor lac [Amann et al., GENE (1983) 25:167; de Boer et al., PROC. NATL. ACAD. SCI. (1983) 80:21]. Además, un promotor bacteriano puede incluir promotores de origen natural de origen no bacteriano que tiene , la capacidad de ligar RNA polimerasa bacteriana e iniciar la transcripción. Un promotor de origen natural de origen no-bacteriano también puede acoplarse con un RNA polimerasa compatible para producir altos niveles | de expresión de algunos genes en procariotas. El sistema promotor/bacteriófago T7 RNA polimerasa es un ejemplo! de un sistema promotor acoplado [Studier et al., J. MOL. BIOL. (1986) 189:113; Tabor et al., Proc Nati. Acad. Sci. (1985) 82:1074]. Además, un promotor híbrido también I puede comprender un promotor bacteriófago y una región de operador E. coli (Pub. EP No. 267 851) . ¡ Además de una secuencia promotora funcional, I un I sitio de enlace de ribosoma eficiente también es útil para expresión de genes extraños en procariotas. En E. coli , el sitio de enlace de ribosoma se denomina la ¡ secuencia Shine-Dalgarno (SD) e incluye un codón ! de inicio (ATG) y una secuencia con longitud de 3-9 nucleótidos ubicados 3-11 nucleótidos corriente arri Iba del codón de inicio [Shine et al . , NATURE ( 1975 ) 254 : 34 ] .

La secuencia SD se considera que promueve enlace de niRNA al ribosoma al aparear bases entre la secuencia SD y 3 f y I de 16S rRNA de E. coli [Steitz et al. "Genetic signáis y nucleotide sequences in messenger RNA" , In Biological Regulation y Development : Gene Expression (Ed. R. F. i Goldberger, 1979) ] . Para expresar genes eucarióticos y genes procarióticos con sitio de enlace de ribosoma débil [Sambrook et al. "Expression of cloned genes ¡ in I Escherichia coli " , Molecular Cloning: A Laboratbry Manual, 1989] . I El término "anfitrión bacteriano" o "célula anfitriona bacteriana" se refiere a una bacteria ¡que puede ser o ha sido utilizada como un recipiente para vectores recombinantes u otra transferencia de DNA. ' El término incluye la progenie de la célula anfitrijona bacterial original que se ha transfectado. Se entiende que la progenie de una sola célula padre puede ' no i necesariamente ser idéntica por completo en morfología o i en complemento de DNA total o genomico al padre original, debido a mutación accidental o deliberada. La progenie de la célula padre que son suficientes similares al padre para caracterizarse por la propiedad relevante, tal como 1 la presencia de un ABP que codifica secuencia nucleótido, se incluye en la progenie pretendida por esta definicijón. La selección de bacterias anfitrionas i I convenientes para expresión de ABP es bien conocida por aquellos con destreza ordinaria en la especialidad. Para seleccionar anfitriones bacterianos para expresión, anfitriones convenientes pueden incluir aquellos que se muestra tienen, inter alia, buena capacidad de formación de cuerpo de inclusión, baja actividad proteolítica,! y robustez total. Anfitriones bacterianos en general están disponibles de una variedad de fuentes incluyendo pero¡ no limitadas a, the Bacterial Genetic Stock Center, Department of Biophysics y Medical Physics, Universityj of California (Berkeley, CA) ; y the American Type Culture Collección ("ATCC") (Manassas, VA). Fermentación industrial/farmacéutica generalmente utiliza bacterias derivadas de las cepas K (e.g. W3110) o de bacterias derivadas de las cepas B (e.g. BL21) . Estas cepas son particularmente útiles debido a sus parámetros ¡ de crecimiento son extremadamente bien conocidos y robustos. Además, estas cepas son no patogénicas, lo que : es comercialmente importante por razones de seguridad y i ambientales. En una modalidad de los métodos de j la presente invención, el anfitrión E. coli es una cepa¡ de BL21. En otra modalidad de los métodos de la presente invención, el anfitrión de E. coli es una cepa proteasa i menos pero no limitada a, OMP- y LON- . En otra modalidad i de los métodos de la presente invención, la cepa de I células anfitrionas es una especie de Pseudomonas, incluyendo pero no limitadas a, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas aeruginosa, y Pseudomonas putida . Pseudomonas I fluorescens biovar 1, designadas cepa MB101, se conoce útil para producción recombinante y está disponible para procesos de producción de proteínas terapéuticas. Un ejemplo de un sistema de expresión de Pseudomonas incluye el sistema disponible de The Dow Chemical Company cpmo una cepa anfitriona (Midland, MI available on the World i Wide Web at dow.com). Las patentes de los E.U.A. Nos. 4,755,465 y 4,859,600, que se incorporan aquí por referencia, describen el uso de cepas Pseudomonas cpmo una célula anfitriona para producción de hormona de crecimiento humano. Una vez que una cepa de célula anfitriona recombinante se ha establecido (es decir, la construcción de expresión se ha introducido en la célula anfitriona y se aislan células anfitrionas con la construcción ¡ de i expresión apropiada) , la cepa de célula anfitriona recombinante se cultiva bajo condiciones apropiadas p ra la producción de ABP. Como será aparente para una persona con destreza en la técnica, el método de cultivo de ¡ la cepa de célula anfitriona recombinante dependerá de la naturaleza de la construcción de expresión utilizada y! la identidad de la célula anfitriona. Cepas anfitrionas recombinanates normalmente se cultivan utilizando métodos que son bien conocidos en la especialidad. Células anfitrionas recombinantes típicamente se cultivan I en medio líquido que contiene fuentes asimilables , de i carbono, nitrógeno y sales inorgánicas y opcionalmente contienen vitaminas, aminoácidos, factores de crecimiento y otros suplementos de cultivo proteináceos bien conocidos en la especialidad. Medios líquidos para cultivo de células anfitrionas pueden contener opcionalmente antibióticos o antifungales, para evitari el crecimiento de microorganismos indeseables y/o compuestos incluyendo pero no limitados a, antibióticos para i seleccionar células anfitrionas que contienen el vector de expresión. Células anfitrionas recombinantes pueden cultivarse en formatos por lotes o continuos, ya sea ¡con cosecha de células (en el caso en donde el ABP se acumula i intracelularmente) o cosecha de sobrenadante de cult¡ivo I ya sea n formatos de lotes o continuos. Para producción en células anfitrionas procarióticas, se prefieren cultivo por lotes y cosecha de células. | ! Los polipéptidos de enlace de antígeno de, la I presente invención normalmente se purifican después! de expresión en sistemas recombinantes. El ABP puede i purificarse de células anfitrionas por una variedad de métodos conocidos en la especialidad. Normalmente, ABP producido en células anfitrionas bacterianas es deficientemente soluble o insoluble (en la forma de cuerpos de inclusión) . En una modalidad de la presente I invención, sustituciones de aminoácidos pueden fácilmente elaborarse en el polipéptido enlace de antígeno que ' se elige con el propósito de aumentar la solubilidad , de proteína producida en forma recombinante utilizando ¡los I métodos aquí descritos así como aquellos conocidos en' la especialidad. En le caso de proteína insoluble, i la proteína puede recolectarse de lisados de células anfitrionas por centrifugación y además puede seguirse por homogeneización de las células. En el caso ' de I proteína deficientemente soluble, compuestos incluyendo i pero no limitados a, polietilen imina (PEÍ) pueden agregarse para inducir la precipitación de proteína parcialmente soluble. La proteína precipitada puede entonces recolectarse convenientemente por centrifugación. Células anfitrionas recombinantes pueden i romperse u homogeneizarse para liberar los cuerpos] de i inclusión del interior de las células utilizando una variedad de métodos bien conocidos por aquellos icón destreza ordinaria en la especialidad. Ruptura) u I homogeneización de células anfitrionas pueden realizarse I utilizando técnicas bien conocidas incluyendo peroj no I limitadas a ruptura de células enzimáticas, sonicación, homogeneización dounce, o ruptura con liberación de alta presión. En una modalidad del método de la presente invención, la técnica de liberación de alta presión Iise emplea para romper las células anfitrionas de E. Coli para liberar los cuerpos de inclusión de ABP. Cuando 'se manejan cuerpos de inclusión de ABP, es ventajoso reducir al mínimo el tiempo de homogeneización en repeticiones a fin de llevar al máximo el rendimiento de cuerpos de i inclusión sin pérdida debida a factores tales como solubilización, corte o cizalla mecánica o proteolisis .| ABP insoluble o solubilizarse entonces utilizando cualquier cantidad de agentes de solubilización convenientes conocidos en • la técnica. De preferencia, ABP se solubiliza con hidrocloruro de guanidina o urea. El volumen del ABP solubilizado deberá minimizarse de manera tal que grandes lotes puedan producirse empleando tamaños de lote convenientemente manejables. Este factor puede ser significante en un ambiente comercial a gran escala, en donde el anfitrión recombinante puede desarrollarse ' en lotes que son de miles de litros en volumen. Además, cuando se fabrica ABP en un ambiente comercial a gran i escala, en particular para usos farmacéuticos humanos, habrá de ejercerse el evitar productos químicos agresivos que puedan dañar la maquinaria y le recipiente, o ¡el propio producto de proteína, de ser posible. Se ¡ha mostrado en le método de la presente invención que leí agente de desnaturalización menos agresivo urea puede emplearse para solubilizar los cuerpos de inclusión ABP I en lugar del agente desnaturalizante más agresivo i hidrocloruro de guanidina. El uso de urea reduce significativamente el riesgo o daño a equipo de acero inoxidable utilizado en el proceso de fabricación' y I purificación de ABP mientras que se solubiliza I eficientemente los cuerpos de inclusión ABP. | En el caso de ABP soluble, ABP puede I secretarse en el espacio periplásmico o en el medio I de cultivo. Además, ABP soluble puede estar presente en le citoplasma de las células anfitrionas. Puede ser conveniente el concentrar ABP soluble antes de realizar etapas de purificación. Técnicas estándar conocidas por aquellos con destreza en la especialidad pueden emplearse I para concentrar ABP soluble por ejemplo de lisados celulares o medio de cultivo. Además, técnicas estándar conocidas por aquellos con destreza en la especialidad s i pueden emplearse para romper las células anfitrionas y i liberar ABP soluble del citoplasma o espacio periplásmico de las células anfitrionas. ¡ Cuando ABP se produce como una proteína i de fusión, la secuencia de fusión de preferencia se retira. i La remoción de una secuencia de fusión puede lograrse por escisión enzimática o química, de preferencia por escisión enzimática. La remoción enzimática de fusión puede lograrse utilizando conocidos para aquellos en la especialidad. La selección de enzima para retirar la secuencia de fusión será determinada por la identidad de la fusión, y las i condiciones de reacción serán especificadas por ¡ la i selección de enzima como será aparente para aquellos 'con destreza en la técnica. El ABP escindido de preferencia se purifica de la secuencia de fusión escindida por i métodos bien conocidos. Estos métodos se determinarán por la identidad y propiedades de la secuencia de fusión y¡ el I ABP, como será aparente para una persona con destreza, en la especialidad. Métodos para purificación pueden incluir, pero no están limitados a cromatografía de exclusión de tamaño, cromatografía de interacción hidrofóbica, cromatografía de intercambio de iones¡ o diálisis o cualquier combinación de las mismas. El ABP también de preferencia se purifica para retirar DNA de la solución de proteínas. DNA puede retirarse por cualquier método conveniente conocido en! la I especialidad, tales como precipitación o cromatografía! de intercambio de iones, pero de preferencia se retira por I precipitación con un agente de precipitación de ácido nucleico tal como, pero no limitado a, protamina sulfato.

ABP puede separarse del DNA precipitado utilizando I métodos bien conocidos estándar incluyendo pero j no limitados a centrifugación o filtración. La remoción de moléculas de ácido nucleico anfitrión es un fact Ior importante en una configuración o ambiente en donde el ABP se va a utilizar para tratar a humanos y los métodos de la presente invención reducen el DNA de célula anfitriona a niveles farmacéuticamente aceptables. Métodos para fermentación a pequeña escala a gran escala, también pueden emplearse en expresión de proteínas, incluyendo pero no limitados a termentadores, I I matraces de agitación, biorreactores de lecho fluidizado, biorreactores de fibras huecas, sistemas de cultivo en frascos rodantes, y sistemas de biorreactor de tanque I agitado. Cada uno de estos métodos puede realizarse e un proceso de modo por lotes, alimentación por lotes o i continua. I ABP humano de la invención puede recuperarse I generalmente utilizando métodos estándar en la técnica.

Por ejemplo, medio de cultivo o lisado celular puede ¡ centrifugarse o filtrarse para retirar desechos celulares. EL sobrenadante puede concentrarse o diluirse a un volumen deseado o diafiltrarse en un amortiguador conveniente para acondicionar la preparación para mayor purificación. Mayor purificación del ABP de la presente invención incluye separar formas desaminadas y recortadas de la variante ABP de la forma intacta. Cualquiera de los procedimientos ejemplares siguientes puede emplearse para purificación de polipéptidos de enlace de antígeno de la invención: cromatografía de afinidad; cromatografía de intercambio i de aniones o cationes (utilizando, incluyendo pero ' no limitado a, DEAE SEPHAROSE) ; cromatografía en sílice; HPLC de fase inversa; filtración en gel (usando, incluyendo pero no limitado a, SEPHADEX G-75) ; cromatografía de interacción hidrofóbica; cromatografía de exclusión de tamaño; cromatografía de quelato de metal; ultrafiltración/diafiltración; precipitación con etanol; precipitación con sulfato dé amonio; cromatoenfoque; cromatografía de desplazamiento; I procedimientos electroforéticos (incluyendo pero | no limitados a, enfoque isoeléctrico preparativp) , solubilidad diferencial (incluyendo pero no limitada a precipitación con sulfato de amonio) ; SDS-PAGE, o extracción. Proteínas de la presente invención incluyendo pero no limitadas a, proteínas que comprenden aminoácidos i no naturales, anticuerpos de proteínas que comprenden i I aminoácidos no naturales, socios de enlace para proteínas que comprenden aminoácidos no naturales, etc., puejden purificarse ya sea parcial o sustancialmente ! a homogeneidad, de acuerdo con procedimientos estándar conocidos por y utilizados por aquellos con destreza i en I la técnica. De acuerdo con esto, polipéptidos de | la invención pueden recuperarse y purificarse por cualquiera de una cantidad de métodos bien conocidos en i la i especialidad, incluyendo pero no limitados ¡a, precipitación de etanol o sulfato de amonio, extracciión de ácido o base, cromatografía en columna, cromatografía de columna de afinidad, cromatografía de intercambio ide i i aniones o cationes, cromatografía de fosfocelulosa, cromatografía de interacción hidrofóbica, cromatografía de hidroxilapatita, cromatografía de lectina, electroforesis en gel y semejantes. Pueden etapas de plegamiento de proteína, según se producir proteínas maduras correctamente Cromatografía de líquido de alto desempeño (HPLC) , cromatografía de afinidad u otros métodos convenientes, i pueden emplearse en etapas de purificación finales ,en I donde se desea alta pureza. En una modalidad, anticuerpos elaborados contra aminoácidos no naturales (o proteínas que comprenden aminoácidos no naturales) se emplean como i reactivos de purificación, incluyendo pero no limitados a, purificación basada en afinidad de proteínas que comprenden uno o más aminoácidos no naturales. Una yez I purificados, parcialmente o a homogeneidad según se desee, los polipéptidos se emplean opcionalmente para una amplia variedad de utilidades, incluyendo pero no limitadas a componentes de ensayo, terapéuticos, profilaxis y diagnóstico, reactivos de investigación y/o como inmunógenos para producción de anticuerpos. Además de otras referencias aquí anotadas, son bien conocidos en la especialidad una variedad de métodios i de plegamiento de proteína/purificación, incluyendo pero no limitados a, aquellos establecidos en R. Scopes, i Protein Purification, Springer-Verlag, N. Y. (1982) ; Deutscher, Methods in Enzymology Vol. 182: Guide to Protein Purification, Academic Press, Inc. N. Y. (1990); Sandana, (1997) Bioseparation of Proteins, Academic j Press, Inc.; Bollag et al. (1996) Protein Methods. 2nd i Edition Wiley-Liss, NY; Walker, (1996) The Protéin Protocols Handbook Humana Press, NJ, Harris y Angal, (1990) Protein Purification Applications: A Practicial Approach IRL Press at Oxford, Oxford, England; Harris y Angal, Protein Purification Methods: A Practical Approach i IRL Press at Oxford, Oxford, England; Scopes, (1993) Protein Purification: Principies y Practice 3rd Edition I Springer Verlag, NY; Janson y Ryden, (1998) Protein Purification: Principies, High Resolution Methods ¡ y Applications, Second Edition Wiley- VCH, NY; y Walker (1998) , Protein Protocols on CD-ROM Humana Press, NJ; y las referencias ahí citadas. ! Una ventaja de producir una proteína I o I polipéptido de interés con un aminoácido no natural i en una célula anfitriona eucariótica o célula anfitriona ¡ no I eucariótica es que típicamente las proteínas ¡ o i polipéptidos se plegarán en sus conformaciones nativas. Sin embargo, en ciertas modalidades de la invención, I aquellos con destreza en la técnica reconocerán que, después de síntesis, expresión y/o purificación, las proteínas pueden poseer una conformación diferente de las conformaciones deseadas de los polipéptidos relevantes. En un aspecto de la invención, la proteína expresada opcionalmente se desnaturaliza y después renaturalilza. Esto se logra utilizando métodos conocidos en la técnica, incluyendo pero no limitados a, al agregar ¡una chaperonina a la proteína o polipéptido de interés,] al solubilizar la proteína en un agente caotrópico tal como guanidina HCl utilizando proteína disulfuro isomerajsa, etc. ! En general, ocasionalmente es conveniente¡ el I desnaturalizar y reducir polipéptidos expresados' y I después provocar que los polipéptidos re-plieguen ai la conformación preferida. Por ejemplo, guanidina, urea, I DTT, DTE, y/o una chaperonina pueden agregarse a ¡ un producto de traducción de interés. Métodos para reducir, desnaturalizar y renaturalizar proteínas son bien i conocidos por aquellos con destreza en la especialidad i (ver las referencias anteriores y Debinski, et al. (1993) J. Biol. Chem. 268: 14065-14070; Kreitman y Pastan (1993) Bioconjug. Chem., 4: 581-585; y Buchner, et al., (1992) i Anal. Biochem. 205: 263-270). Debinski, et al., por I ejemplo, describen la desnaturalización y reducción ¡de proteínas de cuerpo de inclusión en guanidina-DTE. Las proteínas pueden replegarse en un amortiguador redox que i contiene, incluyendo pero no limitado a, glutatióna oxidada y L-arginina. Reactivos de replegamiento puedien hacerse circular o de otra forma pasarse en contacto con ¡ uno o más polipéptidos u otro producto de expresión, ¡ o i viceversa. ¡ En el caso de producción procariótica de ABP, ABP así producido puede plegarse mal y de esta manera carece o tiene actividad biológica reducida. 'La I bioactividad de la proteína puede restaurarse p¡or "replegamiento". En general, ABP plegado mal se repliega por solubilización (en donde el ABP también es | insoluble) , desplegando y reduciendo la cadena I polipéptido utilizando por ejemplo uno o más agentes cistamina) , lo que permite la reformación de enlaces 4,511,502, 4,511,503, y 4,512,922, que aquí se incorporan por referencia. El ABP también puede co-plegarse con otras proteínas para formar heterodímeros , o heteromultímeros. Después de plegamiento o ¿o- i plegamiento, el ABP de preferencia se purifica adicionalmente. Métodos de purificación en general . Cualquiera de una variedad de etapas ' de aislamiento pueden realizarse en el lisado celular que comprenden ABP o cualesquiera mezclas de ABP que resultan de cualesquiera etapas de aislamiento incluyendo pero ¡ no limitadas a, cromatografía de afinidad, cromatografía de I intercambio de iones, cromatografía de interacción hidrofóbica, cromatografía de filtración en gel, cromatografía de líquido de alto desempeño ("HPLC"), HPLC de fase inversa ("RP-HPLC"), adsorción en lecho expandido o cualquier combinación y/o repetición de las mismas en cualquier orden apropiado. Equipo y otros materiales necesarios empleados para realizar las técnicas aquí descritas están comercialmente disponibles. Bombas, recolectores ¡de fracciones, monitores, grabadoras y sistemas completos están disponibles por ejemplo de Applied Biosystéms (Foster City, CA) , Bio-Rad Laboratories, Inc. (Hercules, compañías. ¡ Compensación y otras etapas en los procesos 'de cromatografía en columna aquí descritos tales como lavado y elusión, pueden lograrse más rápidamente utilizando equipo especializado tal como una bomba. Bombas comercialmente disponibles incluyen pero no están I limitadas a HILOAD® Pump P-50, Peristaltic Pump P-I, Pump I P-901, y Pump P-903 (Amersham Biosciences, Piscataway, ¡ NJ) . ' Ejemplos de colectores de fracciones incluyen el RediFrac Fraction Collector, FRAC-100 y FRAC-200 I Fraction Collectors, y SUPERFRAC® Fraction Collectíor (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) . Mezcladores también están disponibles para formar gradientes de I concentración lineal y pH. Mezcladores comercialmente disponibles incluyen Gradient Mixer GM-I y In-Line Mixers i (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) . ] El proceso cromatográfico puede supervisarse utilizando cualquier monitor comercialmente disponible. Estos monitores pueden emplearse para recolectar I información como UV, pH, y conductividad. Ejemplos Ide detectores incluye Monitor UV-I, UVICORD® S II, Monitor i UV-M II, Monitor UV-900, Monitor UPC-900, Monitor pH/C- 900, y Conductivity Monitor (Amersham Biosciences, i Piscataway, NJ) . Sin duda, sistemas completos están comercialmente disponibles incluyendo los diversos sistemas AKTA® systems de Amersham Biosciences I (Piscataway, NJ) . En una modalidad de la presente invención, por ejemplo el ABP puede reducirse y desnaturalizarse ¡al primero desnaturalizar el ABP purificador resultante 'en urea, seguido por dilución en amortiguador TRIS que contiene un agente reductor (tal como DTT) a un pH i conveniente. En otra modalidad, el ABP se desnaturaliza i en urea en un rango de concentraciones de entre aproximadamente 2 M a aproximadamente 9 M, seguido por i dilución en amortiguador TRIS a un pH en el intervalo de aproximadamente 5.0 a aproximadamente 8.0. La mezcla de I reflej amiento de esta modalidad puede ser entonces incubada. En una modalidad, la mezcla de reflej amiento se incuba a temperatura ambiente por 4 a 24 horas. La mezcla ABP reducida y desnaturalizada puede entonces ser aislada o purificada adicionalmente. ! Como se establece aquí, el pH de la primer mezcla ABP puede ajustarse antes de realizar cualesquiera etapas de aislamiento subsecuente. Además, la primer mezcla ABP o cualquier mezcla subsecuente de la misma puede ser concentrado utilizando técnicas conocidas en la especialidad. Aún más, el amortiguador de elusión que comprende la primer mezcla ABP o cualquier mezcla subsecuente de las mismas puede intercambiarse por un amortiguador adecuado para la siguiente etapa i de aislamiento utilizando técnicas bien conocidas por aquellos con destreza ordinaria en la especialidad. Cromatografía de intercambio de iones En una modalidad y como una etapa adicional I opcional, cromatografía de intercambio de iones puede realizarse en la primer mezcla ABP. Ver en general ION EXCHANGE CHROMATOGRAPHY : PRINCIPLES AND METHODS (Cat. Ño. 18- 1114-21, Amersham Biosciences (Piscataway, NJ)i ) .

Columnas de intercambio de iones comercialmente j disponibles incluyen las columnas HITRAP®, HIPREP®,¡ y HILOAD® (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) . Estas I columnas incluyen fuertes intercambiadores de aniones tales como Q SEPHAROSE® Fast Flow, Q SEPHAROSE® High Performance, y Q SEPHAROSE® XL; intercambiadores de cationes fuertes tales como SP SEPHAROSE® H gh Performance, SP SEPHAROSE® Fast Flow, y SP SEPHAROSE® XL; intercambiadores de aniones débiles tales como DEAE SEPHAROSE® Fast Flow; e y intercambiadores de cationes I débiles tales como CM SEPHAROSE® Fast Flow (Amersjam I Biosciences, Piscataway, NJ) . Cromatografía en columna de intercambio de aniones o cationes puede realizarse I en el ABP en cualquier etapa del proceso de purificación para aislar el ABP substancialmente purificado. La etapa i de cromatografía de intercambio de cationes puede 1 realizarse utilizando cualquier matriz de intercambio de cationes conveniente. Matrices de intercambio 'de cationes útiles incluyen pero no están limitadas a material de matriz de intercambio de cationes fibroso, ! poroso, no poroso, micro granular, en perlas ' o entrelazado. Estos materiales de matriz de intercambio de cationes incluyen pero agarosa, dextrano, poliestireno, sílice, poliéter, o compuestos ¡de cualquiera de los anteriores. La matriz de intercambio de cationes puede ser cualquier intercambiador de cationes conveniente incluyendo intercambiadores de cationes fuertes ¡ y débiles. Intercambiadores de cationes fuertes pueden permanecer ionizados sobre un amplio intervalo de pH y; de esta manera pueden ser capaces de ligar ABP sobre , un i amplio intervalo de pH. Intercambiadores de cationes i débiles sin embargo pueden perder ionización como una función del pH. Por ejemplo, intercambiadores i, de 1 cationes débiles pueden perder carga cuando el pH cae por i debajo de aproximadamente pH 4 o pH 5. Intercambiadores de cationes fuertes convenientes incluyen pero no están i limitados a grupos funcionales cargados tales como I sulfopropilo (SP) , metil sulfonato (S) , o sulfoetilo (SE) . La matriz de intercambio de cationes puede ser 'un intercambiador de cationes fuertes de preferencia que I I tiene un rango de pH de enlace de ABP de aproximadamente | 2.5 a aproximadamente 6.0. En forma alterna, ¡el intercambiador de cationes fuerte puede tener un intervalo de pH de enlace ABP de aproximadamente 2.5 a I aproximadamente 5.5. La matriz de intercambio ¡de i cationes puede ser un intercambiador de cationes fuert¡es i que tiene un pH de enlace de ABP de aproximadamente 3.0.

En forma alterna, la matriz de intercambio de cationes i puede ser un intercambiador de cationes fuertes de preferencia que tiene un rango de pH de enlace de ABP de aproximadamente 6.0 a aproximadamente 8.0. La matriz de intercambio de cationes puede ser un intercambiador de cationes fuertes de preferencia que tiene un intervalo de pH de enlace de ABP de aproximadamente 8.0 a aproximadamente 12.5. En forma alterna, el intercambiador de cationes fuertes puede tener un ABP intervalo de pH de enlace de ABP de aproximadamente 8.0 a aproximadamente pH 12.0. Antes de cargar el ABP, la matriz de intercambio de cationes puede ser equilibrada, por ejemplo, utilizando varios volúmenes de columna de un ácido diluido, débil, por ejemplo 4 volúmenes de columna de ácido acético 20 mM, pH 3. Después de equilibrio, el ABP puede agregarse y la columna puede ser lavada una o varias veces, antes de elusión de ABP substancialmente purificado, también utilizando una solución de ácido débil tal como una solución de ácido fosfórico o ácido débil. Por ejemplo, aproximadamente 2 a 4 volúmenes de columna de ácido acético 20 mM, pH 3 puede emplearse para lavar la columna. Lavados adicionales utilizando por ejemplo 2 a 4 volúmenes de columna de acetato de sodio 0.05 M, acetato de sodio con pH 5.5, o 0.05 M en mezcla con cloruro de sodio 0.1 M, pH 5.5, también puede usarse. En forma alterna, utilizando métodos conocidos en la técnica, la matriz de intercambio de cationes puede equilibrarse utilizando varios volúmenes de columna de una base débil diluida. En forma alterna, ABP substancialmente purificado puede eluirse al contactar la matriz de intercambio de cationes con un amortiguador que tiene un pH suficientemente bajo o concentración iónica para desplazar el APB de la matriz. El pH del amortiguador de elusión puede estar en el intervalo de aproximadamente 2.5 a aproximadamente 6.0. Más específicamente, el pH del amortiguador de elusión puede estar en el intervalo de aproximadamente 2.5 a aproximadamente 5.5, aproximadamente 2.5 a aproximadamente 5.0. El amortiguador de elusión puede tener un pH de aproximadamente 3.0. Además, la cantidad de amortiguador de elusión puede variar ampliamente y en general estará en el intervalo de aproximadamente 2 a aproximadamente 10 volúmenes de columna. Aún más, amortiguadores convenientes conocidos por aquellos con destreza en la técnica pueden encontrar uso aquí, incluyendo pero no limitado a, amortiguadores citrato, fosfato, formato, HEPES, y MES en el intervalo en concentración de al me.ios aproximadamente 5 mM a cuando menos aproximadamente 100 mM. Después de adsorción del polipéptido ABP en la matriz de intercambio de cationes, polipéptido ABP substancialmente purificado puede eluirse por contacto de la matriz con un amortiguador que tiene un pH¡ o concentración iónica suficientemente altos para desplazar el ABP de la matriz. Amortiguadores convenientes para utilizar en elusión de alto pH de ABP substancialmente I purificado pueden incluir, pero no están limitados | a, amortiguadores citrato, fosfato, formato, acetato, HEPES, y MES en el intervalo de concentración de al menos aproximadamente 5 mM a al menos aproximadamente 100 mM.I I Cromatografía de fase inversa. ¡ I RP-HPLC puede realizarse para purificar proteínas siguiendo protocolos convenientes que ' se conocen por aquellos con destreza ordinaria en lia especialidad. Ver por ejemplo, Pearson y colaboradores, ANAL. BIOCHEM. (1982) 124:217-230 (1982); Rivier ¡ y colaboradores, J. CHROM. (1983) 268:112-119; Kunitani] y i colaboradores, J. CHROM. (1986) 359:391-402. RP-HRLC puede realizarse en el ABP para aislar ABP I substancialmente purificado. En este aspecto, resinas derivatizadas de sílice con funcionalidades alquilo con I una amplia variedad de longitudes, incluyendo pero no i limitadas a cuando menos aproximadamente C3 a cuando I menos aproximadamente C30, a cuando menos aproximadamente I C3 a cuando menos aproximadamente C20, o al menos aproximadamente C3 a cuando menos aproximadamente C?8 i resinas. En forma alterna, una resina polimérica puede utilizarse. Por ejemplo, resina TosoHaas Amberchrome CGlOOOsd puede emplearse, que es una resina de polímero de estireno. Resinas ciano o poliméricas con una amplia variedad de longitudes de cadena alquilo también pueden emplearse. Además, la columna RP-HPLC puede lavarse cpn un solvente tal como etanol . La columna RP fuente ¡es otro ejemplo de una columna RP-HPLC. I Un amortiguador de elusión conveniente que contiene un agente de apareamiento de iones y 'un modificador orgánico tal como metanol, isopropanol, I tetrahidrofurano, acetonitrilo o etanol, puede emplearse para eluir el ABP de la columna RP-HPLC. Los agentes de pero no están limitados a ácido acético, ácido fórmico, ácido clorito, ácido fosfórico, ácido trifluoroacético, ácido heptafluorobutírico, trietilamina, cloruro de tetrametilamonio, tetrabutilamonio, y trietilamonio. ¡La ¡ elusión puede realizarse utilizando uno o más gradientes o condiciones isocráticas con condiciones gradiente I preferidas para reducir el tiempo de separación y I disminuir el ancho de picos. Otro método involucra | el I uso de dos gradientes con diferentes rangos ¡de concentración de solvente. Ejemplos de amortiguadores de elusión convenientes para emplear aquí pueden incluir pero no están limitados a, soluciones de acetato de iI amonio y acetonitrilo. ' Técnicas de purificación de cromatografía | de interacción hidrofóbica Cromatografía de interacción hidrofóbica (HIC = Hydrophobic interaction chromatography) puede realizarse en el ABP. Ver en general HYDROPHOBIC INTERACTION CHROMATOGRAPHY HANDBOOK: PRINCIPLES AND METHODS (Cat. No. 18-1020-90, Amersham Biosciences (Piscataway, NJ) quei se incorporan aquí por referencia. Matrices HIC convenientes pueden incluir pero no están limitadas a I matrices substituidas con alquilo o arilo, tales cjomo matrices substituidas con butilo, hexilo, octil?| o i fenilo, incluyendo matrices de agarosa, agarbsa i entrelazada, sefarosa, celulosa, sílice, dextrano, poliestireno, poli (metacrilato) y resinas de modo mixto, incluyendo pero no limitadas a una resina polietilenamina o una matriz de poli (metacrilato) substituida con butilo o fenilo. Fuentes comercialmente disponibles para i cromatografía en columna de interacción hidrofóbíca i incluyen pero no están limitadas a columnas, HITRAP®, HIPREP®, y HILOAD® (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) . i Brevemente, antes de carga, la columna HIC I puede equilibrarse utilizando amortiguadores estándar conocidos por aquellos con destreza ordinaria en la especialidad, tales como solución de ácido I acético/cloruro de sodio o sulfato de amonio que contiene t HEPES. Puede emplearse sulfato de amonio como ¡el amortiguador para cargar la columna HIC. Después ¡ de i cargar el ABP, a columna puede ser lavada utilizando amortiguadores y condiciones estándar para retirar materiales indeseados pero reteniendo el ABP en I la columna HIC. ABP puede eluirse con aproximadamente 3 a I aproximadamente 10 volúmenes de columna de un i amortiguador estándar, tal como amortiguador HEPES que i contiene EDTA y menor concentración de sulfato de amonio, i que el amortiguador de equilibrio, o un amortiguador ¡de i ácido acético/cloruro de sodio, entre otros. ¡Un gradiente de sal lineal decreciente utilizando por ejemplo un gradiente de fosfato de potasio, también puede I emplearse para eluir las moléculas de ABP. El eluyeñte puede entonces concentrarse, por ejemplo por filtración tal como diafiltración o ultrafiltración. 'La i diafiltración puede utilizarse para retirar la s¡al empleada para eluir ABP. i i Otras técnicas de purificación. Todavía otra ¡ etapa de aislamiento utilizando por ejemplo filtración ¡en i gel (GEL FILTRATION: PRINCIPLES y METHODS (Cat. No. 18- I 1022-18, Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) que se incorpora aquí por referencia, cromatografía de hidroxi apatita (matrices convenientes incluyen pero no están limitadas a, HA-Ultrogel, High Resolution (Calbiochem), CHT Ceramic Hydroxyapatite (BioRad) , Bio - Gel HTP Hydroxyapatite (BioRad) ) , HPLC, adsorción en lecho I expandido, ultrafiltración, diafiltración, diofilización I y semejantes, pueden realizarse en la primer mezcla ABP o cualquier mezcla subsecuente para retirar cualesquiera I excesos de sal para reemplazar el amortiguador con I un amortiguador conveniente para la siguiente etapa , de i aislamiento o incluso formulación del producto de droga final . El amino ácido no naturalmente codificado presente en el ABP también puede utilizarse para proporcionar separación de otras proteínas celulares que no contienen el amino ácido no naturalmente codificado. ! Ya que el amino ácido no-naturalmente codificado puede comprender grupos funcionales químicos únicos, !el acoplamiento del grupo funcional único con otra molécula ¡ puede proporcionar una etapa de purificación substancial . I Por ejemplo, el amino ácido no-naturalmente codificado puede acoplarse a otra molécula que facilite ¡la separación de otras proteínas. Estas moléculas pata acoplamiento al amino ácido no natural incluyen pero no i están limitadas a PEG y otros polímeros, perlas y otras I substancias sólidas. ¡ El rendimiento de ABP, incluyendo ABP substancialmente purificado, puede supervisarse en cada etapa aquí descrito utilizando técnicas conocidas por aquellos con destreza ordinaria en la especialidad. Estas técnicas también pueden emplearse para estimar el rendimiento de ABP subst la última etapa de rendimiento de ABP puede supervisarse utilizando I cualquier de varias columnas de cromatografía liquida con I alta presión de fase inversa, que tiene una variedad de longitudes de cadena alquilo tales como ciano RP-HPLC, C?8RP-HPLC; así como HPLC de intercambio de cationes ¡ y HPLC de filtración de gel. En modalidades específicas de la presente invención, el rendimiento de ABP después cada etapa de purificación puede ser al menos aproximadamente 30%, al I menos aproximadamente 35%, al menos aproximadamente 40¡%, I al menos aproximadamente 45%, al menos aproximadamente 50%, al menos aproximadamente 55%, al menos I aproximadamente 60%, al menos aproximadamente 65%, ¡al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 75%, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 91%, al menos aproximadamente 92%, al menos aproximadamente 93%, al menos aproximadamente 94%, I al menos aproximadamente 95%, al menos aproximadam nte I 96%, al menos aproximadamente 97%, al menos I aproximadamente 98%, al menos aproximadamente 99%, i al menos aproximadamente 99.9%, o al menos aproximadamente 99.99%, del ABP en el material de partícula para cada i etapa de purificación. 1 La pureza puede determinarse utilizando técnicas estándar, tales como SDS-PAGE, o la medir ABP utilizando transferencia Western y ensayos ELISA. Por ejemplo, anticuerpos policlonales pueden generarse contra proteínas aisladas de fermentación de levadura ' de control negativa y la recuperación de intercambio I de cationes. Los anticuerpos también pueden emplearse para sondear la presencia de proteínas de célula huésped I contaminantes . ! i RP-HPLC material Vydac C4 (Vydac) consiste 'de partículas de gel de sílice, de los cuales la superficie i transportan cadenas C4 -alquilo. La separación del ABP ¡de las impurezas proteinaseas se basa en diferencias en lia i fuerza de las interacciones hidrofobicas . La ilusión se realiza con un gradiente de acetonitrilo en ácido trifluoroacetico diluido. HPLC preparativa se realiza utilizando una columna de acero inoxidable (rellena c ¡pn i 2.8 a 3.2 litros de Vydac C4 silicagel) . El elua|to i hidroxiapatita ultrogel se acidifica al agregar ácijdo i trifluoroacetico y cargar en la columna Vydac C4. Para lavado y elución se utiliza un gradiente de acetonitrilo en ácido trifluoroacetico diluido. Fracciones se recolectan y neutralizan inmediatamente con amortiguador I fosfato. Las fracciones ABP que están dentro de los límites IPC se recolectan. El material DEAE Sepharose (Pharmacia) consiste de grupos dietilaminoetil (DEAE) que están ligados covalentemente a la superficie de la perlas de Sepharosa. El enlace de ABP con los grupos de DEAE esta mediado por interacciones iónicas. Paso de acetonitrilo y ácido trifluoroacetico a través de la columna sin retenerse. Después de que estas substancias se han lavado arrastre, se retiran impurezas en trazar al lavar columna con amortiguador acetato a bajo pH. Después columna se lava con amortiguador fosfato neutro y eluye ABP con un amortiguador con concentración iónica incrementada. La columna se empaca con DEAE Sepharosa fast flow. El volumen de columna se ajusta para asegurar una carga de ABP en el intervalo de 3-10 mg ABP polipéptido/ml de gel. La columna se lava con agua y amortiguador de equilibrio (fosfato de sodio/potasio) . Las fracciones recolectadas del eluato HPLC se cargan la columna se lava con amortiguador de equilibrio Después, la columna se lava con amortiguador de lavado i (amortiguador de acetato de sodio) , seguido por lavado con amortiguador de equilibrio. Subsecuentemente, ABP' se í eluye de la columna con amortiguador de elución (cloruro i de sodio, fosfato de sodio/potasio) y recolecta en una sola fracción de acuerdo con el perfil de elución maestro. El eluato de la columna DEAE Sepharosa se ajusta 1 a la conductividad especificada. La sustancia de droga resultante se filtra estéril en botellas de Teflóri y I almacena a -70 grados C. ¡ í Métodos adicionales que pueden emplearse incluyen, pero no están limitados a, etapas para retirar endotoxinas . Las endotoxinas son lipopoli-sacáridos (LPSs) que se ubican en la membrana exterior de células I anfitrionas Gram negativas, tales como por ejemplo, Escherichia coli. Métodos para reducir niveles ¡de I endotoxinas se conocen por una persona con destreza en ¡la i técnica e incluyen pero no están limitados a técnicas ¡de purificación utilizando soportes de sílice, polvo Ide i vidrio o hidroxiapatita, cromatografía de fase inveráa, afinidad, exclusión de tamaño, intercambio de aniones, cromatografía interacción hidrofobica, una combinación !de I estos métodos y semejantes. Modificaciones o métodos i adicionales puedan requerirse para retirar contaminantes tales como proteínas co-migrantes del polipéptido de interés. i i I I i Una amplia variedad de métodos y procedimientos pueden emplearse para estimar el rendimiento y pureza I de proteína ABP uno o más amino ácidos no naturalmente codificados, incluyendo pero no limitados al ensayo Bradford, SDS-PAGE, continción de plata, SDS-PAGE, continción, así SDS-PAGE, espectrometría de masas (incluyendo pero no limitan a, MALDI-TOF) y otros métodos para caracterizar proteínas que se conocen por una I persona con destreza en la técnica. i VIII. Expresión en Sistemas Alternos ' i Varias estrategias se han empleado para i introducir amino ácidos no naturales en proteínas ¡en células anfitrionas no recombinantes, células anfitrionas mutagenizadas o en sistemas libres de células. Estos sistemas son también convenientes para utilizar ¡en producir los polipéptidos de enlace de antígeno de ¡la presente invención. La derivatización de amino ácido con I cadenas laterales reactivas tales como Lys, Cys y Tyr resulta en la conversión de lisina a N2-acetil-lisinla. I Síntesis química también proporciona un método directo para incorporar amino ácidos no naturales. Con él reciente desarrollo de ligación enzimática y ligación química nativa de fragmentos péptidos, es posible hacer más grandes proteínas. Ver, por ejemplo, P. E. Dawson , y S. B. H. Kent, Annu. Rev. Biochem, 69:923 (2000). Un i I método biosintetico in vitro general en donde el tRNA supresor asilado químicamente con el amino ácido 10 natural deseado se agrega a un extracto in vitro capaz de soportar biosíntesis de proteína, se ha empleado para incorporar específicamente en sito más de 100 amino ácidos no naturales en una variedad de proteínas virtualmente con cualquier tamaño. Ver, por ejemplo, V.W. Cornish, D. Mendel y P.G. Schultz, Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 1995, 34:621 (1995); CJ. Noren, SJ. Anthony-Cahill, M.C. Griffith, P.G. Schultz, A general method for si te-specific incorporation of unnatural amino acids into proteins, Science 244:182-188 (1989); y, J.D. Bain, CG. Glabe, T.A. Dix, A.R. Chamberlin, E.S. Díala, Biosynthetic si te-specific incorporation of a non-natural amino acid into a polypeptide, J. Am. Chem. Soc. 111:8013-8014 (1989). Un amplio rango de grupos funcionales se ha introducido en proteínas para estudios de estabilidad proteína, plegamiento de proteín¡a, mecanismo enzimático y transducción de señal. Un método in vivo, denominado incorporación de presión selectiva, se desarrollo para explotar la promiscuidad de sintetazas tipo silvestres. Ver, por ejemplo, N. Budisa, C. Minks, S. Alefelder, W. Wenger, F.M. Dong, L. Moroder y R. Huber, FASEB J. , 13:41 (1999). Una sepa auxotrofica, en donde la ruta metabólica relevante que suministra la célula con un amino ácido natural particular se desactiva, se desarrolla en medio mínimo que contiene concentraciones limitadas del ami?o ácido natural, mientras que se reprime el gen diana. Al inicio de la fase crecimiento estacionario, el ami?o ácido natural se agota y reemplaza con el análogo de amino ácido no natural . La inducción de expresión de proteína recombinante resulta en la acumulación de una proteína que contiene el análogo no natural. Por ejemplo, I utilizando esta estrategia, o, m y p-fluorofenylalanina se han incorporado en proteínas, y exhiben dos hombros característicos en el espectro UV que pueden ser fácilmente identificados, ver, por ejemplo, C. Minks, R. Huber, L. Moroder y N. Budisa, Anal. Biochem., 284:29 (2000) ; trifluorometionina se ha empleado para reemplazar metionina en el bacteriófago T4 lisozima para estudiar su I interacción con ligandos quitooligosacárido por 19F RMN, i ver, por ejemplo, H. Duewel, E. Daub, V. Robinson y J. <F.

Honek, Biochemistry, 36:3404 (1997); y trifluoroleucina ! se ha incorporado en lugar de leucina, resultando én incrementada estabilidad térmica y química de una proteína cremallera leucina. Ver, por ejemplo, Y. Tang, G. Ghirlanda, W.A. Petka, T. Nakajima, W.F. DeGrado ¡ y i D.A. Tirrell, Angew. Chem. Int. Ed. Engl , 40:1494 (20011) . Aun más, selenomethionine y telluromethionine se incorporan en diversas proteínas recombinantes para facilitar la solución de fases en cristalografía ' de rayos X. Ver, por ejemplo, W.A. Hendrickson, J.R. Hor'ton y D.M. Lemaster, EMBO J. , 9:1665 (1990); J.O. Boles, I K. Lewinski, M. Kunkle, J. D. Odom, B. Dunlap, L. Lebiodá y I M. Hatada, Nat. Struct . Biol., 1:283 (1994); N. Budisa, B. Steipe, P. Demange, C. Eckerskorn, J. Kellermann y R.

Huber, Eur. J. Biochem. 230:788 (1995); y, N. Budisa, i W.

Karnbrock, S. Steinbacher, A. Hum, L. Prade, | T. Neuefeind, L. Moroder y R. Huber, J. Mol. Biol. 270:616 (1997) . Análogos de. metionina con funcionalidades alqueno o alquino también se han incorporado eficientemente, permitiendo modificación adicional de medios químicos. Ver, por ejemplo, J. C. A. Tirrell, FEBS Lett., 428:68 (1998); J. K. L. Kiick y D. A. Tirrell, J. Am. Chem. Soc, 122:1282 I (2000); y, K. L. Kiick y D. A. Tirrell, Tetrahedrón, 56:9487 (2000); Patente de los E.U.A. No. 6,586,20i,7; Publicación de Patente de los E.U.A. No. 2002/004209,7, i que se incorporan aquí por referencia. ! | El éxito de este método depende del reconocimiento de los análogos de amino ácido no naturales por aminoacil -tRNA de sintetizas, que en I general, requieren alta selectividad para asegurar la fidelidad de traducción de proteína. Una forma de expansión del alcance de este método es relajar la especificidad de substrato de aminoacil-tRNA sintetizas, que se ha logrado en un número limitado de casos. Por ejemplo, reemplazo de Ala294 por Gly en fenilalanil-tRNA cintetaza (PheRS) Escherichia coli , aumenta el tamaño de la cavidad de enlace de substrato, y resulta en ¡la acilación de tRNAPhe por p-Cl-fenilalanina (p-Cl-Phe) . Ver, M. Ibba, P. Kast y H. Hennecke, Biochemistry, 33:7107 (1994). Una sepa de Escherichia coli que aloja esta PheRS mutante permite la incorporación de p-Cl-fenilalanina p-Br-fenilalanina en lugar de fenilalanina. Ver, por ejemplo, M. Ibba y H. Hennecke, FEBS Lett-, 364:272 (1995); and, N. Shar a, R. Furter, P. Kast y D. A. Tirrell, FEBS Lett., 467:37 (2000). Similarmente, una mutación punto Phel30Ser cerca el sitio de enlace amino ácido de tirosil-tRNA cintetaza Escherichia coli ¡se I muestra que permite azatirosina incorporada más eficientemente que tirosine. Ver, F. Hamano-Takaku, T.

Iwama, S. Saito-Yano, K. Takaku, Y. Monden, ,M. Kitabatake, D. Soil y S. Nishimura, J. Biol. Chem. 275:40324 (2000) . Otra estrategia para incorporar amino ácido 'no naturales en proteínas in vivo es modificar sintetizas I que tienen mecanismos de reacción. Estas sintetizas ¡no pueden discriminar y por lo tanto activar amino ácidos i que son estructuralmente similares a los amino ácidos conato. Este error se corrige en un sitio separado, que desacila el amino ácido mal cargado del tRNA para mantener la fidelidad de traducción de proteína. Si ¡la actividad de revisión de la sintetaza se desactiva, análogos estructurales que están mal activados puede escapar la función de edición y pueden incorporarse. Este enfoque se ha demostrado recientemente con la valyl-tRNA sintetaza (ValRS) . Ver, V. Doring, H. D. Mootz, L. ¡A. i Nangle, T. L. Hendrickson, V. de Crecy-Lagard, 'P. I Schimmel y P. Marliere, Science, 292:501 (2001). ValRS puede malaminoacilar tRNAVal con Cys, Thr, ¡ o aminobutirato (Abu) ; estos aminos ácidos no conato I subsecuentemente se hidrolizan al dominio de edición. Después de mutagénesis aleatoria del cromosoma ¡de Escherichia coli , una sepa de Escherichia coli mutante 'se elige que tenga una mutación en el sitio de edición i¡de i ValRS . Esta ValRS defectuosa en edición car¡ga incorrectamente tRNAVal con Cys. Debido a que Abu seme'ja I Cys esféricamente a (grupo -SH de Cys se reemplaza coni - CH3 en Abu) , la ValRS mutante también incorpora Abu en proteínas cuando esta sepa de Escherichia coli mutante 'se desarrolla en la presencia de Abu. Análisis espectrométrico de masas muestra que aproximadamente 24% de valinas se reemplan por Abu a cada posición valina en la proteína nativa. I Síntesis de fase sólida y métodos semi- I sintéticos también han permitido la síntesis de una cantidad de proteínas que contienen amino ácidos novedosos. Por ejemplo, ver. las siguientes publicaciones y referencias citadas que, son como sigue: Crick, F.J.G., Barrett, L. Brenner, S. Watts-Tobin, R. General nature \ of E.T. Synthetic approaches to biologically active peptides y proteins including enyzmes, Ace Chem Res, 47-54 (1989J) ; Nakatsuka, T., Sasaki , T., Kaiser, E.T. Peptide segment coupling catalyzed by the semi synthetic enzyme thiosubtilisin, J Am Chem Soc, 3808-3810 (1987Í) ; Schnolzer, M. , Kent, S B H. Constructing proteins by dovetailing unprotected synthetic peptides : backbo?e-engineered HIV protease, Science, 256 (5054) : 221-225 (1992) ; Chaiken, LM. Semisynthetic peptides y proteins, I CRC Grit Rev Biochem. 11 (3) : 255-301 (1981); Offord, R.E. i Protein engineering by chemical means Protein EngL , 1(3): 151-157 (1987); and, Jackson, D.Y. , Burnier, J? , Quan, C, Stanley, M., Tom, J. , Wells, J.A. A Designed Peptide Ligasefor Total Synthesis of Ribonuclease A wi th Unnatural Catalytic Residues, Science, 266 (5183) : 243 (1994) . Modificación química se ha empleado para introducir una variedad de cadenas laterales ,no naturales, incluyendo cofactores, etiquetas de espini y oligonucleótidos en proteínas in vitro. Ver, por ejemplo, Corey, D.R., Schultz, P. G. Generation of a hybrid sequence- specific single -stranded deoxyribonuc léase, Science, 238 (4832) : 1401-1403 (1987); Kaiser, E.T., Lawrence D.S., Rokita, S.E. The chemical modification of enzymatic specifici ty, Annu Rev Biochem, 54:565- 595 I ( 1985 ) ; Kaiser, E . T . , Lawrence , D . S . Chemical mutation ofenyzme active si tes, Science, 226 (4674) : 505-511 (1984'); I Neet, K.E., Nanci A, Koshland, D.E. Properties of thi?l -subtilisin, J Biol . Chem, 243 (24) : 6392-6401 (1968); Polgar, L.B., M.L. A new enzyme containing ¡ a synthetically formed active si te. Thiol -subtilisin . J. Am Chem Soc, 3153-3154 (1966); y, Pollack, SJ., Nakayama, |G. i Schultz, P. G. Introduction of nucleophiles I y spectroscopic probes into antibody combining si tes, Science, 242 (4881) : 1038-1040 (1988). ¡ En forma alterna, métodos biosinteticos que I emplean aminoacil-tRNAs químicamente modificados se han empleado para incorporar varias sondas biofísicas 'en proteínas sintetizadas in vitro. Ver las siguientes publicaciones y referencias citadas en: Brunner, J. New Photolabeling y crosslinking methods, Annu. Rev Biochem, I 62:483-514 (1993); y, Krieg, U.C., Walter, P., Hohnson, A.E. Photocrosslinking of the signal sequence of nascent preprolactin of the 54 -kilodal ton polypeptide of the signal recogni tion particle, Proc. Nati. Acad. Sci, 83 (22) :8604-8608 (1986). I I Previamente, se ha mostrado que amino ácidos ¡no naturales pueden ser incorporados específicamente 'en i sitio en proteínas in vitro por la adición de tRNAs i supresores químicamente aminoacilados en reacciones ,de I síntesis de proteína programadas con un gen que contiene I una mutación sin sentido ámbar deseada. Utilizando estos enfoques, se puede sustituir una cantidad de los veinte amino ácidos comunes con homólogos estructurales cercanos, por ejemplo fluorofenilalanina por i fenilalanina, utilizando sepas auxotropicas para un amino I ácido particular. Ver, por ejemplo, Noren, C.J., Anthony-Cahill, Griffith, M.C., Schul tz , P. G. A general method for si te-specific incorporation of unnatural amino ácidos into proteins, Science, 244: 182-188 (1989); M. W. Nowak, et al., Science 268:439-42 (1995); Bain, J.D. , Glabe, C.G., Dix, T.A., Chamberlin, A.R., Diala, E.¡S. Biosynthetic site-specific Incorporation of a non -natural amino acid into a polypeptide, J . Am Chem Soc , 111 : 80|13 - I 8014 (1989); N. Budisa et al., FASEB J. 13:41-51 (1999); EUman, J.A. , Mendel, D., Anthony-Cahill , S., Noren, CJ. , Schultz, P.G. Biosynthetic method for introducing unnatural amino acids si te-specifically into proteihs, Methods in Enz . , 301-336 (1992); and, Mendel, D., Cornish, V.W. & Schultz, P.G. Si te-Directed Mutagenesis wi th an Expanded Gene tic Code, Annu Rev Biophys . Biomol I Struct. 24, 435-62 (1995). ¡ I Por ejemplo, un tRNA supresor se prepara que I reconoce el codon de parada UAG y se amino asila i químicamente con amino ácido no natural . Mutagenéis dirigido por sitio convencional se utiliza para i introducir el codon de parada TAG, en el sitio de interés en el gen de proteínas. Ver por ejemplo Sayers, J.R., ¡ Schmidt, W. Eckstein, F. 5', 3' Exonuclease in i phosphorothioate-based olignoucleotide-direcúed mutagensis , Nucleic Acids Res, 16(3) :791- 802 (1988). i Cuando el tRNA supresor asilado y el gen mutante ¡se combinan en un sistema de transcripción/traducción ¡¡in vitro, el amino ácido no natural se incorpora en respuesta al codon UAG que dio una proteína que contiene ese amino ácido en la posición especificada. Experimentos utilizando [3H] -Phe y experimentos con alfa-hidroxiacidos i demostraron que solo el amino ácido deseado se incorpora en la posición especificad por el codon UAG y que este amino ácido no se incorpora en cualquier otro sitio en la proteína. Ver Noren, et al, supra ; Kobayashi et al., (2003) Nature Structural Biology 10 (6) :425-432 ; an¡d, I Ellman, J.A. , Mendel, D., Schultz, P.G. Si te-specific incorporation of novel backbone structures into protei?s , Science, 255 (5041) : 197-200 (1992). i Técnicas de microinyección también han I utilizado incorporar amino ácido no naturales en proteínas. Ver, por ejemplo, M. W. Nowak, P. C. Kearney, J. R. Sampson, M. E. Saks, C. G. Labarca, S. K.

Silverman, W. G. Zhong, J. Thorson, J. N. Abelson, N.

Davidson, P. G. Schultz, D. A. Dougherty y H. A. Lester, Science, 268:439 (1995); y, D. A. Dougherty, Curr. Opin. Chem. Biol . , 4:645 (2000). Un oocito Xenopus se coinyecta con dos especies RNA hechas in vitro: un mRNA que codifica la proteína diana con un codon de parada UAG en la posición amino ácido de interés y un tRNA supres¡or ámbar aminoacilado con el amino ácido no natural deseadp. La maquinaria de traducción del oocito inserta entonces i el amino ácido no natural en la posición especificada por UAG. Este método ha permitido estudios de funcióh- I estructura in vivo de proteínas de membrana integral, qµe i en general no son susceptibles a sistemas de expresión ín vitro. Ejemplos incluyen la incorporación de un amino ácido fluorescente en el receptor taquinina neuroquinina-2 para medir distancias por la transferencia de energía de resonancia por fluorescencia, ver por ejemplo, G.

Turcatti, K. Nemeth, M. D. Edgerton, U. Meseth, ' F. I Talabot, M. Peitsch, J. Knowles, H. Vogel y A. Chollet, J. Biol. Chem., 271:19991 (1996); la incorporación | de amino ácidos biotinilados para identificar residuos I expuestos en superficie en canales de iones, ver por I ejemplo, J. P. Gallivan, H. A. Lester y D. A. Dougherty, Chem. Biol . , 4:739 (1997); el uso de análogos tirosina enjaulados para supervisar cambios de conformación en lun canal de iones en tiempo real, ver por ejemplo, J. le. Miller, S. K. Silverman, P. M. England, D. A. Dougherty y H. A. Lester, Neuron, 20:619 (1998); y el uso de alfa hidroxi amino ácido para cambiar estructuras principales de canal de ion para sondear sus mecanismos 'de i I compuertas. Ver por ejemplo, P. M. England, Y. Zhang, ¡D. I A. Dougherty y H. A. Lester, Cell, 96:89 (1999); y T. Lu, I A. Y. Ting, J. Mainland, L. Y. Jan, P. G. Schultz y J. Yang, Nat. Neurosci., 4:239 (2001). | i La capacidad por incorporar aminoácidos ho naturales directamente en proteínas in vivo, ofrece las ventajas de altos rendimientos de proteínas mutantes, facilidad técnica, el potencial por estudiar las i proteínas mutantes en células o posiblemente en organismos vivos y el uso de estas proteínas mutantes en tratamientos terapéuticos. La capacidad por incluir aminoácidos no naturales con diversos tamaños, acideces, nucleofilicidades, hidrofobicidades y otras propiedades en proteínas, puede expander enormemente nuestra habilidad para manipular en forma racional y sistemática las estructuras de proteínas, tanto para sondear ¡la i función de proteínas como crear nuevas proteínas | u organismos con novedosas propiedades. Sin embargo, ¡el proceso es difícil debido a la naturaleza compleja de las interacciones tRNA-sintetasa que se requieren para lograr i un alto grado de fidelidad en traducción de proteínas. | En un intento por incorporar específicamente ¡en sitio para-F-Phe, un par supresor ámbar de levadu'ra tRNAPheCUA /fenilalanil-tRNA sintetasa se empleó en ¡un sepa de Escherichia coli auxotrófica Phe, resistente a p- F-Phe. Ver R. Furter, Protein Sci, 7:419 (1998). ¡ I También puede ser posible el obtener expresión í de un polinucleótido ABP de la presente invención utilizando un sistema de traducción libre de células (in-vitro) . En estos sistemas, que pueden incluir ya sea I rnRNA como una plantilla (traducción in Vitro) o DNA como I una plantilla (transcripción y traducción combinada in Vitro), la síntesis in Vitro se dirige por los ribosomas . i Esfuerzo considerable se ha aplicado al desarrollo de i sistemas de expresión de proteínas libres de células. Ver por ejemplo Kim, D.-M. y J.R. Swartz, Biotechnology ' y Bioengineering, 74 :309- 316 (2001); Kim, D.-M. y J . '.X Swartz, Biotechnology Letters, 22, 1537-1542, (2000); I Kim, D.-M., y J.R. Swartz, Biotechnology Progress, 16, 385-390, (2000); Kim, D.-M., y J.R. Swartz, Biotechnology y Bioengineering, 66, 180-188, (1999) ; y Patnaik, R.

J.R. Swartz, Biotechniques 24, 862-868, (1998); patente i de los EUA número 6,337,191; publicación de patente de puede aplicarse a la expresi n de polip ptidos de enlace de antígeno que comprende un aminoácido no naturalmente codificado, incluye la técnica de fusión mRNA-péptido. Ver por ejemplo R. Roberts y J. Szostak, Proc . Nati Acad .

Sci . (USA) 94:12297- 12302 (1997); A. Frankel , et al, Chemistry & Biology 10:1043-1050 (2003). En este enfoqué, una plantilla de mRNA enlazada con puromicina se traduce en péptido en el ribosoma. Si se han modificado una o más moléculas de tRNA, aminoácidos no naturales pueden incorporarse en el péptido por igual. Después de que se ha leído el último codon mRNA puromicina captura el extremo C del péptido. Si el conjugado mRNA-péptido resultante se encuentra que tiene propiedades interesantes en un ensayo in Vitro, su identidad puede revelarse fácilmente de la secuencia mRNA. De esta manera se pueden supervisar bibliotecas de polipéptidos ¡de enlace de antígeno que comprenden uno o más aminoácidos i no naturalmente codificados para identificar polipéptid'os que tienen propiedades deseadas. Mas recientement , traducciones de ribosomas in Vitro con componentes purificados se han reportado que permiten la síntesis ¡de I péptidos substituidos con aminoácidos no naturalmente codificados. Ver A. Forster et al., Proc. Nati Acad. Sci. (USA) 100:6353 (2003). IX. Polímeros macromoleculares acoplados a ABP Diversas modificaciones a los péptidos de aminoácidos no naturales descritos aquí pueden efectuarge I utilizando las composiciones métodos, técnicas ¡y estrategias descritas aquí. Estas modificaciones incluyen la incorporación de adicional funcionalidad en el componente de aminoácido no natural del polipéptido incluyendo pero no limitado a una etiqueta; un colorante; un polímero; un polímero soluble en agua, un derivado polietilen glicol; un foto-entrelazador; un radio núclido, un compuesto citotóxico; una droga, una etiqueta de afinidad, una etiqueta de foto-afinidad, un compuesto reactivo, una reina, una segunda proteína o polipéptido I o análogo de polipéptido; un anticuerpo o fragmento de anticuerpo, un quelador de metal, un cofactor, un ácido graso, un carbohidrato, un polinucleótido, un DNA, un RNA, un polinucleótido anti-sentido, un dendrímero soluble en agua, una ciclodextrina, un ácido ribonucleico inhibitorio un biomaterial, una nanopartícula, una etiqueta de espin, un fluoroforo, una porción que contiene metal, una porción radioactiva, un grupo funcional novedoso, un grupo que interactúa covalente o no covalentemente con otras moléculas, una porción fot¡o-enjaulada, una porción foto-isomerizable, biotina, ¡un derivado de biotina, un análogo de biotina, una porci n que incorpora un átomo pesado, un grupo químicamente escindible, un grupo fotoescindible, una cadena later l alargada, un azúcar enlazada con carbono, un agente redjox activo, un amino-tioácido, una porción tóxica, una porción isotópicamente etiquetada, una sonda biofísica, i un grupo fosforecente, un grupo quimioluminiscente, un grupo denso en electrones, un grupo magnético, un grupo I de intercalado, un cromóforo, un agente de transferencia de energía, un agente biológicamente activo, una etiqueta detectable, una pequeña molécula o cualquier combinación de los anteriores, o cualquier otro compuesto o sustancia deseable. Como un ejemplo ilustrativo no limitante de las i composiciones, métodos, técnicas y estrategias aquí I descritas, la siguiente descripción se enfocará en i agregar polímeros macromoleculares al polipéptido i I I i aminoácido no natural con el entendido de que las composiciones, métodos, técnicas y estrategias aquí descritos también son aplicables (con modificaciones apropiadas, de ser necesario y para las cuales una persona con destreza en la técnica podrá producir con l¡as presentes descripciones) para agregar otras funcionalidades, incluyendo pero no limitadas a aquellas citadas anteriormente. | I Una amplia variedad de polímeras macromoleculares y otras moléculas puede enlazarse cpn polipéptidos de enlace de antígeno de la presente invención, para modular propiedades biológicas del ABP, y/o proporcionar nuevas propiedades biológicas a la molécula ABP. Estos polímeros macromoleculares pueden enlazarse al ABP mediante un aminoácido naturalmente codificado mediante un aminoácido no naturalmente | codificado o cualquier sustituyente funcional de µn I aminoácido natural o no natural o cualquier sustituyente o grupo funcional agregado a un aminoácido natural o no natural. El peso molecular del polímero puede ser de un amplio rango incluyendo pero no limitado a entre aproximadamente 100 Da y aproximadamente 100,000 Da más . I La presente invención proporciona preparaciones substancialmente homogéneas de conjugados polímeros: proteínas. "Substancialmente homogénea" como se empela aquí significa que las moléculas de conjugado polímero: proteína se observan mayores que la mitad de la proteína total. El conjugado polímero: proteína tiene actividad biológica y las preparaciones ABP modificadas con polietilen glicol "substancialmente homogéneas" acuí proporcionadas son aquellas que son suficientemente homogéneas para exhibir las ventajas de una preparación homogénea, por ejemplo facilidad en aplicación clínica en pronóstico de farmacocinética lote a lote. También se puede elegir el preparar una mezcla de moléculas conjugadas polímero: proteína y la venta'ja que aquí se proporciona es que se puede seleccionar i¡la proporción de conjugado mono-polímero : proteína para i incluirlo en la mezcla. De esta manera, si se desea se puede preparar una mezcla de diversas proteínas cpn diversos números de porciones polímero conectadas (i.e¡. , i di-, tri-, térra-, etc.) y combinar estos conjugados con I el conjugado mono-polímero : proteína que se prepara I utilizando los métodos de la presente invención, y tener una mezcla con una proporción predeterminada de conjugados mono-polímero: proteína. j El polímero seleccionado puede ser soluble en agua de manera tal que la proteína a la cual se conecta no precipita en un ambiente acuoso, tal como un ambiente fisiológico. El polímero puede ser ramificado o sin I ramificar. De preferencia, para uso terapéutico de 'la preparación del producto final, el polímero será farmacéuticamente aceptable. ¡ La proporción de moléculas de polietilen glicol a moléculas de proteína variará, al igual que sus concentraciones en la mezcla de reacción. En general, ,1a proporción óptima (en términos de eficiencia de reacción ya que hay exceso reaccionar) puede polietilen glicol reactivos disponibles. En lo referente a peso molecular, típicamente entre mayor sea el peso molecular del polímero, menor será el número de moléculas de polímero que puedan conectarse a la proteína. Similarmente, 'la ramificación del polímero deberá tomarse en cuenta cuando se optimizan estos parámetros. En general, entre mayor sea el peso molecular (o las más ramificaciones) mayor será la proporción de polímero: proteína. i Como se emplea aquí, y cuando se contempla ¡en conjugados PEG:ABP, el término "cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a una cantidad que da el beneficio deseado a un paciente. La cantidad variará de un individuo a otro y dependerá de un número de factores, incluyendo la condición física total del paciente y la causa subyacente de la condición a tratar. La cantidad 'de I polipéptido ABP utilizado para terapia da una velocidad de cambio aceptable y mantiene respuesta deseada a un nivel benéfico. La cantidad terapéuticamente efectiva ¡de las presentes composiciones puede evaluarse fácilmente por una persona con destreza en la técnica utilizando materiales y procedimientos públicamente disponibles. El polímero soluble en agua puede ser cualquier forma estructural incluyendo pero no limitada a lineal, en orquilla o ramificada. Típicamente, el polímero soluble en agua es un poli (alquilen glicol) , tal como poli (etilen glicol) (PEG) , pero otros polímeros solubles en agua también pueden emplearse. A manera de ejemplo, PEG se emplea para describir ciertas modalidades de esta i invención. i PEG es un polímero soluble en agua bi¡en conocido que está comercialmente disponible o puede I prepararse por polimerización de abertura de anillo de i etilen glicol de acuerdo con métodos bien conocidos en la especialidad (Sandler y Karo, Polymer Synthesis, Academíc Press, New York, Vol. 3, pages 138-161). El término "PEG" se emplea ampliamente para abarcar cualquier molécula de i polietilen glicol sin considerar el tamaño o modificación en un extremo del PEG, y puede representarse como se enlaza al ABP por la fórmula: ¡ XO- (CH2CH20)n-CH2CH2-Y en donde n es 2 a 10,000 y X es H o una modificación terminal incluyendo pero no limitado a un C?_4 alquilo. En algunos casos, un PEG empleado en ^a invención termina en un extremo con un hidroxi o metoxi, i es decir X es H o CH3 ("niethoxy PEG"). En forma alterna, el PEG puede terminar con un grupo reactivo, formando de esta manera un polímero bifuncional. Grupos reactivos típicos pueden incluir aquellos grupos reactivos que se emplean comúnmente para reaccionar con los grupps funcionales que se encuentran en los 20 aminoácidos comunes (incluyendo pero no limitado a grupos maleimida, carbonatos activados (incluyendo pero no limitado a p-nitrofenil ester) esteres activados (incluyendo pero no limitado a N-hidroxisuccinimida, p-nitrofenil éster) aldehidos) , al igual que grupos funcionales que son inertes a los 20 aminoácidos comunes pero que reaccionan específicamente con grupos funcionales complementarios presentes en aminoácidos no naturalmente codificados (incluyendo pero no limitados a grupos azida, grupos alquino) . Se nota que el otro extremo del PEG que se I ilustra en la fórmula anterior por Y se conectará ya directa o indirectamente con un polipéptido con enlace de antígeno mediante un aminoácido de origen natural o no naturalmente codificado. Por ejemplo, Y puede ser un enlace amida, carbamato o urea con un grupo amina (incluyendo pero no limitado a epsilón amina de lisinaj o el extremo N) del polipéptido. En forma alterna, Y puejde ser un enlace maleimida con un grupo tiol (incluyendo pero no limitado a el grupo tiol de cisteína) . En forma alterna, Y puede ser un enlace a un residuo no comúnmente accesible mediante los 20 aminoácidos comunes. Ppr ejemplo, un grupo azida en el PEG puede reaccionarse c¡on un grupo alquino en el ABP para formar un producto ¡de cicloadición Huisgen [3+2] . En forma alterna, un grupo alquino en el PEG puede reaccionarse con un grupo azida presente en un aminoácido no naturalmente codificado para formar un producto similar. En algunas modalidades, puede reaccionarse un fuerte nucleófilo (incluyendo pero no I limitado a hidrazina, hidrazida, hidroxilamina, semicarbazida) con un grupo aldehido o cetona presente en un aminoácido no naturalmente codificado para formar una hidrozona, oxima o semicarbazona según aplique, que algunos casos puede ser reducido adicionalmente tratamiento con el agente reductor apropiado. En forma alterna, el fuerte nucleófilo puede incorporarse en el ABP mediante un aminoácido no naturalmente codificado , y utilizarse para reaccionar preferencialmente con un grupo I I I i cetona o aldehido presente en el polímero soluble en agua . i Cualquier masa molecular para un PEG puede utilizarse como sea prácticamente conveniente, incluyendo pero no limitado a de aproximadamente 100 Daltons (Da) 100,000 Da o más según se desee (incluyendo pero no limitado a en ocasiones 0.1-50 kDa o 10-40 kDa). PEGs de I cadena ramificada, incluyendo pero no limitado | a i moléculas PEG con cada cadena que tiene MW en él intervalo de 1-100 kDa (incluyendo pero no limitado a 1-50 kDa o 5-20 kDa) también puede emplearse. Un amplio rango de moléculas de PEG se describen en, incluyendo pero no limitado al catálogo de Shearwater Polymers, Inc., catálogo Nektar Therapeutics, incorporados aquí ppr referencia. En general, al menos un extremo de la molécula PEG está disponible para reacción con el aminoácido ho naturalmente codificado. Por ejemplo, derivados PEG que i contiene porciones alquino y azida para reacción con cadenas laterales aminoácido, pueden utilizarse para conectar PEG a aminoácidos no naturalmente codificados | como se describe aquí . Si el aminoácido no naturalmente i codificado comprende una azida, entonces el PEG contendrá típicamente ya sea una porción de alquino para efectuar la formación del producto de cicloadición [3+2] o una especie PEG activada (es decir éster, carbonato) que contiene un grupo fosfino para efectuar la formación del enlace amida. En forma alterna, si el aminoácido no ¡ naturalmente codificado comprende un alquino, entonces el I-PEG típicamente contendrá una porción azida para efectuar la formación del producto de cicloadición Huisgen [3+2!] .

Si el aminoácido no naturalmente codificado comprende un grupo carbonilo, el PEG típicamente comprenderá un i nucleófilo potente (incluyendo pero no limitado a una funcionalidad hidrazida, hidrazina, hidroxilamina ' o semicarbazida) , a fin de efectuar formación de los correspondientes enlaces hidrazona, oxima y semicarbazona, respectivamente. En otras alternativas, una inversión de la orientación de los grupos reactivos descritos anteriormente puede emplearse, es decir una porción azida en el aminoácido no naturalmente codificado I puede reaccionarse con un derivado PEG que contiene un alquino. En algunas modalidades, la variante ABP con un derivado PEG contiene una funcionalidad química que es reactiva con la funcionalidad química presente en la cadena lateral del aminoácido no naturalmente codificado. La invención proporciona en algunas modalidades derivados polímero que contienen azida , y acetileno que comprenden una estructura principal de polímero soluble en agua que tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 800 Da a aproximadamente 100,000 Da. La estructura principal de polímero del polímero soluble en agua puede ser poli (etilen glicolj) . Sin embargo, habrá de notarse que una amplia variedad de polímeros solubles en agua incluyendo pero no limitados a, poli (etilen) glicol y otros polímeros relacionados, incluyendo poli (dextran) y poli (propilen glicol), s¡on también convenientes para utilizar en la práctica de esta invención y que el uso del término PEG o poli (etilen glicol) se pretende que abarque o incluya todas est'as moléculas. El término PEG incluye, pero no está limitado a poli (etilen glicol) en cualquiera de sus formas, incluyendo PEG bifuncional, PEG de múltiples brazos, PEG derivatizado, PEG en orquilla, PEG ramificado, PEG secundario (es decir, PEG o polímeros relacionados que tienen uno o más grupos funcionales secundarios a la estructura principal de polímero) , o PEG con enlaces i degradables ahí . ¡ PEG típicamente es claro, incoloro, inoloro, soluble en agua, estable al calor, inerte a muchos agentes químicos, no se hidroliza o deteriora y n general no es tóxico. Poli (etilen glicol) se considera biocompatible, es decir que PEG es capaz de coexistencia con tejidos u organismos vivos sin provocarles daño. Más específicamente, PEG es sustancialmente no inmunogénicp, es decir, el PEG no tiende a producir una respuesta inmune en el cuerpo. Cuando se conecta a una molécula que ¡ tiene alguna función deseable en el cuerpo, tal como un agente biológicamente activo, el PEG tiende a enmascarar el agente y puede reducir o eliminar cualquier respuesta inmune de manera tal que un organismo pueda tolerar la presencia del agente. Conjugados PEG tienden a ¡no producir una respuesta inmune sustancial o provocar ¡ coagulación u otros efectos inconvenientes. PEG tiene la i fórmula - CHCH20- (CH2CH20) n - CH2CH2-, en donde n es de aproximadamente 3 a aproximadamente 4000, típicamente de aproximadamente 20 a aproximadamente 2000, es adecuado para utilizar en la presente invención. PEG que tiene un peso molecular de aproximadamente 800 Da a aproximadamente 100,000 Da en algunas modalidades de la presente invención son particularmente útiles como la estructura principal de polímero. La estructura principal de polímero puede ser i lineal o ramificada. Estructuras principales de polímero ramificadas en general se conocen en la técnica.

Típicamente, un polímero ramificado tiene una porción núcleo de ramificación central y una pluralidad de cadenas poliméricas lineales enlazadas con el núcleo de ramificación central. PEG se emplea comúnmente en formas I 1 ramificadas que pueden prepararse por adición de etilén glicol a diversos polioles, tales como glicerol, oligómeros de glicerol, pentaeritritol y sorbitol. La porción de ramificación central también puede derivarse de varios aminoácidos tales como lisina. El poli (etilen glicol) ramificado puede representarse en la forma general como R(-PEG-OH)m, en donde R se deriva de una porción núcleo, tal como glicerol, oligómeros de gliceril o pentaeritritol, y n representa el número de brazos. Moléculas de PEG de múltiples brazos tales como aquellas descritas en las patentes de los E.U.A. números 5,932,462 5,643,575; 5,229,490; 4,289,872; solicitud de patente de los E.U.A. número 2003/0143596; WO 96/21469; y ljíO 93/21259, cada una de las cuales aquí se incorpora por referencia totalmente, también pueden emplearse, la i estructura principal de polímero. , PEG ramificado también puede estar en la forma de un PEG en orquilla, representado por PEG (-YCHZ2) n, en donde Y es un grupo de enlace y Z es un grupo terminal activado enlazado a CH por una cadena de átomos de longitud definida. Todavía otra forma ramificada, el PEG secundario tiene grupos reactivos tales como carboxilo, sobre la estructura principal PEG en el extremo de las cadenas PEG.

Además de estas formas de PEG, el polímero también puede prepararse con enlaces débiles o degradables en la estructura principal. Por ejemplo, PEG I puede prepararse con enlaces éster en la estructura principal del polímero que están sujetos a hidrólisis. Como se muestra a continuación, esta hidrólisis resulta en escisión del polímero en fragmentos de menor peso molecular: i -PEG-C02-PEG-+H20 -> PEG-C02H+HO-PEG- Se entiende por aquellos con destreza en la técnica que el término poli (etilen glicol) o PEG representa o incluye todas las formas conocidas en la especialidad incluyendo pero no limitadas a aquellas aquí descritas. ¡ Muchos otros polímeros son también adecuados para utilizar en la presente invención. En algunas modalidades, estructuras principales de polímero que son solubles en agua, con de 2 a aproximadamente 300 extremos, son particularmente útiles en la invención. Ejemplos de polímeros convenientes incluyen pero no están limitados a otros poli (alquilen glicoles), tales como poli (propilen glicol) ("PPG"), sus copolímeros (incluyendo pero no limitados a copólímeros de etilén glicol y propilen glicol) , sus terpolímeros, sus mezclas y semejantes. Aunque el peso molecular de cada cadena de la estructura principal de polímero puede variar, típicamente está en el intervalo de aproximadamente 800 Da a aproximadamente 100,000 Da, a menudo de i aproximadamente 6,000 Da a aproximadamente 80,000 Da. i Aquellos con destreza ordinaria en la especialidad reconocerán que la lista anterior de estructuras principales sustancialmente solubles en agua I de ninguna manera es exhaustiva y es solamente ilustrativa, y que todos los materiales poliméricos que tienen las cualidades anteriormente descritas, se i contemplan como adecuados para utilizar en la presente invención. ' En algunas modalidades de la presente invención, los derivados de polímero son "multi- I funcionales", lo que significa que la estructura principal de polímero tiene cuando menos dos extremos, posiblemente tantos como aproximadamente 300 extremos, funcionarizados o activados con un grupo funcional. Derivados de polímeros multifuncionales incluyen pero no están limitados a polímeros lineales que tienen dos i extremos, cada extremo está unido a un grupo funcional que pueden ser iguales o diferentes. i En una modalidad, el derivado polímero tiene I la estructura: ! X- A- POLY- B-N=N=N en donde : N=N=N es una porción azida; B es una porción de enlace, que puede estar presente ausente; POLY es un polímero no antihigiénico soluble en agua; A es una porción de enlace que puede estar presente ausente y que puede ser la misma que B o diferente; y X es un segundo grupo funcional. Ejemplos de una porción de enlace para A y B se incluyen pero no están limitados a, un grupo alquilo múltiple funcionarizado que contiene hasta 18, y más preferiblemente de entre 1 a 10 átomos de carbono. Un heteroátomo tal como nitrógeno, oxígeno azufre puede incluirse con la cadena alquilo. La cadena alquilo también puede ramificarse en una heteroátomo. Otros ejemplos de una porción de enlace para A y B se incluyen pero no están limitados a un grupo arilo de múltiples funcionalidades, que contiene hasta 10 y más preferiblemente 5 a 6 átomos de carbono. El grupo arilo puede estar sustituido con uno o más átomos de carbono, nitrógeno, oxígeno o azufre. Otros ejemplos de grupos de enlace convenientes incluyen aquellos grupos de enlace descritos en las patentes de los E.U.A. números 5,932,462; 5,643,575; y la publicación de la solicitud de patente de los E.U.A. número 2003/0143596, cada una ce las cuales aquí se incorpora por referencia. Aquellos con destreza ordinaria en la especialidad reconocerán que la lista anterior para porciones de enlace de ninguna manera es exhaustiva y simplemente es ilustrativa, y que tode.s las porciones de enlace que tienen las cualidades descritas anteriormente se contemplan adecuadas para utilizar en la presente invención. Ejemplos de grupos funcionales convenientes para utilizar como X incluyen pero no están limitados a, hidroxilo, hidroxilo protegido, alcoxi, éster activo tal como N-hidroxisuccinimidil esteres y 1-benzotriazolil esteres, carbonato activo, tales como N-hidroxisuccinimidil carbonatos y 1-benzotriazol?l carbonatos, acetal, aldehido, aldehido hidratos, alquenilo, acrilato, metacrilati, acrilamida, sulfona activa, amina, aminooxi, amina protegida, hidrazida, hidrazida protegida, tiol protegido, ácido carboxílixo, ácido carboxílico protegido, isocianato, isotiocianato, maleimida, vinilsulfona, ditiopiridina, vinilpiridina, yodoacetamida, epóxido, glioxales, dionas, mesilatos, tosilatos, tresilato, alqueno, cetona y azida. Como se entiende por aquellos con destreza en la técnica, la porción X selecta deberá ser compatible con el grupo azida de manera tal que la reacción con el grupo azida no ocurra. Los derivados de polímero que contienen azida pueden ser homobifuncionales, lo que significa que el segundo grupo funcional (es decir, X) también es una porción azida o heterobifuncional, lo que significa que el segundo grupo funcional ' es un grupo funcional diferente . EL término "protegido" se refiere a la presencia de un grupo o porción protectora que evita la reacción del grupo funcional químicamente reactivo ba¡ o ciertas condiciones de reacción. EL grupo protector variará dependiendo del tipo de grupo químicamente reactivo que se protege. Por ejemplo, si el grupo químicamente reactivo es una amina o una hidrazida, el grupo protector puede seleccionarse del grupo de ter-butiloxicarbonil (t- Boc) y 9-fluorenilmetoxicarbom.l (Fmoc) . Si el grupo químicamente reactivo es un tiol, el grupo protector puede ser ortopiridildisulfuro. Si el grupo químicamente reactivo es un ácido carboxílico, tal como ácido butanoico o propiónico, o un grupo hidroxilo, el grupo protector puede ser benzilo o alquilo tal como metilo, etilo o terbutilo. Otros grupos protectores conocidos en la técnica también pueden emplearse en la presente invención. Ejemplos específicos de grupos funcionales terminales en la literatura incluyen pero no están limitados a, N-succinimidil carbonato (ver por ejemplo, las patentes de los E.U.A. números 5,281,698, 5,468,478), amina (ver por ejemplo, Buckmann et al. Makromol . Chem. 182:1379 (1981), Zaplipsky et al. Eur. Polym. J. 19:1177 (1983)), hidrazida (ver por ejemplo, Andresz et a].. Makromol. Chem. 179:301 (1978)), succinimidil propiona o y succinimidil butanoato (ver por ejemplo, Olson et al. in Poli (etilen glicol) Chemistry & Biological Applications, pp 170-181, Harris & Zaplipsky Eds., ACS, Washington, D.C., 1997; ver también la patente de los E.U.A. número 5,672,662), succinimidil succinato (ver por ejemplo, Abuchowski et al. Cáncer Biochem. Biophys. 7:175 (1984) y Joppich et al. Macrolol . Chem. 180:1381 (1979), succinimidil éster (ver por ejemplo, la patente de los E.U.A. número 4,670,417), benzotriazol carbonato (ver por ejemplo, la patente de los E.U.A. número 5,650,234), glicidil éter (ver por ejemplo, Pitha et al. Eur. ¡J Biochem. 94:11 (1979), Elling et al., Biotech. Appl. Biochem. 13:354 (1991), oxicarbonilimidazol (ver por ejemplo, Beauchamp, et al., Anal. Biochem. 131:25 (1983), Tondelli et al. J. Controlled Reléase 1:251 (1985)), p-nitrofenil carbonato (ver por ejemplo, Veronese, et al., Appl. Biochem. Biotech., 11: 141 (1985); y Sartore et al., Appl. Biochem. Biotech., 27:45 (1991)), aldehido (ver por ejemplo, Harris et al. J. Polym. Sci. Chem. Ed. 22:341 (1984), patente de los E.U.A. número 5,824,784, patente de los E.U.A. número 5,252,714), maleimida (ver por ejemplo, Goodson et al. Bio/Technology 8:343 (1990), Romani et al. in Chemistry of Peptides and Proteins 2:29 (1984)), y Kogan, Synthetic Comm. 22:2417 (1992)), ortopiridil-disulfuro (ver por ejemplo, Woghiren, et a.. . Bioconj . Chem. 4:314(1993)), acrilol (ver por ejemplo, Sawhney et al., Macromolecules, 26:581 (1993)), vinilsulfona (ver por ejemplo, la patente de los E.U.A. número 5,900,461). Todas las referencias y patentes anteriores se incorporan aquí por referencia. En ciertas modalidades de la presente invención, los derivados polímero de la invención comprenden una estructura principal polímero que tiene la estructura: X-CH2CH20- (CH2CH20)n -CH2CH2 -N=N=N en donde : X es un grupo funcional como se de describió anteriormente; y n es aproximadamente 20 a aproximadamente 4000. En otra modalidad, los derivados de polímero de la invención comprenden una estructura principal de polímero que tiene la estructura: X-CH2CH20- (CH2CH20)n -CH2CH2 - 0-(CH2)m W-N=N=N en donde: W es una porción enlazadora alifática o aromática que comprende entre 1 y 10 átomos de carbono; n es aproximadamente 20 a aproximadamente 4000; y X es un grupo funcional como se describió anteriormente m está entre 1 y 10. Los derivados PEG que contienen azida de la invención pueden prepararse por una variedad de métodos conocidos en la especialidad y/o descritos aquí. En un método, mostrado a continuación, una estructura principal de polímero soluble en agua que tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 800 Da a aproximadamente 100,000 Da, la estructura principal de polímero tiene un primer extremo unido a un primer grupo funcional y un segundo extremo unido a un grupo saliente conveniente, se reacciona con un anión azida (que puede aparearse con cualquiera de una cantidad de contraiones convenientes, incluyendo sodio, potasio, terbutil amonio y así n adelante) . El grupo saliente se somete a desplazamiento nucleofílico y se reemplaza por una porción azida, dando por resultado el polímero PEG que contiene azida deseadp, X-PEG-L + N3~ -> X-PEG-N3 Como se muestra, una estructura principal de polímero conveniente para utilizar en la presente invención tiene la fórmula X-PEG-L, en donde PEG es poli (etilen glicol) y X es un grupo funcional que no reacciona con grupos azida y L es un grupo saliente conveniente. Ejemplos de grupos funcionales convenientes incluyen pero no están limitados a, hidroxilo, hidroxilo protegido, acetal, alquenilo, amina, aminooxi, amina protegida, hidrazida protegida, tiol protegido, ácido carboxílico, ácido carboxílico protegido, maleimida, ditiopiridina, y vinilpiridina, y cetona. Ejemplos de grupos salientes convenientes incluyen pero no están limitados a, cloruro, bromuro, yoduro, mesilatp, tresilato y tosilato. En otro método para preparar los derivados polímero que contienen azida de la presente invención como un agente de enlace que contiene una funcionalidad azida se contacta con una estructura principal de polímero soluble en agua que tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 800 Da a aproximadamente 100,000 Da, en donde el agente de enlace contiene una funcionalidad química que reaccionará selectivamente con una funcionalidad química en el polímero PEG, para formar un producto derivado de polímero que contiene azida en donde la azida se separa de la estructura principal de polímero por un grupo de enlace. Un esquema de reacción ejemplar se muestra continuación : X-PEG-M + N-enlazador-N=N=N -> PG-X-PEG-enlazador-N=N=N en donde : PEG es poli (etilen glicol) y X es un grupo de terminación de extremo tal como un grupo alcoxi o uncional como se describió anteriormente; y M es un grupo funcional que no es reactivo con la funcionalidad azida pero que reaccionará eficiente selectivamente con el grupo N funcional . Ejemplos de grupos funcionales convenientes incluyen pero no están limitados a, M que es un ácidío carboxílico, carbonato o éster activo si N es una amina; M es una cetona si N es una porción hidrazida o aminooxi; M es un grupo saliente si N es un nucleófilo. Purificación del producto crudo puede lograrse por métodos conocidos incluyendo pero no limitado a, precipitación del producto seguido por cromatografía, de ser necesario. Un ejemplo más específico se muestra continuación en el caso de PEG diamina, en donde una de las aminas se protege por una porción de grupo protector tal como ter-butil-Boc y la PEG diamina monoprotegida resultante se reacciona con una porción de enlace que contiene la funcionalidad azida: BocHN-PEG-NH2 + H02C- (CH2) 3-N=N=N En este caso, el grupo amina puede acoplarse al grupo de ácido carboxílico utilizando una variedad ce agentes de activación tales como reactivos cloruro c.e tionilo o carbodiimida y N-hidroxisuccinimida o IS-hidroxibenzotriazol para crear un enlace amida entre el derivado PEG monoamina y la porción enlazadora que contiene azida. Después de formación exitosa del enlace amida, el derivado que contiene azida N-ter-butil-Boc-protegido resultante puede utilizarse directamente para modificar moléculas bioactivas o puede ser adicionalmente elaborado para instalar otros grupos funcionales útiles. Por ejemplo, el grupo N-t-Boc puede hidrolizarse por tratamiento con ácido fuerte para generar una omega-amino-PEG-azida . La amina resultante puede utilizarse como un asa o mango sintético para instalar ot::a funcionalidad útil tales como grupos maleimida, disulfuros activados, esteres activados y así en adelante, para la creación de reactivos heterobifuncionales valiosos.

Derivados hetero-bifuncionales son particularmente útiles cuando se desea el conectar diferentes moléculas a cada extremo del polímero. Por ejemplo, el omega-N- amino-N-azido PEG permitirá la conexión de una molécula que tiene un grupo electrofílico activado tal como un aldehido, cetona, éster activado carbonato activado y así en adelante a un, extremo del PEG y una molécula que tiene un grupo acetileno al otro extremo del PEG. En otra modalidad de la invención, el derivado de polímero tiene la estructura: X- A- POLY- B- C=C-R en donde: R puede llegar a ser H o un grupo alquilo, alqueno, alquioxi o arilo o arilo substituido; B es una porción de enlace, que puede estar presente ausente; POLY es un polímero no antigénico soluble en agua; A es una porción de enlace, que puede estar presente ausente y que puede ser igual que B o diferente; X es un segundo grupo funcional . Ejemplos de una porción de enlace para A y B incluyen pero no están limitados a un grupo alquilo de funcionalidad múltiple que contiene hasta 18 y más preferiblemente entre 1 a 10 átomos de carbono. Un heteroátomo tal como nitrógeno, oxígeno o azufre puede incluirse con la cadena alquilo. La cadena alquilo puede también ser ramificada en un heteroátomo. Otros ejemplos de una porción de enlace para A y B incluyen pero no están limitados a un grupo arilo de funcionalidad múltiple que contiene hasta 10 y más preferiblemente 5 6 átomos de carbono. El grupo arilo puede estar substituido con uno o más átomos de carbono, nitrógeno oxígeno o azufre. Otros ejemplos de grupos de enlace convenientes incluyen aquellos grupos de enlace descritos en las patentes de los EUA números 5,932,462 y 5,643,575 y la publicación de la solicitud de patente de los EUA número 2003/0143596, cada una de las cuales aquí se incorpora por referencia. Aquellos con destreza ordinaria en la especialidad reconocerán que la lista anterior para porciones de enlace de ninguna manera es exhaustiva y se pretende que sea solamente ilustrativa, y que una amplia variedad de porciones de enlace que tienen las cualidades descritas anteriormente, se contemplan útiles en la presente invención. Ejemplos de grupos funcionales convenientes para utilizar como X incluyen hidroxilo, hidroxilo protegido, alcoxilo, éster activo tal como N-hidroxisuccinimidil esteres y 1-benzotriazolil esteres, carbonato activo, tal como N-hidroxisuccinimidil carbonatos y 1-benzotriazolil carbonatos, acetal, aldehido, aldehidos hidratos, alquenilo, acrilato, metacrilato, acrilamida, sulfona activa, amina, aminooxl, amina protegida hidrazida, hidrazida protegida, tiol protegido, ácido carboxílico, ácido carboxílico protegido, isocianato, isotiocianato, maleimida, vinilsulfona, ditiopiridina, vinilpiridina, yodoacetamida, epoxido, glioxales, dionas, mesilatos, tosilatos, y trsilato, alqueno, cetona y acetileno. Como se entenderá, la porción X selecta deberá ser compatible con el grupo acetileno de manera tal que la reacción con el grupo acetileno no ocurra. Los derivados de polímero que contienen acetileno pueden ser homo-bifuncionales, lo que significa que el segundo grupo funcional (i.e., X) también es una porción acetileno o hetero-bifuncional, lo que significa que el segundo grupo funcional es un grupo funcional diferente. En otra modalidad de la presente invención, los derivados de polímero comprenden una estructura principal de polímero que tiene la estructura: X-CH2CH20- (CH2CH20)n -CH2CH2 - O- (CH2) m-C=CH en donde : X es un grupo funcional como se describió anteriormente; N es aproximadamente 20 a aproximadamente 4000; y m es entre está entre 1 y 10. Ejemplos específicos de cada uno de los polímeros PEG hetero-bifuncionales se muestran continuación. Los derivados PEG que contienen acetileno de la invención pueden prepararse utilizando métodos conocidos por aquellos conocidos en la técnica y/o descritos aquí. En un método, una estructura principal de polímero soluble en agua que tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 800 Da a aproximadamente 100,000 Da, la estructura principal del polímero tiene un primer extremo unido a un primer grupo funcional y un segundo extremo unido a un grupo nucleofílico conveniente, se reacciona con un compuesto que contiene tanto funcionalidad acetileno como un grupo saliente, que es adecuado para reacción con el grupo nucleofílico en el PEG. Cuando el polímero PEG que contiene la porción nucleofílica y la molécula que contiene grupos salientes se combinan, el grupo saliente se somete a un desplazamiento nucleofílico y se reemplaza por una porción nucleofílica, dando por resultado el polímero que contiene acetileno deseado. X-PEG-Nu + L-A-C -> X-PEG-Nu- A-C=CR' Como se muestra, una estructura principal de polímero preferido para utilizar en la reacción tiene la fórmula X-PEG-Nu, en donde PEG es poli (etilen glicol), Nu es una porción nucleofílica y X es un grupo funcional que no reacciona con Nu,L o la funcionalidad acetileno Ejemplos de Nu incluyen pero no están limitados a grupos amin, alcoxi, ariloxi, sulfidrilo, imino, carboxilato, hidrazida, aminooxi que reaccionarán primordialmente mediante un mecanismo tipo SN2. Ejemplos adicionales de grupos Nu incluyen aquellos grupos funcionales que reaccionan primordialmente mediante una reacción de adición nucleofílica. Ejemplos de grupos L incluyen cloruro, bromuro y yoduro mesilato, tresilato y tosilato y otros grupos que se esperan someterse a desplazamiento nucleofílico así como cetonas, aldehidos, tioésteres, definas, grupos carbonilo alfa- beta y insaturados, carbonatos y otros grupos electrofílicos que se esperan se sometan a adición por nucleófilos. En otra modalidad de la presente invención, es un enlazador alifático de entre 1-10 átomos de carbono o un anillo arilo substituido de entre 6-14 átomos de carbono. X es un grupo funcional que no reacciona con grupos azida y L es un grupo saliente conveniente. En otro método para preparación de los derivados de polímero que contiene acetileno de la invención, un polímero PEG que tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 800 Da a aproximadamente 100,000 Da, contiene ya sea un grupo funcional protegido o un agente de terminación de extremo en un extremo y un grupo saliente conveniente en el otro extremo se contacta por un anión acetileno. Un esquema de reacción ejemplar se muestra continuación : X-PEG-L + -C=CR' -> X-PEG-C=CR' en donde : PEG es poli (etilen glicol) y X es un grupo de terminación de extremo tal como un grupo alcoxi o funcional como se describe anteriormente; R' es ya es H un grupo alquilo, alcoxi o arilo o ariloxi o un grupo substituido alquilo, alcoxi, arilo o ariloxi En el ejemplo anterior, el grupo saliente L deberá ser suficientemente reactivo para someterse a desplazamiento tipo SN2 cuando se contacta con una concentración suficiente del anión acetileno. Las condiciones de reacción requeridas para lograr desplazamiento SN2 de grupos salientes por aniones acetilenos son bien conocidas en la especialidad. La purificación del producto crudo usualmente puede lograrse por métodos conocidos en la especialidad incluyendo pero no limitados a precipitación del producto seguido por cromatografía de ser necesario. Polímeros solubles en agua pueden enlazarse los polipéptidos de enlace de antígeno de la invención. Los polímeros solubles en agua pueden enlazarse mediante un aminoácido no naturalmente codificado incorporado en el polipéptido de enlace de antígeno o cualquier grupo substituyente funcional de un aminoácido no naturalmente codificado o naturalmente codificado, o cualquier grupo substituyente funcional agregado a un aminoácido no naturalmente codificado o naturalmente codificado. En forma alterna, los polímeros solubles en agua se enlazan a un polipéptido de enlace de antígeno que incorpora un aminoácido no naturalmente codificado mediante un aminoácido de origen natural (incluyendo pero no limitado a cisteína, lisina o el grupo amina del residuo N-terminal) . En algunos casos, el ABP de la invención comprende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 aminoácidos no naturales, en donde uno o más aminoácidos no naturalmente codificados se enlazan a polímero o polímeros solubles en agua (incluyendo pero no limitados a PEG y/u oligosacáridos) , en algunos casos, el ABP de la invención además comprende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, o más aminoácidos naturalmente codificados enlazados polímeros solubles en agua. En algunos casos, el ABP de la invención comprende uno o más aminoácidos no naturalmente codificados enlazados a polímeros solubles en agua y uno o más aminoácidos de origen natural enlazados a polímeros solubles en agua. En algunas modalidades, los polímeros solubles en agua empleados en la presente invención mejoran la vida media en suero del ABP respecto a la forma no conjugada. El número de polímeros solubles en agua enlazados a un polipéptido de enlace de antígeno (es decir la extensión de modificación con polietilen glicol o glicosilación) de la presente invención puede ajustarse para proporcionar una característica alterada (incluyendo pero no limitada a incrementada o disminuida) farmacológica, farmacocinética o farmacodinámica tal como vida media in vivo . En algunas modalidades, la vida media de ABP se aumenta al menos aproximadamente 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 por ciento, 2 veces, 5 veces, 10 veces, 50 veces, o cuando menos aproximadamente 100 veces frente al polipéptido no modificado. Derivados PEG que contienen un grupo nucleofílico fuerte (es decir hidrazida, hidracina, hidroxilamina semicarbazida) . En una modalidad de la presente invención, un polipéptido de enlace de antígeno comprende un aminoácido no naturalmente codificado que contiene carbonilo se modifica con un derivado PEG que contiene una porción terminal hidracina, hidroxilamina, hidrazida o semicarbazida enlazada directamente a la estructura principal PEG. En algunas modalidades, el derivado PEG hidroxilamina terminal tendrá la estructura: RO- (CH2CH20)n-0- (CH2)m-0-NH2 en donde R es un simple alquilo (metilo, etilo, propilb, etc.) m es 2-10 y n es 100-1,000 (peso molecular promedio está entre 5-40 kDa) . En algunas modalidades, el derivado PEG que contiene hidracina o hidrazida tendrá la estructura: RO- (CH2CH20)n-0- (CH2)m-X-NH-NH2 en donde R es un simple alquilo (metilo, etilo, propilo, etc.), m es 2-10 y n es 100-1,000 y X es opcionalmente un grupo carbonilo (C=0) que puede estar presente o ausente, En algunas modalidades, el derivado PEG que contiene semicarbazida tendrá la estructura: RO- (CH2CH20)n -O- (CH2)m-NH-C(0) -NH-NH2 en donde R es un simple alquilo (metilo, etilo, propilo, etc.), m es 2-10 y n es 100-1,000. En otra modalidad de la invención, un polipéptido de enlace de antígeno, comprende un aminoácido que comprende carbonilo se modifica con un derivado PEG que contiene una porción terminal hidroxilamina, hidrazida, hidracina o semicarbazida que se enlaza a la estructura principal PEG mediante un enlace amida. En algunas modalidades, los derivados PEG hidroxilamina terminales tienen la estructura: RO- (CH2CH20) n-0- (CH2) 2-NH-C (O) (CH2) m-0-NH2 en donde R es un simple alquilo (metilo, etilo, propilo, etc.), m es 2-10 y n es 100-1,000 (peso molecular promedio está entre 5-40 kDa) .

En algunas modalidades, los derivados PEG que contienen hidracina o hidrazida tienen la estructura: RO- (CH2CH20)n-0- (CH2)2-NH-C(0) (CH2) m-X-NH-NH2 en donde R es un simple alquilo (metilo, etilo, propilo, etc.), m es 2-10, n es 100-1,000 y X es opcionalmente un grupo carbonilo (C=0) que puede estar presente o ausente. En algunas modalidades, los derivados PEG que contienen semicarbazida tienen la estructura: RO- (CH2CH20) n-0- (CH2) 2-NH-C (O) (CH2) m-NH-C (O) -NH-NH2 en donde R es un simple alquilo (metilo, etilo, propilo, etc.), m es 2-10 y n es 100-1,000. En otra modalidad de la invención, un ABP que comprende un aminoácido que contiene carbonilo 'se modifica con un derivado PEG ramificado que contiene una porción terminal hidracina, hidroxilamina, hidrazida semicarbazida con cada cadena del PEG ramificado que tiene un peso molecular (MW) en el intervalo de 10-40 kDa y más preferiblemente de 5-20 kDa. En otra modalidad de la invención, un ABP que comprende un aminoácido no naturalmente codificado se modifica con un derivado PEG que tiene una estructura ramificada. Por ejemplo, en algunas modalidades, el derivado PEG hidrazina o hidrazida terminal tendrá la siguiente estructura: [RO- (CH2CH20) n-0- (CH2) 2-NH-C (0) ] 2CH (CH2) m-X-NH-NH2 en donde R es un simple alquilo (metilo, etilo, propilp, etc.), m es 2-10 y n es 100-1,000, y X es opcionalmenjte un grupo carbonilo (C=0) que puede estar presente ausente. En algunas modalidades, los derivados PEG que contienen un grupo semicarbazida tendrá la estructura: [RO- (CH2CH20) n-0- (CH2) 2-C (O) -NH-CH2-CH2] 2CH-X- (CH2) m-NH-C(0) -NH-NH2 en donde R es un simple alquilo (metilo, etilo, propilb, etc.), X es opcionalmente NH, 0, S, C(O) o no está presente, m es 2-10 y n es 100-1,000. En algunas modalidades, los derivados PEG que contienen un grupo hidroxilamina tendrán la estructura: [RO- (CH2CH20) n-0- (CH2) 2-C (0) -NH-CH2-CH2] 2CH-X- (CH2) m-0-NH2 en donde R es un simple alquilo (metilo, etilo, propilb, etc.), X es opcionalmente NH, O, S, C (O) o no está presente, m es 2-10 y n es 100-1,000. El grado y sitios en los cuales el o los polímeros solubles en agua se enlazan al ABP pueden modular el enlace o unión del ABP a un antígeno receptor. Métodos y química para activación de polímeros así como para conjugación de péptidos se describen en la literatura y se conocen en la especialidad. Métodos comúnmente empleados para la activación de polímeros incluyen pero no están limitados a activación de grupos funcionales con bromuro de cianógeno, peryodato, glutaraldehído, biepóxidos, epiclorohidrina, divinilisulfona, carbodiimida, sulfonil, haluros, triclorotriazina, etc. (ver R. F. Taylor, (1991), PROTEiiN IMMOBILISATION. FUNDAMENTAL y APPLICATIONS, Marcel Dekker, N.Y.; S. S. Wong, (1992), CHEMISTRY OF PROTEIN CONJUGATION y CROSSLINKING, CRC Press, Boca Ratón; G. T. Hermanson et al, (1993), IMMOBILIZED AFFINITY LIGAND TECHNIQUES, Academic Press, N.Y.; Dunn, R.L., et al, Eds. POLYMERIC DRUGS y DRUG DELIVERY SYSTEMS, ACS Symposium Series Vol. 469, American Chemical Society, Washington, D.C. 1991) . Varias revisiones y monografías de la funcionalización y conjugación de PEG, está disponibles.

Ver por ejemplo Harris, Macronol . Chem. Phys . C25: 325- 373 (1985); Scouten, Methods in Enzymology 135: 30-65 (1987); Wong et al, Enzyme Microb. Technol . 14: 866-874 (1992); Delgado et al., Critical Reviews in Tlierapeutic Drug Carrier Systems 9: 249-304 (1992); Zalipsky, Bioconjugate Chem. 6: 150-165 (1995). Métodos para activación de polímeros también puede encontrarse en WO 94/17039, patente de los EUA número 5,324,844, WO 94/18247, WO 94/04193, Patente de los E.U.A. número 5,219,564, Patente de los E.U.A. número 5,122,614, WO 90/13540, Patente de los E.U.A. número 5,281,698, y WO 93/15189, y para conjugación entre polímeros activados y enzimas incluyendo pero no limitados a factor de coagulación VIII (WO 94/15625) , hemoglobina (WO 94/09027) , molécula portadora de oxígeno (Patente de los E.U.A. número 4,412,989), ribonucleasa y superóxido dismutasa (Veronese at al., App. Biochen. Biotech. 11 : 141-45 (1985)). Todas las referencias y patentes citadas se incorporan aquí por referencia. La modificación con PEG (es decir, adición de cualquier polímero soluble en agua (de polipéptidos de enlace de antígeno que contienen un aminoácido no naturalmente codificado tal como P-azido-L-fenilananina, se lleva a cabo mediante cualquier método conveniente. Por ejemplo, ABP se modifica con polietilen glicol con un derivado mPEG terminado en aqluino. Brevemente, un exceso de mPEG(5000) -0-CH2-C=CH sólido se agrega, con agitación, a una solución acuosa de ABP que contiene p-azido-L-Phe- a temperatura ambiente. Típicamente, . '.a solución acuosa se amortigua con un amortiguador que tiene un pKa cerca de pH en el cual la reacción se llevará a cabo (generalmente en forma aproximada pH 4 10). Ejemplos de amortiguadores convenientes pa modificación con polietilen glicol a pH 7.5, por ejemplo incluyen pero no están limitados a HEPES, fosfato, borato, TRIS-HCl, EPPS, y TES. El pH se supervisa continuamente y ajusta de ser necesario. La reacción típicamente se deja que continúe entre aproximadamente y 48 horas. Los productos de reacción subsecuentemente se someten a cromatografía de interacción hidrofóbica para separar variantes ABP modificadas con polietilen glicol partir de mPEG (5000) -0-CH2-C=CH libre y cualesquiera complejos de alto peso molecular del ABP modificado con polietilen glicol que puede formarse cuando PEG sin bloquear se activa en ambos extremos de la molécula, entrelazando de esta manera moléculas variantes de AB]?. Las condiciones durante cromatografía de interacción hidrofóbica son tales que mPEG (5000) -0-CH2-C=CH lib::e fluye a través de la columna mientras que cualesquiera complejos variantes ABP modificados con polietilen glicol eluyen después de las formas deseadas, que contienen una molécula variante de ABP conjugada con uno o más grupos PEG. Condiciones convenientes varían dependiendo de los tamaños relativos de los complejos entrelazados contra los conjugados deseados y se determina fácilmente por aquellos con destreza en la técnica. EL eluyente que contiene los conjugados deseados se concentra por ultra filtración y desalifican por diafiltración.

De ser necesario, el ABP modificado con polietilen glicol obtenido de la cromatografía hidrofóbica, puede purificarse más por uno o más procedimientos conocidos por aquellos con destreza en la especialidad, incluyendo pero no limitados cromatografía de afinidad; cromatografía de intercambio de aniones o cationes (utilizando, incluyendo pero no limitado a, DEAE SEPHAROSE) ; cromatografía en sílice; HPLC de fase inversa; filtración en gel (utilizando, incluyendo pero no limitado a, SEPHADEX G-75) ; cromatografía de interacción hidrofóbica; cromatografía de exclusión de tamaño; cromatografía de quelato-metal ; ultrafiltración/diafiltración; precipitación de etanol ; precipitación con sulfato de amonio; cromatoenfoque; cromatografía de desplazamiento; procedimientos electroforéticos (incluyendo pero no limitados a, enfoque isoeléctrico preparativo) , solubilidad diferencial (incluyendo pero no limitada a, precipitación con sulfato de amonio) , o extracción. Peso molecular aparente puede estimarse por GPC por comparación con normas de proteína globular (PROTEIN PURIFICATION METHODS, A PRACTICAL APPROACH (Harris & Angal, Eds.) IRL Press 1989, 293-306). La pureza del conjugado ABP-PEG puede estimarse por degradación protolítica (incluyendo pero no limitado a, escisión con tripsina) seguido por análisis de etc.), m es 2-10, p es 2-10 y n es 100-1,000 (es decir, peso molecular promedio está entre 5-40 kDa) . En otra modalidad de la invención, un ABP que comprende un aminoácido que contiene alquino se modifica con derivado PEG ramificado que contiene una porción azida-terminal , con cada cadena del PEG ramificado que tiene un MW en el intervalo de 10-40 kDa y más preferiblemente de 5-20 kDa. Por ejemplo, en algunas modalidades, el derivado PEG azida-terminal tendrá la siguiente estructura: [RO- (CH2CH20) n-0- (CH2) 2-NH-C (O) ] 2CH (CH2) m-X- (CH2) pN3 en donde R es un alquilo simple (metilo, etilo, propilo, etc.), m es 2-10, p es 2-10, y n es 100- 1,000, y X es opcionalmente un O, N, S o grupo carbonilo (C=0) , en cada caso que pueda estar presente o ausente. Derivados PEG que contienen alquino En otra modalidad de la invención, un polipéptido de enlace de antígeno se modifica con un derivado PEG que contiene una porción alquino que reaccionará con una porción azida presente en la cadena lateral del aminoácido no naturalmente codificado. En algunas modalidades, el derivado PEG alquino-terminal tendrá la siguiente estructura: RO- (CH2CH20)n-0- (CH2)m-C=CH en donde R es un alquilo simple (metilo, etilo, propilo, etc.), m es 2-10 y n es 100-1,000 (es decir, peso molecular promedio está entre 5-40 kDa) . En otra modalidad de la invención, un polipéptido de enlace de antígeno que comprende un aminoácido no naturalmente codificado que contiene alquino, se modifica con un derivado PEG que contiene una porción azida-terminal o alquino-terminal que se enlaza la estructura principal PEG mediante un enlace amida. En algunas modalidades, el derivado PEG alquino-terminal tendrá la siguiente estructura: RO- (CH2CH20)n-0- (CH2)m-NH-C(0) - (CH2)p-C=CH en donde R es un alquilo (metilo, etilo, propilo, etc.), m es 2-10, p es 2-10 y n es 100-1,000. En otra modalidad de la invención, un polipéptido de enlace de antígeno que comprende un aminoácido que contiene azida se modifica con un derivado PEG ramificado que contiene una porción alquino-terminal, con cada cadena del PEG ramificado que tiene un MW en el intervalo de 10-40 kDa y más preferiblemente de 5-20 kDa. Por ejemplo, en algunas modalidades, el derivado PEG alquino-terminal tendrá la siguiente estructura: [RO-(CH2CH20)n-0-(CH2)2-NH-C(0)]2CH(CH2)m-X-(CH2)p C=CH en donde R es un simple alquilo (metilo, etilo, propilo, etc.), m es 2-10, p es 2-10, y n es 100-1,000, y X es opcionalmente un 0, N, S o grupo carbonilo (C=0) , o no está presente. Derivados PEG que contienen fosfina En otra modalidad de la invención, un polipéptido de enlace de antígeno se modifica con un derivado PEG que contiene un grupo funcional activado (incluyendo pero no limitado a, éster, carbonato) además comprende un grupo aril fosfina que reaccionará con una porción azida presente en la cadena lateral del aminoácido no naturalmente codificado. En general, los derivados PEG tendrán un peso molecular promedio en el intervalo de 1-100 kDa y en algunas modalidades de 10-40 kDa. En algunas modalidades, el derivado PEG tendrá la estructura: en donde n es 1-10; X puede ser 0, N, S o no está presente, Ph es fenilo, y W es un polímero soluble en agua . En algunas modalidades, el derivado PEG tendrá la estructura: en donde X puede ser 0, N, S o no está presente, Ph es fenilo, W es un polímero soluble en agua y R puede ser .3, un grupo alquilo, arilo, alquilo sustituido y arilo sustituido. Grupos R ejemplares incluyen pero no están limitados a, -CH2, -C(CH3)3, -OR', -NR'R", -SR', halógeno, -C(0)R', - CONR'R", -S(0)2R', -S(0)2NR'R", -CN y -N02. R', R", R'" y R" " cada uno independientemente se refiere a hidrógeno, heteroalquilo sustituido o sin sustituir, arilo sustituido o sin sustituir, incluyendo pero no limitado a, arilo sustituido con 1 a 3 halógenos, grupos sustituidos o sin sustituir alquilo, alcoxi o tioalcoxi o arilalcoxi. Cuando un compuesto de la invención incluye más de un grupo R, por ejemplo cada u o de los grupos R se eligen independientemente como cada uno de los grupos R', R" , R'" y R" " cuando más de uno de estos grupos está presente. Cuando R' y R" se conectan al mismo átomo de nitrógeno, pueden combinarse con el átomo de nitrógeno para formar un anillo de 5 , 6 o 7 miembros. Por ejemplo, -NR'R" se entiende que incluya pero no es:á limitado a, 1-pirrolidinil y 4-morfolinil . De la discusión anterior de sutituyentes, una persona con destreza en la especialidad comprenderá que el térmi.io "alquilo" se entiende que incluya grupos que incluyen átomos de carbono ligados a grupos diferentes a grupos hidrógeno, tales como haloalquilo (incluyendo pero no limitado a, -CF3 y -CH2CF3) y acilo (incluyendo pero no limitado a, - C(0)CH3, -C(0)CF3, -C (O) CH2OCH3, semejantes) . Otros derivados PEG y técnicas de modificación con polietilen glicol generales Otras moléculas PEG ejemplares que pueden enlazarse a polipéptidos de enlace de antígeno, así como métodos de modificación de polietilen glicol incluyen aquellos descritos en, por ejemplo las publicaciones de patentes de los E.U.A. números 2004/0001838 2002/0052009; 2003/0162949 2004/0013637 2003/0228274 2003/0220447; 2003/0158333 2003/0143596 2003/0114647 2003/0105275; 2003/0105224 2003/0023023 2002/0156047 2002/0099133; 2002/0086939 2002/0082345 2002/0072573 2002/0052430; 2002/0040076 2002/0037949 2002/0002250 2001/0056171; 2001/0044526 2001/0027217 2001/0021763 patente de los E.U.A. número 6,646,110 5,824,778 5,476,653 5,219,564 5,629,384 5,736,625 4,902,502 5,281,698 5,122,614 5,473,034 5,516,673 5,382,657 6,552,167 6,610,281 6,515,100 6,461,603 6,436,386 6,214, 966 5, 990,237 5,900,461 5,739,208 5,672,662 5,446,090 5,808,096 5,612,460 5,324,844 5,252,714 6,420,339 6,201,072 6,451,346 6,306,821 5,559,213 5,612,460 5,747,646 5,834,594 5,849,860 5,980,948 6,004,573; 6,129,912; WO 97/32607, EP 229,108, EP 402,378, WO 92/16555, WO 94/04193, WO 94/14758, WO 94/17039, WO 94/18247, WO 94/28024, WO 95/00162, WO 95/11924, WO95/13090, WO 95/33490, WO 96/00080, WO 97/18832, WO 98/41562, WO 98/48837, WO 99/32134, WO 99/32139, WO 99/32140, WO 96/40791, WO 98/32466, WO 95/06058, EP 439 508, WO 97/03106, WO 96/21469, WO 95/13312, EP 921 131, , WO 98/05363, EP 809 996, WO 96/41813, WO 96/07670, EP 605 963, EP 510 356, EP 400 472, EP 183 503 y EP 154 316, que se incorpora aquí por referencia. Cualquiera de las moléculas PEG aquí descritas pueden emplearse en cualquier forma incluyendo pero no limitado a, cadena sencilla, cadena ramificada, cadena de múltiples brazos, funcional sencilla, bifuncional, multifuncional o cualquier combinación de los mismos. Mejorar la afinidad para albúmina de suero Diversas moléculas también pueden ser fusionadas a los polipéptidos de enlace de antígeno de la invención para modular la vida media de ABP en suero. En algunas modalidades, moléculas se enlazan o fusionan con polipéptidos de enlace de antígeno de la invención paira mejorar la afinidad para albúmina de suero endógeno en un animal . Por ejemplo, en algunos casos, una fusión recombinante de un polipéptido de enlace de antígeno y una secuencia de enlace de albúmina se realiza. Secuencias de enlace de albúmina ejemplares incluyen pero no están limitadas a, el dominio de enlace de albúmina de la proteína de estreptococos G (ver por ejemplo Makric.es et al., J. Farmacol . Exp. Titer. 277:534-542 (1996) y Sjolander et al , J Immunol . Methods 201:115-123 (1997)), o péptidos de enlace de albúmina tales como aquellos descritos en Dennis, et al, J. Biol. Chem. 277:35035-35043 (2002) . En otras modalidades, los polipéptidos de enlace de antígeno de la presente invención se acilan con ácidos grasos. En algunos casos, los ácidos grasos promueven enlace a albúmina de suero. Ver Kurtzhals, et al., Biochem. J. 312:725-731 (1995). En otras modalidades, los polipéptidos de enlace de antígeno de la invención se fusionan directamente con albúmina de suero (incluyendo pero no limitado a, albúmina de suero humano) . Aquellos con destreza en la técnica reconocerán que una amplia variedad de otras moléculas también puede enlazarse a ABP en la presente invención para modular enlace con albúmina de suero u otros componentes de suero. X. Glicosilación de ABP La invención incluye polipéptidos de enlace de antígeno que incorporan uno o más aminoácidos nio naturalmente codificados que contienen residuos sacáridos. Los residuos sacárido pueden ya ser naturales (incluyendo pero no limitados a, N-acetilglucosamina) o no naturales (incluyendo pero no limitados a, 3-fluorogalactosa) . Los sacáridos pueden enlazarse a los aminoácidos no naturalmente codificados ya sea por un enlace glicosídico N- u O-enlazado (incluyendo pero :o limitado a, N-acetilgalactosa-L-serina) o un enlace :o natural (incluyendo pero no limitado a, una oxima o el glicósido C- o S-enlazado correspondiente) . Las porciones sacárido (incluyendo pero :o limitadas a, glicosilo) pueden agregarse a polipéptidos de enlace de antígeno ya sea in vivo o in vi tro . !3n algunas modalidades de la invención, un polipéptido de enlace de antígeno comprende un aminoácido que contie: e carbonilo no naturalmente codificado, se modifica con un sacárido derivatizado con un grupo aminooxi para generar el polipéptido glicosilado correspondiente enlazado mediante un enlace oxima. Una vez conectado al aminoácido no naturalmente codificado, el sacárido puede ser adicionalmente elaborado por tratamiento con glicosil transferasas y otras enzimas para generar un enlace oligosacárido con el polipéptido de enlace de antígeno. Ver por ejemplo H. Liu, et al. J. Am. Chem. Soc. 125: 1702-1703 (2003) . En algunas modalidades de la invención, un polipéptido de enlace de antígeno que comprende un aminoácido no naturalmente codificado que contiene carbonilo, se modifica directamente con un glicano con definida estructura preparado como un derivado aminooxi. Una persona con destreza reconocerá que otras funcionalidades incluyendo azida, alquino, hidrazid'a, hidrazina y semicarbazida, pueden emplearse para enlazar el sacárido con el aminoácido no naturalmente codificado. En algunas modalidades de la invención, un polipéptido de enlace de antígeno comprende un aminoácido no naturalmente codificado que contiene alquinilo o azida puede entonces ser modificado por, incluyendo pero no limitado a, una reacción de cicloadición Huisgen [3+2] con, incluyendo pero no limitado a, derivados alquinilo azida, respectivamente. Este método permite que se modifiquen proteínas con selectividad extremadamente elevada. XI. Dímeros y multímeros ABP La presente invención también proporciona combinaciones ABP incluyendo pero no limitadas a homodímeros, heterodímeros, homomultímeros o heteromultímeros ABP (es decir trímeros, tetrámeros, etc.) en donde un polipéptido ABP que contiene uno o más aminoácidos no naturalmente codificados se liga a otro ABP o su variante o cualquier otro polipéptido que es polipéptido no ABP o su variante, ya sea directamente a la estructura principal polipéptido o mediante un enlazador. Debido a su peso molecular incrementado en comparación con monómeros, los conjugados de dímero o multímero ABP pueden exhibir propiedades nuevas o convenientes, incluyendo pero no limitadas a, diferentes farmacológicas, farmacocinéticas, farmacodinámicas, vida media terapéutica modulada, o vida media en píasría modulada respecto al ABP monomérico. En algunas modalidades, los dímeros ABP de la invención modularán la dimerización del receptor ABP. En otras modalidades, los dímeros o multímeros ABP de la presente invención actuarán como un antagonista, agonista o modulador de receptor ABP. En algunas modalidades, uno o más de ABP presentes en un dímero o multímero que contiene ABP, comprende un aminoácido no naturalmente codificado enlazado a un polímero soluble en agua. En algunas modalidades, los ABPs se enlazan directamente, incluyendo pero no limitados a, mediante un enlace Asn-Lys amida enlace Cys-Cys disulfuro. En algunas modalidades, los ABPs enlazados y/o el polipéptido no-ABP enlazado comprenderán diferentes aminoácidos no naturalmente codificados para facilitar dimerización, incluyendo pero no limitado a, un alquino en un aminoácido :po naturalmente codificado de un primer ABP y una azida en un segundo aminoácido no naturalmente codificado de un segundo ABP se conjugará mediante una cicloadición Huisgen [3+2] . En forma alterna, un primer ABP y/o el polipéptido no-ABP enlazado que comprende un aminoácido no naturalmente codificado que contiene cetona, puede conjugarse a un segundo polipéptido ABP que comprende un aminoácido no naturalmente codificado que contiene hidroxilamina y los polipéptidos se reaccionan mediante formación de la oxima correspondiente. En forma alterna, los dos ABPs y/o el polipéptido no-ABP enlazado, se conectan mediante un enlazador. Cualquier enlazador hetero- u homo-bifuncional puede emplearse para enlazar los dos ABPs y/o los polipéptidos no-ABP enlazados, que pueden tener la misma o diferente secuencia primaria. En algunos casos, el enlazador empleado para amarrar el ABP, y/o los polipéptidos no-ABP enlazados juntos, pueden ser un reactivo PEG bifuncional. El enlazador puede tener un amplio rango de peso molecular o longitud molecular. Enlazadores de peso molecular grande o pequeño pueden emplearse para proporcionar una relación o conformación espacial deseada entre el ABP y la entidad enlazada. Los enlazadores que tienen longitud molecular mas larga o mas corta también pueden emplearse para proporcionar un espacio o flexibilidad deseados entre el ABP y la entidad enlazada. Similarmente, un enlazador que tiene una forma o conformación particular puede utilizarse para impartir una forma o conformación particular al ABP o entidad enlazada, ya sea antes o después que el ABP alcance SU objetivo o diana. Los grupos funcionales presentes en cada extremo del enlazador pueden seleccionarse para modular la liberación de un polipéptido ABP o no-ABP bajo condiciones deseadas. Esta optimización de la relación espacial entre el ABP y la entidad enlazada puede proporcionar propiedades nuevas moduladas o deseadas a ¡la molécula. En algunas modalidades, la invención proporciona enlazadores bifuncionales solubles en agua que tienen una estructura de campana que incluyen: a) una azida, un alquino, una hidrazina, una hidrazida, u a hidroxilamina, o una porción que contiene carbonilo en al menos un primer extremo de una estructura principal polímetro; y b) al menos un segundo grupo funcional en un segundo extremo de la estructura principal de polímero. El segundo grupo funcional puede ser igual o diferenre que el primer grupo funcional . El segundo grupo funcional en algunas modalidades no es reactivo con el primer grupo funcional. La invención proporciona, en algunas modalidades, compuestos solubles en agua que comprenden cuando menos un brazo de una estructura molecular ramificada. Por ejemplo, la estructura molecular ramificada puede ser dendrítica. En algunas modalidades, la invención proporciona multímeros que comprenden uno o más ABPs formados por reacciones con polímeros activados solubles en agua que tienen la estructura: -(CI-l2CH2?)? O-(CH2)m-en donde n es de aproximadamente 5 a 3,000, m es de 3-10, x puede ser una azida, un alquino, una hidrazina, una hidrazida, un grupo aminooxi, una hidroxilamina, un acetilo, o una porción que contiene carbonilo, y r es un grupo de terminación de extremo, un grupo funcional o un grupo saliente que puede ser igual o diferente que X. R puede ser por ejemplo un grupo funcional seleccionado del grupo que consiste de hidroxilo, hidroxilo protegido, alcoxilo, N-hidroxisuccinimidil ester, 1-benzotriazonil ester, N- hidroxisuccinimidil carbonato, 1-benzotriazonil carbonato, acetal, aldehido, aldehido hidratos, alquenilo, acrilato, metacrilato, acrilamida, sulfona activa, amina, aminooxi, amina protegida, hidrazida, hidrazida protegida, tiol protegido, ácido carboxílico, ácido carboxílico protegido isocianato, isotiocianatp, maleimida, vinilsulfona, ditiopiridina, vinilpiridina, yodoacetamida, epoxido, glioxales, dionas, mesilatos, tosilatos y tresilato, alkeno y cetona. XII. Medición de actividad de ABP y afinidad de ABP para el antígeno ABP o socio de enlace La actividad ABP puede determinarse utilizando ensayos estándar in vi tro o in vivo . Por ejemplo, células o líneas celulares que ligan ABP (incluyendo pero no limitado a, células que contienen antígeno ABP nativo socio de enlace o antígeno ABP recombinante o células productoras de socio de enlace) pueden emplearse para supervisar enlace de ABP. Para polipéptido de enlace de antígeno modificado con polietinel glicol o no modificado con polietinel glicol que comprende un aminoácido :o natural, la afinidad del ABP por su antígeno o socio de enlace puede medirse al utilizar técnicas conocidas en {La especialidad tales como el biosensensor BIAcore1 (MR) (Pharmacia) . Independientemente de que métodos se emplean para crear los ABPs, los ABPs están sujetos a ensayos para actividad biológica. Ensayos de timidina tritiada pueden conducirse para evaluar el grado de división celular, de ser apropiado. Otros ensayos biológicos sin embargo pueden emplearse para evaluar la actividad deseada. Ensayos biológicos tales como medir la habilidad para inhibir una actividad biológica de antígeno, tal como actividad encimática proliferativa o metabólica, también permite una indicación de la actividad de ABP. Otros ensayos in vi tro pueden emplearse para evaluar actividad biológica. En general, la prueba para actividades biológicas deberá proporcionar análisis para el resultado deseado, tal como incremento o decremento en actividad biológica (en comparación con ABP no alterado) , actividad biológica deferente (en comparación con ABP no alterado) , análisis de afinidad de receptor, cambios de conformación o estructurales o análisis de vida media en suero, como sea apropiado para la actividad biológica del antígeno. La compilación anterior de referencias para metodologías de ensayos no es exhaustiva y aquellos con destreza en la técnica reconocerán otros ensayos útiles para probar para el resultado final deseado. | XIII. Medición de potencia, vida media in vivo funcional y parámetros farmacocinéticos Un aspecto importante de la invención es la vida media biológica prolongada que se obtiene al construir ABP con o sin conjugación del ABP con u: a porción de polímero soluble en agua. La disminución rápida de las concentraciones en suero de ABP ha hecho importante el evaluar respuestas biológicas para tratamiento con ABP conjugado y no conjugado y sus variantes. De preferencia, el ABP conjugado no conjugado y sus variantes de la presente invención tienen vidas medias en suero prolongadas también después de administración i.v., haciendo posible medir, por ejemplo por método ELISA o por un ensayo de supervisión primari Medición de vida media biológica in vivo se lleva a cabo como se describe aquí . Parámetros farmacocinéticos para un polipéptido de enlace de antígeno que comprende un amino ácido no naturalmente codificado, pueden evaluarse en ratas macho Sprague-Dawley normales (N=5 animales por grupo de tratamiento) . Animales recibirán ya sea una sola dosis de 25 µg/rata iv o 50 µg/rata se, y aproximadamente 5-7 muestras de sangre se tomarán de acuerdo con un curso de tiempo predefinido, cubriendo generalmente aproximadamente 6 horas para un polipéptido de enlace de antígeno que comprende un amino ácido no naturalmente codificado, no conjugado con un polímetro soluble en agua y aproximadamente 4 días para un polipéptido de enlace de antígeno que comprende un amino ácido no naturalmente codificado y un conjugado con un polímero soluble en agua. Datos farmacocinéticos para ABP están bien estudiados en varias especies y pueden ser comparados directamente con los datos obtenidos para ABP que comprende un amino ácido no naturalmente codificado. La actividad específica de ABP de acuerdo con esta invención, puede determinarse por diversos ensayos conocidos en la especialidad. La actividad biológica de las ABP muteinas, o sus fragmentos, obtenidas y purificadas de acuerdo con esta invención, puede probarse por métodos descritos o referidos aquí o conocidos por aquellos con destreza en la especialidad. XIV. Administración y composiciones farmacéuticas Los polipéptidos o proteínas de la invención (incluyendo pero no limitados a ABP, síntetasas, proteínas que comprenden uno o más amino ácidos no naturales, etc.) se emplean opcionalmente para usos terapéuticos, incluyendo pero no limitados a, en combinación con un portador farmacéutico conveniente. Estas composiciones por ejemplo comprenden una cantidad terapéuticamente efectiva del compuesto y un portador o excipiente farmacéuticamente aceptable. Este portador o excipiente incluye pero no esta limitado a salino, salino amortiguado, dextrosa, agua, glicerol, etanol, y/o sus combinaciones. La formulación se hace para ajustar al modo de administración. En general, los métodos de administración de proteínas son bien conocidos en la especialidad y pueden aplicarse para administración de los polipéptidos de la invención. Composiciones terapéuticas que comprenden uno o más polipéptidos de la invención se prueban opcionalmer.te en uno o más modelos de enfermedad en animales in vi tro y/o in vivo apropiados, para comprobar eficacia, metabolismo del tejido y estimar dosis, de acuerdo con métodos bien conocidos en la especialidad. En particular, las dosis pueden ser determinadas inicialmente por actividad, estabilidad u otras medidas convenientes de homólogos amino ácidos no naturales aquí a naturales (incluyendo pero no limitados a, comparación de un ABP modificado para incluir uno o más amino ácidos no naturales a un amino ácido natural ABP) es decir en un ensayo relevante. La administración es por cualquiera de las rutas normalmente empleadas para introducir una molécula en el contacto final con sangre o células de tejido. Los polipéptidos de amino ácido no natural de la invención se administran en cualquier forma conveniente, opcionalmente con uno o más portadores farmacéuticamente aceptable. Métodos adecuados para administrar estos polipéptidos en el contexto de la presente invención a un paciente están disponibles y aunque más de una ruta puede emplearse para administrar una composición particular, una ruta particular a menudo puede proporcionar una acción reacción más inmediata y más efectiva que otra ruta. Portadores farmacéuticamente aceptables se determinan en parte por la composición particular que se administra, así como por el método particular utilizado para administrar la composición. De acuerdo con esto, hay una amplia variedad de formulaciones convenientes de composiciones farmacéuticas de la presente invención. Composiciones de polipéptido pueden administrarse por una cantidad de rutas incluyendo pero no limitadas a medios orales, intravenosos, intrapeitoneales, intramusculares, transdérmicos, subcutáneos, tópicos, sublinguales o rectales. Composiciones que comprenden polipéptidos de amino ácidos no naturales, modificados o no modificados también puede administrarse por liposomas. Estas rutas de administración y formulaciones apropiadas en general son conocidas por aquellos con destreza en la técnica. EL ABP que comprende un amino ácido no natural solo o en combinación con otros componentes convenientes, también puede constituirse en formulaciones de aerosol (es decir pueden ser "nebulizados" ) para administrase por inhalación. Formulaciones en aerosol pueden colocarse en propulsores aceptables a presión, tales como diclorodifluorometano, propano, nitrógeno y semejantes. Formulaciones adecuadas para administración parenteral tales, por ejemplo por rutas intraarticular (en las articulaciones) , intravenoso, intramuscular, intradermica, intrapreitoneal y subcutáneas, incluyendo soluciones para inyección estériles isotónicas acuosas y no-acuosas, que pueden contener antioxidantes, amortiguadores, bacteriostaticos y solutos que hacen a la formulación isotónica con la sangre del recipiente pretendido y suspensiones estériles acuosas y no-acuosas que pueden incluir agentes de suspensión, solubilizantes, agentes espezantes, estabilizantes y conservadores. Las formulaciones del ABP empacado puede presentarse en recipientes sellados de dosis unitaria o de múltiples dosis tales como ampolletas y frasquitos. Administración partenteral y administración intravenosa son métodos de administración preferido. En particular, las rutas de administración que ya están en uso para terapéuticos de homólogos de amino ácidos naturales (incluyendo pero no limitados a, aquellos típicamente empleados para EPO, GH, ABP, G-CSF, GM-CS , IFNs, interleucinas, anticuerpos, y/o cualquier otra proteína farmacéuticamente subministrada) , junto • con formulaciones en uso actual, proporcionan rutas de administración y formulaciones preferidas para los polipéptidos de la invención. La dosis administrada a un paciente, en el contexto de la presente invención es suficiente para tener una respuesta terapéutica benéfica en el paciente con el tiempo, incluyendo pero no limitado a inhibir infección por un patógeno, u otra actividad apropiada, dependiendo de la aplicación. La dosis se determina por la eficacia del vector particular, o formulación, y la actividad, estabilidad o vida media en suero del polipéptido amino ácido no natural empleado y la condición del paciente, así como el peso corporal o área superficial del paciente a tratar. El tamaño de la dosis también se determina por la existencia, naturaleza extensión de cualesquiera efectos secundarios adversos que acompañan la administración de un vector particular, formulación o semejantes en un paciente particular. Para determinar la cantidad efectiva del vector o formulación a administrar en el tratamiento o profilaxis de enfermedad (incluyendo pero no limitado a canceres, enfermedades heredadas, diabetes, SIDA o semejantes) el médico evalúa los niveles en circulación en plasma, toxicidad de formulación, avance de la enfermedad y/o si es relevante, la producción de anticuerpos de polipéptido amino ácido antinaturales. La dosis administrada, por ejemplo a ún paciente de 70 kilogramos, típicamente está en el rango equivalente a dosis de proteínas terapéuticas actualmente empleadas, ajustado para la actividad alterada o vida media en suero de la composición relevante. Los vectores de esta invención pueden suplementar condiciones de tratamiento por cualquier terapia convencional conocida, incluyendo administración de anticuerpos, administración de vacuna, administración de agente citotóxicos, polipéptidos de amino ácidos naturales, ácidos nucleicos, análogos de nucleótidos, modificadores de respuesta biológica y semejantes. Para administración, formulaciones de la presente invención se administran a una velocidad determinada por la LD-50 o ED-50 de la formulación relevante y/u observación de cualesquiera efectos secundarios de los amino ácidos no naturales a diversas concentraciones incluyendo pero no limitado a, como se aplica a la masa y salud total del paciente. Administración puede lograrse mediante dosis sencillas divididas. Si un paciente que se somete a infusión de una formulación desarrolla fiebres, calosfríos o dolores musculares, recibirá la dosis apropiada de aspirina, ibuprofen, acetaminofen u otra droga para control de dolor/fiebre. Pacientes que experimentan reacciones a la infusión tales como fiebre, dolores musculares calosfríos son premedicados 30 minutos antes de las infusiones futuras ya sea con aspirina, acetaminofen, o incluyendo pero no limitado a difenhidramina . Se utiliza meperidina para más severos calosfríos y dolores musculares que no responden rápidamente a antipiréticos antihistamina. Infusión celular se frena o interrumpe dependiendo de la severidad de la reacción. Polipéptidos de enlace de antígeno humanos de la invención pueden administrarse directamente a un sujeto mamífero. Administración es por cualquiera de las rutas normalmente empleadas para introducir ABP a un sujeto. Las composiciones de ABP de acuerdo con modalidades de la presente invención incluyen aquellas adecuadas para administración oral, rectal, tópica, inhalación (incluyendo pero no limitadas a, mediante un aerosol) , bucal (incluyendo pero no limitada a, sublingual) , vaginal, parenteral (incluyendo pero rio limitada a, subcutánea, intramuscular, intradérmica, intraarticular, intrapleural , intraperitoneal, intracerebral , intraarterial, o intravenosa), tópica (es decir, tanto superficies de la piel como mucosales, incluyendo superficies de vías respiratorias) y administración transdérmica, aunque la ruta más conveniente en cualquier caso determinado dependerá de la naturaleza y severidad de la condición que se trata. administración ya puede ser local o sistémica. Las formulaciones de compuestos pueden presentarse en recipientes sellados con dosis unitarias o múltiples dosis, tales como ampolletas y frasquitos. ABP de la invención puede prepararse en una mezcla en forma inyectable de dosis unitaria (incluyendo pero no limitada a, solución, suspensión o emulsión) con un portador farmacéuticamente aceptable. ABP de la invención también puede administrarse por infusión continua (utilizando, incluyendo pero no limitado a, minibombas tales como bombas osmóticas) , formulaciones de un solo bolo o de depósito de liberación lenta. Formulaciones adecuadas para administración incluyen soluciones acuosas y no acuosas, soluciones estériles isotónicas, que pueden contener antioxidantes, amortiguadores, bacterioestáticos y solutos que hacen a la formulación isotónica, y suspensiones estériles acuosas y no acuosas que pueden incluir agentes en suspensión, solubilizantes, agentes espesantes, estabilizantes y conservadores. Pueden prepararse soluciones y suspensiones a partir de polvos estériles, granulos y tabletas del tipo previamente descrito. Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden comprender un portador farmacéuticamente aceptable. Portadores farmacéuticamente aceptables se determinan en parte por la composición particular que se administra, así como por el método particular empleado para administrar la composición. De acuerdo con esto, hay una amplia variedad de formulaciones convenientes de composiciones farmacéuticas (incluyendo portadores excipientes o estabilizantes farmacéuticamente aceptables) de la presente invención (ver por ejemplo Remington's Pharmaceutical Sciences, 17a ed. 1985)). Portadores convenientes incluyen amortiguadores que contienen fosfato, borato, HEPES, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes incluyendo ácido ascórbico; polipéptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 residuos) ; proteínas tales como albúmina de suero, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrofílicos tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos y otros carbohidratos incluyendo glucosja, mañosa o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; iones de metales divalentes tales como zinc, cobalto cobre; azúcar alcoholes tales como manitol o sorbitol; contrapones formadores de sales tales como sodio; y/o surfactantes no iónicos tales como Tween™, PluronicsMR PEG. ABPs de la invención, incluyendo aquellos enlazados con polímeros solubles en agua tales como PEG, también pueden administrarse por o como parte de sistemas de liberación sostenida. Composiciones de liberación sostenida incluyen, incluyendo pero no limitado a, matrices de polímeros semi-permeable en la forma de artículos conformados, incluyendo pero no limitados a, películas o microcápsulas. Matrices de liberación sostenida incluyen de materiales biocompatibles tales como poli (2 -hidroxietil metacrilato) (Langer et al , J. Biomed . Mater. Res . , 15: 167-277 (1981); Langer, Chem . Tech . , 12: 98-105 (1982), etilen vinil acetato (Langer et al, supra) o poli-D- (-) -3- ácido hidroxibutírico (.3P 133,988), poliláctidos (ácido poliláctico) (patente de los E.U.A. número 3,773,919; EP 58,481), poliglicólido (polímero de ácido glicólico) , polilactida co-glicólido (copolímeros de ácido láctico y ácido glicólico) polianhídridos, copolímeros de ácido L-glutámico y gamma-etil-L-glutamato (U. Sidman et al., Biopolímeros, 22, 547-556 (1983), poli (ortho) esteres, polipéptidos, ácido hialurónico, colágeno, sulfato de condroitina, ácidos carboxílicos, ácidos grasos, fosfolípidos, polisacáridos, ácidos nucleicos, poliaminoácidos, aminoácidos tales como fenilalanina, tirosina, isoleucina, polinucleótidos, polivinil propileno, polivinil pirrolidona y silicona. Composiciones de liberación sostenida también incluyen un compuesto liposomalmente atrapado. Liposomas que contienen el compuesto se preparan por métodos conocidos per se: DE 3,218,121; Epstein et al, Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A., 82: 3688-3692 (1985); Hwang et al, Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A., 77: 4030-4034 (1980); EP 52,322; EP 36,676; EP 88,046; EP 143,949; EP 142,641; solicitud de patente japonesa 83-118008; patentes de los E.U.A. números 4,485,045 y 4,544,545; y EP 102,324. Todas las referencias y patentes citadas se incorporan aquí ppr referencia. ABP liposomalmente atrapado puede prepararse por métodos descritos en DE 3,218,121; Epstein et al, Proc. Nati. Acad. Sd. U.S.A., 82: 3688-3692 (1985); Hwang et al, Proc. Nati. Acad. Sd. U.S.A., 77: 4030-40 B4 (1980); EP 52,322; EP 36,676; EP 88,046; EP 143,949; EP 142,641; solicitud de patente japonesa 83-118008; patentes de los E.U.A. números 4,485,045 y 4,544,545; EP 102,324. Composición y tamaño de liposomas son bien conocidos o capaces de determinarse fácilmente en forma empírica por una persona con destreza en la técnica. Algunos ejemplos de liposomas como se describe por ejemplo en Park JW, et al, Proc. Nati. Acad. Sd. USA 92:1327-1331 (1995); Lasic D y Papahadjopoulos D (eds MEDICAL APPLICATIONS OF LIPOSOMES (1998) ; Drammond DC, ét al, Liposomal drug delivery systems for cáncer therapy, in Teicher B (ed) : CÁNCER DRUG DISCOVERY y DEVELOPMENT (2002); Park JW, et al, Clin. Cáncer Res. 8:1172- 1181 (2002); Nielsen UB, et al, Biochim. Biophys. Acta 1591(1-3): 109-118 (2002); Mamot C, et al, Cáncer Res. 63: 3154 3161 (2003) . Todas las referencias y patentes citadas se incorporan aquí por referencia. La dosis administrada a un paciente en el contexto de la presente invención deberá ser suficiente para provocar una respuesta benéfica en el sujeto con el tiempo. En general, la cantidad farmacéuticamente efectiva total del ABP de la presente invención administrado parenteralmente por dosis está en el rango de aproximadamente 0.01 µ .g/kg/día a aproximadamente 100 /xg/kg, o aproximadamente 0.05 mg/kg a aproximadamente 1 mg/kg, de peso corporal del paciente, aunque esto está sujeto a discreción terapéutica. La frecuencia de dosis también se somete a discreción terapéutica, y puede ser más frecuente o menos frecuente que los productos ABP comercialmente disponibles aprobados para utilizar en humanos. En general, un polipéptido de enlace de antígeno modificado con polietilen glicol de la invención puede administrarse por cualquiera de las rutas de administración descritas anteriormente. XV. Usos terapéuticos de polipéptidos de enlace de antígeno de la invención Los polipéptidos ABP de la invención son útiles para tratar un amplio rango de desórdenes. Las composiciones farmacéuticas que contienen el ABP pueden formularse a una concentración efectiva para administración por diversos medios a un paciente humano que experimenta desórdenes que pueden ser afectados por agonistas o antagonistas ABP, tales como, pero no limitados a, antiproliferativos, antiinflamatorios antivirales son empleados, ya sea solos o como parte de una condición o enfermedad. Cantidades promedio de ABP pueden variar y en particular deberán basarse en las recomendaciones y receta de un médico calificado, .lia cantidad exacta de ABP es cuestión de preferencia suje:a a factores tales como el tipo exacto de condición que se trata, la condición del paciente a tratar, así como los otros ingredientes en la composición. La invención también permite administración de una cantidad terapéuticamente efectiva de otro agente activo tal como un agente quimioterapéutico anti-cáncer. La cantidad suministrar puede determinarse fácilmente por una persona con destreza en la técnica con base en la terapia con ABP. EJEMPLOS Los siguientes ejemplos se ofrecen paira ilustrar pero no limitar la invención reivindicada. Ejemplo 1 Este ejemplo describe uno de los muchos conjuntos de criterios potenciales para la selección de sitios preferidos de incorporación de aminoácidos no naturalmente codificados en ABP. Este ejemplo demuestra cómo sitios preferidos dentro del polipéptido de enlace de antígeno se seleccionaron para introducción de un aminoácido no naturalmente codificado. La estructura tridimensional compuesta de dos moléculas de ABP o la estructura secundaria, terciaria o cuaternaria de ABP se utilizan para determinar posiciones preferidas en las cuales uno o más aminoácidos no naturalmente codificados pueden ser introducidos . Los siguientes criterios se utilizaron para evaluar cada posición de ABP para la introducción de un aminoácido no naturalmente codificado: el residuo (a) no deberá interferir con enlace de cualquier ABP basado en análisis estructural de las tres estructuras dimensionales o la estructura secundaria, terciaria cuaternaria de ABP, (b) no habrá de afectarse por mutagénesis de exploración homologa o de alanina (c) deberá ser expuesto en superficie y exhibir mínimas interacciones de uniones de hidrógeno o de van der Waa s con los residuos circundantes, (d) puede estar en una o más de las caras expuestas de ABP, (e) puede ser un sitio o sitios de ABP yuxtapuestos a un segundo ABP, u otra molécula o fragmento del mismo, (f) ya deberá ?er eliminado o variable en variantes ABP, (g) resultará en cambios conservadores ante sustitución con un aminoácido no naturalmente codificado, (h) puede modular la conformación del propio ABP o un dímero o multímero que comprende uno o más ABP alterando la flexibilidad o rigidez de la estructura completa según se desee, (i) puede encontrarse en cualquiera de regiones altamente flexibles o regiones estructuralmente rígidas y (j) se encuentran en regiones de determinación de complementareidad (CDR = complementarity determining regions) o no. Además, se realizaron cálculos adicionales en la molécula ABP utilizando el programa Cx (Pintar et al. Bioinformatics, 18, pp 980) para evaluar la extensión de proyección para cada átomo de proteína. Cpmo resultado, en algunas modalidades, el aminoácido no naturalmente codificado se sustituye en pero no limitado a, una o más posiciones de ABP. Ejemplo 2 Este ejemplo detalla clonación y expresión de ABP incluyendo el aminoácido no naturalmente codificado en E. coli . Un sistema de traducción introducido que comprende un tRNA ortogonal (O- tRNA) y una aminoacil SEQ ID NO: 15 Aminoacil tRNA sintetasa para la RS incorporación de p-acetil -fenilalanina (LW6) SEQ ID NO: 16 Aminoacil tRNA sintetasa para la RS incorporación de p-azido-fenilalanina (Az PheRS- 5) SEQ ID NO: 17 Aminoacil tRNA sintetasa para la RS incorporación de p-azido-fenilalanina (Az PheRS- 6) La transformación de E. coli con plásmidos que contienen el gen ABP modificado y el par ortogonal aminoacil tRNA sintetasa/tRNA (específico para el aminoácido no naturalmente codificado deseado) permite '..a incorporación específica de sitio de aminoácido no naturalmente codificado en ABP. El E. coli transformado, cultivado a 37 grados C en medio que contiene entre 0.01 100 mM del aminoácido no naturalmente codificado particular, expresa ABP codificado con alta fidelidad eficiencia. EL ABP etiquetado con HIS contiene un aminoácido no naturalmente codificado se produce por células anfitrionas de E. coli como cuerpos de inclusión o agregados. Los agregados se solubilizan y purifican por afinidad bajo condiciones de desnaturalización en guanidina HCl 6M. El plegamiento se realiza por diálisis a 4 grados C durante la noche en TRIS-HC1 50mM, pH 8.0, 40//M de CuS04, y Sarkosyl 2% (p/v) . El material después se dializa contra TRIS-HCl 20mM, pH 8.0, NaCl lOOmM, CaCl2 2mM, seguido por remoción de la etiqueta HIS. Ver Boissel et al, (1993) 268:15983-93. Métodos para purificación de ABP son bien conocidos en la especialidad y se confirman por SDS-PAGE, análisis de transferencia Western o espectrometría de masa con atrapamiento de iones por electrorocío-ionización y semejantes. Construcciones de expresión scFv-108 periplásmico: Las regiones variables (VL y VH) del anticuerpo monoclonal específico de EGFR mAblOd (patente de los E.U.A. número 6,217,866 que se incorpora aquí por referencia) se clonaron como un fragmento scFv con secuencia enlazadora (GGGGS)4 corriente debajo de una secuencia de líder periplásmica BGL de levadura (C7) (Humphreys, DP et al. Protein Expr Purif. 2000 Nov;20 (2) :252-64) . Una secuencia epítope reconocida por el anticuerpo c-myc así como la etiqueta 6X-His se clonó corriente abajo del dominio VL. La construcción scFv-108 de tipo silvestre, así como variantes que contienen el codón de parada ámbar (TAG) en el dominio VL (ver Figura 2, Panel A) se clonaron en un vector de expresión E. coli bajo el control de un promotor inducible. Este plásmido también expresa en forma constitutiva un tirosil tRNATyr/CUA supresor ámbar de Methanococcus jannaschii {Mj tRNATyr CUA) . Ubicaciones de los codones de parada ámbar se indican. La construccicón hecha se ilustra como SEQ ID NO: 18 (secuencia de nucleótidos) y SEQ ID NO: 19 (secuencia de proteína traducida) . La construcción se describe en las Tablas 3 4. Tabla 3 : Secuencia Posición líder C7 15-83 VH 84-446 enlazador GlySer 447-506 VL 507-827 yc 843-887 His 888-905 TAA 906-908 Tabla 4 Secuencia Posición (SEQ ID NO: 19) líder C7 1-23 VH 24-144 enlazador GlySer 145-164 VL 165-276 Myc 277-291 His 292-297 scFv-108 ci toplásmico : secuencias VH-enlazado::--VL (VH-GlySer-VL) que contienen una secuencia MetGly-N-terminal y una secuencia 6X-His se clonaron en un vector de expresión bajo control del promotor T7 (ver Figura 2, Panel B) . La ubicación de los codones de parada ámbar los residuos modificados con polietilen glicol se indican. La construcción elaborada se muestra como SEQ ID NO: 20 (secuencia de nucleótidos) y SEQ ID NO: 21 (secuencia de proteína traducida) . La construcción se describe en la Tabla 5. Tabla 5 : Secuencia Posición (SEQ ID NO : 209 ) His 3 -26 enlazador GlySer 390-449 VL 450-767 Fab-108 : las secuencias VL y VH de mAblOd se clonaron en pFT3 , un plásmido que codifica las secuencias líder periplásmicas (VL) y STII (VH) , así como ] os dominios CH1 y constante kappa humano. El extremo C del dominio CH1 contiene una etiqueta 6-His para facilitar la purificación. Mutaciones ámbar se introdujeron en el dominio CH1 , y todo el cassette bicistronic se clonó en el plásmido de expresión que expresa en forma constitutiva un supresor ámbar tirosil tRNATyr/CUA de Methanococcus jannaschii (Mj tRNATyr/CUA) (ver Figura 2, Panel C) . Las dos secuencias Shine Delgarno (SD) que desplazan la traducción de los dominios VL y VH del fragmento Fab se muestran. La construcción elaborada se muestra como SEQ ID NO: 22 (secuencia de nucleótido) y SEQ ID NO: 23 y 24 (secuencia de proteína traducida de cadena Kappa VL de Fab 108; cadena VH-CH1 de Fabl08) . ¡La construcción se describe en la tabla 6. Tabla 6 : Secuencia Posición (SEQ ID NO: 22) líder g3 15-68 VL 1-416 cadena K 432-755 Líder STII 788-856 VH 875-1237 Dominio CH1 1247-1543 His 1544-1561 scFv-4D5 periplásmico : las regiones variables (VL y VH) del anticuerpo monoclonal específico HER2 mAB-4D5 (Cárter, P., et . al, Biotechnology (N Y). 1992 Feb;10 (2) : 163-7) , se clonaron como fragmentos ScFv corriente abajo de una secuencia líder periplásmica BGL2 (C7) de levadura. Una etiqueta 6X-His se clonó ya sea en el extremo C de la secuencia VL (scFv-4D5-His ; Figura 2, Panel D) o en el extremo N del dominio VH (His- scFv-4D5; Figura 2, Panel E) . Las construcciones scFv-4D5 de tipo silvestre así como una variante que contiene el codón de parada ámbar (TAG) y el dominio enlazador GlyS se clonaron en el vector de expresión de E. coli que expr sa en forma constitutiva un supresor ámbar tirosil tRNATyr/CUA de Methanococcus jannaschii (Mj tRNATyr/CUA) . La construcción terminal 6X-His C elaborada se muestra como SEQ ID NO: 25 (secuencia nucleótido) y SEQ ID NO: 26 (secuencia de proteína traducida) . La construcción terminal 6X-His N elaborada se muestra como SEQ ID NO 27 (secuencia nucleótido) y SEQ ID NO: 28 (secuencia de proteína traducida) . La construcción 6X-His C terminal se describe en la Tabla 7 y la construcción terminal 6X-His N se describe en la Tabla 8. Tabla 7: Secuencia Posición (SEQ ID NO: 25) líder C7 15-83 VH 84-443 enlazador GlySer 444-503 VL 504-824 His 825-848 Tabla 8: Secuencia Posición (SEQ ID NO: 27) líder C7 15-83 His 84-107 VH 108-470 enlazador GlySer 471-530 VL 531-854 Fab-4D5 : Las secuencias VL y VH de mAb 4D5 se subclonaron en pFT3 , un plásmido que codifica las secuencias líder periplásmicas g3 y STII así como los dominios CH1 y constante K humanos, y después se clonaron en el plásmido de expresión que expresa en forma constitutiva un supresor ámbar tirosil tRNATyr/CUA de Methanococcus jannaschii (Mj tRNATyr CUA) . La Figura 2, Panel F muestra el cistrón empleado para expresión de Fab-4D5. Una mutación ámbar se introduce en el dominio CH1 de Fab 4D5 en lisina 139. Esta lisina corresponde K142 en Fab 108. Una construcción Fab-4D5 que contiene un residuo cisteína extra (THTCAA) en le extremo C del dominio CH1, se elaboró por PCR de superposición (Fa -4D5-cys) . La construcción elaborada se muestra como S3Q ID NO: 29 (secuencia nucleótido) y SEQ ID NO: 30 y 31 (secuencia de proteína traducida de cadena kappa VL de Fab 4D5; cadena VH-CH1 de Fab 4D5) . La construcción se describe en la Tabla 9.

Tabla 9 : Secuencia Posición Líder g3 1-54 VL 67 -386 cadena K 403 -726 Líder STII 759 - 827 VH 846 - 1205 Dominio CH1 1215 - 1511 His 1512 - 1529 Exprés ion/ Supresión Supresión con para - acetil - fenilalanina (pAcF) : Supresión de las mutaciones ámbar en E. coli se logra utilizando protocolos estándar conocidos en la especialidad. Brevemente, para la supresión periplásmica de fragmentos de anticuerpo en E. coli (scFv y Fab) , la construcción de vector de expresión se transforma en células anfitrionas de E. coli con un plásmido que codifica la tirosil-tRNA-sintetasa ortogonal de M. jannaschii (M'/TyrRS) . Cultivos bacterianos durante la noche se diluyeron 1:100 en matraces de agitación que contienen ya sea el medio LB (Luria-Bertani) Superbroth, y desarrollaron a 37 grados C a un OD de aproximadamente 0.8. Expresión Fab y scFv se incluye mientras que la supresión del codón ámbar se logra por la adición de para-acetil-fenilalanina (pAcF) a una concentración final de 4 mM. Los cultivos se incubaron 25 grados C durante la noche. Expresión de fragmentos scFv y Fab de tipo silvestre (que carecen de codón ámbar) (incluyendo Fab-4D5-cys) se realizó bajo condiciones idénticas. Expresión/supresión de fragmentos scFv citoplásmicos (Figura 2, Panel B) se logra en una forma similar. Supresión con aa9. 2 : Supresión de mutaciones ámbar con un derivado de pAcF (aa 9.2) se logra en una forma similar a pAcF, excepto que la tirosil-tRNA sintetasa ortogonal de M. jannaschii (M'/TyrRS) empleada fue específica para este aminoácido. La supresión se logró por la adición de aa9.2 (4 mM) al tiempo de inducción. Extracción y purificación de proteína Se recolectaron células por centrifugación y resuspendieron en amortiguador de liberación periplásmico (NaP0 50 mM, sacarosa al 20%, EDTA 1 mM, pH 8.0) suplementado con 100 ug/ml de lisozima e incubaron en hielo por 30 minutos. Después de centrifugación, fragmentos de anticuerpo en el sobrenadante se inmovilizaron en perlas ProBind (Invitrogen; Carlsbad, CA) en virtud de su etiqueta His, las perlas se lavaron extensamente con amortiguador de enlace y después los fragmentos ligados se eluyen de las perlas con imidazol 0.5 M. Fragmentos purificados se dializaron en amortiguador de almacenamiento (HEPES 50 mM, NaCl 150 mM, glicerol al 10%, sacarosa al 5%, pH 7.8). Para análisis en pequeña escala de fragmento scFv expresado en el citoplasma, E. coli de 15 ml de cultivo se recolectaron por centrifugación y resuspendieron en 1 ml c.e amortiguador de lisis (B-PER, Pierce Biotechnology; Rockford, IL) suplementado con 10 ug/ml de DNase. La mezcla se incuba a 37 grados C por 30 minutos, diluyó IX en amortiguador de carga de proteína (Invitrogen; Carlsbad, CA) y analizó por SDS-PAGE. La Figura 3, Panel A muestra la supresión de mutaciones ámbar en la segunda serina del enlazador GlySer (S131Am) , y purificación del scFv que contiene pAcF correspondiente se muestra (Figura 3, Panel B) . EL análisis de transferencia Western mostrado como Figura 3, Panel A demuestra que pAcF se requiere para suprimir . '.a mutación de parada ámbar cuando las células se desarrollan ya sea en LB o medio Superbroth. La presenc:.a de pAcF no afecta la expresión de un scFv que carece del codón de parada TAG (WT scFv-108) . La Figura 3, Panel B muestra la purificación de pAcF-scFv 108- (S131) por I cromatografía de afinidad de metal inmovilizado (EVIAC Rendimiento estimado de scFv que contiene pAcF fue 1 mg/L. La posición del fragmento scFv se indica por la cabeza de flecha. El gel de Coomassie se cargó como sigue: pista 1 - scFv control (1.7 ug) ; pista 2- EVIAC pre-enlace IMAC (20 ul/70 ml) ; pista 3- MAC hueco (20 ul/70 ml) ; pista 4- elusión de IMAC (5 ul/1.3 ml) ; pista 5- intercambio de amortiguador NAP10 (10 ul/1.5 ml) ; pista 6 - post-elusión de perlas IMAC; pista 7 - control scFv (3.4 ug) . La supresión de una mutación ámbar en la cad na VL (Ll 56) durante expresión citoplásmica de un scFv se muestra en la Figura 4. Rendimientos fueron mayores a 100 mg/L de cultivo de E. coli y supresión del codón de paradas fue absolutamente dependiente de la presencia de pAcF. scFv de longitud integral se indica por la cabeza de flecha. Productos truncados en el codón ámbar se indican por un círculo relleno. Modificación con PEG/dimerización de fragmentos de anticuerpo (1) Modificación con polietilen glicol Aproximadamente 1 mg de proteína pAcF-scFv-108 se concentran en amortiguador de reacción (NaOAc 100 mM, NaCl 100 mM, EDTA 1 mM, pH 4.0) a un volumen final de 50 ul . La mezcla de reacción se incuba a 28 grados C por 32 horas con exceso molar 100 veces de PEG 5 K monofuncional (hidroxilamina) (equlibrado en amortiguador de reacción) en un volumen final de 100 ul . Material modificado con polietilen glicol se evalúa siguiendo electrofóresis en gel y utilizado directamente en ensayos de enlace de células . Dimerización : Un procedimiento similar se empleó para dimerizar fragmentos scFv-108 que contienen pAcF. Brevemente, los fragmentos scFv que contienen pAcF de partida se concentraron a un valor de >5 ug/ul en amortiguador de reacción y después incubaron con enlazador PEG conjugado con hidroxilamida bifuncioral (364 Da) . PEG sin reaccionar se retira por diálisis y una alícuota fresca de fragmento pAcF-scFv (equivalencia proteína :proteína 1 molar) se agrega a la mezcla. La mezcla después se incuba a 28 grados C por otras 32 horas. El dímero se carga en la columna de intercambio de cationes (SP-5PW) equilibrada con acetato de sodio 20 mM (pH 4.0) y eluye sobre un gradiente NaCl (0 - 0.4M) . Modificación con polietilen glicol y dimerización de fragmentos pAcF-scFv-108 se muestran en la Figura 5. La Figura 5, Panel A muestra modificación con polietilen glicol (5K) de pAcF-scFv-108- (L156) y pAcF-scFv-108- (S136) y dimerización de pAcF-scFv-108- (S136) . El gel se cargó como sigue: pista 1 - pAcF-scFv- 108-(L156) (5K PEG); pista 2- pAcF-scFv-108- (S136) (5K PEG) ; pista 3- dimerización de pAcF-scFv-108- (S136) (364 de aPEG) enlazador; pista 4 - dimerización de pAcF- scFv-108-(S136); enlazador no se retiró siguiendo la primer reacción de modificación con polietilen glicol. Posición de los fragmentos scFv mono-modificados con polietilen glicol y el dímero scFv-108- (S136) se indican por las cabezas de flechas sencillas y dobles respectivamente. La ausencia de dimerización en la pista 4 demuestra que el scFv no se acopló a través de formación de enlace disulfuro intermolecular. Figura 5, Panel C muestra que la conjugación de PEG a fragmentos scFv es absolutamente dependiente de la presencia de pAcF. No se observó modificación con polietilen glicol de fragmentos WT scFv. El gel se cargó como sigue: pista 1 - WT scFv 108 control; pista 2 - scFv WT, en amortiguador de reacción, sin PEG, 16 horas; pista 3- scFv WT + 5K PEG, en amortiguador de reacción, 16 horas. La Figura 6 muestra análisis SDS PAGE de fracciones que se toma durante cromatografía de intercambio de cationes de homodímeros scFv. Fragmentos pAcF-scFvl08- (S131) se homodimerizaron utilizando un enlazador PEG de 364 daltons de hidroxilamina bifuncional. Las fracciones se tomaron en diferentes puntos en el gradiente NaCl (0 - 0.4 M) durante cromatografía de intercambio de cationes. El gel se cargó como sigue: pista 1 - marcador, pista 2 - pAcF-scFvlOd (S131) -X-pAcF-scFvl08 (S131) Fracción #1, pista pAcF-scFvl08 (S131) -X-pAcF-scFvl08 (S131) Fracción #2, pista 4-pAcF-scFvl08 (S131) -X-pAcF-scFvl08 (S131) Fracción #3. La Figura 8, Panel A muestra análisis SDS PAGE de fragmentos Fab pAcF-modificado con polietilen glicol y pAcF. Fragmentos Fab-108 modificados en K142, T204, y K219 se muestran y la eficiencia de modificación con polietilen glicol es específica de sitio. La modificación con polietilen glicol de fragmentos Fab que contienen pAcF se realizó utilizando 5K PEG conjugado con hidroxilamina . La Figura 10, Paneles A y B muestra supresión de una mutación ámbar en la segunda serina del enlazador GlySer de C-terminal (pAcF-scFv-4D5-His (S 133) ; Figura 10, Panel A) o N-terminal ( [rho] AcF-His-scFv-4D5 (S139?) ; Figura 10, Panel B) fragmentos scFv-4D5. Expresión de las proteínas scFv se induce por adición de arabinosa a 0.02% ya sea por 5 horas o durante la noche (16 horasi) . Supresión de la mutación ámbar se logró por la adición concomitante de aa9.2 (4 niM) . El producto suprimido se indica por la cabeza de flecha y la proteína truncada por el círculo relleno. Rendimiento de supresión mayor a 50% I se lograron (1.5 mg/L) . La pista de control cargada con scFv 108, que recorre ligeramente superior a scFv-4D5, se indica (C) . Fragmentos Fab pAcF-Fab-4D5- (K139) y Fab-4D5-cys se expresaron y purificaron en la misma forma. Figura 11, Panel A presenta muestras resueltas por SDS-PAGE tanto bajo condiciones reductoras como no reductoras. Los rendimientos de fragmento Fab fueron como sigue: pAcF-Fab-4D5- (K139) , 0.37 mg/L/OD (final OD600 = 3.14) y Fab-4D5-cys 0.23 mg/L/OD (final OD60O = 3.26). Figura 11, Panel B muestra una transferencia Western de muestras (5 ul) que se ilustra en la Figura 11, Panel A empleando un anticuerpo anti-His. Las muestras se corrieron bajo condiciones no reductoras. Complejos de VH-CH1 multiméricos de la construcción Fab-4D5-cys se indican con flechas. No se vieron complejos multiméricos con pAcF-Fab-4D5- (K139) . Modificación con polietilen glicol/Dimerización de fragmentos de anticuerpo (2) Modificación con polietilen glicol Aproximadamente 1 mg de proteína pAcF-scFv-108 se concentran en amortiguador de reacción nativo (NaOAc 20 mM, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, pH 4.0) y amortiguador de reacción de desnaturalización (NaOAc 20 mM, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, Urea 8 M, pH 4.0) a un volumen final de 50 ul . La mezcla de reacción se incuba a 28 grados C por 32 horas con un exceso molar de 100 veces de 5K PEG monofuncional (hidroxilamina) (equilibrado en amortiguadores de reacción correspondientes) en un volumen final de 100 ul . Después de 16 horas, La mezcla de reacción se evalúa por SDS-PAGE y utiliza directamen en ensayos de enlace celular.

Conjugación de un polipéptido con un enlazador polímero, molécula biológicamente activa u otra molécula bajo condiciones de desnaturalización puede tener una más ventajas. Estas ventajas incluyen pero no están limitadas a, más fácil conjugación debido al acceso mejorado del grupo reactivo, más fácil plegamiento del polipéptido conjugado en comparación con el polipéptido no conjugado, y la capacidad de utilizar polipéptido a una concentración superior para conjugar que a concentración de polipéptido útil bajo condiciones s:.n desnaturalización. Las condiciones de desnaturalización pueden ser deseadas, por ejemplo si el polipéptido es inestable y no puede ser altamente concentrado para !.a reacción de conjugación. Sin embargo, la conjugación de polipéptidos bajo condiciones de desnaturalización puede resultar en sitios indeseables y/o no pretendidos de conjugación en polipéptidos con una o más cisteínas, lipsinas u otros amino ácidos ante reacción con químicas de conjugación basadas en cisteína estándar tales como químicas de maleimida, o químicas basadas en glicina tales como químicas de maleimida. Estos sitios de conjugación indeseables y/o no pretendidos pueden tener un impacto en la actividad del polipéptido conjugado. Por otra parte, polipéptidos tales como ABP que comprenden uno o más amino ácidos no naturalmente codificados, pueden conjugarse en una forma específica de sitio bajo condiciones de desnaturalización ya que los grupos reactivos involucrados en la reacción de conjugación son parte de un amino ácido no naturalmente codificado. De esta manera, cualesquiera ventajas que se obtienen de conjugar bajo condiciones de desnaturalización, pueden explotarse con el uso de polipéptidos que comprenden uno o más amino ácidos no naturalmente codificados. La figura 5B muestra análisis SDS-PAGE PEGylated pAcF-scFv- (S136) modificado con polietilén glicol y muestras de control. El gel se cargó como sigue: pista 1 - pAcF-scFv- (S 136); pista 2- pAcF- scFv- (S136) , incubado a 28 grados C por 16 horas; pista 3 --PACF-SCFV- (SISO) , 5 K PEG, incubado a 28 grados C por 16 horas, condición nativa; pista 4-pAcF-scFv- (S136) , 5 K PEG, incubado a 28 grados C por 16 horas, condición de desnaturalización. Las flechas indican scFv y PEG modificado con polietilén glicol. La figura 5C muestra que la conjugación de PEG con fragmentos scFv es absolutamente dependiente de la presencia de pAcF. No se observó modificación copolietilén glicol de fragmentos VÑT scFv. El gel se cargó como sigue: pista 1- WT scFv 108 control; pista 2- scFv WT, en amortiguador de reacció: , sin PEG, 16 horas; pista 3 - scFv WT + 5K PEG3 en amortiguador de reacción, 16 horas.

Dimerización secuencial : Brevemente, dos fragmentos scFv que contienen pAcF de partida se concentraron a una concentración de 10 mg/ml en amortiguador de reacción y después se incubaron con exceso de 100 veces en un enlazador PEG conjugado con hidroxilamina bifuncional (364 Da) . La mezcla de reacción se incubó por 16 horas a 28 grados C. PEG sin reaccionar se retira por diálisis, y una aliquota fresca de fragmento pAcF-scFv (equivalencia de proteína: proteína 1 molar) se agrega a la mezcla. La mezcla después se incuba a 28 grados C por otras 32 horas. Ver figura 13. El dímero se cargó en una columna de intercambio de cationes (SP-5PW, 20 mieras) equilibrado con acetato de sodio 20 mM (pH 4.0) y eluido sobre un gradiente de NaCl (0-0.4M) . La figura 14, panel A y B muestran análisis SDS PAGE sin reducción y con reducción de muestras de dimerización. Los geles se cargaron como sigue: pista mezcla de reacción de dimerización scFv final con enlazador bifuncional PEG de 364 Da; pista 2- control de reacción de dimerización scFv final sin enlazador bifuncional PEG de 364 Da; pista 3- scFv. Las flechas indican dímeros scFv y monómeros scFv. Dímeros scFv se sintetizaron sólo en la presencia del enlazadpr bifuncional. La ausencia de dimerización en la pista demuestra que el scFv no se acopló a través de formación de enlace disulfuro intermolecular. Ya que no se observa diferencia entre muestras analizadas en geles SDS PAGE de reducción y sin reducción, la presencia del enlazador bifuncional no facilita formación de enlace disulfuro intermolecular . Purificación de dímero : La mezcla de reacción de dimerización se purifica utilizando columna de intercambio de cartiones fuertes (SP-5PW, 20 mieras) . Amortiguador A: 20 mM NaOAc, pH 4.0; amortiguador B: NaOAc 20 mM, NaCl 1 M, pH 4.0. dímero scFv eluido a 40 por ciento B. Análisis SDS PAGE (Figura 15) del dímero purificado mostró que después de una purificación de columna, la pureza del dímero fue de aproximadamente 90 por ciento. Un ejemplo de un ABP hetero-bifuncional de la presente invención se ilustra en la figura 9. Con base en la estructura de cristal conocida determinada para dos moléculas de anticuerpo diferentes (por ejemplo Herceptina y Omnitarg) que ligan a diferentes epítopes del mismo antígeno (por ejemplo ErbB2) , posiciones de amino ácido específicas se identifican de manera tal que ajusten dentro de un cierto criterio de selección deseado. El criterio de selección deseado para posición de amino ácidos en este ejemplo incluye la proximidad relativa de una o más posiciones amino ácido específicas en cada molécula. Estas posiciones de amino ácido puede desearse que formen la molécula hetero-bifuncional mostrada en la figura 9 utilizando una molécula enlazadora. Posiciones de amino ácido específicas en cada molécula que ajustan a los criterios, se muestran en la tabla 10 siguiente, como una molécula enlazadora que pueda utilizarse para formar ABP hetero-bifuncional. Aquellos con destreza ordinaria en la especialidad reconocerán que la lista de ninguna manera es exhaustiva y solamente es ilustrativa, y que todas las posiciones de amino ácido que ajustan a un cierto criterio de selección deseado se contemplan adecuadas para utilizar en la presente invención. Un amino ácido no natural de la presente invención puede ser sustituido en una o más de estas posiciones en cada molécula para proporcionar los grupos funcionales químicos utilizados para conexión del enlazador. Una amplia variedad de otros criterios de selección también puede utilizarse para identificar posiciones de amino ácido para ajustar a los criterios deseados, incluyendo pero no limitados a, proximidad entre iguales o diferentes moléculas, modulación de cambio de conformación, modulación de distancia entre ABPs o moléculas enlazadas al ABP, longitud o forma de enlazador, exposición superficial, modulación de Con base en la interacción de Fab 4E10 humano que neutraliza HIV-1 con el gen HIV gp41 env, se identifican posiciones de amino ácido específicas de manera tal que ajusten dentro de un cierto criterio de selección deseado. Criterios de selección deseados para porción de amino ácido en este ejemplo incluyen residuos que serían utilizados para conjugar el péptido T-20 al Fab tal que el enlace de T-20 con gp41 ocurre sin un efecto negativo al enlace y reconocimiento de las regiones de determinación de complementareidad (CDR) de 4E10 a gp41. T-20, también conocido como DP-178, inhibe la entrada de HIV en células al actuar como un inhibidor de fusión viral. La figura 12 muestra Fab 4E10 humano que neutraliza HIV con un péptido G41 mímico. Residuos potenciales para conectar el péptido T-20 se muestran. Residuos potenciales para incorporar amino ácidos no naturalmente codificados incluyen pero no están limitados a: Gln64--cadena pesada de Fab; GIuI-- cadena ligera de Fab, y Gln27- -cadena ligera del Fab. Aquellos cpn destreza ordinaria en la especialidad reconocerán que la lista de ninguna manera es exhaustiva y solamente ilustrativa, y que todas las posiciones de amino ácido que ajusten a un cierto criterio de selección deseado se contemplan adecuadas para utilizar en la presente invención. Una amplia variedad de otros criterios de selección también puede utilizarse para identificar posiciones de amino ácido para ajustar los criterios deseados, incluyendo pero no limitados a, proximidad entre iguales o diferentes moléculas, modulación de cambio de conformación, modulación de distancia entre ABPs o moléculas enlazadas a ABP, incluyendo un enlazador, longitud en forma de enlazador, exposición de superficie, modulación de características de enlace ligando, modulación de dimerización de receptor, etcétera. Ejemplo 3 Este ejemplo detalla introducción de un amino ácido que contiene carbonilo y subsecuente reacción con PEG que contiene amino óxido. Este ejemplo demuestra un método para la generación de un polipéptido de enlace de antígeno que incorpora un amino ácido no naturalmente codificado que contiene acetona, que se reacciona subsecuentemente con un PEG que contiene amino oxi de aproximadamente 5,000 MW. Cada uno de los residuos identificado de acuerdo con los criterios del Ejemplo 1, se sustituye por separado con un amino ácido codificado no en forma natural que tiene la siguiente estructura: Las secuencias utilizadas para la incorporación específica de sitio de p-acetil- fenilalanina en ABP son SEQ ID NO: 1 (muttRNA, M. jannaschii mtRNATyrcuA) , y 13, 14 o 15 (TyrRS LWl , 5, o 6) descrito en el Ejemplo 2 anterior. Una vez modificada, la variante ABP que comprende el amino ácido que contiene carbonilo se reacciona con un derivado PEG que contiene amino oxi de la fórmula: R-PEGCN O-CCHa^-O- Hz en donde R es metilo, n es 3 y N es aproximadamente 5,000 MW. El ABP purificado que contiene P-acetil fenilalanina disuelto a 10 mg/mL MES de 25 mM (Sigma Chemical, St . Louis, MO) pH 6.0, Hepes 25 mM (Sigma Chemical, St Louis, MO) pH 7.0, o en Acetato de Sodio 10 mM (Signa Chemical, St . Louis, MO) pH 4.5, se reacciona con un exceso de 10 a 100- veces de PEG que contiene amino oxi, y después se agita por 10 - 16 horas a temperatura ambiente (Jencks, W. J. Am. Chem. Soc. 1959, 81, pp 4751) . El PEG-ABP después se diluye en amortiguador apropiado para purificación y análisis inmediatos. Ejemplo 4 Conjugación con un PEG que consiste de un grupo hidroxilamina enlazado al PEG mediante un enlace amida. Un reactivo PEG que tiene la siguiente estructura, se acopla a un amino ácido no naturalmente codificado que contiene acetona utilizando el procedimiento descrito en el Ejemplo 3.

R-PEG(l^)-0-{CH2)2- H-C(0)(CH2)n-O-NH2 en donde R = metilo, n=4 y N es aproximadamente 20,000 MW. Las condiciones de reacción, purificación y análisis son como se describe en el Ejemplo 3. Ejemplo 5 Este ejemplo detalla la introducción de dos amino ácidos no naturalmente codificados distintos en ABP. Este ejemplo demuestra un método para generar un polipéptido de enlace de antígeno que incorpora amino ácido no naturalmente codificado que comprende una funcionalidad cetona en dos posiciones, identificado de acuerdo con el Ejemplo 1, en donde X* representa un amino ácido no naturalmente codificado. El polipéptido de enlace de antígeno se prepara como se describe en los Ejemplos 1 y 2, excepto porque el codón supresor se introduce en dos sitios distintos dentro del ácido nucleico. Ejemplo 6 Este ejemplo detalla conjugación de polipéptido de enlace de antígeno a un PEG que contiene hidracida subsecuente reducción in situ.

Un polipéptido de enlace de antígeno que incorpora un amino ácido que contiene carbonilo, se prepara de acuerdo con el procedimiento descrito en los ejemplo 2 y 3. Una vez modificado, un PEG que contiene hidracida que tiene la siguiente estructura, se conjuga al ABP: R-PEGÍ -CKCH^-NH- OXCHj -NH-NKt en donde R = metilo, n=2 y N = 10,000 MW y X es un grupo carbonilo (C=0) . El ABP purificado que contiene acetil fenilalanina se disuelve entre 0.1-10 mg/mL en 25 mM en MES (Sigma Chemical, St . Louis, MO) pH 6.0, Hepes 25 mM (Sigma Chemical, St . Louis, MO) pH 7.0, o en Acetato de Sodio 10 mM (Sigma Chemical, St . Louis, MO) pH 4.5, se reacciona con un exceso de 1 a 100- veces de PEG que contiene hidracida y la hidrozona correspondiente se reduce in si tu por adición de material NaCNBH3 1M (Sigma Chemical, St . Louis, MO) , disuelto en H20, a un concentración final de 10-50 mM. Reacciones se llevan cabo a la oscuridad a 4 grados C a temperatura ambiente por 18-24 horas. Se detienen las reacciones por adición de Tris 1M (Sigma Chemical, St. Louis, MO) aproximadamente pH 7.6 a una concentración Tris final de 50 mM o diluye en amortiguador apropiado para purificación inmediata. Ejemplo 7 Este ejemplo detalla la introducción de un amino ácido que contiene alquino en un ABP y derivatización con mPEG-azida. Cualquiera de los residuos identificados de acuerdo con el Ejemplo 1, se sustituyen con el siguiente amino ácido no naturalmente codificado: Las secuencias utilizadas para incorporación específica en sitio de p-propargil-tirosina son SEQ ID NO: 1 (muttRNA, M. jannaschii mtRNAtyrCUA) , y 6, 7 u 8 descritos en el Ejemplo 2 anterior. El polipéptido de enlace de antígeno que contiene la propargil tirosina se expresa en E. coli y purifica utilizando las condiciones descritas en el Ejemplo 3. El ABP purificado que contiene propargil-tirosina disuelta entre 0.1-10 mg/niL en amortiguador .?B (fosfato de sodio 100 mM, NaCl 0.15 M, pH = 8) y un exceso de 10 a 1000- veces de un PEG que contiene azida se agrega a la mezcla de reacción. Una cantidad catalítica de CuS04 y alambre de Cu se agregan a mezcla de reacción. Después de que la mezcla se incuba (incluyendo pero no limitado a, aproximadamente 4 horas a temperatura ambiente o 37 grados C, o durante la noche a 4 grados C) H20 se agrega y la mezcla se filtra a través de una membrana de diálisis. La mezcla puede analizarse para la adición, incluyendo pero no limitado a por procedimientos similares descritos en el Ejemplo 3. En este Ejemplo, el PEG tendrá la siguiente estructura : R-PEGC O-(CH2)2-NH-C(0?CH2)n-N3 en donde R es metilo, n es 4 y N es 10,000 MW. Ejemplo 8 Este ejemplo detalla la substitución de Un amino ácido hidrofóbico grande en ABP con propargil tirosina. Un residuo Phe, Trp o Tyr presente en la secuencia de ABP se substituye con el siguiente amino ácido no-naturalmente codificado como se «-'describe en él Ejemplo 7: Una vez modificado, un PEG se conecta a la variante ABP que comprende el amino ácido que contiene alquino. El PEG tendrá las siguientes estructuras: Me-PEG(N 0-(CH2)rN3 y procedimientos de acoplamiento seguirán aquellos del Ejemplo 7. Esto generará una variante ABP que comprende un amino ácido no-naturalmente codificado que es aproximadamente isoestérico con uno de los amino ácidos hidrofóbicos grandes de origen natural, y que se modifica con un derivado PEG en un sitio distinto dentro del polipéptido. Ejemplo 9 Este ejemplo detalla la generación de un homodímero, heterodímero, homomultímero o heteromultímero de ABP separado por uno o más enlazadores PEG. La variante de ABP que contiene alquino producida en el Ejemplo 7 se reacciona con un derivado PEG bifuncional de la forma: N3-(?)n^O>NH C?2)2-O-PEGOT-0-(CT2)2-lOT- {OHCH2)n-N3 en donde n es 4 y el PEG tiene un MW promedio de aproximadamente 5,000, para generar el homodímero ABP correspondiente en donde las dos moléculas ABP se separan físicamente por PEG. En una forma análoga, un polipéptido de enlace de antígeno puede acoplarse a uno más otros polipéptidos para formar heterodímeros, homomultímeros o heteromultímeros. Acoplamiento, purificación y análisis se realizarán como en los Ejemplos 7 y 3. Ejemplo 10 Este ejemplo detalla el acoplamiento de una porción sacárido al ABP. Uno o más residuos amino ácido del ABP se substituyen con el siguiente amino ácido no naturalmente codificado, como se describe en el Ejemplo 3.

Una vez modificada, la variante de ABP que comprende el amino ácido que contiene carbonilo se reacciona con un análogo aminooxi [ ß ] -enlazado de N-acetilglucosamina (GIcNAc) . La variante ABP (10 mg/mL) y el aminooxi sacárido (21 mM) se mezclan en amortiguador de acetato de sodio 100 mM (pH 5.5) e incuban a 37 grados C por 7 a 26 horas. Un segundo sacárido se acopla al primero enzimáticamente al incubar el ABP conjugado con sacárido (5 mg/mL) con UDP-galactosa (16 mM) y [ ?]-l,4-galacitosiltransferasa (0.4 unidad/mL) en amortiguador HEPES 150 mM (pH 7.4) por 48 horas a temperatura ambiente (Schanbacher et al. J. Biol. Chema. 1970, 245, 505 5061) . Ejemplo 11 Este ejemplo detalla la generación de un antagonista ABP modificado con polietilen glicol. Uno o más de los residuos amino ácido ABP substituyen con el siguiente amino ácido no-naturalmenjte codificado como se describe en el Ejemplo 3.

Una vez modificada, la variante ABP que comprende el amino ácido que contiene carbonilo se reaccionará con un derivado PEG que contiene aminooxi de la forma: R-PEGC -CKCH?^-O-NH? en donde R es metilo, n es 4 y N es 20,000 MW para generar un antagonista ABP que comprende un amino áci o no-naturalmente codificado que se modifica con un derivado PEG en un solo sitio dentro del polipéptido. Acoplamiento, purificación y análisis se realizan como en el Ejemplo 3.

Ejemplo 12 Generación de un homodímero, heterodímero, homomultímero o heteromultímero de ABP en donde las moléculas de ABP se Enlazan Directamente Una variante ABP que comprende el amino ácido que contiene alquino puede acoplarse directamente con otra variante ABP que comprende el amino ácido que contiene azido, cada uno de los cuales comprende substituciones de amino ácido no-naturalmente codificadas en los sitios descritos en, pero no limitados a Ejemplo 10. Esto generará el homodímero ABP correspondiente en donde las dos variantes ABP se unen físicamente. En una forma análoga, un polipéptido de enlace de antígeno puede acoplarse a uno o más otros polipéptidos para formar heterodímeros, homomultímeros o heteromultímeros. Acoplamiento, purificación y análisis se realizan como en los Ejemplos 3, 6, y 7. Ejemplo 13 PEG-OH+Br-íCHa 'sC ' -> PEG-CKCHJ C=CR' A B El polialquilen glicol (P-OH) se reacciona con el haluro de alquilo (A) para formar el éter (B) . En estos compuestos, n es un entero de uno a nueve y R1 puede ser un grupo alquilo o heteroalquilo de Cl a C20 de cadena recta o ramificada, saturado o insaturado. R1 puede también ser un grupo alquilo cíclico saturado o insaturado o heteroalquilo cíclico, un grupo arilo o hetero arilo substituido o sin substituir, o un grupo alcarilo substituido o sin substituir (el alquilo es un alquilo de Cl a C20 saturado o insaturado) o heteroalcarilo. Típicamente, PEG-OH es polietilen glicol (PEG) o monometoxi polietilen glicol (mPEG) que tiene un peso molecular de 800 a 40,000 Daltons (Da). Ejemplo 14 mPEG-OH+Br-CH2 ~C*CH -» mPEG-O-CHa-CsCH mPEG-OH con un peso molecular de 20,000 Da (mPEG-OH 20 kDa; 2.0 g, 0.1 mmol, Sunbio) se trató con NaH (12 mg, 0.5 mmol) en THF (35 mL) . Una solución de bromuro de propargilo, disuelta como una solución al 80% en peso en xileno (0.56 mL, 5 mmoles, 50 equiv., Aldrich) , y una cantidad catalítica de Kl se agregan a la solución y la mezcla resultante se calienta al reflujo por 2 horas. Agua (1 mL) se agrega y el solvente se retira al vacío. Al residuo se agregan CH2C12 (25 mL) y la capa orgánica se separa, seca sobre Na2S04 anhidro, y el volumen se reduce a aproximadamente 2 mL. Esta solución CH2C12 se agrega a dietil éter (150 mL) por gotas. El precipitado resultante se recolecta, lava con etil acetato (3 x 15 mL) y las capas orgánicas combinadas se lavan con solución de NaCl saturada (10 mL) , secan sobre Na2S04 anhidro y concentran para dar el bromuro deseado. mPEG-OH 20 kDa (1.0 g, 0.05 mmol, Sunbio) se disuelve en THF (20 mL) y la solución se enfría en un baño de hielo. NaH (6 mg, 0.25 mmol) se agrega con agitación vigorosa sobre un periodo de varios minutos, seguido por adición del bromuro que se obtiene anteriormente (2.55 g, 11.4 mmoles) y una cantidad catalítica de Kl . El baño de enfriamiento se retira y la mezcla resultante se calienta al reflujo por 12 horas. Agua (1.0 mL) se agrega a la mezcla y el solvente se retira al vacío. Al residuo se agrega CH2C12 (25 mL) y la capa orgánica se separa, seca sobre Na2S04 anhidro y el volumen se reduce a aproximadamente 2 mL. Adición por gotas a una solución de éter (150 mL) resultó en un precipitado blanco, que se recolecta para dar el derivado PEG. Ejemplo 17 Los polímeros de poli (etilen glicol) que contienen alquilo terminal también pueden obtenerse al acoplar un polímero de poli (etilen glicol) que contiene un grupo funcional terminal a una molécula reactiva que contiene la funcionalidad alquino como se mostró anteriormente, n está entre 1 y 10. R' puede ser H o un pequeño grupo alquilo de Cl a C4. Ejemplo 18 (1) H?2C-(CH2) 5CH+NHS +DCC-» NHSO-C(OMCH2)2-G=CH (2) mPEG-NHz +NHSO- OMCH?)2-C-CH -» mPEG-NH-C(OHCH2)2-C=CE Ácido 4-pentinoico (2.943 g, 3.0 mmoles) ße disuelve en CH2C12 (25 mL) . N-hidroxisuccinimida (3.80 g, 3.3 mmoles) y DCC (4.66 g, 3.0 mmoles) se agregan y la solución se agita durante la noche a temperatura ambiente. El ester NHS crudo resultante 7 se emplea en la siguiente reacción sin mayor purificación. mPEG-NH2 con un peso molecular de 5,000 Da (mPEG-NH2, 1 g, Sunbio) se disuelve en THF (50 mL) y la mezcla se enfría a 4 grados C. Éster NHS 7 (400 mg, 014 mmol) se agrega en porciones con agitación vigorosa. Se deja que la mezcla agite por 3 horas mientras que se calienta a temperatura ambiente. Agua (2 mL) se agrega y el solvente se retira al vacío. Al residuo se agrega CH2C12 (50 mL) y la capa orgánica se separa, seca sobre Na2S0 anhidro y el volumen se reduce a aproximadamente mL. Esta solución CH2C12 se agrega a éter (150 mL) por gotas. El precipitado resultante se recolecta y seca al vacío. Ejemplo 19 Este ejemplo representa la preparación de metan sulfonil éster de poli (etilen glicol), que también puede ser referido como el metansulfonato o mesilato de poli (etilen glicol). El tosilato correspondiente y los haluros pueden prepararse por procedimientos similares. mPEG-OH+ CH3SO2CI +N(Et)3 -» H1PEG-O-SO2CH3-> mPEG-N3 El mPEG-OH (MW = 3,400, 25 g, 10 mmoles) en 150 mL de tolueno se destila azeotrópicamente por 2 horas bajo nitrógeno y la solución se enfría a temperatura ambiente. 40 mL de CH2C1 seco y 2.1 mL de trietilamina seca (15 mmoles) se agregan a la solución. La solución se enfría en un baño de hielo y 1.2 mL de cloruro de metansulfonilo destilado (15 mmoles) se agrega por gotas. La solución se agita a temperatura ambiente bajo nitrógeno durante la noche y la reacción se neutraliza al agregar 2 mL de etanol absoluto. La mezcla se evapora al vacío para retirar solventes, primordialmente aquellos diferentes a tolueno, filtra, concentra de nuevo bajo vacío y después se precipitan en 100 mL de dietil éter. El filtrado se lava con varias porciones de dietil éter frío y seca al vacío para dar el mesilato.

El mesilato (20 g, 8 mmoles) se disuelve en |75 ml de THF y la solución se enfría a 4 grados C. La solución enfriada se agrega azida de sodio (1.56 g, 24 mmoles) . La reacción se calienta al reflujo bajo nitrógeno por 2 horas. El solvente después se evapora el residuo diluye con CH2C12 (50 mL) . La fracción orgánica se lava con solución de NaCl y seca sobre MgS0 anhidro. El volumen se reduce a 20 ml y el producto se precipita por adición a 150 ml de éter seco frío. Ejemplo 20 (1) Ns-CsI-LrCOaH -» Ni-CsftjOfcOH (2) N CeaCflfcOH -» Br-CHz-C?-Nj (3) mPEG-OH + Br-CHr ^-Ns -» mPEG-O-C?k-Cßfti-Nj 4-azidobenzil alcohol puede producirse utilizando el método descrito en la patente de los E.U.A. No. 5,998,595, que se incorpora aquí por referencia. Cloruro de metansulfonilo (2.5 g, 15.7 mmoles) trietilamina (2.8 mL, 20 mmoles) se agregan a una solución de A-azidobenzil alcohol ( 1.75 g, 11.0 mmoles) en CH2C12 a 0 grados C y la reacción se coloca en el refrigerador por 16 horas. Un procesamiento usual genera el mesilato como un aceite amarillo pálido. Este aceite (9.2 mmoles) se disuelve en THF (20 mL) y LiBr (2.0 g, 23.0 mmoles) se agrega. La mezcla de reacción se calienta al reflujo por 1 hora y después se enfría a temperatura ambiente. A la mezcla se agrega (2.5 mL) y el solvente se retira al vacío. El residuo se extrae con etil acetato (3 x 15 mL) y las capas orgánicas combinadas se lavan con solución de NaCl saturado (10 mL) , secan sobre Na2S0 anhidro y concentran para dar el bromuro deseado. mPEG-OH 20 kDa (2.0 g, 0.1 mmol, Sunbio) se trata con NaH (12 mg, 0.5 mmol) en THF (35 mL) y el bromuro (3.32 g, 15 mmoles) se agrega a la mezcla junto con una cantidad catalítica de Kl . La mezcla resultante se calienta al reflujo por 12 horas. Agua (1.0 mL) se agrega a la mezcla y el solvente se retira al vacío. Al residuo se agrega CH2C12 (25 mL) y la capa orgánica se separa, seca sobre Na2S04 anhidro y el volumen se reduce aproximadamente 2 mL. Adición por gotas a una solución de éter (150 mL) resultó en un precipitado, que se recolectó para dar por resultado mPEG-O- CH2-CeH4-N3. Ejemplo 21 NH2-PEG-O-CH2CH2CO2H + NJ-CH2CH2CQ2-NHS •» N3-CH2CH2-C(0)NH-PBG- - CH2CH2CO2H NH2 - PEG-0-CH2CH2C02H (MW 3 , 400 Da , 2 . 0 g) se disuelve en una solución acuosa saturada de NaHC03 ( 10 mL) y la solución se enfrió a 0 grados C . 3 - azido- l -N-hidroxisuccinimido propionato ( 5 equiv . ) se agrega con agitación vigorosa. Después de 3 horas, 20 mL de H20 se agregan y la mezcla se agita por adicionales 45 minutos a temperatura ambiente. El pH se ajusta a 3 con H2S0 0.5 N y NaCl se agrega a una concentración de aproximadamente 15% en peso. La mezcla de reacción se extrae con CH2C12 (100 mL x 3) , seca sobre Na2S04 y concentra. Después de precipitación con dietil éter frío, el producto se recolecta por filtración y seca al vacío para dar el derivado omega-carboxi -azida PEG. Ejemplo 22 A una solución de acetiluro de litio (4 equiv.), preparada como se conoce en la técnica y enfriada a -78 grados C en THF, se agrega por gotas a una solución de mPEG-OMs disuelto en THF con agitación vigorosa. Después de 3 horas, la reacción se deja que caliente a temperatura ambiente y neutraliza con la adición de 1 mL de butanol. 20 mL de H20 y después se agrega y la mezcla se agita por 45 minutos adicionales temperatura ambiente. El pH se ajusta a 3 con H2S04 0.5 y NaCl se agrega a una concentración de aproximadamente 15% en peso. La mezcla de reacción se extrae con CH2C12 (100 mL x 3) , seca sobre Na2S04 y concentra. Después de precipitación con dietil éter frío, el producto se recolecta por filtración y seca al vacío para dar l-(but-3-iniloxi) -metoxipolietilen glicol (mPEG) . Ejemplo 23 Los aminoácidos que contienen azida y acetileno fueron incorporados selectivamente en sitio en proteínas utilizando los métodos descritos en L. Wang, et al., (2001), Science 292:498-500, J.W. Chin et al., Science 301:964-7 (2003)), J. W. Chin et al., (2002), Journal of the American Chemical Society 124:9026-9027; J. W. Chin, & P. G. Schultz, (2002), Chem Bio Chem 11:1135-1137; J. W. Chin, et al., (2002), PNAS United States of America 99:11020-11024: y, L. Wang, & P. G. Schultz, (20021), Chem. Comm. , 1-10. Una vez que los aminoácidos se incorporan, la reacción de cicloadición se lleva a cabo con proteína 0.01 mM en amortiguador fosfato (PB) , pH 8, en la presencia de derivado PEG 2 mM, CUS04 1 mM, aproximadamente 1 mg de alambre de cobre por 4 horas a 37 grados C. Ejemplo 24 Este ejemplo describe métodos parea medir actividad in vi tro e in vivo de ABP que comprende un aminoácido no naturalmente modificado y ABP modificado con polietilen glicol. Ensayos de enlace de células Células (3xl06) se incuben en duplicado en PBS/BSA al 1% (100 µ l ) en la ausencia o presencia de diversas concentraciones (volumen: 10 µ l ) de ABP no etiquetado, ABP o un control negativo y en la presencía de 125I-ABP (aproximadamente 100,000 cpm o 1 ng) a grados C por 90 minutos (volumen total: 120 µ l ) . Las células después se re-suspenden y forman en capas sobre 200 µ 1 de FCS enfriado por hielo en una tubo de centrífuga de plástico de 350 µ 1 y centrifugan (100 g; minuto) . El precipitado se recolecta al cortar el extremo del tubo y el precipitado de sobrenadante se cuentan por separado en un contador gama (Packard) . Enlace específico (cpm) se determina como enlace total en la ausencia de un enlace menos competidor (por medio de duplicados) (cpm) en la presencia de un exceso de 100 veces de ABP sin etiquetar (enlace no específico) . El enlace no específico se mide para cada uno de los tipos de células empleado. Experimentos se corren en días separados utilizando la misma preparación de 125I-ABP y habrán de exhibir consistencia interna. El enlace se inhibe en una forma dependiente de dosis por ABP o ABP natural no etiquetado, pero no por control negativo. La capacidad de ABP para competir para el enlace de 125I-ABP natural, sugiere que los receptores reconozcan ambas formas igualmente bien. Para ensayos de enlace con scFv-108, células A431 se recolectan siguiendo el tratamiento con tripcina, re-suspenden en amortiguador FACS (PBS, FBS al 2%, NaN3 0.01%), y después siembran en placas de microtitulación de fondo redondo de 96 pozos (3 X 105 células/pozo) . Se incubaron células con diferentes concentraciones de fragmentos scFv-108 que contienen pAcF o de ti;?o silvestre por 30 minutos en hielo. Proteínas scFv sin ligar se retiraron al lavar después de precipitación (repetida 2 a 3 veces) . Después se incubaron células con el mAb-108 (ATCC # HB 9764) a una concentración de 7.5 nM (EC80) por 30 minutos. Después de dos lavados, las células se incubaron con anticuerpo anti-ratón etiquetado A C (aloficocianina) (10 /g/ml) por 30 minutos en hielo.

Después de lavar las células dos veces para retirar el anticuerpo secundario, las células se resuspenden en amortiguador FAC suplementado con yoduro de propidio (0.5 g/ml) , y analizan por citometría de flujo. Para ensayos de enlace con Fab-108, se incubaron células con cantidades crecientes de Fab- 108 bajo las mismas condiciones que se emplean para los ensayos scFv-108. Enlace FAB se detectó utilizando un anticuerpo anti-His seguido por un anticuerpo secundario anti-ratón etiquetado con APC. La Figura 7, Paneles A-C muestran curvas de enlace de competencia de las proteínas scFv que contienen La Figure 8, Paneles B-D muestra enlace de pAcF o pAcF-PEG que contiene fragmentos Fab- 108 y WT Fab células A431 que expresan receptores EGF. La modificación con polietilen glicol de los fragmentos Fab resultan en una disminución mínima en la afinidad de los fragmentos a los receptores EGF. Enlace de los fragmentos Fab modificados respecto al de Fab de tipo silvestre se - , no mo ca o y so uc n amortiguadora se administran a ratones o ratas. Los resultados mostrarán superior actividad y vida media prolongada del ABP modificado con polietilen glicol de presente invención, en comparación con ABP sin modificar Medida de la vida media in vivo de ABP conjugado y no conjugado y sus variantes Ratas macho Sprague Dawley (aproximadamente de 7 semanas de edad) se emplean. El día de administración, el peso de cada animal se mide. 100 µ g por kg de peso corporal de las muestras ABP no conjugadas y conjugadas cada una se inyectan intravenosamente a la vena de la cola de tres ratas. A 1 minuto, 30 minutos, 1, 2, 4, 6, y 24 horas después de la inyección, 500 µ l de sangre se retiran de cada rata mientras que está bajo anestesia con C02. Las muestras de sangre se almacenan a temperatura ambiente por 1.5 horas seguido por aislamiento del sue ;r¡ o por centrifugación (4 grados C, 18000xg por 5 minutos Las muestras de suero se almacenan a -80 grados C hasta el día de análisis. La cantidad de ABP activo en 1as muestras de suero se cuantifica por el ensayo de actividad in vi tro de ABP después de descongelar las muestras en hielo. Ejemplo 31 Prueba clínica humana de seguridad y/o eficacia de ABP modificado con polietilen glicol, que comprende un aminoácido no naturalmente codificado. Objetivo. Comparar la seguridad farmacocinética de ABP humanos recombinantes modificados con polietilen glicol, administrado subcutáneamente que comprenden un aminoácido no naturalmente codificado con un producto comercialmente disponible específico para el mismo antígeno diana (por ejemplo Herceptin®, Bexxar®, Campath®, CEA-Sean®, Enbrel®, Erbitux®, Humira®, Myoscint®, Prostascint® , Raptiva®, Remicade®, ReoPro® Rituxan®, Simulect®, Synagis®, Verluma®, Xolair® Zenapax®, Zevalin®, o Avastin®. Pacientes . Dieciocho voluntarios sanos en el intervalo entre 20 a 40 años de edad y con peso entre 60 y 90 kilos participan en el estudio. Los sujetos no tendrán valor de laboratorio anormales clínicamente significantes para hematología o química de suero, y una prueba de toxicología de orina negativa, prueba de HIV, y antígeno de superficie hepatitis B. No deberán tener evidencia alguna de los siguiente: hipertensión; una historia de enfermedad hematológica primaria; historia de enfermedad significante hepática, renal, cardiovascular, gastrointestinal, genitourinaria, metabólica, neurológica; una historia de anemia o desorden de ataque; una sensibilidad conocida a productos derivados de mamíferos o bacterias, PEG, o albúmina de suero humano; consumidor habitual y pesado de bebidas que contengan cafeína; participación en cualquier otra prueba clínica o que se le hubiera sometido a transfusión de sangre o donado en 30 días de la entrada al estudio; se hubiera expuesto a ABP dentro de tres meses de la entrada |al estudio; tuviera una enfermedad dentro de los siete dias de la entrada al estudio; y tuvieran anormalidades significantes en el examen físico pre-estudio o las evaluaciones de laboratorio clínicas dentro de 14 días de entrada al estudio. Todos los sujetos se evalúan por seguridad y todas las tomas de sangre para análisis farmacocinético se recolectan como se programó. Todos los estudios se realizan con consentimiento del paciente y aprobación del comité de ética institucional. Diseño de estudio. Este será un estudio cruzado Fase I, de centro sencillo, etiqueta abierta, al azar, de dos periodos en voluntarios masculinos sanos. Dieciocho sujetos se asignan aleatoriamente a uno de dos sub-grupos de secuencia de tratamiento (nueve sujetos/grupo) . ABP se administra en dos periodos de dosis separados como an bolo, inyección s.c. en el muslo superior utilizando dosis equivalentes de ABP modificado con polietilen glicol que comprende un aminoácido no naturalmente codificado y el producto comercialmente disponible selecto. La dosis y frecuencia de administración del producto comercialmente disponible es como se instruye en las etiquetas del empaque. Dosis adicionales, frecuencias de dosis u otro parámetro según se desee, utilizando los productos comercialmente disponibles, pueden agregarse al estudio incluyendo grupos de sujetos adicionales. Cada periodo de dosis se separa por un periodo de limpieza profunda. Sujetos se confinan al centro de estudio al menos 12 horas antes de y 72 horas después de dosis por cada uno de los dos periodos de dosis, pero no entre periodos de dosis. Grupos de sujetos adicionales pueden agregarse si van a haber adicionales dosis, frecuencias u otros parámetros, a probarse para el ABP modificado con polietilen glicol por igual. La formulación experimental de ABP es el ABP modificado con polietilen glicol que comprende un aminoácido no naturalmente codificado. Muestras de sangre. Sangre serial se toma por punción directa en vena antes y después de administración de ABP. Muestras de sangre venosas (5 mL) para determinación de concentraciones de ABP en suero, se obtienen a aproximadamente 30, 20, y 10 minutos antes de dosis (3 muestras de línea base) y a aproximadamente los siguientes tiempos después de dosis: 30 minutos y a 1, 2, 5, 8, 12, 15, 18, 24, 30, 36, 48, 60 y 72 horas. Cada muestra en suero se divide en dos alícuotas. Todas las muestras de suero se almacenan a -20 grados C. Muestras de suero se embarcan en hielo seco. Pruebas de laboratorio clínico en ayunas (hematología, química de suero y urinálisis) se realizan inmediatamente antes de la dosis inicial el día 1, la mañana del día 4, inmediatamente antes de dosis el día 16 y la mañana del día 19. Métodos bioanalíticos . Un procedimiento de equipo de radioinmunoensayo (RA) o ELISA se emplea para la determinación de concentraciones de ABP en suero. Determinaciones de seguridad. Signos vitales se registran inmediatamente antes de cada dosis (Días 1 y 16) y a 6, 24, 48, y 72 horas después de cada dosis. Determinaciones de seguridad se basan en la incidencia y tipo de eventos adversos y los cambios en pruebas de clínica de laboratorio de línea base. Además, cambios de pre-estudio en medidas de signos vitales, incluyendo presión sanguínea, y resultados de examen físico, se evalúan. Análisis de datos. Valores de concentración n suero de post-dosis se corrigen para concentraciones de ABP de línea base pre-dosis al sustraer de cada uno de los valores post -dosis la concentración ABP de línea base promedio determinada de promediar los niveles Abp de las tres muestras recolectadas a 30, 20, y 10 minutos antes de dosis. Concentraciones de ABP en suero pre-dosis no se incluyen en el cálculo del valor promedio si están por debajo del nivel de cuantificación del ensayo. Parámetros farmacocinéticas se determinan de datos de concentración en suero corregidos para concentraciones ABP de línea base. Parámetros farmacocinéticas se calculan por métodos independientes de modelo en un sistema de computadora Digital Equipment Corporation VAX 8600 utilizando la versión más reciente del programa BIOAVL. Se determinan los siguientes parámetros farmacocinéticos: concentración pico en suero (Cmax) ; tiempo para concentración pico en suero (tmax) ; área bajo la cuerva de tiempo-concentración (AUC = área under the concentration-time curve) del tiempo cero al último tiempo de toma de sangre (AUC0-7 ) calculado con el uso de la regla trapezoidal lineal; y vida media de eliminación terminal (T?/2) , calculada a partir de la constante de la velocidad de eliminación. La constante de velocidad de eliminación se estima por regresión lineal de puntos de datos consecutivos en la región lineal terminal del trazo de concentración lineal logarítmica-tiempo. La desviación estándar promedio (SD) , y coeficiente de variación (CV) de los parámetros farmacocinéticas se calculan para cada tratamiento. La proporción de promedios de parámetros (formulación conservada/formulación no conservada) se calcula. Resultados de seguridad. La incidencia de eventos adversos se distribuye igualmente a través de los grupos de tratamiento. No hay cambios clínicamente significantes de presiones de sangre o pruebas de laboratorio clínico de línea base o pre-estudio y no hay cambios notables de pre-estudio en resultados de examen físico y medidas de signos vitales. Los perfiles de seguridad para los dos grupos de tratamiento deberán aparecer similares. Resultados farmacocinéticos. Perfiles de concentración de ABP promedio en suero-tiempo (sin corregir para niveles ABP de línea base) en todos los 18 sujetos después de recibir una sola dosis de uno o más de productos comercialmente disponibles específicos para el mismo antígeno diana, se comparan con el ABP modificado con polietilen glicol, que comprende un aminoácido no naturalmente codificado en cada punto en tiempo medido. Todos los sujetos deberán tener concentraciones ABP de línea base pre-dosis dentro del rango fisiológico normal. Parámetros farmacocinéticos se determinan a partir de datos en suero corregidos para concentraciones ABP de línea base promedio pre-dosis y se determinan Cmax y tmax. La tmax para el o los comparadores clínicos seleccionados, es significativamente más corta que la tmax para el A P modificado con polietilen glicol que comprende el aminoácido no naturalmente codificado. Valores de vida media terminales son significativamente más cortos para los productos ABP comercialmente disponibles probados en comparación con la vida media terminal para el A.3P modificado con polietilen glicol que comprende un aminoácido no naturalmente codificado. Aunque el presente estudio se realiza en sujetos masculinos sanos, características de absorción similares y perfiles de seguridad se anticiparán en otras poblaciones de pacientes; tales como pacientes masculinos o femeninos con cáncer o falla renal crónica, pacientes pediátricos de falla renal, pacientes en programas de pre-depósito autólogo, o pacientes programados para cirugía electiva. En conclusión, dosis sencillas administradas subcutáneamente de ABP modificado con polietilen glicol que comprenden aminoácido no naturalmente codificado, serán seguras y bien toleradas por sujetos masculinos sanos. Con base en una incidencia comparativa de eventos adversos, valores clínicos de laboratorio, signos vitales y resultados de examen físico, los perfiles de seguridad de las formas comercialmente disponibles de ABP y A P modificado con polietilen glicol que comprenden aminoácidos no naturalmente codificados, serán equivalentes. El ABP modificado con polietilen glicol que comprende aminoácido no naturalmente codificado, proporciona potencialmente gran utilidad clínica pacientes y proveedores del cuidado de la salud. Se entiende que los ejemplos y modalidades aquí descritos son con propósitos ilustrativos solamente y que enlazador bifuncional, o al menos un polipéptido de enlace de antígeno adicional. 6. El polipéptido de enlace de antígeno de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque el enlazador o polímero bifuncional se enlaza a un segundo polipéptido. 7. El polipéptido de enlace de antígeno de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque el second polipéptido es un polipéptido de enlace de antígeno. 8. El polipéptido de enlace de antígeno de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque el segundo polipéptido es un polipéptido sin enlace de antígeno. 9. El polipéptido de enlace de antígeno de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque el polímero soluble en agua comprende una porción poli (etilen glicol) . 10. El polipéptido de enlace de antígeno de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque el polímero bifuncional es una porción poli (etilen glicol) . 11. El polipéptido de enlace de antígeno de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque el polímero soluble en agua está enlazado a un amino ácido no-naturalmente codificado presente en el polipéptido de enlace de antígeno. 12. El polipéptido de enlace de antígeno de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende al menos dos amino ácidos enlazados a un polímero soluble en agua que comprende una porción poli (etilen glicol) . 13. El polipéptido de enlace de antígeno de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque al menos un amino ácido enlazado al polímero soluble en agua es un amino ácido no naturalmente codificado. 14. El polipéptido de enlace de antígeno de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el polipéptido de enlace de antígeno comprende uno o más de substitución, adición o eliminación de amino ácidos que modula la afinidad del polipéptido de enlace de antígeno para un antígeno o receptor de ABP. 15. El polipéptido de enlace de antígeno de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el polipéptido de enlace de antígeno comprende uno o más de substitución, adición o eliminación de amino ácidos que modula la estabilidad, nivel de expresión en una célula anfitriona recombinante o sintetizada in vitro, inmunogenicidad, resistencia a proteasa, especificidad de tejido u órgano, o solubilidad del polipéptido de enlace de antígeno. 16. El polipéptido de enlace de antígeno de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el amino ácido no-naturalmente codificado es reactivo hacia un enlazador, copolímero o molécula biológicamente activa, que de otra forma no es reactiva hacia ninguno de los 20 amino ácidos comunes en el polipéptido. 17. El polipéptido de enlace de antígeno de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el amino ácido no-naturalmente codificado comprende un grupo carbonilo, un grupo aminooxi, un grupo hidrazina, un grupo hidrazida, un grupo semicarbazida, un grupo azida, o un grupo alquino. 18. El polipéptido de enlace de antígeno de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque el amino ácido no-naturalmente codificado comprende un grupo carbonilo. 19. El polipéptido de enlace de antígeno de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque el amino ácido no-naturalmente codificado tiene la estructura : en donde n es 0-10; Rl es un alquilo, arilo, alquilo sustituido, o arilo sustituido; R2 es H, un alquilo, arilo, alquilo sustituido, y arilo sustituido; y R3 es H, un amino ácido, a polipéptido, o un grupo de modificación de extremo amino, y R4 es H, un amino ácido, a polipéptido, o un grupo de modificación de extremo carboxi . 20. El polipéptido de enlace de antígeno de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque el amino ácido no-naturalmente codificado comprende un grupo aminooxi . 21. El polipéptido de enlace de antígeno de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque el amino ácido no-naturalmente codificado comprende un grupo hidrazida. 22. El polipéptido de enlace de antígeno de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque el amino ácido no-naturalmente codificado comprende un grupo hidrazina 23. El polipéptido de enlace de antígeno de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque el amino ácido no-naturalmente codificado comprende un grupo semicarbazida 24. El polipéptido de enlace de antígeno de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque el amino ácido no-naturalmente codificado comprende un grupo azida. 25. El polipéptido de enlace de antígeno de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque el amino ácido no-naturalmente codificado tiene la estructura : en donde n es 0-10; Rl es un alquilo, arilo, alquilo substituido, arilo substituido o no está presente; X es 0, N, S o no está presente; m es 0-10; R2 es H, an amino ácido, un polipéptido, o un grupo de modificación de extremo amino, y R3 es H, an amino ácido, a polipéptidp, o un grupo de modificación de extremo carboxi. 26. El polipéptido de enlace de antígeno de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque el amino ácido no-naturalmente codificado comprende un grupo alquino. 27. El polipéptido de enlace de antígeno de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque el amino ácido no-naturalmente codificado tiene la un grupo aminooxi, una hidrazina, hidrazida semicarbazida . 31. El polipéptido de enlace de antígeno de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado porque el grupo aminooxi, hidrazina, hidrazida o semicarbazida está enlazado al polímero soluble en agua a través de un enlace amida. 32. El polipéptido de enlace de antígeno de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque se elabora al reaccionar un polímero soluble en agua que comprende un grupo carbonilo con un polipéptido que comprende un amino ácido no-naturalmente codificado que comprende un grupo aminooxi, una hidrazina, una hidrazida o semicarbazida. 33. El polipéptido de enlace de antígeno de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque se elabora al reaccionar un polipéptido de enlace de antígeno que comprende un amino ácido que contiene alquino con un polímero soluble en agua que comprende una porción azida. 34. El polipéptido de enlace de antígeno de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque se elabora al reaccionar un polipéptido de enlace de antígeno que comprende un amino ácido que contiene azida, con un polímero soluble en agua que comprende una porción alquino. 35. El polipéptido de enlace de antígeno de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque el grupo azida o alquino está enlazado a un polímero soluble en agua a través de un enlace amida. 36. El polipéptido de enlace de antígeno de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque el polímero soluble en agua es polímero ramificado o de múltiples brazos. 37. El polipéptido de enlace de antígeno de conformidad con la reivindicación 36, caracterizado porque cada ramificación del polímero soluble en agua tiene un peso molecular de entre aproximadamente 1 kDa 100 kDa. 38. El polipéptido de enlace de antígeno de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el polipéptido es un antagonista polipéptido de enlace de antígeno. 39. El polipéptido de enlace de antígeno de conformidad con la reivindicación 38, caracterizado porque el polipéptido comprende uno o más de modificación post-traducción, enlazador, polímero, o molécula biológicamente activa. 40. El polipéptido de enlace de antígeno de conformidad con la reivindicación 39, caracterizado porque el polímero comprende una porción seleccionada que el grupo que consiste de un polímero soluble en agua poli (etilen glicol). 41. El polipéptido de enlace de antígeno de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el amino ácido no-naturalmente codificado comprende una porción sacárido. 42. El polipéptido de enlace de antígeno de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque el enlazador, polímero o molécula biológicamente activa se enlaza al polipéptido mediante una porción sacárido 43. Un ácido nucleico aislado que comprende un polinucleótido que hibridiza bajo condiciones severas a un polinucleótido que codifica polipéptido de enlace de antígeno, caracterizado porque el polinucleótido comprende al menos un codón selector. 44. El ácido nucleico aislado de conformidad con la reivindicación 43, caracterizado porque el codón selector se elige del grupo que consiste de un codón ámbar, codón ocre, codón ópalo, un codón único, un codón raro y un codón de cuatro bases. 45. Un método para producir el polipéptido de enlace de antígeno de conformidad con la reivindicación 3, el método se caracteriza porque comprende contactar un polipéptido de enlace de antígeno aislado que comprende un amino ácido no-naturalmente codificado con un enlazador, polímero o molécula biológicamente activa se comprende proporción que reacciona con el amino ácido no naturalmente codificado. 46. El método de conformidad con la reivindicación 45, caracterizado porque el polímero comprende una porción seleccionada del grupo que consiste de un polímero soluble en agua y poli (etilen glicol) . 47. El método de conformidad con la reivindicación 45, caracterizado porque el amino ácido no-naturalmente codificado comprende un grupo carbonilo, un grupo aminooxi, un grupo hidrazida, un grupo hidrazina, un grupo semicarbazida, un grupo azida, o un grupo alquino. 48. El método de conformidad con la reivindicación 45, caracterizado porque el amino ácido no-naturalmente codificado comprende una porción carbonilo y enlazador, polímero o molécula biológicamente activa comprende una porción aminooxi, una hidrazina, una hidrazida, o semicarbazida. 49. El método de conformidad con la reivindicación 48, caracterizado porque la porción aminooxi, una hidrazina, una hidrazida, o una porción semicarbazida se enlazan al asador, polímero o molécula biológicamente activa a través de un enlace amida. 50. El método de conformidad con la reivindicación 45, caracterizado porque el amino ácido no-naturalmente codificado comprende una porción alquino y el enlazador, polímero, o molécula biológicamente activa comprende una porción azida. 51. El método de conformidad con la reivindicación 45, caracterizado porque el amino ácido no-naturalmente codificado comprende una porción azida y el enlazador, polímero, o molécula biológicamente activa comprende una porción alquino. 52. El método de conformidad con la reivindicación 47, caracterizado porque la porción azida o alquino se enlaza a un enlazador, polímero o molécula biológicamente activa a través de un enlace amida. 53. El método de conformidad con la reivindicación 46, caracterizado porque la porción poli (etilen glicol) tiene un peso molecular promedio de entre aproximadamente 0.1 kDa y aproximadamente 100 kDa 54. El método de conformidad con la reivindicación 46, caracterizado porque la porción poli (etilen glicol) es un polímero ramificado o de múltiples brazos. 55. Una composición que comprende el polipéptido de enlace de antígeno de conformidad con la reivindicación 1 y un portador farmacéuticamente aceptable. 56. La composición de conformidad con reivindicación 55, caracterizada porque el amino ácido no-naturalmente codificado está enlazado a un polímero soluble en agua. 57. Un método para tratar a un paciente que tiene un desorden modulado por ABP, caracterizado porque comprende administrar al paciente una cantidad terapéuticamente efectiva de la composición de conformidad con la reivindicación 55. 58. Una célula que comprende el ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 43. 59. La célula de conformidad con la reivindicación 58, caracterizada porque comprende una tRNA sintetasa ortogonal o un tRNA ortogonal . 60. Un método para producir un polipéptido de enlace de antígeno que comprende un amino ácido no naturalmente codificado, el método se caracteriza porque comprende cultivar células que comprenden un polinucleótido o polinucleótidos que codifican un polipéptido de enlace de antígeno que comprende un codón selector, una RNA sintetasa ortogonal y un tRNA ortogonal, bajo condiciones para permitir expresión del polipéptido de enlace de antígeno que comprende un amino ácido no naturalmente codificado; y purificar el polipéptido de enlace de antígeno. 61. Un método para modular vida media en suero o tiempo de circulación de un polipéptido de enlace de antígeno, el método se caracteriza porque comprende sustituir uno o más amino ácidos no naturalmente codificados por cualquiera uno o más amino ácidos de origen natural en el polipéptido de enlace de antígeno. 62. Un polipéptido de enlace de antígeno codificado por un polinucleótido en donde el polinucleótido comprende un codón selector, y en donde el polipéptido comprende al menos un amino ácido no naturalmente codificado. 63. El polipéptido de enlace de antígeno de conformidad con la reivindicación 62, caracterizado porque el amino ácido no-naturalmente codificado es enlazado a un enlazador, polímero, polímero soluble en agua, o molécula biológicamente activa. j I 64. El polipéptido de enlace de antígeno de conformidad con la reivindicación 63, caracterizado porque el polímero soluble en agua comprende una porción poli (etilen glicol) . 65. El polipéptido de enlace de antígeno de conformidad con la reivindicación 62, caracterizado porque el amino ácido no-naturalmente codificado comprende un grupo carbonilo, un grupo aminooxi, un grupo hidrazida, un grupo hidrazina, un grupo semicarbazida, un grupo azida, o un grupo alquino. 66. El polipéptido de enlace de antígeno de conformidad con la reivindicación 64, caracterizado porque la porción poli (etilen glicol) tiene un peso molecular de entre aproximadamente 0.1 kDa y aproximadamente 100 kDa. 67. El polipéptido de enlace de antígeno de conformidad con la reivindicación 64, caracterizado porque la porción poli (etilen glicol) es un polímero ramificado o de múltiples brazos. 68. El polipéptido de enlace de antígeno de conformidad con la reivindicación 67, caracterizado porque la porción poli (etilen glicol) tiene un peso molecular de entre aproximadamente 1 kDa y aproximadamente 100 kDa. 69. Una composición que comprende él polipéptido de enlace de antígeno de conformidad con la reivindicación 62 y un portador farmacéuticamente aceptable. 70. Un ABP bi-específico que comprende un primer ABP y un segundo ABP unidos entre sí, en donde el primer ABP y el segundo ABP ligan específicamente diferentes epítopes, en donde el primer ABP tiene especificidad de enlacepara al menos un epítope en un primer antígeno, y el segundo ABP tiene especificidad de enlace por un segundo epítope en el primer antígeno o un segundo antígeno que es diferente del primer epítope, en donde el ABP bi-específico comprende al menos un amino ácido no naturalmente codificado. 71. El ABP bi-específico de conformidad con la reivindicación 70, caracterizado porque el primer ABP el segundo ABP se unen por un enlazador. 72. El ABP biespecífico de conformidad con reivindicación 71, caracterizado porque el enlazador es un enlazador péptido. 73. El ABP biespecífico de conformidad con reivindicación 72, represado porque el enlazador es un enlazador péptido que carece de un sitio de escisión proteolítica. 74. El ABP biespecífico de conformidad con la reivindicación 70, caracterizado porque el primer ABP es un ABP de cadena sencilla y el segundo ABP es un ABP de cadena sencilla y el primer ABP está acoplado al segundo ABP por un enlazador péptido. 75. Una composición que comprende un ABP biespecífico de conformidad con la reivindicación 70 y un portador farmacéuticamente aceptable. 76. Un método para tratar una enfermedad condición, el método se caracteriza porque comprende administrar a un paciente que lo requiere, una cantidad terapéuticamente efectiva de la composición de conformidad con la reivindicación 75. 77. Un ABP que comprende el ABP biespecífico de conformidad con la reivindicación 70, acoplado a una molécula biológicamente activa. 78. El ABP de conformidad con la reivindicación 77, caracterizado porque la molécula biológicamente activa se elige del grupo que consiste de una citotoxina, una etiqueta, un radionúclido, una droga, un liposoma, un ligando, y un ABP. 79. El ABP de conformidad con la reivindicación 77, caracterizado porque el ABP es una proteína de fusión. 80. Un método para detectar una célula o tejido que expresa uno o más antígenos, el método se caracteriza porque comprende: contactar una célula o tejido con un ABP de conformidad con la reivindicación 70 conectado una etiqueta detectable; y detectar la etiqueta, en donde la detección de la etiqueta en asociación con una célula o tejido, indica la presencia de una célula o tejido que expresa uno o más antígenos ligados por el ABP. 81. El método de conformidad con la reivindicación 80, caracterizado porque la etiqueta detectable se elige del grupo que consiste de un emisor gamma, un emisor de positrones, una etiqueta de MRI , una etiqueta fluorescente. 82. El método de conformidad con la reivindicación 80, caracterizado porque la etiqueta detectable es un emisor gamma y la detección comprende informar en imagen con una cámara gamma . 83. El método de conformidad con reivindicación 80, caracterizado porque le etiqueta detectable es un emisor de positrones y la detección comprende formar en imagen con tomografía de emisión de positrones (PET = positrón emission tomography) . 84. El método de conformidad con la reivindicación 80, caracterizado porque la etiqueta detectable es una etiqueta MRI y la detección comprende comprende detectar con formación de imagen por resonancia magnética . 85. Un polipéptido de enlace de antígeno que comprende un polímero soluble en agua enlazado por un enlace covalente al polipéptido de enlace de antígeno en un solo amino ácido. 86. El polipéptido de enlace de antígeno de conformidad con la reivindicación 85, caracterizado porque el polímero soluble en agua comprende una porción poli (etilen glicol) . 87. El polipéptido de enlace de antígeno de conformidad con la reivindicación 85, caracterizado porque el amino ácido ligado covalentemente al polímero soluble en agua es un amino ácido no naturalmente codificado. 88. Un polipéptido de enlace de antígeno que comprende cuando menos un enlazador, polímero o molécu! biológicamente activa, en donde el enlazador, polímero molécula biológicamente activa se conecta al polipéptido a través de un grupo funcional de un amino ácido no-naturalmente codificado incorporado ribosomalmente al polipéptido. 89. El polipéptido de enlace de antígeno de conformidad con la reivindicación 88, caracterizado porque el polipéptido de enlace de antígeno es mono-modificado con polietilen glicol (PEGilado) . 90. Un polipéptido de enlace de antígeno que comprende un enlazador, polímero o molécu! biológicamente activa que se conecta a uno o más amino ácidos no naturalmente codificados en donde el amino ácido no-naturalmente codificado se incorpora ribosomalmente en el polipéptido en sitios pre-seleccionados . 91. El polipéptido de enlace de antígeno de conformidad con la reivindicación 90, caracterizado porque el polipéptido de enlace de antígeno comprende un enlazador, polímero o molécula biológicamente activa. 92. El polipéptido de enlace de antígeno de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el polipéptido de enlace de antígeno comprende uno o más de substitución, adición o eliminación de amino ácidos que modulan vida media en suero o tiempos de circulación del polipéptido de enlace de antígeno. 93. Un método para modular inmunogenicidad de un polipéptido de enlace de antígeno, el método se caracteriza porque comprende sustituir uno o más amino ácidos no naturalmente codificados por cualquiera uno más amino ácidos de origen natural en el polipéptido de enlace de antígeno. 94. El ácido nucleico aislado de conformidad con la reivindicación 43, caracterizado porque secuencia del ácido nucleico aislado se seleccionan del grupo que consiste de SEQ ID NO: 18, 20, 22, 25, 27, y 29 o su fragmento. 95. Un polipéptido de enlace de antígeno en donde el polipéptido se selecciona del grupo que consiste de SEQ TD NO: 19, 21, 23, 24, 26, 28, 30, 31 o su fragmento. 96. El polipéptido de enlace de antígeno de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque el polipéptido de enlace de antígeno está enlazado al enlazador, polímero o molécula biológicamente activa condiciones de desnaturalización.

Claims (23)

1. REIVINDICACIONES 1. Un polipéptido de enlace de antígeno que comprende uno o más amino ácidos no naturalmente codificados .
2. 2. El polipéptido de enlace de antígeno de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el polipéptido de enlace de antígeno comprende una o más modificaciones post-traducción.
3. 3. El polipéptido de enlace de antígeno de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el polipéptido de enlace de antígeno se enlaza a un enlazador, polímero o molécula biológicamente activa.
4. 4. Un ácido nucleico aislado que comprende un polinucleótido que hibridiza bajo condiciones severas un polinucleótido que codifica polipéptido de enlace de antígeno, caracterizado porque el polinucleótido comprende al menos un codón selector.
5. 5. Un método para producir el polipéptido de enlace de antígeno de conformidad con la reivindicación 3 , el método se caracteriza porque comprende contactar un polipéptido de enlace de antígeno aislado que comprende un amino ácido no-naturalmente codificado con un enlazador, polímero o molécula biológicamente activa que comprende una porción que reacciona con el amino ácido no naturalmente codificado.
6. 6. Una composición que comprende el polipéptido de enlace de antígeno de conformidad con la reivindicación 1 y un portador farmacéuticamente aceptable .
7. 7. Un método para tratar a un paciente que tiene un desorden modulado por ABP, caracterizado porque comprende administrar al paciente una cantidad terapéuticamente efectiva de la composición de conformidad con la reivindicación 6.
8. 8. Una célula que comprende el ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 4.
9. 9. Un método para producir un polipéptido de enlace de antígeno que comprende un amino ácido no naturalmente codificado, el método se caracteriza porque comprende cultivar células que comprenden un polinucleótido o polinucleótidos que codifican un polipéptido de enlace de antígeno que comprende un codón selector, una RNA sintetasa ortogonal y un tRNA ortogonal, bajo condiciones para permitir expresión del polipéptido de enlace de antígeno que comprende un amino ácido no naturalmente codificado; y purificar el polipéptido de enlace de antígeno.
10. 10. Un método para modular vida media en suero o tiempo de circulación de un polipéptido de enlace de antígeno, el método se caracteriza porque comprende sustituir uno o más amino ácidos no naturalmente codificados por cualquiera uno o más amino ácidos e origen natural en el polipéptido de enlace de antígeno.
11. 11. Un polipéptido de enlace de antígeno codificado por un polinucleótido en donde el polinucleótido comprende un codón selector, y en donde el polipéptido comprende al menos un amino ácido no naturalmente codificado.
12. 12. Una composición que comprende el polipéptido de enlace de antígeno de conformidad con la reivindicación 11 y un portador farmacéuticamente aceptable .
13. 13. Un ABP bi-específico que comprende un primer ABP y un segundo ABP unidos entre sí, en donde el primer ABP y el segundo ABP ligan específicamente diferentes epítopes, en donde el primer ABP tiene especificidad de enlace para al menos un epítope en un primer antígeno, y el segundo ABP tiene especificidad de enlace por un segundo epítope en el primer antígeno o un segundo antígeno que es diferente del primer epítope, en donde el ABP bi-específico comprende al menos un amiho ácido no naturalmente codificado.
14. 14. Una composición que comprende un ABP biespecífico de conformidad con la reivindicación 13 y un portador farmacéuticamente aceptable.
15. 15. Un método para tratar una enfermedad condición, el método se caracteriza porque comprende administrar a un paciente que lo requiere, una cantide.d terapéuticamente efectiva de la composición de conformidad con la reivindicación 14.
16. 16. Un ABP que comprende el ABP biespecífico de conformidad con la reivindicación 13, acoplado a una molécula biológicamente activa.
17. 17. Un método para detectar una célula o tejido que expresa uno o más antígenos, el método se caracteriza porque comprende: contactar una célula o tejido con un ABP de conformidad con la reivindicación 13 conectado una etiqueta detectable; y detectar la etiqueta, en donde la detección de la etiqueta en asociación con una célula tejido, indica la presencia de una célula o tejido que expresa uno o más antígenos ligados por el ABP.
18. 18. Un polipéptido de enlace de antígeno que comprende un polímero soluble en agua enlazado por un enlace covalente al polipéptido de enlace de antígeno en un solo amino ácido.
19. 19. Un polipéptido de enlace de antígeno que comprende cuando menos un enlazador, polímero o molécula biológicamente activa, en donde el enlazador, polímero molécula biológicamente activa se conecta al polipéptido a través de un grupo funcional de un amino ácido no-naturalmente codificado incorporado ribosomalmente al polipéptido.
20. 20. Un polipéptido de enlace de antígeno que comprende un enlazador, polímero o molécu!.a biológicamente activa que se conecta a uno o más amino ácidos no naturalmente codificados en donde el amino ácido no-naturalmente codificado se incorpora ribosomalmente en el polipéptido en sitios pre-seleccionados .
21. 21. Un método para modular inmunogenicidad de un polipéptido de enlace de antígeno, el método se caracteriza porque comprende sustituir uno o más amino ácidos no naturalmente codificados por cualquiera uno más amino ácidos de origen natural en el polipéptido de enlace de antígeno.
22. 22. Un polipéptido de enlace de antígeno n donde el polipéptido se selecciona del grupo que consiste de SEQ TD NO: 19, 21, 23, 24, 26, 28, 30, 31 o su fragmento .
23. 23. El polipéptido de enlace de antígeno de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque el polipéptido de enlace de antígeno está enlazado al enlazador, polímero o molécula biológicamente activa bajo condiciones de desnaturalización.