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ES2775192T3 - Procedimientos de tratamiento de una tauopatía - Google Patents

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ES2775192T3
ES2775192T3 ES13830020T ES13830020T ES2775192T3 ES 2775192 T3 ES2775192 T3 ES 2775192T3 ES 13830020 T ES13830020 T ES 13830020T ES 13830020 T ES13830020 T ES 13830020T ES 2775192 T3 ES2775192 T3 ES 2775192T3
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Irene Griswold-Prenner
Nancy E Stagliano
Vu Dang
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iPierian Inc
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Abstract

Un anticuerpo que se une específicamente a Tau, donde el anticuerpo comprende: a) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 37 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 41; b) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 36 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 40; c) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 36 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 41; d) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 36 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 42; e) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 36 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 43; f) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 37 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 40; g) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 37 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 42; h) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 37 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 43; i) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 38 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 40; j) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 38 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 41; k) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 38 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 42; l) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 38 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 43; m) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 39 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 40; n) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 39 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 41; o) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 39 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 42; o p) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 39 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 43.

Description

DESCRIPCIÓN
Procedimientos de tratamiento de una tauopatía
INTRODUCCIÓN
La proteína tau asociada a microtúbulos es abundante en el sistema nervioso central y es producida principalmente por neuronas. La función principal de tau es estabilizar los microtúbulos. Existen seis isoformas de tau en el cerebro humano adulto; las isoformas de tau son los productos de splicing alternativo de un solo gen. Los anticuerpos monoclonales Tau-12 y Tau-13, y el uso de Tau-13 en la investigación del truncamiento de la proteína Tau durante la progresión de la enfermedad de Alzheimer han sido descritos por García-Sierra y col. (Journal of Alzheimer's Disease 5: 65-77, 2003). En esta publicación de García-Sierra y col., se describe que Tau-12 y Tau-13 se unen a los residuos 9-18 del extremo N-terminal de la proteína tau.
Las tauopatías son una clase de enfermedades neurodegenerativas que resultan de la agregación patológica de la proteína tau en los llamados ovillos neurofibrilares (NFT) en el cerebro. Algunos ejemplos de tauopatías incluyen demencia frontotemporal (FTD), enfermedad de Alzheimer, parálisis supranuclear progresiva, degeneración corticobasal y degeneración lobular frontotemporal.
Existe la necesidad en la técnica de procedimientos de tratamiento de tauopatías y de reactivos adecuados para su uso en dichos procedimientos.
Boutajangout y col. (J. Neurochem (2011) 118 (4): 658-667) estudia la inmunización pasiva con el anticuerpo PHF1 en un modelo en ratón.
RESUMEN
La presente descripción proporciona procedimientos de tratamiento de una tauopatía, que implican administrar un anticuerpo anti-Tau. La presente descripción también proporciona anticuerpos anti-Tau, y formulaciones que los comprenden, para su uso en los procedimientos.
CARACTERÍSTICAS
La presente descripción proporciona un anticuerpo monoclonal humanizado aislado que se une específicamente a un epítopo dentro de los aminoácidos 15-24 de un polipéptido Tau. En algunos casos, el epítopo no comprende un aminoácido fosforilado. En algunos casos, el epítopo no comprende un aminoácido nitrado. En algunos aspectos, el epítopo comprende un aminoácido fosforilado, un aminoácido nitrado, o tanto un aminoácido fosforilado como un aminoácido nitrado.
La presente descripción proporciona un anticuerpo aislado que comprende una región marco de cadena ligera humanizada; y una región marco de cadena pesada humanizada, donde el anticuerpo aislado compite por unirse a un epítopo en una región N-terminal de un polipéptido Tau con un anticuerpo que comprende: a) una región de cadena ligera que comprende: i) una VlCDR1 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 7; (ii) una V lCDR2 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 8; y (iii) una VlCDR3 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 9; y b) una región de cadena pesada que comprende: (i) una Vh CDR1 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 10; (ii) una VhCDR2 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 11; y (iii) una VhCDR3 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6 o SEQ ID NO: 12. En algunos casos, la región de cadena ligera y la región de cadena pesada están presentes en polipéptidos separados. En algunos casos, la región de cadena ligera y la región de cadena pesada están presentes en un único polipéptido. En algunos casos, la región de cadena pesada es del isotipo IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4. En algunos casos, la región de cadena pesada es del isotipo IgG4. En algunas de estas realizaciones, la región de bisagra comprende una sustitución S241P. Véase, por ejemplo, Angal y col. (1993) Mol. Immunol 30: 105. En algunos casos, el anticuerpo es un Fv, scFv, Fab, F(ab')2 o Fab'. En algunos casos, el anticuerpo comprende un polímero sintético no peptídico unido covalentemente, por ejemplo, un polímero de poli(etilenglicol). En algunos casos, el anticuerpo se fusiona, directamente o mediante un enlazador, a una molécula portadora, un péptido o una proteína que promueve el cruce de la barrera hematoencefálica. En algunos casos, el epítopo está dentro de los aminoácidos 15-24 de un polipéptido Tau. En algunos casos, la región marco de cadena ligera humanizada comprende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 de las sustituciones de aminoácidos representadas en la tabla 3. En algunos aspectos, la región marco de cadena pesada humanizada comprende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 12 de las sustituciones de aminoácidos representadas en la tabla 2.
La presente descripción proporciona un anticuerpo aislado, donde el anticuerpo es un Fv, scFv, Fab, F(ab')2 o Fab', y donde el anticuerpo compite por unirse a un epítopo en una región N-terminal de un polipéptido Tau con un anticuerpo que comprende: a) una región de cadena ligera que comprende: i) una VlCDR1 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 7; (ii) una VlCDR2 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 8; y (iii) una VlCDR3 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 9; y b) una región de cadena pesada que comprende: (i) una VhCDR1 que comprende una secuencia de aminoácidos de Se Q iD NO: 4 o SEQ ID NO: 10; (ii) una VhCDR2 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 11; y (iii) una VhCDR3 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6 o SEQ ID NO: 12. En algunos casos, el anticuerpo aislado comprende una región marco de cadena ligera humanizada. En algunos casos, la región marco de cadena ligera humanizada comprende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 de las sustituciones de aminoácidos representadas en la tabla 3. En algunos casos, el anticuerpo aislado comprende una región marco de cadena pesada humanizada. En algunos casos, la región marco de cadena pesada humanizada comprende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 12 de las sustituciones de aminoácidos representadas en la tabla 2.
La presente descripción proporciona un anticuerpo aislado, donde el anticuerpo aislado comprende una región constante de cadena ligera humana y una región constante de cadena pesada humana, y donde el anticuerpo aislado compite por unirse a un epítopo en una región N-terminal de un polipéptido Tau con un anticuerpo que comprende: a) una región de cadena ligera que comprende: i) una VlCDR1 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 7; (ii) una VlCDR2 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 8; y (iii) una VlCDR3 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 9; y b) una región de cadena pesada que comprende: (i) una VHCDR1 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 10; (ii) una Vh CDR2 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 11; y (iii) una VhCDR3 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6 o SEQ ID NO: 12.
La presente descripción proporciona una formulación farmacéutica que comprende: a) un anticuerpo anti-Tau de la presente descripción; y b) un excipiente farmacéuticamente aceptable.
La presente descripción proporciona una formulación farmacéutica que comprende: a) un anticuerpo que se une específicamente a un epítopo dentro de una parte N-terminal de Tau, donde el anticuerpo comprende: (i) una VlCDR1 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 7; (ii) una VlCDR2 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 8; (iii) una VlCDR3 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 9; (iv) una Vh CDR1 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 10; (v) una VhCDR2 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 11; y (vi) una VhCDR3 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6 o SEQ ID NO: 12; y b) un excipiente farmacéuticamente aceptable adecuado para administración a un ser humano, donde la formulación está libre de endotoxinas. En algunos casos, el anticuerpo comprende una región marco de cadena ligera humanizada. En algunos casos, la región marco de cadena ligera humanizada comprende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 de las sustituciones de aminoácidos representadas en la tabla 3. En algunos casos, el anticuerpo comprende una región marco de cadena pesada humanizada. En algunos casos, la región marco de cadena pesada humanizada comprende 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 12 de las sustituciones de aminoácidos representadas en la tabla 2. En algunos casos, el anticuerpo está encapsulado en un liposoma. En algunos casos, el anticuerpo está formulado con un agente que facilita el cruce de la barrera hematoencefálica. En algunos casos, el anticuerpo se fusiona, directamente o mediante un enlazador, a una molécula portadora, un péptido o una proteína que promueve el cruce de la barrera hematoencefálica. En algunos casos, el anticuerpo es un Fv, scFv, Fab, F(ab')2 o Fab'.
La presente descripción proporciona un vector de expresión recombinante que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un anticuerpo anti-Tau de la presente descripción, donde la secuencia de nucleótidos está unida operativamente a un elemento de control transcripcional que está activo en una célula eucariota. La presente descripción proporciona una célula huésped in vitro modificada genéticamente con un vector de expresión recombinante de la presente descripción.
La presente descripción proporciona un recipiente estéril que comprende una formulación farmacéutica de la presente descripción. En algunos casos, el recipiente es una jeringa.
La presente descripción proporciona un procedimiento de tratamiento de una tauopatía en un individuo, comprendiendo el procedimiento administrar al individuo un anticuerpo anti-Tau de la presente descripción, o una composición farmacéutica de la presente descripción.
La presente descripción proporciona un procedimiento de tratamiento de una tauopatía en un individuo, comprendiendo el procedimiento administrar al individuo una composición farmacéutica que comprende: a) un anticuerpo que compite por unirse a un epítopo en una región N-terminal de un polipéptido Tau con un anticuerpo que comprende: i) regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de cadena ligera de un anticuerpo representado en la figura 1B; y CDR de cadena pesada de un anticuerpo representado en la figura 1A; o ii) CDR de cadena ligera de un anticuerpo representado en la figura 2B; y CDR de cadena pesada de un anticuerpo representado en la figura 2A; y b) un excipiente farmacéuticamente aceptable adecuado para administración a un ser humano. En algunos casos, el anticuerpo comprende: (i) una VlCDR1 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 7; (ii) una VlCDR2 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 8; (iii) una VlCDR3 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 9; (iv) una VhCDR1 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 10; (v) una VhCDR2 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 11; y (vi) una VhCDR3 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6 o SEQ ID NO: 12. En algunos casos, el anticuerpo comprende una región marco de cadena ligera humanizada. En algunos casos, el anticuerpo comprende una región marco de cadena pesada humanizada. En algunos casos, el anticuerpo está encapsulado en un liposoma. En algunos casos, el anticuerpo está formulado con un agente que facilita el cruce de la barrera hematoencefálica. En algunos casos, el anticuerpo se fusiona, directamente o mediante un enlazador, a una molécula portadora, un péptido o una proteína que promueve el cruce de la barrera hematoencefálica. En algunos casos, el anticuerpo es un Fv, scFv, Fab, F(ab')2 o Fab'. En algunos casos, la administración es intravenosa. En algunos casos, la administración es intratecal.
En algunos casos, la administración de un anticuerpo anti-Tau de la presente da como resultado un cambio en uno o más de: a) la cantidad de tau extracelular libre en el tejido cerebral; b) la cantidad de tau extracelular libre en el líquido intersticial (ISF); c) la cantidad de tau extracelular libre en el líquido cefalorraquídeo (CSF); d) la diseminación de neurona a neurona de tau; e) la cantidad de agregados de tau intraneuronales; f) el grado de activación microglial y/o de astrocitos; g) la cantidad de tau fosforilada o hiperfosforilada; h) la cantidad de tau total o tau libre en el ISF o el CSF; i) la cantidad de fragmentos de tau N-terminales intracelulares; j) hiperactividad neuronal; k) la cantidad de Ap40 y/o Ap42 en el CSF; 1) la carga de la placa Ap; m) secreción de Ap40 y/o Ap42 de una neurona; n) actividad promotora de la proteína precursora de amiloide (APP); o) nivel de ARNm y/o proteína de APP; p) la actividad de beta-secretasa y/o gamma secretasa; q) el estado de activación de una vía de señalización inducida por Ap; r) la cantidad de tau total o tau libre intracelular; s) la cantidad de tau unida a anticuerpo anti-tau en el ISF o el CSF; y t) la cantidad de tau unida a anticuerpo anti-tau intracelular.
En algunos casos, un procedimiento de la presente descripción para tratar una tauopatía en un individuo comprende además administrar al menos un agente adicional que trata la tauopatía.
La presente descripción proporciona un procedimiento para monitorizar la progresión de una tauopatía en un individuo, comprendiendo el procedimiento: a) determinar un primer nivel de un polipéptido Tau en una muestra biológica obtenida del individuo en un primer punto temporal; b) determinar un segundo nivel de un polipéptido Tau en una muestra biológica obtenida del individuo en un segundo punto temporal; y c) comparar el segundo nivel de Tau con el primer nivel de Tau, donde dicha determinación comprende: i) poner en contacto la muestra biológica con un anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1, 5, 16 y 21; y ii) cuantificar la unión del anticuerpo al polipéptido Tau presente en la muestra. En algunos casos, la muestra biológica es líquido cefalorraquídeo, sangre, plasma, suero, orina o saliva. En algunos casos, el polipéptido Tau cuantificado es el polipéptido Tau total. En algunos casos, el polipéptido Tau cuantificado es un fragmento N-terminal de un polipéptido Tau de longitud completa. En algunos casos, el primer punto temporal es un punto temporal antes del inicio de un régimen de tratamiento, y el segundo punto temporal es un punto temporal después del inicio de un régimen de tratamiento.
La presente descripción proporciona un procedimiento de detección de un polipéptido Tau en un individuo vivo in vivo, comprendiendo el procedimiento: a) administrar al individuo un anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1, 5, 16 y 21; y b) detectar la unión del anticuerpo al polipéptido tau en un tejido cerebral en el individuo usando un procedimiento de imagenología. En algunos casos, el anticuerpo comprende un agente de contraste adecuado para su uso en el procedimiento de imagenología. En algunos casos, el procedimiento de imagenología es resonancia magnética o tomografía por emisión de positrones.
La presente descripción proporciona un procedimiento in vitro de detección de un polipéptido Tau en una muestra biológica obtenida de un individuo, comprendiendo el procedimiento: a) poner en contacto la muestra biológica con un anticuerpo compite por unirse a un epítopo dentro de la región N-terminal de Tau con un anticuerpo que comprende: i) regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de cadena ligera de un anticuerpo representado en la figura 1B; y CDR de cadena pesada de un anticuerpo representado en la figura 1A; o ii) CDR de cadena ligera de un anticuerpo representado en la figura 2B; y CDR de cadena pesada de un anticuerpo representado en la figura 2A; y b) detectar la unión del anticuerpo al polipéptido Tau presente en la muestra. En algunos casos, la muestra biológica es sangre, suero, plasma, orina, saliva o líquido cefalorraquídeo. En algunos casos, se sospecha que el individuo tiene una tauopatía, se le ha diagnosticado una tauopatía o tiene una predisposición genética a desarrollar una tauopatía. En algunos casos, el procedimiento es cuantitativo. En algunos casos, el polipéptido Tau detectado es el polipéptido Tau total. En algunos casos, el polipéptido Tau detectado es un fragmento N-terminal de un polipéptido Tau de longitud completa.
Basándose en la descripción contenida en el presente documento, la presente invención proporciona un anticuerpo que se une específicamente a Tau, donde el anticuerpo comprende:
a) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 37 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 41; b) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 36 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 40; c) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 36 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 41; d) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 36 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 42; e) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 36 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 43; f) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 37 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 40; g) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 37 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 42; h) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 37 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 43; i) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 38 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 40; j) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 38 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 41; k) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 38 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 42; l) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 38 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 43; m) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 39 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 40; n) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 39 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 41; o) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 39 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 42; o p) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 39 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 43. En otro aspecto, la presente invención proporciona una composición farmacéutica, que comprende:
a) el anticuerpo de la invención; y
b) un excipiente farmacéuticamente aceptable.
En otro aspecto, la presente invención proporciona un vector de expresión recombinante que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el anticuerpo de la invención, donde la secuencia de nucleótidos está unida operativamente a un elemento de control transcripcional que está activo en una célula eucariota.
En otro aspecto, la presente invención proporciona una célula huésped in vitro genéticamente modificada con el vector de expresión recombinante de la invención.
En otro aspecto, la presente invención proporciona el anticuerpo de la invención, o la composición farmacéutica de la invención, para su uso en el tratamiento de una tauopatía en un sujeto humano.
En otro aspecto, la presente invención proporciona un procedimiento de monitorización de la progresión de una tauopatía en un sujeto humano, comprendiendo el procedimiento:
a) determinar un primer nivel de un polipéptido Tau en una muestra biológica obtenida del sujeto humano en un primer punto temporal;
b) determinar un segundo nivel de un polipéptido Tau en una muestra biológica obtenida del sujeto humano en un segundo punto temporal; y
c) comparar el segundo nivel de Tau con el primer nivel de Tau, donde dicha determinación comprende:
i) poner en contacto la muestra biológica con el anticuerpo de la invención; y
ii) cuantificar la unión del anticuerpo al polipéptido Tau presente en la muestra.
En otro aspecto, la presente invención proporciona el anticuerpo de la invención para su uso en un procedimiento de detección de un polipéptido Tau en un sujeto humano vivo al que se le ha administrado el anticuerpo, donde dicho procedimiento comprende detectar la unión del anticuerpo a un polipéptido Tau en el tejido cerebral en el sujeto humano vivo usando un procedimiento de imagenología.
La presente invención y las realizaciones de la misma se exponen en las reivindicaciones adjuntas.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
Las figuras 1A y 1B proporcionan secuencias de aminoácidos de IPN001 VH (figura 1A) y VL (figura 1B). Las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) están en negrita y subrayadas.
Las figuras 2A y 2B proporcionan secuencias de aminoácidos de IPN002 VH (figura 2A) y VL (figura 2B). Las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) están en negrita y subrayadas.
Las figuras 3A-D representan el efecto del anticuerpo anti-Tau IPN002 sobre la despolarización de membrana mediada por Tau en neuronas corticales.
Las figuras 4A-C representan el aislamiento por afinidad de Tau del líquido cefalorraquídeo (CSF).
La figura 5 representa la cuantificación de muestras de CSF y medio acondicionado (CM) antes y después del aislamiento por afinidad de Tau.
Las figuras 6A-D proporcionan secuencias de aminoácidos de Tau humana de longitud completa.
La figura 7 representa la detección de fragmentos de Tau en medio acondicionado, en líquido intersticial (ISF) de ratones tau P301L, y en CSF de pacientes con PSP y AD
Las figuras 8A-D representan la inducción de hiperactividad de la neurona cortical por un fragmento de tau extracelular (eTau) (figuras 8A-C); y la reducción de la hiperactividad neuronal inducida por eTau por el anticuerpo anti-Tau IPN001. La figura 9 representa una secuencia de aminoácidos de la variante 1 de IPN002 VH humanizada; y una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos.
La figura 10 representa una secuencia de aminoácidos de la variante 2 de IPN002 VH humanizada; y una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos.
La figura 11 representa una secuencia de aminoácidos de la variante 3 de IPN002 VH humanizada; y una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos.
La figura 12 representa una secuencia de aminoácidos de la variante 4 de IPN002 VH humanizada; y una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos.
La figura 13 representa una secuencia de aminoácidos de la variante 1 de IPN002 Vk humanizada; y una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos.
La figura 14 representa una secuencia de aminoácidos de la variante 2 de IPN002 Vk humanizada; y una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos.
La figura 15 representa una secuencia de aminoácidos de la variante 3 de IPN002 Vk humanizada; y una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos.
La figura 16 representa una secuencia de aminoácidos de la variante 4 de IPN002 Vk humanizada; y una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos.
La figura 17 proporciona la tabla 4, que muestra las propiedades de unión de las variantes de IPN-002 humanizadas a las proteínas eTau.
La figura 18 proporciona la tabla 5, que muestra las propiedades de unión de las variantes de IPN-002 humanizadas a Tau-383.
Las figuras 19A y 19B representan propiedades de variantes de IPN002 humanizadas. La figura 19A representa la unión de variantes de IPN-002 humanizadas a tau presente en medios acondicionados con iPSC-CN; lisados de iPSC-CN; lisados cerebrales con AD; y lisados de corteza cerebral de ratón P301L tau; y lisados cerebrales de macaco cangrejero. La figura 19B representa la inhibición de la hiperactividad neuronal inducida por eTau por variantes de IPN002 humanizadas.
La figura 20 representa secuencias de aminoácidos de fragmentos eTau, en alineación con una secuencia de aminoácidos de tau fetal.
Las figuras 21A-C representan respuestas de proliferación a un anticuerpo anti-Tau humanizado (figura 21A), un anticuerpo quimérico (figura 21B) y A33 humanizado (figura 21C).
La figura 22 muestra el efecto de IPN002 sobre los niveles de Tau fosforilado in vivo.
La figura 23 representa la reducción en los niveles de tau libre y en los niveles de tau total en el líquido intersticial (ISF) después del tratamiento con IPN002.
La figura 24 muestra la reducción de los niveles de tau libre en el líquido cefalorraquídeo (CSF) después del tratamiento con IPN002.
La figura 25 representa la reducción de la hiperactividad neuronal inducida por eTau por IPN002.
La figura 26 representa la presencia de fragmentos de Tau en el CSF de individuos con probable encefalopatía traumática crónica.
La figura 27 representa la unión de una variante humanizada de IPN002 a péptidos de tau sintéticos usando un ensayo en fase sólida.
La figura 28 representa la unión de una variante humanizada de IPN002 a péptidos de tau sintéticos usando un ensayo en fase en solución.
La figura 29 representa la unión de una variante humanizada de IPN002 a Tau recombinante y a un péptido PAD. La figura 30 representa la competencia de formas no biotiniladas de péptidos de tau sintéticos con formas biotiniladas de péptidos de tau sintéticos para unirse a una variante humanizada de IPN002.
La figura 31 representa el efecto de la administración de IgG de control, PHF1 o IPN002 sobre las puntuaciones de distonía en el modelo de ratón P310L.
La figura 32 muestra el efecto de la administración de IgG de control, PHF1 o IPN002 sobre la latencia promedio en la prueba de caminar sobre barra en el modelo de ratón P310L.
La figura 33 representa el efecto de la administración de IgG de control, PHF1 o IPN002 sobre el nivel de tau libre (tau no unido al anticuerpo anti-tau) en muestras de CSF en el modelo de ratón P310L.
La figura 34 representa la inhibición por anticuerpos de la hiperexcitabilidad neuronal inducida por eTaula.
La figura 35 representa el efecto de la tau de longitud completa, reactiva con PHF1, o eTaula, sobre la hiperexcitabilidad neuronal en neuronas corticales in vitro
La figura 36 representa gráficamente el efecto de la tau de longitud completa, reactiva con PHF1, o eTaula, sobre la hiperexcitabilidad neuronal en neuronas corticales in vitro
La figura 37 representa el efecto de IgG de control, inhibidor de BACE o IPN002 sobre los niveles de Ap40 (panel izquierdo) o Ap42 (panel derecho) secretados por las neuronas corticales.
La figura 38 representa el efecto de IgG de control, inhibidor de BACE o anticuerpos anti-Tau sobre los niveles de Ap40 secretados por las neuronas corticales primarias.
La figura 39 representa el efecto de IgG de control, inhibidor de BACE o anticuerpos anti-Tau sobre los niveles de Ap42 secretados por las neuronas corticales primarias.
La figura 40 representa los resultados del mapeo de epítopos de una variante humanizada de IPN002 (hu-IPN002). La figura 41 representa un ensayo para detectar diversos polipéptidos tau en CSF.
La figura 42 representa la unión de Tau en CSF por IPN002, PHF1 o un anticuerpo policlonal que se une a un epítopo lineal en la parte C-terminal de Tau (epítopo lineal pAb-tau).
La figura 43 representa el efecto del tratamiento de ratones P301L con IgG de control, PHF1 o IPN002 sobre los niveles de tau total en CSF.
Las figuras 44A-H representan el efecto del tratamiento de ratones P301L con IgG de control, PHF1 o IPN002 sobre fosfo Tau AT8 en diversas regiones y tejidos del cerebro.
Las figuras 45A-E representan el efecto del tratamiento de ratones P301L con IgG de control, PHF1 o IPN002 sobre los niveles de Tau fosforilada en diversas regiones y tejidos del cerebro.
La figura 46 representa el efecto del tratamiento de ratones P301L con IgG de control, PHF1 o IPN002 en el nivel de histología de a T8 fosfo Tau en el rombencéfalo.
La figura 47 representa el efecto del tratamiento de ratones P301L con IgG de control, PHF1 o IPN002 en el nivel de histología de ATl00 fosfo Tau en el rombencéfalo.
Las figuras 48A y 48B representan el efecto del tratamiento de ratones P301L con IgG de control, PHF1 o IPN002 sobre el nivel de proteína GFAP en homogeneizado hipocámpico y en homogeneizado de corteza.
Las figuras 49A y 49B representan el efecto del tratamiento de ratones P301L con IgG de control, PHF1 o IPN002 sobre el nivel de proteína Iba1 en homogeneizado hipocámpico y en homogeneizado de corteza.
Las figuras 50A y 50B representan el efecto del tratamiento de ratones P301L con IgG de control, PHF1 o IPN002 sobre el nivel de Ap40 en el homogeneizado de corteza y la fracción S1 de la corteza.
La figura 51 muestra el efecto del tratamiento de ratones P301L con IgG de control, PHF1 o IPN002 sobre el porcentaje de ratones capaces de realizar la prueba de caminar sobre barra.
La figura 52 representa la unión de hu-IPN002 a diversos péptidos de Tau.
La figura 53 representa la unión de diversos péptidos de Tau biotinilados a hu-IPN002.
Las figuras 54A y 54B son representaciones esquemáticas de ensayos para Tau no unido a IPN002 (Tau libre) (figura 54A); y Tau unido a IPN002 (Tau unido) (figura 54b ).
DEFINICIONES
Los términos “anticuerpos” e “inmunoglobulina” incluyen anticuerpos o inmunoglobulinas de cualquier isotipo, fragmentos de anticuerpos que retienen la unión específica al antígeno, incluidos, pero sin limitación, fragmentos Fab, Fv, scFv y Fd, anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados, anticuerpos de cadena sencilla, anticuerpos biespecíficos y proteínas de fusión que comprenden una parte de unión a antígeno de un anticuerpo y una proteína no anticuerpo. Los anticuerpos pueden marcarse de manera detectable, por ejemplo, con un radioisótopo, una enzima que genera un producto detectable, una proteína fluorescente, y similares. Los anticuerpos pueden conjugarse además con otros restos, tales como los miembros de pares de unión específicos, por ejemplo, biotina (miembro del par de unión específico biotinaavidina) y similares. Los anticuerpos también pueden unirse a un soporte sólido, que incluye, de modo no taxativo, placas o microesferas de poliestireno, y similares. El término también comprende los fragmentos Fab', Fv, F(ab')2, y otros fragmentos de anticuerpo que retienen la unión específica al antígeno y anticuerpos monoclonales. Un anticuerpo puede ser monovalente o bivalente.
La expresión “inmunoglobulina humanizada”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a una inmunoglobulina que comprende partes de inmunoglobulinas de orígenes diferentes, donde al menos una parte comprende secuencias de aminoácidos de origen humano. Por ejemplo, el anticuerpo humanizado puede comprender partes obtenidas a partir de una inmunoglobulina de origen no humano con la especificidad necesaria, tal como un ratón, y a partir de secuencias de inmunoglobulina de origen natural (por ejemplo, inmunoglobulina quimérica), unidas entre sí químicamente mediante técnicas convencionales (por ejemplo, síntesis) o preparadas como un polipéptido contiguo mediante el uso de técnicas de modificación genética (por ejemplo, puede expresarse el ADN que codifica las partes de proteína del anticuerpo quimérico para producir una cadena de polipéptidos contiguos). Otro ejemplo de una inmunoglobulina humanizada es una inmunoglobulina que contiene una o más cadenas de inmunoglobulina que comprenden una CDR obtenida a partir de un anticuerpo de origen no humano y una región marco obtenida a partir de una cadena ligera y/o pesada de origen humano (por ejemplo, anticuerpos injertados con CDR con o sin cambios de marco). Los anticuerpos de cadena simple injertados con CDR o quiméricos también están comprendidos en la expresión inmunoglobulina humanizada. Véase, por ejemplo, Cabilly y col., patente estadounidense N° 4.816.567; Cabilly y col., Patente Europea No. 0.125.023 B1; Boss y col., patente estadounidense N° 4.816.397; Boss y col., Patente Europea No. 0.120.694 b 1; Neuberger, M. S. y col., WO 86/01533; Neuberger, M. S. y col., Patente Europea No. 0.194.276 b 1; Winter, patente estadounidense N° 5.225.539; Winter, patente europea no. 0.239.400 B1; Padlan, E. A. y col., Solicitud de Patente Europea No. 0.519.596 A1. Véase también, Lader y col., patente estadounidense N° 4.946.778; Huston patente estadounidense N° 5.476.786; y Bird, R. E. y col., Science, 242: 423-426 (1988)), con respecto a los anticuerpos de cadena sencilla.
Por ejemplo, las inmunoglobulinas humanizadas se pueden producir usando ácidos nucleicos sintéticos y/o recombinantes para preparar genes (por ejemplo, ADNc) que codifican la cadena humanizada deseada. Por ejemplo, las secuencias de ácido nucleico (por ejemplo, ADN) que codifican regiones variables humanizadas se pueden construir utilizando procedimientos de mutagénesis por PCR para alterar las secuencias de ADN que codifican una cadena humana o humanizada, tales como una plantilla de ADN de una región variable previamente humanizada (véase por ejemplo, Kamman, M., y col., Nucl. Acids Res., 17: 5404 (1989)); Sato, K., y col., Cancer Research, 53: 851-856 (1993); Daugherty, B. L. y col., Nucleic Acids Res., 19 (9): 2471-2476 (1991); y Lewis, A. P. y J. S. Crowe, Gene, 101: 297-302 (1991)). Usando estos u otros procedimientos adecuados, las variantes también se pueden producir fácilmente. Por ejemplo, las regiones variables clonadas pueden mutagenizarse, y las secuencias que codifican variantes con la especificidad deseada pueden seleccionarse (por ejemplo, de una biblioteca de fagos; véase, por ejemplo, Krebber y col., patente estadounidense N° 5.514.548; Hoogenboom y col., WO 93/06213, publicado el 1 de abril de 1993)).
Los “fragmentos de anticuerpo” comprenden una parte de un anticuerpo intacto, por ejemplo, la región variable o de unión al antígeno del anticuerpo intacto. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpos incluyen fragmentos Fab, Fab', F(ab')2 y Fv; diacuerpos; anticuerpos lineales (Zapata y col., Protein Eng. 8(10): 1057-1062 (1995)); moléculas de anticuerpos de cadena sencilla; y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpos. La digestión de papaína de los anticuerpos produce dos fragmentos de unión al antígeno idénticos, llamados fragmentos “Fab”, cada uno con un solo sitio de unión a antígeno, y un fragmento “Fc” residual, una designación que refleja la capacidad de cristalizarse rápidamente. El tratamiento con pepsina proporciona un fragmento F(ab')2 que tiene dos sitios de combinación de antígenos y aun así es capaz de reticular el antígeno.
“Fv” es el fragmento de anticuerpo mínimo que contiene un sitio de unión y reconocimiento del antígeno completo. Esta región consiste en un dímero de un dominio variable de cadena pesada y uno de cadena ligera en asociación fuerte, no covalente. En esta configuración, las CDR de cada dominio variable interactúan para definir un sitio de unión a antígeno en la superficie del dímero Vh-Vl. En conjunto, las seis CDR confieren al anticuerpo especificidad de unión al antígeno. Sin embargo, incluso un dominio variable simple (o la mitad de un Fv que comprende solo tres CDR específicas para un antígeno) tiene la capacidad de reconocer y unirse a un antígeno, aunque con una afinidad menor que todo el sitio de unión.
El fragmento “Fab” también contiene el dominio constante de cadena ligera y el primer dominio constante (CH1) de cadena pesada. Los fragmentos Fab difieren de los fragmentos Fab' por la adición de unos pocos residuos en el extremo carboxilo del domino de cadena pesada CH1 que incluye una o más cisteínas de la región bisagra del anticuerpo. Fab'-SH es la designación que se utiliza en la presente para el Fab' en que el o los residuos de cisteína de los dominios constantes portan un grupo tiol libre. Los fragmentos de anticuerpo F(ab')2 se produjeron originalmente como pares de fragmentos Fab' que tenían cisteínas bisagra entre ellos. También se conocen otros acoplamientos químicos de fragmentos de anticuerpos.
Las “cadenas ligeras” de anticuerpos (inmunoglobulinas) de cualquier especie de vertebrados pueden asignarse a uno de dos tipos claramente separados, denominados kappa y lambda, en función de las secuencias de aminoácidos de sus dominios constantes. En función de la secuencia de aminoácidos del dominio constante de sus cadenas pesadas, las inmunoglobulinas pueden asignarse a diferentes clases. Existen cinco clases principales de inmunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, y varias de estas se pueden dividir adicionalmente en subclases (isotipos), por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA e IgA2.
Los fragmentos de “anticuerpo Fv de cadena sencilla o “scFv” comprenden los dominios de anticuerpo Vh y Vl, donde estos dominios están presentes en una sola cadena polipeptídica. En algunas realizaciones, el polipéptido Fv comprende además un enlace polipeptídico entre los dominios Vh y Vl, que permite que el sFv forme la estructura deseada para la unión al antígeno. Para acceder a una revisión de sFv, véase Pluckthun en The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, Nueva York, págs. 269-315 (1994).
El término “diacuerpos” se refiere a pequeños fragmentos de anticuerpos con dos sitios de unión a antígeno, fragmentos que comprenden un dominio variable de cadena pesada (Vh) conectado a un dominio variable de cadena ligera (Vl) en la misma cadena polipeptídica (Vh-Vl) Al utilizar un enlazador que es muy corto como para permitir el apareamiento entre dos dominios en la misma cadena, los dominios se ven forzados a aparearse con los dominios complementarios de otra cadena y a crear dos sitios de unión a antígenos. Los diacuerpos se describen más completamente en, por ejemplo, los documentos EP 404,097; WO 93/11161; y Hollinger y col., (1993), Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 90:6444-6448. Tal como se usa en la presente, el término “afinidad” se refiere a la constante de equilibrio para la unión reversible de dos agentes (por ejemplo, un anticuerpo y un antígeno) y se expresa como la constante de disociación (Kd). La afinidad puede ser 1 vez mayor, al menos 2 veces mayor, al menos 3 veces mayor, al menos 4 veces mayor, al menos 5 veces mayor, al menos 6 veces mayor, al menos 7 veces mayor, al menos 8 veces mayor, al menos 9 veces mayor, al menos 10 veces mayor, al menos 20 veces mayor, al menos 30 veces mayor, al menos 40 veces mayor, al menos 50 veces mayor, al menos 60 veces mayor, al menos 70 veces mayor, al menos 80 veces mayor, al menos 90 veces mayor, al menos 100 veces mayor o al menos 1000 veces mayor, o más, que la afinidad de un anticuerpo con respecto a secuencias de aminoácidos no relacionadas. La afinidad de un anticuerpo con respecto a una proteína diana puede ser, por ejemplo, de alrededor de 100 nanomolar (nM) a alrededor de 0.1 nM, de alrededor de 100 nM a alrededor de 1 picomolar (pM), o de alrededor de 100 nM a alrededor de 1 femtomolar (fM) o más. Tal como se usa en la presente, el término “avidez” se refiere a la resistencia de un complejo de dos o más agentes a la disociación después de la dilución. Los términos “inmunorreactivo” y “se une preferentemente” se usan indistintamente en el presente documento con respecto a anticuerpos y/o fragmentos de unión a antígeno.
El término “unión” se refiere a una asociación directa entre dos moléculas, debido, por ejemplo, a interacciones covalentes, electrostáticas, hidrófobas, iónicas y/o de enlaces de hidrógeno, incluidas interacciones tales como puentes de sal y puentes de agua. Un anticuerpo anti-Tau de la presente se une específicamente a un epítopo dentro de un polipéptido Tau. La unión no específica se referiría a la unión con una afinidad de menos de aproximadamente 10'7 M, por ejemplo, unión con una afinidad de 10'6 M, 10'5 M, 10'4 M, etc.
Como se usa en el presente documento, el término “CDR” o “región determinante de la complementariedad” pretende significar los sitios de combinación de antígeno no contiguos que se encuentran dentro de la región variable de polipéptidos de cadena pesada y ligera. Las CDR han sido descritas por Kabat y col., J. Biol. Chem 252: 6609-6616 (1977); Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, “Sequences of proteins of immunological interest” (1991); por Chothia et al., J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987); y MacCallum et al., J. Mol. Biol. 262:732-745 (1996), donde las definiciones incluyen superposición o subconjuntos de residuos de aminoácidos cuando se comparan entre sí. Sin embargo, la aplicación de cualquier definición en referencia a una CDR de un anticuerpo o anticuerpos injertados variantes de ellos se encuentra comprendida dentro del alcance de la expresión tal como se definió y se utilizó en el presente documento. Los residuos de aminoácidos que abarcan las CDR, como se define por cada una de las referencias citadas anteriormente, se exponen a continuación en la tabla 1 como una comparación.
Tabla 1: Definiciones
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Como se usa en el presente documento, el término “marco” cuando se usa en referencia a una región variable de anticuerpo pretende significar todos los residuos de aminoácidos fuera de las regiones CDR dentro de la región variable de un anticuerpo. Un marco de región variable es generalmente una secuencia de aminoácidos discontinua entre aproximadamente 100-120 aminoácidos de longitud, pero está destinada a hacer referencia solo a aquellos aminoácidos fuera de las CDR. Como se usa en el presente documento, la expresión “región marco” pretende significar cada dominio del marco que está separado por las CDR.
Un anticuerpo “aislado” es uno que ha sido identificado y separado y/o recuperado de un componente de su entorno natural. Los componentes contaminantes de su entorno natural son materiales que interferirían con los usos diagnósticos o terapéuticos para el anticuerpo, y pueden incluir enzimas, hormonas y otros solutos proteínicos o no proteínicos. En algunas realizaciones, el anticuerpo se purificará (1) hasta mayor que 90 %, mayor que 95 % o mayor que 98 % en peso del anticuerpo, tal como se determinó mediante el método de Lowry, por ejemplo, más que 99 % en peso, (2) hasta un grado suficiente para obtener al menos 15 residuos de secuencia de aminoácidos interna o N-terminal mediante el uso de un secuenciador de taza giratoria, o (3) hasta la homogeneidad mediante electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato sódico (SDS-PAGE) en condiciones de reducción o condiciones de no reducción mediante el uso de tinción con azul Coomassie o argéntica. El anticuerpo aislado incluye el anticuerpo in situ dentro de células recombinantes ya que al menos un componente del entorno natural del anticuerpo no estará presente. En algunos aspectos, el polipéptido aislado se preparará mediante al menos una etapa de purificación.
Los términos “polipéptido”, “péptido” y “proteína”, usados indistintamente en el presente documento, se refieren a una forma polimérica de aminoácidos de cualquier longitud, que puede incluir aminoácidos codificados genéticamente y no codificados genéticamente, aminoácidos modificados o derivados químicamente o bioquímicamente, y polipéptidos que tienen cadenas principales de péptidos modificados. El término incluye proteínas de fusión, que incluyen, pero sin limitación, proteínas de fusión con una secuencia de aminoácidos heteróloga, fusiones con secuencias líder heterólogas y homólogas, con o sin residuos de metionina en el extremo N; proteínas marcadas inmunológicamente; y similares. Como se usan en el presente documento, los términos “tratamiento”, “tratar” y similares se refieren al hecho de obtener un efecto farmacológico y/o fisiológico deseado. El efecto puede ser profiláctico en términos de prevenir total o parcialmente una enfermedad o un síntoma de esta y/o puede ser terapéutico en términos de una cura parcial o total para una enfermedad y/o un efecto adverso atribuible a la enfermedad. “Tratamiento” tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a una enfermedad en un mamífero, particularmente en un ser humano, e incluye: (a) prevenir que se produzca la enfermedad en un sujeto que puede estar predispuesto a la enfermedad pero que aún no se ha diagnosticado que la tiene; (b) inhibir la enfermedad, es decir, detener su desarrollo; y (c) aliviar la enfermedad, es decir, causar una regresión de la enfermedad.
Los términos “individuo”, “sujeto”, “huésped” y “paciente”, usados indistintamente en este documento, se refieren a un mamífero, que incluye, pero no se limita a, murinos (ratas, ratones), primates no humanos, humanos, caninos, felinos, ungulados (por ejemplo, equinos, bovinos, ovinos, porcinos, caprinos), etc.
Una “cantidad terapéuticamente efectiva” o “cantidad efectiva” se refiere a la cantidad de un anticuerpo anti-Tau que, cuando se administra a un mamífero u otro sujeto para tratar una enfermedad, es suficiente para efectuar dicho tratamiento para la enfermedad. La cantidad terapéuticamente efectiva variará dependiendo del compuesto, la enfermedad y su gravedad, y la edad, el peso, etc., del sujeto a tratar.
Una “muestra biológica” abarca una variedad de tipos de muestra obtenidos de un individuo y puede usarse en un ensayo de diagnóstico o monitorización. La definición abarca muestras de sangre y otras muestras líquidas de origen biológico, muestras de tejido sólido tales como una muestra de biopsia o cultivos de tejidos o células derivadas de los mismos y la progenie de las mismas. La definición también incluye muestras que han sido manipuladas de cualquier forma después de su obtención, como por ejemplo con tratamiento con reactivos, solubilización o enriquecimiento de ciertos componentes, tales como los polinucleótidos. La expresión “muestra biológica” abarca una muestra clínica y también incluye células en cultivo, sobrenadantes celulares, lisados celulares, suero, plasma, fluidos biológicos y muestras de tejido. La expresión “muestra biológica” incluye orina, saliva, líquido cefalorraquídeo, fracciones de sangre tales como plasma y suero, y similares.
Antes de describir la presente invención de forma adicional, se debe comprender que la invención no se limita a las realizaciones particulares descritas, ya que estas evidentemente pueden variar. También debe comprenderse que la terminología utilizada en el presente documento tiene el fin de describir solamente realizaciones particulares y no pretende ser taxativa, dado que el alcance de la presente invención estará limitado solamente por las reivindicaciones adjuntas. Cuando se proporciona un intervalo de valores, se entiende que cada valor intermedio, hasta la décima parte de la unidad del límite inferior, a menos que el contexto indique claramente lo contrario, entre el límite superior y el inferior de ese intervalo, y cualquier otro valor establecido o intermedio en ese intervalo establecido, queda comprendido dentro de la invención. Los límites superiores e inferiores de estos intervalos menores pueden estar incluidos de forma independiente en los intervalos menores también comprendidos dentro de la invención, sujeto a cualquier límite específicamente excluido en el intervalo indicado. Cuando el intervalo indicado incluye uno o ambos límites, los intervalos que excluyen cualquiera o ambos de los límites incluidos también se incluyen en la invención.
A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que comúnmente es entendido por un experto habitual en la materia a la que pertenece la presente invención. Aunque cualquier procedimiento y material similar o equivalente a los descritos en el presente documento también se puede usar en la práctica o prueba de la presente invención, los procedimientos y materiales preferidos se describen ahora. Todas las publicaciones mencionadas en el presente documento se incorporan en el presente documento mediante referencia para divulgar y describir los procedimientos y/o materiales con relación a los cuales se mencionan las publicaciones.
Cabe señalar que tal como se usa en el presente documento y en las reivindicaciones adjuntas, las formas en singular “un/o”, “una” y “el/la” incluyen referencias en plural, a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Así, por ejemplo, la referencia a “un anticuerpo anti-Tau humanizado” incluye una pluralidad de tales anticuerpos y la referencia a “la tauopatía” incluye referencia a una o más tauopatías y equivalentes de las mismas conocidas por los expertos en la materia, y así sucesivamente. Se observa además que las reivindicaciones pueden ser redactadas de forma que excluyan cualquier elemento opcional. Como tal, esto pretende servir como base antecedente para el uso de terminología exclusiva tal como “solamente”, “únicamente” y similares con relación a la enumeración de los elementos de las reivindicaciones o el uso de una limitación “negativa”.
DESCRIPCIÓN DETALLADA
La presente descripción proporciona procedimientos de tratamiento de una tauopatía, que implican administrar un anticuerpo anti-Tau. La presente descripción también proporciona anticuerpos anti-Tau, y formulaciones que los comprenden, para su uso en los procedimientos. La presente descripción proporciona además procedimientos de detección in vitro e in vivo que usan un anticuerpo anti-Tau descrito en el presente documento.
PROCEDIMIENTOS DE TRATAMIENTO DE UNA TAUOPATÍA
La presente descripción proporciona procedimientos de tratamiento de una tauopatía. Los procedimientos generalmente implican administrar una cantidad efectiva de un anticuerpo anti-Tau de la presente descripción a un individuo que lo necesite. En algunos casos, la administración de un anticuerpo anti-tau de la presente reduce el nivel de un polipéptido tau patológico en una célula, un tejido o un fluido de un individuo, y trata la tauopatía.
Por ejemplo, en algunas realizaciones, un procedimiento de la presente puede comprender administrar a un individuo que lo necesite una cantidad efectiva de un anticuerpo monoclonal humanizado aislado que se une específicamente a un epítopo dentro de los aminoácidos 15-24 de un polipéptido Tau. En algunas realizaciones, el anticuerpo está presente en una formulación farmacéutica con un excipiente farmacéuticamente aceptable, por ejemplo, un excipiente farmacéuticamente aceptable que es adecuado para administración a un ser humano.
Por ejemplo, en algunas realizaciones, un procedimiento de la presente puede comprender administrar a un individuo que lo necesite una cantidad efectiva de un anticuerpo aislado que comprende una región marco de cadena ligera humanizada; y una región marco de cadena pesada humanizada, donde el anticuerpo aislado compite por unirse a un epítopo en una región N-terminal de un polipéptido Tau con un anticuerpo que comprende: a) una región de cadena ligera que comprende: i) una Vl CDR1 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 7; (ii) una Vl CDR2 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 8; y (iii) una VlCDR3 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 9; y b) una región de cadena pesada que comprende: (i) una VhCDR1 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 10; (ii) una Vh CDR2 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 11; y (iii) una VhCDR3 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6 o SEQ ID NO: 12. En algunas realizaciones, el anticuerpo está presente en una formulación farmacéutica con un excipiente farmacéuticamente aceptable, por ejemplo, un excipiente farmacéuticamente aceptable que es adecuado para administración a un ser humano.
Por ejemplo, en algunas realizaciones, un procedimiento de la presente puede comprender administrar a un individuo que lo necesite una cantidad efectiva de un anticuerpo aislado, donde el anticuerpo es un Fv, scFv, Fab, F(ab')2 o Fab', y donde el anticuerpo compite por unirse a un epítopo en una región N-terminal de un polipéptido Tau con un anticuerpo que comprende: a) una región de cadena ligera que comprende: i) una VLCDR1 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 7; (ii) una VlCDR2 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 8; y (iii) una VLCDR3 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 9; y b) una región de cadena pesada que comprende: (i) una VhCDR1 que comprende una secuencia de aminoácidos de SeQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 10; (ii) una VhCDR2 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 11; y (iii) una VhCDR3 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6 o SEQ ID NO: 12. En algunas realizaciones, el anticuerpo está presente en una formulación farmacéutica con un excipiente farmacéuticamente aceptable, por ejemplo, un excipiente farmacéuticamente aceptable que es adecuado para administración a un ser humano.
Por ejemplo, en algunas realizaciones, un procedimiento de la presente puede comprender administrar a un individuo que lo necesite una cantidad efectiva de un anticuerpo aislado, donde el anticuerpo aislado comprende una región constante de cadena ligera humana y una región constante de cadena pesada humana, y donde el anticuerpo aislado compite por unirse a un epítopo en una región N-terminal de un polipéptido Tau con un anticuerpo que comprende: a) una región de cadena ligera que comprende: i) una VlCDR1 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 7; (ii) una VlCDR2 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 8; y (iii) una VlCDR3 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 9; y b) una región de cadena pesada que comprende: (i) una VHCDR1 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 10; (ii) una VhCDR2 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 11; y (iii) una VhCDR3 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6 o SEQ ID NO: 12. En algunas realizaciones, el anticuerpo está presente en una formulación farmacéutica con un excipiente farmacéuticamente aceptable, por ejemplo, un excipiente farmacéuticamente aceptable que es adecuado para administración a un ser humano.
Un anticuerpo anti-Tau de la presente descripción se une a tau extracelular. “Tau extracelular” (“eTau”), como se usa en el presente documento, abarca cualquier polipéptido Tau que pueda detectarse en el líquido cefalorraquídeo (CSF) o en el líquido intersticial (ISF). En algunas realizaciones, eTau es un polipéptido que tiene una longitud de 175 aminoácidos y que comprende los aminoácidos 2-176 de tau de longitud completa; por ejemplo, en algunas realizaciones, eTau es un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en s Eq ID NO: 45. En algunas realizaciones, eTau es un polipéptido que tiene una longitud de 171 aminoácidos y que comprende los aminoácidos 2-172 (SEQ ID NO: 44) de tau de longitud completa; por ejemplo, en algunas realizaciones, eTau es un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 44. En algunas realizaciones, eTau es un polipéptido eTau-2 que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 46. En algunas realizaciones, eTau es un polipéptido eTau-3 que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 47. En algunas realizaciones, eTau es un polipéptido eTau-4 que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 48.
En algunos casos, un polipéptido eTau tiene una longitud de aproximadamente 50 aminoácidos a aproximadamente 175 aminoácidos, por ejemplo, de aproximadamente 50 aminoácidos (aa) a aproximadamente 75 aa, de aproximadamente 75 aa a aproximadamente 100 aa, de aproximadamente 100 aa a aproximadamente 125 aa, de aproximadamente 125 aa a aproximadamente 150 aa, o de aproximadamente 150 aa a aproximadamente 175 aa; y puede comprender de 50 a aproximadamente 75, de aproximadamente 75 a aproximadamente 100, de aproximadamente 100 a aproximadamente 125, de aproximadamente 125 a aproximadamente 150, o de aproximadamente 150 a aproximadamente 175, aminoácidos contiguos de los aminoácidos 2-176 de tau de longitud completa. Los ejemplos de polipéptidos eTau se representan en la figura 20.
Como se describe con más detalle a continuación, un anticuerpo anti-Tau de la presente descripción se une específicamente a Tau, donde el epítopo al que se une el anticuerpo es un epítopo lineal y comprende residuos de aminoácidos dentro de una parte amino-terminal (N-terminal) de Tau, por ejemplo, dentro de los aminoácidos 1-25 de Tau, dentro de los aminoácidos 1-18 de Tau, dentro de los aminoácidos 9 a 18 de Tau, dentro de los aminoácidos 13-24 de Tau, dentro de los aminoácidos 15-44 de Tau, o dentro de aminoácidos 15-24 de Tau. Las secuencias de aminoácidos de las isoformas de Tau humanas se representan en las figuras 6A-D. Los aminoácidos 1-18 de Tau son: MAEPRQEFEVMEDHAGTY; SEQ ID NO: 53). Véase, por ejemplo, García-Sierra y col. (2003) J. Alzheimer's Disease 5:65; y Horowitz y col. (2004) J. Neurosci. 24:7895. Los aminoácidos 15-24 de Tau son: AGTYGLGDRK (SEQ ID NO: 51).
En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-Tau de la presente descripción se une específicamente a Tau, donde el epítopo al que se une el anticuerpo es un epítopo lineal, y comprende residuos de aminoácidos dentro de los aminoácidos 1-25 de Tau, dentro de los aminoácidos 13-24 de Tau, o dentro de los aminoácidos 15-24 de Tau. En algunos casos, un anticuerpo anti-Tau humanizado de la presente descripción se une específicamente a un epítopo lineal que comprende residuos de aminoácidos dentro de los aminoácidos 1-25 de Tau, dentro de los aminoácidos 13-24 de Tau, o dentro de los aminoácidos 15-24 de Tau, donde el epítopo no incluye un aminoácido fosforilado. En algunos casos, un anticuerpo anti-Tau humanizado de la presente descripción se une específicamente a un epítopo lineal que comprende residuos de aminoácidos dentro de los aminoácidos 1-25 de Tau, dentro de los aminoácidos 13-24 de Tau, o dentro de los aminoácidos 15-24 de Tau, donde el epítopo incluye un aminoácido fosforilado. En algunos casos, un anticuerpo anti-Tau humanizado de la presente descripción se une específicamente a un epítopo lineal que comprende residuos de aminoácidos dentro de los aminoácidos 1-25 de Tau, dentro de los aminoácidos 13-24 de Tau, o dentro de los aminoácidos 15-24 de Tau, donde el epítopo no incluye un aminoácido nitrado. En algunos casos, un anticuerpo anti-Tau humanizado de la presente descripción se une específicamente a un epítopo lineal que comprende residuos de aminoácidos dentro de los aminoácidos 1-25 de Tau, dentro de los aminoácidos 13-24 de Tau, o dentro de los aminoácidos 15-24 de Tau, donde el epítopo incluye un aminoácido nitrado. En algunos casos, un anticuerpo anti-Tau humanizado de la presente descripción se une específicamente a un epítopo lineal que comprende residuos de aminoácidos dentro de los aminoácidos 1-25 de Tau, dentro de los aminoácidos 13-24 de Tau, o dentro de los aminoácidos 15-24 de Tau, donde el epítopo incluye un aminoácido nitrado y no incluye un aminoácido fosforilado. En algunos casos, un anticuerpo anti-Tau humanizado de la presente descripción se une específicamente a un epítopo lineal que comprende residuos de aminoácidos dentro de los aminoácidos 1-25 de Tau, dentro de los aminoácidos 13-24 de Tau, o dentro de los aminoácidos 15-24 de Tau, donde el epítopo incluye un aminoácido fosforilado y no incluye un aminoácido nitrado. En algunos casos, un anticuerpo anti-Tau humanizado de la presente descripción se une específicamente a un epítopo lineal que comprende residuos de aminoácidos dentro de los aminoácidos 1-25 de Tau, dentro de los aminoácidos 13-24 de Tau, o dentro de los aminoácidos 15-24 de Tau, donde el epítopo incluye un aminoácido nitrado y un aminoácido fosforilado.
Por ejemplo, en algunas realizaciones, un anticuerpo anti-Tau de la presente descripción se une específicamente a un epítopo lineal que comprende residuos de aminoácidos dentro de los aminoácidos AGTYGLGDRK (SEQ ID NO: 51) de Tau. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-Tau humanizado de la presente descripción se une específicamente a un epítopo lineal que comprende residuos de aminoácidos dentro de los aminoácidos AGTYGLGDRK (SEQ ID NO: 51) de Tau.
En algunos casos, un anticuerpo anti-Tau humanizado de la presente descripción se une específicamente a un epítopo lineal que comprende residuos de aminoácidos dentro de los aminoácidos AGTYGLGDRK (SEQ ID NO: 51) de Tau, donde el epítopo no incluye un aminoácido fosforilado. En algunos casos, un anticuerpo anti-Tau humanizado de la presente descripción se une específicamente a un epítopo lineal que comprende residuos de aminoácidos dentro de los aminoácidos AGTYGLGDRK (SEQ ID NO: 51) de Tau, donde el epítopo incluye un aminoácido fosforilado. En algunos casos, un anticuerpo anti-Tau humanizado de la presente descripción se une específicamente a un epítopo lineal que comprende residuos de aminoácidos dentro de los aminoácidos AGTYGLGDRK (SEQ ID NO: 51) de Tau, donde el epítopo no incluye un aminoácido nitrado. En algunos casos, un anticuerpo anti-Tau humanizado de la presente descripción se une específicamente a un epítopo lineal que comprende residuos de aminoácidos dentro de los aminoácidos AGTYGLGDRK (SEQ ID NO: 51) de Tau, donde el epítopo incluye un aminoácido nitrado. En algunos casos, un anticuerpo anti-Tau humanizado de la presente descripción se une específicamente a un epítopo lineal que comprende residuos de aminoácidos dentro de los aminoácidos AGTYGLGDRK (SEQ ID NO: 51) de Tau, donde el epítopo incluye un aminoácido nitrado, y no incluye un aminoácido fosforilado. En algunos casos, un anticuerpo anti-Tau humanizado de la presente descripción se une específicamente a un epítopo lineal que comprende residuos de aminoácidos dentro de los aminoácidos AGTYGLGDRK (SEQ ID NO: 51) de Tau, donde el epítopo incluye un aminoácido fosforilado y no incluye un aminoácido nitrado. En algunos casos, un anticuerpo anti-Tau humanizado de la presente descripción se une específicamente a un epítopo lineal que comprende residuos de aminoácidos dentro de los aminoácidos AGTYGLGDRK (SEQ ID NO: 51) de Tau, donde el epítopo incluye un aminoácido nitrado y un aminoácido fosforilado.
En algunos casos, un procedimiento de la presente descripción para tratar una tauopatía comprende administrar a un individuo que lo necesite una composición farmacéutica que comprende: a) un anticuerpo anti-Tau que comprende: i) una, dos o tres regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de cadena ligera de un anticuerpo representado en la figura 1; y una, dos o tres CDR de cadena pesada de un anticuerpo representado en la figura 1; o ii) una, dos o tres CDR de cadena ligera de un anticuerpo representado en la figura 2; y una, dos o tres CDR de cadena pesada de un anticuerpo representado en la figura 2; y b) un excipiente farmacéuticamente aceptable adecuado para administración a un ser humano.
En algunos casos, un procedimiento de la presente descripción para tratar una tauopatía comprende administrar a un individuo que lo necesite una composición farmacéutica que comprende: a) un anticuerpo que se une específicamente a un epítopo dentro de un polipéptido Tau humano, donde el anticuerpo compite por unirse al epítopo con un anticuerpo que comprende: i) regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de cadena ligera de un anticuerpo representado en la figura 1B; y CDR de cadena pesada de un anticuerpo representado en la figura 1A; o ii) CDR de cadena ligera de un anticuerpo representado en la figura 2B; y CDR de cadena pesada de un anticuerpo representado en la figura 2A; y b) un excipiente farmacéuticamente aceptable adecuado para administración a un ser humano.
En algunos casos, un procedimiento de la presente descripción para tratar una tauopatía comprende administrar a un individuo que lo necesite una composición farmacéutica que comprende: a) un anticuerpo que compite con IPN002 humanizado (hu-IPN002) por unirse a un epítopo en Tau que es reconocido por hu-IPN002 (por ejemplo, un epítopo lineal dentro de una parte N-terminal de Tau, por ejemplo, dentro de los aminoácidos 1-25 de Tau, dentro de los aminoácidos 1-18 de Tau, dentro de los aminoácidos 9 a 18 de Tau, dentro de aminoácidos 15-44 de Tau, dentro de los aminoácidos 13-24 de Tau, o dentro de los aminoácidos 15-24 de Tau); y b) un excipiente farmacéuticamente aceptable adecuado para administración a un ser humano.
IPN001 (también denominado en el presente documento “IPN1” o “ IPN-1”) e IPN002 (también denominado en el presente documento “IPN2” o “ IPN-2”) se unen específicamente a Tau. El epítopo al que se une IPN001 es un epítopo lineal y comprende residuos de aminoácidos dentro de una parte amino-terminal (N-terminal) de Tau, por ejemplo, dentro de los aminoácidos 1-25 de Tau.
En algunos aspectos, un anticuerpo anti-Tau de la presente descripción que es adecuado para su uso en un procedimiento de tratamiento de una tauopatía comprende: a) una región variable de cadena ligera que comprende: i) una, dos o tres Vl CDR de un anticuerpo IPN001; y ii) una región marco de cadena ligera humanizada; y b) una región variable de cadena pesada que comprende: i) una, dos o tres VhCDR de un anticuerpo IPN001; y ii) una región marco de cadena pesada humanizada; donde las Vh y Vl CDR son las definidas por Kabat (véase, por ejemplo, la tabla 1, más arriba; y Kabat y col., U.S. Dept. of Health and Human Services, “Sequences of proteins of immunological interest” (1991)).
En algunos aspectos, un anticuerpo anti-Tau de la presente descripción que es adecuado para su uso en un procedimiento de tratamiento de una tauopatía comprende: a) una región de cadena ligera que comprende: i) una, dos o tres Vl CDR de un anticuerpo IPN001; y ii) una región marco de cadena ligera humanizada; y b) una región de cadena pesada que comprende: i) una, dos o tres V h CDR de un anticuerpo IPN001; y ii) una región marco de cadena pesada humanizada; donde las Vh y Vl CDR son las definidas por Chothia (véase, por ejemplo, la tabla 1, más arriba; y Chothia y col., J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987)).
En otros aspectos, un anticuerpo anti-Tau de la presente descripción que es adecuado para su uso en un procedimiento de tratamiento de una tauopatía comprende: a) una región de cadena ligera que comprende: i) una, dos o tres VL CDR de un anticuerpo IPN002; y ii) una región marco de cadena ligera humanizada; y b) una región de cadena pesada que comprende: i) una, dos o tres Vh CDR de un anticuerpo IPN002; y ii) una región marco de cadena pesada humanizada; donde las Vh y Vl CDR son las definidas por Kabat (véase, por ejemplo, la tabla 1, más arriba; y Kabat y col., U.S. Dept. of Health and Human Services, “Sequences of proteins of immunological interest” (1991)).
En otros aspectos, un anticuerpo anti-Tau de la presente descripción (por ejemplo, un anticuerpo de la presente que se une específicamente a un epítopo en un polipéptido Tau, donde el epítopo está dentro de una parte amino-terminal (N-terminal) de Tau, por ejemplo, dentro de los aminoácidos 1-25 de Tau, dentro de los aminoácidos 1-18 de Tau, dentro de los aminoácidos 9 a 18 de Tau, dentro de los aminoácidos 15-44 de Tau, dentro de los aminoácidos 13-24 de Tau, o dentro de los aminoácidos 15- 24 de Tau) comprende: a) una región de cadena ligera que comprende: i) una, dos o tres Vl CDR de un anticuerpo IPN002; y ii) una región marco de cadena ligera humanizada; y b) una región de cadena pesada que comprende: i) una, dos o tres Vh CDR de un anticuerpo IPN002; y ii) una región marco de cadena pesada humanizada; donde las Vh y Vl CDR son las definidas por Chothia (véase, por ejemplo, la tabla 1, más arriba; y Chothia y col., J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987)).
En algunos casos, un procedimiento de la presente descripción para tratar una tauopatía comprende administrar a un individuo que lo necesite una cantidad efectiva de una composición farmacéutica que comprende: a) un anticuerpo que se une específicamente a un epítopo lineal dentro de una parte amino-terminal (N-terminal) de Tau, por ejemplo, dentro de los aminoácidos 1-25 de Tau, dentro de los aminoácidos 1-18 de Tau, dentro de los aminoácidos 9 a 18 de Tau (donde los aminoácidos 1-18 de Tau son: MAEPRQEFEVMEDHAGTY; SEQ ID NO: 53), dentro de los aminoácidos 15-44 de Tau, dentro de los aminoácidos 13-24 de Tau, o dentro de los aminoácidos 15-24 de Tau (donde los aminoácidos 15-24 de Tau son: AGTYGLGDRK (SEQ ID NO: 51)), donde el anticuerpo comprende: (i) una Vl CDR1 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 7; (ii) una VlCDR2 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 8; (iii) una VLCDR3 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 9; (iv) una Vh CDR1 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 10; (v) una VhCDR2 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 11; y (vi) una VhCDR3 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6 o SEQ ID NO: 12; y b) un excipiente farmacéuticamente aceptable adecuado para administración a un ser humano.
Las secuencias de aminoácidos de Vh y Vl de IPN001 se representan en las figuras 1A y 1B. Las CDR (como las define Kabat) están en negrita y subrayadas. Las secuencias de aminoácidos de Vh y Vl de IPN002 se representan en las figuras 2A y 2B. Las CDR (como las define Kabat) están en negrita y subrayadas.
Las SEQ ID NO: 1-12 son las siguientes:
RSSQTILHSNGNTYLE (SEQ ID NO: 1);
KVSKRFS (SEQ ID NO: 2);
FQGSLVPWA (SEQ ID NO: 3);
SYGMS (SEQ ID NO: 4);
TISSSGSRTYFPDSVKG (SEQ ID NO: 5);
TWDGAMDY (SEQ ID NO: 6);
KSSQSIVHSNGNTYLE (SEQ ID NO: 7);
KVSNRFS (SEQ ID NO: 8);
FQGSLVPWA (SEQ ID NO: 9);
KYGMS (SEQ ID NO: 10);
TISSSGSRTYYPDSVKG (SEQ ID NO: 11);
SWDGAMDY (SEQ ID NO: 12).
En algunos casos, el anticuerpo comprende una región marco de cadena ligera humanizada y/o una región marco de cadena pesada humanizada. Los anticuerpos anti-Tau humanizados se describen en detalle a continuación.
Una tauopatía es un trastorno caracterizado por un nivel anormal de tau en una célula, un tejido o un fluido en un individuo. En algunos casos, una tauopatía se caracteriza por la presencia en una célula, un tejido o un fluido de niveles elevados (más altos de lo normal) de tau o polipéptidos tau y/o formas patológicas de tau. Por ejemplo, en algunos casos, una tauopatía se caracteriza por la presencia en el tejido cerebral y/o líquido cefalorraquídeo de niveles elevados de tau o polipéptidos tau y/o formas patológicas de tau. Un nivel de tau “más alto de lo normal” en una célula, un tejido o un fluido indica que el nivel de tau en el tejido o fluido es más alto que un nivel de control normal, por ejemplo, más alto que un nivel de control normal para un individuo o población de individuos del mismo grupo de edad. Véase, por ejemplo, Blomberg et al. (2001) “Cerebrospinal fluid tau levels increase with age in healthy individuals” Dement. Geriatr. Cogn. Disord. 12:127. En algunos casos, un individuo que tiene una tauopatía exhibe uno o más síntomas adicionales de una tauopatía (por ejemplo, deterioro cognitivo).
En otros casos, una tauopatía se caracteriza por la presencia en una célula, un tejido o un fluido de niveles de tau inferiores a lo normal. Un nivel de tau “inferior a lo normal” en un tejido o fluido indica que el nivel de tau en la célula, tejido o fluido es inferior a un nivel de control normal, por ejemplo, inferior a un nivel de control normal para un individuo o población de individuos del mismo grupo de edad.
La enfermedad de Alzheimer y ciertas formas de demencia frontotemporal (enfermedad de Pick, demencia frontotemporal esporádica y demencia frontotemporal con parkinsonismo asociada al cromosoma 17) son las formas más comunes de tauopatía. La presente descripción proporciona un procedimiento de tratamiento como se describió anteriormente, donde la tauopatía es Alzheimer, enfermedad de Pick, demencia frontotemporal esporádica y demencia frontotemporal con parkinsonismo asociada al cromosoma 17. Otras tauopatías incluyen, pero sin limitación, parálisis supranuclear progresiva (PSP), degeneración corticobasal (CBD) y panencefalitis esclerosante subaguda.
Una tauopatía neurodegenerativa incluye enfermedad de Alzheimer, esclerosis lateral amiotrófica/complejo parkinsonismo-demencia, demencia argirofílica granulosa, angiopatía amiloide de tipo británica, angiopatía amiloide cerebral, degeneración corticobasal, enfermedad de Creutzfeldt-Jakob, demencia pugilística, ovillos neurofibrilares difusos con calcificación, síndrome de Down, demencia frontotemporal (FTD), demencia frontotemporal con parkinsonismo relacionado con el cromosoma 17, degeneración lobular frontotemporal, enfermedad de Gerstmann-Straussler-Scheinker, enfermedad de Hallervorden-Spatz, miositis por cuerpos de inclusión, atrofia multisistémica, distrofia miotónica, enfermedad de Niemann-Pick tipo C, enfermedad de motoneuronas no de Guam con ovillos neurofibrilares, enfermedad de Pick, parkinsonismo postencefalítico, angiopatía amiloide cerebral por proteína priónica, gliosis subcortical progresiva, parálisis supranuclear progresiva, panencefalitis esclerosante subaguda, demencia solo con ovillos, demencia por infarto múltiple, ictus isquémico, encefalopatía traumática crónica (CTE), lesión cerebral traumática (TBI) e ictus.
La presente descripción también proporciona procedimientos para tratar una sinucleinopatía, por ejemplo, enfermedad de Parkinson (EP); demencia con cuerpos de Lewy (DLB); atrofia multisistémica (MSA); etc. Por ejemplo, la EP con demencia (PDD) puede tratarse con un procedimiento de la presente.
En una realización, un anticuerpo anti-tau de la presente descripción previene o retrasa la aparición de al menos un síntoma de una tauopatía neurodegenerativa en un sujeto. En una realización, un anticuerpo anti-tau de la presente reduce o elimina al menos un síntoma de una tauopatía neurodegenerativa en un sujeto. El síntoma puede ser la formación de uno o más depósitos patológicos de tau; Tau y/o fragmentos de Tau solubles extracelulares; depósitos de tau hiperfosforilados; depósitos de tau insolubles; ovillos neurofibrilares; fibras neurofibrilares; agregados de fosfo-tau pre­ ovillos; ovillos neurofibrilares intraneuronales; hiperactividad neuronal; y ovillos neurofibrilares extraneuronales en el cerebro o la médula espinal de un sujeto. El síntoma puede ser un síntoma neurológico, por ejemplo, deterioro de la función cognitiva, deterioro de la memoria, pérdida de la función motora, etc. En algunos casos, un anticuerpo anti-tau de la presente descripción puede mejorar la función cognitiva. En algunos casos, un anticuerpo anti-tau de la presente descripción puede reducir la tasa de disminución de la función cognitiva. En algunos casos, un anticuerpo anti-tau de la presente descripción puede mejorar la función motora. En algunos casos, un anticuerpo anti-tau de la presente descripción puede reducir la tasa de disminución de la función motora.
El síntoma también puede ser el nivel de un polipéptido Tau en el CSF del individuo. Por ejemplo, en algunas realizaciones, un anticuerpo anti-tau de la presente, cuando se administra en una o más dosis como monoterapia o en terapia de combinación a un individuo que tiene una tauopatía, reduce el nivel de un polipéptido Tau en el CSF del individuo al menos en aproximadamente un 10%, al menos aproximadamente un 15%, al menos aproximadamente un 20%, al menos aproximadamente un 25 %, al menos aproximadamente un 30 %, al menos aproximadamente un 40 %, al menos aproximadamente un 50 % o más del 50 %, en comparación con el nivel del polipéptido Tau en el CSF del individuo antes del tratamiento con el anticuerpo anti-tau.
La administración de un anticuerpo anti-tau de la presente a un individuo puede dar como resultado uno o más de: reducción de la cantidad de Tau extracelular libre en el tejido cerebral; reducción de la diseminación de célula a célula (por ejemplo, diseminación de neurona a neurona) de Tau (por ejemplo, fragmentos de Tau); reducción de la cantidad de agregados de tau (por ejemplo, agregados de tau intracelular (por ejemplo, intraneuronal)); reducción de la cantidad de ovillos neurofibrilares en el tejido cerebral; reducción del nivel de activación microglial y/o activación de astrocitos; reducción de la cantidad de tau fosforilada; reducción de la cantidad de tau hiperfosforilada; reducción de Tau total (por ejemplo, Tau intracelular total; y/o Tau extracelular total); reducción de Tau libre (por ejemplo, Tau que no está unido a un anticuerpo anti-Tau de la presente); reducción de la hiperactividad neuronal; y reducción de la cantidad de fragmentos Tau N-terminales. “Tau total” puede incluir la suma total de Tau de longitud completa de cualquier isoforma; y cualquier fragmento de Tau N-terminal que esté presente y que muestre el epítopo reconocido por un anticuerpo anti-Tau de la presente. Las secuencias de aminoácidos de Tau de longitud completa humana se presentan en las figuras 6A-D. La reducción en Tau fosforilada se puede determinar usando cualquier procedimiento conocido, por ejemplo, un procedimiento inmunológico que usa un anticuerpo anti-fosfo-Tau.
La administración de un anticuerpo anti-tau de la presente a un individuo puede dar como resultado un cambio en uno o más de: a) la cantidad de tau extracelular libre en el tejido cerebral; b) la cantidad de tau extracelular libre en el líquido intersticial (ISF); c) la cantidad de tau extracelular libre en el líquido cefalorraquídeo (CSF); d) la diseminación de neurona a neurona de tau; e) la cantidad de agregados de tau intraneuronales; f) el grado de activación microglial y/o de astrocitos; g) la cantidad de tau fosforilada o hiperfosforilada; h) la cantidad de tau total o tau libre en el ISF o el CSF; i) la cantidad de fragmentos de tau N-terminales intracelulares; j) hiperactividad neuronal; k) la cantidad de Ap40 y/o Ap42 en el CSF; l) la carga de la placa Ap; m) secreción de Ap40 y/o Ap42 de una neurona; n) actividad promotora de la proteína precursora de amiloide (APP); o) nivel de ARNm y/o proteína de APP; p) la actividad de beta-secretasa y/o gamma secretasa; q) el estado de activación de una vía de señalización inducida por Ap; r) la cantidad de tau total o tau libre intracelular; s) la cantidad de tau unida a anticuerpo anti-tau en el ISF o el CSF; y t) la cantidad de tau unida a anticuerpo anti-tau intracelular.
La administración de un anticuerpo anti-tau de la presente a un individuo puede, en algunos casos, mejorar la función cognitiva en el individuo, o al menos reducir la tasa de disminución de la función cognitiva en el individuo.
En algunos casos, la administración de un anticuerpo anti-tau de la presente a un individuo reduce la cantidad de polipéptido tau extracelular libre (por ejemplo, la cantidad de polipéptido tau extracelular libre en un tejido cerebral) en al menos aproximadamente un 10 %, al menos aproximadamente un 20 %, al menos aproximadamente un 25 %, al menos aproximadamente un 50 %, o más del 50 %, en comparación con la cantidad de polipéptido tau extracelular libre en el individuo antes de la administración con el anticuerpo anti-tau.
En algunos casos, la administración de un anticuerpo anti-tau de la presente a un individuo reduce la diseminación de célula a célula (por ejemplo, neurona a neurona) de un polipéptido tau (por ejemplo, un polipéptido tau patológico) en al menos aproximadamente un 10 %, al menos aproximadamente un 20 %, al menos aproximadamente un 25 %, al menos aproximadamente un 50%, o más del 50%, en comparación con la diseminación de célula a célula antes de la administración con un anticuerpo anti-tau de la presente.
En algunos casos, la administración de un anticuerpo anti-tau de la presente a un individuo reduce la cantidad de agregados de tau (por ejemplo, agregados de tau intracelulares (por ejemplo, intraneuronales)) en al menos aproximadamente un 10 %, al menos aproximadamente un 20 %, al menos aproximadamente un 25 %, al menos aproximadamente un 50 %, o más del 50 %, en comparación con la cantidad de agregados de tau antes de la administración con el anticuerpo anti-tau.
En algunos casos, la administración de un anticuerpo anti-tau de la presente a un individuo reduce la neurotoxicidad en un individuo; y/o reduce la neuroinflamación en un individuo; y/o reduce la activación de astrocitos y microglia; y/o reduce la inducción de efectos electrofisiológicos patológicos; y/o reduce la cantidad de tau en exosomas.
En algunos casos, la administración de un anticuerpo anti-tau de la presente a un individuo reduce la hiperactividad neuronal en al menos aproximadamente un 10 %, al menos aproximadamente un 20 %, al menos aproximadamente un 25 %, al menos aproximadamente un 50 % o más del 50 %, en comparación con el nivel de grado de hiperactividad neuronal antes de la administración con el anticuerpo anti-tau. En algunos casos, la administración de un anticuerpo antitau de la presente a un individuo reduce la hiperactividad neuronal en al menos aproximadamente un 10%, al menos aproximadamente un 20 %, al menos aproximadamente un 25 %, al menos aproximadamente un 50 %, o más del 50 %, como se determina por el registro de pinzamiento zonal de membrana celular completa de una neurona por ejemplo, el registro de pinzamiento zonal de membrana celular completa de una neurona cortical derivada de células madre pluripotentes inducidas (iPSC-CN) o de un cultivo de neuronas corticales humanas (CHC).
La administración de las composiciones adecuadas se puede efectuar de diferentes maneras, por ejemplo, por administración intravenosa, intraperitoneal, subcutánea, intracraneal, intratecal, intraarterial (por ejemplo, a través de la arteria carótida), intramuscular, intranasal, tópica o intradérmica o administración espinal o cerebral. Las formulaciones en aerosol tales como formulaciones nasales en spray incluyen soluciones acuosas purificadas u otras del agente activo con agentes conservantes y agentes isotónicos. Dichas formulaciones se ajustan a un pH y estado isotónico compatible con las membranas mucosas nasales.
En algunos casos, un anticuerpo anti-tau de la presente se modifica o formula de tal manera que proporciona la capacidad del anticuerpo para cruzar la barrera hematoencefálica. Tal anticuerpo o composición de anticuerpo se puede administrar a un individuo que tiene una tauopatía por diversas vías de administración enteral y parenteral, incluyendo oral, intravenosa, etc.
Las preparaciones para administración parenteral incluyen soluciones, suspensiones y emulsiones acuosas o no acuosas estériles. El propilenglicol, polietilenglicol, aceites vegetales tales como el aceite de oliva y ésteres orgánicos inyectables, tales como oleato de etilo son ejemplos de disolventes no acuosos. Los vehículos acuosos incluyen agua y soluciones, emulsiones o suspensiones alcohólicas/acuosas, entre ellas, solución salina y medios tamponados. Los vehículos parenterales incluyen solución de cloruro de sodio, dextrosa de Ringer, cloruro de sodio y dextrosa, Ringer lactado o aceites fijos. Los vehículos intravenosos incluyen regeneradores de fluidos y nutrientes, regeneradores de electrolitos (tales como los basados en dextrosa de Ringer), y similares. Los conservantes y otros aditivos también pueden estar presentes tales como, por ejemplo, antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes y gases inertes y similares. Además, la composición farmacéutica de la presente descripción puede comprender agentes adicionales tales como dopamina o fármacos sicofarmacológicas, dependiendo del uso pretendido de la composición farmacéutica.
El régimen de dosificación será determinado por el médico tratante u otro personal médico, basándose en diversos factores clínicos. Tal como se conoce en la técnica médica, las dosificaciones para cualquier paciente dependen de diversos factores, incluida la talla del paciente, el área de superficie del cuerpo, la edad, el compuesto particular a administrar, el sexo, el momento y la vía de administración, la salud general y otros fármacos que se administren simultáneamente. Una dosis de un anticuerpo anti-tau de la presente puede estar, por ejemplo, en el intervalo de 0,001 |jg a 1000 |jg; sin embargo, se prevén dosis inferiores o superiores a este intervalo ejemplar, especialmente teniendo en cuenta los factores antes mencionados. Generalmente, la dosis puede variar, por ejemplo, de aproximadamente 0,0001 a 100 mg/kg, o de aproximadamente de 0,01 a 5 mg/kg (por ejemplo, 0,02 mg/kg, 0,25 mg/kg, 0,5 mg/kg, 0,75 mg/kg, 1 mg/kg, 2 mg/kg, etc.), del peso corporal del huésped. Por ejemplo, las dosis pueden ser 1 mg/kg de peso corporal o 10 mg/kg de peso corporal o dentro del intervalo de 1-10 mg/kg, o al menos 1 mg/kg. Las dosis intermedias en los intervalos anteriores también pretenden estar dentro del alcance de la invención. Tales dosis se pueden administrar a los sujetos diariamente, en días alternos, semanalmente o según cualquier otro cronograma determinado por análisis empírico. Cualquier tratamiento ejemplar comprende la administración en múltiples dosis durante un período prolongado, por ejemplo, de al menos seis meses. Los regímenes de tratamiento ejemplares adicionales comprenden la administración una vez cada dos semanas o una vez al mes o una vez cada 3 a 6 meses. Los cronogramas de dosificación ejemplares incluyen 1-10 mg/kg o 15 mg/kg en días consecutivos, 30 mg/kg en días alternativos o 60 mg/kg semanalmente. En algunos procedimientos, dos o más anticuerpos monoclonales con diferentes especificidades de unión se administran de manera simultánea, en cuyo caso la dosis de cada anticuerpo administrado se encuentra dentro de los intervalos indicados. La evolución se puede controlar por evaluación periódica.
Terapia de combinación
Un anticuerpo anti-tau de la presente descripción se puede administrar a un individuo que lo necesite solo (por ejemplo, como monoterapia); o en terapia de combinación con uno o más agentes terapéuticos adicionales.
Para el tratamiento de la AD, los agentes terapéuticos adicionales adecuados incluyen, pero no se limitan a, inhibidores de acetilcolinesterasa, que incluyen, pero no se limitan a, Aricept (donepezil), Exelon (rivastigmina), metrifonato y tacrina (Cognex); un anticuerpo anti-Ap; agentes antiinflamatorios no esteroideos, que incluyen, pero no se limitan a, ibuprofeno e indometacina; inhibidores de la ciclooxigenasa-2 (Cox2) tales como Celebrex; e inhibidores de la monoaminooxidasa, tales como Selegilene (Eldepryl o Deprenyl). Las dosis para cada uno de los agentes anteriores son conocidas en la técnica.
Otro agente terapéutico adicional adecuado en el tratamiento de AD es un agente que inhibe la agregación de tau, por ejemplo, un derivado de naftoquinona que inhibe la agregación de tau, como se describe en la patente estadounidense N° 7.605.179. Otro agente terapéutico adicional adecuado es un agente que inhibe la fosforilación de tau, por ejemplo, un derivado de 4-pirimidona 3-sustituido que inhibe la proteína cinasa 1 de tau, como se describe en la patente estadounidense N° 7.572.793.
“En combinación con” como se usa en el presente documento se refiere a usos donde, por ejemplo, el primer compuesto se administra durante todo el ciclo de administración del segundo compuesto; donde el primer compuesto se administra durante un período de tiempo que se superpone con la administración del segundo compuesto, por ejemplo, donde la administración del primer compuesto comienza antes de la administración del segundo compuesto y la administración del primer compuesto termina antes de que termine la administración del segundo compuesto; donde la administración del segundo compuesto comienza antes de la administración del primer compuesto y la administración del segundo compuesto termina antes de que termine la administración del primer compuesto; donde la administración del primer compuesto comienza antes de que comience la administración del segundo compuesto y la administración del segundo compuesto termina antes de que termine la administración del primer compuesto; donde la administración del segundo compuesto comienza antes de que comience la administración del primer compuesto y la administración del primer compuesto termina antes de que termine la administración del segundo compuesto. Como tal, “en combinación” también puede referirse a un régimen que implica la administración de dos o más compuestos. “En combinación con” como se usa en el presente documento también se refiere a la administración de dos o más compuestos que pueden administrarse en las mismas o diferentes formulaciones, por la misma o diferentes vías, y en el mismo o en un tipo de forma de dosificación diferente.
Individuos a tratar
Los individuos adecuados para el tratamiento con un anticuerpo anti-tau de la presente incluyen individuos a los que se les ha diagnosticado una tauopatía; individuos con mayor riesgo que la población general para desarrollar una tauopatía (por ejemplo, individuos que tienen una predisposición genética a desarrollar una tauopatía); individuos con p DD; y similares. En algunos casos, el individuo es un ser humano adulto. En algunos casos, el ser humano adulto tiene 30 años de edad o más; 40 años o más, 50 años o más, 60 años o más, 70 años o más, u 80 años o más. Por ejemplo, el ser humano adulto puede tener entre 40 y 50 años, entre 50 y 60 años, entre 60 y 70 años, o más de 70 años.
PROCEDIMIENTOS DE REDUCCIÓN DE LOS NIVELES Ap40 Y Ap42
La presente descripción proporciona un procedimiento de reducción del nivel de Ap40 y/o Ap42 en una célula neuronal y/o líquido extracelular en un individuo. El procedimiento generalmente implica administrar al individuo: a) una cantidad efectiva de un anticuerpo humanizado que se une a una región N-terminal de un polipéptido tau; o b) una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo humanizado.
Un anticuerpo humanizado que se une a una región N-terminal de un polipéptido tau, y que es adecuado para su uso en un procedimiento de la presente de reducción de Ap40 y Ap42 en una célula neuronal y/o líquido extracelular, es un anticuerpo humanizado que se une a un epítopo de Tau es decir, dentro de los aminoácidos 2-176 de Tau, por ejemplo, dentro de los aminoácidos 2-15, aminoácidos 15-24, aminoácidos 24-50, aminoácidos 2-25, aminoácidos l5 a 50, aminoácidos 50 a 75, aminoácidos 40 a 60, aminoácidos 75 a 100, aminoácidos 60 a 80, aminoácidos 100 a 125, aminoácidos 80-115, aminoácidos 125 a 150, aminoácidos 115 a 140, aminoácidos 150 a 176 o aminoácidos ácidos 140 a 160, de Tau. Los polipéptidos Tau ejemplares se representan en la figura 20; un anticuerpo que reduce el nivel de Ap40 y/o Ap42 en una célula neuronal y/o líquido extracelular en un individuo puede ser un anticuerpo humanizado que se une específicamente a un epítopo en un polipéptido Tau representado en la figura 20.
En algunos casos, un anticuerpo que reduce el nivel de Ap40 y/o Ap42 en una célula neuronal y/o líquido extracelular en un individuo, y que es adecuado para su uso en un procedimiento de la presente, es un anticuerpo anti-Tau humanizado de la presente descripción. En algunos casos, el anticuerpo es un anticuerpo humanizado que se une a un epítopo dentro de los aminoácidos 15-24 de Tau.
ANTICUERPOS ANTI-TAU
La presente descripción proporciona anticuerpos anti-Tau aislados y formulaciones farmacéuticas que los comprenden. La presente descripción proporciona un anticuerpo aislado que se une específicamente a un epítopo dentro de una región N-terminal de un polipéptido Tau (por ejemplo, un epítopo lineal dentro de una parte amino-terminal (N-terminal) de Tau, por ejemplo, dentro de los aminoácidos 1-25 de Tau, dentro de los aminoácidos 1-18 de Tau, dentro de los aminoácidos 9 a 18 de Tau (donde los aminoácidos 1-18 de Tau son: MAEPRQEFEVMEDHAGTY; SEQ ID NO: 53), dentro de los aminoácidos 15-44 de Tau, dentro de los aminoácidos 13-24 de Tau, o dentro de los aminoácidos 15-24 de Tau (donde los aminoácidos 15-24 de Tau son: AGTYGLGDRK (SEQ ID NO: 51). En algunos aspectos, el anticuerpo se humaniza, por ejemplo, una o más regiones marco de la región variable de cadena pesada y/o la región variable de cadena ligera incluye secuencias derivadas de un marco de inmunoglobulina humana.
La presente descripción proporciona un anticuerpo monoclonal humanizado aislado que se une específicamente a un epítopo dentro de los aminoácidos 15-24 de un polipéptido Tau. En algunos casos, el epítopo no comprende un aminoácido fosforilado. En algunos casos, el epítopo no comprende un aminoácido nitrado. En algunos casos, el epítopo comprende un aminoácido fosforilado, un aminoácido nitrado, o tanto un aminoácido fosforilado como un aminoácido nitrado.
La humanización de una región o regiones marco reduce el riesgo de que el anticuerpo provoque una respuesta de anticuerpo humano-anti-ratón (HAMA) en seres humanos. Los procedimientos reconocidos en la técnica de determinación de la respuesta inmunitaria se pueden realizar para controlar una respuesta HAMA en un paciente en particular o durante ensayos clínicos. Los pacientes a los que se les administraron anticuerpos humanizados se les puede dar una evaluación de inmunogenicidad al comienzo y durante toda la administración de la terapia. La respuesta HAMA se mide, por ejemplo, mediante la detección de anticuerpos para el reactivo terapéutico humanizado, en muestras de suero del paciente usando un procedimiento conocido por los expertos en la materia, que incluye tecnología de resonancia de plasmón superficial (BlAcORE) y/o enzimoinmunoanálisis de adsorción en fase sólida (ELISA). En muchos casos, un anticuerpo humanizado anti-Tau de la presente no provoca sustancialmente una respuesta HAMA en un sujeto humano. En algunos casos, un anticuerpo anti-Tau humanizado de la presente tiene un potencial inmunógeno reducido, según lo determinado por un ensayo EpiScreen™ realizado usando células mononucleares de la sangre periférica agotadas en CD8+. En algunos casos, un anticuerpo humanizado anti-Tau de la presente exhibe un índice de estimulación de menos de 2.0.
Determinados aminoácidos de los residuos de la región marco variable humana pueden seleccionarse para la sustitución basándose en su posible influencia sobre la conformación de CDR y/o la unión a antígenos. La yuxtaposición no natural de las regiones CDR murinas con la región marco variable humana puede dar como resultado restricciones conformacionales no naturales, que, a menos que se corrijan mediante la sustitución de determinados residuos de aminoácidos, conducen a la pérdida de la afinidad de unión.
La selección de residuos de aminoácidos para la sustitución se puede determinar, en parte, mediante modelización por ordenador. El hardware y el software para producir imágenes tridimensionales de moléculas de inmunoglobulina son conocidos en la técnica. En general, los modelos moleculares se producen a partir de estructuras resueltas para cadenas de inmunoglobulina o dominios de las mismas. Las cadenas a modelizar se comparan para la similitud de secuencia de aminoácidos con cadenas o dominios de estructuras tridimensionales resueltas, y las cadenas o dominios que muestran la mayor similitud de secuencia se seleccionan como puntos de partida para la construcción del modelo molecular. Las cadenas o dominios que comparten al menos el 50 % de identidad de secuencia se seleccionan para la modelización, por ejemplo, aquellos que comparten al menos el 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o más del 90 %, de identidad de secuencia o más se seleccionan para la modelización. Las estructuras iniciales resueltas se modifican para permitir diferencias entre los aminoácidos reales en las cadenas o dominios de inmunoglobulina que se están modelizando, y aquellos en la estructura inicial. Las estructuras modificadas se ensamblan después en una inmunoglobulina compuesta. Finalmente, el modelo se refina minimizando la energía y verificando que todos los átomos estén a distancias apropiadas entre sí y que las longitudes y ángulos de enlace estén dentro de límites químicamente aceptables.
Las CDR y regiones marco están definidas por Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, 1987 y 1991). Una definición estructural alternativa ha sido propuesta por Chothia y col., J. Mol. Biol. 196: 901 (1987); Nature 342: 878 (1989); y J. Mol. Biol. 186: 651 (1989) (denominados colectivamente “Chothia”). Cuando los residuos marco, como se define por Kabat, supra, constituyen residuos de bucle estructural como se define por Chothia, supra, los aminoácidos presentes en el anticuerpo de ratón pueden seleccionarse para su sustitución en el anticuerpo humanizado. Los residuos que son “adyacentes a una región CDR” incluyen residuos de aminoácidos en posiciones inmediatamente adyacentes a una o más de las CDR en la secuencia primaria de la cadena de inmunoglobulina humanizada, por ejemplo, en posiciones inmediatamente adyacentes a una CDR según lo definido por Kabat, o una CDR según lo definido por Chothia (véase, por ejemplo, Chothia y Lesk JMB 196: 901 (1987)). Es particularmente probable que estos aminoácidos interactúen con los aminoácidos en las CDR y, si se eligen del aceptor, distorsionen las CDR del donante y reduzcan la afinidad. Además, los aminoácidos adyacentes pueden interactuar directamente con el antígeno (Amit y col., Science, 233: 747 (1986)) y seleccionar estos aminoácidos del donante puede ser deseable para mantener todos los contactos de antígeno que proporcionan afinidad en el anticuerpo original.
La presente descripción proporciona un anticuerpo aislado que comprende una región de estructura de cadena ligera humanizada; y una región de estructura de cadena pesada humanizada, donde el anticuerpo aislado compite por unirse a un epítopo en una región N-terminal de un polipéptido Tau con un anticuerpo que comprende: a) una región de cadena ligera que comprende: i) una VlCDR1 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 7; (ii) una V lCd R2 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 8; y (iii) una VlCDR3 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 9; y b) una región de cadena pesada que comprende: (i) una Vh CDR1 que comprende una secuencia de aminoácidos de s Eq ID NO: 4 o SEQ ID NO: 10; (ii) una VhCDR2 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 11; y (iii) una VhCDR3 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6 o SEQ ID NO: 12. En algunos casos, la región de cadena ligera y la región de cadena pesada están presentes en polipéptidos separados. En otros casos, la región de cadena ligera y la región de cadena pesada están presentes en un único polipéptido. El anticuerpo aislado puede incluir una cadena pesada que comprende una región constante del isotipo IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4. En otros casos, el anticuerpo es un Fv, scFv, Fab, F(ab')2 o Fab'. El anticuerpo puede comprender un polímero sintético no peptídico unido covalentemente, por ejemplo, donde el polímero sintético es un polímero de poli(etilenglicol). En algunos casos, el anticuerpo aislado se fusiona, directamente o mediante un enlazador, a una molécula portadora, un péptido o una proteína que promueve el cruce de la barrera hematoencefálica. En algunos casos, el epítopo al que se une el anticuerpo aislado está dentro de los aminoácidos 15-24 de un polipéptido Tau. La región marco de cadena ligera humanizada del anticuerpo aislado puede comprender 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 de las sustituciones de aminoácidos representadas en la tabla 3. La región marco de cadena pesada humanizada del anticuerpo aislado comprende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 12 de las sustituciones de aminoácidos representadas en la tabla 2.
En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-Tau de la presente descripción (por ejemplo, un anticuerpo de la presente que se une específicamente a un epítopo en un polipéptido Tau, por ejemplo, un epítopo lineal dentro de una parte aminoterminal (N-terminal) de Tau, por ejemplo, dentro de los aminoácidos 1-25 de Tau, dentro de los aminoácidos 1-18 de Tau, dentro de los aminoácidos 9 a 18 de Tau (donde los aminoácidos 1-18 de Tau son: MAEPRQEFEVMEDHAGTY; SEQ ID NO: 53), dentro de los aminoácidos 15-44 de Tau, dentro de los aminoácidos 13-24 de Tau, o dentro de los aminoácidos 15-24 de Tau (donde los aminoácidos 15-24 de Tau son: AGTYGLGDRK (SEQ ID NO: 51)) comprende: a) una región de cadena ligera que comprende: i) una, dos, o tres regiones determinantes de complementariedad (CDR) de un anticuerpo IPN001, donde las CDR son como las define Kabat (véase, por ejemplo, tabla 1, más arriba; y Kabat y col., U.S. Dept. of Health and Human Services, “Sequences of proteins of immunological interest” (1991)).
En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-Tau de la presente descripción (por ejemplo, un anticuerpo de la presente que se une específicamente a un epítopo en un polipéptido Tau, por ejemplo, un epítopo lineal dentro de una parte aminoterminal (N-terminal) de Tau, por ejemplo, dentro de los aminoácidos 1-25 de Tau, dentro de los aminoácidos 1-18 de Tau, dentro de los aminoácidos 9 a 18 de Tau (donde los aminoácidos 1-18 de Tau son: MAEPRQEFEVMEDHAGTY; SEQ ID NO: 53), dentro de los aminoácidos 15-44 de Tau, dentro de los aminoácidos 13-24 de Tau, o dentro de los aminoácidos 15-24 de Tau (donde los aminoácidos 15-24 de Tau son: AGTYGLGDRK (SEQ ID NO: 51)) comprende: a) una región de cadena ligera que comprende: i) una, dos o tres Vl CDR de un anticuerpo IPN001; y ii) una región marco de cadena ligera humanizada; y b) una región de cadena pesada que comprende: i) una, dos o tres VhCDR de un anticuerpo IPN001; y ii) una región marco de cadena pesada humanizada; donde las Vh y VlCDR son las definidas por Kabat (véase, por ejemplo, la tabla 1, más arriba; y Kabat y col., U.S. Dept. of Health and Human Services, “Sequences of proteins of immunological interest” (1991)). En algunas de estas realizaciones, el anticuerpo anti-Tau incluye una región marco Vh y/o Vl humanizada.
En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-Tau de la presente descripción (por ejemplo, un anticuerpo de la presente que se une específicamente a un epítopo en un polipéptido Tau, por ejemplo, un epítopo lineal dentro de una parte aminoterminal (N-terminal) de Tau, por ejemplo, dentro de los aminoácidos 1-25 de Tau, dentro de los aminoácidos 1-18 de Tau, dentro de los aminoácidos 9 a 18 de Tau (donde los aminoácidos 1-18 de Tau son: MAEPRQEFEVMEDHAGTY; SEQ ID NO: 53), dentro de los aminoácidos 15-44 de Tau, dentro de los aminoácidos 13-24 de Tau, o dentro de los aminoácidos 15-24 de Tau (donde los aminoácidos 15-24 de Tau son: AGTYGLGDRK (SEQ ID NO: 51)) comprende: a) una región de cadena ligera que comprende: i) una, dos o tres Vl CDR de un anticuerpo IPN001; y ii) una región marco de cadena ligera humanizada; y b) una región de cadena pesada que comprende: i) una, dos o tres Vh CDR de un anticuerpo IPN001; y ii) una región marco de cadena pesada humanizada; donde las Vh y Vl CDR son las definidas por Chothia (véase, por ejemplo, la tabla 1, más arriba; y Chothia y col., J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987)).
En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-Tau de la presente descripción (por ejemplo, un anticuerpo de la presente que se une específicamente a un epítopo en un polipéptido Tau, por ejemplo, un epítopo lineal dentro de una parte aminoterminal (N-terminal) de Tau, por ejemplo, dentro de los aminoácidos 1-25 de Tau, dentro de los aminoácidos 1-18 de Tau, dentro de los aminoácidos 9 a 18 de Tau (donde los aminoácidos 1-18 de Tau son: MAEPRQEFEVMEDHAGTY; SEQ ID NO: 53), dentro de los aminoácidos 15-44 de Tau, dentro de los aminoácidos 13-24 de Tau, o dentro de los aminoácidos 15-24 de Tau (donde los aminoácidos 15-24 de Tau son: AGTYGLGDRK (SEQ ID NO: 51)) comprende: a) una región de cadena ligera que comprende: i) una, dos o tres Vl CDR de un anticuerpo IPN002; y ii) una región marco de cadena ligera humanizada; y b) una región de cadena pesada que comprende: i) una, dos o tres Vh CDR de un anticuerpo IPN002; y ii) una región marco de cadena pesada humanizada; donde las Vh y Vl CDR son las definidas por Kabat (véase, por ejemplo, la tabla 1, más arriba; y Kabat y col., U.S. Dept. of Health and Human Services, “Sequences of proteins of immunological interest” (1991)).
En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-Tau de la presente descripción (por ejemplo, un anticuerpo de la presente que se une específicamente a un epítopo en un polipéptido Tau, por ejemplo, un epítopo lineal dentro de una parte aminoterminal (N-terminal) de Tau, por ejemplo, dentro de los aminoácidos 1-25 de Tau, dentro de los aminoácidos 1-18 de Tau, dentro de los aminoácidos 9 a 18 de Tau (donde los aminoácidos 1-18 de Tau son: MAEPRQEFEVMEDHAGTY; SEQ ID NO: 53), dentro de los aminoácidos 15-44 de Tau, dentro de los aminoácidos 13-24 de Tau, o dentro de los aminoácidos 15-24 de Tau (donde los aminoácidos 15-24 de Tau son: AGTYGLGDRK (SEQ ID NO: 51)) comprende: a) una región de cadena ligera que comprende: i) una, dos o tres Vl CDR de un anticuerpo IPN002; y ii) una región marco de cadena ligera humanizada; y b) una región de cadena pesada que comprende: i) una, dos o tres Vh CDR de un anticuerpo IPN002; y ii) una región marco de cadena pesada humanizada; donde las Vh y Vl CDR son las definidas por Chothia (véase, por ejemplo, la tabla 1, más arriba; y Chothia y col., J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987)).
En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-Tau de la presente descripción (por ejemplo, un anticuerpo de la presente que se une específicamente a un epítopo en un polipéptido Tau, por ejemplo, un epítopo lineal dentro de una parte aminoterminal (N-terminal) de Tau, por ejemplo, dentro de los aminoácidos 1-25 de Tau, dentro de los aminoácidos 1-18 de Tau, dentro de los aminoácidos 9 a 18 de Tau (donde los aminoácidos 1-18 de Tau son: MAEPRQEFEVMEDHAGTY; SEQ ID NO: 53), dentro de los aminoácidos 15-44 de Tau, dentro de los aminoácidos 13-24 de Tau, o dentro de los aminoácidos 15-24 de Tau (donde los aminoácidos 15-24 de Tau son: AGTYGLGDRK (SEQ ID NO: 51)) comprende: a) una región de cadena ligera que comprende: i) una, dos o tres CDR seleccionadas de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, y SEQ ID NO: 3; y ii) una región marco de cadena ligera humanizada; y b) una región de cadena pesada que comprende: i) una, dos o tres CDR seleccionadas de SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6; y ii) una región marco de cadena pesada humanizada.
En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-Tau de la presente descripción (por ejemplo, un anticuerpo de la presente que se une específicamente a un epítopo en un polipéptido Tau, por ejemplo, un epítopo lineal dentro de una parte aminoterminal (N-terminal) de Tau, por ejemplo, dentro de los aminoácidos 1-25 de Tau, dentro de los aminoácidos 1-18 de Tau, dentro de los aminoácidos 9 a 18 de Tau (donde los aminoácidos 1-18 de Tau son: MAEPRQEFEVMEDHAGTY; SEQ ID NO: 53), dentro de los aminoácidos 15-44 de Tau, dentro de los aminoácidos 13-24 de Tau, o dentro de los aminoácidos 15-24 de Tau (donde los aminoácidos 15-24 de Tau son: AGTYGLGDRK (SEQ ID NO: 51)) comprende: a) una región de cadena ligera que comprende: i) una, dos o tres CDR seleccionadas de SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, y SEQ ID NO: 9; y ii) una región marco de cadena ligera humanizada; y b) una región de cadena pesada que comprende: i) una, dos o tres Cd R seleccionadas de SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: 12; y ii) una región marco de cadena pesada humanizada.
En algunos aspectos, el anticuerpo comprende: a) una región de cadena ligera que comprende: i) una Vl CDR1 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 7; (ii) una VlCDR2 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 8; (iii) una VlCDR3 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 9; y (iv) una región marco de cadena ligera humanizada; y b) una región de cadena pesada que comprende: (i) una VhCDRI que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 10; (ii) una Vh c Dr2 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 11; (iii) una VhCDR3 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6 o SEQ ID NO: 12; y iv) una región marco de cadena pesada humanizada.
En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-Tau de la presente comprende una región variable de cadena pesada que comprende una, dos o tres de las CDR de cadena pesada que tienen una secuencia de aminoácidos seleccionada de una o más de las SEQ ID NO: 4, 5 y 6; y una, dos, tres o cuatro regiones FR que están humanizadas. Por ejemplo, en algunas realizaciones, un anticuerpo de la presente comprende una región variable de cadena pesada que comprende, en orden desde el extremo N al extremo C: una FR1 de cadena pesada humanizada; una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 4; una FR2 de cadena pesada humanizada; una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 5; una FR3 de cadena pesada humanizada; una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 6; y una FR4 de cadena pesada humanizada.
En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-Tau de la presente comprende una región variable de cadena ligera que comprende una, dos o tres de las CDR de cadena ligera que tienen una secuencia de polipéptidos seleccionada de una o más de las SEQ ID NO: 1, 2 y 3; y una, dos, tres o cuatro regiones FR que están humanizadas. Por ejemplo, en algunas realizaciones, un anticuerpo de la presente comprende una región variable de cadena ligera que comprende, en orden desde el extremo N al extremo C: una FR1 de cadena ligera humanizada; una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 1; una FR2 de cadena ligera humanizada; una c DR2 que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 2; una FR3 de cadena ligera humanizada; una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 3; y una FR4 de cadena ligera humanizada.
En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-Tau de la presente comprende una región variable de cadena pesada que comprende una, dos o tres de las CDR de cadena pesada que tienen una secuencia de aminoácidos seleccionada de una o más de las SEQ ID NO: 10, 11 y 12; y una, dos, tres o cuatro regiones FR que están humanizadas. Por ejemplo, en algunas realizaciones, un anticuerpo de la presente comprende una región variable de cadena pesada que comprende, en orden desde el extremo N al extremo C: una FR1 de cadena pesada humanizada; una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 10; una fR2 de cadena pesada humanizada; una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 11; una FR3 de cadena pesada humanizada; una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 12; y una FR4 de cadena pesada humanizada.
En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-Tau de la presente comprende una región variable de cadena ligera que comprende una, dos o tres de las CDR de cadena ligera que tienen una secuencia de polipéptidos seleccionada de una o más de las SEQ ID NO: 7, 8 y 9; y una, dos, tres o cuatro regiones FR que están humanizadas. Por ejemplo, en algunas realizaciones, un anticuerpo de la presente comprende una región variable de cadena ligera que comprende, en orden desde el extremo N al extremo C: una FR1 de cadena ligera humanizada; una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 7; una FR2 de cadena ligera humanizada; una c DR2 que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 8; una FR3 de cadena ligera humanizada; una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 9; y una FR4 de cadena ligera humanizada.
Las secuencias de aminoácidos de Vh y Vl de IPN001 se representan en las figuras 1A y 1B. Las CDR (como las define Kabat) están en negrita y subrayadas. Las secuencias de aminoácidos de Vh y Vl de IPN002 se representan en las figuras 2A y 2B. Las CDR (como las define Kabat) están en negrita y subrayadas.
Las SEQ ID NO: 1-12 son las siguientes:
RSSQTILHSNGNTYLE (SEQ ID NO: 1);
KVSKRFS (SEQ ID NO: 2);
FQGSLVPWA (SEQ ID NO: 3);
SYGMS (SEQ ID NO: 4);
TISSSGSRTYFPDSVKG (SEQ ID NO: 5);
TWDGAMDY (SEQ ID NO: 6);
KSSQSIVHSNGNTYLE (SEQ ID NO: 7);
KVSNRFS (SEQ ID NO: 8);
FQGSLVPWA (SEQ ID NO: 9);
KYGMS (SEQ ID NO: 10);
TISSSGSRTYYPDSVKG (SEQ ID NO: 11);
SWDGAMDY (SEQ ID NO: 12).
Un anticuerpo anti-Tau de la presente puede comprender una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que es un 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a la secuencia representada en la figura 1B y establecida en la SEQ ID NO: 13.
Un anticuerpo anti-Tau de la presente puede comprender una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que es un 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a la secuencia representada en la figura 1A y establecida en la SEQ ID NO: 14.
Un anticuerpo anti-Tau de la presente puede comprender una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que es un 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a la secuencia representada en la figura 2B y establecida en la SEQ ID NO: 15.
Un anticuerpo anti-Tau de la presente puede comprender una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que es un 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a la secuencia representada en la figura 2A y establecida en la SEQ ID NO: 16.
Un anticuerpo anti-Tau de la presente puede comprender una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que es un 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a la secuencia representada en la figura 9 (Variante 1 de VH).
Un anticuerpo anti-Tau de la presente puede comprender una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que es un 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a la secuencia representada en la figura 10 (Variante 2 de VH).
Un anticuerpo anti-Tau de la presente puede comprender una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que es un 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a la secuencia representada en la figura 11 (Variante 3 de VH).
Un anticuerpo anti-Tau de la presente puede comprender una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que es un 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a la secuencia representada en la figura 12 (Variante 4 de VH).
Un anticuerpo anti-Tau de la presente puede comprender una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que es un 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a la secuencia representada en la figura 13 (Variante 1 de Vk).
Un anticuerpo anti-Tau de la presente puede comprender una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que es un 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a la secuencia representada en la figura 14 (Variante 2 de Vk).
Un anticuerpo anti-Tau de la presente puede comprender una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que es un 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a la secuencia representada en la figura 15 (Variante 3 de Vk).
Un anticuerpo anti-Tau de la presente puede comprender una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que es un 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a la secuencia representada en la figura 16 (Variante 4 de Vk).
Un anticuerpo anti-Tau de la presente puede comprender una región variable de cadena pesada que comprende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 12 de las sustituciones de aminoácidos marco (FR), en relación con las secuencias de aminoácidos FR del anticuerpo parental IPN002, representadas en la tabla 2.
(continuación)
Tabla 2: Variantes de VH
Figure imgf000025_0001
Por ejemplo, un anticuerpo anti-Tau de la presente puede comprender una región variable de cadena pesada que comprende una sustitución H^-Q en la posición de aminoácido 3 en VH FR1 y/o una sustitución K^-R en la posición de aminoácido 19 en VH FR1.
Como otro ejemplo, un anticuerpo anti-Tau de la presente puede comprender una región variable de cadena pesada que comprende una sustitución T ^A en la posición de aminoácido 40 en VH FR2 y/o una sustitución D^-G en la posición de aminoácido 42 en VH FR2 y/o una sustitución R^-G en la posición 44 en VH FR2.
Como otro ejemplo, un anticuerpo anti-Tau de la presente puede comprender una región variable de cadena pesada que comprende una sustitución Q^-R en la posición de aminoácido 66 en VH FR3 y/o una sustitución S^-N en la posición de aminoácido 83 en VH FR3 y/o una sustitución L^-S en la posición de aminoácidos 85 en VH FR3 y/o una sustitución K^-R en la posición de aminoácido 86 en FR3 y/o una sustitución S ^A en la posición de aminoácidos 87 en VH FR3 y/o una sustitución S ^A en la posición de aminoácido 93 en VH FR3.
Como otro ejemplo, un anticuerpo anti-Tau de la presente puede comprender una región variable de cadena pesada que comprende una sustitución S ^T en la posición de aminoácido 108 en VH FR4.
En algunos casos, un anticuerpo anti-Tau aislado de la presente puede comprender, en orden del extremo N al extremo C una región VH que comprende:
EVX1 LVESGGALVKPGGSLRLSCAASGFSFS (SEQ ID NO: 83); VH CDR1 como se muestra en la figura 2A; WVRQAPGKGLEWVA (SEQ ID NO: 84); VH CDR2 como se muestra en la figura 2A;
RFTISRDNAKNTLYLQMX2SX3X4X5EDTAMYYCX6I (SEQ ID NO: 85); VH CDR3 como se muestra en la figura 2A; WGQGTX7VTVSS (SEQ ID NO: 86), donde X1 es H o Q; X2 es S o N; X3 es S o L; X4 es K o R; X5 es S o A; Xa es S o A; y X7 es S o T.
Un anticuerpo anti-Tau de la presente puede comprender una región variable de cadena ligera que comprende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 de las sustituciones de aminoácidos marco (FR), en relación con las secuencias de aminoácidos FR del anticuerpo parental IPN002, representadas en la tabla 3.
(continuación)
Tabla 3: Variantes de Vk
Figure imgf000026_0001
Por ejemplo, un anticuerpo anti-Tau de la presente puede comprender una región variable de cadena ligera que comprende una sustitución L ^V en la posición de aminoácido 3 en VL FR1 y/o una sustitución T^-S en la posición de aminoácido 7 en VL FR1 y/o una sustitución S ^T en la posición de aminoácido 14 en VL FR1 y/o una sustitución D^-Q en la posición de aminoácido 17 en VL FR1 y/o una sustitución Q^-P en la posición de aminoácido 18 en VL FR1. Como otro ejemplo, un anticuerpo anti-Tau de la presente puede comprender una región variable de cadena ligera que comprende una sustitución K ^Q en la posición de aminoácido 45 de Vl FR2 y/o una sustitución de V ^ I en la posición de aminoácido 48 de VL FR2.
Como otro ejemplo, un anticuerpo anti-Tau de la presente puede comprender una región variable de cadena ligera que comprende una sustitución L ^V en la posición de aminoácido 83 de Vl FR3 y/o una sustitución T ^V en la posición de aminoácido 85 de VL FR3.
Como otro ejemplo, un anticuerpo anti-Tau de la presente puede comprender una región variable de cadena ligera que comprende una sustitución L ^V en la posición de aminoácido 104 de VL FR4.
En algunos casos, un anticuerpo anti-Tau aislado de la presente puede comprender, en orden del extremo N al extremo C una región VL que comprende: DVX1 MTQSPLSLPVTLGQPASISC (SEQ iD NO: 54); VL CDR1 como se muestra en la figura 2B; WYLQKPGQSPQLLX2Y (SEQ ID NO: 55); VL CDR2 como se muestra en la figura 2B; GVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGX3YYC (SEQ ID NO: 56); VL CDR3 como se muestra en la figura 2B; FGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 57); donde X1 es L o V; X2 es V o I; y X3 es T o V.
En algunos casos, un anticuerpo anti-Tau de la presente descripción comprende:
a) una variante 1 de VH que comprende la secuencia de aminoácidos representada en la figura 9; y una variante 1 de Vk que comprende la secuencia de aminoácidos representada en la figura 13;
b) una variante 1 de VH que comprende la secuencia de aminoácidos representada en la figura 9; y una variante 2 de Vk que comprende la secuencia de aminoácidos representada en la figura 14;
c) una variante 1 de VH que comprende la secuencia de aminoácidos representada en la figura 9; y una variante 3 de Vk que comprende la secuencia de aminoácidos representada en la figura 15;
d) una variante 1 de VH que comprende la secuencia de aminoácidos representada en la figura 9; y una variante 4 de Vk que comprende la secuencia de aminoácidos representada en la figura 16;
e) una variante 2 de VH que comprende la secuencia de aminoácidos representada en la figura 10; y una variante 1 de Vk que comprende la secuencia de aminoácidos representada en la figura 13;
f) una variante 2 de VH que comprende la secuencia de aminoácidos representada en la figura 10; y una variante 2 de Vk que comprende la secuencia de aminoácidos representada en la figura 14;
g) una variante 2 de VH que comprende la secuencia de aminoácidos representada en la figura 10; y una variante 3 de Vk que comprende la secuencia de aminoácidos representada en la figura 15;
h) una variante 2 de VH que comprende la secuencia de aminoácidos representada en la figura 10; y una variante 4 de Vk que comprende la secuencia de aminoácidos representada en la figura 16;
i) una variante 3 de VH que comprende la secuencia de aminoácidos representada en la figura 11; y una variante 1 de Vk que comprende la secuencia de aminoácidos representada en la figura 13;
j) una variante 3 de VH que comprende la secuencia de aminoácidos representada en la figura 11; y una variante 2 de Vk que comprende la secuencia de aminoácidos representada en la figura 14;
k) una variante 3 de VH que comprende la secuencia de aminoácidos representada en la figura 11; y una variante 3 de Vk que comprende la secuencia de aminoácidos representada en la figura 15;
l) una variante 3 de VH que comprende la secuencia de aminoácidos representada en la figura 11; y una variante 4 de Vk que comprende la secuencia de aminoácidos representada en la figura 16;
m) una variante 4 de VH que comprende la secuencia de aminoácidos representada en la figura 12; y una variante 1 de Vk que comprende la secuencia de aminoácidos representada en la figura 13;
n) una variante 4 de VH que comprende la secuencia de aminoácidos representada en la figura 12; y una variante 2 de Vk que comprende la secuencia de aminoácidos representada en la figura 14;
o) una variante 4 de VH que comprende la secuencia de aminoácidos representada en la figura 12; y una variante 3 de Vk que comprende la secuencia de aminoácidos representada en la figura 15; o
p) una variante 4 de VH que comprende la secuencia de aminoácidos representada en la figura 12; y una variante 4 de Vk que comprende la secuencia de aminoácidos representada en la figura 16.
En algunas realizaciones, un anticuerpo de la presente comprende CDR de cadena pesada anti-Tau y CDR de cadena ligera anti-Tau en una única cadena polipeptídica, por ejemplo, en algunas realizaciones, un anticuerpo de la presente es un scFv. En algunas realizaciones, un anticuerpo de la presente comprende, en orden del extremo N al extremo C: una primera secuencia de aminoácidos de aproximadamente 5 aminoácidos a aproximadamente 25 aminoácidos de longitud; una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 1; una segunda secuencia de aminoácidos de aproximadamente 5 aminoácidos a aproximadamente 25 aminoácidos de longitud; una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 2; una tercera secuencia de aminoácidos de aproximadamente 5 aminoácidos a aproximadamente 25 aminoácidos de longitud; una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 3; una cuarta secuencia de aminoácidos de aproximadamente 5 aminoácidos a aproximadamente 25 aminoácidos de longitud; una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 4; una quinta secuencia de aminoácidos de aproximadamente 5 aminoácidos a aproximadamente 25 aminoácidos de longitud; una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 5; una sexta secuencia de aminoácidos de aproximadamente 5 aminoácidos a aproximadamente 25 aminoácidos de longitud; una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 6; y una séptima secuencia de aminoácidos de aproximadamente 5 aminoácidos a aproximadamente 25 aminoácidos de longitud. En algunas realizaciones, un anticuerpo de la presente comprende, en orden del extremo N al extremo C: una región FR1 de cadena ligera; una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 1; una región FR2 de cadena ligera; una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 2; una región FR3 de cadena ligera; una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 3; opcionalmente una región FR4 de cadena ligera; una región enlazadora; opcionalmente una región FR1 de cadena pesada; una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID: 4; una región FR2 de cadena pesada; una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 5; una región FR3 de cadena pesada; una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 6; y una región FR4 de cadena pesada. En algunas de estas realizaciones, una o más de las regiones FR es una región FR humanizada. En algunas de estas realizaciones, cada una de las regiones FR es una región FR humanizada. La región enlazadora puede tener una longitud de aproximadamente 5 aminoácidos a aproximadamente 50 aminoácidos, por ejemplo, de aproximadamente 5 aa a aproximadamente 10 aa, de aproximadamente 10 aa a aproximadamente 15 aa, de aproximadamente 15 aa a aproximadamente 20 aa, de aproximadamente 20 aa a aproximadamente 25 aa, de aproximadamente 25 aa a aproximadamente 30 aa, de aproximadamente 30 aa a aproximadamente 35 aa, de aproximadamente 35 aa a aproximadamente 40 aa, de aproximadamente 40 aa a aproximadamente 45 aa, o de aproximadamente 45 aa a aproximadamente 50 aa de longitud.
En algunas realizaciones, un anticuerpo de la presente comprende, en orden del extremo N al extremo C: una región FR1 de cadena pesada; una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 4; una región FR2 de cadena pesada; una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 5; una región FR3 de cadena pesada; una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 6; opcionalmente una región FR4 de cadena pesada; un enlazador; opcionalmente una región FR1 de cadena ligera; una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID: 1; una región FR2 de cadena ligera; una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 2; una región FR3 de cadena ligera; una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 3; y una región FR4 de cadena ligera. En algunas de estas realizaciones, una o más de las regiones FR es una región FR humanizada. En algunas de estas realizaciones, cada una de las regiones FR es una región FR humanizada. La región enlazadora puede tener una longitud de aproximadamente 5 aminoácidos a aproximadamente 50 aminoácidos, por ejemplo, de aproximadamente 5 aa a aproximadamente 10 aa, de aproximadamente 10 aa a aproximadamente 15 aa, de aproximadamente 15 aa a aproximadamente 20 aa, de aproximadamente 20 aa a aproximadamente 25 aa, de aproximadamente 25 aa a aproximadamente 30 aa, de aproximadamente 30 aa a aproximadamente 35 aa, de aproximadamente 35 aa a aproximadamente 40 aa, de aproximadamente 40 aa a aproximadamente 45 aa, o de aproximadamente 45 aa a aproximadamente 50 aa de longitud.
En algunas realizaciones, un anticuerpo de la presente comprende, en orden del extremo N al extremo C: una región FR1 de cadena ligera; una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 7; una región FR2 de cadena ligera; una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 8; una región FR3 de cadena ligera; una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 9; opcionalmente una región FR4 de cadena ligera; una región enlazadora; opcionalmente una región FR1 de cadena pesada; una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID: 10; una región FR2 de cadena pesada; una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 11; una región FR3 de cadena pesada; una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 12; y una región FR4 de cadena pesada. En algunas de estas realizaciones, una o más de las regiones FR es una región FR humanizada. En algunas de estas realizaciones, cada una de las regiones FR es una región FR humanizada. La región enlazadora puede tener una longitud de aproximadamente 5 aminoácidos a aproximadamente 50 aminoácidos, por ejemplo, de aproximadamente 5 aa a aproximadamente 10 aa, de aproximadamente 10 aa a aproximadamente 15 aa, de aproximadamente 15 aa a aproximadamente 20 aa, de aproximadamente 20 aa a aproximadamente 25 aa, de aproximadamente 25 aa a aproximadamente 30 aa, de aproximadamente 30 aa a aproximadamente 35 aa, de aproximadamente 35 aa a aproximadamente 40 aa, de aproximadamente 40 aa a aproximadamente 45 aa, o de aproximadamente 45 aa a aproximadamente 50 aa de longitud.
En algunas realizaciones, un anticuerpo de la presente comprende, en orden del extremo N al extremo C: una región FR1 de cadena pesada; una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 10; una región FR2 de cadena pesada; una c DR2 que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 11; una región FR3 de cadena pesada; una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 12; opcionalmente una región FR4 de cadena pesada; un enlazador; opcionalmente una región FR1 de cadena ligera; una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID: 7; una región FR2 de cadena ligera; una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 8; una región FR3 de cadena ligera; una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 9; y una región FR4 de cadena ligera. En algunas de estas realizaciones, una o más de las regiones FR es una región FR humanizada. En algunas de estas realizaciones, cada una de las regiones FR es una región FR humanizada. La región enlazadora puede tener una longitud de aproximadamente 5 aminoácidos a aproximadamente 50 aminoácidos, por ejemplo, de aproximadamente 5 aa a aproximadamente 10 aa, de aproximadamente 10 aa a aproximadamente 15 aa, de aproximadamente 15 aa a aproximadamente 20 aa, de aproximadamente 20 aa a aproximadamente 25 aa, de aproximadamente 25 aa a aproximadamente 30 aa, de aproximadamente 30 aa a aproximadamente 35 aa, de aproximadamente 35 aa a aproximadamente 40 aa, de aproximadamente 40 aa a aproximadamente 45 aa, o de aproximadamente 45 aa a aproximadamente 50 aa de longitud.
Los enlazadores adecuados para uso de un anticuerpo de la presente incluyen “enlazadores flexibles”. Si están presentes, las moléculas enlazadoras son generalmente de longitud suficiente para permitir algún movimiento flexible entre regiones enlazadas. Las moléculas enlazadoras son, generalmente, de una longitud de aproximadamente 6-50 átomos. Las moléculas enlazadoras también pueden ser, por ejemplo, acetileno de arilo, oligómeros de etilenglicol que contienen 2­ 10 unidades de monómeros, diaminas, diácidos, aminoácidos o combinaciones de estos. A la luz de esta descripción, se pueden usar otras moléculas enlazadoras que pueden unirse a polipéptidos.
Los enlazadores adecuados se pueden seleccionar fácilmente y pueden ser de cualquiera de las longitudes adecuadas, tales como de 1 aminoácido (por ejemplo, Gly) a 20 aminoácidos, de 2 aminoácidos a 15 aminoácidos, de 3 aminoácidos a 12 aminoácidos, incluidos 4 aminoácidos a 10 aminoácidos, 5 aminoácidos a 9 aminoácidos, 6 aminoácidos a 8 aminoácidos, o 7 aminoácidos a 8 aminoácidos, y pueden ser de 1, 2, 3, 4, 5, 6 o 7 aminoácidos.
Los conectores flexibles ejemplares incluyen polímeros de glicina (G)n, polímeros de glicina-serina (incluidos, por ejemplo, (GS)n, GSGGS n (SEQ ID NO: 58) y GGGSn (SEQ ID NO: 59), donde n es un número entero de al menos uno), polímeros de glicina-alanina, polímeros de alanina-serina y otros enlazadores flexibles conocidos en la técnica. Los polímeros de glicina y glicina-serina son de interés ya que estos dos aminoácidos están relativamente desestructurados y, por lo tanto, pueden servir como un enlace neutro entre los componentes. Los polímeros de glicina son de particular interés ya que la glicina accede significativamente a más espacio phi-psi que incluso la alanina, y es mucho menos restringida que los residuos con cadenas laterales más largas (véase Scheraga, Rev. Computational Chem. 11173-142 (1992)). Los enlazadores flexibles ejemplares incluyen, pero no se limitan a GGSG (SEQ ID NO: 60), GGSGG (SEQ ID nO: 61), GSGSG (SEQ ID NO: 62), GSGGG (SEQ ID NO: 63), GGGSG (SEQ ID NO: 64), GSSSG (SEQ ID NO: 65), y similares. El experto en la materia reconocerá que el diseño de un péptido conjugado con cualquier elemento descrito anteriormente puede incluir enlazadores que sean total o parcialmente flexibles, de modo que el enlazador pueda incluir un enlazador flexible, así como una o más partes que confieran una estructura menos flexible.
En algunos casos, un anticuerpo aislado de la presente es un fragmento de anticuerpo, un Fv, scFv, Fab, F(ab')2 o Fab'. Por lo tanto, la presente descripción proporciona un anticuerpo aislado, donde el anticuerpo es un Fv, scFv, Fab, F(ab')2 o Fab', y donde el anticuerpo compite por unirse a un epítopo en una región N-terminal de un polipéptido Tau con un anticuerpo que comprende: a) una región de cadena ligera que comprende: i) una VlCDR1 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 7; (ii) una VlCDR2 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 8; y (iii) una VlCDR3 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 9; y b) una región de cadena pesada que comprende: (i) una VhCDR1 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 10; (ii) una VhCDR2 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 11; y (iii) una VhCDR3 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6 o SEQ ID NO: 12. En algunas de estas realizaciones, el anticuerpo aislado comprende una, dos, tres o cuatro regiones marco VL humanizadas, como se describió anteriormente. En algunas de estas realizaciones, el anticuerpo aislado comprende una, dos, tres o cuatro regiones marco VH humanizadas, como se describió anteriormente.
En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-Tau de la presente descripción es un anticuerpo scFv. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-Tau de la presente descripción comprende multímeros de scFv. Por ejemplo, en algunas realizaciones, un anticuerpo de la presente es un dímero de scFv (por ejemplo, comprende dos scFv en tándem (scFv 2)), un trímero de scFv (por ejemplo, comprende tres scFv en tándem (scFv3)), un tetrámero de scFv (por ejemplo, comprende cuatro scFv en tándem (scFv 4)), o es un multímero de más de cuatro scFv (por ejemplo, en tándem). Los monómeros de scFv pueden unirse en tándem a través de enlazadores de aproximadamente 2 aminoácidos a aproximadamente 10 aminoácidos (aa) de longitud, por ejemplo, 2 aa, 3 aa, 4 aa, 5 aa, 6 aa, 7 aa, 8 aa, 9 aa o 10 aa de longitud. Los enlazadores adecuados incluyen, por ejemplo, (Gly)x, donde x es un número entero de 2 a 10. Otros enlazadores adecuados son los analizados anteriormente. En algunas realizaciones, cada uno de los monómeros de scFv en un multímero de scFV de la presente se humaniza, como se describió anteriormente.
En algunos casos, un anticuerpo de la presente comprende una región constante de una inmunoglobulina (por ejemplo, una región Fc). La región Fc, si está presente, puede ser una región Fc humana. Si hay regiones constantes, el anticuerpo puede contener regiones constantes tanto de cadena ligera como de cadena pesada. La región constante de cadena pesada adecuada incluye regiones CH1, bisagra, CH2, CH3 y CH4. Los anticuerpos descritos en el presente documento incluyen anticuerpos que tienen todos los tipos de regiones constantes, incluyendo IgM, IgG, IgD, IgA e IgE, y cualquier isotipo, incluyendo IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. Un ejemplo de una región Fc de cadena pesada adecuada es un isotipo humano IgG1 Fc. En algunos casos, la región de cadena pesada es del isotipo IgG4. En algunas de estas realizaciones, la región de bisagra comprende una sustitución S241P. Véase, por ejemplo, Angal y col. (1993) Mol. Immunol 30: 105. Las regiones constantes de cadena ligera pueden ser lambda o kappa. Un anticuerpo de la presente (por ejemplo, un anticuerpo humanizado de la presente) puede comprender secuencias de más de una clase o isotipo. Los anticuerpos pueden expresarse como tetrámeros que contienen dos cadenas ligeras y dos pesadas, como cadenas pesadas separadas, cadenas ligeras, como Fab, Fab', F(ab')2 y Fv o como anticuerpos monocatenarios en los que los dominios variables de cadena pesada y ligera se enlazan a través de un espaciador.
En algunas realizaciones, la presente descripción proporciona un anticuerpo aislado, donde el anticuerpo aislado comprende una región constante de cadena ligera humana y una región constante de cadena pesada humana, y donde el anticuerpo aislado compite por unirse a un epítopo en una región N-terminal de un polipéptido Tau con un anticuerpo que comprende: a) una región de cadena ligera que comprende: i) una VlCDR1 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 7; (ii) una VlCDR2 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 8; y (iii) una VlCDR3 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 9; y b) una región de cadena pesada que comprende: (i) una VhCDR1 que comprende una secuencia de aminoácidos de SeQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 10; (ii) una Vh CDR2 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 11; y (iii) una VhCDR3 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6 o SEQ ID NO: 12. En algunas de estas realizaciones, el anticuerpo aislado comprende una, dos, tres o cuatro regiones marco VL humanizadas, como se describió anteriormente. En algunas de estas realizaciones, el anticuerpo aislado comprende una, dos, tres o cuatro regiones marco VH humanizadas, como se describió anteriormente.
Un anticuerpo de la presente puede comprender un grupo tiol libre (-SH) en el extremo carboxilo, donde el grupo tiol libre puede usarse para unir el anticuerpo a un segundo polipéptido (por ejemplo, otro anticuerpo, incluido un anticuerpo de la presente), un andamio, un vehículo, etc.
En algunas realizaciones, un anticuerpo de la presente comprende uno o más aminoácidos de origen no natural. En algunas realizaciones, el aminoácido codificado de forma no natural comprende un grupo carbonilo, un grupo acetilo, un grupo aminooxi, un grupo hidrazina, un grupo hidrazida, un grupo semicarbazida, un grupo azida o un grupo alquino. Véase, por ejemplo, la patente estadounidense No. 7.632.924 para aminoácidos de origen no natural adecuados. La inclusión de un aminoácido de origen no natural puede proporcionar un enlace a un polímero, un segundo polipéptido, un andamio, etc. Por ejemplo, un anticuerpo de la presente unido a un polímero soluble en agua se puede preparar haciendo reaccionar un polímero soluble en agua (por ejemplo, PEG) que comprende un grupo carbonilo para el anticuerpo, donde el anticuerpo comprende un aminoácido codificado de forma no natural que comprende un grupo aminooxi, hidrazina, hidrazida o semicarbazida. Como otro ejemplo, un anticuerpo de la presente unido a un polímero soluble en agua se puede hacer reaccionar un anticuerpo de la presente que comprende un aminoácido que contiene alquino con un polímero soluble en agua (por ejemplo, PEG) que comprende un resto azida; en algunas realizaciones, el grupo azida o alquino está unido a la molécula de PEG a través de un enlace amida. Un “aminoácido codificado de forma no natural” se refiere a un aminoácido que no es uno de los 20 aminoácidos comunes o pirrolisina o selenocisteína. Otras expresiones que se pueden usar como sinónimos del término “aminoácido codificado de forma no natural” son “aminoácido no natural”, “aminoácido no natural”, “aminoácido de origen no natural” y versiones de las mismas con varios guiones y sin guiones. La expresión “aminoácido codificado de forma no natural” también incluye, pero no se limita a, aminoácidos que se producen por modificación (por ejemplo, modificaciones postraduccionales) de un aminoácido codificado de forma natural (incluidos, entre otros, los 20 aminoácidos comunes o pirrolisina y selenocisteína) pero no son incorporados de forma natural en una cadena polipeptídica en crecimiento por el complejo de traducción. Los ejemplos de tales aminoácidos de origen no natural incluyen, pero no se limitan a, N-acetilglucosaminil-L-serina, N-acetilglucosaminil-L-treonina y O-fosfotirosina.
En algunas realizaciones, un anticuerpo de la presente está unido (por ejemplo, unido covalentemente) a un polímero (por ejemplo, un polímero distinto de un polipéptido). Los polímeros adecuados incluyen, por ejemplo, polímeros biocompatibles y polímeros biocompatibles solubles en agua. Los polímeros adecuados incluyen polímeros sintéticos y polímeros de origen natural. Los polímeros adecuados incluyen, por ejemplo, polímeros de polialquileno de cadena lineal o ramificada sustituidos o no sustituidos, polímeros de polialquenileno o polioxialquileno o polisacáridos ramificados o no ramificados, por ejemplo, un homo- o heteropolisacárido. Los polímeros adecuados incluyen, por ejemplo, copolímero de etileno y alcohol vinílico (comúnmente conocido por el nombre genérico EVOH o por el nombre comercial EVAL); polibutilmetacrilato; poli(hidroxivalerato); poli(ácido L-láctico); policaprolactona; poli(lactida-co-glicólido); poli(hidroxibutirato); poli(hidroxibutirato-co-valerato); polidioxanona; poliortoéster; polianhídrido; poli(ácido glicólico); poli(ácido D,L-láctico); poli(ácido glicólico-co-carbonato de trimetileno); polifosfoéster; polifosfoéster uretano; poli(aminoácidos); cianoacrilatos; poli(carbonato de trimetileno); poli(iminocarbonato); copoli(éter-ésteres) (por ejemplo, copolímeros de poli(óxido de etileno)-poli(ácido láctico) (PEO/PLA)); oxalatos de polialquileno; polifosfacenos; biomoléculas, tales como fibrina, fibrinógeno, celulosa, almidón, colágeno y ácido hialurónico; poliuretanos; siliconas; poliésteres; poliolefinas; copolímeros de poliisobutileno y etileno-alfaolefina; polímeros y copolímeros acrílicos; polímeros y copolímeros de haluro de vinilo, tales como cloruro de polivinilo; polivinil éteres, tales como polivinil metil éter; haluros de polivinilideno, tales como fluoruro de polivinilideno y cloruro de polivinilideno; poliacrilonitrilo; polivinil cetonas; aromáticos de polivinilo, tales como poliestireno; ésteres de polivinilo, tales como acetato de polivinilo; copolímeros de monómeros de vinilo entre sí y con olefinas, tales como copolímeros de etileno-metacrilato de metilo, copolímeros de acrilonitrilo-estireno, resinas ABS y copolímeros de etileno-acetato de vinilo; poliamidas, tales como Nylon 66 y policaprolactama; resinas alquídicas; policarbonatos; polioximetilenos; poliimidas; poliéteres; resinas epoxi; poliuretanos; rayón; triacetato de rayón; celulosa; acetato de celulosa; butirato de celulosa; acetato butirato de celulosa; celofán; nitrato de celulosa; propionato de celulosa; éteres de celulosa; Teflon amorfo; poli(etilenglicol); y carboximetilcelulosa.
Los polímeros sintéticos adecuados incluyen poli(etilenglicol), poli(propilenglicol), poli (alcohol vinílico) de cadena lineal o ramificada sustituidos y no sustituidos y derivados de los mismos, por ejemplo, poli(etilenglicol) sustituido tal como metoxipoli(etilenglicol) y derivados del mismo. Los polímeros de origen natural adecuados incluyen, por ejemplo, albúmina, amilosa, dextrano, glucógeno y derivados de los mismos.
Los polímeros adecuados pueden tener un peso molecular promedio en un intervalo de 500 Da a 50000 Da, por ejemplo, de 5000 Da a 40000 Da, o de 25000 a 40000 Da. Por ejemplo, en algunas realizaciones, donde un anticuerpo de la presente comprende un polímero de poli(etilenglicol) (PEG) o metoxipoli(etilenglicol), el polímero de PEG o metoxipoli(etilenglicol) puede tener un peso molecular en un intervalo de aproximadamente 0,5 kiloDaltons (kDa) a 1 kDa, de aproximadamente 1 kDa a 5 kDa, de 5 kDa a 10 kDa, de 10 kDa a 25 kDa, de 25 kDa a 40 kDa, o de 40 kDa a 60 kDa. Como se señaló anteriormente, en algunas realizaciones, un anticuerpo de la presente está unido covalentemente a un polímero PEG. En algunas realizaciones, un multímero scFv de la presente está unido covalentemente a un polímero de PEG. Véase, por ejemplo, Albrecht y col. (2006) J. Immunol. Methods 310: 100. Los procedimientos y reactivos adecuados para la PEGilación de una proteína son bien conocidos en la técnica y se pueden encontrar en, por ejemplo, en la patente estadounidense N° 5.849.860. El PEG adecuado para la conjugación con una proteína es generalmente soluble en agua a temperatura ambiente y tiene la fórmula general R(O-CH2-CH2)nO, donde R es hidrógeno o un grupo protector tal como un grupo alquilo o alcanol, y donde n es un número entero de 1 a 1000. Cuando R es un grupo protector, generalmente tiene de 1 a 8 carbonos.
El PEG conjugado con el anticuerpo de la presente puede ser lineal. El PEG conjugado con la proteína de la presente también puede ser ramificado. Derivados de PEG ramificados como los descritos en la patente estadounidense No.
5.643.575, “PEG de estrella” y PEG de múltiples brazos tales como los descritos en el Catálogo de Shearwater Polymers, Inc. “Polyethylene Glycol Derivatives 1997-1998”. Los PEG en estrella se describen en la técnica que incluyen, por ejemplo, en la patente estadounidense N° 6.046.305.
Un anticuerpo de la presente puede estar glicosilado, por ejemplo, un anticuerpo de la presente puede comprender un resto carbohidrato o polisacárido unido covalentemente. Normalmente, la glicosilación de los anticuerpos es mediante unión a N o unión a O. Con “unida a N” se hace referencia a la unión del resto carbohidrato a la cadena lateral de un residuo asparagina. Las secuencias de tripéptido asparagina-X-serina y asparagina-X-treonina, donde X es cualquier aminoácido menos prolina, son las secuencias de reconocimiento para la unión enzimática del resto de carbohidrato a la cadena lateral de asparagina. Por lo tanto, la presencia de cualquiera de estas secuencias de tripéptido en un polipéptido crea un posible sitio de glicosilación. La glicosilación unida con O hace referencia al acoplamiento de uno de los azúcares N-acetilgalactosamina, galactosa o xilosa a un ácido hidroxiamino, más comúnmente serina o treonina, aunque también se puede utilizar 5-hidroxiprolina o 5-hidroxilisina.
La adición de sitios de glicosilación al anticuerpo se logra de forma conveniente mediante la alteración de la secuencia de aminoácidos de forma tal que contenga una o más de las secuencias de tripéptidos descritas anteriormente (para los sitios de glicosilación unidos a N). La modificación también puede realizarse mediante la adición o sustitución por uno o más residuos de serina o treonina en la secuencia del anticuerpo original (para sitios de glicosilación unidos a O). De manera similar, la eliminación de los sitios de glicosilación se puede lograr mediante la alteración de aminoácidos dentro de los sitios de glicosilación nativos de un anticuerpo.
Un anticuerpo de la presente en algunas realizaciones comprenderá un marcador “radiopaco”, por ejemplo, un marcador que se puede visualizar fácilmente usando, por ejemplo, rayos X. Los materiales radiopacos son bien conocidos por los expertos en la materia. Los materiales radiopacos más comunes incluyen yoduro, bromuro o sales de bario. También se conocen otros materiales radiopacos e incluyen, entre otros, derivados orgánicos de bismuto (véase, por ejemplo, la patente estadounidense No. 5.939.045), multiuretanos radiopacos (véase la patente estadounidense No. 5.346.981), compuestos de organobismuto (véase, por ejemplo, la patente estadounidense No. 5.256.334), complejos multiméricos de bario radiopacos (véase, por ejemplo, la patente estadounidense No. 4.866.132), y similares.
Un anticuerpo de la presente se puede unir covalentemente a un segundo resto (por ejemplo, un lípido, un polipéptido distinto de un anticuerpo de la presente, un polímero sintético, un carbohidrato y similares) usando, por ejemplo, glutaraldehído, un reticulante homobifuncional o un reticulante heterobifuncional. El glutaraldehído reticula polipéptidos a través de sus restos amino. Los reticuladores homobifuncionales (por ejemplo, un imidoéster homobifuncional, un éster homobifuncional de N-hidroxisuccinimidilo (NHS) o un reticulante reactivo de sulfhidrilo homobifuncional) contienen dos o más restos reactivos idénticos y pueden usarse en un procedimiento de reacción de una sola etapa en el que el reticulante se añade a una solución que contiene una mezcla de los polipéptidos a unir. El éster de n Hs homobifuncional y los ésteres de imido reticulan polipéptidos que contienen amina. En un pH alcalino leve, los ésteres de imido reaccionan solo con aminas primarias para formar imidoamidas, y la carga general de los polipéptidos reticulados no se ve afectada. Los reticulantes reactivos con sulfhidrilo homobifuncionales incluyen bismaleimidhexano (BMH), 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenceno (DFDNB) y 1,4-di-(3',2'-piridilditio)propinoamidobutano (DPDPB).
Los reticulantes heterobifuncionales tienen dos o más restos reactivos diferentes (por ejemplo, resto reactivo con amina y un resto reactivo con sulfhidrilo) y se reticulan con uno de los polipéptidos a través del resto reactivo con amina o sulfhidrilo, y luego reaccionan con el otro polipéptido a través del resto no reaccionado. Se encuentran disponibles múltiples reticulantes de haloacetilo heterobifuncionales, así como reticulantes de disulfuro de piridilo. Las carbodiimidas son un ejemplo clásico de reactivos reticulantes heterobifuncionales para acoplar carboxilos a aminas, lo que da como resultado un enlace amida.
Un anticuerpo de la presente puede inmovilizarse sobre un soporte sólido. Los soportes adecuados son bien conocidos en la técnica y comprenden, entre otros, materiales de columna disponibles en el mercado, perlas de poliestireno, perlas de látex, perlas magnéticas, partículas de metal coloidal, virutas y superficies de vidrio y/o silicio, tiras de nitrocelulosa, membranas de nylon, láminas, duracitos, pocillos de bandejas de reacción (por ejemplo, placas multipocillo), tubos de plástico, etc. Un soporte sólido puede comprender cualquiera de una variedad de sustancias, que incluyen, por ejemplo, vidrio, poliestireno, cloruro de polivinilo, polipropileno, polietileno, policarbonato, dextrano, nylon, amilosa, celulosas naturales y modificadas, poliacrilamidas, agarosas y magnetita. Los procedimientos adecuados para inmovilizar un anticuerpo de la presente sobre un soporte sólido son bien conocidos e incluyen, pero no se limitan a, interacciones iónicas, hidrófobas, covalentes y similares. Los soportes sólidos pueden ser solubles o insolubles, por ejemplo, en solución acuosa. En algunas realizaciones, un soporte sólido adecuado es generalmente insoluble en una solución acuosa.
Un anticuerpo de la presente en algunas realizaciones comprenderá un marcador detectable. Los marcadores detectables adecuados incluyen cualquier composición detectable mediante mecanismos espectroscópicos, fotoquímicos, bioquímicos, inmunoquímicos, eléctricos, ópticos o químicos. Adecuado incluye, pero no se limita a, perlas magnéticas (por ejemplo, Dynabeads™), colorantes fluorescentes (por ejemplo, isotiocianato de fluoresceína, rojo texas, rodamina, una proteína fluorescente verde, una proteína fluorescente roja, una proteína fluorescente amarilla y similares), radiomarcadores (por ejemplo 3H, 125I, 35S, 14C o 32P), enzimas (por ejemplo, peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina, luciferasa y otras comúnmente utilizadas en un enzimoinmunoanálisis de adsorción (ELISA)), y marcadores colorimétricos tales como perlas de oro coloidal o vidrio o plástico coloreado (por ejemplo, poliestireno, polipropileno, látex, etc.).
En algunas realizaciones, un anticuerpo de la presente comprende un agente de contraste o un radioisótopo, donde el agente de contraste o radioisótopo es uno que es adecuado para su uso en imagenología, por ejemplo, procedimientos de imagenología realizados en seres humanos. Ejemplos no limitantes de marcadores incluyen radioisótopos tales como 1231I (yodo) 18F (flúor), 99Tc (tecnecio), 111In (indio), y 67Ga (galio) y agentes de contraste tales como gadolinio (Gd), disprosio y hierro. Isótopos radiactivos de Gd (153Gd) también están disponibles y son adecuados para procedimientos de imagenología en mamíferos no humanos. Un anticuerpo de la presente puede marcarse usando técnicas estándar. Por ejemplo, un anticuerpo de la presente puede yodarse usando cloramina T o 1,3,4,6-tetracloro-3a, 6a-difenilglicurilo. Para la fluoración, se añade flúor a un anticuerpo de la presente durante la síntesis mediante una reacción de desplazamiento de iones fluoruro. Véase, Muller-Gartner, H., TIB Tech., 16: 122-130 (1998) y Saji, H., Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst., 16 (2): 209-244 (1999) para una revisión de la síntesis de proteínas con dichos radioisótopos. Un anticuerpo de la presente también puede marcarse con un agente de contraste a través de técnicas estándar. Por ejemplo, un anticuerpo de la presente puede marcarse con Gd conjugando quelatos de Gd de bajo peso molecular tales como ácido dietilentriaminopentaacético de Gd (GdDTPA) o tetraazaciclododecanotetraacético de Gd (GdDOTA) al anticuerpo. Véase, Caravan y col., Chem. Rev. 99: 2293-2352 (1999) y Lauffer y col., J. Magn. Reson. Imaging, 3: 11-16 (1985). Un anticuerpo de la presente puede marcarse con Gd, por ejemplo, conjugando quelatos de polilisina-Gd al anticuerpo. Véase, por ejemplo, Curtet y col., Invest. Radiol., 33 (10): 752-761 (1998) Como alternativa, un anticuerpo de la presente puede marcarse con Gd incubando liposomas paramagnéticos polimerizados que incluyen lípido quelante de Gd con avidina y anticuerpo biotinilado. Véase, por ejemplo, Sipkins y col., Nature Med., 4: 623-626 (1998).
Las proteínas fluorescentes adecuadas que se pueden unir a un anticuerpo de la presente incluyen, pero no se limitan a, una proteína fluorescente verde de Aequoria victoria o un mutante o derivado de la misma, por ejemplo, como se describe en las patentes estadounidenses No. 6.066.476; 6.020.192; 5.985.577; 5.976.796; 5.968.750; 5.968.738; 5.958.713; 5.919.445; 5.874.304; por ejemplo, GFP mejorada, muchas de dichas GFP que están disponibles en el mercado, por ejemplo, de Clontech, Inc.; una proteína fluorescente roja; una proteína fluorescente amarilla; cualquiera de una variedad de proteínas fluorescentes y coloreadas de especies de antozoos, como se describe en, por ejemplo, Matz y col. (1999) Nature Biotechnol. 17: 969-973; y similares.
Un anticuerpo de la presente en algunas realizaciones estará unido a (por ejemplo, unido covalentemente o no covalentemente) un socio de fusión, por ejemplo, un ligando; una marca epitópica; un péptido; una proteína que no sea un anticuerpo; y similares. Los compañeros de fusión adecuados incluyen péptidos y polipéptidos que confieren mejor estabilidad in vivo (por ejemplo, mejor semivida en suero), proporcionan facilidad de purificación, por ejemplo, (His)n, por ejemplo, 6His y similares, proporcionan secreción de la proteína de fusión de una célula, proporcionan una marca epitópica, por ejemplo, GST, hemaglutinina (HA, por ejemplo, YPYDVPDYA; SEQ ID NO: 71), FLAG (por ejemplo, DYKDDDDK; SEQ ID NO: 69), c-myc (por ejemplo, EQKLISEEDL; SEQ ID NO: 68) y similares, proporciona una señal detectable, por ejemplo, una enzima que genera un producto detectable (por ejemplo, p-galactosidasa, luciferasa) o una proteína que en sí puede se detectable, por ejemplo, una proteína fluorescente verde, una proteína fluorescente amarilla, etc., proporciona multimerización, por ejemplo, un dominio de multimerización tal como una parte Fc de una inmunoglobulina; y similares.
La fusión también puede incluir un dominio de afinidad, que incluye secuencias peptídicas que pueden interactuar con un socio de unión, por ejemplo, tal como uno inmovilizado en un soporte sólido, útil para identificación o purificación. Los aminoácidos individuales consecutivos, tales como histidina, cuando se fusionan con una proteína, se pueden usar para la purificación en una sola etapa de la proteína de fusión mediante la unión de alta afinidad a una columna de resina, tal como níquel-Sepharose. Los ejemplos de dominios de afinidad incluyen His5 (HHHHH) (SEQ ID NO: 66), HisX6 (HHHHHH) (SEQ ID NO: 67), C-myc (EQKLISEEDL) (SEQ ID NO: 68), Flag (DYKDDDDK) (SEQ ID NO: 69), StrepTag (WSHPQFEK) (SEQ ID NO: 70), hemaglutinina, por ejemplo, marca de HA (YPYDVPDYA) (SEQ ID NO: 71), glutatión-S-transferasa (GST), tiorredoxina, dominio de unión a celulosa, RYIRS (SEQ ID NO: 72), Phe-His-His-Thr (SEQ ID NO: 73), dominio de unión a quitina, péptido S, péptido T7, dominio SH2, marca de ARN de extremo C, WEAAAREACCRECCArA (SEQ ID NO:74), dominios de unión a metales, por ejemplo, dominios de unión a cinc o dominios de unión a calcio tales como los de las proteínas de unión a calcio, por ejemplo, calmodulina, troponina C, calcineurina B, cadena ligera de miosina, recoverina, S-modulina, visinina, VILIP, neurocalcina, hipocalcina, frecuenina, caltractina, subunidad larga de calpaína, proteínas S100, parvalbúmina, calbindina D9K, calbindina D28K y calretinina, inteínas, biotina, estreptavidina, MyoD, secuencias de cremalleras de leucina y proteína de unión a maltosa.
Un anticuerpo de la presente se fusionará en algunas realizaciones a un polipéptido que se une a un receptor endógeno de la barrera hematoencefálica (BBB). Enlazar un anticuerpo de la presente a un polipéptido que se une a un receptor de la BBB endógeno facilita el cruce de la BBB, por ejemplo, en un procedimiento de tratamiento de la presente (véase más adelante) que implica la administración de un anticuerpo de la presente a un individuo que lo necesite. Los polipéptidos adecuados que se unen a un receptor de la BBB endógeno incluyen anticuerpos, por ejemplo, anticuerpos monoclonales, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que se unen específicamente a un receptor de la BBB endógeno. Los receptores de la BBB endógenos adecuados incluyen, pero no se limitan a, un receptor de insulina, un receptor de transferrina, un receptor de leptina, un receptor de lipoproteína y un receptor de factor de crecimiento similar a insulina. Véase, por ejemplo, la publicación de patente estadounidense N° 2009/0156498.
Como ejemplo, un anticuerpo anti-Tau de la presente puede ser un anticuerpo biespecífico que comprende una primera parte de unión a antígeno que se une específicamente a un epítopo en un polipéptido Tau (por ejemplo, un epítopo lineal dentro de una parte amino-terminal (N-terminal) de Tau, por ejemplo, dentro de los aminoácidos 1-25 de Tau, dentro de los aminoácidos 1-18 de Tau, o dentro de los aminoácidos 9 a 18 de Tau); y una segunda parte de unión a antígeno que se une a un receptor de la BBB endógeno. Por ejemplo, en algunos aspectos, un anticuerpo anti-Tau de la presente es un anticuerpo biespecífico que comprende una primera parte de unión a antígeno que se une específicamente a un epítopo en un polipéptido Tau (por ejemplo, un epítopo lineal dentro de una parte amino terminal (N-terminal) de Tau, por ejemplo, dentro de los aminoácidos 1-25 de Tau, dentro de los aminoácidos 1-18 de Tau, o dentro de los aminoácidos 9 a 18 de Tau); y una segunda parte de unión a antígeno que se une a un receptor de transferrina.
Por ejemplo, un anticuerpo anti-Tau de la presente descripción se puede fusionar a un péptido que facilita el cruce de la BBB, teniendo el péptido una longitud de aproximadamente 15 aminoácidos a aproximadamente 25 aminoácidos, y comprendiendo una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente el 85 % de identidad de secuencia de aminoácidos con uno de los siguientes péptidos: Angiopep-1 (TFFYGGCRGKRNNFKTEEY; SEQ ID NO: 75); Angiopep-2 (TFFYGGSRGKRNNFKTEEY; SEQ ID NO: 76); cys-Angiopep-2 (CTFFYGGSRGKRNNFKTEEY; SEQ ID NO: 77); Angiopep-2-cys (TFFYGGSRGKRNNFKTEEYC; SEQ ID NO: 78); y un fragmento de aprotinina (TFVYg Gc RAKRn Nf KS; SEQ ID NO: 79). Véanse, por ejemplo, las publicaciones de patentes No. 2011/0288011; y 2009/0016959. Un péptido que facilita el cruce de la BBB puede fusionarse al extremo N de una región de cadena ligera anti-Tau, al extremo C de una región de cadena ligera anti-Tau, al extremo N de una región de cadena pesada anti-Tau, al extremo C de una región de cadena pesada anti-Tau, al extremo N de un anticuerpo de cadena sencilla anti-Tau de la presente, al extremo C de un anticuerpo de cadena sencilla anti-Tau de la presente, etc.
En algunas realizaciones, un anticuerpo de la presente comprende una modificación de poliamina. La modificación de poliamina de un anticuerpo de la presente aumenta la permeabilidad del anticuerpo modificado en la BBB. Un anticuerpo de la presente puede modificarse con poliaminas que sean de origen natural o sintéticas. Véase, por ejemplo, la patente estadounidense N° 5.670.477. Las poliaminas útiles de origen natural incluyen putrescina, espermidina, espermina, 1,3-diaminopropano, norspermidina, sinhomospermidina, termina, termospermina, caldopentamina, homocaldopentamina y canavalmina. La putrescina, la espermidina y la espermina son particularmente útiles. Las poliaminas sintéticas están compuestas por la fórmula empírica CxHyNz, pueden ser cadenas de hidrocarburos cíclicos o acíclicos, ramificados o no ramificados de 3-12 átomos de carbono que además incluyen 1-6 restos NR o N(R)2 , donde R es H, alquilo (C1-C4), fenilo o bencilo. Las poliaminas se pueden unir a un anticuerpo utilizando cualquier procedimiento de reticulación estándar.
En algunas realizaciones, un anticuerpo de la presente se modifica para incluir un resto de carbohidrato, donde el resto de carbohidrato se puede unir covalentemente al anticuerpo. En algunas realizaciones, un anticuerpo de la presente se modifica para incluir un resto lipídico, donde el resto lipídico se puede unir covalentemente al anticuerpo. Los restos lipídicos adecuados incluyen, por ejemplo, un grupo acilo N-graso tal como N-lauroilo, N-oleoilo, etc.; una amina grasa tal como dodecil amina, oleoil amina, etc.; un lípido alifático de cadena larga C3-C16; y similares. Véase, por ejemplo, la patente estadounidense N.° 6.638.513). En algunas realizaciones, un anticuerpo de la presente se incorpora en un liposoma.
Procedimientos de producción de un anticuerpo de la presente
Se puede producir un anticuerpo de la presente mediante cualquier procedimiento conocido, por ejemplo, procedimientos sintéticos convencionales para síntesis de proteínas; procedimientos de ADN recombinante; etc.
Cuando un anticuerpo de la presente es un polipéptido de cadena sencilla, puede sintetizarse usando técnicas de síntesis de péptidos químicas estándar. Cuando se sintetiza químicamente un polipéptido, la síntesis puede llevarse a cabo mediante una fase líquida o una fase sólida. La síntesis de polipéptidos en fase sólida (SPPS), en la que el aminoácido C-terminal de la secuencia se une a un soporte insoluble seguido de la adición secuencial de los aminoácidos restantes en la secuencia, es un ejemplo de un procedimiento adecuado para la síntesis química de un anticuerpo de la presente. Diversas formas de SPpS, tales como Fmoc y Boc, están disponibles para sintetizar un anticuerpo de la presente. Las técnicas para la síntesis en fase sólida se describen por Barany y Merrifield, Solid-Phase Peptide Synthesis; págs. 3-284 en The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology. Vol. 2: Special Methods in Peptide Synthesis, Part A., Merrifield, y col. J. Am. Chem. Soc., 85: 2149-2156 (1963); Stewart y col., Solid Phase Peptide Synthesis, 2a ed. Pierce Chem. Co., Rockford, Ill. (1984); y Ganesan A. 2006 Mini Rev. Med Chem. 6:3-10 y Camarero JA y col. 2005 Protein Pept Lett. 12: 723-8. En resumen, las pequeñas perlas porosas insolubles se tratan con unidades funcionales sobre las que se construyen cadenas peptídicas. Después de ciclos repetidos de acoplamiento/desprotección, la amina N-terminal libre de una fase sólida unida se acopla a una única unidad de aminoácidos N-protegida. Esta unidad se desprotege y revela una nueva amina N-terminal a la que se puede unir un aminoácido adicional. El péptido permanece inmovilizado en la fase sólida y se somete a un proceso de filtración antes de ser escindido.
Se pueden usar procedimientos recombinantes estándar para la producción de un anticuerpo de la presente. Por ejemplo, los ácidos nucleicos que codifican regiones variables de cadena ligera y pesada, opcionalmente unidas a regiones constantes, se insertan en vectores de expresión. Las cadenas ligeras y pesadas se pueden clonar en los mismos o diferentes vectores de expresión. Los segmentos de ADN que codifican las cadenas de inmunoglobulina están unidos operativamente a secuencias de control en el o los vectores de expresión que garantizan la expresión de polipéptidos de inmunoglobulina. Las secuencias de control de la expresión incluyen, pero no se limitan a, promotores (por ejemplo, promotores asociados de forma natural o heterólogos), secuencias señal, elementos potenciadores y secuencias de terminación de la transcripción. Las secuencias de control de la expresión pueden ser sistemas promotores eucariotas en vectores capaces de transformar o transfectar células huésped eucariotas (por ejemplo, células COS o CHO). Una vez que el vector se ha incorporado al huésped apropiado, el huésped se mantiene en condiciones adecuadas para la expresión de alto nivel de las secuencias de nucleótidos, y la recolección y purificación de los anticuerpos.
Debido a la degeneración del código, una variedad de secuencias de ácido nucleico puede codificar cada secuencia de aminoácidos de inmunoglobulina. Las secuencias de ácido nucleico deseadas pueden producirse mediante síntesis de ADN en fase sólida de novo o mediante mutagénesis por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) de una variante preparada anteriormente del polinucleótido deseado. La mutagénesis mediada por oligonucleótidos es un ejemplo de un procedimiento adecuado para preparar variantes de sustitución, deleción e inserción del ADN del polipéptido diana. Véase Adelman y col., DNA 2: 183 (1983). En resumen, el ADN del polipéptido diana se altera hibridando un oligonucleótido que codifica la mutación deseada con una plantilla de ADN monocatenario. Después de la hibridación, se usa una ADN polimerasa para sintetizar una segunda cadena complementaria completa de la plantilla que incorpora el cebador oligonucleotídico y codifica la alteración seleccionada en el ADN del polipéptido diana.
Los vectores de expresión adecuados se replican normalmente en los organismos huésped como episomas o como una parte integral del ADN cromosómico del huésped. Comúnmente, los vectores de expresión contienen marcadores de selección (por ejemplo, resistencia a ampicilina, resistencia a higromicina, resistencia a tetraciclina, resistencia a kanamicina o resistencia a neomicina) para permitir la detección de aquellas células transformadas con las secuencias de ADN deseadas.
Escherichia coli es un ejemplo de una célula huésped procariota que puede usarse para clonar un polinucleótido que codifica un anticuerpo de la presente. Otros huéspedes microbianos adecuados para su uso incluyen bacilos, tales como Bacillus subtilis, y otras enterobacterias, tales como Salmonella, Serratia y diversas especies de Pseudomonas. En estos huéspedes procariotas, también se pueden fabricar vectores de expresión, que normalmente contendrán secuencias de control de expresión compatibles con la célula huésped (por ejemplo, un origen de replicación). Además, estará presente cualquier variedad de promotores conocidos, tales como el sistema promotor de lactosa, un sistema promotor de triptófano (trp), un sistema promotor de beta-lactamasa o un sistema promotor de fago lambda. Los promotores normalmente controlarán la expresión, opcionalmente con una secuencia operadora, y tienen secuencias de sitio de unión a ribosomas y similares, para iniciar y completar la transcripción y la traducción.
Otros microbios, tales como levadura, también son útiles para la expresión. Saccharomyces (por ejemplo, S. cerevisiae) y Pichia son ejemplos de células huésped de levadura adecuadas, con vectores adecuados que tienen secuencias de control de la expresión (por ejemplo, promotores), un origen de replicación, secuencias de terminación y similares, según se desee. Los promotores típicos incluyen 3-fosfoglicerato cinasa y otras enzimas glicolíticas. Los promotores inducibles de levadura incluyen, entre otros, promotores de alcohol deshidrogenasa, isocitocromo C y enzimas responsables para la utilización de maltosa y galactosa.
Además de microorganismos, células de mamífero (por ejemplo, células de mamífero cultivadas en cultivo celular in vitro) también puede usarse para expresar y producir un anticuerpo anti-tau de la presente descripción (por ejemplo, polinucleótidos que codifican un anticuerpo anti-Tau de la presente). Véase Winnacker, From Genes to Clones, VCH Publishers, NY, Ny (1987). Las células huésped de mamífero adecuadas incluyen líneas celulares CHO, diversas líneas celulares Cos, células HeLa, líneas celulares de mieloma y linfocitos B transformados o hibridomas. Los vectores de expresión para estas células pueden incluir secuencias de control de la expresión, tales como un origen de replicación, un promotor, un potenciador (Queen y col., Immunol. Rev. 89: 49 (1986)), y sitios de información de procesamiento necesarios, tales como sitios de unión al ribosoma, sitios de splicing del ARN, sitios de poliadenilación y secuencias de terminación transcripcional. Ejemplos de secuencias de control de la expresión adecuadas son promotores derivados de genes de inmunoglobulina, SV40, adenovirus, virus del papiloma bovino, citomegalovirus y similares. Véase Co y col., J. Immunol. 148: 1149 (1992).
Una vez sintetizados (ya sea química o recombinantemente), los anticuerpos completos, sus dímeros, las cadenas ligeras y pesadas individuales u otras formas de un anticuerpo de la presente (por ejemplo, ScFv, etc.) se pueden purificar según los procedimientos estándar de la técnica, incluido precipitación con sulfato de amonio, columnas de afinidad, cromatografía en columna, purificación por cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC), electroforesis en gel y similares (véase en general Scopes, Protein Purification (Springer-Verlag, N.Y., (1982)). Un anticuerpo de la presente puede ser sustancialmente puro, por ejemplo, al menos aproximadamente del 80 % al 85 % puro, al menos aproximadamente del 85 % al 90 % puro, al menos aproximadamente del 90 % al 95 % puro, o del 98 % al 99 %, o más, puro, por ejemplo, libre de contaminantes tales como restos celulares, macromoléculas que no sean un anticuerpo de la presente, etc.
Composiciones
La presente descripción proporciona una composición que comprende un anticuerpo de la presente. Una composición de anticuerpo de la presente puede comprender, además de un anticuerpo de la presente, uno o más de: una sal, por ejemplo, NaCl, MgCh, KCl, MgSO4, etc.; un agente tamponante, por ejemplo, un tampón Tris, ácido N-(2-hidroxietil)piperazin-N'-(2-etanosulfónico) (HEPES), ácido 2-(N-morfolino)etanosulfónico (MES), sal sódica del ácido 2-(N-morfolino)etanosulfónico (MES), ácido 3-(N-morfolino)propanosulfónico (MOPS), ácido N- tris[hidroximetil]metil-3-aminopropanosulfónico (TAPS), etc.; un agente solubilizante; un detergente, por ejemplo, un detergente no iónico, tal como Tween-20, etc.; un inhibidor de proteasa; glicerol; y similares.
ÁCIDOS NUCLEICOS, VECTORES DE EXPRESIÓN Y CÉLULAS HUÉSPED
La presente descripción proporciona ácidos nucleicos que comprenden secuencias de nucleótidos que codifican un anticuerpo anti-Tau de la presente.
Una secuencia de nucleótidos que codifica el anticuerpo anti-Tau de la presente puede comprender una secuencia de nucleótidos que codifica una región variable de cadena ligera y que tiene al menos el 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia de nucleótidos con la secuencia de nucleótidos representada en la figura 1B y establecida en SEQ ID NO: 17.
Una secuencia de nucleótidos que codifica el anticuerpo anti-Tau de la presente puede comprender una secuencia de nucleótidos que codifica una región variable de cadena pesada y que tiene al menos el 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia de nucleótidos con la secuencia de nucleótidos representada en la figura 1A y establecida en SEQ ID NO: 18.
Una secuencia de nucleótidos que codifica el anticuerpo anti-Tau de la presente puede comprender una secuencia de nucleótidos que codifica una región variable de cadena ligera y que tiene al menos el 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia de nucleótidos con la secuencia de nucleótidos representada en la figura 2B y establecida en SEQ ID NO: 19.
Una secuencia de nucleótidos que codifica el anticuerpo anti-Tau de la presente puede comprender una secuencia de nucleótidos que codifica una región variable de cadena pesada y que tiene al menos el 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia de nucleótidos con la secuencia de nucleótidos representada en la figura 2A y establecida en SEQ ID NO: 20.
Una secuencia de nucleótidos que codifica un anticuerpo de la presente puede unirse operativamente a uno o más elementos reguladores, tales como un promotor y potenciador, que permiten la expresión de la secuencia de nucleótidos en las células diana deseadas (por ejemplo, una célula que está modificada genéticamente para sintetizar el anticuerpo codificado).
Los elementos promotores y potenciadores adecuados son conocidos en la técnica. Para la expresión en una célula bacteriana, los promotores adecuados incluyen, pero sin limitarse a, lacI, lacZ, T3, T7, gpt, lambda P y trc. Para la expresión en una célula eucariota, los promotores adecuados incluyen, pero sin limitarse a, elementos potenciadores y promotores del gen de inmunoglobulina de cadena pesada y/o ligera; promotor temprano inmediato de citomegalovirus; promotor de timidina cinasa del herpes simple; promotores temprano y tardío de SV40; promotor presente en repeticiones terminales largas de retrovirus; promotor de la metalotioneína I de ratón; y diversos promotores específicos de tejido conocidos en la técnica.
En algunas realizaciones, por ejemplo, para la expresión en una célula de levadura, un promotor adecuado es un promotor constitutivo tal como un promotor ADH1, un promotor PGK1, un promotor ENO, un promotor PYK1 y similares; o un promotor regulable tal como un promotor GAL1, un promotor GAL10, un promotor ADH2, un promotor p HO5, un promotor CUP1, un promotor GAL7, un promotor MET25, un promotor MET3, un promotor CYC1, un promotor HIS3, un promotor ADH1, un promotor PGK, un promotor GAPDH, un promotor ADC1, un promotor TRP1, un promotor URA3, un promotor LEU2, un promotor ENO, un promotor TP1 y AOX1 (por ejemplo, para su uso en Pichia). La selección del vector y promotor apropiado está dentro del nivel de habilidad ordinaria en la técnica.
Los promotores adecuados para su uso en células huésped procariotas incluyen, pero no se limitan a, un promotor de ARN polimerasa de bacteriófago T7; un promotor trp; un promotor de operón lac; un promotor híbrido, por ejemplo, un promotor híbrido lac/tac, un promotor híbrido tac/trc, un promotor trp/lac, un promotor T7/lac; un promotor trc; un promotor tac y similares; un promotor araBAD; promotores regulados in vivo, tales como un promotor ssaG o un promotor relacionado (véase, por ejemplo, la Publicación de Patente No. 20040131637), un promotor pagC (Pulkkinen y Miller, J. Bacteriol., 1991: 173(1): 86-93; Alpuche-Aranda y col., PNAS, 1992; 89 (21): 10079-83), un promotor nirB (Harborne y col. (1992) Mol. Micro. 6: 2805-2813), y similares (véase, por ejemplo, Dunstan y col. (1999) Infect. Immun. 67: 5133­ 5141; McKelvie y col. (2004) Vaccine 22: 3243-3255; y Chatfield y col. (1992) Biotechnol. 10: 888-892); un promotor sigma70, por ejemplo, un promotor sigma70 de consenso (véase, por ejemplo, los números de acceso al GenBank AX798980, AX798961 y AX798183); un promotor de fase estacionaria, por ejemplo, un promotor dps, un promotor spv y similares; un promotor derivado de la isla de patogenicidad SPI-2 (véase, por ejemplo, WO96/17951); un promotor de actA (véase, por ejemplo, Shetron-Rama y col. (2002) Infect. Immun. 70: 1087-1096); un promotor rpsM (véase, por ejemplo, Valdivia y Falkow (1996). Mol. Microbiol 22: 367); un promotor tet (véase, por ejemplo, Hillen, W. y Wissmann, A. (1989) En Saenger, W. y Heinemann, U. (eds), Topics in Molecular and Structural Biology, Protein-Nucleic Acid Interaction. Macmillan, Londres, Reino Unido, vol. 10, págs. 143-162); un promotor SP6 (véase, por ejemplo, Melton y col. (1984) Nucl. Acids Res. 12: 7035); y similares. Promotores fuertes adecuados para su uso en procariotas tales como Escherichia coli incluyen, pero sin limitarse a, Trc, Tac, T5, T7 y PLambda. Los ejemplos no limitantes de operadores para su uso en células huésped bacterianas incluyen un operador del promotor de lactosa (la proteína represora LacI cambia de conformación cuando se pone en contacto con la lactosa, evitando así que la proteína represora LacI se una al operador), un operador del promotor de triptófano (cuando forma complejo con triptófano, la proteína represora TrpR tiene una conformación que se une al operador; en ausencia de triptófano, la proteína represora TrpR tiene una conformación que no se une al operador) y un operador del promotor tac (véase, por ejemplo, deBoer y col. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 80: 21-25).
Una secuencia de nucleótidos que codifica un anticuerpo de la presente puede estar presente en un vector de expresión y/o un vector de clonación. Cuando un anticuerpo de la presente comprende dos polipéptidos separados, las secuencias de nucleótidos que codifican los dos polipéptidos pueden clonarse en el mismo o en vectores separados. Un vector de expresión puede incluir un marcador seleccionable, un origen de replicación y otras características que posibilitan la replicación y/o el mantenimiento del vector.
Los expertos en la materia conocen un gran número de vectores y promotores adecuados; muchos están disponibles en el mercado para generar una construcción recombinante de la presente. Los siguientes vectores se proporcionan a modo de ejemplo. Bacterianos: pBs, phagescript, PsiX174, pBluescript SK, pBs KS, pNH8a, pNH16a, pNH18a, pNH46a (Stratagene, La Jolla, California, EE. UU.); pTrc99A, pKK223-3, pKK233-3, pDR540 y pRIT5 (Pharmacia, Uppsala, Suecia). Eucariotas: pWLneo, pSV2cat, pOG44, PXR1, pSG (Stratagene) pSVK3, pBPV, pMSG y pSVL (Pharmacia). Los vectores de expresión generalmente tienen sitios de restricción convenientes ubicados cerca de la secuencia promotora para proporcionar la inserción de secuencias de ácido nucleico que codifican proteínas heterólogas. Puede estar presente un marcador seleccionable operativo en el huésped de expresión. Los vectores de expresión adecuados incluyen, pero no se limitan a, vectores virales (por ejemplo, vectores virales basados en virus vaccinia; poliovirus; adenovirus (véase, por ejemplo, Li et al., Invest Opthalmol Vis Sci 35: 25432549, 1994; Borras y col., Gene Ther 6: 515 524, 1999; Li y Davidson, PNAS 92: 77007704, 1995; Sakamoto y col., H Gene Ther 5: 10881097, 1999; WO 94/12649, WO 93/03769; WO 93/19191; WO 94/28938; WO 95/11984 y WO 95/00655); virus adenoasociado (véase, por ejemplo, Ali y col., Hum Gene Ther 9: 81 86, 1998, Flannery y col., PNAS 94: 69166921, 1997; Bennett y col., Invest Opthalmol Vis Sci 38: 28572863, 1997; Jomary y col., Gene Ther 4: 683690, 1997, Rolling y col., Hum Gene Ther 10: 641 648, 1999; Ali y col., Hum Mol Genet 5: 591 594, 1996; Srivastava en WO 93/09239, Samulski y col., J. Vir. (1989) 63: 3822­ 3828; Mendelson y col., Virol. (1988) 166: 154-165; y Flotte y col., PNAS (1993) 90: 10613-10617); SV40; virus del herpes simple; virus de inmunodeficiencia humana (véase, por ejemplo, Miyoshi y col., PNAS 94: 1031923, 1997; Takahashi y col., J Virol 73: 78127816, 1999); un vector retroviral (por ejemplo, virus de la leucemia murina, virus de la necrosis del bazo y vectores derivados de retrovirus tales como virus del sarcoma de Rous, virus del sarcoma de Harvey, virus de la leucosis aviar, un lentivirus, virus de la inmunodeficiencia humana, virus del sarcoma mieloproliferativo, y virus del tumor mamario); y similares.
Como se señaló anteriormente, un ácido nucleico de la presente comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un anticuerpo de la presente. Un ácido nucleico de la presente puede comprender una secuencia de nucleótidos que codifica CDR de cadena pesada y ligera de IPN001. En algunas realizaciones, un ácido nucleico de la presente comprende una secuencia de nucleótidos que codifica CDR de cadena pesada y ligera de IPN002, donde las secuencias que codifican CDR se intercalan con secuencias de nucleótidos que codifican FR. En algunas realizaciones, las secuencias de nucleótidos que codifican FR son secuencias de nucleótidos que codifican FR humanas.
Células huésped
La presente descripción proporciona células huésped modificadas genéticamente aisladas (por ejemplo, células in vitro) que están modificadas genéticamente con un ácido nucleico de la presente. En algunas realizaciones, una célula huésped modificada genéticamente aislada de la presente puede producir un anticuerpo de la presente.
Las células huésped adecuadas incluyen células huésped eucariotas, tales como una célula de mamífero, una célula huésped de insecto, una célula de levadura; y células procariotas, tales como una célula bacteriana. La introducción de un ácido nucleico de la presente en la célula huésped puede realizarse, por ejemplo, mediante precipitación con fosfato de calcio, transfección mediada por DEAE dextrano, transfección mediada por liposomas, electroporación u otro procedimiento conocido.
Las células de mamífero adecuadas incluyen células primarias y líneas celulares inmortalizadas. Las líneas celulares de mamífero adecuadas incluyen líneas celulares humanas, líneas celulares de primates no humanos, líneas celulares de roedores (por ejemplo, ratones, ratas) y similares. Las líneas celulares de mamífero adecuadas incluyen, pero sin limitarse a, células HeLa (por ejemplo, Colección americana de cultivos tipo (ATCC) n.° CCL-2), células CHO (por ejemplo, ATCC n.° CRL9618, c Cl61, c Rl9096), células 293 (por ejemplo, ATCC n.° CRL-1573), células Vero, células NlH 3T3 (por ejemplo, ATCC n.° CRL-1658), células Huh-7, células BHK (por ejemplo, ATCC n.° CCL10), células PC12 (ATCC n.° CRL1721), células COS, células COS-7 (ATCC n.° CRL1651), células RAT1, células L de ratón (ATCC n.° CCLI.3), células embrionarias de riñón humano (HEK) (ATCC n.° CRL1573), células HLHepG2 y similares. En algunos casos, las células son células HEK. En algunos casos, las células son células CHO, por ejemplo, células CHO-K1 (ATCC n.° CCL-61), células CHO-M, células CHO-DG44 (ATCC n.° PTA-3356) y similares.
Las células de levadura adecuadas incluyen, pero no se limitan a, Pichia pastoris, Pichia finlandica, Pichia trehalophila, Pichia koclamae, Pichia membranaefaciens, Pichia opuntiae, Pichia thermotolerans, Pichia salictaria, Pichia guercuum, Pichia pijperi, Pichia stiptis, Pichia methanolica, Pichia sp., Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces sp., Hansenula polymorpha, Kluyveromyces sp., Kluyveromyces lactis, Candida albicans, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Trichoderma reesei, Chrysosporium lucknowense, Fusarium sp., Fusarium gramineum, Fusarium venenatum, Neurospora crassa, Chlamydomonas reinhardtii, y similares.
Las células procariotas adecuadas incluyen, pero no se limitan a, cualquiera de una variedad de cepas de laboratorio de Escherichia coli, Lactobacillus sp., y similares. Véase, por ejemplo, Carrier y col. (1992) J. Immunol. 148: 1176-1181; patente estadounidense N° 6.447.784; y Sizemore y col. (1995) Science 270: 299-302. Normalmente, la cepa de laboratorio es una que no es patógena. Los ejemplos no limitantes de otras bacterias adecuadas incluyen, pero no se limitan a, Bacillus subtilis, y similares. En algunas realizaciones, la célula huésped es Escherichia coli.
FORMULACIONES FARMACÉUTICAS
La presente descripción proporciona composiciones, incluyendo composiciones farmacéuticas, que comprenden un anticuerpo de la presente. En general, una formulación comprende una cantidad efectiva de un anticuerpo de la presente. Una “cantidad efectiva” significa una dosis suficiente para producir un resultado deseado, por ejemplo, reducción de un síntoma adverso asociado con una tauopatía, mejoría de un síntoma de una tauopatía, disminución de la progresión de una tauopatía, etc. Generalmente, el resultado deseado es al menos una reducción de un síntoma de una tauopatía, en comparación con un control. Un anticuerpo de la presente puede administrarse de tal manera que se evite la barrera hematoencefálica, como se describe con más detalle a continuación. Un anticuerpo de la presente puede formularse y/o modificarse para permitir que el anticuerpo cruce la barrera hematoencefálica.
La presente descripción proporciona una formulación farmacéutica que comprende: a) un anticuerpo que se une específicamente a un epítopo dentro de una parte N-terminal de Tau, donde el anticuerpo comprende: (i) una VlCDR1 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 7; (ii) una VlCDR2 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 8; (iii) una VlCDR3 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 9; (iv) una Vh CDR1 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 10; (v) una VhCDR2 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 11; y (vi) una VhCDR3 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6 o SEQ ID NO: 12; y b) un excipiente farmacéuticamente aceptable adecuado para administración a un ser humano, donde la formulación está libre de endotoxinas.
La presente descripción proporciona una formulación farmacéutica que comprende: a) un anticuerpo monoclonal humanizado aislado que se une específicamente a un epítopo dentro de los aminoácidos 15-24 de un polipéptido Tau; y b) un excipiente farmacéuticamente aceptable, donde en algunas realizaciones el excipiente farmacéuticamente aceptable es adecuado para administración a un ser humano.
La presente descripción proporciona una formulación farmacéutica que comprende: A) un anticuerpo aislado que comprende una región de estructura de cadena ligera humanizada; y una región de estructura de cadena pesada humanizada, donde el anticuerpo aislado compite por unirse a un epítopo en una región N-terminal de un polipéptido Tau con un anticuerpo que comprende: a) una región de cadena ligera que comprende: i) una VlCDR1 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 7; (ii) una V lCDR2 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 8; y (iii) una VlCDR3 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 9; y b) una región de cadena pesada que comprende: (i) una VhCDR1 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 10; (ii) una VhCDR2 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 11; y (iii) una VhCDR3 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6 o SEQ ID NO: 12; y B) un excipiente farmacéuticamente aceptable, donde en algunas realizaciones el excipiente farmacéuticamente aceptable es adecuado para administración a un ser humano.
La presente descripción proporciona una formulación farmacéutica que comprende: A) un anticuerpo aislado, donde el anticuerpo es un Fv, scFv, Fab, F(ab')2 o Fab', y donde el anticuerpo compite por unirse a un epítopo en una región N-terminal de un polipéptido Tau con un anticuerpo que comprende: a) una región de cadena ligera que comprende: i) una VlCDR1 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 7; (ii) una VlCDR2 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 8; y (iii) una VlCDR3 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 9; y b) una región de cadena pesada que comprende: (i) una Vh CDR1 que comprende una secuencia de aminoácidos de s Eq ID NO: 4 o SEQ ID NO: 10; (ii) una VhCDR2 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 11; y (iii) una VhCDR3 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6 o SEQ ID NO: 12; y B) un excipiente farmacéuticamente aceptable, donde en algunas realizaciones el excipiente farmacéuticamente aceptable es adecuado para administración a un ser humano.
La presente descripción proporciona una formulación farmacéutica que comprende: A) un anticuerpo aislado, donde el anticuerpo aislado comprende una región constante de cadena ligera humana y una región constante de cadena pesada humana, y donde el anticuerpo aislado compite por unirse a un epítopo en una región N-terminal de un polipéptido Tau con un anticuerpo que comprende: a) una región de cadena ligera que comprende: i) una VlCDR1 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 7; (ii) una VlCDR2 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 8; y (iii) una VlCDR3 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 9; y b) una región de cadena pesada que comprende: (i) una VhCDR1 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 10; (ii) una VhCDR2 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 11; y (iii) una VhCDR3 que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6 o SEQ ID NO: 12; y B) un excipiente farmacéuticamente aceptable, donde en algunas realizaciones el excipiente farmacéuticamente aceptable es adecuado para administración a un ser humano.
Formulaciones
En los procedimientos de la presente, un anticuerpo de la presente puede administrarse al huésped usando cualquier medio conveniente capaz de dar como resultado el efecto terapéutico o efecto diagnóstico deseado. Por lo tanto, el agente puede incorporarse en una variedad de formulaciones para administración terapéutica. Más particularmente, un anticuerpo de la presente puede formularse en composiciones farmacéuticas por combinación con vehículos o diluyentes farmacéuticamente aceptables apropiados, y puede formularse en preparaciones en formas sólidas, semisólidas, líquidas o gaseosas, tales como comprimidos, cápsulas, polvos, gránulos, pomadas, soluciones, supositorios, inyecciones, inhalantes y aerosoles.
En formas de dosificación farmacéutica, un anticuerpo de la presente puede administrarse en forma de sus sales farmacéuticamente aceptables, o también puede usarse solo o en asociación apropiada, así como en combinación, con otros compuestos farmacéuticamente activos. Las siguientes formulaciones y procedimientos son meramente ejemplares y no son limitantes de manera alguna.
Para preparaciones orales, un anticuerpo de la presente puede usarse solo o en combinación con aditivos apropiados para fabricar comprimidos, polvos, gránulos o cápsulas, por ejemplo, con aditivos convencionales, tales como lactosa, manitol, almidón de maíz o almidón de patata; con aglutinantes, tales como celulosa cristalina, derivados de celulosa, goma arábiga, almidón de maíz o gelatinas; con disgregantes, tales como almidón de maíz, almidón de patata o carboximetilcelulosa de sodio; con lubricantes, como talco o estearato de magnesio; y, si se desea, con diluyentes, agentes tamponantes, agentes humectantes, conservantes y agentes aromatizantes.
Un anticuerpo de la presente puede formularse en preparaciones para inyección disolviéndolo, suspendiéndolo o emulsionándolo en un disolvente acuoso o no acuoso, tal como aceites vegetales u otros aceites similares, glicéridos de ácido alifáticos sintéticos, ésteres de ácidos alifáticos superiores o propilenglicol; y, si se desea, con aditivos convencionales tales como solubilizantes, agentes isotónicos, agentes de suspensión, agentes emulsionantes, estabilizantes y conservantes.
Las composiciones farmacéuticas que comprenden un anticuerpo de la presente se preparan mezclando el anticuerpo que tiene el grado deseado de pureza con vehículos, excipientes, estabilizantes, tensioactivos, tampones y/o agentes de tonicidad fisiológicamente aceptables opcionales. Los vehículos, excipientes y/o estabilizantes aceptables no son tóxicos para los receptores a las dosis y concentraciones empleadas, e incluyen tampones tales como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes que incluyen ácido ascórbico, glutatión, cisteína, metionina y ácido cítrico; conservantes (tales como etanol, alcohol bencílico, fenol, m-cresol, p-clor-m-cresol, metil o propil parabenos, cloruro de benzalconio o combinaciones de los mismos); aminoácidos tales como arginina, glicina, ornitina, lisina, histidina, ácido glutámico, ácido aspártico, isoleucina, leucina, alanina, fenilalanina, tirosina, triptófano, metionina, serina, prolina y combinaciones de los mismos; monosacáridos, disacáridos y otros carbohidratos; polipéptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 residuos); proteínas, tales como gelatina o albúmina sérica; agentes quelantes tales como EDTA; azúcares tales como trehalosa, sacarosa, lactosa, glucosa, manosa, maltosa, galactosa, fructosa, sorbosa, rafinosa, glucosamina, N-metilglucosamina, galactosamina y ácido neuramínico; y/o tensioactivos no iónicos tales como Tween, Brij Pluronics, Triton-X o polietilenglicol (PEG).
La composición farmacéutica puede estar en forma líquida, en forma liofilizada o en forma líquida reconstituida a partir de una forma liofilizada, donde la preparación liofilizada debe reconstituirse con una solución estéril antes de la administración. El procedimiento estándar para reconstituir una composición liofilizada es volver a añadir un volumen de agua pura (normalmente equivalente al volumen eliminado durante la liofilización); sin embargo, las soluciones que comprenden agentes antibacterianos pueden usarse para la producción de composiciones farmacéuticas para administración parenteral; véase también Chen (1992) Drug Dev Ind Pharm 18, 1311-54.
Las concentraciones de anticuerpos ejemplares en una composición farmacéutica de la presente pueden variar de aproximadamente 1 mg/ml a aproximadamente 200 mg/ml o de aproximadamente 50 mg/ml a aproximadamente 200 mg/ml, o de aproximadamente 150 mg/ml a aproximadamente 200 mg/ml.
Se puede preparar una formulación acuosa del anticuerpo en una solución tamponada con pH, por ejemplo, a un pH que varía de aproximadamente 4,0 a aproximadamente 7,0, o de aproximadamente 5,0 a aproximadamente 6,0, o como alternativa aproximadamente 5,5. Los ejemplos de tampones que son adecuados para un pH dentro de este intervalo incluyen tampones de fosfato, histidina, citrato, succinato, acetato y otros tampones de ácido orgánico. La concentración de tampón puede ser de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 100 mM, o de aproximadamente 5 mM a aproximadamente 50 mM, dependiendo, por ejemplo, del tampón y la tonicidad deseada de la formulación.
Se puede incluir un agente de tonicidad en la formulación del anticuerpo para modular la tonicidad de la formulación. Los agentes de tonicidad ejemplares incluyen cloruro de sodio, cloruro de potasio, glicerina y cualquier componente del grupo de aminoácidos, azúcares, así como combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones, la formulación acuosa es isotónica, aunque las soluciones hipertónicas o hipotónicas pueden ser adecuadas. El término “isotónica” denota una solución que tiene la misma tonicidad que alguna otra solución con la que se compara, tal como solución salina fisiológica 0 suero. Los agentes de tonicidad pueden usarse en una cantidad de aproximadamente 5 mM a aproximadamente 350 mM, por ejemplo, en una cantidad de 100 mM a 350 nM.
También se puede añadir un tensioactivo a la formulación del anticuerpo para reducir la agregación del anticuerpo formulado y/o minimizar la formación de partículas en la formulación y/o reducir la adsorción. Los tensioactivos ejemplares incluyen ésteres de ácido graso de polioxietilensorbitán (Tween), éteres de alquilpolioxietileno (Brij), éteres de alquilfenilpolioxietileno (Triton-X), copolímero de polioxietileno-polioxipropileno (Poloxamer, Pluronic) y dodecilsulfato de sodio (SDS). Ejemplos de ésteres de ácido graso de polioxietilenosorbitán adecuados son polisorbato 20 (vendido con la marca comercial Tween 20™) y polisorbato 80 (vendido con la marca comercial Tween 80™). Ejemplos de copolímeros de polietileno-polipropileno adecuados son los vendidos con los nombres de Pluronic® F68 o Poloxamer 188™. Ejemplos de éteres de alquilpolioxietileno adecuados son los vendidos con la marca registrada Brij™. Las concentraciones ejemplares de tensioactivo pueden variar de aproximadamente el 0,001 % a aproximadamente el 1 % p/v.
También se puede añadir un lioprotector para proteger el principio activo lábil (por ejemplo, una proteína) contra condiciones desestabilizadoras durante el proceso de liofilización. Por ejemplo, los lioprotectores conocidos incluyen azúcares (incluyendo glucosa y sacarosa); polioles (incluyendo manitol, sorbitol y glicerol); y aminoácidos (incluyendo alanina, glicina y ácido glutámico). Los lioprotectores pueden incluirse en una cantidad de aproximadamente 10 mM a 500 nM.
En algunas realizaciones, una formulación de la presente incluye un anticuerpo de la presente y uno o más de los agentes identificados anteriormente (por ejemplo, un tensioactivo, un tampón, un estabilizante, un agente de tonicidad) y está esencialmente libre de uno o más conservantes, tales como etanol, alcohol bencílico, fenol, m-cresol, p-clor-m-cresol, metil o propil parabenos, cloruro de benzalconio y combinaciones de los mismos. En otras realizaciones, se incluye un conservante en la formulación, por ejemplo, a concentraciones que varían de aproximadamente el 0,001 a aproximadamente el 2 % (p/v).
Por ejemplo, una formulación de la presente puede ser una formulación líquida o liofilizada adecuada para administración parenteral, y puede comprender: de aproximadamente 1 mg/ml a aproximadamente 200 mg/ml de un anticuerpo de la presente; de aproximadamente el 0,001 % a aproximadamente el 1 % de al menos un tensioactivo; de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 100 mM de un tampón; opcionalmente de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 500 mM de un estabilizante; y de aproximadamente 5 mM a aproximadamente 305 mM de un agente de tonicidad; y tiene un pH de aproximadamente 4,0 a aproximadamente 7,0.
Como otro ejemplo, una formulación parenteral de la presente es una formulación líquida o liofilizada que comprende: de aproximadamente 1 mg/ml a aproximadamente 200 mg/ml de un anticuerpo de la presente; el 0,04 % de Tween 20 p/v; L-histidina 20 mM; y sacarosa 250 mM; y tiene un pH de 5,5.
Como otro ejemplo, una formulación parenteral de la presente comprende una formulación liofilizada que comprende: 1) 15 mg/ml de un anticuerpo de la presente; el 0,04 % de Tween 20 p/v; L-histidina 20 mM; y sacarosa 250 mM; y tiene un pH de 5,5; o 2) 75 mg/ml de un anticuerpo de la presente; el 0,04 % de Tween 20 p/v; L-histidina 20 mM; y sacarosa 250 mM; y tiene un pH de 5,5; o 3) 75 mg/ml de un anticuerpo de la presente; el 0,02 % de Tween 20 p/v; L-histidina 20 mM; y sacarosa 250 mM; y tiene un pH de 5,5; o 4) 75 mg/ml de un anticuerpo de la presente; el 0,04 % de Tween 20 p/v; L-histidina 20 mM; y trehalosa 250 mM; y tiene un pH de 5,5; o 6) 75 mg/ml de un anticuerpo de la presente; el 0,02 % de Tween 20 p/v; L-histidina 20 mM; y trehalosa 250 mM; y tiene un pH de 5,5.
Como otro ejemplo, una formulación parenteral de la presente es una formulación líquida que comprende: 1) 7,5 mg/ml de un anticuerpo de la presente; el 0,022 % de Tween 20 p/v; L-histidina 120 mM; y sacarosa 250125 mM; y tiene un pH de 5,5; o 2) 37,5 mg/ml de un anticuerpo de la presente; el 0,02 % de Tween 20 p/v; L-histidina 10 mM; y sacarosa 125 mM; y tiene un pH de 5,5; o 3) 37,5 mg/ml de un anticuerpo de la presente; el 0,01 % de Tween 20 p/v; L-histidina 10 mM; y sacarosa 125 mM; y tiene un pH de 5,5; o 4) 37,5 mg/ml de un anticuerpo de la presente; el 0,02 % de Tween 20 p/v; L-histidina 10 mM; Trehalosa 125 mM; y tiene un pH de 5,5; o 5) 37,5 mg/ml de un anticuerpo de la presente; el 0,01 % de Tween 20 p/v; L-histidina 10 mM; y trehalosa 125 mM; y tiene un pH de 5,5; o 6) 5 mg/ml de un anticuerpo de la presente; el 0,02 % de Tween 20 p/v; L-histidina 20 mM; y trehalosa 250 mM; y tiene un pH de 5,5; o 7) 75 mg/ml de un anticuerpo de la presente; el 0,02 % de Tween 20 p/v; L-histidina 20 mM; y manitol 250 mM; y tiene un pH de 5,5; o 8) 75 mg/ml de un anticuerpo de la presente; el 0,02 % de Tween 20 p/v; L-histidina 20 mM; y cloruro de sodio 140 mM; y tiene un pH de 5,5; o 9) 150 mg/ml de un anticuerpo de la presente; el 0,02 % de Tween 20 p/v; L-histidina 20 mM; y trehalosa 250 mM; y tiene un pH de 5,5; o 10) 150 mg/ml de un anticuerpo de la presente; el 0,02 % de Tween 20 p/v; L-histidina 20 mM; y manitol 250 mM; y tiene un pH de 5,5; o 11) 150 mg/ml de un anticuerpo de la presente; el 0,02 % de Tween 20 p/v; L-histidina 20 mM; y cloruro de sodio 140 mM; y tiene un pH de 5,5; o 12) 10 mg/ml de un anticuerpo de la presente; el 0,01 % de Tween 20 p/v; L-histidina 20 mM; y cloruro de sodio 40 mM; y tiene un pH de 5,5.
Un anticuerpo de la presente puede utilizarse en formulación de aerosol para administrarse por inhalación. Un anticuerpo de la presente puede formularse en propulsores aceptables a presión tales como diclorodifluorometano, propano, nitrógeno y similares.
Además, un anticuerpo de la presente puede convertirse en supositorios mezclándolo con una variedad de bases tales como bases emulsionantes o bases solubles en agua. Un anticuerpo de la presente puede administrarse por vía rectal a través de un supositorio. El supositorio puede incluir vehículos tales como manteca de cacao, Carbowaxes y polietilenglicoles, que se derriten a la temperatura corporal, pero se solidifican a temperatura ambiente.
Se pueden proporcionar formas de dosificación unitarias para administración oral o rectal, tales como jarabes, elixires y suspensiones, donde cada unidad de dosificación, por ejemplo, cucharadita, cucharada, comprimido o supositorio, contiene una cantidad predeterminada de la composición que contiene uno o más inhibidores. De manera similar, las formas de dosificación unitaria para inyección o administración intravenosa pueden comprender un anticuerpo de la presente en una composición como una solución en agua estéril, solución salina normal u otro vehículo farmacéuticamente aceptable.
La expresión “forma de dosificación unitaria”, como se usa en el presente documento, se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como dosificaciones unitarias para sujetos humanos y animales, conteniendo cada unidad una cantidad predeterminada de un anticuerpo anti-Tau de la presente descripción, calculada en una cantidad suficiente para producir el efecto deseado en asociación con un diluyente, portador o vehículo farmacéuticamente aceptable. Las especificaciones para un anticuerpo de la presente pueden depender del anticuerpo particular empleado y el efecto a lograr, y de la farmacodinámica asociada con cada anticuerpo en el huésped.
Otros modos de administración también encontrarán uso con un procedimiento de la presente descripción. Por ejemplo, un anticuerpo de la presente puede formularse en supositorios y, en algunos casos, en aerosol y composiciones intranasales. Para los supositorios, la composición del vehículo incluirá aglutinantes y portadores tradicionales tales como polialquilenglicoles o triglicéridos. Dichos supositorios pueden formarse a partir de mezclas que contienen el principio activo en el intervalo de aproximadamente el 0,5 % a aproximadamente el 10 % (p/p), por ejemplo, de aproximadamente el 1 % a aproximadamente el 2 %.
Las formulaciones intranasales generalmente incluirán vehículos que no causan irritación en la mucosa nasal ni alteran significativamente la función ciliar. Se pueden emplear diluyentes tales como agua, solución salina acuosa u otras sustancias conocidas. Las formulaciones nasales también pueden contener conservantes tales como, pero sin limitarse a, clorobutanol y cloruro de benzalconio. Puede estar presente un tensioactivo para mejorar la absorción del anticuerpo de la presente por la mucosa nasal.
Un anticuerpo de la presente puede administrarse como una formulación inyectable. Normalmente, las composiciones inyectables se preparan como soluciones o suspensiones líquidas; también se pueden preparar formas sólidas adecuadas para solución en, o suspensión en, vehículos líquidos antes de la inyección. La preparación también puede emulsionarse, o el anticuerpo encapsularse en vehículos liposomas.
Los vehículos excipientes adecuados son, por ejemplo, agua, solución salina, dextrosa, glicerol, etanol o similares, y combinaciones de los mismos. Además, si se desea, el vehículo puede contener cantidades menores de sustancias auxiliares tales como agentes humectantes o emulsionantes o agentes tamponantes del pH. Los procedimientos exactos de preparación de tales formas de dosificación son conocidos, o serán evidentes, para los expertos en la materia. Véase, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania, 17a edición, 1985.La composición o formulación a administrar contendrá, en cualquier caso, una cantidad de un anticuerpo de la presente adecuada para alcanzar el estado deseado en el sujeto que está siendo tratado.
Los excipientes farmacéuticamente aceptables, tales como vehículos, adyuvantes, portadores o diluyentes, están fácilmente disponibles para el público. Además, están fácilmente disponibles sustancias auxiliares farmacéuticamente aceptables, tales como agentes de ajuste y tamponantes del pH, agentes de ajuste de la tonicidad, estabilizantes, agentes humectantes y similares.
En algunas realizaciones, un anticuerpo de la presente se formula en una formulación de liberación controlada. Las preparaciones de liberación sostenida pueden prepararse usando procedimientos bien conocidos en la técnica. Ejemplos adecuados de preparaciones de liberación sostenida incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrófobos sólidos que contienen el anticuerpo en el que las matrices están en forma de artículos conformados, por ejemplo películas o microcápsulas. Los ejemplos de matrices de liberación sostenida incluyen poliésteres, copolímeros de ácido L-glutámico y etil-L-glutamato, etileno-acetato de vinilo no degradable, hidrogeles, polilactidas, copolímeros degradables de ácido láctico-ácido glicólico y ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico. La posible pérdida de actividad biológica y los posibles cambios en la inmunogenicidad de los anticuerpos comprendidos en las preparaciones de liberación sostenida pueden impedirse usando aditivos apropiados, controlando el contenido de humedad y desarrollando composiciones de matriz polimérica específicas.
Se puede considerar que la liberación controlada dentro del alcance de la presente descripción significa cualquiera de varias formas de dosificación de liberación prolongada. Los siguientes términos pueden considerarse sustancialmente equivalentes a la liberación controlada, para los fines de la presente descripción: liberación continua, liberación controlada, liberación retardada, depósito, liberación gradual, liberación a largo plazo, liberación programada, liberación prolongada, liberación proporcional, liberación persistente, repositorio, retardo, liberación lenta, liberación espaciada, liberación sostenida, recubrimiento temporizado, liberación temporizada, acción retardada, acción prolongada, acción temporizada en capas, de acción duradera, acción prolongada, acción repetida, de acción lenta, acción sostenida, medicamentos de acción sostenida y liberación prolongada. Se pueden encontrar más análisis sobre estos términos en Lesczek Krowczynski, Extended-Release Dosage Forms, 1987 (CRC Press, Inc.).
Las diversas tecnologías de liberación controlada cubren un espectro muy amplio de formas de dosificación de fármacos. Las tecnologías de liberación controlada incluyen, pero no se limitan a, sistemas físicos y sistemas químicos.
Los sistemas físicos incluyen, pero sin limitarse a, sistemas de depósito con membranas de control de velocidad, tales como microencapsulación, macroencapsulación y sistemas de membrana; sistemas de depósito sin membranas de control de velocidad, tales como fibras huecas, triacetato de celulosa ultra microporosa y sustratos poliméricos porosos y espumas; sistemas monolíticos, incluidos aquellos sistemas disueltos físicamente en matrices no porosas, poliméricas o elastoméricas (por ejemplo, no erosionables, erosionables, entrada de agentes ambientales y degradables), y materiales dispersados físicamente en matrices no porosas, poliméricas o elastoméricas (por ejemplo, no erosionables, erosionables, entrada de agentes ambientales y degradables); estructuras laminadas, incluyendo capas de depósito químicamente similares o diferentes a las capas de control externas; y otros procedimientos físicos, tales como bombas osmóticas o adsorción sobre resinas de intercambio iónico.
Los sistemas químicos incluyen, pero no se limitan a, erosión química de matrices poliméricas (por ejemplo, erosión heterogénea u homogénea), o erosión biológica de una matriz polimérica (por ejemplo, heterogénea u homogénea). Se puede encontrar un análisis adicional de categorías de sistemas para liberación controlada en Agis F. Kydonieus, Controlled Release Technologies: Methods, Theory and Applications, 1980 (CRC Press, Inc.).
Hay una serie de formulaciones de fármacos de liberación controlada que se desarrollan para administración por vía oral. Estas incluyen, pero no se limitan a, sistemas de administración gastrointestinal controlados por presión osmótica; sistemas de administración gastrointestinal controlados por presión hidrodinámica; sistemas de administración gastrointestinal controlados por permeación de membrana, que incluyen dispositivos microporosos de administración gastrointestinal controlados por permeación de membrana; dispositivos de administración gastrointestinal de liberación controlada dirigidos al intestino resistentes a los fluidos gástricos; sistemas de administración gastrointestinal controlados por difusión de gel; y sistemas de administración gastrointestinal controlados por intercambio iónico, que incluyen fármacos catiónicos y aniónicos. Se puede encontrar información adicional sobre los sistemas de liberación controlada de fármacos en Yie W. Chien, Novel Drug Delivery Systems, 1992 (Marcel Dekker, Inc.).
Dosificaciones
Una dosificación adecuada puede determinarse por un médico tratante u otro personal médico calificado, basándose en diversos factores clínicos. Tal como se conoce en la técnica médica, las dosificaciones para cualquier paciente dependen de muchos factores, incluida la talla del paciente, el área de superficie del cuerpo, la edad, el compuesto particular a administrar, el sexo del paciente, el momento y la vía de administración, la salud general y otros fármacos que se administren simultáneamente. Un anticuerpo de la presente puede administrarse en cantidades entre 1 ng/kg de peso corporal y 20 mg/kg de peso corporal por dosis, por ejemplo, entre 0,1 mg/kg de peso corporal y 10 mg/kg de peso corporal, por ejemplo, entre 0,5 mg/kg de peso corporal y 5 mg/kg de peso corporal; sin embargo, se contemplan dosis por debajo o por encima de este intervalo ejemplar, considerando especialmente los factores mencionados anteriormente. Si el régimen es una infusión continua, también puede estar en el intervalo de 1 |jg a 10 mg por kilogramo de peso corporal por minuto.
Los expertos en la materia observarán fácilmente que los niveles de dosis pueden variar en función del anticuerpo específico, la gravedad de los síntomas y la susceptibilidad del sujeto a los efectos secundarios. Las dosis preferidas para un determinado compuesto pueden ser determinadas fácilmente por los expertos en la materia mediante una diversidad de medios.
Vías de administración
Se administra un anticuerpo de la presente a un individuo usando cualquier procedimiento y vía disponibles adecuados para la administración de fármacos, incluyendo procedimientos in vivo y ex vivo, así como vías de administración sistémicas y localizadas.
Las vías de administración convencionales y farmacéuticamente aceptables incluyen la administración intranasal, intramuscular, intratraqueal, intratecal, subcutánea, intradérmica, aplicación tópica, intravenosa, intraarterial, rectal, nasal, oral y otras vías de administración enteral y parenteral. Las vías de administración pueden combinarse, si se desea, o ajustarse dependiendo del anticuerpo y/o el efecto deseado. Una composición de anticuerpo de la presente puede administrarse en una dosis única o en dosis múltiples. En algunas realizaciones, una composición de anticuerpo de la presente se administra por vía oral. En algunas realizaciones, una composición de anticuerpo de la presente se administra a través de una vía de inhalación. En algunas realizaciones, una composición de anticuerpo de la presente se administra por vía intranasal. En algunas realizaciones, una composición de anticuerpo de la presente se administra por vía local. En algunas realizaciones, una composición de anticuerpo de la presente se administra por vía intracraneal. En algunas realizaciones, una composición de anticuerpo de la presente se administra por vía intravenosa. En algunas realizaciones, una composición de anticuerpo de la presente se administra por vía intratecal.
Un anticuerpo de la presente descripción se puede administrar a un huésped usando cualquier procedimiento y vía convencional disponible adecuados para la administración de fármacos convencionales, incluyendo las vías sistémicas o localizadas. En general, las vías de administración contempladas por la invención incluyen, pero no se limitan necesariamente a, vías enterales, parenterales o por inhalación.
Las vías de administración parenterales distintas de la administración por inhalación incluyen, pero sin limitación, vías tópicas, transdérmica, subcutánea, intramuscular, intraorbital, intracapsular, intraespinal, intraesternal, intratecal e intravenosa, es decir, cualquier vía de administración distinta de a través del canal alimentario. La administración parenteral puede llevarse a cabo para efectuar la administración sistémica o local de un anticuerpo de la presente. Cuando se desea la administración sistémica, la administración normalmente implica la administración tópica o mucosa invasiva o absorbida sistémicamente de preparaciones farmacéuticas.
Un anticuerpo de la presente también puede administrarse al sujeto mediante administración enteral. Las vías de administración enterales incluyen, pero no se limitan necesariamente a, administración oral y rectal (por ejemplo, usando un supositorio).
Por tratamiento se entiende al menos una mejoría de los síntomas asociados con la afección patológica que afecta al huésped, donde la mejoría se usa en un sentido amplio para referirse al menos a una reducción en la magnitud de un parámetro, por ejemplo, un síntoma, asociado con la afección patológica que está siendo tratada, tal como una tauopatía. Como tal, el tratamiento también incluye situaciones donde la afección patológica, o al menos los síntomas asociados con ella, se inhiben por completo, por ejemplo se impide que sucedan, o se detienen, por ejemplo se termina, de modo que el huésped ya no sufre de la afección patológica, o al menos los síntomas que caracterizan la afección patológica.
En algunas realizaciones, un anticuerpo de la presente se administra mediante inyección y/o administración, por ejemplo, a un sitio en una arteria cerebral o directamente en el tejido cerebral. Un anticuerpo de la presente también puede administrarse directamente a un sitio diana, por ejemplo, mediante administración biolística al sitio diana.
Una variedad de huéspedes (donde el término “huésped” se usa indistintamente en el presente documento con los términos “sujeto”, “individuo” y “paciente”) son tratables según los procedimientos de la presente. En general, estos huéspedes son “mamíferos” o “mamífero”, donde estos términos se usan ampliamente para describir organismos que están dentro de la clase mammalia, incluidos los órdenes carnívoros (por ejemplo, perros y gatos), roedores (por ejemplo ratones, cobayas y ratas) y primates (por ejemplo seres humanos, chimpancés y monos). En algunas realizaciones, los huéspedes serán seres humanos.
Se proporcionan kits con dosis unitarias de un anticuerpo de la presente, por ejemplo, en dosis orales o inyectables. En dichos kits, además de los recipientes que contienen las dosis unitarias, habrá un prospecto informativo que describirá el uso y los beneficios concomitantes del anticuerpo en el tratamiento de la afección patológica de interés. Los compuestos preferidos y las dosis unitarias son los descritos anteriormente en el presente documento.
PROCEDIMIENTOS DE DETECCIÓN
La presente descripción proporciona procedimientos in vitro para detectar un polipéptido Tau en una muestra biológica obtenida de un individuo; y procedimientos para detectar un polipéptido Tau en un individuo vivo in vivo. Un procedimiento de detección in vitro de la presente puede ser cuantitativo. Por lo tanto, Tau puede servir como un biomarcador para la progresión de una tauopatía o como respuesta al tratamiento para una tauopatía.
El polipéptido Tau que se detecta/cuantifica puede ser: a) Tau de longitud completa; b) un fragmento N-terminal de Tau de longitud completa; c) Tau total, donde “Tau total” puede incluir Tau de longitud completa de cualquier isoterma; d) Tau libre, por ejemplo, Tau que no está unido a un anticuerpo anti-tau de la presente; y e) cualquier fragmento de Tau N-terminal que esté presente en una muestra biológica y que muestre el epítopo reconocido por un anticuerpo anti-Tau de la presente. Las secuencias de aminoácidos de Tau de longitud completa humana se presentan en las figuras 6A-D. En algunos casos, un procedimiento de detección de la presente puede comprender además determinar el nivel de Ap40 y/o Ap42 en una muestra biológica. La determinación del nivel de Ap40 y/o Ap42 en una muestra biológica se puede llevar a cabo utilizando un ensayo inmunológico (por ejemplo, un ELISA), por ejemplo, utilizando anticuerpos que se unen a Ap40 y/o Ap42.
Las muestras biológicas adecuadas incluyen, por ejemplo, líquido cefalorraquídeo, sangre, plasma, suero, orina y saliva. Un procedimiento in vitro de la presente descripción de detección de un polipéptido Tau en una muestra biológica obtenida de un individuo generalmente implica: a) poner en contacto la muestra biológica con un anticuerpo anti-Tau como se describe en el presente documento; y b) detectar la unión del anticuerpo al polipéptido Tau presente en la muestra. En algunos casos, el anticuerpo anti-Tau comprende VH y/o VL CDR representadas en las figuras 1A y 1B. En algunos casos, el anticuerpo anti-Tau comprende VH y/o VL CDR de las figuras 2A y 2B.
Se puede usar un procedimiento de detección de la presente descripción para determinar si un individuo tiene o corre el riesgo de desarrollar una tauopatía. Se puede usar un procedimiento de detección de la presente descripción para determinar el estadio (gravedad) de una tauopatía. Se puede usar un procedimiento de detección de la presente descripción para determinar la respuesta de un paciente a un régimen de tratamiento para tratar una tauopatía. Una muestra biológica se puede analizar utilizando un procedimiento de detección de la presente, donde la muestra biológica se obtiene de un individuo sospechoso de tener una tauopatía, un individuo al que se le ha diagnosticado una tauopatía, un individuo que tiene una predisposición genética a desarrollar una tauopatía, etc.
La presente descripción proporciona un procedimiento de diagnóstico de una tauopatía neurodegenerativa en un individuo. El procedimiento generalmente implica (a) evaluar el nivel de un polipéptido Tau en una muestra biológica obtenida del individuo; y (b) comparar el nivel del polipéptido Tau con una referencia, un patrón, o valor de control normal que indica el nivel de Tau en sujetos de control normales. Una diferencia significativa entre el nivel de polipéptido Tau en la muestra biológica y el valor de control normal indica que el individuo tiene una tauopatía neurodegenerativa.
La presente descripción proporciona un procedimiento de monitorización de la progresión de, o monitorización de la respuesta al tratamiento para una tauopatía neurodegenerativa en un individuo. El procedimiento generalmente implica comparar el nivel de un polipéptido Tau en una muestra biológica obtenida del individuo en un primer punto temporal con el nivel de un polipéptido Tau en una muestra biológica obtenida del individuo en un segundo punto temporal. Una diferencia en el nivel del polipéptido Tau en una muestra biológica obtenida del individuo en un segundo punto temporal, en comparación con el nivel del polipéptido Tau en una muestra biológica obtenida del individuo en un primer punto temporal, puede proporcionar una indicación en cuanto a: i) si la tauopatía está progresando o si la progresión de la enfermedad se ha detenido; y/o ii) cuán rápido progresa la tauopatía; y/o iii) si el individuo exhibe una respuesta clínica beneficiosa al tratamiento con un fármaco u otro régimen de tratamiento para tratar la tauopatía.
La presente descripción proporciona un procedimiento de estadificación de una tauopatía. Por ejemplo, un procedimiento de la presente puede proporcionar estadificación de la enfermedad de Alzheimer. Por ejemplo, el nivel de un polipéptido Tau en una muestra biológica (por ejemplo, El CSF u otra muestra biológica líquida) de un individuo vivo puede proporcionar una indicación del estadio de Braak de AD. Braak y Braak (1995) Neurobiol. Aging 16: 271. Por ejemplo, el nivel de un polipéptido Tau en una muestra biológica de un individuo vivo puede proporcionar una indicación de si el individuo está en los estadios transentorrinales I-II de AD; estadios límbicos III-IV de AD; o estadios neocorticales V-VI de AD.
El nivel de un polipéptido Tau en una muestra biológica puede evaluarse mediante cualquier procedimiento adecuado conocido en la técnica. Los procedimientos adecuados incluyen, pero no se limitan a, una transferencia de proteína (“Western”), inmunoprecipitación, enzimoinmunoanálisis de adsorción (ELISA), radioinmunoanálisis (RIA), clasificación de células activadas fluorescentes (FACS), electroforesis en gel bidimensional, espectroscopía de masas (MS), desorción/ionización láser asistida por una matriz-tiempo de vuelo-MS (MALDI-TOF), desorción/ionización láser mejorada para superficie-tiempo de vuelo (SELDI-TOF), cromatografía líquida de alta resolución (HPLC), cromatografía líquida de proteínas rápida (FPLC), cromatografía líquida multidimensional (LC) seguida de espectrometría de masas en tándem (MS/MS) y densitometría láser.
La presente descripción proporciona un procedimiento para monitorizar la progresión de una tauopatía en un individuo, donde el procedimiento generalmente implica: a) determinar un primer nivel de un polipéptido Tau en una muestra biológica obtenida del individuo en un primer punto temporal; b) determinar un segundo nivel de un polipéptido Tau en una muestra biológica obtenida del individuo en un segundo punto temporal; y c) comparar el segundo nivel de Tau con el primer nivel de Tau. Las etapas determinantes pueden comprender: i) poner en contacto la muestra biológica con un anticuerpo anti-Tau de la presente; y ii) cuantificar la unión del anticuerpo al polipéptido Tau presente en la muestra. En algunos casos, el primer punto temporal es un punto temporal antes del inicio de un régimen de tratamiento, y el segundo punto temporal es un punto temporal después del inicio de un régimen de tratamiento. Por lo tanto, la presente descripción proporciona un procedimiento de monitorización de la respuesta al tratamiento con un agente que trata una tauopatía, donde el procedimiento implica: a) determinar un primer nivel de un polipéptido Tau en una muestra biológica obtenida del individuo en un primer punto temporal es antes de que se inicie el tratamiento con un agente para tratar una tauopatía; b) determinar un segundo nivel de un polipéptido Tau en una muestra biológica obtenida del individuo en un segundo punto temporal que es después del inicio del tratamiento con un agente para tratar una tauopatía; y c) comparar el segundo nivel de Tau con el primer nivel de Tau.
Un procedimiento de la presente de monitorización de la progresión de una tauopatía también se puede aplicar a los procedimientos de monitorización de la progresión de una sinucleinopatía, por ejemplo, la enfermedad de Parkinson (PD); demencia con cuerpos de Lewy (DLB); atrofia multisitémica (MSA); etc. Por ejemplo, la progresión de la PD con demencia (PDD) se puede monitorizar con un procedimiento de la presente.
En algunas tauopatías, el nivel de Tau aumenta con la progresión de la enfermedad. En otras tauopatías, el nivel de Tau disminuye con la progresión de la enfermedad. Así, por ejemplo, el nivel de Tau aumenta con la progresión de AD; y disminuye con la progresión de FTD.
Un procedimiento de la presente puede implicar el uso de un kit o un dispositivo de ensayo que comprende un anticuerpo anti-Tau de la presente. La presente descripción proporciona kits y dispositivos de ensayo para llevar a cabo un procedimiento como se describe en el presente documento. Un kit de la presente incluye un anticuerpo anti-tau de la presente descripción.
El anticuerpo anti-tau se puede inmovilizar sobre un soporte insoluble (por ejemplo, una tira reactiva, un pocillo de una placa multipocillo, una perla (por ejemplo, una perla magnética), etc.). Los soportes adecuados son bien conocidos en la técnica y comprenden, entre otros, materiales de columna disponibles en el mercado, perlas de poliestireno, perlas de látex, perlas magnéticas, partículas de metal coloidal, virutas y superficies de vidrio y/o silicio, tiras de nitrocelulosa, membranas de nylon, láminas, pocillos de bandejas de reacción (por ejemplo, placas multipocillo), tubos de plástico, etc. Un soporte sólido puede comprender cualquiera de una variedad de sustancias, que incluyen, por ejemplo, vidrio, poliestireno, cloruro de polivinilo, polipropileno, polietileno, policarbonato, dextrano, nylon, amilosa, celulosas naturales y modificadas, poliacrilamidas, agarosas y magnetita. Los procedimientos adecuados para inmovilizar un anticuerpo de la presente sobre un soporte sólido son bien conocidos e incluyen, pero no se limitan a, interacciones iónicas, hidrófobas, covalentes y similares. Los soportes sólidos pueden ser solubles o insolubles, por ejemplo, en solución acuosa. En algunas realizaciones, un soporte sólido adecuado es generalmente insoluble en una solución acuosa.
Un anticuerpo anti-tau de la presente descripción puede comprender un marcador detectable. Cuando el anticuerpo comprende un marcador detectable, un kit de la presente puede incluir uno o más reactivos para revelar el marcador detectable. Un anticuerpo marcado puede comprender un marcador tal como un agente quimioluminiscente, un marcador particulado, un agente colorimétrico, un agente de transferencia de energía, una enzima, un agente fluorescente o un radioisótopo. Los marcadores detectables adecuados incluyen cualquier composición detectable mediante mecanismos espectroscópicos, fotoquímicos, bioquímicos, inmunoquímicos, eléctricos, ópticos o químicos. Los marcadores detectables adecuados incluyen, pero no se limitan a, marcadores fluorescentes (por ejemplo, isotiocianato de fluoresceína, rojo Texas, rodamina, una proteína fluorescente verde, una proteína fluorescente roja, una proteína fluorescente amarilla y similares); radiomarcadores (por ejemplo 3H, 125I, 35S, 14C o 32P); y enzimas (por ejemplo, peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina, luciferasa y otras enzimas que actúan sobre un sustrato para producir un producto que puede detectarse por medios fluorométricos, colorimétricos o espectrofotométricos).
Un kit de la presente puede incluir además uno o más componentes adicionales, donde los componentes adicionales adecuados incluyen: 1) un control positivo; 2) un tampón (por ejemplo, un tampón de unión; un tampón de lavado; etc.); 3) reactivos para su uso en la generación de una señal detectable; y similares. Otros componentes opcionales del kit incluyen: un inhibidor de proteasa; un marcador detectable; etc. Los diversos componentes del kit pueden estar presentes en recipientes separados o ciertos componentes compatibles pueden combinarse previamente en un solo recipiente, según se desee.
Además de los componentes mencionados anteriormente, un kit de la presente puede incluir instrucciones para usar los componentes del kit para poner en práctica un procedimiento de la presente. Las instrucciones para poner en práctica los procedimientos de la presente están generalmente registradas en un medio de registro adecuado. Por ejemplo, las instrucciones pueden estar impresas en un sustrato, tal como papel o plástico, etc. Como tales, las instrucciones pueden estar presentes en los kits como un prospecto, en el etiquetado del recipiente del kit o componentes del mismo (es decir, asociado al embalaje o subembalaje), etc. En otras realizaciones, las instrucciones están presentes como un archivo de almacenamiento de datos electrónico, presente en un medio de almacenamiento legible por ordenador adecuado, por ejemplo, disco compacto-memoria de solo lectura (CD-ROM), disco versátil digital (DVD), disquete, etc. En aun otras realizaciones, las instrucciones reales no están presentes en el kit, pero se proporcionan medios para obtener las instrucciones desde una fuente remota, por ejemplo, por medio de Internet. Un ejemplo de esta realización es un kit que incluye una dirección web donde se pueden ver las instrucciones y/o desde donde pueden descargarse. Al igual que las instrucciones, este medio para obtener las instrucciones se registra en un sustrato adecuado.
Un dispositivo de ensayo puede incluir un anticuerpo anti-Tau de la presente inmovilizado sobre un sustrato sólido. El dispositivo de ensayo puede estar en cualquiera de una variedad de formatos, por ejemplo, una tira de ensayo, una tira reactiva; etc.
Imagenología in vivo
Como se analizó anteriormente, la presente descripción proporciona procedimientos para detectar un polipéptido Tau en un individuo vivo, por ejemplo, por una técnica de imagenología in vivo. Por ejemplo, en una realización, la imagenología in vivo de un polipéptido Tau se puede lograr mediante tomografía por emisión de positrones (PET), tomografía por emisión de fotón único (SPECT), imagenología óptica de infrarrojo cercano (NIR) o imagenología por resonancia magnética (MRI). Un anticuerpo anti-tau de la presente se administra a un individuo, y se detecta la presencia y/o el nivel del polipéptido tau. El anticuerpo anti-tau puede comprender un marcador adecuado para su uso en PET, SPECT, NIR o MRI. Tales marcadores incluyen un agente de contraste o un radioisótopo, donde el agente de contraste o el radioisótopo es uno que es adecuado para su uso en imagenología, por ejemplo, procedimientos de imagenología realizados en seres humanos, como se describió anteriormente. En algunos casos, el anticuerpo anti-Tau comprende VH y/o VL CDR de IPN001. En algunos casos, el anticuerpo anti-Tau comprende VH y/o VL c Dr de IPN002. El anticuerpo anti-Tau puede comprender una o más regiones marco humanizadas, como se describió anteriormente.
Generación de un informe
En algunos aspectos, un procedimiento de detección de la presente comprende detectar un polipéptido Tau en una muestra biológica obtenida de un individuo; y, basándose en el nivel de polipéptido Tau detectado, generar un informe y/o dirigir la terapia o la gestión del individuo del que se obtuvo la muestra biológica.
Un informe puede incluir uno o más de: una indicación de si el individuo probablemente tiene una tauopatía; una indicación de la gravedad de la tauopatía; una indicación de si el individuo exhibe una respuesta clínica beneficiosa al tratamiento para la tauopatía; y similares.
Por lo tanto, un informe puede incluir información tal como una probabilidad prevista de que el individuo tenga o desarrolle una tauopatía; una recomendación sobre evaluación adicional; una recomendación sobre fármacos terapéuticos y/u otra intervención de gestión sanitaria; y similares.
Por ejemplo, los procedimientos descritos en el presente documento pueden incluir además una etapa de generar o generar un informe que proporcione los resultados de una evaluación de la presente, informe que puede proporcionarse en forma de un medio electrónico (por ejemplo, una pantalla electrónica en un monitor de ordenador), o en forma de un medio tangible (por ejemplo, un informe impreso en papel u otro medio tangible). Una evaluación de la probabilidad de que una persona tenga o corra el riesgo de desarrollar una tauopatía puede denominarse “informe de riesgo”, “puntuación de riesgo” o “puntuación de probabilidad”. Una persona o entidad que prepara un informe (“generador de informes”) también puede realizar etapas tales como la recolección de muestras, el procesamiento de muestras y similares. Como alternativa, una entidad que no sea el generador de informes puede realizar etapas tales como la recolección de muestras, el procesamiento de muestras y similares. Se puede proporcionar un informe de evaluación de riesgos a un usuario. Un “usuario” puede ser un profesional de la salud (por ejemplo, un facultativo, un técnico de laboratorio o un médico). Dirección de la gestión sanitaria
En algunos aspectos, un procedimiento de detección de la presente comprende detectar un polipéptido Tau en una muestra biológica obtenida de un individuo; y, basándose en el nivel de polipéptido Tau detectado, generar un informe y/o dirigir la terapia o la gestión del individuo del que se obtuvo la muestra biológica.
Por lo tanto, por ejemplo, dependiendo del resultado de un procedimiento de detección de la presente, se puede hacer una recomendación para que el individuo se someta a una intervención terapéutica (tratamiento) para la tauopatía y/o que el individuo sea considerado para una gestión sanitaria especial.
La intervención terapéutica puede incluir, por ejemplo, terapia farmacológica para el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer. Los ejemplos de terapia farmacológica para el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer incluyen, pero no se limitan a, inhibidores de la acetilcolinesterasa, que incluyen, pero no se limitan a, Aricept (donepezil), Exelon (rivastigmina), metrifonato y tacrina (Cognex); un anticuerpo anti-Ap (por ejemplo, solanezumab); un anticuerpo anti-tau; agentes antiinflamatorios no esteroideos, que incluyen, pero no se limitan a, ibuprofeno e indometacina; inhibidores de la ciclooxigenasa-2 (Cox2) tales como Celebrex; e inhibidores de la monoaminooxidasa, tales como Selegilene (Eldepryl o Deprenyl). Las dosis para cada uno de los agentes anteriores son conocidas en la técnica. Por ejemplo, Aricept puede administrarse a 50 mg por vía oral por día durante 6 semanas y, si el individuo lo tolera bien, a partir de entonces a 10 mg por día.
DETERMINACIÓN DE LA CANTIDAD DE TAU EXTRACELULAR LIBRE Y UNIDA
Después de la administración de un anticuerpo anti-eTau a un individuo, puede ser de interés determinar la cantidad de eTau que queda en el CSF o ISF que no está unida al anticuerpo anti-eTau. La presente descripción proporciona procedimientos para determinar la cantidad de dicho eTau libre. En la figura 54A se representa una representación esquemática de un procedimiento para determinar la cantidad de eTau restante en el CSF o ISF que no está unida al anticuerpo anti-eTau. Después de la administración de un anticuerpo anti-eTau a un individuo, también puede ser de interés determinar la cantidad de eTau en CSF o ISF que está unida a un anticuerpo anti-eTau. En la figura 54B se representa una representación esquemática de un procedimiento para determinar la cantidad de eTau en CSF o ISF que está unida a un anticuerpo anti-eTau.
Determinación de la cantidad de Tau extracelular libre
La presente descripción proporciona un procedimiento de determinación de la cantidad de Tau extracelular (eTau) no unida a un anticuerpo anti-eTau en una muestra de CSF o ISF obtenida de un sujeto que se somete a terapia con el anticuerpo anti-eTau. El procedimiento generalmente implica: a) poner en contacto un anticuerpo inmovilizado con una muestra de CSF o ISF obtenida del sujeto, donde el anticuerpo inmovilizado compite por unirse a eTau con el anticuerpo anti-eTau administrado al sujeto, y donde la puesta en contacto es en condiciones adecuadas para la unión de la eTau no unida al anticuerpo inmovilizado; y b) determinar la cantidad de eTau unida al anticuerpo inmovilizado. La cantidad de eTau unida al anticuerpo inmovilizado es una indicación de la cantidad de eTau no unida al anticuerpo anti-Tau en la muestra. En algunos casos, la cantidad de eTau unida al anticuerpo inmovilizado se determina usando un tercer anticuerpo marcado de forma detectable que no compite con el anticuerpo inmovilizado para unirse al eTau.
Como se señaló anteriormente, el ensayo mide la cantidad de eTau en una muestra de CSF o ISF obtenida de un individuo sometido a terapia con un anticuerpo anti-eTau. En algunos casos, el anticuerpo anti-eTau es un anticuerpo anti-eTau humanizado terapéutico. En algunos casos, el anticuerpo anti-eTau es un anticuerpo anti-eTau humanizado de la presente descripción. En algunos casos, el anticuerpo anti-eTau es hu-IPN002.
En algunos casos, un procedimiento de la presente comprenderá: a) determinar la cantidad de eTau no unida a un anticuerpo anti-eTau en una muestra de CSF o ISF obtenida de un sujeto sometido a terapia con el anticuerpo anti-eTau, como se describió anteriormente; y b) determinar el nivel de tau total en la muestra.
En algunos casos, un procedimiento de la presente comprenderá: a) determinar la cantidad de eTau no unida a un anticuerpo anti-eTau en una muestra de CSF o ISF obtenida de un sujeto sometido a terapia con el anticuerpo anti-eTau, como se describió anteriormente; y b) comparar el nivel de Tau no unida en la muestra con el nivel de tau total en una muestra de CSF o ISF obtenida del individuo antes del tratamiento con el anticuerpo anti-eTau.
Un procedimiento de detección de la presente es adecuado para determinar el nivel de tau extracelular. “Tau extracelular” (“eTau”), como se usa en el presente documento, abarca cualquier polipéptido Tau que pueda detectarse en el líquido cefalorraquídeo (CSF) o en el líquido intersticial (ISF). En algunas realizaciones, eTau es un polipéptido que tiene una longitud de 175 aminoácidos y que comprende los aminoácidos 2-176 de tau de longitud completa; por ejemplo, en algunas realizaciones, eTau es un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 45. En algunas realizaciones, eTau es un polipéptido que tiene una longitud de 171 aminoácidos y que comprende los aminoácidos 2-172 de tau de longitud completa; por ejemplo, en algunas realizaciones, eTau es un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 44. En algunas realizaciones, eTau es un polipéptido eTau-2 que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 46. En algunas realizaciones, eTau es un polipéptido eTau-3 que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 47. En algunas realizaciones, eTau es un polipéptido eTau-4 que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 48.
En algunos casos, un polipéptido eTau tiene una longitud de aproximadamente 50 aminoácidos a aproximadamente 175 aminoácidos, por ejemplo, de aproximadamente 50 aminoácidos (aa) a aproximadamente 75 aa, de aproximadamente 75 aa a aproximadamente 100 aa, de aproximadamente 100 aa a aproximadamente 125 aa, de aproximadamente 125 aa a aproximadamente 150 aa, o de aproximadamente 150 aa a aproximadamente 175 aa; y puede comprender de 50 a aproximadamente 75, de aproximadamente 75 a aproximadamente 100, de aproximadamente 100 a aproximadamente 125, de aproximadamente 125 a aproximadamente 150, o de aproximadamente 150 a aproximadamente 175, aminoácidos contiguos de los aminoácidos 2-176 de tau de longitud completa. Los ejemplos de polipéptidos eTau se representan en la figura 20.
Determinación de la cantidad de Tau extracelular unida a un anticuerpo anti-eTau
La presente descripción proporciona un procedimiento de determinación de la cantidad de eTau unida a un anticuerpo anti-eTau terapéutico en una muestra de CSF o ISF obtenida de un sujeto sometido a terapia con el anticuerpo anti-eTau terapéutico. El procedimiento generalmente implica: a) poner en contacto un anticuerpo inmovilizado con una muestra de CSF o ISF obtenida del sujeto, donde el anticuerpo inmovilizado no compite por unirse a eTau con el anticuerpo anti-eTau administrado al sujeto, siendo dicha puesta en contacto en condiciones adecuadas para la unión de eTau al unida anticuerpo terapéutico al anticuerpo inmovilizado; y b) determinar la cantidad de complejo anti-eTau terapéutico/eTau unida al anticuerpo inmovilizado, donde la cantidad de complejo anticuerpo anti-eTau terapéutico/eTau unido al anticuerpo inmovilizado es una indicación de la cantidad de eTau presente unida a anticuerpo terapéutico en la muestra. La cantidad de complejo de anticuerpo anti-eTau terapéutico/eTau unido al anticuerpo inmovilizado se determina detectando el anticuerpo anti-eTau presente en el complejo anticuerpo anti-eTau/eTau. La cantidad de complejo anti-eTau anticuerpo terapéutico/eTau unido al anticuerpo inmovilizado se determina mediante la detección del anticuerpo anti-eTau presente en el complejo anticuerpo anti-eTau/eTau y proporciona una indicación de la cantidad de Tau unida al anticuerpo terapéutico en el muestra de CSF o ISF.
Como se señaló anteriormente, el ensayo mide la cantidad de eTau unida a anticuerpo terapéutico en una muestra de CSF o ISF obtenida de un individuo sometido a terapia con el anticuerpo anti-eTau. En algunos casos, el anticuerpo antieTau es un anticuerpo anti-eTau humanizado terapéutico. En algunos casos, el anticuerpo anti-eTau es un anticuerpo anti-eTau humanizado de la presente descripción. En algunos casos, el anticuerpo anti-eTau es hu-IPN002.
En algunos casos, un procedimiento de la presente comprenderá: a) determinar la cantidad de eTau unida a un anticuerpo anti-eTau en una muestra de CSF o ISF obtenida de un sujeto sometido a terapia con el anticuerpo anti-eTau, como se describió anteriormente; y b) determinar el nivel de tau total en la muestra. En algunos casos, un procedimiento de la presente comprenderá: a) determinar la cantidad de eTau unida a un anticuerpo anti-eTau en una muestra de CSF o ISF obtenida de un sujeto sometido a terapia con el anticuerpo anti-eTau, como se describió anteriormente; y b) determinar la cantidad de eTau en la muestra de CSF o ISF que no está unida al anticuerpo anti-eTau terapéutico. En algunos casos, un procedimiento de la presente comprenderá: a) determinar la cantidad de eTau unida a un anticuerpo anti-eTau en una muestra de CSF o ISF obtenida de un sujeto sometido a terapia con el anticuerpo anti-eTau, como se describió anteriormente; b) determinar el nivel de tau total en la muestra; y c) determinar la cantidad de eTau en la muestra CSF o ISF que no está unida al anticuerpo anti-eTau terapéutico.
En algunos casos, un procedimiento de la presente comprenderá: a) determinar la cantidad de eTau unida a un anticuerpo anti-eTau en una muestra de CSF o ISF obtenida de un sujeto sometido a terapia con el anticuerpo anti-eTau, como se describió anteriormente; y b) comparar el nivel de Tau unida a anticuerpo anti-eTau en la muestra con el nivel de tau total en una muestra de CSF o ISF obtenida del individuo antes del tratamiento con el anticuerpo anti-eTau.
En algunos casos, un procedimiento de la presente comprenderá: a) determinar la cantidad de eTau no unida a un anticuerpo anti-eTau en una muestra de CSF o ISF obtenida de un sujeto sometido a terapia con el anticuerpo anti-eTau, como se describió anteriormente; b) determinar la cantidad de eTau unida a un anticuerpo anti-eTau en una muestra de CSF o ISF obtenida de un sujeto sometido a terapia con el anticuerpo anti-eTau, como se describió anteriormente; y c) comparar el nivel de Tau no unida y el nivel de Tau unida a anticuerpo anti-eTau en la muestra con el nivel de tau total en una muestra de CSF o ISF obtenida del individuo antes del tratamiento con el anticuerpo anti-eTau.
Un procedimiento de detección de la presente es adecuado para determinar el nivel de tau extracelular unida a un anticuerpo terapéutico. “Tau extracelular” (“eTau”), como se usa en el presente documento, abarca cualquier polipéptido Tau que pueda detectarse en el líquido cefalorraquídeo (CSF) o en el líquido intersticial (ISF). En algunas realizaciones, eTau es un polipéptido que tiene una longitud de 175 aminoácidos y que comprende los aminoácidos 2-176 de tau de longitud completa; por ejemplo, en algunas realizaciones, eTau es un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 45. En algunas realizaciones, eTau es un polipéptido que tiene una longitud de 171 aminoácidos y que comprende los aminoácidos 2-172 de tau de longitud completa; por ejemplo, en algunas realizaciones, eTau es un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 44. En algunas realizaciones, eTau es un polipéptido eTau-2 que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 46. En algunas realizaciones, eTau es un polipéptido eTau-3 que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 47. En algunas realizaciones, eTau es un polipéptido eTau-4 que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 48.
En algunos casos, un polipéptido eTau tiene una longitud de aproximadamente 50 aminoácidos a aproximadamente 175 aminoácidos, por ejemplo, de aproximadamente 50 aminoácidos (aa) a aproximadamente 75 aa, de aproximadamente 75 aa a aproximadamente 100 aa, de aproximadamente 100 aa a aproximadamente 125 aa, de aproximadamente 125 aa a aproximadamente 150 aa, o de aproximadamente 150 aa a aproximadamente 175 aa; y puede comprender de 50 a aproximadamente 75, de aproximadamente 75 a aproximadamente 100, de aproximadamente 100 a aproximadamente 125, de aproximadamente 125 a aproximadamente 150, o de aproximadamente 150 a aproximadamente 175, aminoácidos contiguos de los aminoácidos 2-176 de tau de longitud completa. Los ejemplos de polipéptidos eTau se representan en la figura 20.
Generación de un informe
En algunos casos, un procedimiento de la presente comprenderá: a) determinar la cantidad de eTau no unida a un anticuerpo anti-eTau en una muestra de CSF o ISF obtenida de un sujeto sometido a terapia con el anticuerpo anti-eTau, como se describió anteriormente; y b) generar un informe y/o dirigir la terapia o la gestión del individuo de quien se obtuvo la muestra. En algunos casos, un procedimiento de la presente comprenderá: a) determinar la cantidad de eTau no unida a un anticuerpo anti-eTau en una muestra de CSF o iSf obtenida de un sujeto sometido a terapia con el anticuerpo antieTau, como se describió anteriormente; b) comparar el nivel de Tau no unida en la muestra con el nivel de tau total en una muestra de CSF o ISF obtenida del individuo antes del tratamiento con el anticuerpo anti-eTau; y c) generar un informe y/o dirigir la terapia o la gestión del individuo de quien se obtuvo la muestra.
En algunos casos, un procedimiento de la presente comprenderá: a) determinar la cantidad de eTau unida a un anticuerpo anti-eTau en una muestra de CSF o ISF obtenida de un sujeto sometido a terapia con el anticuerpo anti-eTau, como se describió anteriormente; y b) generar un informe con los resultados de la determinación. El informe puede incluir además una o ambas cantidades de Tau no unida en la muestra hasta el nivel de tau total en una muestra de CSF o ISF después del tratamiento con el anticuerpo anti-Tau; y la cantidad de Tau total en una muestra de CSF o ISF obtenida del individuo antes del tratamiento con el anticuerpo anti-eTau.
Un informe puede incluir, por ejemplo, una indicación de si el individuo exhibe una respuesta clínica beneficiosa al tratamiento de la tauopatía; una indicación de si la dosis del anticuerpo anti-eTau debe mantenerse, aumentarse o disminuirse; y similares.
Por lo tanto, un informe puede incluir información tal como una recomendación con respecto a una evaluación adicional; una recomendación sobre fármacos terapéuticos y/u otra intervención de gestión sanitaria; una recomendación para aumentar la dosis de anticuerpo anti-eTau; una recomendación para mantener la dosis de anticuerpo anti-eTau; una recomendación para reducir la dosis de anticuerpo anti-eTau; y similares.
Por ejemplo, los procedimientos descritos en el presente documento pueden incluir además una etapa de generar o generar un informe que proporcione los resultados de una evaluación de la presente, informe que puede proporcionarse en forma de un medio electrónico (por ejemplo, una pantalla electrónica en un monitor de ordenador), o en forma de un medio tangible (por ejemplo, un informe impreso en papel u otro medio tangible). Una persona o entidad que prepara un informe (“generador de informes”) también puede realizar etapas tales como la recolección de muestras, el procesamiento de muestras y similares. Como alternativa, una entidad que no sea el generador de informes puede realizar etapas tales como la recolección de muestras, el procesamiento de muestras y similares. Se puede proporcionar un informe de evaluación de riesgos a un usuario. Un “usuario” puede ser un profesional de la salud (por ejemplo, un facultativo, un técnico de laboratorio o un médico).
Dirección de la gestión sanitaria
En algunos aspectos, un procedimiento de la presente comprende a) determinar la cantidad de eTau no unida a un anticuerpo anti-eTau en una muestra de CSF o ISF obtenida de un sujeto sometido a terapia con el anticuerpo anti-eTau, como se describió anteriormente; y, basándose en la cantidad determinada de eTau no unida a un anticuerpo anti-eTau, generar un informe y/o dirigir la terapia o la gestión del individuo del que se obtuvo la muestra biológica.
En algunos casos, un procedimiento de la presente comprende a) determinar la cantidad de eTau no unida a un anticuerpo anti-eTau en una muestra de CSF o ISF obtenida de un sujeto sometido a terapia con el anticuerpo anti-eTau, como se describió anteriormente; y, basándose en la cantidad determinada de eTau no unida a un anticuerpo anti-eTau, mantener la dosis de anticuerpo anti-eTau que se administró al sujeto. En algunos casos, un procedimiento de la presente comprende a) determinar la cantidad de eTau no unida a un anticuerpo anti-eTau en una muestra de CSF o ISF obtenida de un sujeto sometido a terapia con el anticuerpo anti-eTau, como se describió anteriormente; y, basándose en la cantidad determinada de eTau no unida a un anticuerpo anti-eTau, aumentar la dosis de anticuerpo anti-eTau administrada al sujeto. En algunos casos, un procedimiento de la presente comprende a) determinar la cantidad de eTau no unida a un anticuerpo anti-eTau en una muestra de CSF o ISF obtenida de un sujeto sometido a terapia con el anticuerpo anti-eTau, como se describió anteriormente; y, basándose en la cantidad determinada de eTau no unida a un anticuerpo anti-eTau, reducir la dosis de anticuerpo anti-eTau administrada al sujeto.
EJEMPLOS
Los siguientes ejemplos se exponen para proporcionar a aquellos expertos habituales en la materia una divulgación y descripción completas sobre cómo preparar y usar la presente invención, y no pretenden limitar el alcance de lo que los inventores consideran su invención ni pretenden representar que los experimentos a continuación sean todos o los únicos experimentos realizados. Se han realizado esfuerzos para garantizar la precisión con respecto a los números usados (por ejemplo, cantidades, temperatura, etc.), pero se deben tener en cuenta algunos errores y desviaciones experimentales. Salvo que se indique lo contrario, las partes son partes por peso, el peso molecular es el peso molecular promedio, la temperatura se encuentra en grados Celsius y la presión es atmosférica o similar. Se pueden utilizar abreviaturas estándar, por ejemplo, pb, par o pares de bases; kb, kilobase/s; pl, picolitro/s; s o seg, segundo/s; min, minuto/s; h, hora/s; aa, aminoácido/s; kb, kilobase/s; pb, par o pares de bases; nt, nucleótido/s; i.m., intramuscular o por vía intramuscular; i.p., intraperitoneal o por vía intraperitoneal; s.c, subcutánea o por vía subcutánea y similares.
Ejemplo 1: Clonación y secuenciación de las regiones VH y VL de IPN001 e IPN002
Se determinaron las secuencias de aminoácidos de las regiones VH y VL de anticuerpos IPN001 (también denominado en el presente documento “IPN1” o “IPN-1”) e IPN002 (también denominado en el presente documento “IPN2” o “IPN-2”). Las secuencias de aminoácidos de las regiones VH y VL de IPN001 se representan en las figuras 1A y 1B, respectivamente. Las secuencias de aminoácidos de las regiones VH y VL de IPN002 se representan en las figuras 2A y 2B, respectivamente. Las CDR están en negrita y subrayadas. Las c Dr se determinaron utilizando el procedimiento de Kabat y col. (véase tabla 1; y J. Biol. Chem. 252: 6609-6616 (1977); y Kabat y col., U.S. Dept. of Health and Human Services, “Sequences of proteins of immunological interest” (1991)).
Ejemplo 2: Análisis electrofisiológico del efecto de los anticuerpos anti-Tau
MATERIALES Y PROCEDIMIENTOS
El registro de pinzamiento zonal de membrana celular completa de neuronas corticales derivadas de células madre pluripotentes inducidas (iPSC) cultivadas en una monocapa de astrocitos humanos normales se llevó a cabo usando una pipeta de de pinzamiento (2-5 MOhm) llena de solución que contiene (mM): K-metilsulfato (140), NaCl (10), CaCh (1), Mg-ATP (3); Na-GTP (0,4), EGTA (0,2), HEPES (10), Fosfocreatina con pH ajustado = 7,3 y mOsm = 300. Las neuronas se perfundieron (2 ml/min) con líquido cefalorraquídeo artificial que contenía (mM): NaCl (140), KCl (2,5), MgCh (2) CaCh (2), Hepes (10), D-Glucosa (10), sacarosa (20). PH ajustado = 7,4 mOsm = 310. Los registros se realizaron utilizando el software de adquisición de datos pClamp-10.3 (Molecular Devices) y el amplificador MultiClamp 700B (Axon Instrument; Foster City CA). AD tau y AD Tau preincubados con IPN001 o IPN002 (2 horas a temperatura ambiente o 24 horas a 4 grados C a una relación de peso de 10:1) se aplicaron a través del sistema de microperfusión MinisQuirt (AutoMate, Berkeley, CA). El análisis de datos se realizó fuera de línea utilizando el software de análisis Clampfit 10.2 (Molecular Devices). Todos los registros se realizaron a temperatura ambiente.
RESULTADOS
Los datos se representan en las figuras 3A-D.
La aplicación de AD-Tau (6 pg/ml) provoca la despolarización de la membrana de la neurona cortical (A, B y C). La incubación previa de AD-Tau (6 pg/ml) con IPN001 (60 pg/ml) (A) o IPN002 (60 pg/ml) (B) durante >2 horas reduce la despolarización de la membrana mediada por AD-Tau. C. La incubación previa de AD-Tau (6 pg/ml) con IgG de ratón (60 pg/ml) no redujo la despolarización de membrana mediada por AD-Tau en las neuronas corticales. D. El resumen de datos que muestra IPN001 e IPN002 redujo significativamente la despolarización de la membrana mediada por AD-Tau (prueba t para datos emparejados * p<0,037; ** p < 0,009, p < 0,003).
Ejemplo 3: Inmunorreactividad de IPN001 e IPN002 con Tau en CSF de pacientes con AD
El líquido cefalorraquídeo (CSF) se reunió de 10 donantes sanos (1 ml cada uno). El CSF también se combinó de 10 pacientes con enfermedad de Alzheimer (AD) (1 ml cada uno). Se guardaron alícuotas de agrupaciones de CSF para el análisis ELISA. Se usaron 10 ml de medio acondicionado de neuronas corticales diferenciadas durante 315 días de una línea de células madre pluripotentes inducidas por Down (iPSC) iPSC (8941.1) como control para los aislamientos por afinidad del CSF y también se guardó una alícuota para el análisis ELISA. Para determinar si el CSF contiene Tau reactiva con IPN002, cada una de las muestras agrupadas de CSF y los medios acondicionados se limpiaron previamente en una resina acoplada a IgG1 y el flujo continuo se aplicó posteriormente a una resina acoplada a IPN001. Las resinas IPN001 se lavaron a fondo con solución salina tamponada con fosfato (PBS) y las proteínas unidas se eluyeron con glicina 50 mM, NaCl 150 mM, pH 2,3 y se neutralizaron con Tris 1 M, pH 8,3 después de la elución. Las proteínas eluidas se concentraron en concentradores YM10 y se añadieron al tampón de muestra para electroforesis en gel de dodecilsulfato de sodio-poliacrilamida (SDS-PAGE) y análisis de transferencia Western.
Para determinar si IPN002 reacciona con cualquier forma de Tau en el CSF, las transferencias Western de la proteína eluida con IPN002 se sondearon con IPN001, Santa Cruz Tau H-150 (aa1-150) y con el anticuerpo Dako's Tau # A0024 que reacciona con los extremos C (aa # 243-441) de Tau. Los datos se representan en las figuras 4A-C.
Las transferencias Western mostraron bandas inmunorreactivas de IPN001 (figura 4a) y Tau H-150 (figura 4b) presentes en la proteína purificada por afinidad con IPN002 de CSF sano y con AD que oscilaba en el peso molecular de ~25 kd a 37 kd. Estos fragmentos de Tau fueron similares en sus tamaños, pero no en su abundancia relativa, a los fragmentos eTau aislados de los medios acondicionados de la línea de Down. El anticuerpo tau C-terminal de Dako (figura 4c) no detectó ninguna especie reactiva del aislamiento por afinidad con IPN002 de CSF o de medios acondicionados. La Tau de longitud completa no fue detectada por ninguno de los anticuerpos para Tau del aislamiento por afinidad con IPN002. Debido a que las proteínas aisladas por afinidad con IPN002 eran reactivas con IPN001 e IPN002 en la transferencia Western, se concluyó que Tau en el CSF también es reactiva con IPN001.
El CSF y el flujo continuo de medios acondicionados de las resinas de afinidad con IPN002 se aplicaron secuencialmente y se eluyeron de T46 (Tau # 428-441) y HT7 (Tau # 159-163) para determinar si estaba presente cualquier fragmento de tau C-terminal o de región media que no fue aislados por IPN002. Los eluatos se sondearon con el anticuerpo Dako C-terminal (figura 4c) pero no se detectó inmunorreactividad. Estos datos sugieren que la tau inmunorreactiva con IPN001 e IPN002 es más abundante que los fragmentos de tau de longitud completa, de región media solamente o C-terminales. Las alícuotas del flujo continuo de cada uno de los CSF y los medios acondicionados se guardaron para la comparación previa frente a posteriormente al aislamiento para determinar si se eliminó toda la tau detectable durante el aislamiento, utilizando un kit disponible en el mercado comúnmente utilizado para determinar los niveles de Tau en el CSF. Los datos se muestran en la figura 5. Este análisis demostró que toda la tau detectable se eliminó de las muestras posteriores a CSF durante el proceso de aislamiento por afinidad.
Estos datos proporcionan una fuerte evidencia de que tanto IPN001 como IPN002 reaccionan con las principales especies de tau presentes en el CSF de pacientes sanos y con AD.
Ejemplo 4: Detección de eTau en muestras de pacientes.
MATERIALES Y PROCEDIMIENTOS
Recolección de medios acondicionados a partir de neuronas corticales derivadas de iPSC
Se generaron iPSC (células madre pluripotentes inducidas) a partir de controles sanos saludable y pacientes con Alzheimer de la misma edad utilizando el procedimiento Yamanaka (Takahashi y col. (2007) Cell 131 (5), 861) como se describe en Dimos y col. (2008) Science 321: 1218. Las iPSC se diferenciaron en neuronas corticales en gran medida según los protocolos publicados que utilizan el procedimiento de monocapa SMAD doble (Chambers y col. (2009) Nat. Biotechnol. 27: 275) seguido de una diferenciación de neuronas corticales similar a la descrita en Shi y col. (2012) Nat. Neurosci. 15: 477), Las neuronas corticales derivadas de iPSC (iPSC-CN), cultivadas durante 108 días, se lavaron, se añadieron medios frescos y se recogieron medios acondicionados después de tres días, a menos que se indique lo contrario. Se realizaron múltiples diferenciaciones de las líneas para garantizar la reproducibilidad de los niveles de eTau. Los medios acondicionados se centrifugaron a 15.000 rpm durante 15 minutos antes del procesamiento para transferencia Western o ELISA de tau. Para el experimento de brefeldina A, los cultivos de iPSC-CN se lavaron con PBS antes de la adición de medios frescos con y sin brefeldina A 1 pM y medios acondicionados durante una hora antes de la recolección. Recolección de medios acondicionados a partir de neuronas corticales primarias humanas
Se prepararon cultivos de neuronas corticales humanas (CHC) como se describe en Wright y col. (2007) Neurobiol. Aging 28: 226. En resumen, Advanced Bioscience Resources (Alameda, CA) obtuvo tejido cortical cerebral fetal humano y cumplió con las pautas federales para la investigación fetal y con la Ley de Donación Anatómica Uniforme. El tejido se enjuagó en solución salina tamponada de Hank (Cellgro) y se trituró en presencia de 1 pg/ml de DNasa (EMD) y se pasó a través de un filtro de células de 100 pm. Después de la centrifugación, el sedimento se resuspendió en 0,05% de tripsina/EDTA (Invitrogen) durante 20 minutos a 37 °C. La tripsina se inactivó añadiendo un volumen igual de medio que contenía 10% de suero fetal bovino (FBS) y la muestra se trituró suavemente nuevamente en presencia de DNasa. Después de la centrifugación, las células se resuspendieron en medios de siembra en placas (Neurobasal que contiene B27, Invitrogen) y se contaron. Las células se colocaron en placas o en cubreobjetos recubiertos con poli-d-lisina con laminina. Se lavaron HCC de tres semanas de edad, se añadieron medios frescos y se recogieron medios después de tres días de acondicionamiento. Los medios acondicionados se centrifugaron a 15.000 rpm durante 15 minutos antes del procesamiento para la transferencia Western.
Recolecciones de ISF de ratón P301L y CSF humano
Los ratones se anestesiaron usando isoflurano (2 %, 800 ml/min de O2). Se usó bupivacaína/epinefrina para la analgesia local y fynadina o carprofeno para la analgesia peri/postoperatoria. Los animales se colocaron en un marco estereotáxico (Kopf instruments, EE. UU.). Se insertaron sondas de microdiálisis “push-pull” (membrana de fosfatidil etanolamina (PEE), Brainlink, Países Bajos) en el hipocampo (superficie expuesta de 3 mm). El muestreo de microdiálisis se realizó 24 y 48 horas después de la cirugía. En los días del muestreo, las sondas de los animales se conectaron con tubos de etileno propileno fluorado (FEP) a una bomba de microperfusión (bomba de jeringa Harvard PHD 2000, Holliston, MA o similar). Las sondas de microdiálisis se perfundieron con CSF artificial (aCSF) que contenía NaCl 147 mM, KCl 3,0 mM, CaCh 1,2 mM y MgCl21,2 mM y 0,15 % de albúmina de suero bovino (BSA) a un caudal de 0,75 pl/min. Se recogieron muestras de microdiálisis durante períodos de 60 minutos. Después del período de estabilización, se recogieron muestras basales. En el segundo día de muestreo, se repitió el procedimiento anterior (Brains Online). El líquido intersticial (ISF) se centrifugó a 15.000 rpm durante 15 minutos y se eliminaron los sobrenadantes utilizados para las transferencias Western de eTau. Se recogieron 10 ml de CSF (Precision Med) de un grupo de 10 pacientes sanos (Precision Med), 10 pacientes con AD (Precision Med) y 10 pacientes con PSP, se centrifugaron a 15.000 rpm durante 15 minutos, los sobrenadantes se limpiaron previamente en resina de afinidad IgG seguida de aislamiento de tau en una resina de afinidad con IPN002 antitau, se lavaron, se eluyeron con glicina 50 mM, pH 2,3 con NaCl 150 mM en un tubo que contenía TBS 1 M, pH 8,3 para neutralizar el pH, se concentraron en filtros YM10 y se prepararon para transferencias Western de tau. Los medios condicionados con iPSC-CN de un paciente con fAD PSEN1 se aislaron de manera similar como un control positivo para comparar los patrones de formación de bandas.
Transferencias Western
Los medios acondicionados se diluyeron en tampón Laemmli (Sigma). Las neuronas cultivadas se enjuagaron con PBS antes de la incubación en tripsina al 0,05 % en DMEM (Invitrogen), se enjuagaron y se lisaron en tampón Laemmli. Todas las muestras se llevaron a ebullición, se separaron en geles de tris-glicina poliacrilamida (Invitrogen) y se transfirieron a nitrocelulosa usando iBlot (Invitrogen). Las membranas se incubaron en tampón de bloqueo (LiCor), se sondearon con 0,5 pg/ml de anticuerpo IPN001 contra tau y anticuerpo contra p-actina (1:2000; Abcam) en tampón de bloqueo que contenía Tween-20 al 0,1 %, y anticuerpos secundarios 680 anti-ratón y 800 anti-conejo (LiCor). Las transferencias se escanearon con el sistema de imagenología infrarroja Odyssey SA y se analizaron con el software Odyssey SA (LiCor).
ELISA de Tau
Los medios se recogieron después de un período de acondicionamiento de tres días a partir de cultivos de neuronas corticales derivadas de iPSC y se analizaron usando un ensayo homogéneo Alphascreen para medir tau. Se mezclaron 10 pg/ml de perlas aceptoras AlphaLISA y anticuerpo anti-tau biotinilado anti-tau 1 nM con medio acondicionado durante la noche a temperatura ambiente. Se añadieron 40 pg/ml de perlas donadoras de estreptavidina (Perkin Elmer) durante 30 minutos a temperatura ambiente y la placa se leyó en el lector de placas Envision.
Purificación de eTau
Los medios acondicionados recogidos de iPSC-CN de pacientes con AD se centrifugaron a 15.000 rpm durante 15 minutos, se recogieron los sobrenadantes y se limpiaron previamente en una resina de afinidad por IgG. El sobrenadante limpiado previamente se hizo pasar a través de una resina de anticuerpo anti-tau IPN002, se lavó y se eluyó eTau con citrato de sodio 50 mM, pH 2,3 con NaCl 150 mM, en un tubo que contenía TBS 1 M, pH 8,3 para neutralizar el pH. El eluato se concentró y el tampón se cambió a PBS.
Inmunofluorescencia
Las MCC se enjuagaron con PBS, se fijaron en paraformaldehído al 4 %, se bloquearon con suero de burro normal al 10 % (Jackson ImmunoResearch) en PBS, se permeabilizaron (a menos que se especifique lo contrario) con Triton-x-100 al 0,2 % en PBS durante 15 minutos y se tiñeron con anticuerpo IPN001 contra tau con el anticuerpo secundario de burroanti-ratón-A488 (sondas moleculares) y DAPI (Invitrogen). Las imágenes fueron adquiridas usando el microscopio Leica DMI 600 B a 40x usando el software LAS AF (Leica). Se obtuvieron imágenes confocales utilizando el microscopio confocal Nikon Eclipse Ti (Nikon).
RESULTADOS
Se realizaron ensayos para detectar fragmentos de eTau en diversos fluidos. Los resultados se representan en la figura 7. Como se muestra en la figura 7, panel izquierdo, la tau endógena se secreta a partir de neuronas corticales derivadas de células madre pluripotentes inducidas por humanos (iPSC-neuronas corticales humanas; iPSC-CN), donde la Tau secretada se conoce como Tau extracelular o “eTau”. Como se muestra en la figura 7, segundo panel de la izquierda, eTau también está presente en medios acondicionados de neuronas primarias humanas (células corticales humanas; “HCC”), lo que confirma que eTau no es un artefacto de diferenciación de iPSC. Estos fragmentos de eTau también se detectaron en lisados neuronales, lo que sugiere que la tau se escinde dentro de las neuronas antes de la secreción de eTau.
Como se muestra en la figura 7, panel central, se detectaron fragmentos de tau similares en líquido intersticial (ISF) de ratones tau P301L, donde no se detectó tau de longitud completa en ninguno de los sistemas. Los ratones P301L son transgénicos para una forma de tau humana que tiene una mutación P301L; Los ratones P301L son modelos para la tauopatía humana. Véase, por ejemplo, Gotz y col. (2001) J. Biol. Chem 276: 529; y Lewis y col. (2000) Nature Genetics 25: 402.
Como se muestra en la figura 7, paneles de la derecha, los niveles de eTau aumentan en el CSF de pacientes con AD y en múltiples líneas de pacientes con AD familiar (fAD) en comparación con las líneas de pacientes sanos. Como se muestra en la figura 7, paneles de la derecha, también se detectó eTau en el CSF de pacientes con PSP.
Ejemplo 5: eTau induce hiperactividad neuronal
PROCEDIMIENTOS
El registro de pinzamiento zonal de membrana celular completa de iPSC-CN cultivadas en monocapa de astrocitos humanos normales usando micro pipeta (2-5 MOhm) se llenó con una solución que contenía (mM): K-metilsulfato (140), NaCl (10), CaCl2 (1), Mg-ATP (3); Na-GTP (0,4), EGTA (0,2), HEPES (10), Fosfocreatina (10) con pH ajustado = 7,3 y mOsm = 305. Las neuronas se perfundieron (2 ml/min) con líquido cefalorraquídeo artificial que contenía (mM): NaCl (140), KCl (2,5), MgCl2 (2) CaCh (2), Hepes (10), D-Glucosa (10), sacarosa (20), pH ajustado = 7,4 mOsm = 310. Los registros se realizaron utilizando el software de adquisición de datos pClamp-10.3 (Molecular Devices) y el amplificador MultiClamp 700B (Axon Instrument; Foster City CA). La aplicación por descarga instantánea de eTau o eTau con inhibidores, tetrodotoxina (TTX) (Tocris), MK801 (Sigma), NBQX (Tocris) o anticuerpo anti-tau, IPN001, se realizó utilizando el sistema de microperfusión MiniSquirt (AutoMate, Berkeley, CA) El análisis de datos fuera de línea utilizó el software de análisis Clampfit 10.2 (Molecular Devices). Los registros se realizaron a 34-37 °C.
RESULTADOS
Para determinar si eTau puede alterar la función neuronal, se aplicó el fragmento de eTau purificado, eTau, a iPSC-CN o HCC. Los resultados se muestran en las figuras 8A-C.
Como se muestra en la figura 8A, la adición de una mezcla de fragmentos eTau purificados en estas neuronas promovió la hiperactividad. Como se muestra en la figura 8B, la hiperactividad inducida por la mezcla eTau fue inhibida por la tetrodotoxina (TTX) y por los antagonistas de receptores de glutamato NMDA y AMPA, MK801 y NBQX, respectivamente. La TTX bloquea los potenciales de acción en los nervios al unirse a los canales rápidos de sodio dependientes de voltaje en las membranas de las células nerviosas. Estos datos sugieren que la hiperactividad neuronal inducida por eTau depende de la liberación de glutamato mediada por el potencial de acción. En contraste, como se muestra en el panel central de la figura 8A, la aplicación de tau de longitud completa no produjo cambios detectables en la actividad neuronal incluso a concentraciones sustancialmente más altas, lo que demuestra que la hiperactividad inducida por eTau depende de fragmentos de tau. Estos resultados de hiperactividad inducidos por eTau sugieren fuertemente que podría estar ocurriendo movilización de calcio en las neuronas. Para determinar si ocurre movilización de calcio en las neuronas, se puso a prueba el efecto de eTau sobre la movilización de calcio. Como se muestra en la figura 8C, eTau-1a movilizó de manera robusta el calcio. Este tipo de hiperactividad neuronal, si se mantiene en un entorno tal crónico como en la AD, podría provocar disfunción neuronal a través de activaciones sinápticas alteradas y estimulación neuronal aberrante. eTau-1a incluye los aminoácidos 2-166 de tau fetal, es decir, los aminoácidos 2-166 de SEQ ID NO: 27.
Ejemplo 6: El anticuerpo anti-tau reduce la hiperactividad neuronal mediada por eTau
Los análisis electrofisiológicos se llevaron a cabo como se describe en el ejemplo 5. Se evaluó el efecto de IPN001 e IPN002 sobre la hiperactividad neuronal mediada por e-Tau.
Como se muestra en la figura 8D, IPN001 reduce la hiperactividad neuronal mediada por eTau. Como se muestra en la figura 19B, IPN002 reduce la hiperactividad neuronal mediada por eTau.
Ejemplo 7: Anticuerpos anti-Tau humanizados
Se generaron variantes humanizadas de IPN002. Las secuencias de aminoácidos de los dominios VH de cadena pesada de las variantes humanizadas 1-4, y las secuencias de nucleótidos que codifican el dominio VH de cadena pesada de las variantes humanizadas, se muestran en las figuras 9-12. Las secuencias de aminoácidos del dominio VL de cadena ligera de las variantes humanizadas 1-4, y las secuencias de nucleótidos que codifican el dominio VL de cadena ligera de las variantes humanizadas, se muestran en las figuras 13-16. Las diferencias de aminoácidos con respecto a la secuencia de aminoácidos de IPN002 se resumen en las tablas 4 y 5.
Tabla 4: Variantes de VH
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Tabla 5: Variantes de Vk
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Los códigos de aminoácidos de una letra son los siguientes:
G - Glicina (Gly)
P - Prolina (Pro)
A - Alanina (Ala)
V -Valina (Val)
L - Leucina (Leu)
I - Isoleucina (Ile)
M - Metionina (Met)
C - Cisteína (Cys)
F - Fenilalanina (Phe)
Y - Tirosina (Tyr)
W -Triptófano (Trp)
H - Histidina (His)
K - Lisina (Lys)
R - Arginina (Arg)
Q - Glutamina (Gln)
N - Asparagina (Asn)
E - Ácido glutámico (Glu)
D - Ácido aspártico (Asp)
S - Serina (Ser)
T - Treonina (Thr)
Ejemplo 8: Caracterización de variantes de IPN002 humanizadas
Las afinidades de unión a tau relativas para unirse a cada una de las tau recombinantes (tau recombinante de 383 aminoácidos) así como a eTau 1a, eTau1b, eTau2, eTau3 y eTau4 para cada una de las 16 combinaciones de anticuerpos de VH#1-4 con Vk#1-4 se muestran en la tabla 4, que se presenta en la figura 17. Las afinidades de unión relativas para cada especie tau y eTau varían de 121 pM a 1030 pM para cada una de las combinaciones de anticuerpos VH/Vk. eTau 1a incluye los aminoácidos 2-166 de tau fetal, es decir, los aminoácidos 2-166 de SEQ ID NO: 27; y eTau 1b incluye los aminoácidos 2-196 y 217-228 de tau fetal, es decir, los aminoácidos 2-196 y 217-228 de SEQ ID nO: 27. Las secuencias de aminoácidos de eTau3 y eTau 4 se representan en la figura 20.
Para obtener afinidades absolutas, así como Kon y Kdis para estos anticuerpos humanos VH/Vk, el análisis Octet se realizó usando tau (tau recombinante de 383 aminoácidos). La Kd variaba de 42,6 pM a 2120 pM. Para todas las variantes de VH/Vk, los valores de Kon fueron altos y los valores de Kdis fueron bajos para Tau y para cada especie eTau. Los datos se proporcionan en la tabla 5, que se presenta en la figura 18.
Un subconjunto de las variantes de IPN002 humanizadas descritas anteriormente se puso a prueba en un análisis adicional. Como se muestra en la figura 19A, se usaron tres variantes, VH2/Vk1, VH2/Vk2 y VH2/Vk3, en un ensayo de transferencia Western con una variedad de muestras que contenían tau. Las muestras que contenían tau incluían medios condicionados de iPSC-CN; lisados de iPSC-CN; lisados cerebrales de AD; y lisados de corteza cerebral de ratón P301L tau; y lisados cerebrales de macaco cangrejero. Los datos muestran que las variantes de IPN002 humanizadas descritas anteriormente son reactivas con tau en una variedad de muestras.
Se analizó un subconjunto de las variantes de IPN002 humanizadas descritas anteriormente para determinar la capacidad de reducir la hiperactividad neuronal inducida por eTau. Como se muestra en la figura 19B, el IPN002 parental y las variantes VH2/Vk1, VH2/Vk2 y VH2/Vk3 bloquearon la hiperactividad inducida por eTau.
E je m p lo 9: P ru eb a s d e la in m u n o g e n ic id a d d e las v a ria n te s d e IP N 002 h u m a n iza d a s
El anticuerpo anti-tau humanizado se evaluó para determinar el potencial inmunógeno. Se usó un ensayo EpiScreen™. Véase, por ejemplo, Jones y col. (2004) J. Interferon Cytokine Res. 24: 560; y Jones y col. (2005) J. Thromb. Haemost.
3:991. Los ensayos de linfocitos T a lo largo del tiempo se realizaron usando células mononucleares de sangre periférica (PBMC) agotadas en CD8+; y la proliferación de linfocitos T se midió mediante la incorporación de [3H] -timidina en diversos puntos temporales después de la adición de muestras de anticuerpos de prueba.
Las PBMC se aislaron a partir de capas leucocitarias de donantes sanos de la comunidad (por ejemplo, de sangre extraída dentro de las 24 horas de la prueba). Las respuestas de los linfocitos T a un anticuerpo de prueba (por ejemplo, una variante de IPN002 humanizada) se compararon con un anticuerpo estándar clínico.
Se añadió anticuerpo de prueba purificado (variante de IPN002 humanizada) a cultivos de PBMC in vitro hasta una concentración final de 50 pg/ml en medio de cultivo, para generar una muestra de prueba. Se incluyeron como control de anticuerpos clínicos (control positivo) y un control de medio de cultivo solamente (control no estimulado) como muestras de control. Las muestras de prueba (PBMC más el anticuerpo de prueba) y las muestras de control se incubaron durante 8 días a 37 °C con un 5 % de CO2. En los días 5, 6, 7 y 7, las células en las muestras de prueba y de control se suspendieron y transfirieron a los pocillos de una placa de cultivo multipocillo. Las muestras de prueba y control se pulsaron con 0,75 pCi [3H] -timidina y se incubaron durante 18 horas más antes de recoger sobre esteras filtrantes. Los recuentos por minuto (cpm) para cada pocillo se determinaron usando recuento por centelleo.
Para los ensayos de proliferación, se utilizó un umbral de un SI igual o superior a 2, donde las muestras que inducían una respuesta proliferativa por encima de este umbral se consideraron positivas. El SI (Índice de estimulación) es el recuento medio de muestras de prueba dividido por la media del control no estimulado.
Los datos se muestran en las figuras 21A-C. Respuestas de proliferación de linfocitos T de donantes sanos a un anticuerpo de prueba IPN002 humanizado. Se tomaron muestras de PBMC de cultivos en masa y se evaluó la proliferación en los días 5, 6, 7 y 8 después de la incubación con las muestras de prueba. Las respuestas de proliferación con un SI > 2,0 (p <0,05), indicadas por la línea horizontal discontinua, que fueron significativas (p <0,05) utilizando una prueba t de Student de dos muestras con datos no emparejados se consideraron positivas.
Como se muestra en la figura 21A, un anticuerpo IPN002 completamente humanizado de prueba tenía un bajo potencial inmunógeno (por debajo del umbral de SI de 2,0). La figura 21B muestra resultados con un anticuerpo quimérico de referencia, donde el anticuerpo quimérico de referencia tiene regiones variables de cadena ligera y pesada murinas de IPN002 y región constante de IgG4 humana; y la figura 21C muestra resultados con un anticuerpo A33 humanizado de control clínico inmunógeno.
E jem p lo 10: IP N 002 re d u ce el n ivel d e T au fo s fo rila d a in vivo
Se evaluó el efecto de la administración de IPN002 sobre el nivel de Tau que se fosforila en los aminoácidos 202 y 205. Se usó el modelo en ratón P301L. Los ratones P301L son transgénicos para una forma de tau humana que tiene una mutación P301L; Los ratones P301L son modelos para la tauopatía humana. Véase, por ejemplo, Gotz y col. (2001) J. Biol. Chem 276: 529.
Los ratones P301L (3-4 meses) fueron tratados con: 1) IgG de control; 2) anticuerpo anti-Tau fosforilada PHF1; o 3) IPN002. La IgG de control y los anticuerpos IPN002 se inyectaron por vía intraperitoneal a una concentración de 10 mg/kg durante 4 semanas; después a 20 mg/kg durante otras 4 semanas. PHF1 se administró a 10 mg/kg durante todo el ciclo de 8 semanas. En el día 60 después del comienzo del régimen de tratamiento con anticuerpos, se midió el nivel de Tau fosforilada en el hipocampo. Los datos se representan en la figura 22.
Tau que está fosforilada en los aminoácidos 202 y 205 se denomina “AT8”. Como se muestra en la figura 22, el tratamiento con IPN002 dio como resultado una disminución estadísticamente significativa de fosfo-Tau insoluble (AT8) según lo evaluado por ELISA (panel izquierdo), y tendencia a una disminución según lo evaluado por análisis de transferencia Western (panel derecho) en comparación con tratamiento de control con IgG. El tratamiento con PHF1 mostró una tendencia hacia una disminución del AT8 insoluble, en apoyo de los hallazgos de Chai y col. ((2011) J. Biol. Chem.
286:34457) y Boutajangout y col. ((2011) J. Neurochem. 118:658).
Ejemplo 11: IPN002 reduce los niveles de tau libre tanto en ISF como en CSF
Se determinó el efecto de la administración de IPN002 sobre los niveles de tau libre en CSF y líquido intersticial (ISF). Los ratones P301L se trataron como se describe en el ejemplo 10. El nivel de tau libre presente en ISF que no está unida a IPN002 se determinó usando IPN001. Como se muestra en la figura 23, el tratamiento con IPN002 redujo los niveles de Tau libre (no unida a IPN002) (panel izquierdo) en ISF en ratones P301L tratados con IPN002.
Para determinar si IPN002 reduce los niveles de Tau libre en el CSF en la misma medida que lo hace en el ISF, los ratones P301L se trataron como se describe en el ejemplo 10, y se determinó el efecto del tratamiento con IPN002 sobre el nivel de tau libre (no unida a IPN002) en el CSF de los ratones tratados. En la figura 24 se muestran los resultados. En el panel izquierdo de la figura 24, se exhiben los niveles de tau libre (no unida a IPN002; denominada “tau libre (de IPN002)”) en el CSF de ratones no tratados, tratados con IgG de control, tratados con PHF1 y tratados con IPN002. Como se muestra en el panel derecho de la figura 24, los niveles de tau libre en el CSF son comparables a los niveles de tau libre en el ISF de ratones tratados con IPN002, lo que demuestra que el análisis de tau en ISF se correlaciona bien con el material clínicamente más relevante, CSF.
Ejemplo 12: El anticuerpo anti-tau reduce la hiperactividad neuronal mediada por eTau
Los análisis electrofisiológicos se llevaron a cabo como se describe en el ejemplo 5. Se evaluó el efecto de IPN002 sobre la hiperactividad neuronal inducida por e-Tau.
Como se muestra en la figura 25, IPN002 reduce la hiperactividad neuronal mediada por eTau.
Ejemplo 13: Los fragmentos Tau están presentes en el CSF obtenido de individuos con encefalopatía traumática crónica (CTE) probable
Se obtuvieron muestras de CSF de ex-defensas de la Liga Nacional de Fútbol (NFL), quienes exhibían déficits cognitivos/de comportamiento y que se consideraba que tenían CTE. Las muestras de CSF se analizaron para detectar la presencia de fragmentos eTau. Los fragmentos de eTau se aislaron por afinidad a partir del CSF agrupado de individuos sanos e individuos con probable CTE. Los fragmentos eTau aislados se separaron usando electroforesis en gel de poliacrilamida; y los fragmentos separados se transfirieron a una membrana. La membrana se sondeó con IPN001. Los resultados, presentados en la figura 26, muestran que los fragmentos de Tau están presentes en el CSF obtenido de individuos con probable CTE.
Ejemplo 14: Unión de una variante humanizada de IPN002 a péptidos Tau sintéticos
La unión de una variante humanizada de IPN002 (“hu-IPN002”) al péptido Tau biotinilado sintético 1 y 2 se puso a prueba tanto en ensayos en fase sólida como en fase de solución.
Las secuencias de aminoácidos del péptido 1 y el péptido 2 son las siguientes:
Péptido 1 (aminoácidos de Tau 13-24): DHAGTYGLGDRK (SEQ ID NO: 49);
Péptido 2 (aminoácidos de Tau 15-44): AGTYGLGDRKDQGGYTMHQDQEGDTDAGLK (SEQ ID NO: 50).
El anticuerpo o péptido biotinilado se diluyó en solución salina tamponada con fosfato. Las concentraciones finales fueron las siguientes: 1 pg/ml de hu-IPN002; 1 pg/ml de rTau383 (Tau recombinante de longitud completa); 5 pg/ml (péptido biotinilado 1); y 5 pg/ml (péptido biotinilado 2). Se añadieron 100 pl de caseína al 0,1 % en PBS a los pocillos de una placa multipocillo. Se añadieron 150 pl de la solución de 1 pg/ml de hu-IPN002. Se realizaron diluciones en serie. Se añadieron 100 pl de biotina-péptidos a los pocillos que contenían anticuerpos diluidos en serie. La placa multipocillo se incubó durante una hora a temperatura ambiente. Después del período de incubación, los pocillos se lavaron 5 veces con una solución de Tween 20 al 0,05 % en PBS; seguido de 2 lavados con PBS.
Se añadió a los pocillos el anticuerpo secundario conjugado con estreptavidina-peroxidasa de rábano picante (HRP), y las placas se incubaron a temperatura ambiente durante 1 hora. Después del período de incubación, los pocillos se lavaron 5 veces con una solución de Tween 20 al 0,05 % en PBS; seguido de 2 lavados con PBS.
Se añadió sustrato de HRP 3,3',5,5'-tetrametilbencidina (TMB), y se incubó durante 1-15 minutos. La reacción se detuvo mediante la adición de 100 |jl de ácido sulfúrico 1 N. Se leyó la absorbancia a 450 nm.
Los resultados se muestran en las figuras 27 y 28, y se resumen en la tabla 6.
T a b la 6
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La figura 29 representa la unión de hu-IPN002 a Tau recombinante de longitud completa (rTau-383) y péptido del dominio activador de fosfatasa (PAD) (aminoácidos de tau 2-28; AEPRQEFEVMEDHAGTY; SeQ ID NO: 80). Como se muestra en la figura 29, hu-IPN002 no se une al péptido PAD.
La figura 30 muestra que el péptido Tau no biotinilado 1 (aminoácidos de Tau 13-24) y el péptido 2 no biotinilado (aminoácidos de Tau 15-44) compiten con las formas biotiniladas del péptido Tau 1 y el péptido Tau 2 para unirse a hu-IPN002. Estos datos muestran que la unión del péptido Tau 1 y el péptido Tau 2 a hu-IPN002 es específica y no se debe a la adición de la biotina.
E jem p lo 15: E fec to in vivo d e IP N 002 s o b re la p a to lo g ía
En este estudio, se investigó el efecto de una intervención terapéutica sobre la movilidad reducida y la patología de Tau en un modelo de tauopatía de ratón transgénico (hTau.P301L-Tg). En estos ratones, un mutante clínico de Tau humana (P301L) se expresa bajo el control del promotor Thy1 murino (expresión específica de neurona). El comportamiento (equilibrio al caminar sobre barra) se midió a los 7, 8, 8,5 y 9 meses de edad, así como el día antes de la finalización del estudio. Los criterios de valoración del estudio incluyeron: (1) supervivencia; (2) comportamiento: desempeño de equilibrio al caminar sobre barra y puntuación de distonía; (3) bioquímica: pan-Tau en homogeneizado total, fracciones solubles e insolubles del tronco encefálico; y (4) biomarcadores: AT8 en homogeneizado total y fracciones insolubles de tronco encefálico.
M A T E R IA L E S Y P R O C E D IM IE N T O S
Los ratones P301L (3-4 meses) fueron tratados con: 1) IgG de control; 2) anticuerpo anti-Tau fosforilada PHF1; o 3) IPN002. Los anticuerpos IgG de control e IPN002 se inyectaron por vía intraperitoneal a una concentración de 20 mg/kg una vez por semana durante 6 meses. PHF1 se administró a 10 mg/kg durante 6 meses. PHF1 es un anticuerpo monoclonal de ratón que reconoce un epítopo que incluye fosfo-Ser396 y fosfo-Ser404. Santacruz y col. (2005) Science 309: 476.
P eso s c o rp o ra le s y c o m p o rta m ie n to d e d is to n ía
Los pesos corporales se determinaron semanalmente durante el tratamiento y en el sacrificio. El peso corporal y la puntuación de distonía se registraron semanalmente desde el inicio del estudio hasta la edad de 7 meses. A partir de la edad de 7 meses en adelante, los ratones fueron monitorizados dos veces por semana en busca de movilidad en su jaula, pérdida de peso y primeros signos de distonía de las extremidades posteriores y anteriores. Una vez que los signos de distonía estaban presentes, el peso corporal se determinó diariamente y el comportamiento de distonía se puntuó hasta el momento del “sacrificio prematuro”. Para puntuar el comportamiento de distonía, los ratones se sostuvieron a aproximadamente 1,5 cm por encima de la base de su cola durante unos diez segundos. Se calculó la distonía para cada miembro por separado utilizando una escala de calificación de 4 puntos. A los ratones sacrificados de forma preliminar se les asignó una puntuación máxima. Las puntuaciones de las extremidades anteriores se utilizaron principalmente como evidencia de apoyo para las decisiones de sacrificio. Estas últimas se realizaron en las observaciones combinadas de distonía, pérdida de peso y movilidad en su jaula y según criterios predefinidos. Las puntuaciones de las extremidades posteriores izquierda y derecha unificadas en una puntuación de distonía se utilizaron para la evaluación de la evolución de distonía durante todo el tratamiento y la evaluación de las diferencias de grupo al final del estudio. Los ratones que murieron prematuramente por epilepsia están excluidos del análisis. El análisis estadístico se realizó utilizando ANOVA bidireccional con medidas repetidas seguidas de la prueba post-hoc de Bonferroni, y utilizando la prueba de la T de Student en los promedios grupales de las últimas puntuaciones de distonía antes del sacrificio, respectivamente.
Equilibrio al caminar sobre la barra
La prueba de equilibrio al caminar sobre la barra se realizó con el grupo de referencia y a los 7, 8, 8,5 y 9 meses de edad, así como el día antes de la finalización del estudio, con los grupos de tratamiento, para determinar la disfunción motora y el aprendizaje motor. La capacidad de un determinado ratón para mantener el equilibrio sobre la barra y el tiempo necesario para caminar una distancia de 1 metro es una medida de su equilibrio, coordinación, condición física y planificación motora. Se colocó una barra de cobre con un diámetro circular de 12 mm a un ángulo de 30°. El área de inicio de la barra se iluminó con una lámpara de escritorio, mientras que una plataforma de escape interior se colocó al final. Para las pruebas de entrenamiento iniciales, se usó una barra más ancha para entrenar a los ratones a mantener el equilibrio y caminar hacia la plataforma. Después de las pruebas de entrenamiento, se midió la latencia de los ratones a una distancia de 1 m. Además, mediante observaciones de la marcha, se determinaron los primeros síntomas de disfunción motora (resbalones de la pata y arrastre del vientre). El análisis estadístico de las puntuaciones de latencia se realizó mediante ANOVA bidireccional seguido de pruebas post-hoc de Bonferroni.
RESULTADOS
Comportamiento de distoma y equilibrio al caminar sobre la barra
El efecto de IPN002 sobre el comportamiento de distonía se muestra en la figura 31. Como se muestra en la figura 31, el tratamiento con IPN002 redujo la puntuación de distonía, en comparación con IgG de control. En la figura 32 se muestra el efecto de IPN002 sobre la función motora, según lo evaluado por el equilibrio al caminar sobre la barra. Como se muestra en la figura 32, el tratamiento con IPN002 redujo significativamente la latencia promedio (y, por lo tanto, mejoró la función motora), en comparación con IgG de control. Por lo tanto, el tratamiento con IPN002 reduce significativamente el déficit motor en ratones transgénicos P301L tau. Usando el mismo procedimiento estadístico, los resultados con el tratamiento con PHF1 no alcanzaron significación.
Niveles de Tau
Se evaluó el nivel de tau libre (tau no unida a IPN002) en el CSF de ratones P301L después del tratamiento con IgG de control, PHF1 o IPN002. El nivel de tau libre presente en CSF que no está unida a IPN002 se determinó usando IPN001. Los datos se muestran en la figura 33. Como se muestra en la figura 33, el tratamiento con IPN002 redujo los niveles de tau libre (no unida a IPN002) en un 96 %, en comparación con los niveles en ratones tratados con IgG de control.
Ejemplo 16: Efecto de IPN002 sobre la hiperexcitabilidad neuronal inducida por eTau
MATERIALES Y PROCEDIMIENTOS
El registro de pinzamiento zonal de membranas celulares completas se realizó en cultivos corticales primarios humanos. Las neuronas se perfundieron (2 ml/min) con líquido cefalorraquídeo artificial que contenía (mM): NaCl (140), KCl (2,5), MgCl2 (2) CaCl2 (2), Hepes (10), D-Glucosa (10), sacarosa (20), pH ajustado = 7,4 mOsm = 310. Los registros se realizaron utilizando el software de adquisición de datos pClamp-10.3 (Molecular Devices) y el amplificador MultiClamp 700B (Axon Instrument; Foster City CA). Aplicación por descarga instantánea de: 1) eTaula (aminoácidos 2-166); 2) tau fosforilada o eTau con inhibidores; 3) control de IgG; o 4) los anticuerpos anti-tau, PHF1, IPN001 o Dako (tau policlonal anti-C-terminal) se realizaron usando el sistema de microperfusión MiniSquirt (AutoMate, Berkeley, CA). El análisis de datos fuera de línea utilizó el software de análisis Clampfit 10.2 (Molecular Devices). Los registros se realizaron a 34-37 °C.
RESULTADOS
Los datos se muestran en las figuras 34 y 35. Como se muestra en la figura 34, IPN002 redujo la hiperactividad neuronal inducida por eTau1a. Ni el IgG de control ni “Dako” (Ab policlonal anti-C-terminal) efectuaron una reducción significativa en la hiperactividad neuronal. PHF1 no redujo la hiperactividad neuronal inducida por eTau 1a.
El efecto de eTaula sobre la hiperactividad neuronal se comparó con el efecto de la Tau fosforilada, reactiva con PHF1 de longitud completa (fosfo-Tau) sobre la hiperactividad neuronal. Como se muestra en la figura 35, panel medio, fosfo-Tau, reactiva con PHF1, de longitud completa, no indujo hiperactividad neuronal en 2 de las 3 células analizadas; la tercera célula puesta a prueba mostró solo un pequeño grado de hiperactividad neuronal, en comparación con la situación inicial (panel superior). En contraste, eTaula indujo hiperactividad neuronal en las 3 células analizadas (panel inferior). Estos datos se representan gráficamente en la figura 36.
Ejemplo 17: Efecto de IPN002 sobre los niveles de Ap
MATERIALES Y PROCEDIMIENTOS
Secreción de Ap a partir de neuronas corticales derivadas de iPSC
Se cultivaron in vitro neuronas corticales derivadas de iPSC (iPSC-CN) Las iPSC se generaron a partir de individuos sanos; individuos con AD familiar con una mutación en una proteína presenilina (PSEN1); un individuo con AD familiar con una mutación en una proteína presenilina (PSEN2); y un individuo con AD esporádica (sAD). Después de aproximadamente -55-60 días en cultivo, se clasificaron iPSC-CN según la expresión de L1-CAM (CD171) para enriquecer para neuronas corticales maduras; las células clasificadas se cultivaron en cocultivo con astrocitos humanos normales durante 30 días. Después de cocultivar durante 30 días, se trataron iPSC-CN durante 25 días adicionales con diversas concentraciones de inhibidor de la enzima de escisión de la proteína precursora de amiloide del sitio beta (BACE), IgG de control o IPN002, con cambios en los medios 2X/semana. Los medios acondicionados se recogieron y pusieron a prueba en ELISA de beta amiloide 40 humano y beta amiloide 42 de alta sensibilidad de Millipore, para detectar Ap-Mo (“Ap40”) y Api-42 (“A42”). Ap40 y Ap42 son productos de escisión de la proteína precursora de amiloide; las placas seniles contienen tanto Ap42 como Ap40.
Secreción de Ap de neuronas corticales humanas primarias
El tejido cortical cerebral fetal humano fue obtenido por Advanced Bioscience Resources (Alameda, CA) y cumplió con las pautas federales para la investigación fetal y con la Ley de Donación Anatómica Uniforme. El tejido se enjuagó en solución salina tamponada de Hank (Cellgro) y se trituró en presencia de 1 mg/ml de DNasa (EMD) y se pasó a través de un filtro de células de 100 mm. Después de la centrifugación, el sedimento se resuspendió en 0,05 % de tripsina/EDTA (Invitrogen) durante 20 minutos a 37 °C. La tripsina se inactivó añadiendo un volumen igual de medio que contenía 10 % de suero fetal bovino (FBS) y la muestra se trituró suavemente nuevamente en presencia de DNasa. Después de la centrifugación, las células se resuspendieron en medios de siembra en placas (Neurobasal que contiene B27, Invitrogen) y se contaron. Las células se colocaron en placas, se cultivaron durante 5 semanas y se añadieron medios nuevos que contenían anticuerpos a las concentraciones establecidas durante 10 días con cambios de medios cada 3-4 días con medios acondicionados recogidos después de 10 días de tratamiento. Los medios acondicionados se centrifugaron a 15.000 rpm durante 15 minutos antes del procesamiento para el análisis ELISA de Ap40 y Ap42, como se describió anteriormente.
RESULTADOS
Los resultados se muestran en las figuras 37-39.
Como se muestra en la figura 37, el tratamiento de iPSC-CN con IPN002 redujo los niveles de Ap40 y Ap42 secretados por todas las iPSC-CN, mientras que la IgG de control no redujo la secreción de Ap40 o Ap42.
La figura 38 muestra los efectos dependientes de la dosis de diversos anticuerpos sobre la cantidad de Ap40 secretada por las neuronas corticales humanas primarias. Como se muestra en la figura 38, la incubación de neuronas corticales humanas primarias con 10 pg/ml o 30 pg/ml de IPN001, IPN002 o hu-IPN002 (variante humanizada de IPN002) redujo la cantidad de Ap40 secretada. Ni IgG de control ni PHF1 tuvieron ningún efecto significativo sobre la cantidad de Ap40 secretado.
La figura 39 muestra los efectos dependientes de la dosis de diversos anticuerpos sobre la cantidad de Ap42 secretada por las neuronas corticales humanas primarias. Como se muestra en la figura 39, la incubación de neuronas corticales humanas primarias con 10 pg/ml o 30 pg/ml de IPN001, IPN002 o hu-IPN002 redujo la cantidad de Ap42 secretada. Ni IgG de control ni PHF1 tuvieron ningún efecto significativo sobre la cantidad de Ap42 secretado.
Ejemplo 18: Mapeo de epítopos de una variante humanizada de IPN002
MATERIALES Y PROCEDIMIENTOS
El anticuerpo o péptido biotinilado se diluyó en solución salina tamponada con fosfato (PBS). Las concentraciones finales fueron las siguientes: 1 pg/ml de variante humanizada IPN002 (hu-IPN002); 1 pg/ml de rTau383 (Tau recombinante de longitud completa); 5 pg/ml de péptidos biotinilados. Se añadieron 100 pl de caseína al 0,1 % en PBS a los pocillos de una placa multipocillo. Se añadieron 150 pl de la solución de 1 pg/ml de hu-IPN002. Se realizaron diluciones en serie de hu-IPN002, y se aplicaron sobre los pocillos de una placa multipocillo. Se añadieron 100 pl de biotina-péptidos o biotina-Tau de longitud completa a los pocillos que contenían anticuerpos diluidos en serie. La placa multipocillo se incubó durante una hora a temperatura ambiente. Después del período de incubación, los pocillos se lavaron 5 veces con una solución de Tween 20 al 0,05 % en PBS; seguido de 2 lavados con PBS.
Se añadió a los pocillos el anticuerpo secundario conjugado con estreptavidina-peroxidasa de rábano picante (HRP), y las placas se incubaron a temperatura ambiente durante 1 hora. Después del período de incubación, los pocilios se lavaron 5 veces con una solución de Tween 20 al 0,05 % en PBS; seguido de 2 lavados con PBS.
Se añadió sustrato de HRP 3,3',5,5'-tetrametilbencidina (TMB), y se incubó durante 1-15 minutos. La reacción se detuvo mediante la adición de 100 j l de ácido sulfúrico 1 N. Se leyó la absorbancia a 450 nm.
R E S U L T A D O S
Los datos se muestran en la figura 40. Los datos presentados en la figura 40 muestran que biotina-Tau 13-24, biotina-Tau 15-24, biotina-Tau15-44 y biotina-fosfo Tau 15-24 (con una Tyr fosforilada correspondiente al aminoácido 18 de Tau de longitud completa) y Tau de longitud completa (rTau383) todos se unían de manera eficiente a hu-IPN002. Por lo tanto, hu-IPN002 se une a un epítopo dentro de los aminoácidos 15-24 de Tau, independientemente del estado de fosforilación de Tyr-18.
E jem p lo 19: A n tic u e rp o q u e s e u ne a tau en el C S F
Se evaluó la unión de IPN002, PHF1, un anticuerpo específico para un epítopo fosforilado lineal y anticuerpo de control, a la tau presente en el CSF.
Se desarrolló un ensayo de unión para identificar anticuerpos que se unen a tau presente en el CSF. El ensayo se representa esquemáticamente en la figura 41. La IgG de control, anticuerpo policlonal específico para un epítopo fosforilado lineal (“poliAb-tau C-terminal”), PHF1 o IPN002 se aplicó sobre los pocillos de una placa multipocillo. El anticuerpo se diluyó en solución salina tamponada con fosfato (PBS). Las concentraciones finales fueron las siguientes: 5 jg/ml de IPN002, IgG, PHF1 o poliAb-tau C-terminal. Se añadieron 100 j l de caseína al 0,1 % en PBS a los pocillos de una placa multipocillo. Se añadieron 100 j l de CSF humano y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. Se añadieron 100 j l de biotina-BT2 biotina-HT7 a los pocillos. BT2 es un anticuerpo monoclonal de ratón que se une a un epítopo dentro de los aminoácidos 194-198 de tau humana. HT7 es un anticuerpo monoclonal de ratón que se une a un epítopo dentro de los aminoácidos 159-163 de tau humana. La placa multipocillo se incubó durante una hora a temperatura ambiente. Después del período de incubación, los pocillos se lavaron 5 veces con una solución de Tween 20 al 0,05 % en PBS; seguido de 2 lavados con PBS.
Se añadió a los pocillos el anticuerpo secundario conjugado con estreptavidina-peroxidasa de rábano picante (HRP), y las placas se incubaron a temperatura ambiente durante 1 hora. Después del período de incubación, los pocillos se lavaron 5 veces con una solución de Tween 20 al 0,05 % en PBS; seguido de 2 lavados con PBS. Se añadió sustrato de HRP 3,3',5,5'-tetrametilbencidina (TMB), y se incubó durante 1-15 minutos. La reacción se detuvo mediante la adición de 100 j l de ácido sulfúrico 1 N. Se leyó la absorbancia a 450 nm.
El ensayo se cuantificó usando cantidades conocidas de fosfo-tau de longitud completa o cantidades conocidas de eTaula (aminoácidos 2-166 de tau). Como se muestra en la figura 41, panel inferior, el ensayo se realizó utilizando tau de longitud completa (panel inferior izquierdo) o eTau-1a (panel inferior derecho), a concentraciones de 0 ng/ml, 0,16 ng/ml, 0,8 ng/ml, 4 ng/ml, 20 ng/ml y 100 ng/ml. Como se muestra en la figura 41, el panel inferior izquierdo, IPN002, poliAb-tau C-terminal y PHF1 se unen a tau de longitud completa. Como se muestra en la figura 41, panel inferior derecho, solo IPN002 se une a eTaula.
El ensayo descrito anteriormente se realizó para poner a prueba la unión de poliAb-tau C-terminal, PHF1 e IPN002 a tau presente en CSF humano a partir de: 1) pacientes de control (sanos); 2) pacientes con MCI; 3) pacientes con AD leve (“leve”); 4) pacientes con AD moderada (“moderada”); y pacientes con AD grave. Los resultados se muestran en la figura 42. Como se muestra en la figura 42, a la tau presente en el CSF se le une IPN002, pero no el epítopo lineal pAb-tau o PHF1. Los datos muestran que: 1) los fragmentos de Tau N-terminales están presentes en el CSF; 2) se detectó tau de longitud completa en CSF; y 3) no se detectaron fragmentos de tau C-terminales que incluyen epítopos BT2 y HT7 en CSF.
E je m p lo 20: E fec to s in vivo d e IP N 002
Los resultados se obtuvieron de un estudio de eficacia de anticuerpos para tau de seis meses en ratones transgénicos P301L tau. Se descubrió que IPN002 reduce globalmente la progresión de la enfermedad, como lo demuestran los niveles de tau libre reducidos drásticamente en el CSF, los niveles reducidos de un marcador de proteína de astrogliosis, la mejora en la patología de tau en múltiples regiones cerebrales y epítopos de fosfotau, y mejores lecturas conductuales/funcionales. IPN002 funcionó tan bien o mejor que el anticuerpo anti-tau PHF1. Finalmente, se obtuvo la confirmación in vivo de un nuevo mecanismo de acción de tau secretada: regulación por retroalimentación positiva de los niveles de beta amiloide. Este estudio claramente distinguió la capacidad del anticuerpo para eTau, IPN002, en comparación con PHF1, para modular los niveles de beta amiloide.
MATERIALES Y PROCEDIMIENTOS
Estudios en animales
Se usó el modelo en ratón transgénico P301L. El ratón transgénico P301L incluye una tau humana 4R2N mutada en P301L, impulsada en expresión por el promotor Thy1 murino (expresión específica de neurona), como un transgén. El modelo transgénico de P301L muestra una hiperfosforilación de tau (AT8 y AT100) dependiente de la edad en la médula espinal, el tronco encefálico, el mesencéfalo y la corteza. La tau hiperfosforilada muestra cambios conformacionales que conducen a la agregación de tau y los ratones desarrollan ovillos neurofibrilares desde la edad de 6 meses, aunque con una alta variabilidad de inicio. Concomitante con la patología, estos ratones desarrollan progresivamente déficits motores tales como distonía de la extremidad posterior, disminución de la movilidad en equilibrio al caminar sobre la barra y requieren sacrificios prematuros en el intervalo de edad entre 8-11 meses. Terwel y col. (2005) Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU. 280: 3963.
100 ratones aleatorizados recibieron dosis ip semanalmente con anticuerpos desde los 3,5 meses de edad durante 6 meses hasta los 9,5 meses de edad. El tratamiento con IPN002 de 20 mg/kg (mpk) se comparó con un anticuerpo de control negativo, 20 mpk de IgG1, y con un anticuerpo anti-tau, 10 mpk de PHF1. PHF1 es un anticuerpo monoclonal de ratón que reconoce un epítopo que incluye fosfo-Ser396 y fosfo-Ser404. Santacruz y col. (2005) Science 309: 476. Los ratones vivos se examinaron para detectar déficits de distonía y el rendimiento de equilibrio al caminar sobre la barra. Los ratones que progresaron rápidamente a la enfermedad en fase terminal se sacrificaron prematuramente (antes de los 9,5 meses de edad) usando criterios predeterminados. Se obtuvieron suero, CSF, hipocampo, corteza, mesencéfalo y rombencéfalo; y los hemisferios cerebrales se seccionaron sagitalmente para histopatología. Los niveles de anticuerpos se midieron en suero y CSF; tau total y tau libre (tau no unida a IPN002; tau “libre de IPN002”) se midieron en CSF; se realizaron análisis bioquímicos/histológicos en tau humana y de ratón; y se analizaron los marcadores de proteína amiloide beta, inflamatoria y sináptica de ratón y los cambios de expresión génica en marcadores de actividad inflamatoria, sináptica y neuronal. Todos los análisis se realizaron con enmascaramiento.
El número de ratones dedicados a este estudio fue de 25-33 ratones por grupo de estudio y 10 para la situación inicial. Todos los ratones reservados para este estudio recibieron un número aleatorio por ordenador y se asignaron aleatoriamente a un tratamiento. Los grupos de ratones se muestran en la tabla 7.
Tabla 7
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Todos los experimentos con animales se realizaron según pautas bioéticas que cumplen totalmente con los principios internacionalmente aceptados para el cuidado y uso de animales de laboratorio. La tabla 8 proporciona los parámetros de tratamiento.
Tabla 8
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Los pesos corporales se determinaron semanalmente durante el tratamiento y en el sacrificio. Las puntuaciones de distonía se registraron semanalmente a partir de los 7 meses de edad. A partir de los 7 meses de edad, los ratones fueron monitorizados dos veces por semana para determinar la movilidad en la jaula, la pérdida de peso y los primeros signos de distonía de las extremidades posteriores.
Comportamiento de distoma. Para puntuar el comportamiento de distoma, los ratones se sostuvieron por la base de su cola durante diez segundos. La distoma de las extremidades posteriores se puntúa utilizando una escala de calificación de 3 puntos: 0. Extremidades posteriores estiradas y dedos extendidos. 1. Una extremidad posterior parcialmente retraída > 50 % del tiempo. 2. Ambas extremidades posteriores retraídas parcialmente > 50 % del tiempo. 3. Ambas extremidades posteriores retraídas por completo durante > 50 % del tiempo. La distonía de las extremidades anteriores se puntúa según 0. Extremidades anteriores estiradas hacia adelante y distantes del cuerpo. 1. Una extremidad anterior parcialmente retraída > 50 % del tiempo. 2. Ambas extremidades anteriores retraídas parcialmente > 50 % del tiempo. 3. Ambas extremidades anteriores completamente retraídas, inmóviles, pérdida muscular, el ratón está “rezando”. Los ratones que muestran un fenotipo de distonía grave fueron sacrificados temprano.
Equilibrio al caminar sobre la barra. El equilibrio al caminar sobre la barra se realizó a los 7 meses, 8 meses, 8,5 meses, 9 meses y 8,5 meses de edad para determinar la disfunción motora y el aprendizaje motor. La capacidad de un determinado ratón para mantener el equilibrio sobre la barra y el tiempo necesario para caminar 1 metro es una medida de su equilibrio, coordinación, condición física y planificación motora. Se colocó una barra de cobre con un diámetro circular de 12 mm a un ángulo de 30°. El área de inicio se iluminó con y una plataforma de escape interior se colocó en el extremo alejado. Después de las pruebas de entrenamiento, se midió la latencia de los ratones. Además, se contaron los resbalones de la pata y el arrastre del vientre.
El grupo de referencia se sacrificó antes del inicio del estudio. Los ratones en los grupos del estudio que mostraron una grave distonía, reducción del peso corporal y/o quedaron moribundos fueron sacrificados prematuramente (sacrificio temprano). Los ratones restantes se sacrificaron después de 6 meses de tratamiento (sacrificio tardío).
Tabla 9
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El PHF1 libre en plasma se midió añadiendo plasma diluido apropiadamente a las placas recubiertas con tau y detectando usando un ELISA con anticuerpo IgG anti-ratón-HRP y TMB. La sensibilidad del ensayo de PHF1 libre fue insuficiente para medir los niveles de PHF1 libre en el CSF.
El IPN002 libre, en plasma y en CSF, se midió añadiendo plasma o CSF adecuadamente diluido a las placas recubiertas con tau y detectando usando un ELISA con anticuerpo IgG anti-ratón-HRP y TMB.
La tau total en CSF se midió usando un ELISA sándwich usando tanto el anticuerpo anti-tau de recubrimiento como la detección de anticuerpos anti-tau que se demostró que no competían con IPN002 o PHF1.
La tau libre (de IPN002) en el CSF se midió usando un ELISA homogéneo usando dos anticuerpos anti-tau para capturar la tau en el CSF. Uno de estos anticuerpos compite con IPN002 y, por lo tanto, no interactuará con la tau que anteriormente estaba unida a IPN002 en el CSF.
El hipocampo y la corteza se fraccionaron homogeneizando en 10 volúmenes en peso de cóctel frío de TBS/proteasa Roche/inhibidor de fosfatasa. El homogeneizado se generó centrifugando los restos a 10.000 x g durante 15 minutos. El contenido de proteína BCA se realizó en homogeneizados; todos los homogeneizados se diluyeron a 1 mg/ml y las fracciones correspondientes se diluyeron de manera equivalente. Una parte del homogeneizado se centrifugó 1 hora a 100.000 x g a 4 °C para generar una fracción soluble (S1) y un sedimento insoluble. Los sedimentos insolubles se resuspendieron en un cóctel de inhibidor de Sarkosyl al 1 %/proteasa Roche/fosfatasa y se centrifugaron nuevamente durante 1 hora a 100.000 x g. Los sobrenadantes solubilizados de Sarkosyl fueron marcados (PI); el sedimento insoluble de Sarkosyl se resuspendió y se marcó (P2). Los rombencéfalos se fraccionaron de manera similar, excepto que se usó mucha sal (NaCl 0,85 M) seguido de Sarkosyl al 1 % para solubilizar los sedimentos de PI.
El ELISA homogéneo de tau humana informa específicamente sobre tau humana y se usó para determinar los niveles de tau humana en las fracciones homogeneizado, S1, P1 y P2 en el hipocampo, la corteza y el rombencéfalo.
El ELISA homogéneo de AT8 humana informa específicamente sobre p202/205 humano y se usó para determinar los niveles de AT8 humana en las fracciones homogeneizado, S1, P1 y P2 en el hipocampo, la corteza y el rombencéfalo. Se realizaron transferencias de Western SDS-PAGE de HT7, IPN001, policlonal de Dako-tau, AT8, AT100, anti-p262, anti-p396 y AD2, GFAP, Iba1, sinapsina en hipocampo, corteza y/o fracciones del rombencéfalo (Homogeneizado, S1, P1 y/o P2). Se ejecutaron uno o més controles de lisado en cada gel para asegurar la normalización adecuada entre geles. Todas las bandas analizadas se normalizaron a p-actina en la muestra de homogeneizado correspondiente. Los anticuerpos y sus dianas se muestran en la tabla 10.
Tabla 10
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Para histopatología, 6/32 hemisferios cerebrales aleatorios, seccionados sagitalmente se tiñeron para AT8 y AT100; las señales se revelaron con DAB. Tanto el núcleo subtalémico anexo zona incerta (bregma 2,08-1,12) como el núcleo interpuesto del cerebelo (parte anterior y posterior) anexo del núcleo cerebeloso lateral (IntA/P/LAT; bregma 2,28-1,32) se cuantificaron (con enmascaramiento).
Se realizaron ELISA de beta amiloide de ratón (tanto Ap40 como Ap42) para la detección específica de Ap40 y Ap42 en homogeneizados de cerebro de ratón. El ELISA de Ap42 de ratón no era lo suficientemente sensible como para detectar de forma fiable los niveles en homogeneizados de cerebro de ratón. El ELISA de Ap40 de ratón detectó niveles de Ap40 de ratón dentro del intervalo lineal del ensayo. Se usó el ELISA de Ap40 de ratón para determinar los niveles de Ap40 en todos los homogeneizados de cohorte y fracciones solubles (S1).
El análisis de Taqman se realizó en marcadores de inflamación, marcadores sinépticos y marcadores de actividad neuronal. La tabla 11 enumera los marcadores.
Tabla 11
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Estadísticas
El análisis estadístico longitudinal de distoma y equilibrio al caminar sobre la barra fue realizado por un estadístico independiente. En resumen, la pendiente de la curva de disminución se determinó para cada ratón, tanto para el déficit de distonía como para el equilibrio al caminar sobre la barra, y estos coeficientes se usaron para determinar si existían diferencias significativas entre los grupos. Se utilizaron múltiples procedimientos para determinar la pendiente de las curvas y la significación. Para agruparlos, se incluyeron análisis de casos completos longitudinales, ajuste de modelos conjuntos para datos faltantes y análisis longitudinales ordenados bayesianos. Para el equilibrio al caminar sobre la barra, estos incluyeron análisis de casos completos longitudinales, ajuste de modelos conjuntos para datos faltantes, análisis longitudinal utilizando valores de 30 segundos, análisis longitudinal bayesiano con valores faltantes y análisis vivo pero no cruzado.
El análisis estadístico para determinar la significación para la bioquímica, la histología y la expresión génica se realizó en cohortes de cohorte completa, sacrificio temprano y sacrificio tardío utilizando ANOVA unidireccional seguido del análisis post hoc de Dunnett. La prueba de la t también se realizó para la progresión de la enfermedad (situación inicial de 3,5 meses frente a grupos tratados con IgG de 9,5 meses) como un comparador de la importancia derivada del análisis ANOVA unidireccional. Cuando PHF1 o IPN002 parecían tener una gran tendencia hacia los cambios, pero no lo reflejaban mediante el análisis ANOVA unidireccional, se realizó una prueba de la t que comparaba IgG con PHF1 o IPN002 únicamente para determinar si surgían patrones de tendencia para ese criterio de valoración sin alcanzar significación en ANOVa unidireccional.
Para determinar cuál de los 116 criterios de valoración se correlaciona mejor entre sí, se realizó una correlación matricial; y los correlacionadores más altos fueron ordenados según una combinación de sus valores de r2 y valores p.
RESULTADOS
Niveles de anticuerpos y unión a las dianas
Se obtuvieron plasma y CSF antes del sacrificio. Se determinaron los niveles de IPN002 libre y PHF1 libre en plasma, y IPN002 libre en el CSF. El ensayo de PHF1 libre no fue lo suficientemente sensible como para medir los niveles de PHF1 libre en el CSF. También se obtuvo suficiente CSF para determinar los niveles de Tau total y Tau libre (libre de IPN002).
Niveles de IPN002 libre y PHF1 libre en plasma
Los ratones transgénicos P301L Tau se trataron con 20 mpk de IgG, 20 mpk de IPN002 o 10 mpk de PHF1. Estas dosis fueron elegidas basándose en los resultados del estudio de unión a la diana # 1. Los datos resumidos se muestran en la tabla 12.
Tabla 12
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Se descubrió en unión a la diana # 1 que 10 mpk de IPN002 durante 4 semanas seguidas de 20 mpk de IPN002 durante 4 semanas adicionales dio como resultado, en promedio, 0,65 pM de IPN002 libre en el plasma. Se obtuvo la misma concentración, 0,65 pM de PHF1 libre, con 10 mpk de PHF1 constante durante las 8 semanas. En el estudio actual, como se muestra en la tabla 12, las concentraciones plasmáticas promedio fueron 0,55 pM de PHF1 libre y 0,9 pM de IPN002. Por lo tanto, los niveles promedio para IPN002 libre fueron más altos que para PHF1 libre en plasma.
Niveles de IPN002 libre en el CSF
En promedio, 0,9 nM de IPN002 libre estaban presentes en el CSF de ratones P301L tau tratados con IPN002, como se muestra en la tabla 13. Esto se traduce en un 0,1 % de IPN002 libre en CSF: plasma; es decir, la concentración de IPN002 en el CSF fue del 0,1 % de la concentración de IPN002 en plasma (0,9 nM en CSF; 0,9 pM en plasma). El 0,1 % de anticuerpos en el CSF es coherente con los porcentajes determinados para otros anticuerpos en el acceso al cerebro y el drenaje en el CSF, posterior a la administración periférica. Sin embargo, el ensayo de IPN002 libre solo informa sobre IPN002 que no está unido a tau. Tau está unido a IPN002 en el CSF; por lo tanto, el valor del 0,1 % representa el IPN002 total en el CSF. Los cálculos que añaden niveles de IPN002 libre a los niveles de IPN002 unido a tau sugieren que los niveles totales de IPN002 en el CSF son ~0,2 % de los niveles plasmáticos. Como se señala en los Procedimientos, el ensayo de PHF1 libre no es suficientemente sensible para medir los niveles de PHF1 libre en el CSF.
Tabla 13
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Tau total en CSF
Los niveles de Tau total en el CSF se midieron para determinar si PHF1 o IPN002 alteraron estos niveles. Como se muestra en la figura 43 los niveles de tau total en CSF no se alteraron significativamente con el tratamiento con PHF1 o IPN002. Este resultado se esperaba de los datos obtenidos en el estudio de unión a la diana.
Figura 43: Los niveles totales de tau en el CSF de ratones transgénicos P301L tau se midieron usando un ensayo ELISA sándwich de anticuerpo para tau. Como se muestra en la figura 43, los niveles de tau en el CSF aumentaron significativamente con la edad (compare la situación inicial a los 3 meses con la IgG de ratón). Ni PHF1 ni IPN002 alteraron los niveles totales de tau.
Tau libre (de IPN002) en CSF
El ensayo de Tau libre (de IPN002) en CSF, como se describe en Procedimientos, es un ELISA en el que uno de los dos anticuerpos de tau compite con IPN002; por lo tanto, el ensayo no detectará tau que está unido a IPN002. Este ensayo indica si IPN002 ha accedido al cerebro y al CSF y se ha unido a su diana (es decir, se ha unido a tau). Si IPN002 se ha unido a su diana, la señal en el ensayo se reducirá. Este ensayo es específico para tau libre de IPN002 y, por lo tanto, no detecta Tau libre (de PHF1). Como se muestra en la figura 33 los niveles de Tau libre (de IPN002) aumentan con la progresión de la enfermedad según los datos mostrados anteriormente. PHF1 no afecta a los niveles de Tau libre. En contraste, el tratamiento con IPN002 dio como resultado una reducción del 96 % en los niveles de la señal de Tau libre (de IPN002). Estos datos muestran que IPN002 se ha unido completamente a su diana, tau en el CSF.
Bioquímica e histología de Tau y fosfoTau
Como se describe en Procedimientos, el hipocampo, la corteza y el rombencéfalo se fraccionaron en fracciones de homogeneizado, solubles (solubles en Sarkosyl) e insolubles (insolubles en Sarkosyl). Las fracciones se analizaron para tau humana y de ratón, y para múltiples epítopos de fosfotau (AT8, AT100, p262, p396 y AD2) que están hiperfosforilados en cerebros con enfermedad de Alzheimer. Como se muestra en las figuras 44 A-H, el tratamiento con IPN002 redujo los niveles de AT8 en el homogeneizado del hipocampo (figura 44A), la fracción S1 del hipocampo (figura 44B), la fracción P1 del hipocampo (figura 44C), la fracción p2 del hipocampo (figura 44D), el homogeneizado cortical (figura 44E) y la fracción P1 cortical (figura 44G), en comparación con el tratamiento con anticuerpo de control IgG de ratón. Los datos en la figura 44A-H muestran que el tratamiento con IPN002 redujo los niveles de AT8 en un grado similar o mayor que el tratamiento con PHF1. Los datos representados en las figuras 44A-H se normalizaron a BCA.
Como se muestra en la figura 45A, el tratamiento con IPN002 redujo el nivel de p396-tau humana en la fracción S1 de la corteza, en comparación con el tratamiento con anticuerpo de control IgG de ratón. Como se muestra en las figuras 45B y 45C, el tratamiento con IPN002 redujo el nivel de fosfo-tau S262 en el homogeneizado de la corteza (figura 45B) y en la fracción S1 de la corteza (figura 45C), en comparación con el tratamiento con anticuerpos de control IgG de ratón. Como se muestra en las figuras 45D y 45E, el tratamiento con IPN002 redujo el nivel de p396-tau de ratón en la fracción de corteza S1 (figura 45D), y redujo el nivel de AT100 de ratón en la fracción de corteza S1 (figura 45E), en comparación con el tratamiento con anticuerpo de control de IgG de ratón.
La histopatología de Tau (AT8 y AT100) se analizó en dos núcleos distintos dentro del rombencéfalo, el núcleo subtalámico anexo zona incerta (STH) y el núcleo interpuesto del cerebelo (parte anterior y posterior) núcleo cerebeloso lateral anexo (IntA/P/LAT). Como se muestra en la figura 46 IPN002, en los ratones de sacrificio tardío, mejoró significativamente la patología de la enfermedad de AT8. PHF1 tendió hacia una disminución, pero no mejoró significativamente, la histopatología de tau. Como se muestra en la figura 47 El tratamiento con IPN002 mejoró la patología de la enfermedad de AT100 y MC1, en comparación con el tratamiento con IgG de control.
Inflamación
Tanto la astrogliosis como la microgliosis se desarrollan en modelos de AD y tauopatías. Sin embargo, el papel que juegan los astrocitos o las microglias activadas en la enfermedad no está del todo claro. Si se activan astrocitos o microglia en el modelo transgénico de P301L tau, dicha activación resultaría de la sobreexpresión de tau mutada. Se presume que la tau secretada induce la patología de AD. Si la tau secretada induce patología de AD, entonces también podría inducir la activación glial. Como tal, se determinó si las proteínas que aumentan en astrogliosis (GFAP) o microgliosis (Iba1) aumentan en el modelo en ratón transgénico P301L.
Como se muestra en las figuras 48A y 48B, los niveles de proteína GFAP aumentan con la progresión de la enfermedad tanto en el hipocampo como en la corteza. Estos datos indican que los astrocitos se activan en el hipocampo y la corteza o que se han infiltrado en estas regiones del cerebro. El tratamiento con IPN002 redujo significativamente los niveles de proteína GFAP tanto en el hipocampo como en la corteza, lo que demuestra que el tratamiento con IPN002 redujo el aumento de la astrogliosis relacionado con la enfermedad. PHF1 redujo significativamente la GFAP en el hipocampo pero no en la corteza.
Los niveles de proteína Iba1, un marcador de microglia, se midieron tanto en el hipocampo como en la corteza. Como se muestra en las figuras 49A y 49B, Iba1 no aumenta con la progresión de la enfermedad en el hipocampo sino que aumenta en la corteza. El tratamiento con IPN002 no tuvo efecto sobre los niveles de proteína Iba1 con la progresión de la enfermedad. En contraste, el tratamiento con PHF1 redujo significativamente los niveles de proteína Iba1. Los datos sugieren diferentes mecanismos de acción para IPN002 y PHF1.
Modulación del nivel de beta amiloide
Como se muestra en el ejemplo 17, el tratamiento de iPSC-CN con IPN002 redujo los niveles de Ap40 y Ap42 secretados por todas las iPSC-CN, mientras que la IgG de control no redujo la secreción de Ap40 o Ap42. Después se determinó si IPN002 también modula los niveles de Ap in vivo. En el modelo de ratón P301L, no hay sobreexpresión de APP humana; por lo tanto, se midieron los niveles de Ap de ratón. La sensibilidad del ELISA Ap42 de ratón no fue suficiente para medir los niveles de Ap42 en estos homogeneizados. El ELISA de Ap40 de ratón, sin embargo, era suficientemente sensible y, por lo tanto, se usó para determinar los niveles de Ap40 de ratón en las fracciones homogeneizadas y sobrenadantes.
Los niveles de Ap40 de ratón aumentan con la progresión de la enfermedad. El aumento observado en los niveles de Ap40 podría ser dependiente de tau y/o dependiente de la edad. Como se muestra en las figuras 50A y 50B, el tratamiento con IPN002 redujo los niveles de Ab40 tanto en el homogeneizado (figura 50A) como en la fracción soluble (figura 50B).
Los datos en las figuras 50A y 50B muestran que la sobreexpresión de tau (quizás junto con el envejecimiento) conduce a un aumento asociado a la progresión de la enfermedad en los niveles de Ap40. Los datos sugieren que la tau secretada es el factor causal para impulsar el aumento de los niveles de Ap, que IPN002 a su vez inhibe al bloquear la función eTau. PHF1, en contraste, un anticuerpo que no se une a eTau, no tiene efecto sobre los niveles de Ap.
Función motora
Se determinó el efecto del tratamiento con IPN002 sobre la función motora, según lo evaluado por las pruebas de distonía y el equilibrio al caminar sobre la barra. Los datos se muestran en las figuras 31, 32, 51 y 52.
Como se muestra en la figura 31 el tratamiento con IPN002 mejoró las puntuaciones de distonía, en comparación con el tratamiento con control de IgG de ratón.
Como se muestra en las figuras 32 y 51, el tratamiento con IPN002 mejoró la latencia promedio en la prueba de equilibrio al caminar sobre la barra (figura 32) y redujo el porcentaje de ratones incapaces de mantener el equilibrio al caminar sobre la barra (figura 51), en comparación con el tratamiento con control de IgG de ratón.
Ejemplo 21: Mapeo de epítopos
Los ensayos de unión a péptidos y competencia se llevaron a cabo como se describe en el ejemplo 18 anterior.
Se usaron los siguientes péptidos:
IPIG-1: EVMEDHAGTYGLGDRK (SEQ ID NO: 81; aminoácidos 9-24 de tau);
IPIG-2: DHAGTYGLGDRK (SEQ ID NO: 49; aminoácidos 13-24 de tau);
IPIG-3: AGTYGLGD (SEQ ID NO: 82; aminoácidos 15-22 de tau);
IPIG-4: AGTYGLGDRKDQGGYTMHQDQEGDTDAGLK (SEQ ID NO: 50; aminoácidos 15-44 de tau);
Péptido PAD: AEPRQEFEVMEDHAGTY (SEQ ID NO: 80; aminoácidos 2-18 de tau).
Los resultados se muestran en las figuras 53-55.
La figura 30 muestra que los péptidos tau no biotinilados compiten con las formas biotiniladas de tau. El panel superior muestra la competencia del péptido Tau 13-24 biotinilado (IPIG-2; SEQ ID NO: 49) con Tau 13-24 no biotinilado para unirse a hu-IPN002.
La figura 52 muestra que tau de longitud completa, a IPIG-1, IPIG-2 e IPIG-4 se les unió hu-IPN002. A IPIG-3, que carece de residuos 23 y 24, no se le unió hu-IPN002, ni a PAD. Por lo tanto, los residuos 23 y 24 parecen ser necesarios para la unión a hu-IPN002.
La figura 53 muestra que el péptido eTau-4 se une a hu-IPN002; sin embargo, los péptidos PAD (tau 2-18), Tau 15-22, Tau 19-28 y Tau 21-31 no se unieron a hu-IPN002.
Los datos indican que los residuos 15-24 parecen ser necesarios para la unión a hu-IPN002.

Claims (22)

REIVINDICACIONES
1. Un anticuerpo que se une específicamente a Tau, donde el anticuerpo comprende:
a) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 37 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 41; b) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 36 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 40; c) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 36 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 41; d) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 36 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 42; e) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 36 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 43; f) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 37 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 40; g) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 37 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 42; h) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 37 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 43; i) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 38 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 40; j) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 38 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 41; k) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 38 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 42; l) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 38 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 43; m) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 39 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 40; n) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 39 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 41; o) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 39 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 42; o p) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 39 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 43.
2. El anticuerpo de la reivindicación 1, donde el anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 37 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 41.
3. El anticuerpo de la reivindicación 1 o 2, donde el anticuerpo comprende una región constante de cadena pesada del isotipo IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4.
4. El anticuerpo de la reivindicación 1 o 2, donde el anticuerpo comprende una cadena pesada que comprende la región variable de cadena pesada y una región constante de cadena pesada de IgG4 humana.
5. El anticuerpo de la reivindicación 1 o 2, donde el anticuerpo comprende una cadena pesada que comprende la región variable de cadena pesada y una región constante de la cadena pesada de IgG4 humana, donde la cadena pesada comprende una región bisagra que comprende una sustitución S241P (numeración de Kabat).
6. El anticuerpo de la reivindicación 1 o 2, donde el anticuerpo comprende (i) una cadena pesada que comprende la región variable de cadena pesada y una región constante de cadena pesada de IgG4 humana, y (ii) una cadena ligera que comprende la región variable de cadena ligera y una región constante de cadena ligera kappa humana.
7. El anticuerpo de la reivindicación 1 o 2, donde el anticuerpo comprende (i) una cadena pesada que comprende la región variable de cadena pesada y una región constante de cadena pesada de IgG4 humana, donde la cadena pesada comprende una región bisagra que comprende una sustitución S241P (numeración de Kabat), y (ii) una cadena ligera que comprende la región variable de cadena ligera y una región constante de cadena ligera kappa humana.
8. El anticuerpo de la reivindicación 1 o 2, donde el anticuerpo es un Fv, scFv, Fab, F(ab')2 o Fab'.
9. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el anticuerpo comprende un polímero sintético no peptídico unido covalentemente.
10. El anticuerpo de la reivindicación 9, donde el polímero es un polímero de poli(etilenglicol).
11. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el anticuerpo se fusiona, directamente o mediante un enlazador, a una molécula portadora, un péptido o una proteína que promueve el cruce de la barrera hematoencefálica.
12. Una composición farmacéutica que comprende:
a) el anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11; y
b) un excipiente farmacéuticamente aceptable.
13. La composición farmacéutica de la reivindicación 12, donde el anticuerpo está encapsulado en un liposoma.
14. La composición farmacéutica de la reivindicación 12 o 13, donde el anticuerpo se formula con un agente que facilita el cruce de la barrera hematoencefálica.
15. Un vector de expresión recombinante que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, donde la secuencia de nucleótidos está unida operativamente a un elemento de control transcripcional que está activo en una célula eucariota.
16. Una célula huésped in vitro genéticamente modificada con el vector de expresión recombinante de la reivindicación 15.
17. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, o la composición farmacéutica de cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14, para su uso en el tratamiento de una tauopatía en un sujeto humano.
18. El anticuerpo o la composición farmacéutica para el uso de la reivindicación 17, donde la tauopatía es parálisis supranuclear progresiva.
19. El anticuerpo o la composición farmacéutica para el uso de la reivindicación 17, donde la tauopatía es demencia frontotemporal.
20. El anticuerpo o la composición farmacéutica para el uso de la reivindicación 17, donde la tauopatía es enfermedad de Alzheimer.
21. Un procedimiento de monitorización de la progresión de una tauopatía en un sujeto humano, comprendiendo el procedimiento:
a) determinar un primer nivel de un polipéptido Tau en una muestra biológica obtenida del sujeto humano en un primer punto temporal;
b) determinar un segundo nivel de un polipéptido Tau en una muestra biológica obtenida del sujeto humano en un segundo punto temporal; y
c) comparar el segundo nivel de Tau con el primer nivel de Tau, donde dicha determinación comprende:
i) poner en contacto la muestra biológica con el anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11; y
ii) cuantificar la unión del anticuerpo al polipéptido Tau presente en la muestra.
22. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 para su uso en un procedimiento de detección de un polipéptido Tau en un sujeto humano vivo al que se le ha administrado el anticuerpo, donde dicho procedimiento comprende detectar la unión del anticuerpo a un polipéptido Tau en el tejido cerebral en el sujeto humano vivo usando un procedimiento de imagenología.
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