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MX2012005589A - Materiales y metodos para el tratamiento o prevencion de enfermedades asociadas al her-3. - Google Patents

Materiales y metodos para el tratamiento o prevencion de enfermedades asociadas al her-3.

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MX2012005589A
MX2012005589A MX2012005589A MX2012005589A MX2012005589A MX 2012005589 A MX2012005589 A MX 2012005589A MX 2012005589 A MX2012005589 A MX 2012005589A MX 2012005589 A MX2012005589 A MX 2012005589A MX 2012005589 A MX2012005589 A MX 2012005589A
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MX
Mexico
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agent
seq
cancer
group
antigen
Prior art date
Application number
MX2012005589A
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English (en)
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MX349513B (es
Inventor
Robert Radinsky
Thore Hettmann
Daniel J Freeman
Original Assignee
Amgen
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Publication date
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Abstract

Los materiales y métodos descritos en este documento son para el tratamiento de sujetos con una enfermedad asociada con HER-3, mediante la administración de un primer agente que se une al HER-3, en combinación con un segundo agente que se une y / o inhibe a otro miembro de la familia HER. El primer y el segundo agente pueden ser un producto biológico, tales como una proteína de unión al antígeno, o un pequeño inhibidor molecular de la tirosina de quinasa, por ejemplo.

Description

MATERIALES Y METODOS PARA EL TRATAMIENTO O PREVENCION DE ENFERMEDADES ASOCIADAS AL HER-3 Campo de la Invención Este documento se refiere a los materiales y métodos para el tratamiento de individuos con una enfermedad que esta asociada al receptor del factor de crecimiento epidérmico humano -3 (HER-3) cuando se administra un primer agente que se une al HER-3, en combinación con un segundo agente que se une o inhibe otro miembro de la familia del receptor del factor de crecimiento epidérmico humano (HER) . El primer y segundo agente pueden ser cualquier tipo de molécula que se une al HER-3 o se une y/o inhibe otro miembro de la familia HER, respectivamente, incluyendo, pero no limitado a un compuesto biológico, tales como proteínas de unión antigénicas, un inhibidor tirosina quinasa de molécula pequeña, siRNA, o una sustancia natural: Antecedentes de la Invención El HER-3, también conocido como ErbB3, es una proteína receptora tirosina quinasa que pertenece a la familia del receptor del factor de crecimiento epidérmico humano (EGF-R, también conocido como HER) de proteínas receptoras tirosina quinasa, la cual también incluye HER-1 (también conocida como EGF-r o erbB) , Her-2 (también conocida como erbB2) , y HER-4 (también conocida como erbB4) (Plowman et al. (1990) Proc. Nati. Acad. Sci. U.S. A. 87:4905-4909; Kraus et al. - - (1989) Proc. Nati. Acad. Sci. U.S. A. 86:9193-9197; y Kraus et al. (1993) Proc. Nati. Acad. Sci. U.S. A. 90:2900-2904). Al igual que el receptor del factor de crecimiento epidérmico prototipico, el receptor trans-membranosos Her-3 consiste de un dominio extracelular de unión al ligando (ECD) , un dominio de dimerización con el ECD, un dominio trans-membranoso (TMD) , un dominio de proteina intracelular tirosina quinasa (TKD) , y un dominio C-terminal de fosforilación .
El ligante para HER-3, conocido como erlegulina (HRG), se une al dominio extracelular del HER-3 y activa la señalización del receptor-mediador al promover la dimerización con otro miembro de la familia del receptor del factor de crecimiento epidérmico humano (HER) , transfosforilación subsecuente del dominio intracelular de HER-3, y la activación en cascada de señales. Formaciones dimeras con múltiples miembros de la familia HER expanden el potencial de la señalización de HER-3, y es un medio para la diversificación de señales como para la amplificación de señales.
Sumario de la Invención Este documento se relaciona a los materiales y métodos para el tratamiento del individuo que sufra una enfermedad asociada al HER-3, al administrar un agente que se una al HER-3, en combinación de un segundo agente que se una a y/o inhiba otro miembro de la familia HER. El primer y el segundo agente pueden ser cualquier tipo de molécula que se una al - - HER-3 o se una a y/o inhiba otro miembro de la familia HER, respectivamente, incluyendo, pero que no se limite a un compuesto biológico, tales como una proteina de unión antigena, un pequeño inhibidor tirosina quinasa molecular, un siRNA, o una sustancia natural.
En un aspecto, este documento muestra un método de tratamiento o prevención de una enfermedad asociada con HER-3 en un individuo, que consiste en administrar al individuo un primer agente y un segundo agente, en donde el primer agente se une al HER-3 y el segundo agente se une a y/o inhibe la actividad de otro miembro de la familia HER. El primer agente puede ser un pequeño compuesto molecular o una proteina antigena-de unión que se una al HER-3. El primer agente puede ser una proteina antigena-de unión que se una al HER-3 y que incluye una pesada cadena de secuencia de amino ácidos que incluye un CDRH1, seleccionado del grupo, que consiste de SEQ ID NOs: 236, 251, 252, y 256; un CDRH2, seleccionado del grupo que consiste de SEQ ID NOs:258, 278, 280, y 282; y un CDRH3 seleccionado del grupo que consiste de SEQ ID NOs:283, 285, 309, 313, y 315; y una liviana cadena de secuencias de amino ácidos que incluyen un CDRLl seleccionado del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 320, 334, 337, y 340; un CDRL2 seleccionado del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 343, 356, 351, y 344; y un CDRL3 seleccionado del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 360, 381, 385, y 387. El primer agente puede ser una proteina antigena-de unión que se une a un HER-3 que incluye una pesada cadena de secuencia de amino ácidos que incluye al menos un CDR seleccionado del grupo que consiste de (a) CDRH1 tal como se - - muestra en SEQ ID NOs:236, 251, 252, y 256; (b) CDRH2 tal como se muestra en SEQ ID NOs:258, 278, 280, y 282/ y (c) CDRH3 tal como se muestra en SEQ ID NOs:283, 285, 309, 313, y 315. El primer agente puede ser una proteina antigena-de unión que se une al HER-3 y que incluye una liviana cadena de secuencias de amino ácidos que incluyen al menos uno de los CDR seleccionados del grupo que consiste de : (d) CDRL1 tal como se muestra en SEQ ID NOs : 320, 334, 337, y 340; (e) CDRL2 tal como se muestra en SEQ ID NOs: 343, 356, 351, y 344; y (f) CDRL3 tal como se muestra en SEQ ID NOs:360, 381, 385, y 387.
El primer agente puede ser una proteina antigena-de unión que se une al HER-3 y que incluye una pesada cadena de secuencias de amino ácidos que incluyen al menos uno de los CDR seleccionado del grupo que consiste de (a) CDRH1 tal como se muestra en SEQ ID NOs: 236, 251, 252, y 256; (b) CDRH2 tal como se muestra en SEQ ID NOs:258, 278, 280, y 282; y (c) CDRH3 tal como se muestra en SEQ ID NOs: 283, 285, 309, 313, y 315; y una liviana cadena de secuencias de amino ácidos que incluyen un CDR seleccionado del grupo que consiste de : (d) CDRL1 tal como se muestra en SEQ ID NOs: 320, 334, 337, y 340; (e) CDRL2 tal como se muestra en SEQ ID NOs: 343, 356, 351, y 344; y (f) CDRL3 tal como se muestra en SEQ ID NOs: 360, 381, 385, y 387. El primer agente puede ser una proteina antigena de unión que se une al HER-3 y que incluye una pesada cadena de secuencia de amino ácidos que incluye un CDRH1 seleccionado del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 236, 251, 252, y 256, a CDRH2 seleccionado del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 258, - - 278, 280, y 282, y un CDRH3 seleccionado del grupo que consiste de SEQ ID NOs : 283, 285, 309, 313, y 315, o una liviana cadena de secuencias de amino ácidos que incluyen un CDRL1 seleccionado del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 320, 334, 337, y 340, a CDRL2 seleccionado del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 343, 356, 351, y 344, y un CDRL3 seleccionado del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 360, 381, 385, y 387.
El primer agente puede ser una proteína antígena-de unión que se une al HER-3 y que incluye una pesada cadena de secuencia de amino ácidos seleccionados del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 42, 54, 70, 92, y 96. La proteína antígena-de unión puede incluir una liviana cadena de secuencias de amino ácidos, seleccionado del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 44, 56, 72, 94, y 98.
El primer agente puede ser una proteína antígena-de unión que se une al HER-3 y que incluye una pesada cadena de secuencia de amino ácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 42, 54, 70, 92, y 96; y una pesada cadena de secuencia de amino ácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 44, 56, 72, 94, y 98.
El primer agente puede ser una proteína antígena de unión que se une al HER-3 y que incluye la pesada cadena de secuencia de amino ácidos de SEQ ID NO: 42 y la liviana cadena de secuencia de amino ácidos de SEQ ID NO: 44. El primer agente puede ser una proteína antígena-de unión que se une al HER-3 y que incluye la pesada cadena de secuencia de amino ácidos de SEQ ID NO: 54 y la liviana cadena de - - secuencia de amino ácidos de SEQ ID NO: 56. El primer agente puede ser una proteina antigena-de unión que se une al HER-3 y que incluye la pesada cadena de secuencia de amino ácidos de SEQ ID NO: 70 y la liviana cadena de secuencia de amino ácidos de SEQ ID NO: 72. El primer agente puede ser una proteina antigena-de unión que se une al HER-3 y que incluye un CDRH3 seleccionado del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 283, 285, 309, 313, y 315. El primer agente puede ser una proteina antigena de unión que se une al HER-3 y que incluye un CDHL3 seleccionado del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 360, 381, 385, y 387.
La proteina antigena-de unión puede ser dirigida en contra del dominio extracelular del HER-3. La unión de la proteina antigena-de unión al HER-3 puede reducir la transducción de la señal de HER-3-mediadora, reducir la fosforilación del HER-3, reducir la proliferación de células, reducir la migración de células, y/o incrementar la regulación de HER-3.
La proteina antigena-de unión que se une a HER-3 puede ser un anticuerpo. El anticuerpo puede ser un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo policlonal, un anticuerpo recombinante, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo humano, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo multiespecifico, o un fragmento de anticuerpo (p. e., un fragmento Fab, un fragmento Fab' , un fragmento F(ab')2, un fragmento Fv, un diacuerpo, o una molécula de un anticuerpo de cadena sencilla) . El anticuerpo puede ser del tipo IgGl-, IgG2-, IgG3-, o IgG4-.
- - El primer agente puede ser una proteina antigena-de unión que se une al HER-3, y la proteina antigena-de unión puede ser unida a un grupo efector. El grupo efector puede ser un radioisótopo o radionúclido, una toxina, o un grupo terapéutico o quimioterapéutico (e.g, un grupo terapéutico o quimioterapéutico seleccionado del grupo que consiste de caliqueamicina, auristatins-PE, geldanamicina, Maytansine y derivados del mismo) .
El segundo agente puede ser una pequeña molécula compuesta, o una proteina antigena de unión. El segundo agente puede ser, por ejemplo, trastuzumab, lapatinib, neratinib, panitumumab, Erlotinib, el cetuximab, pertuzumab, y T-DM1.
En otro aspecto, este documento muestra un método para el tratamiento o prevención de una enfermedad asociada con el HER-3 en un individuo, que consiste en, el administrar al sujeto un primer agente y un segundo agente, en donde el primer agente es una proteina antigena-de unión que se une al HER-3 y que incluye una pesada cadena de secuencias de amino ácidos de SEQ ID NO: 42 y la liviana cadena de secuencias de amino ácidos de SEQ ID NO: 44, y en donde el segundo agente es seleccionado del grupo que consiste de Erlotinib, lapatinib, y neratinib. Además, este documento muestra métodos para el tratamiento o prevención de enfermedades asociadas con HER-3 en un individuo, que consiste en la administración al sujeto de un primer agente y un segundo agente, en donde el primer agente es una proteina antigena de unión, que se une al HER-3, y comprende un pesada cadena de secuencias de amino ácidos de SEQ ID NO: 54 y la liviana - - cadena de secuencias de amino ácidos de SEQ ID NO: 56, o una proteina antígena-de unión, que se une a HER-3 y comprende la pesada cadena de secuencias de amino ácidos de SEQ ID NO: 70 y la liviana cadena de secuencias de amino ácidos de SEQ ID NO: 72, y en donde el segundo agente es seleccionado del grupo que consiste de Erlotinib, Lapatinib, y neratinib.
Este documento también muestra un método de tratamiento o prevención de una enfermedad asociada al HER-3 en un individuo, que consiste en administrar al sujeto un primer agente y un segundo agente, en donde el primer agente en una proteina antigena-de unión que se une a HER-3 y que incluye la pesada cadena de secuencias de amino ácidos de SEQ ID NO: 42 y la liviana cadena de secuencias de amino ácidos de SEQ ID NO: 44, y en donde el segundo agente es seleccionado de grupo que consiste de trastuzumab, T-DM1, panitumumab, y cetuximab .
Los métodos previstos en este documento pueden incluir de manera opcional la administración de un tercer o futuro agente terapéutico y/o terapia de radiación. El tercer o futuro agente terapéutico puede ser un agente anti-neoplásicas (p. e., un anticuerpo anti-tumor o un agente quimioterapéutico, tales como capecitabina, antraciclina, doxorrubicina, ciclofosfamida, paclitaxel, docetaxel, cisplatina, gemcitabina, o carboplatino) .
El primer agente y el segundo agente pueden ser administrados por vía intravenosa, subcutánea, intramuscular o vía oral. La enfermedad puede ser una enfermedad hiperproliferativa (p. e., una enfermedad seleccionada del grupo que consiste del cáncer de seno, cáncer ovario, cáncer de próstata, cáncer de colon, cáncer renal, cáncer de pulmón, cáncer del páncreas, carcinoma epidermoide, fibrosarcoma, melanoma, carcinoma nasofaríngeo, y el carcinoma de células escamosas) .
Los métodos previstos en este documento pueden incluir la administración del primer agente en una dosis de cerca de 1 a unos 20 mg/kg, de peso corporal, al menos una vez cada 6 semanas. Los métodos pueden incluir la administración del segundo agente en una dosis de cerca de 1 a 20 mg/kg, de peso corporal, al menos una vez cada 6 semanas. Los métodos también además pueden incluir, antes de la administración, la utilización de un método que incluya el análisis de un marcador predecible para seleccionar a un individuo que sufra de la enfermedad asociada al HER-3. Los métodos también podrán incluir, después de que sean administrados, el monitoreo de los resultados terapéuticos.
Salvo que se disponga de otra manera, todos los términos técnicos y científicos utilizados en este documento, tienen el mismo significado que comúnmente es entendido por alguien con conocimientos generales en la materia, a la cual la invención pertenece. Aunque, los métodos y materiales similares o equivalentes a aquellos descritos en este documento pueden ser utilizados para practicar la invención, los métodos y materiales apropiados son descritos a continuación. Todas las publicaciones solicitudes de patentes, patentes, y otras referencias mencionadas en este documento son incorporadas por la referencia en su totalidad. En caso de conflicto, la presente especificación, incluyendo definiciones, tomara control. Además, los materiales, métodos, y ejemplos son ilustrativos y no pretenden presentar ninguna limitación.
Los detalles de una o varias representaciones de la invención son establecidos en los dibujos anexos y la descripción debajo. Otras características, objetivos, y ventajas de la invención serán evidentes, a partir de la descripción, y los dibujos, y de las reivindicaciones.
Breve Descripción de las Figuras de la Invención La figura 1 es una gráfica que representa los efectos de un anticuerpo humano anti HER-3 y panitumumab, tanto solo, como en combinación, en cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) tumor xenoinjerto (Calu-3) crecido.
La figura 2 es una gráfica que representa los efectos de un anticuerpo humano anti HER-3 y Erlotinib, tanto solo, como en combinación, en Calu-3 crecido.
La figura 3 es una gráfica que representa los efectos de un anticuerpo humano anti HER-3, tanto solo, como en combinación con c2C4 (un HER- 2 inhibidor de dimerización) , o trastuzumab en un cultivo basal de anclaje-independiente de SkBr-3 de células de cáncer de seno.
La figura 4 es una gráfica que representa los efectos de un anticuerpo humano anti HER-3, tanto solo, como en combinación con c2C4 trastuzumab, o cetuximab, en un cultivo - - HRG estimulado de anclaje-independiente de SkBr-3 de células de cáncer de seno.
La figura 5 es una gráfica que representa los efectos de un anticuerpo humano anti HER-3, tanto solo, como en combinación con c2C4 trastuzumab, o cetuximab, en un cultivo basal de anclaje-independiente de MDA-MB-435 de células de cáncer de ovario.
Las figuras 6A-6D son una serie de gráficas que representan los efectos de un anticuerpo humano anti HER-3, tanto solo, como en combinación con trastuzumab (FIG. 6A) , lapatinib (FIG. 6B) , gemcitabina (FIG. 6C) , o cisplatino (FIG. 6D) , en proliferación de MDS-MB-175 VII de células de cáncer de seno.
La figura 7 es una gráfica que representa los efectos de un anticuerpo humano anti HER-3, tanto solo, como en combinación con c2C4 trastuzumab, o lapatinib, en una proliferación de HRG estimulado de ZR-75-30 de células de cáncer de seno.
La figura 8 es una gráfica que representa los efectos de un anticuerpo humano anti HER-3, tanto solo, como en combinación con c2C4 trastuzumab, o lapatinib, en una proliferación de HRG estimulado de BT474 de células de cáncer de seno.
La figura 9 es una gráfica que representa los efectos de un anticuerpo humano anti HER-3, tanto solo como en combinación con cetuximab, c2C4, o trastuzumab, en una - - proliferación de HRG estimulado de DLD-1 células de cáncer de colon.
La figura 10 es una gráfica que representa los efectos de un anticuerpo humano anti HER-3, tanto solo, como en combinación con c2C4 trastuzumab, o lapatinib, en una proliferación de HRG estimulado de HCC-1569 de células de cáncer de seno.
La figura 11 es una gráfica que representa los efectos de un anticuerpo humano anti HER-3, tanto solo, como en combinación con 2C4 trastuzumab, o lapatinib, en una proliferación de HRG estimulado de SkBr-3 de células de cáncer de seno.
La figura 12 es una gráfica que representa los efectos de un anticuerpo humano anti HER-3, tanto solo, como en combinación con panitumumab en una proliferación de células de cáncer FaDu de cabeza y cuello.
La figura 13 es la imagen de una Western blot que muestra los efectos de un anticuerpo anti-HER-3 humano, tanto solo como en combinación con cetuximab, c2C4, o trastuzumab, en fosforilación de HER-3 (panel superior) , Akt (panel medio), y ERK (panel inferior) en MDA- B- 175 VII de células de cáncer de seno.
La figura 14 es la imagen de una Western blot que muestra los efectos de un anticuerpo anti-HER-3 humano, tanto solo, como en combinación con cetuximab, c2C4, trastuzumab, o lapatinib, en fosforilación de HER-3 (panel superior) , Akt (panel medio) , y ERK (panel inferior) en HGR estimulado SkBr-3 de células de cáncer de seno.
La figura 15 es la imagen de una técnica Western blot que muestra los efectos de un anticuerpo anti-HER-3 humano, tanto solo, como en combinación con cetuximab, pertuzumab (c2C4), o trastuzumab, en fosforilación de HER-3 (panel superior) o Akt (panel inferior) en HGR estimulado Lsl74T de células de cáncer de colon.
La figura 16 es la imagen de una técnica Western blot que muestra los efectos de un anticuerpo anti-HER-3 humano, tanto solo, como en combinación con cetuximab, c2C4, o trastuzumab, en fosforilación de HER-3 (panel superior) , Akt (panel medio) , y ERK (panel inferior) en HGR estimulado HCC 1569 de células de cáncer de seno.
La figura 17 es la imagen de una técnica Western blot que muestra los efectos de un anticuerpo anti-HER-3 humano, tanto solo, como en combinación con panitumumab, en fosforilación de Akt, PGFR, HER-2, HER-3, HER-4 y ERK, en células del epitelio alveolar A549. Via 1, control de IgG; vía 2, panitumumab solo, vía 3, Ul-solo 59, vía 4, Ul-59 en combinación con panitumumab. La Tubulina se utilizó como control para cargas iguales.
La figura 18 es la imagen de una técnica Western blot que muestra los efectos de un anticuerpo anti-HER-3 humano, tanto solo como en combinación con panitumumab o lapatinib, en fosforilación de HER-3, Akt, HER-2, ERK, y EGF-R en células Calu3 NSCLC. Vía 1, control de IgG; vía 2, panitumumab solo, vía 3, Ul-solo 59, vía 4, lapatinib solo; via 5, Ul-59 en combinación con panitumumab; via 6, Ul-59 en combinación con lapatinib.
La figura 19 es una gráfica que representa los efectos de un anticuerpo humano anti HER-3y lapatinib, tanto solo como combinado en un cultivo de un tumor de cáncer de seno xenoinjerto (HCC-1569) .
La figura 20 muestra que el tratamiento de las células A549 con CPNM Ul-59 inhibe la fosforilación HER3 y reduce la reactivación después del tratamiento con Gefitinib. Las células A549 fueron tratados con Gefitinib, o una combinación de Ul-59, y la fosforilación HER3 se evaluó con el test ELISA. El tratamiento con Gefitinib durante 1 hora dio lugar a una inhibición parcial de la fosforilación HER, que se invirtió para controlar los niveles después de 24 horas. Por el contrario, el tratamiento con Ul-59 llevó a una mayor inhibición de la fosforilación HER que se mantuvo después de 24 horas. El tratamiento combinado con ambos agentes impidió la reversión de la inhibición visto después de 24 horas en las células tratadas solamente con Gefitinib. Los experimentos se realizaron en pozos por triplicado y se repitieron por lo menos dos veces. Los resultados se expresan como media + desviación estándar.
Descripción Detallada de la Invención Los títulos de las secciones utilizados en este documentos son para propósitos de organizar y no suponen estar estructurados como limitantes del tema descrito.
- - A menos de que se defina de otra manera en este documento, los términos científicos y técnicos utilizados, en relación a la presente aplicación, habrán de tener los mismos significados a como usualmente son entendidos para aquellos con una experiencia ordinaria en la materia. Además, a menos de que el contexto exija lo contrario, los términos singulares habrán de incluir pluralidades y términos plurales que han de ser incluidos en los términos singulares.
Generalmente, las nomenclaturas utilizadas en relación a, y las técnicas de cultivos de células y tejidos, biología molecular, inmunología, microbiología, química genética y química proteica y de acido nucleico, e hibridación, descritos en este documento, son aquellos que son bien conocidos en la técnica. Los métodos y técnicas de la presente solicitud son usualmente realizados de acuerdo a los métodos convencionales que son bien conocidos en la técnica, y son descritos en diversas referencias generales y específicas, las cuales son descritas y discutidas a lo largo de la presente especificación, a menos de que se indique de otra manera. Ver p. e., Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001), Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates (1992), y Harlow y Lañe Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1990), los cuales son incorporados en este documento por la referencia. Las reacciones enzimáticas y las técnicas de purificación son llevadas a cabo de acuerdo a las especificaciones del - - manufacturador, como usualmente es llevado a cabo en la técnica, o como se describe en este documento. La terminología utilizada en relación a, y los procedimientos y técnicas de laboratorio de, química analítica, química sintética y orgánica, y la química medicinal y farmacéutica que son descritos en este documento, son bien conocidos y generalmente utilizados en la técnica. Las técnicas estándar pueden ser utilizadas para síntesis química, análisis químico, preparaciones farmacéuticas, formulaciones, suministración y tratamiento de los pacientes.
Debería de entenderse que esta invención no se encuentra limitada a la metodología en particular, protocolos, reactivos, etc., descritos en este documento y como tales puedan variar. La terminología utilizada en este documento es para propósitos de describir solamente las representaciones particulares, y no supone limitar el ámbito de lo revelado, lo cual es descrito únicamente por las reivindicaciones.
Otros, diferentes a aquellos en los ejemplos de operación, o que fueron indicados por otra parte, todos los números que expresan las cantidades de ingredientes o condiciones de reacción, utilizados en este documento han de ser entendidas en toda instancia por el término "cerca de". El término "cerca de", cuyo es utilizado con porcentaje, puede significar. +/-. 1%.
Este documento provee materiales y métodos que se relacionan al tratamiento o prevención de enfermedades asociadas al HER-3, utiliza una combinación de un primer agente que se une al HER-3, y un segundo agente que se une a/o inhibe la actividad de otros miembros de la familia HER. El primer agente y el segundo agente pueden ser un compuesto biológico, tales como una proteina antigena de unión, o un inhibidor tirosina quinasa molecular pequeño. Por ejemplo, en este documento son provistos polipéptidos aislados (p. e., proteínas de unión, tales como anticuerpos), y/o inhibidores tirosina quinasa molecular pequeño que se una a y/o inhibe varios o uno de los miembros de la familia HER, tales como HER-3, HER-2, EGF-R, HER-4 , y/o cualquier otro de los miembros de la familia HER. También se proveen composiciones que comprenden un primer agente que se une al HER-3, y un segundo agente que se une a y/o inhibe la actividad de uno o varios otros miembros de la familia HER, y métodos para la utilización del mismo para tratar o prevenir enfermedades asociadas al HER-3.
Ciertos agentes primarios y/o secundarios descritos en este documento, son biológicos, tales como lo son las proteínas antígenas de unión. En ciertas representaciones, la estructura del polipéptido de una proteína antigena de unión está basada en anticuerpos, incluyendo, pero no limitado a, anticuerpos monoclonales , anticuerpos biespecíficos, minibodies, anticuerpos de dominio, anticuerpos sintéticos (a veces conocidos como "anticuerpos miméticos") , anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados, anticuerpos humanos, fusiones de anticuerpos (a veces conocido como "conjugados de anticuerpos"), y fragmentos de estos, respectivamente. Las diversas estructuras serán descritas a continuación. En otras representaciones, el primer y/o segundo agente es un - - inhibidor tirosina quinasa molecular pequeño. En otras representaciones, el primer y/o segundo agente son un si RNA. En otras representaciones, el primer y/o segundo agente es una sustancia natural.
La composición descrita en este documento, y los métodos para el uso de las mismas, han podido demostrar que logran inhibir el crecimiento de tumores sólidos que expresen el HER-3 y al menos algún otro miembro de la familia HER. En particular, la administración de una combinación de un primer agente que se une al HER-3 y un segundo agente que se une a y/o inhibe al menos algún otro miembro de la familia HER, ha sido demostrado en este documento de haber incrementado su eficacia al inhibir el crecimiento de la variedad de tumores, cuyo se comparan con la administración de tanto el primer agente como el segundo agente, cada uno solo. Asi, las composiciones y métodos revelados en este documento han demostrado utilidad en métodos para el tratamiento y prevención de enfermedades neoplásicas, tales como cáncer.
Agentes de unión HER-3 Tal como se describe en este documento, el agente que se une al HER-3 puede ser un compuesto biológico, incluyendo, pero no limitado a, una proteína antígena de unión, tales como anticuerpos, o inhibidores tirosina quinasa molecular pequeño. Tal como se utiliza en este documento, una "proteína antígena de unión" o "proteína de unión", se refiere a una proteína que se une específicamente - - a un antigeno blanco especifico, tales como miembros de la familia HER, p. e., HER-3. Una proteina antigena de unión esta hecha para "unirse específicamente" a su antígeno blanco, cuando la constante de disociación (KD) es < 10"8M. El anticuerpo se une de manera especifica al antígeno con "alta afinidad" cuando el KD < 5xl0"9 M, y con una "muy alta afinidad" cuando el KD < 5xl0"10 M. En una representación, el anticuerpo tiene un KD < 5xl0~10 M y una margen de error de cerca de lx.lO"Vs. en una representación, el margen de error es de cerca de lx.l05/s. en otras representaciones, los anticuerpos se unirán a un miembro específico de la familia HER con un KD entre cerca de 10"8 M y de 10~10M, y en otra representación este se unirá con un KD<2x.lO~10. Además, tal como se utiliza en este documento, un compuesto molecular pequeño es un compuesto molecular de bajo peso que ha sido químicamente sintetizado para inhibir la actividad enzimática de uno o más proteínas quinasa, incluyendo serina, treonina y quinasas tirosinas.
En algunas representaciones, en donde el agente de unión HER-3 es un compuesto biológico, el agente es una proteína antigena de unión, como un anticuerpo se puede unir al HER-3. Por lo tanto, se provee en este documento para su uso en composiciones y métodos para el tratamiento de enfermedades asociadas al HER-3 son proteínas de unión HER, incluyendo anticuerpos anti-HER3. En algunas representaciones, un anticuerpo marcado para HER-3, puede ser dirigido en contra del dominio extracelular (ECD) de HER-3. Por ejemplo, un anticuerpo anti-HER-3, tal como se describe en este documento, puede interactuar con al menos un epítopo en la parte extracelular del HER-3. Los epitopospueden ser ubicados en el dominio amino terminal Ll (aa 19-184), en el SI (aa 185-327) y S2 (aa 500-632) dominios ricos en cisteina, en el dominio L2 (342-499) , el cual esta limitado por los dos dominios ricos en cisteina, o en una combinación de dominios HER-3. Los epitopostambién pueden ser ubicados en combinaciones de dominios, tales como, sin limitación, un epitopo compuesto por parte de Ll y SI.
Una proteina HER-3 de unión puede ser caracterizada más adelante porque su unión al HER-3 reduce la transducción de la señal HER-3- mediador. Una reducción de la señal de transducción HER-3-mediador puede ser, p. e., ser causado por una regulación de HER-3 que resulta en al menos una desaparición parcial de molécula HER-3 de la superficie celular o por estabilización del HER-3 en la superficie de la célula un una forma substancialmente inactiva, p. e., una forma que muestra una baja señal de transducción que también puede ser causada por influencia, p. e., disminuyendo o inhibiendo la capacidad de unión de un ligando u otro miembro de la familia HER al HER-3. Por ejemplo, una reducción de la señal de transducción de HER-3 mediador también puede ser causado por, disminuir la formación de HER-3 que contenga dimeros con otros miembros de la familia HER (p. e., EGF-r) .
Un agente HER-3 de unión puede ser una proteina andamio que tenga una actividad de unión similar a la de un anticuerpo) p. e., teniendo una actividad similar a un anticuerpo anti-HER-3) o un anticuerpo p. e., un anticuerpo anti-HER-3. Tal como se utiliza en este documento, el término "proteina andamio" se refiera a un polipéptido o - - proteina con áreas superficiales expuestas en las cuales las inserciones de amino ácido, substituciones o eliminaciones son altamente tolerables. Ejemplos de proteínas andamio que pueden ser utilizados de acuerdo al presente método, incluye la proteina A del Estafilococo áureos, la proteina de unión bilin del Pieris brassicae u otros lipocalinos, proteínas de repetición ankyrin, y fibronectina humana (revisado en Binz y Plückthun (2005) Curr. Opin. Biotechnol. 16:459-69). La producción de una proteína andamio puede ser considerado a injertar o integrando una función de afinidad de acuerdo al presente documento. Uno de estos andamios puede ser estructuralmente separable de la secuencia de amino ácidos confiriendo la especificad de unión. En general, las proteínas que aparecen como apropiadas para el desarrollo de dicha afinidad artificial de los reactivos, también puede ser obtenida por técnicas de producción de proteínas, racional, o más común, combinatorial, tales como paneo en contra del HER-3, tanto proteínas purificadas o proteínas expuestas en la superficie de la célula, para agentes de unión en un catalogo de andamios artificiales expuestos in vítro, habilidades que son conocidas dentro de la técnica (ver p. e., Skerra (2000) J. Mol. Recog. 13:167-87; y Binz y Plückthun, supra) .Además, una proteína andamio que tenga una actividad de unión similar a la de un anticuerpo puede ser derivado de un polipéptido aceptador que contenga el dominio del andamio, el cual puede ser injertado con dominios de unión de un polipéptido donante para conferir la especificidad de unión, del polipéptido donante en el dominio del andamio que contenga el polipéptido aceptador. Los dominios de unión insertados pueden ser, por ejemplo, la - - región complementaria determinante (CDR) de un anticuerpo, en especial, de un anticuerpo anti-HER-3. La inserción puede ser llevada a cabo por diversos métodos conocidos para aquellos con experiencia en la técnica, incluyendo, por ejemplo, síntesis de polipéptidos, síntesis de ácidos nucleicos de un amino acido codificante, al igual por varios métodos recombinantes bien conocidos por aquellos con experiencia en la técnica.
El término "anticuerpo" incluye a anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales, anticuerpos recombinantes, anticuerpos humanizados (Jones et al. (1986) Nature 321:522-525; Riechmann et al. (1988) Nature 332:323-329; y Presta (1992) Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596), chimeric antibodies ( orrison et al. (1984) Proc. Nati. Acad. Sci. U.S. A. 81:6851-5855), anticuerpos multi específicos (p. e., anticuerpos biespecificos) formados de al menos dos anticuerpos, o fragmentos de anticuerpos de estos. El termino "fragmento de anticuerpo" comprende cualquier porción de los anteriormente mencionados anticuerpos, tales como sus uniones de antígenos o regiones variables. Ejemplos de fragmentos de anticuerpos incluyen fragmentos Fab fragmento Fab' , fragmentosF (ab)2/ fragmentos Fv, diabodies (Hollinger et al. (1993) Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 90:6444-6448), moléculas de anticuerpos de una sola cadena (Plückthun in: The Pharmacology of Monoclonal Antibodies 113, Rosenburg y Moore, eds., Springer Verlag, N.Y. (1994), 269-315) y otros fragmento de anticuerpos, siempre y cuanto muestren la capacidad de unión deseada al HER-3.
Además, el término "anticuerpo", tal como se utiliza en este documento, incluye moléculas similares a anticuerpos que - - contienen sub-dominios producidos, tales como dominios de VH-solo o VL-solo derivados de tanto fuente naturales tales como camélidos (Muyldermans et al. (2001) Rev. Mol. Biotechnol. 74:277-302) o a través de representaciones de catálogos in vitro de humanos, camélidos de otras especies (Holt et al. (2003) Trends Biotechnol. 21:484-90).
Un "fragmento Fv" es el fragmento de anticuerpo mínimo más completo que contiene un sitio antígeno-reconocedor y -de unión. Esta región consiste de un dímero del dominio variable de una cadena pesada y del dominio variable de una cadena liviana en una estrecha asociación no-covalente . Es en esta configuración donde los tres CDRs de cada dominio variable interactúan para definir un sitio antígeno-de unión en la superficie del dimero VH-VL. Colectivamente, los seis CDRs confieren una especificación antígena-de unión al anticuerpo. De todas maneras, inclusive un solo dominio variable (o la mitad de un Fv que comprenda solo tres CDRs específicos para un antígeno) tiene la habilidad para reconocer y unir el antígeno, aun así a una afinidad mas baja que del sitios de unión entero. El "fragmento Fab" también contiene el dominio constante de la cadena liviana y el primer dominio constante (CH1) de la cadena pesad. El "fragmento Fab" difiere del "fragmento Fab'" por la adición de unos pocos residuos a los términos del dominio de la cadena pesada CH1, incluyendo uno o mas cisteínas de la región eje del anticuerpo. El "fragmento F (ab)2"es originalmente producido como un par de "fragmentos Fab'", los cuales tienen cisteínas eje entre estas. Métodos para preparar dichos fragmentos de anticuerpos, tales como papaína o digestión pepsina, son conocidos para aquellos con experiencia en la técnica. - - ün anticuerpo puede ser de tipo IgA-, IgD-, IgE, IgG-o IgM- incluyendo tipos IgG- o IgM-, tales como, sin limitación alguna, clases de IgGl-, IgG2-, IgG3-, IgG4-, IgMl- y IgM2-. Por ejemplo, en algunos casos, el anticuerpo es de tipo IgGl-, IgG2- o IgG4.
En ciertos aspectos p. e., en relación a la generación de anticuerpos como candidatos terapéuticos en contra de HER-3, puede ser deseable que el anticuerpo sea capaz de fijar el complemento y que participe en la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) . Hay una serie de isótopos de anticuerpos que son capaces de lo mismo, incluyendo: IgM murino, IgG2a murino, IgG2b murino, IgG3 murino, IgM humano, IgGl humano, IgG3 humano e IgA humano, por ejemplo. Se podrá apreciar el que los anticuerpos que son generados no necesiten de una posesión inicial, a comparación de un isótopo, pero a pesar de que el anticuerpo, al ser generado puede poseer cualquier isótopo, y el anticuerpo puede cambiar de isótopo al añadir los genes molecularmente clonados de la región V, o cADN, a genes regionales molecularmente clonados constantemente o cADNs en vectores de expresión apropiados utilizando técnicas moleculares biológicas convencionales que son bien conocidos en la técnica, y luego expresando los anticuerpos en las células huésped utilizando técnicas conocidas en la materia. El anticuerpo de isótopo cambiado puede también poseer una región Fe que ha sigo producida molecularmente para poseer variantes de los CDC superiores de ocurrencia sobre natural (Idusogie et al. (2001) J. Immunol. 166:2571-2575) y expresados de manera recombinada en las células huésped utilizando técnicas conocidas dentro de la material. Tales técnicas incluyen el uso de técnicas recombinantes directas (see, p. e., U.S. Patent No. 4, 816, 397), técnicas de fusión célula-célula (see, p. e., U.S. Patent Nos. 5, 916, 771 y 6, 207, 418), entre otras. En la técnica de fusión célula-célula, un mieloma u otra linea celular, tales como CHO, es preparada para que posea una cadena pesada con cualquier isótopo deseado, y otro mieloma u otra linea celular tales como CHO, es preparada para que posea una cadena liviana. Dichas células pueden ser fundidas después, y una línea celular que exprese un anticuerpo intacto puede ser separada. Como ejemplo, un anticuerpo humano anti-HER-3 IgG4 que posea la unión deseada para en antígeno del HER-3, puede ser fácilmente cambiada de isótopo para generar un isótopo IgM humano, IgGl humano o IgG3 humano, mientras aun posea la misma región variable (la cual define la especificad del anticuerpo y algunas de sus afinidades) . Dicha molécula puede ser capaz de fijar el complemento y que participe en el CDC.
Por otra parte, un anticuerpo también puede ser capaz de unirse a receptores Fe en células efectoras, tales como los monocitos y células asesinas naturales (NK) , y participando en citoxicidad celular anticuerpo-dependiente (ADCC) . Hay una serie de isótopos anticuerpos que son capaces de lo mismo, incluyendo, sin limitación, lo siguiente: IgG2a murina, IgG2b murina, IgG3 murina, IgGl humana e IgG3 humana. Se apreciara el que los anticuerpos que son generados no necesitan de posesión inicial a comparación de un isótopo, pero a diferencia, el anticuerpo, al ser generado, puede poseer cualquier isótopo, y el anticuerpo puede cambiar de isótopo al agregar los genes regionales molecularmente clonados V, o cADN a genes regionales molecularmente clonados constantemente, o cADNs en los vectores de expresión apropiados, utilizando técnicas biológicas moleculares convencionales que son bien conocidas en la técnica. El anticuerpo de isótopo-cambiado también puede poseer una región Fe que ha sido molecularmente procesada para poseer variantes de los ADCC superiores de ocurrencia sobre natural (Shields et al. (2001) J. Biol. Chem. 276:6591-604) y expresados de manera recombinante en células huésped utilizando técnicas conocidas en el tema. Dichas técnicas incluyen el uso de técnicas recombinantes (see, p. e., U.S. Patent No. 4, 816, 397), técnicas de fusión célula-célula (see, p. e., U.S. Patent Nos. 5, 916, 771 y 6, 207, 418), entre otras. En la técnica de fusión célula-célula, un mieloma u otra linea celular, tales como CHO, es preparada para que posea una cadena pesada con cualquier isótopo deseado, y otro mieloma u otra linea celular tales como CHO, es preparada para que posea una cadena liviana. Dichas células pueden ser fundidas después, y una linea celular que exprese un anticuerpo intacto puede ser separada. Como ejemplo, un anticuerpo humano anti-HER-3 IgG4 que posea la unión deseada para en antígeno del HER-3, puede ser fácilmente cambiada de isótopo para generar un isótopo IgGl humano, o un isótopo IgG3, mientras aun posea la misma región variable (la cual define la especificidad del anticuerpo y algunas de sus afinidades) . Dichas moléculas pueden ser luego capaces de unirse al FcyR en células efectoras y participando en ADCC.
- - La TABLA 10 en este documento provee unas secuencias de amino ácidos para una variedad de CDRs que pueden ser incluidos en anticuerpos en contra de HER-3. En algunas representaciones, una proteina de unión aislada, marcada para HER-3 puede incluir una cadena pesada de secuencias de amino ácidos que contengan al menos un CDR seleccionado del grupo que consiste de: (a) CDRH1 como se muestra en SEQ ID NOS: 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 36, 40, 42, 46, 50, 54, 60, 62, 66, 70, 74, 78, 80, 84, 88, 92, 96, 100, 104, 108, 112, 116, 120, 122, 126, 130, 134, 138, 142, 146, 150, 154, 158, 162, 166, 170, 174, 178, 182, 186, 190, 194, 198, 202, 206, 210, 214, 218, 222, 226 y 230, (b) CDRH2 como se muestra en SEQ ID NOS:2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 36, 40, 42, 46, 50, 54, 60, 62, 66, 70, 74, 78, 80, 84, 88, 92, 96, 100, 104, 108, 112, 116, 120, 122, 126, 130, 134, 138, 142, 146, 150, 154, 158, 162, 166, 170, 174, 178, 182, 186, 190, 194, 198, 202, 206, 210, 214, 218, 222, 226 y 230, y (c) CDRH3 como se muestra en SEQ ID NOS:2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 36, 40, 42, 46, 50, 54, 60, 62, 66, 70, 74, 78, 80, 84, 88, 92, 96, 100, 104, 108, 112, 116, 120, 122, 126, 130, 134, 138, 142, 146, 150, 154, 158, 162, 166, 170, 174, 178, 182, 186, 190, 194, 198, 202, 206, 210, 214, 218, 222, 226 y 230, y/c > una cadena liviana de secuencias de amino ácidos que comprende al menos uno de los CDRs seleccionados del grupo que consiste de: (d) CDRL1 como se muestra en SEQ ID NOS: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 38, 44, 48, 52, 56, 58, 64, 68, 72, 76, 82, 86, 90, 94, 98, 102, 106, 110, 114, - - 118, 124, 128, 132, 136, 140, 144, 148, 152, 156, 160, 164, 168, 172, 176, 180, 184, 188, 192, 196, 200, 204, 208, 212, 216, 220, 224, 228 y 232, (e) CDRL2 como se muestra en SEQ ID NOS :4, £í, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 38, 44, 48, 52, 56, 58, 64, 68, 72, 76, 82, 86, 90, 94, 98, 102, 106, 110, 114, 118, 124, 128, 132, 136, 140, 144, 148, 152, 156, 160, 164, 168, 172, 176, 180, 184, 188, 192, 196, 200, 204, 208, 212, 216, 220, 224, 228 y 232, y ' (f) CDRL3 como se muestra en SEQ ID NOS: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 38, 44, 48, 52, 56, 58, 64, 68, 72, 76, 82, 86, 90, 94, 98, 102, 106 , no, 114, 118, 124, 128, 132, 136, 140, 144, 148, 152, 156, 160, 164, 168, 172, 176, 180, 184, 188, 192, 196, 200, 204, 208, 212, 216, 220, 224, 228 y 232, como se muestra en el listado de secuencia llenado adjunto a este documento.
En algunas representaciones, una proteina aislada, marcada para el HER-3 puede incluir una cadena pesada de secuencias de amino ácidos seleccionados del grupo que consiste en SEQ ID NOS: 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 36, 40, 42, 46, 50, 54, 60, 62, 66, 70, 74, 78, 80, 84, 88, 92, 96, 100, 104, 108, 112, 116, 120, 122, 126, 130, 134, 138, 142, 146, 150, 154, 158, 162, 166, 170, 174, 178, 182, 186, 190, 194, 198, 202, 206, 210, 214, 218, 222, 226 y 230, y/o una cadena liviane de secuencias de amino ácidos, seleccionadas de grupo que consiste de SEQ ID NOS: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 38, 44, 48, 52, 56, 58, 64, 68, 72, 76, 82, 86, 90, 94, 98, 102, 106, 110, 114, 118, - - 124, 128, 132, 136, 140, 144, 148, 152, 156, 160, 164, 168, 172, 176, 180, 184, 188, 192, 196, 200, 204, 208, 212, 216, 220, 224, 228 y 232, como se muestra en el listado de secuencia llenado adjunto a este documento.
En algunas representaciones, un anticuerpo anti-HER-3 puede incluir una cadena pesada de secuencias de amino ácidos y una cadena liviana de secuencias de amino ácidos, como se muestra en SEQ ID NOS: 2 y 4, 6 y 8, 10 y 12, 14 y 16, 18 y 20, 22 y 24, 26 y 28, 30 y 32, 36 y 38, 42 y 44, 46 y 48, 50 y 52, 54 y 56, 60 y 58, 62 y 64, 66 y 68, 70 y 72, 74 y 76, 78 y 82, 80 y 82, 84 y 86, 88 y 90, 92 y 94, 96 y 98, 100 y 102, 104 y 106, 108 y 110, 112 y 114, 116 y 118, 122 y 124, 126 y 128, 130 y 132, 134 y 136, 138 y 140, 142 y 144, 146 y 148, 150 y 152, 154 y 156, 158 y 160, 162 y 164, 166 y 168, 170 y 172, 174 y 176, 178 y 180, 182 y 184, 186 y 188, 190 y 192, 194 y 196, 198 y 200, 202 y 204, 206 y 208, 210 y 212, 214 y 216, 218 y 220, 222 y 224, 226 y 228, 230 y 232, o una cadena pesada de secuencias de amino acids, tal como se muestra en cualquiera de SEQ ID NOS: 34, 40, 60, 62, y 120, o una cadena liviana de secuencias de amino ácidos, tal como se muestra en uno u otro de los SEQ ID NOS: 58 y 64, como se muestra en el listado de secuencia llenado adjunto a este documento.
En algunas representaciones, una proteina marcada para el HER-3 puede ser una proteina andamio que tenga una actividad de unión similar a la de un (p. e., teniendo actividad similar a un anticuerpo anti-HER-3), o un anticuerpo, p. e., un anticuerpo anit-HER-3. El anticuerpo anti-HER-3 puede ser seleccionado del grupo que consiste de anticuerpos designados Ul-1, Ul-2, Ul-3, Ul-4, Ul-5, Ul-6, Ul-7, Ul-8, Ul-9, Ul-10, Ul-11, Ul-12, Ul-13, Ul-14, Ul-15, Ul-16, Ul-17, Ul-18, Ul-19, ül-20, Ul-21, Ul-22, Ul-23, Ul-24, Ul-25, Ul-26, Ul-27, Ul-28, Ul-29, Ul-30, Ul-31, Ul-32, Ul-33, Ul-34, Ul-35, Ul-36, Ul-37, Ul-38, Ul-39, Ul-40, Ul-41, Ul-42, Ul-43, Ul-44, Ul-45, Ul-46, Ul-47, Ul-48, Ul-49, Ul-50, Ul-51, Ul-52, Ul-53, Ul-55.1, Ul-55, Ul-57.1, Ul-57, Ul-58, Ul-59, Ul-61.1, Ul-61, y Ul-62, o un anticuerpo que tenga al menos una cadena pesada o liviana de los anticuerpos anteriormente mencionados. Los anticuerpos designados como Ul-49 (SEQ ID NO: 42/44), Ul-53 (SEQ ID NO: 54/56), y Ul-59 (SEQ ID NO: 70/72) , o un anticuerpo que tenga al menos una cadena pesada o liviana de uno de estos anticuerpos, pueden ser particularmente útiles.
Se debe entender que las secuencias de amino ácidos de las proteínas de unión HER-3 provistas en este documento no esta limitado a los veinte amino ácidos convencionales (see, Immunology - A Synthesis (2nd Edition, Golub y Gren, eds . , Sinauer Associates, Sunderly, Mass. (1991)), el cual es incorporado en este documento por la referencia) . Por ejemplo, los amino ácidos pueden incluir estereoisomeros (p. e., D-amino ácidos) de los veinte amino ácidos convencionales, amino ácidos no naturales, tales como a-a-amino ácidos di-substituidos, amino ácidos N-alkyl, acido láctico, y otros amino ácidos no convencionales. Ejemplos de amino ácidos no convencionales, los cuales también pueden - - ser apropiados como componentes para la unión de las proteínas provistas en este documento, incluye: 4-hydroxyproline, ?-carboxyglutamate, e-?, N, N-trimethyllysine, e-?-acetyllysine, O-phosphoserine, N-acetylserine, N-formylmethionine, 3-methylhistidine, 5-hydroxylysine, s-?-methylarginine, y otros amino ácidos similares e imino ácidos, p. e., 4-hydroxyproline .
Además, variaciones menores en las secuencias de amino ácidos mostradas en SEQ ID NOS: 1-390 (como se plantea e el apéndice llenado anexo a este documento) son contemplados mientras son abarcados por la presente revelación, provisto que las variantes en las secuencias de amino ácidos mantengan al menos un 75% (p. e., al menos 80%, 90%, 95%, o 99%) de las secuencias mostradas en SEQ ID NOS: 1-390. Las variaciones pueden ocurrir dentro de las regiones del marco (p. e., fuera de los CDRs) , dentro de los CDRs, o dentro de las regiones del marco y del CDR. En algunas representaciones, las variaciones en las secuencias de amino ácidos mostradas en SEQ ID NOS: 1-390, p. e., eliminaciones, inserciones y/o substituciones de al menos un amino acido, puede ocurrir cerca de los limites de los dominios funcionales. Los dominios funcionales y estructurales pueden ser identificados al comparar los nucleótidos y/o la información de las secuencias de amino ácidos para bases de datos de secuencias públicas o privadas. Métodos de comparación computarizada pueden ser utilizados para identificar los motivos de las secuencias o dominios de proteínas de conformación predichas, que ocurran en otras proteínas de unión de la estructura conocida y/o función. Los métodos para identificar las secuencias de proteínas que se pliegan en una estructura tri-dimensional que son conocidas en la técnica. See, p. e., Bowie et al. (1991) Science 253:164; Proteínas, Structures y Molecular Principies (Creighton, Ed. , W. H. Freeman y Company, New York (1984)); Introduction to Proteína Structure (Bryen y Tooze, eds., Garly Publishing, New York, N.Y. (1991)); y Thornton et al. (1991) Nature 354:105), los cuales son todos incorporados en este documento por la referencia. Por lo tanto, aquellos con experiencia dentro de la materia pueden reconocer motivos de secuencias y conformaciones estructurales que pueden ser utilizados para definir dominios estructurales y funcionales, de acuerdo a las proteínas descritas en este documento.
Las variaciones en las secuencias de amino ácidos mostrados en SEQ ID NOS: 1-390 puede incluir a aquellos que llevan a una reducción de susceptibilidad, a proteólisis u oxidación, alterar los patrones de glicolizacion, o alterar afinidades de unión o conferir o modificar otras propiedades fisicoquímicas o funcionales de la proteína de unión. En particular, se contemplan suplentes de amino ácidos conservativos. Los suplentes conservativos son aquellos que toman lugar dentro de la familia de amino ácidos que están relacionados en sus cadenas laterales. Las familias de amino ácidos incluyen los siguientes: familia ácida = aspartato, glutamato, familiar básica = lisina, la arginina, la histidina, la familia no polar = alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano; familia polares sin carga = glicina, asparagina, glutamina, cisteina, serina, tirosina treonina. Familias alternativas incluyen: la familia alifáticos-hidroxi = serina y treonina; familia amida-contenida = asparagina y la glutamina, la familia alifáticos = alanina, valina, leucina e isoleucina, ; y la familia aromática = fenilalanina, triptófano y tirosina. Por ejemplo, es razonable esperar que un suplemento aislado de una leucina con una isoleucina o valina, un aspartate con un glutamate, una treonina con una serina, o un suplemento similar de un amino acido con un amino acido estructuralmente similar no tendrá mayor efecto en la unión de propiedades de la proteina de unión resultante, especialmente si el suplemento también son abarcados en este documento. Si el cambio de un amino acido resulta en una proteina de unión funcional HE-3, que reduzca las señales de transducción del HER-3, pueden ser fácilmente determinados por ensayar la actividad del de unión HER-3 específico de la proteína de unión resultante por el método ELISA o FACS, o con pruebas funcionales in vitro o in vivo.
En algunas representaciones, una proteína de unión HER- 3 puede ser acoplada a un grupo efector, dicha proteína de unión puede ser especialmente útil para aplicaciones terapéuticas. Según como se utiliza en este documento, el término "grupo efector" se refiere a un grupo citotóxico, tales como un radio isótopo o radionuclideos (p. e., 3H, 14, C-,, 15MN, 35So, 90vY, 99mTe, 111TI„n, 125 TI, 131 TI\) o isótopos no radiales (p. e., 2D) caliquemicina, dolastaina análogas tales como auristatins, y los agentes quimioterapéuticos, tales como derivados geldanamicina y maytansine, incluyendo DM1. Por lo tanto, en algunos casos, un grupo puede ser tanto un grupo marcador como un grupo efector. Varios métodos de unir el grupo efector a polipéptidos o glicopolipéptidos (tales como anticuerpos) son conocidos dentro de la técnica, pueden ser utilizados en la producción y el proceso de llevar las composiciones y métodos descritos en este documento. En algunas representaciones, puede ser útil el tener un grupo efector unido a una proteina de unión por brazos espaciadores de diferentes longitudes para, por ejemplo, reducir la potencial obstaculización esférica.
Este documento también se relaciona a un proceso para la preparación de una proteina de unión HER-3 aislada, incluyendo el paso de preparar la proteína de una célula huésped que exprese a la proteína. Las células huésped que pueden ser utilizadas incluyen, sin ninguna limitación, hibridomasr células eucariotas (p. e., células de mamíferos como el hámster, el conejo, la rata, el cerdo, o células de ratón) , las células vegetales, las células de hongos, células de levadura (por ejemplo, Saccharomyces cerevisiae o células de Pichia pastoris) , las células procariotas (por ejemplo, E. células coli) , y otras células utilizadas para la producción de proteínas de unión. Varios métodos para la preparación y aislamiento de proteínas de unión, tales como proteínas andamios o anticuerpos, de células huésped, son conocidas en la materia y pueden ser utilizados para mejorar los métodos descrito en este documento. Además, los métodos para preparar fragmento de proteínas de unión, p. e., fragmentos de proteínas andamio o fragmento de anticuerpos, tales como papaína o pepsina, técnicas modernas de clonación, técnicas para preparar moléculas de anticuerpos de una sola cadena (Plückthun, supra) y diacuerpos (Hollinger et al., Supra), también son conocidos por los expertos en la materia y pueden ser utilizados en la ejecución de los métodos descritos en la actualidad.
En algunas representaciones, un HER-3 de unión a proteínas puede ser preparado a partir de un hibridoma que segrega la proteína. See, p. e., Kóhler et al. (1975) Nature 256:495.
En algunas representaciones, una proteína de unión HER-3 puede ser preparada de manera recombinante al optimizar y/o amplificar las expresiones de las proteína de unión en la célula huésped, y aislamiento la proteína de unión de las células huésped. En este punto, las células huésped pueden ser transformadas o transferidas con ADN (p. e., un vector, que codifique una proteína de unión HER-3, y cultivadas bajo condiciones apropiadas para producir la proteína de unión. See, p. e., U.S. Patent No. 4, 816, 567. Células útiles de acogida, por ejemplo, las células CHO, NS / 0 células del mieloma, células del riñon embrionario humano 293, las células E. coli, y células Saccharomyces cerevisiae.
La proteína de unión HER-3 que son anticuerpos, pueden ser preparados a partir de animales genéticamente diseñados para hacer anticuerpos completamente humanos, o de una colección de anticuerpos hechos en bacteriófagos, levaduras, ribosomas o E. coli. See, p. e., Clackson et al. (1991) Nature 352 : 62 -628 ; Marks et al. (1991) J. Mol . Biol. 222:581-597; Feldhaus y Siegel (2004) J. Immunol. Methods - - 2_90:69-80; Groves y Osbourn (2005) Expert Opin. Biol. Ther. 5:125-135; y Jostock y Dubel (2005) Comb. Chem. High Throughput Screen 8^:127-133.
En algunas representaciones, los anticuerpos provistos en este documento pueden ser preparados por anticuerpos completamente humanos o Humanizados. Lo anticuerpos evitan ciertos problemas asociados con anticuerpos xenogeneticos , tales como anticuerpos que poseen regiones variablesy/o constantes marinos o de rata. La presencia de proteínas xenogeneticos-derivados puede llevar a una respuesta inmune en contra del anticuerpo por parte del paciente, llevyo así, subsecuentemente, a la rápida liquidación dell anticuerpo, perdida de la utilidad terapéutica a travez de la neutralización del anticuerpo, y/o reacciones alérgicas severas, e inclusive riesgosas para la salud. Para evitar el uso de anticuerpos marinos o de rata, se pueden generar anticuerpos completamente humanos a travez de la locación funcional de un anticuerpo humano dentro de un roedos u otro animal o mamífero similar al roedor, otro animal o mamífero produce anticuerpos completamente humanos.
Un método para generar anticuerpos completamente humanos es la utilización de cepas XENOMOSE® de ratón que han sido producidas para contener fragmentos de configuración germlina de tamaño 245 kb y 190kb de cadena pesada humana locus y de cadena liviana kappa locus. Otras cepas XENOMOUSE® contiene fragmentos de configuración germlina de 980 kb y 800kb de tamaño de cadena pesada humana locus y de cadena liviana kappa locus. Aun otras cepas XENOMOUSE® de ratones contienen fragmentos de configuración germlina de tamaño 980 kb y 800 - - kb de cadena pesada humana locus y de cadena liviana kappa locus además de fragmentos de configuración germlina de tamaño 740 kb de una cadena liviana lambda humana. See, Méndez et al. (1997) Nature Genetics _15: 146-156; y Green y Jakobovits (1998) J. Exp. Med. 188:483-495. XENOMOUSE® strains are available from Amgen, Thousy Oaks, CA.
La producción de ratones XENOMOUSE® es discutida más adelante y delineada en U.S. Patent Publication 2003/0217373, llenado en November 20, 2002; U.S. Patent Nos. 5, 939, 598, 6, 075, 181, 6, 114, 598, 6, 150, 584, 6, 162, 963, 6, 673, 986, 6, 833, 268, y 7, 435, 871, y Japanese Patent Nos. 3068180B2, 3068506B2, y 3068507B2. See, also, European Patent No. EP 0463151, PCT Publication Nos. WO 94/02602, WO 96/34096, WO 98/24893, y WO 00/76310. Las revelaciones de cada una de las patentes anteriormente citadas, solicitudes y referencias, son incorporadas en su totalidad en este documento por la referencia.
Alternativamente, el enfoque "minilocus" puede ser utilizado. En el enfoque de minilocus, un locus exógeno Ig es reproducido a través de la inclusión de piezas (genes individuales) del locus Ig. Por lo tanto, uno o mas genes VH, uno o más genes DH, uno o más genes JH, una región constante mu, y y una segunda región constante (p. e., región constante a gamma) son formados dentro de una construcción para la inserción en animales. Este enfoque es descrito en U.S. Patent Nos. 5, 545, 806, 5, 545, 807, 5, 569, 825, 5, 591, 669, 5, 612, 205, 5, 625, 126, 5, 625, 825, 5, 633, 425, 5, 643, 763, 5, 661, 016, 5, 721, 367, 5, 770, 429, 5, 789, 215, 5, 789, 650, 5, 814, 318, 5, - - 874, 299, 5, 877, 397, 5, 981, 175, 6, 023, 010, 6, 255, 458, las incorporaciones de la cuales están aquí por la referencia. See, también, European Patent No. 0546073, PCT Publication Nos. WO 92/03918, WO 92/22645, WO 92/22647, WO 92/22670, WO 93/12227, WO 94/00569, WO 94/25585, WO 96/14436, WO 97/13852, and WO 98/24884, las representaciones de las cuales son todas incorporadas en este documento por la referencia.
Los Anticuerpos humanos también pueden ser generados a partir de ratones, en los cuales, a través de fusión micro celular, grandes pedazos de cromosomas o cromosomas completos, han sido incorporados. See, European Patent Application Nos. 773288 and 843961, las representaciones de las cuales son todas introducidas en este documento por la referencia. Adicionalmente, ratones KM™, los cuales son el resultado de reproducciones cruzadas de ratones Kirin' s Te con ratones minilocus Medarex' s (Humab) que han sido generados. Estos ratones poseen la transchromosome HC de los ratones Kirin y el transgén de la cadena kappa de los ratones Medarex (Ishida et al. (2002) Cloning Stem Cells 4: 91-102 ) .
Los anticuerpos humanos también pueden ser obtenidos por métodos in vitro. Ejemplos apropiados, incluyendo, pero no limitado a, de despliegues de fagos (como se comercializa por Cambridge Antibody Technology, MorphoSys, Dyax, Biosite / Medarex, Xoma, Symphogen, Alexion (antes Proliferon) , y Affimed) , de los ribosomas (como comercializado por Cambridge Antibody Tecnología) , despliegues de levadura, y similares.
Tal como se describe en este documento, los anticuerpos fueron preparados utilizando tecnología XENOMOUSE®, tal como se describe a continuación. Dichos ratones son capaces de producir moléculas humanas de inmunoglobinas y de anticuerpos, y son deficientes en la producción de moléculas murinas de inmunoglobina y anticuerpos. Las tecnologías utilizadas para lograr lo mismo, son reveladas en las patentes, solicitudes y referencias que se revelan en este documento. Por ejemplo, la producción transgénica de un ratón y anticuerpos de este son revelados en U.S. Patent Application Serial No. 08/759, 620, filed December 3, 1996, and International Patent Application Nos. WO 98/24893, published June 11, 1998 and WO 00/76310, published December 21, 2000, las representaciones de las cuales son incorporadas en este documento por la referencia. See also Méndez et al. (1997) Nature Genetics 15:146-156, las representaciones de las cuales son incorporadas en este documento por la referencia.
Utilizando tecnología como se describe en este documento, se pueden producir anticuerpos monoclonales completamente humanos para una variedad de antígenos. Por ejemplo, líneas de ratones XENOMOUSE® pueden ser inmunizadas con un antígeno HER-3 de interés (p. e. HER-3 o fragmento de este) , células linfáticas (tales como células-B) pueden ser recuperadas de ratones que expresen anticuerpos, y las líneas de células recuperadas pueden ser fusionadas con una línea celular de tipo mieloide, para preparar líneas de células hibridomas inmortales. Estas líneas de células hibridomas pueden ser seleccionadas para identificar líneas - - de células hibridomas que produzcan anticuerpos específicos para el antigeno de interés. En este documento se proveen métodos para la producción de líneas múltiples de células hibridomas que produzcan anticuerpos específicos para el HER-3 además se proveen en este documento métodos para la caracterización de anticuerpos producidos por dichas líneas celulares, incluyendo análisis de secuencias de nucleótidos y amino ácidos de las cadenas pesadas y livianas de dichos anticuerpos .
En general, los anticuerpos producidos por la fusión de hibridomas, como se describe a continuación, son cadenas humana pesadas IgGl con cadenas livianas kappa completamente humanas, aun así algunos de los anticuerpos descritos en este documento posee cadenas pesadas humanas IgG4, al igual que cadena pesadas IgGl. Los anticuerpos también pueden ser de otros isótopos humanos, incluyendo IgG2 e IgG3. Los anticuerpos generalmente tienen grandes afinidades, con un KD típico de entre 10~6 a cerca de ?G13? o menor, cuando se mide por técnicas de fase solida y basadas en células.
Este documento también provee moléculas aisladas de acido nucleico que codifican proteínas de unión HER-3, tal como es descrito en este documento. El término "molécula aislada de acido nucleico", como se utiliza en este documento, se refiere a un polinucleótido de genómico, cADN, o de origen sintético, o algunas combinaciones de este, el cual (1) no está asociado con todo o una porción de un polinucleótido en donde el "polinucleótido aislado" es encontrado en su fase madura, (2) i ligado de manera operable a un polinucleótido, al cual no está unido - - naturalmente, o (3) no ocurre en la naturaleza como parte de una secuencia mas grande. Además, el término "molécula de acido nucleico", tal como es utilizado en este documento, se refiere a una forma polimérica de un nucleótido de al menos 10 bases de largo, ya sea tanto ribonucleotidos o desoxinucleotidos o una forma modificada de tanto un tipo de nucleótido, tales como nucleótidos con grupos de azucares modificados o substituidos, y algunos similares. El término también incluye formas de ADN de una sola o doble cadena.
En algunas representaciones, una molécula de acido nucleico puede ser unido de manera operable a una secuencia de control. El término "secuencia de control", tal como es utilizado en este documento, se refiere a secuencias de polinucleótidos que son necesarios para afectar la expresión y procesión de secuencias codificantes a las cuales estos se hallan ligados. La naturaleza de dicha secuencias de control difiere dependiendo respecto al organismo huésped. En procariotas, dichas secuencias de control incluyen promotores, sitios de unión ribosomales y secuencias de terminación de transcripción. En eucariotas, generalmente, dichas secuencias de control incluyen promotores y secuencias de terminación de transcripción. El término "secuencia de control" está dirigida para incluir, en un mínimo, todos los componentes cuya presencia es esencial para la expresión y procesamiento, y también incluye componentes adicionales, cuya presencia es ventajosa, por ejemplo, secuencias líderes y secuencias conyugas de fusión. Además, el término "ligado de manera operable", como se utiliza en este documento, se refiere a la posición de - - componentes descrito que se encuentren relacionados que les permita funcionar de la manera adecuada.
Por otra parte, una secuencia de control de expresión, ligada de manera operable, a una secuencia codificante, está ligada de tal manera que la expresión de la secuencia codificante es lograda bajo condiciones compatibles con la secuencia de control de expresión.
También provisto en este documento, están los vectores que comprenden una molécula de acido nucleico que codifique una proteina de unión, tal como se divulga en este documento. La molécula de acido nucleico puede ser ligado de manera operable a una secuencia de control. Además, el vector puede contener, adicionalmente, un origen de replicación o un gen de selección marcador. Ejemplos de marcadores que pueden ser utilizados incluyen p. e., plasmids, cosmids, fagos, y viruses.
Este documento también provee células huésped, transformadas con una molécula de acido nucleico, o vectores, tal como es descrito en este documento. La transformación puede ser llevada a cabo por un método conocido para introducir polinucleótidos dentro de una célula huésped, incluyendo, por ejemplo, sellar el polinucleótido en un virus (o dentro de un vector viral) y transduciendo células huésped con el virus (o vector), o por procedimientos de transfeccion conocidos en la técnica, tal como es ejemplificado por U.S. Patent Nos. 4, 399, 216, 4, 912, 040, 4, 740, 461, y 4, 959, 455, los cuales son aquí incorporados a este documento en su totalidad por la - - referencia. Los métodos para introducir polinucleótidos heterologos dentro de células mamiferas son bien conocidos en la técnica, incluyendo, sin limitación alguna, transfección dextran-mediada, precipitación de fosfato de calcio, polibreno de transfección mediada, la fusión de protoplastos, electroporación, la encapsulación del (los) polinucleótido (s) en liposomas, y la microinyeccion directa de ADN en los núcleos. Ejemplos de las células del huésped que pueden ser utilizadas, incluyen hibridomas, células eucariotas (p. e., células de mamíferos como hámsters, conejos, ratas, cerdos, ratones, o las células de otros animales) , células vegetales (por ejemplo, el maíz y las células del tabaco), las células fúngicas ( por ejemplo, S. cerevisiae y células de P. pastoris), las células procariotas como E. coli, y otras células utilizadas en la técnica para la producción de anticuerpos. Líneas de células mamiferas disponibles como huéspedes para expresiones son bien conocidas en la técnica e incluyen, por ejemplo, varias líneas de células inmortalizadas disponibles en la American Type Culture Collection (ATCC; Manassas, VA) . Esto incluye, sin limitación alguna, células de ovarios de hámster chimo (CHO) , células HeLa, células de riñon de hámster bebe (BHK) , células de riñon de mono (COS) , las células carcinoma hepatocelular (por ejemplo, las células Hep G2) , y una serie de otras líneas celulares.
En otras realizaciones, el agente de unión a HER-3 es un compuesto de moléculas pequeñas. Estos compuestos pueden ser identificados utilizando, por ejemplo, colecciones virtuales o físicas de moléculas pequeñas. En algunas realizaciones, - - por ejemplo, compuestos moleculares pequeños útiles moléculas pueden ser identificados utilizando los métodos de detección de consenso virtual basados en inhibidores de HER-3 conocidos y modelos de HER-3 activos y estructuras de estado inactivo. Los compuestos que parecen ser de interés pueden ser analizados más adelante por su novedad estructural y propiedades fisico-quimicas deseables. Los compuestos del Candidato identificados mediante la detección virtual pueden ser probados in vitro, p.e., la capacidad de inhibir el crecimiento de las células que sobre-expresan el HER-3. En otras realizaciones, compuestos moleculares pequeños útiles pueden ser identificados a partir de una colección de compuestos moleculares pequeños, usando métodos de alto rendimiento para detectar un gran número de compuestos para la capacidad de unirse y / o inhibir la actividad de HER-3 (p.e., en las células que sobre-expresión de HER-3). De moléculas inhibidores de HER 3 pequeñas pueden ser sintetizados utilizando métodos estándar síntesis química, por ejemplo.
En otra representación, el agente que se une al HER-3 puede ser un siRNA que interfiere con la expresión del HER-3. Un ejemplo de siRNA es EZN-3920 (antisentido dirigidos erbB3 ARNm) (Santaris Pharma, Hoersholm, Dinamarca) .
En otra representación, el agente que se une al HER-3 puede ser una sustancia natural. Por ejemplo, Kahalalido F, un agente de origen marino, ha sido sugerido para inhibir la - - señalización ocogénica del HER 3 (Jimeno et al. (2006) J.
Translational Med. 4:3) por expresiones de la proteina HER 3 bajo regulación, y señalización AKT (Janmaat et al. (2005) Mol. Pharmacol. 68:502-510).
En otras representaciones el agente que se une al HER 3 puede ser un andamio de origen artificial o natural, el cual no es un anticuerpo anti-HER- 3, pero tiene una actividad similar a la de un anticuerpo (p. e., tiene una actividad similar a aquella del anticuerpo anti- HER-3) . 3. Agentes que se unen a otros miembros de la familia HER.
Como ya se mencionó anteriormente, las composiciones y los métodos previstos en este documento para el tratamiento de la enfermedades asociadas a HER-3 incluyen un primer agente que se une al HER-3, en combinación con un segundo agente que se une y / o inhibe al menos un miembro de la familia HER, incluyendo pero no limitado a, EGF-R, HER-2, SU- 4. El segundo agente puede ser, sin limitación, las drogas biológicas, P. E., una proteina de unión, tales como un anticuerpo que se une específicamente a un miembro de la familia HER, o un compuesto molecular pequeño que se une a y / o altera (p. e., inhibe) la actividad de por lo menos un miembro de la familia HER diferente a (o en adición a) HER-3, un siRNA, o una sustancia natural. Tal como se utiliza en este documento, los términos "otros miembros de la familia HER" y "otro miembro de la familia HER" se refieren a miembros de la familia HER que no son el HER-3. Algunos ejemplos son el EGF-R, HER-2, y HER-4, pero "miembro de la - - familia HER" también incluye a los miembros de la familiar que aún no han sido identificados.
El segundo agente puede alterar la actividad (p. e., incrementar o disminuir) la actividad de otro miembro de la familia HER, ya sea a través de un efecto directo o un efecto indirecto sobre un miembro de la familia HER. Sin embargo es de anotar, que todos los segundos agentes como se suministro aquí, tendrán un efecto en la actividad y en la función sobre la Familia HER.
En algunos casos, por ejemplo, el segundo agente puede ser un anticuerpo que se puede unir a otro miembro de la familia HER (p. e., EGF-R, HER-2, o HER-4), o a otra molécula que a su vez puede afectar la actividad de el otro miembro de la familia HER. Es asi como un anticuerpo puede ser marcado, por ejemplo, para el dominio extracelular de otro miembro de la familia HER, o para cualquier otro dominio adecuado de los mismos (p. e., un dominio quinasao un dominio de dimerización) .
Un segundo agente puede ser caracterizado además porque su efecto en otro miembro de la familia HER reduce la transducción de señal HER mediadora. Una reducción de la transducción de la señal HER- mediadora puede, p. e., ser causada por una baja regulación del miembro HER marcado, dando como resultado una mínima desaparición de la molécula - - HER a partir de la célula, o por una estabilización del miembro de la familia HER en una forma sustancialmente inactiva. Por otra parte, una reducción de la transducción de la señal HER- mediadora puede ser causada por influencia, p. e., disminución o inhibición, la unión de un ligando a un miembro de la familia HER, la unión del miembro de la familia HER a HER-3, o la unión de GRB2 a HER-2 o GRB2 a SHC, o por la inhibición de la fosforilación de la tirosina del receptor, la fosforilación de AKT, la fosforilación de la tirosina PYK2, o fosforilación ERK2, o cualquier otro componente celular que afectan el camino de la transducción de la señal de la familia HER-mediadora . Por ejemplo, una reducción de la transducción de la señal del HER mediador puede ser causado por la disminución de la formación de dimeros que contienen HER-3 y otros miembros de la familia HER (p. e., EGF-R, HER-2, o HER-4). Independientemente del mecanismo detrás de la función, se observa que el segundo agente puede servir para amplificar el efecto del primer agente que es marcado para HER-3.
En algunas realizaciones, un agente que se une a otro miembro de la familia HER o a otra proteína que a su vez afecta la actividad de otro miembro de la familia HER puede ser una protexna de andamxaje que tiene una actividad similar a la de anticuerpo de unión (p. e., que tienen actividad similar a un anticuerpo anti-HER-3) o un anticuerpo (por ejemplo, un anti-EGF-R, anti-HER-2, o anticuerpos anti-HER-4) . Las proteínas de andamiaje y los anticuerpos en este contexto son definidos y descritos anteriormente por los agentes marcados para HER-3. Tal andamiaje puede ocurrir de manera artificial o natural.
Se observa, en algunas realizaciones, el primer agente que se une al HER-3, y el segundo agente que se une a y / o inhibe otro miembro de la familia HER se combinan en un compuesto, como un anticuerpo biespecificos .
También como se describe anteriormente, las secuencias de aminoácidos de las proteínas que se unen a otros miembros de la familia HER, o a otras proteínas que a su vez afectan a la actividad de otro miembro de la familia HER, no se limitan a los veinte aminoácidos convencionales. Además, en cuanto a las proteínas de unións HER, descritas en este documento, un agente que se une a o, por el contrario, afecta la actividad de otro miembro de la familia HER, se puede unir a un grupo efector.
Este documento se refiere también a los procesos para la preparación de los aislamientos de proteínas (por ejemplo, anticuerpos) que pueden unirse a otros miembros de su familia, por ejemplo. Estos procesos incluyen los descritos anteriormente en el contexto de las proteínas de unións HER-3. En algunas realizaciones, los anticuerpos (por ejemplo, anti-HER, anti-HER-2, o anticuerpos anti-HER-4, respectivamente) se pueden preparar a partir de animales creados para producir anticuerpos totalmente humanos, o desde una selección de anticuerpos producidos en bacteriófagos, levaduras, ribosomas, o E. coli. Además, un anticuerpo marcado directamente o indirectamente para otro miembro de la familia HER puede ser plenamente humano o humanizado, como se describe anteriormente.
También suministrado en este documento están las moléculas de ácido nucleico aisladas (p. e. vectores) proteínas de expresión que pueden unirse a otros miembros de la familia HER y otras proteínas que pueden afectar la actividad de otros miembros de la familia HER. Las secuencias de codificación de proteínas de las moléculas de ácido nucleico pueden ser unidas operativamente a una o varias secuencias de control, como se describe anteriormente. Además, las moléculas de ácido nucleico pueden ser transformada o transfectada a una célula huésped como se describe anteriormente.
En algunas realizaciones, el segundo agente es un inhibidor tirosina quinasamolecular pequeño, previsto que el agente puede afectar (directa o indirectamente) la actividad de un miembro de la familia HER diferente a (o en adición a) HER-3. Estos inhibidores pueden ser identificados utilizando, por ejemplo catálogos, físicos o virtuales de moléculas pequeñas. En algunas realizaciones, por ejemplo, compuestos moleculares pequeños útiles pueden ser identificados utilizando los métodos de cribado virtual de consenso sobre la base de inhibidores de la tirosina quinasaconocida y los - - modelos de estructuras de los miembros de la familia HER en los estados activos e inactivos. Los compuestos que son inicialmente identificados como de interés potencial pueden ser analizados para novedad estructural y las propiedades fisico-quimicas deseadas. Los compuestos examinados e identificados mediante el cribado virtual pueden ser probados in vitro para p. e., la capacidad de inhibir el crecimiento de las células que sobre expresan un miembro de la familia HER diferente a HER- 3. En otras realizaciones, inhibidores tirosina quinasamolecular pequeño puede ser identificado a partir de una selección de compuestos de pequeñas moléculas y el uso de métodos de alto rendimiento para detectar un gran número de los compuestos de la capacidad de unirse y / o inhibir la actividad de uno o más miembros de la familia HER diferente a HER- 3 (P. E., en las células que sobre expresan la proteina HER) . Los Inhibidores tirosina quinasamolecular pequeño moleculares pueden ser sintetizados usando, por ejemplo, los métodos estándar de síntesis química.
Los agentes que pueden afectar una actividad del EGF-R (HER) incluyen AEE-788 (Novartis, Basilea, Suiza), BIBW-2992 (N-[4 - (3-cloro-4-fluorofenil) amino] -7 - [[ (3S)-tetrahidro-3-furanilo] oxi] -6-quinazolinyl] -4 (dimetilamino) -2-butenamide (Boehringer Ingelheim, Ingelheim, Alemania) , BMS-599626 (Bristol-Myers Squibb, Nueva York, NY) , carnetinib BMS-690514 (Bristol-Myers Squibb, Nueva York, NY) , dihidrocloruro (N-[4 - [N- ( 3-cloro-4-fluorofenil) amino] -7 - [3 - (4-morfolinil) propoxi ] ] dihidrocloruro de acrilamida quinazolin-6-il (Pfizer, Nueva York, NY) , CNX-222 - - (Ávila Therapeutics, altham, A) , CUDC-101 (Curis, la patente de EE.UU. N ° 7547781), Dimercept (receptor Biologix, Palo Alto , CA) , lapatinib (ditosilate hidrato (N- [ 3-cloro-4-[ (3-fluorobenzilo) fenil] oxi] -6 - [5 - [[[2 (Methylsulfonyl ) etil] metil] amino] furan-2-il bis] quinazolin-4-amina (4 methylbenzenesulfonate) monohidrato (GlaxoSmithKline, Londres, Inglaterra) , MP-412 (Mitsubishi Tanabe Pharma Co., Osaka, Japón) , neratinib ((2E)-N-[4 -[ [3-cloro-4- [ (piridina-2-il) ] metoxi fenil] ] -3-ciano-7-ethoxyquinolin-6-il] -4 - ( dimetilamino) , pero-2-enamide) (Wyeth, de Madison, New Jersey) , S-222611 (Shionogi, Osaka, Japón), varlitinib (4-N- [3-cloro-4- (2-tiazol-ylmethoxy) fenil] - 6-N- [ (4R) -4-metil-4 , 5-dihydrooxazol-2-il] quinazolina bis-4 , 6-diamina (4 methylbenzenesulfonate) (Array BioPharma, Boulder, CO) , AGT-2000 (ArmeGen tecnologías, Santa Monica, CA) , AZD-4769 (AstraZeneca, Londres, Inglaterra), BIBX-1382 (Boehringer Ingelheim, Ingelheim, Alemania), CGP-52411 (4,5-bis ( fenilamino) -1H-isoindol-1, 3 (2H)-diona) (Novartis, Basilea, Suiza), CL-387 785 (N-[4 - [(3 - bromofenil) ] amino] -6-quinazolinyl-2-butynamide) (Wyeth, de Madison, New Jersey), CP-292.597 (Pfizer, Nueva York, NY) , DAB-1059 (Mitsubishi Tanabe Pharma Co., Osaka, Japón), erlotinib (clorhidrato de (4 - (3-ethynylphenylamino) -6,7-bis (2-metoxietoxi) clorhidrato quinazolina (OSI Pharmeceuticals, Long Island, Nueva York, la patente de U.S N ° 5.747.498), gefitinib (4 - (3-4 cloro- -fluorophenylamino) -7-metoxi-6- [3 - (4-morfolinil) propoxi] quinazolina) (AstraZeneca, Londres, Inglaterra, la patente de EE.UU. N 0 5.821.246), HMPL-813 (Hutchison MediTech China, Hong Kong) , MDP- 01, (Discovery Med, el Plan-les-Ouates, - - Suiza) , MT-062 (Tecnologías Medisyn, Minneapolis, N) , ONC-101 (Oncalis, Schlieren, Suiza), PD-153035, (4 - (3-bromophenylamino) -6, 7-dimethoxyquinazoline) (AstraZeneca, Londres, Inglaterra), PD-169540 (Pfizer, Nueva York, Y) , pelitinib (Wyeth Pharmaceuticals, adison, NJ ), PF-299804 (Pfizer, Nueva York, NY) , PKI-166 (4 - (R) -phenethylamino-6-(hidroxilo) fenil-7H-pirrolo [2,3-d] pirimidina-) (Novartis, Basilea, Suiza ), vandetanib (N- ( 4-bromo-2-fluorofenil ) -6-metoxi-7- [ ( l-methylpiperidin-4-il) metoxi] quinazolin-4-amina) (AstraZeneca, Londres, Inglaterra) , VGA 1102 (Taisho Pharmaceuticals, Tokio, Japón), WHI-P154 (4 - ( 3 ' -bromo-4 ' -hidroxifenil) -amino-6 , 7-dimethoxyquinazoline) , ZD-1838 (AstraZeneca, Londres, Inglaterra) , cetuximab ( ImClone Systems, Nueva York, NY) , panitumumab (Amgen, Thousand Oaks, CA) .
Los agentes que pueden afectar a una actividad de HER2 incluyen AEE-788 (Novartis, Basilea, Suiza) , ARRY-333786 (Array BioPharma, Boulder, CO) , ARRY-380 (Array BioPharma, Boulder, CO) , BIBW-2992 (N- [4 - ( 3-cloro-4-fluorofenil ) amino] -7 - [ [ (3S) ] -tetrahidro-3-furanilo oxi]-6-quinazolinyl] -4 - (dimetilamino) -2-butenamide (Boehringer Ingelheim, Ingelheim, Alemania), BMS-599.626 (Bristol-Myers Squibb, Nueva York, NY) , el diclorhidrato de BMS-690514 (Bristol-Myers Squibb, Nueva York, NY) , carnetinib (N-[4 -[N-(3-cloro -4-fluorofenil) amino] -7 - [3 - (4-morfolinil) propoxi dihidrocloruro]] quinazolin-6-il acrilamida) (Pfizer, Nueva York, NY) , CNF-201 (Biogen Idee, San Diego, CA) , CNX-222 (Ávila Therapeutics , altham, MA) , CP-654577 (OSI Pharmaceuticals, Long Island, NY) , CP-724 714 (2-metoxi-N- [3 - - - [4 - [3-metil-4- ( 6-metil-piridina-3-iloxi ) fenilamino] acetamida] quinazolin-6-il ] -E-alilo) (OSI Pharmaceuticals, Long Island, NY) , CUDC-101 (Curis, Cambridge, MA, la patente de EE.UU. N ° 7.547.781), D-69491 (Baxter International Deerfield, IL) , Dimercept (Biologix receptor, Palo Alto, CA) , EHT-102 (Terapéutica ExonHit, París, Francia ) , antagonista de HER2 (Centgent Terapéutica, San Diego, CA) , HER / neu vacuna (Corixa, Seattle, WA) , Herzyme (siRNA Therapeutics , San Francisco, CA) , HuMax-HER2 (Genmab, Copenhague, Dinamarca), INS - 18 (Insmed, Richmond, VA), lapatinib (ditosilate hidrato (N- [3-cloro-4- [ (3-fluorobenzilo) fenil] oxi] -6 - [5 - [[[2 - (methylsulfonyl) etil] amino metil] ] bis] furan-2-il quinazolin-4-amina (4 methylbenzenesulfonate) monohidrato) (GlaxoSmithKline, Londres, Inglaterra), MP-412 (Mitsubishi Tanabe Pharma Co., Osaka, Japón), mu-4-D -5 (Genentech, Oceanside, CA) , mubritinib (1 - [4 - [4 - [ [2 - [(E) -2 - [4 - (Trifluorometil) fenil] etenilo] ] oxazol-4-il metoxi] fenil] butil]-lH-l , 2 , 3-triazol ) (Takeda Pharmaceuticals, Deerfield, IL) , neratinib ((2E)-N-[4 - [[3-cloro-4- [ (piridina-2-il) fenil] metoxi ]] -3-ciano-7-ethoxyquinolin-6-il] -4 - (dimetilamino) -2-, pero enamide) : (Wyeth , Madison, Nueva Jersey) , pertuzumab (Genentech, Oceanside, CA) , PX-103.1 (Pharmexa, Copenhague, Dinamarca), PX-103.2 (Pharmexa, Copenhague, Dinamarca), PX-104.1 (Pharmexa, Copenhague, Dinamarca), S- 222611 (Shionogi, Osaka, Japón) , Tak-285 (Takeda Pharmaceuticals, Deerfield, IL) , el trastuzumab (Genentech, Oceanside, CA) , trastuzumab-DM1 (ImmunoGen, Waltham, MA) , varlitinib (4-N-[3 - cloro-4- (2-tiazol-ylmethoxy) ] fenil-6-?- [ (4R) -4-metil-4 quinazolina] , 5-dihydrooxazol-2-il-4 , 6-bis diamina (4 - - methylbenzenesulfonate) ) (Array BioPharma, Boulder, CO) , VM-206 (ViroMed, Minneapolis, MN) .
Los agentes que pueden afectar la actividad de HER 4 incluyen Dimercept (receptor Biologix, Palo Alto, CA) , neratinib ((2E)-N-[4 - [ [ 3-cloro-4- [ (piridina-2-il ) fenil] metoxi] ] amino-3-ciano-7-ethoxyquinolin-6-il] -4 (dimetilamino) but-2-enamide ) ( yeth, de Madison, New Jersey) .
Ejemplos particulares, no limitativos, de agentes que pueden unirse y / o alterar la actividad de otros miembros de la familia HER y pueden ser utilizado en las composiciones y métodos proporcionados en este documento incluyen, sin limitación, erlotinib panitumumab (Amgen, Thousand Oaks, CA) , (Genentech , South San Francisco, CA, OSI Pharmaceuticals, Long Island, Nueva York; Roche, Basilea, Suiza) , lapatinib Glaxo Smith Kline, Londres, Reino Unido) , pertuzumab (Genentech, South San Francisco, CA) , el trastuzumab (Genentech, South San Francisco , CA) , cetuximab (ImClone, Nueva York, NY, y Bristol Myers Squibb, Nueva York, NY) , neratinib (Pfizer Inc., Nueva York, NY) , y T-DMl (Genentech, South San Francisco, CA; Roche , Basilea, Suiza) , gefitinib (AstraZeneca, Londres, Reino Unido, y Teva, Petah Tikva, Israel) . Estas se describen en detalle más adelante.
Panitumumab, comercializado como Vectibix ®, es un anticuerpo monoclonal totalmente humano especifico para EGF-R. En algunas ocasiones, una combinación para el tratamiento de la enfermedad asociada al HER- 3 puede ser Ul-1, Ul-2, Ul-3, Ul-4, Ul-5, Ul-6, Ul-7, Ul-8, Ul-9, Ul-10, Ul-11, Ul-12, - - Ul-13, Ul-14, Ul-15, Ul-16, Ul-17, Ul-18, Ul-19, Ul-20, Ul-21, Ul-22, Ul-23, Ul-24, Ul-25, Ul-26, Ul-27, Ul-28, Ul-29, Ul-30, Ul-31, Ul-32, Ul-33, Ul-34, Ul-35, Ul-36, Ul-37, Ul-38, Ul-39, Ul-40, Ul-41, Ul-42, Ul-43, Ul-44, Ul-45, Ul-46, Ul-47, Ul-48, Ul-49, Ul-50, Ul-51, Ul-52, Ul-53, Ul-55.1, Ul-55, Ul-57.1, Ul-57, Ul-58, Ul-59, Ul-61.1, Ul-61, or Ul-62, en combinación con panitumumab, ó Ul-1, Ul-2, Ul-3, Ul-4, Ul-5, Ul-6, Ul-7, Ul-8, Ul-9, Ul-10, Ul-11, Ul-12, Ul-13, Ul-14, Ul-15, Ul-16, Ul-17, Ul-18, Ul-19, Ul-20, Ul-21, Ul-22, Ul-23, Ul-24, Ul-25, Ul-26, Ul-27, Ul-28, Ul-29, Ul-30, Ul-31, Ul-32, Ul-33, Ul-34, Ul-35, Ul-36, Ul-37, Ul-38, Ul-39, Ul-40, Ul-41, U-42, Ul-43, Ul-44, Ul-45, Ul-46, Ul-47, Ul-48, Ul-49, Ul-50, Ul-51, Ul-52, Ul-53, Ul-55.1, Ul-55, Ul-57.1, Ul-57, Ul-58, Ul-59, Ul-61.1, Ul-61, ó Ul-62, Ul-1, Ul-2, Ul-3, Ul-4, Ul-5, Ul-6, Ul-7, Ul-8, Ul-9, Ul-10, Ul-11, Ul-12, Ul-13, Ul-14, Ul-15, Ul-16, Ul-17, Ul-18, Ul-19, Ul-20, Ul-21, Ul-22, Ul-23, Ul-24, Ul-25, Ul-26, Ul-27, Ul-28, Ul-29, Ul-30, Ul-31, Ul-32, Ul-33, Ul-34, Ul-35, Ul-36, Ul-37, Ul-38, Ul-39, Ul-40, Ul-41, Ul-42, Ul-43, Ul-44, Ul-45, Ul-46, Ul-47, Ul-48, Ul-49, Ul-50, Ul-51, Ul-52, Ul-53, Ul-55.1, Ul-55, Ul-57.1, Ul-57, Ul-58, Ul-59, Ul-61.1, Ul-61, ó Ul-62, en combinación con panitumumab, para el tratamiento de enfermedades neoplásicas, como el cáncer. Ejemplos de los tipos de cáncer que se pueden tratar con tales combinaciones son el cáncer de mama, cáncer gastrointestinal, cáncer de páncreas, cáncer de próstata, cáncer de ovario, cáncer de estómago, cáncer de endometrio, cáncer de glándula salival, cáncer de pulmón, cáncer renal, cáncer de colon, cáncer de colon, tiroides cáncer, cáncer de vejiga, gliomas, melanoma, cáncer de mama metastático, el cáncer de pulmón de células no - - pequeñas, el carcinoma epidermoide, el fibrosarcoma, el melanoma, el carcinoma nasofaríngeo, y el carcinoma de células escamosas.
El Erlotinib (comercializado como Tarceva ™) es un fármaco utilizado para tratar el NSCLC, cáncer de páncreas, y varios otros tipos de cáncer. El Erlotinib se dirige específicamente a la tirosina quinasadel EGF-R, unido reversible al sitio de unión del ATP del receptor. En algunas representaciones, una composición para el tratamiento de la enfermedad asociada al HER3 puede ser Ul-1, Ul-2, Ul-3, Ul-4, Ul-5, Ul-6, Ul-7, Ul-8, Ul-9, Ul-10, Ul-11, Ul-12, Ul-13, Ul-14, Ul-15, Ul-16, Ul-17, Ul-18, Ul-19, Ul-20, Ul-21, Ul-22, Ul-23, Ul-24, Ul-25, Ul-26, Ul-27, Ul-28, Ul-29, Ul-30, Ul-31, Ul-32, Ul-33, Ul-34, Ul-35, Ul-36, Ul-37, Ul-38, Ul-39, Ul-40, Ul-41, Ul-42, Ul-43, Ul-44, Ul-45, Ul-46, Ul-47, Ul-48, Ul-49, Ul-50, Ul-51, Ul-52, Ul-53, Ul-55.1, Ul-55, Ul-57.1, Ul-57, Ul-58, Ul-59, Ul-61.1, Ul-61, ó Ul-62, Ul-1, Ul-2, Ul-3, Ul-4, Ul-5, Ul-6, Ul-7, Ul-8, Ul-9, Ul-10, Ul-11, Ul-12, Ul-13, Ul-14, Ul-15, Ul-16, Ul-17, Ul-18, Ul-19, Ul-20, Ul-21, Ul-22, Ul-23, Ul-24, Ul-25, Ul-26, Ul-27, Ul-28, Ul-29, Ul-30, Ul-31, Ul-32, Ul-33, Ul-34, Ul-35, Ul-36, Ul-37, Ul-38, Ul-39, Ul-40, Ul-41, Ul-42, Ul-43, Ul-44, Ul-45, Ul-46, Ul-47, Ul-48, Ul-49, Ul-50, Ul-51, Ul-52, Ul-53, Ul-55.1, Ul-55, Ul-57.1, Ul-57, Ul-58, Ul-59, Ul-61.1, Ul-61, ó Ul-62, Ul-49, Ul-53 ó Ul-59, en combinación con Erlotinib, ó Ul-1, Ul-2, Ul-3, Ul-4, Ul-5, Ul-6, Ul-7, Ul-8, Ul-9, Ul-10, Ul-11, Ul-12, Ul-13, Ul-14, Ul-15, Ul-16, Ul-17, Ul-18, Ul-19, Ul-20, Ul-21, Ul-22, Ul-23, Ul-24, Ul-25, Ul-26, Ul-27, Ul-28, Ul-29, Ul-30, Ul-31, Ul-32, Ul-33, Ul-34, Ul-35, Ul- - - 36, Ul-37, Ul-38, Ul-39, Ul-40, Ul-41, Ul-42, ül-43, Ul-44, Ul-45, Ul-46, Ul-47, Ul-48, Ul-49, Ul-50, Ul-51, Ul-52, Ul-53, Ul-55.1, Ul-55, Ul-57.1, Ul-57, Ul-58, Ul-59, Ul-61.1, Ul-61, ó Ul-62, Ul-1, Ul-2, Ul-3, Ul-4, Ul-5, Ul-6, Ul-7, Ul-8, Ul-9, Ul-10, Ul-11, Ul-12, ül-13, Ul-14, Ul-15, Ul-16, Ul-17, Ul-18, Ul-19, Ul-20, Ul-21, Ul-22, Ul-23, Ul-24, Ul-25, Ul-26, Ul-27, Ul-28, Ul-29, Ul-30, Ul-31, Ul-32, Ul-33, Ul-34, Ul-35, Ul-36, Ul-37, Ul-38, Ul-39, Ul-40, Ul-41, Ul-42, ül-43, Ul-44, Ul-45, Ul-46, Ul-47, Ul-48, Ul-49, Ul-50, Ul-51, Ul-52, Ul-53, Ul-55.1, Ul-55, Ul-57.1, Ul-57, Ul-58, Ul-59, Ul-61.1, Ul-61, ó Ul-62,Ul-49, Ul-53 ó Ul-59, en combinación con Erlotinib y otro agente (s), para el tratamiento de enfermedades neoplásicas, tales como el cáncer, incluyendo pero no limitado al cáncer de mama, cáncer gastrointestinal, cáncer de páncreas, cáncer de próstata, cáncer de ovario, cáncer de estómago, cáncer de endometrio, cáncer de glándula salival , cáncer de pulmón, cáncer renal, cáncer de colon, el cáncer colorrectal, cáncer de tiroides, cáncer de vejiga, gliomas, melanoma, cáncer de mama metastático, el cáncer de pulmón de células no pequeñas, el carcinoma epidermoide, el fibrosarcoma, el melanoma, el carcinoma nasofaríngeo, o carcinoma de células escamosas. En algunas realizaciones preferidas, Ul-49, Ul-53 o Ul de 59 puede ser utilizado en el tratamiento de pacientes con cánceres incluyendo el cáncer local avanzado, de células no pequeñas (NSCLC) , NSCLC localmente avanzado y NSCLC metastático, después de fracasar de por lo menos una terapia quimioterapéutica previa, en combinación con Erlotinib. - - El Lapatinib (comercializado como Lapatinib) es una molécula pequeña activa por vía oral para el tratamiento de tumores sólidos como el cáncer de mama. El Lapatinib es un inhibidor dual de la tirosina quinasa que inhibe la actividad tirosina quinasa asociada con EGF-R y HER2/neu (tipo humano EGF-R 2) . En algunas realizaciones, una composición para el tratamiento de la enfermedad asociada al HER3 puede ser Ul-1, Ul-2, Ul-3, Ul-4, Ul-5, Ul-6, Ul-7, Ul-8, Ul-9, Ul-10, Ul-11, Ul-12, Ul-13, Ul-14, Ul-15, Ul-16, Ul-17, Ul-18, Ul-19, Ul-20, Ul-21, Ul-22, Ul-23, Ul-24, Ul-25, Ul-26, Ul-27, Ul-28, Ul-29, Ul-30, Ul-31, Ul-32, Ul-33, Ul-34, Ul-35, Ul-36, Ul-37, Ul-38, Ul-39, Ul-40, Ul-41, Ul-42, Ul-43, Ul-44, Ul-45, Ul-46, Ul-47, Ul-48, Ul-49, Ul-50, Ul-51, Ul-52, Ul-53, Ul-55.1, Ul-55, Ul-57.1, Ul-57, Ul-58, Ul-59, Ul-61.1, Ul-61, ó Ul-62, Ul-1, Ul-2, Ul-3, Ul-4, Ul-5, Ul-6, Ul-7, Ul-8, Ul-9, Ul-10, Ul-11, Ul-12, Ul-13, Ul-14, Ul-15, Ul-16, Ul-17, Ul-18, Ul-19, Ul-20, Ul-21, Ul-22,' Ul-23, Ul-24, Ul-25, Ul-26, Ul-27, Ul-28, Ul-29, Ul-30, Ul-31, Ul-32, Ul-33, Ul-34, Ul-35, Ul-36, Ul-37, Ul-38, Ul-39, Ul-40, Ul-41, Ul-42, Ul-43, Ul-44, Ul-45, Ul-46, Ul-47, Ul-48, Ul-49, Ul-50, Ul-51, Ul-52, Ul-53, Ul-55.1, Ul-55, Ul-57.1, Ul-57, Ul-58, Ul-59, Ul-61.1, Ul-61, ó Ul-62, Ul-49, Ul-53 ó Ul-59, en combinación con Lapatinib, ó Ul-1, Ul-2, Ul-3, Ul-4, Ul-5, Ul-6, Ul-7, Ul-8, Ul-9, Ul-10, Ul-11, Ul-12, Ul-13, Ul-14, Ul-15, Ul-16, Ul-17, Ul-18, Ul-19, Ul-20, Ul-21, Ul-22, Ul-23, Ul-24, Ul-25, Ul-26, Ul-27, Ul-28, Ul-29, Ul-30, Ul-31, Ul-32, Ul-33, Ul-34, Ul-35, Ul-36, Ul-37, Ul-38, Ul-39, Ul-40, Ul-41, Ul-42, Ul-43, Ul-44, Ul-45, Ul-46, Ul-47, Ul-48, Ul-49, Ul-50, Ul-51, Ul-52, Ul-53, Ul-55.1, Ul-55, Ul-57.1, Ul-57, Ul-58, Ul-59, Ul-61.1, Ul-61, ó Ul-62, Ul-1, Ul-2, Ul-3, Ul-4, Ul-5, Ul-6, - - Ul-7, Ul-8, Ul-9, Ul-10, Ul-11, Ul-12, Ul-13, Ul-14, Ul-15, Ul-16, Ul-17, Ul-18, Ul-19, Ul-20, Ul-21, Ul-22, Ul-23, Ul-24, Ul-25, Ul-26, Ul-27, Ul-28, Ul-29, Ul-30, Ul-31, Ul-32, Ul-33, Ul-34, Ul-35, Ul-36, Ul-37, Ul-38, Ul-39, Ul-40, Ul-41, Ul-42, Ul-43, Ul-44, Ul-45, Ul-46, Ul-47, Ul-48, Ul-49, Ul-50, Ul-51, Ul-52, Ul-53, Ul-55.1, Ul-55, Ul-57.1, Ul-57, Ul-58, Ul-59, Ul-61.1, Ul-61, ó Ul-62, Ul-49, Ul-53 ó Ul-59, En combinación con Lapatinib y otro agente (s) como la Capecitabina, para el tratamiento de enfermedades neoplásicas, como el cáncer, en donde el cáncer es, por ejemplo, el cáncer de mama, cáncer gastrointestinal, cáncer de páncreas, cáncer de próstata, cáncer de ovario, cáncer de estómago , cáncer de endometrio, cáncer de glándula salival, cáncer de pulmón, cáncer renal, cáncer de colon, el cáncer colorrectal, cáncer de tiroides, cáncer de vejiga, gliomas, melanoma, cáncer de mama metastático, el cáncer de pulmón de células no pequeñas, el carcinoma epidermoide, el fibrosarcoma, el melanoma, el carcinoma nasofaríngeo , o carcinoma de células escamosas. En algunas realizaciones preferidas, Ul-49, ül-53 o Ul de 59 puede ser utilizado en el tratamiento de pacientes con cánceres como el cáncer de mama y el cáncer de mama metastático cuyos tumores expresan o sobre-expresan la proteína HER-2 y que han recibido quimioterapia previa incluyendo una antraciclina (por ejemplo, doxorrubicina o agente relacionado) y / o un taxano (por ejemplo, el paclitaxel o docetaxel) , y trastuzumab, en combinación con el Lapatinib, o, en combinación con Lapatinib y capecitabina.
- - Trastuzumab (también conocido como Herceptin ®) es un anticuerpo monoclonal humanizado que interfiere con el receptor HER2/neu. En algunas realizaciones, una composición para el tratamiento de la enfermedad asociada al HER-3 puede ser Ul-1, Ul-2, Ul-3, Ul-4, Ul-5, Ul-6, Ul-7, Ul-8, Ul-9, Ul-10, Ul-11, Ul-12, Ul-13, Ul-14, Ul-15, Ul-16, Ul-17, Ul-18, Ul-19, Ul-20, Ul-21, Ul-22, Ul-23, Ul-24, Ul-25, Ul-26, Ul-27, Ul-28, Ul-29, Ul-30, Ul-31, Ul-32, Ul-33, Ul-34, Ul-35, Ul-36, Ul-37, Ul-38, Ul-39, Ul-40, Ul-41, Ul-42, Ul-43, Ul-44, Ul-45, Ul-46, Ul-47, Ul-48, Ul-49, Ul-50, Ul-51, Ul-52, Ul-53, Ul-55.1, Ul-55, Ul-57.1, Ul-57, Ul-58, Ul-59, Ul-61.1, Ul-61, ó Ul-62, Ul-1, Ul-2, Ul-3, Ul-4, Ul-5, Ul-6, Ul-7, Ul-8, Ul-9, Ul-10, Ul-11, Ul-12, Ul-13, Ul-14, Ul-15, Ul-16, Ul-17, Ul-18, Ul-19, Ul-20, Ul-21, Ul-22, Ul-23, Ul-24, Ul-25, Ul-26, Ul-27, Ul-28, Ul-29, Ul-30, Ul-31, Ul-32, Ul-33, Ul-34, Ul-35, Ul-36, Ul-37, Ul-38, Ul-39, Ul-40, Ul-41, Ul-42, Ul-43, Ul-44, Ul-45, Ul-46, Ul-47, Ul-48, Ul-49, Ul-50, Ul-51, Ul-52, Ul-53, Ul-55.1, Ul-55, Ul-57.1, Ul-57, Ul-58, Ul-59, Ul-61.1, Ul-61, ó Ul-62, Ul-49, Ul-53 ó Ul-59, en combinación con trastuzumab, ó Ul-1, Ul-2, Ul-3, Ul-4, Ul-5, Ul-6, Ul-7, Ul-8, Ul-9, Ul-10, Ul-11, Ul-12, Ul-13, Ul-14, Ul-15, Ul-16, Ul-17, Ul-18, Ul-19, Ul-20, Ul-21, Ul-22, Ul-23, Ul-24, Ul-25, Ul-26, Ul-27, Ul-28, Ul-29, Ul-30, Ul-31, Ul-32, Ul-33, Ul-34, Ul-35, Ul-36, Ul-37, Ul-38, Ul-39, Ul-40, Ul-41, Ul-42, Ul-43, Ul-44, Ul-45, Ul-46, Ul-47, Ul-48, Ul-49, Ul-50, Ul-51, Ul-52, Ul-53, Ul-55.1, Ul-55, Ul-57.1, Ul-57, Ul-58, Ul-59, Ul-61.1, Ul-61, ó Ul-62, Ul-1, Ul-2, Ul-3, Ul-4, Ul-5, Ul-6, Ul-7, Ul-8, Ul-9, Ul-10, Ul-11, Ul-12, Ul-13, Ul-14, Ul-15, Ul-16, Ul-17, Ul-18, Ul-19, Ul-20, Ul-21, Ul-22, Ul-23, Ul-24, Ul-25, Ul-26, Ul-27, Ul-28, Ul-29, - - Ul-30, Ul-31, Ul-32, Ul-33, Ul-34, Ul-35, Ul-36, Ul-37, Ul-38, Ul-39, Ul-40, Ul-41, Ul-42, Ul-43, Ul-44, Ul-45, Ul-46, Ul-47, Ul-48, Ul-49, Ul-50, Ul-51, Ul-52, Ul-53, Ul-55.1, Ul-55, Ul-57.1, Ul-57, Ul-58, Ul-59, Ul-61.1, Ul-61, ó U1-62,U1-49, Ul-53 ó Ul-59, En combinación con trastuzumab y otro agente (s) como docetaxel o paclitaxel para el tratamiento de enfermedades neoplásicas, como el cáncer, como el cáncer de mama, cáncer gastrointestinal, cáncer de páncreas, cáncer de próstata, cáncer de ovario, cáncer de estómago, cáncer de endometrio, cáncer de glándula salival, cáncer de pulmón, cáncer renal, cáncer de colon, el cáncer colorrectal, cáncer de tiroides, cáncer de vejiga, gliomas, melanoma, cáncer de mama metastático, cáncer de pulmón de células no pegueñas, el carcinoma epidermoide, el fibrosarcoma, el melanoma, el carcinoma nasofaríngeo, o de células escamosas carcinoma. En algunas realizaciones preferidas, Ul-49, Ul-53 o Ul de 59 puede ser utilizado en el tratamiento de pacientes con cánceres como el cáncer de mama y el cáncer de mama metastático cuyos tumores expresan y sobre-expresan la proteína HER-2 y quien no hayan recibido quimioterapia para su (metastático) enfermedad, en combinación con trastuzumab y paclitaxel, o, en combinación con trastuzumab y docetaxel.
T-DMl es un medicamento con anticuerpos conjugados que incluye trastuzumab unido químicamente a una droga potente antimicrotubular (DMl) derivados de maytansine. Maytansine ha sido utilizado como una droga libre, y ha mostrado eficacia en, por ejemplo, en pacientes de cáncer mama y de pulmón. El tioéter no reducible vinculador MCC se utiliza en T-DMl, proporcionando un vínculo estable entre trastuzumab y DMl, la - - prolongación de la exposición, y la reducción de la toxicidad de la T-DM1, mientras se mantiene la actividad. En algunas representaciones, un método para el tratamiento de la enfermedad asociada a HER3 puede incluir la administración de Ul-1, Ul-2, Ul-3, Ul-4, Ul-5, Ul-6, Ul-7, Ul-8, Ul-9, Ul-10, Ul-11, Ul-12, Ul-13, Ul-14, Ul-15, Ul-16, Ul-17, Ul-18, Ul-19, Ul-20, Ul-21, Ul-22, Ul-23, Ul-24, Ul-25, Ul-26, Ul-27, Ul-28, Ul-29, Ul-30, Ul-31, Ul-32, Ul-33, Ul-34, Ul-35, Ul-36, Ul-37, Ul-38, Ul-39, Ul-40, Ul-41, Ul-42, Ul-43, Ul-44, Ul-45, Ul-46, Ul-47, Ul-48, Ul-49, Ul-50, Ul-51, Ul-52, Ul-53, Ul-55.1, Ul-55, Ul-57.1, Ul-57, Ul-58, Ul-59, Ul-61.1, Ul-61, ó Ul-62, Ul-1, Ul-2, Ul-3, Ul-4, Ul-5, Ul-6, Ul-7, Ul-8, Ul-9, Ul-10, Ul-11, Ul-12, Ul-13, Ul-14, Ul-15, Ul-16, Ul-17, Ul-18, Ul-19, Ul-20, Ul-21, Ul-22, Ul-23, Ul-24, Ul-25, Ul-26, Ul-27, Ul-28, Ul-29, Ul-30, Ul-31, Ul-32, Ul-33, Ul-34, Ul-35, Ul-36, Ul-37, Ul-38, Ul-39, Ul-40, Ul-41, Ul-42, Ul-43, Ul-44, Ul-45, Ul-46, Ul-47, Ul-48, Ul-49, Ul-50, Ul-51, Ul-52, Ul-53, Ul-55.1, Ul-55, Ul-57.1, Ul-57, Ul-58, Ul-59, Ul-61.1, Ul-61, ó Ul-62, Ul-49, Ul-53 ó Ul-59, en combinación con T-DM1 (p.e., ya sea simultáneamente o separadamente), ó Ul-1, Ul-2, Ul-3, Ul-4, Ul-5, Ul-6, Ul-7, Ul-8, Ul-9, Ul-10, Ul-11, Ul-12, Ul-13, Ul-14, Ul-15, Ul-16, Ul-17, Ul-18, Ul-19, Ul-20, Ul-21, Ul-22, Ul-23, Ul-24, Ul-25, Ul-26, Ul-27, Ul-28, Ul-29, Ul-30, Ul-31, Ul-32, Ul-33, Ul-34, Ul-35, Ul-36, Ul-37, Ul-38, Ul-39, Ul-40, Ul-41, Ul-42, Ul-43, Ul-44, Ul-45, Ul-46, Ul-47, Ul-48, Ul-49, Ul-50, Ul-51, Ul-52, Ul-53, Ul-55.1, Ul-55, Ul-57.1, Ul-57, Ul-58, Ul-59, Ul-61.1, Ul-61, ó Ul-62, Ul-1, Ul-2, Ul-3, Ul-4, Ul-5, Ul-6, Ul-7, Ul-8, Ul-9, Ul-10, Ul-11, Ul-12, Ul-13, Ul-14, Ul-15, Ul-16, Ul-17, Ul-18, Ul-19, Ul-20, Ul-21, Ul-22, Ul- - - 23, Ul-24, Ul-25, Ul-26, Ul-27, Ul-28, Ul-29, Ul-30, Ul-31, Ul-32, Ul-33, Ul-34, Ul-35, Ul-36, Ul-37, Ul-38, Ul-39, Ul-40, Ul-41, Ul-42, Ul-43, Ul-44, Ul-45, Ul-46, Ul-47, Ul-48, Ul-49, Ul-50, Ul-51, Ul-52, Ul-53, ül-55.1, ül-55, Ul-57.1, Ul-57, Ul-58, Ul-59, Ul-61.1, Ul-61, ó Ul-62,Ul-49, Ul-53 ó Ul-59, Ul-53 o Ul de 59 En combinación con T-DM1 y otro agente (s) como docetaxel o paclitaxel para el tratamiento de enfermedades neoplásicas, tales como el cáncer, incluyendo cánceres como el cáncer gastrointestinal, cáncer de páncreas, cáncer de próstata, cáncer de ovario, cáncer de estómago, cáncer de endometrio , el cáncer de las glándulas salivales, cáncer de riñon, cáncer de colon, cáncer de tiroides, cáncer de vejiga, gliomas, melanoma, cáncer de pulmón como el cáncer de pulmón de células no pequeñas, cáncer colorrectal, y I o cáncer de mama como el cáncer de mama metastático. En algunas realizaciones preferidas, Ul-49, Ul-53 o Ul de 59 puede ser utilizado en el tratamiento de pacientes con cánceres como el cáncer de mama y el cáncer de mama metastático cuyos tumores expresan y sobre expresan la proteina HER-2 y que no hayan recibido quimioterapia para su (metastático) enfermedad, en combinación con T-DM1 y paclitaxel, o, en combinación con T-DM1 y docetaxel.
Pertuzumab (2C4) (comercializado o para ser comercializado como OMNITARG ™) es un anticuerpo monoclonal que inhibe la dimerización de HER2 con otros receptores HER. En algunas realizaciones, una composición para el tratamiento de la enfermedad asociada al HER -3 puede ser Ul-1, Ul-2, Ul-3, Ul-4, Ul-5, Ul-6, Ul-7, Ul-8, Ul-9, Ul-10, Ul-11, Ul-12, Ul-13, Ul-14, Ul-15, Ul-16, Ul-17, Ul-18, Ul-19, Ul-20, - - Ul-21, Ul-22, Ul-23, Ul-24, Ul-25, Ul-26, Ul-27, Ul-28, Ul-29, Ul-30, Ul-31, Ul-32, Ul-33, Ul-34, Ul-35, Ul-36, Ul-37, Ul-38, Ul-39, Ul-40, Ul-41, Ul-42, Ul-43, Ul-44, Ul-45, Ul-46, Ul-47, Ul-48, Ul-49, Ul-50, Ul-51, Ul-52, Ul-53, Ul-55.1, Ul-55, Ul-57.1, Ul-57, Ul-58, Ul-59, Ul-61.1, Ul-61, ó Ul-62, Ul-1, Ul-2, Ul-3, Ul-4, Ul-5, Ul-6, Ul-7, Ul-8, Ul-9, Ul-10, Ul-11, Ul-12, Ul-13, Ul-14, Ul-15, Ul-16, Ul-17, Ul-18, Ul-19, Ul-20, Ul-21, Ul-22, Ul-23, Ul-24, Ul-25, Ul-26, Ul-27, Ul-28, Ul-29, Ul-30, Ul-31, Ul-32, Ul-33, Ul-34, Ul-35, Ul-36, Ul-37, Ul-38, Ul-39, Ul-40, Ul-41, Ul-42, Ul-43, Ul-44, Ul-45, Ul-46, Ul-47, Ul-48, Ul-49, Ul-50, Ul-51, Ul-52, Ul-53, Ul-55.1, Ul-55, Ul-57.1, Ul-57, Ul-58, Ul-59, Ul-61.1, Ul-61, ó Ul-62,Ul-49, Ul-53 ó Ul-59, en combinación con pertuzumab, ó Ul-1, Ul-2, Ul-3, Ul-4, Ul-5, Ul-6, Ul-7, Ul-8, Ul-9, Ul-10, Ul-11, Ul-12, Ul-13, Ul-14, Ul-15, Ul-16, Ul-17, Ul-18, Ul-19, Ul-20, Ul-21, Ul-22, Ul-23, Ul-24, Ul-25, Ul-26, Ul-27, Ul-28, Ul-29, Ul-30, Ul-31, Ul-32, Ul-33, Ul-34, Ul-35, Ul-36, Ul-37, Ul-38, Ul-39, Ul-40, Ul-41, Ul-42, Ul-43, Ul-44, Ul-45, Ul-46, Ul-47, Ul-48, Ul-49, Ul-50, Ul-51, Ul-52, Ul-53, Ul-55.1, Ul-55, Ul-57.1, Ul-57, Ul-58, Ul-59, Ul-61.1, Ul-61, ó Ul-62, Ul-1, Ul-2, Ul-3, Ul-4, Ul-5, Ul-6, Ul-7, Ul-8, Ul-9, Ul-10, Ul-11, Ul-12, Ul-13, Ul-14, Ul-15, Ul-16, Ul-17, Ul-18, Ul-19, Ul-20, Ul-21, Ul-22, Ul-23, Ul-24, Ul-25, Ul-26, Ul-27, Ul-28, Ul-29, Ul-30, Ul-31, Ul-32, Ul-33, Ul-34, Ul-35, Ul-36, Ul-37, Ul-38, Ul-39, Ul-40, Ul-41, Ul-42, Ul-43, Ul-44, Ul-45, Ul-46, Ul-47, Ul-48, Ul-49, Ul-50, Ul-51, Ul-52, Ul-53, Ul-55.1, Ul-55, Ul-57.1, Ul-57, Ul-58, Ul-59, Ul-61.1, Ul-61, ó Ul-62, Ul-49, Ul-53 ó Ul-59, En combinación con pertuzumab y otro agente (s), para el tratamiento de enfermedades neoplásicas, como el cáncer, - - incluyendo, p. e., el cáncer de mama, cáncer gastrointestinal, cáncer de páncreas, cáncer de próstata, cáncer de ovario, cáncer de estómago, cáncer de endometrio, cáncer de glándula salival , cáncer de pulmón, cáncer renal, cáncer de colon, el cáncer colorrectal, cáncer de tiroides, cáncer de vejiga, gliomas, melanoma, cáncer de mama metastático, el cáncer de pulmón de células no pequeñas, el carcinoma epidermoide, el fibrosarcoma, el melanoma, el carcinoma nasofaríngeo, y el carcinoma de células escamosas.
El cetuximab (comercializado como Erbitux ®) es un (ratón / humano) anticuerpo monoclonal quimérico que se une e inhibe la EGF-R. En algunas realizaciones, una composición para el tratamiento de la enfermedad asociada al HER3 puede ser Ul-1, Ul-2, Ul-3, Ul-4, Ul-5, Ul-6, Ul-7, Ul-8, Ul-9, Ul-10, Ul-11, Ul-12, Ul-13, Ul-14, Ul-15, Ul-16, Ul-17, Ul-18, Ul-19, Ul-20, Ul-21, Ul-22, Ul-23, Ul-24, Ul-25, Ul-26, Ul-27, Ul-28, Ul-29, Ul-30, Ul-31, Ul-32, Ul-33, Ul-34, Ul-35, Ul-36, Ul-37, Ul-38, Ul-39, Ul-40, Ul-41, Ul-42, Ul-43, Ul-44, Ul-45, Ul-46, Ul-47, Ul-48, Ul-49, Ul-50, Ul-51, Ul-52, Ul-53, Ul-55.1, Ul-55, Ul-57.1, Ul-57, Ul-58, Ul-59, Ul-61.1, Ul-61, ó Ul-62, Ul-1, Ul-2, Ul-3, Ul-4, Ul-5, Ul-6, Ul-7, Ul-8, Ul-9, Ul-10, Ul-11, Ul-12, Ul-13, Ul-14, Ul-15, Ul-16, Ul-17, Ul-18, Ul-19, Ul-20, Ul-21, Ul-22, Ul-23, Ul-24, Ul-25, Ul-26, Ul-27, Ul-28, Ul-29, Ul-30, Ul-31, Ul-32, Ul-33, Ul-34, Ul-35, Ul-36, Ul-37, Ul-38, Ul-39, Ul-40, Ul-41, Ul-42, Ul-43, Ul-44, Ul-45, Ul-46, Ul-47, Ul-48, Ul-49, Ul-50, Ul-51, Ul-52, Ul-53, Ul-55.1, Ul-55, Ul-57.1, Ul-57, Ul-58, Ul-59, Ul-61.1, Ul-61, ó Ul-62, Ul-49, Ul-53 ó Ul-59, en combinación con cetuximab, ó Ul-1, Ul-2, Ul-3, Ul-4, Ul-5, Ul-6, Ul-7, Ul-8, Ul-9, Ul-10, Ul-11, Ul-12, Ul-13, Ul-14, Ul-15, Ul-16, Ul-17, Ul-18, Ul-19, Ul-20, Ul-21, Ul-22, Ul-23, ül-24, Ul-25, Ul-26, Ul-27, Ul-28, Ul-29, Ul-30, Ul-31, Ul-32, Ul-33, Ul-34, Ul-35, Ul-36, Ul-37, Ul-38, Ul-39, Ul-40, Ul-41, Ul-42, Ul-43, Ul-44, Ul-45, Ul-46, Ul-47, Ul-48, Ul-49, Ul-50, Ul-51, Ul-52, Ul-53, Ul-55.1, Ul-55, Ul-57.1, Ul-57, Ul-58, Ul-59, Ul-61.1, Ul-61, ó Ul-62, Ul-1, Ul-2, Ul-3, Ul-4, Ul-5, Ul-6, Ul-7, Ul-8, Ul-9, Ul-10, Ul-11, Ul-12, Ul-13, Ul-14, Ul-15, Ul-16, Ul-17, Ul-18, Ul-19, Ul-20, Ul-21, Ul-22, Ul-23, Ul-24, Ul-25, Ul-26, Ul-27, Ul-28, Ul-29, Ul-30, Ul-31, Ul-32, Ul-33, Ul-34, Ul-35, Ul-36, Ul-37, Ul-38, Ul-39, Ul-40, Ul-41, Ul-42, Ul-43, Ul-44, Ul-45, Ul-46, Ul-47, Ul-48, Ul-49, Ul-50, Ul-51, Ul-52, Ul-53, Ul-55.1, Ul-55, Ul-57.1, Ul-57, Ul-58, Ul-59, Ul-61.1, Ul-61, ó Ul-62,Ul-49, Ul-53 ó Ul-59, en combinación con cetuximab para el tratamiento de enfermedades neoplásicas, tales como el cáncer, incluyendo, p. e., el cáncer de mama, cáncer gastrointestinal, cáncer de páncreas, cáncer de próstata, cáncer de ovario, cáncer de estómago, cáncer de endometrio, cáncer de glándula salival, cáncer de pulmón, cáncer renal, de colon el cáncer, el cáncer colorrectal, cáncer de tiroides, cáncer de vejiga, gliomas, melanoma, cáncer de mama metastático, el cáncer de pulmón de células no pequeñas, el carcinoma epidermoide, el fibrosarcoma, el melanoma, el carcinoma nasofaríngeo, y el carcinoma de células escamosas. En algunas realizaciones preferidas, Ul-49, Ul-53 o Ul-59 puede ser utilizado en el tratamiento de pacientes con cáncer como el cáncer colorrectal y el cáncer colorrectal metastático, después de fallar con la quimioterapia basada en fluorouracilo-5, en combinación con cetuximab e irinotecán.
- - Gefitinib (comercializado como IRESSA ®) es un fármaco que actúa de manera similar a la de Erlotinib. Gefitinib inhibe de manera selectiva dominio de tirosina quinasaEGF-R. En algunas realizaciones, una composición para el tratamiento de la enfermedad asociada al HER3 puede ser Ul-1, Ul-2, Ul-3, Ul-4, Ul-5, Ul-6, Ul-7, Ul-8, Ul-9, Ul-10, Ul-11, Ul-12, Ul-13, Ul-14, Ul-15, Ul-16, Ul-17, Ul-18, Ul-19, Ul-20, Ul-21, Ul-22, ül-23, Ul-24, Ul-25, Ul-26, Ul-27, Ul-28, Ul-29, Ul-30, Ul-31, Ul-32, Ul-33, Ul-34, Ul-35, Ul-36, Ul-37, Ul-38, Ul-39, Ul-40, Ul-41, Ul-42, Ul-43, Ul-44, ül-45, Ul-46, Ul-47, Ul-48, Ul-49, Ul-50, Ul-51, Ul-52, Ul-53, Ul-55.1, Ul-55, Ul-57.1, Ul-57, Ul-58, Ul-59, Ul-61.1, Ul-61, ó Ul-62, Ul-1, Ul-2, Ul-3, Ul-4, Ul-5, Ul-6, Ul-7, Ul-8, Ul-9, Ul-10, Ul-11, Ul-12, Ul-13, Ul-14, Ul-15, Ul-16, Ul-17, Ul-18, Ul-19, Ul-20, Ul-21, Ul-22, Ul-23, Ul-24, Ul-25, Ul-26, Ul-27, Ul-28, Ul-29, Ul-30, Ul-31, Ul-32, Ul-33, Ul-34, Ul-35, Ul-36, Ul-37, Ul-38, Ul-39, Ul-40, Ul-41, Ul-42, Ul-43, Ul-44, Ul-45, Ul-46, Ul-47, Ul-48, Ul-49, Ul-50, Ul-51, Ul-52, Ul-53, Ul-55.1, Ul-55, Ul-57.1, Ul-57, Ul-58, Ul-59, Ul-61.1, Ul-61, ó Ul-62, Ul-49, Ul-53 ó Ul-59, en combinación con Gefitinib, ó Ul-1, Ul-2, Ul-3, Ul-4, Ul-5, Ul-6, Ul-7, Ul-8, Ul-9, Ul-10, Ul-11, Ul-12, Ul-13, Ul-14, Ul-15, Ul-16, Ul-17, Ul-18, Ul-19, Ul-20, Ul-21, Ul-22, Ul-23, Ul-24, Ul-25, Ul-26, Ul-27, Ul-28, Ul-29, Ul-30, Ul-31, Ul-32, Ul-33, Ul-34, Ul-35, Ul-36, Ul-37, Ul-38, Ul-39, Ul-40, Ul-41, Ul-42, Ul-43, Ul-44, Ul-45, Ul-46, Ul-47, Ul-48, Ul-49, Ul-50, Ul-51, Ul-52, Ul-53, Ul-55.1, Ul-55, Ul-57.1, Ul-57, Ul-58, Ul-59, Ul-61.1, Ul-61, ó Ul-62, Ul-1, Ul-2, Ul-3, Ul-4, Ul-5, Ul-6, Ul-7, Ul-8, Ul-9, Ul-10, Ul-11, Ul-12, Ul-13, Ul-14, Ul-15, Ul-16, Ul-17, Ul-18, Ul-19, Ul-20, Ul-21, Ul-22, Ul-23, Ul-24, Ul-25, - - Ul-26, Ul-27, Ul-28, Ul-29, Ul-30, Ul-31, Ul-32, Ul-33, Ul-34, Ul-35, Ul-36, Ul-37, Ul-38, Ul-39, Ul-40, Ul-41, Ul-42, Ul-43, Ul-44, Ul-45, Ul-46, Ul-47, Ul-48, Ul-49, Ul-50, Ul-51, Ul-52, Ul-53, Ul-55.1, Ul-55, Ul-57.1, Ul-57, Ul-58, Ul-59, Ul-61.1, Ul-61, ó Ul-62,Ul-49, Ul-53 ó Ul-59, en combinación con Gefitinib y otro agente (s), para el tratamiento de las enfermedades neoplásicas, tales como el cáncer, incluyendo, p. e., el cáncer de mama, cáncer gastrointestinal, cáncer de páncreas, cáncer de próstata, cáncer de ovario, cáncer de estómago, cáncer de endometrio, cáncer de glándulas salivales, pulmón cáncer, cáncer renal, cáncer de colon, el cáncer colorrectal, cáncer de tiroides, cáncer de vejiga, gliomas, melanoma, cáncer de mama metastático, el cáncer de pulmón de células no pequeñas, el carcinoma epidermoide, el fibrosarcoma, el melanoma, el carcinoma nasofaríngeo, y el carcinoma de células escamosas.
El Neratinib es un inhibidor del receptor tirosina quinasadel HER-2. El Neratinib se une irreversiblemente al receptor tirosina quinasadel HER-2 y por lo tanto reduce la autofosforilación en las células, al parecer dirigiéndose a un residuo de cisteína en el bolsillo ATP de unión del receptor. El tratamiento de células con neratinib resulta en la inhibición de eventos de señales de transducción bajo corrientes y de sendas reguladoras del ciclo celular, la detención en la fase de transición Gl-S del ciclo celular y, finalmente, la disminución de la proliferación celular. Además, neratinib inhibe la quinasadel EGF-R y la proliferación de las células del EGF-R-dependiente . En algunas representaciones, un método para el tratamiento de la - - enfermedad asociada a HER3 puede incluir la administración de Ul-1, Ul-2, Ul-3, Ul-4, Ul-5, Ul-6, Ul-7, Ul-8, Ul-9, Ul-10, Ul-11, Ul-12, Ul-13, Ul-14, Ul-15, Ul-16, Ul-17, Ul-18, Ul-19, Ul-20, Ul-21, Ul-22, Ul-23, Ul-24, Ul-25, Ul-26, Ul-27, Ul-28, Ul-29, Ul-30, Ul-31, Ul-32, Ul-33, Ul-34, Ul-35, Ul-36, Ul-37, Ul-38, Ul-39, Ul-40, Ul-41, Ul-42, Ul-43, Ul-44, Ul-45, Ul-46, Ul-47, Ul-48, ül-49, Ul-50, Ul-51, Ul-52, Ul-53, Ul-55.1, Ul-55, Ul-57.1, Ul-57, Ul-58, Ul-59, Ul-61.1, Ul-61, ó Ul-62, Ul-1, Ul-2, Ul-3, Ul-4, Ul-5, Ul-6, Ul-7, Ul-8, Ul-9, Ul-10, Ul-11, Ul-12, Ul-13, Ul-14, Ul-15, Ul-16, Ul-17, Ul-18, Ul-19, Ul-20, Ul-21, Ul-22, Ul-23, Ul-24, Ul-25, Ul-26, Ul-27, Ul-28, Ul-29, Ul-30, Ul-31, Ul-32, Ul-33, Ul-34, Ul-35, Ul-36, Ul-37, Ul-38, Ul-39, Ul-40, Ul-41, Ul-42, Ul-43, Ul-44, Ul-45, Ul-46, Ul-47, Ul-48, Ul-49, Ul-50, Ul-51, Ul-52, Ul-53, Ul-55.1, Ul-55, Ul-57.1, Ul-57, Ul-58, Ul-59, Ul-61.1, Ul-61, ó Ul-62, Ul-49, Ul-53 ó Ul-59, en combinación con neratinib (p. e., simultáneamente o separadamente), ó Ul-1, Ul-2, Ul-3, Ul-4, Ul-5, Ul-6, Ul-7, Ul-8, Ul-9, Ul-10, Ul-11, Ul-12, Ul-13, Ul-14, Ul-15, Ul-16, Ul-17, Ul-18, Ul-19, Ul-20, Ul-21, Ul-22, Ul-23, Ul-24, Ul-25, Ul-26, Ul-27, Ul-28, Ul-29, Ul-30, Ul-31, Ul-32, Ul-33, Ul-34, Ul-35, Ul-36, Ul-37, Ul-38, Ul-39, Ul-40, Ul-41, Ul-42, Ul-43, Ul-44, Ul-45, Ul-46, Ul-47, Ul-48, Ul-49, Ul-50, Ul-51, Ul-52, Ul-53, Ul-55.1, Ul-55, Ul-57.1, Ul-57, Ul-58, Ul-59, Ul-61.1, Ul-61, ó Ul-62, Ul-1, Ul-2, Ul-3, Ul-4, Ul-5, Ul-6, Ul-7, Ul-8, Ul-9, Ul-10, Ul-11, Ul-12, Ul-13, Ul-14, Ul-15, Ul-16, Ul-17, Ul-18, Ul-19, Ul-20, Ul-21, Ul-22, Ul-23, Ul-24, Ul-25, Ul-26, Ul-27, Ul-28, Ul-29, Ul-30, Ul-31, Ul-32, Ul-33, Ul-34, Ul-35, Ul-36, Ul-37, Ul-38, Ul-39, Ul-40, Ul-41, Ul-42, Ul-43, Ul-44, Ul-45, Ul-46, Ul-47, Ul-48, - - Ul-49, Ul-50, Ul-51, Ul-52, Ul-53, Ul-55.1, Ul-55, Ul-57.1, Ul-57, Ul-58, Ul-59, Ul-61.1, Ul-61, ó Ul-62,Ul-49, Ul-53 ó Ul-59, En combinación con neratinib y otro agente (s) , para el tratamiento de las enfermedades neoplásicas, tales como el cáncer, incluyendo, p. e., el cáncer gastrointestinal, cáncer de páncreas, cáncer de próstata, cáncer de ovario, cáncer de estómago, cáncer de endometrio, cáncer de glándula salival, cáncer de riñon, cáncer de colon, cáncer de tiroides, cáncer de vejiga, gliomas, melanoma, cáncer de pulmón como el cáncer de pulmón de células no pequeñas, cáncer colorrectal y / o cáncer de mama incluyendo el cáncer de mama metastático. 4. Agentes adicionales para ser usados en las composiciones y métodos revelados en este documento. agentes adicionales pueden ser agregados a el primer y segundo agente de unión para el HER-3, y de unión para y / o la inhibición de otro miembro de la familia HER, respectivamente, como se describe en este documento. Estos, en algunas realizaciones, serian fármacos quimioterapéuticos . Los agentes adicionales para ser utilizados en las composiciones y los métodos revelados en este documento pueden ser utilizados como el segundo agente (s) en lugar de que la aglutinación para y / o la inhibición de otro miembro de la familia HER en la presente invención. En otras palabras, el primer agente vinculante para HER3 puede ser utilizado en ciertos tratamientos con algunos de los agentes adicionales descritos en lo sucesivo, sin / en lugar del segundo agente vinculante para y / o inhibir otro familia HER.
- - Por ejemplo, los agentes que actúan como estimulantes microtúbulos son NK-105 (paclitaxel) [(-)- (1S, 2R, 3S, 4S, 5R, 7S, 8S, 10R, 13S) -4 , 10-diacetoxy-2-benzoyloxy-5, 20-epoxy-l, 7-dihydroxy-9-oxotax-ll-en-13-yl (2R, 3S) -3-benzoylamino-2-hydroxy-3-phenylpropionate] (NanoCarrier, Chiba, Japón), milataxel (1, 10^-dihydroxy-9-oxo-5 , 20-epoxy-3zeta-tax-ll-ene-2a, 4 , 7ßl3a-tetrayl 4-acetate 2-benzoate 13-[ (2R, 3R) -3- ( tert-butoxycarbonylamino) -3- (furan-2-yl) -2-hydroxypropanoate] 7-propanoate) (Taxolog, Fairfield, NJ) , laulimalide (Kosan Biosciences, Hayward, CA (B-M Squibb)), sarcodictyin A (3- ( l-methylimidazol-4-yl ) -2 (E) -acido propenoico (IR, aR, 6S, 7S, 10R, 12aR) -ll-methoxycarbonyl-7 , 10-epoxy-10-hydroxy-l-isopropyl-4 , 7-dimethyl- 1,2, 4a, 5,6,7,10, 12a-octahydrobenzocyclododecen-6-yl ester) (Pfizer, New York, NY) , simotaxel ( (2aR, 4S, 4aS, 6R, 9S, US, 12S, 12aR, 12bS) -4 , 11-dihydroxy-4a, 8 , 13, 13-tetramethyl-5-oxo- 2a, 3, 4, 4a, 5, 6, 9, 10, 11, 12, 12a, 12b-dodecahydro-7 , 11-methano-lH-cyclodeca [3, 4] benz [1, 2-b] oxete-6, 9, 12, 12b-tetrayl 12b-acetate 12-benzoate 6-cyclopentanecarboxylate 9- [ (2R, 3R) -2-hydroxy-3-[ [ ( 1-methylethoxy) carbonyl] amino] -3- (thiophen-2-yDpropanoate] ) (Taxolog, Fairfield, NJ) , SYN-2001 (CLL Pharma, Nice, France) , TL-310 (Taxolog, Fairfield, NJ) , TL1836 (Taxolog, Fairfield, NJ) , tesetaxel (21-[ (dimethylamino) metil] -l-hydroxy-5 , 20-epoxy-9o¡, 10a-dihydro [1, 3] dioxolo [4 ' , 5 ' : 9, 10] tax-ll-ene-2a, 4, 13a-triyl4-acetate 2-benzoate 13- [ (2R, 3S) -3- [ (tert-butoxycarbonyl) amino] -3- (3-fluoropyridin-2-yl) -2-hydroxypropanoate) (Daiichi Sankyo, Tokio, Japón), TL-1892 (Taxolog, Fairfield, NJ) , TPI-287 ( (21 R, 3 ' S) -2 ' -hydroxy-N- - - carboxy-3 ' -amino-51 -methyl-hexanoic, N-tert-butil ester, 13 ester 5ß-20-epoxy-l , 2a, 4, 7(3, 9a, 10a, 13a-heptahydroxy-4 , 10-diacetate-2-benzoate-7 , 9-acrolein acetal-tax-ll-ene (Tapestry Pharmaceuticals, Boulder, CO) , ortataxel (2aR-[2aa, 4ß, 4a , 6ß, 9 (2R, 3S) , 10ß, 11ß, 12a, 12aa, 12ba] -3- (tert-butoxycarbonylamino) -2-hydroxy-5-methyl-hexanoic acido 6,12b-diacetoxy-12-benzoyloxy-10, 11- carbonyldioxy-4-hydroxy-4a, 8 , 13, 13-tetramethyl-5-oxo- 2a, 3, 4, 4a, 5, 6, 9, 10, 11, 12, 12a, 12b-dodecahydro-lH-7, 11-methanocyclodeca [3, 4 ] benz [ 1, 2-b] oxet-9-yl ester) (Indena, Milán, Italia) , paclitaxel poliglumex (L-pyroglutamylpoly-L-glutamil-L-glutamico acido partially ?-esterificado con (IR, 2S) -2- (benzoil amino)-l-[ [ [ (2aR, 4S, 4aS, 6R, 9S, US, 12S, 12aR, 12bS) -6, 12b-bis (acetyloxy) -12- (benzoyloxy) -4 , ll-dihydroxy-4a, 8,13, 13-tetramethyl-5-oxo-2a, 3, 4, a, 5, 6, 9,10, 11, 12, 12a, 12b-dodecahydro-7 , 11-methano-lH-cyclodeca [3,4] benzo [ 1, 2-b] oxet-9-yl] oxy] carbonyl] -2-phenylethyl) (Cell Therapeutics , Seattle, A) , paclitaxel proteina-bound particles (paclitaxel : (-)-(1S, 2R, 3S, S, 5R, 7S, 8S, 10R, 13S) -4, 10-diacetoxy-2-benzoyloxy-5, 20-epoxy-l, 7-dihydroxy-9-oxotax-ll-en-13-yl (2R, 3S) -3-benzoylamino-2-hydroxy-3-phenylpropionate) (Abraxis BioScience, Los Angeles, CA) , paclitaxel (NCI ) ( (-)-(1S,2R, 3S, 4S, 5R, 7S, 8S, 10R, 13S) -4 , 10-diacetoxy-2-benzoyloxy-5, 20-epoxy-l, 7-dihydroxy-9-oxotax-ll-en-13-yl (2R,3S)-3-benzoylamino-2-hydroxy-3-phenylpropionate) (NCI (NIH) ) , paclitaxel (NeoPharm, Lake Bluff, IL) ( (-)- (1S, 2R, 3S, 4S, 5R, 7S, 8S, 10R, 13S) -4 , 10-diacetoxy-2-benzoyloxy-5, 20-epoxy-l,7-dihydroxy-9-oxotax-ll-en-13-yl (2R, 3S) -3-benzoylamino-2-hydroxy-3-phenylpropionate) (NeoPharm, Lake - - Bluff, IL), patupilone ( (1S, 3S, 7S, 10R, 11S, 12S, 16R) -7, 11-dihydroxy-8, 8, 10, 12, 16-pentamethyl-3- [ (1E) -1- (2-methyl-l, 3-thiazol-4-yl)prop-l-en-2-yl] -4, 17-dioxabicyclo [1 .1.0] heptadecane-5, 9-dione) (U.S. Publication No. 2003/0104625, Novartis, Basel, Suiza), PEG-paclitaxel (Enzo Pharmaceuticals, Long Island, NY) , docetaxel hydrate((-) - (1S,2S, 3R, 4S, 5R, 7S, 8S, 10R, 13S ) -4-acetoxy-2-benzoyloxy-5 , 20-epoxy-1, 7, 10-trihydroxy-9-oxotax-ll-ene-13-yl (2R, 3S) -3-tert-butoxycarbonylamino-2-hydroxy-3-phenylpropionate trihydrate) (Sanofi-Aventis, Bridgewater, NJ) , eleutherobin (3-(l-methylimidazol-4-yl) -2 (E) -acido propenoico (1R, aR, 6S, 7S, 10R, 12aR) -11- (2-0-acetyl-p-D-arabinopyranosyloxymethyl) -7, 10-epoxy-l-isopropyl-10-methoxy-4, 7-dimethyl-l, 2, 4a, 5, 6, 7, 10, 12a-octahydrobenzocyclododecen-6-yl ester) (Bristol-Myers Squibb, New York, Y) , IDN-5390 (Indena, Milán, Italia), ixabepilone ( (1S, 3S,7S, 10R, US, 12S, 16R) -7 , ll-dihydroxy-8 , 8 , 10 , 12 , 16-pentamethyl-3- [ ( 1E) -l-methyl-2- (2-methylthiazol-4-yl) ethenyl] -17-oxa-4-azabicyclo [14.1.0] heptadecane-5, 9-dione) (Bristol-Myers Squibb, Nueva York, NY) , KOS-1584 (Kosan Biosciences, Hayward, CA (B-M Squibb)), KOS-1803 (17-iso-oxazole 26-trifluoro-9, 10-dehydro-12, 13-desoxy-epothilone B) (Kosan Biosciences, Hayward, CA (B-M Squibb) ) , KOS-862 (Kosan Biosciences, Hayward, CA (B-M Squibb); U.S. Patente Nos. 6204388 y 6303342), larotaxel ( l-hydroxy-9-oxo-5(3, 20-epoxy-7ß, 19-cyclotax-ll-ene-2a, 4, 10ß, 13a-tetrayl 4 , 10-diacetate 2-benzoate 13- [ (2R, 3S) -3- [ (tert-butoxycarbonyl) amino] -2-hydroxy-3-phenylpropanoate] dehydrate) (Sanofi-Aventis, Bridgewater, NJ, PCT Publicación Nos. WO 95/26961 and WO 96/1259), ANG-1005 (Angiopep-2/paclitaxel conjugado) - - (AngioChem, Montreal, Canadá, U.S. Patente No. 7557182), BMS-184476 (Bristol-Myers Squibb, New York, NY, EP Publicación No. 639577), BMS-188797 (Bristol-Myers Squibb, New York, NY) , BMS-275183 (3 ' -tert-butyl-3 ' -N-tert-butyloxycarbonyl-4-deacetyl-31 -dephenyl-3 ' -N-debenzoyl-4-0-methyoxycarbonyl-paclitaxel) (Bristol-Myers Squibb, Nueva York, NY) , BMS-310705 (Bristol-Myers Squibb, New York, NY) , BMS-753493 (Bristol-Myers Squibb, Nueva York, NY) , cabazitaxel (1-hydroxy-7 , 10ß-dimethoxy-9-oxo-5ß, 20-epoxytax-ll-ene-2a, 4, 13a-triyl 4-acetate 2-benzoate 13- [ (2R, 3S) -3-[ [ ( tertbutoxy) carbonyl] amino] -2-hydroxy-3-phenylpropanoate] ) (Sanofi-Aventis, Bridgewater, NJ) , DHA-paclitaxel (Protarga, King of Prusia, PA, TAXOPREXIN®) , disermolide ([3S-[ [3a^^,6a(2R*,3Z,5R*,6R*,7S*,8Z,llR*,12S*,13S*,14S*,15R*,l 6E) ] ] -6- [1 [ (aminocarbonyl) oxy] -2, 6, 12-trihydroxy-5, 7, 9, 11, 13, 15-hexamethyl-3, 8, 16, 18-nonadecatetraenyl] tetrahydro-4-hydroxy-3, 5-dimethyl-2H-pyran-2-one) (Novartis, Basel, Suiza, U.S. Patente Nos. 4939168 y 5681847) . Algunos de estos estimulantes microtúbulos tienen un anillo de taxano en sus estructuras químicas, los compuestos que tienen un anillo de taxano se conocen como "taxanos" en este documento.
Las Antraciclinas incluyen actinomycins como actinomicina D (dactinomicina: ?-2-amino, [N'-bis (6S, 9R, IOS, 13R, 18aS) - 6, 13-diisopropil-2, 5, 9-trimetil-l, 4 ,7,11,14-pentaoxohexadecahydro-lH-pirrolo [2,1-c] [1,4,7,10,13]] oxatetraazacyclohexadecin-10-il - 4 , 6-dimetil-3-oxo-3H-phenoxazine - 1, 9-dicarboxamide) , bleomicina (clorhidrato de bleomicina: (3 - {[(2'-{(5S, 8S, 9S, 10R, 13S) -15 - {6- - - amino-2- [ ( 1S) -3 -amino-1- { [ (2S) -2, 3-diamino-3-oxopropyl] amino} -3-oxopropyl] -5-methylpyrimidin-4-il } -13 -[{[( 2R, 3S, 4S, 5S, 6S) -3 - { [ (2R, 3S, 4S, 5R, 6R) -4 - ( carbamoyloxy) -3, 5-dihidroxi-6- (hidroximetil) tetrahidro-2H-pirano-2-il] oxi} -4 , 5-dihidroxi-6- (hidroximetil) oxi] tetrahidro-2H-pirano-2-il} (lH-imidazol-5-il) metil] -9-hidroxi-5- [ ( IR) -1-hidroxietil ] -8 , 10-dimetil-4 , 7,12,15 - tetraoxo-3-, 6, 11, 14 tetraazapentadec-l-il } -2,4 '-bi-l, 3 - tiazol-4-il) carbonil] amino} propil) (dimetil) sulfonio) , clorhidrato de daunorrubicina (daunorrubicina : 8S-cis) -8-acetil-10- (3 (-amino-2 , 3 , 6-trideoxy-alfa-L-lyxo-hexopyranosyl ) Oxy) 7, 8, 9, 10-tetrahidro-6 , 8 , ll-trihidroxi-l-metoxi-5 ,12-naphthacenedione clorhidrato) , clorhidrato de doxorrubicina (doxorrubicina : (8S, 10S) -10 - [ (3 - amino-2 , 3, 6-trideoxy-a-L-lyxo-hexopyranosyl) ] oxi-8-glycoloyl-7 , 8,9,10 tetrahidro-6 , 8 , ll-trihidroxi-l-metoxi-5 , 12-naphthacenedione clorhidrato) (Alza, ountain View, CA) , clorhidrato de idarubicina ( (7S, 9S) -9-acetil-7, 8,9,10 -tetrahidro-6-,7,9,11 tetrahidroxi-7-?- (2, 3, 6-trideoxy-3-amino-a-L-lyxo-hexopyranosyl) clorhidrato -5, 12-naphthacenedione) (Pfizer, Nueva York, Y, EE.UU. Patente No. 4046878 y 4471052), y mitomicina ((las, 8S, 8AR, 8BR) -6-amino-4, 7 - dioxo-1, 1 bis, 2,8,8 a, 8b-hexahidro- 8a-metoxi-5-methylazirino [2,3:3,4] pirrólo [1,2-a] indol-8-ylmethylcarbamate) (Kyowa Hakko—Kirin, Tokio, Japón) .
El Cisplatino y la gemcitabina son agentes quimioterapéuticos . El Cisplatino o diamminedichloroplatinum cis-(II) es un medicamento a base de platino se usa para tratar varios tipos de cánceres. El complejo de platino - - cisplatino reacciona in vivo, aglutinando a y produciendo entrecruzamiento de ADN, lo que finalmente desencadena la apoptosis. La gemcitabina es un análogo de nucleósidos en los que los átomos de hidrógeno de los carbonos 2 'de desoxicitidina son reemplazados por átomos de flúor. Al igual que fluorouracilo y otros análogos de pirimidina, de gemcitabina sustituyen la citidina durante la replicación del ADN, lo cual detiene el crecimiento del tumor ya que mas nucleósidos no se pueden unir al nucleósidos defectuoso, dando como resultado la apoptosis. La gemcitabina se comercializa como Gemzar ® por Eli Lilly y Compañía (Indianápolis, IN) . En algunas realizaciones, una combinación para el tratamiento de la enfermedad asociada a HER3 pueden ser: Ul-49, Ul-53 o Ul-59 en combinación con un segundo agente como se describe en este documento y la gemcitabina o cisplatino u otro agente (s), para el tratamiento de cáncer como es el cáncer gastrointestinal, cáncer de páncreas, cáncer de próstata, cáncer de ovario, cáncer de estómago, cáncer de endometrio, cáncer de glándula salival, cáncer de riñon, cáncer de colon, cáncer de tiroides, cáncer de vejiga, gliomas, melanoma, cáncer de pulmón como el cáncer de pulmón de células no pequeñas , el cáncer colorrectal y / o cáncer de mama incluyendo el cáncer de mama metastático.
La Capecitabina (pentilo [1 - ( 3, 4-dihidroxi-5-metil-tetrahidrofurano-2-il) -5-fluoro-2-oxo-lH-pirimidin-4-il] aminomethanoate, Xeloda, de Roche) es un agente quimioterapéutico que se administra por vía oral. La capecitabina es un Profármaco que se convierte enzimáticamente a 5-fluorouracilo en el tumor, donde inhibe - - la síntesis de ADN y retrasa el crecimiento del tejido tumoral. En algunas realizaciones, una combinación para el tratamiento de la enfermedad asociada al HER3 pueden ser: Ul-49, Ul-53 o Ul-59 en combinación con un segundo agente como se describe en este documento (p. e., Lapatinib) y capecitabina para el tratamiento del cáncer, en donde el cáncer es, cáncer gastrointestinal, cáncer de páncreas, cáncer de próstata, cáncer de ovario, cáncer de estómago, cáncer de endometrio, cáncer de glándula salival, cáncer de riñon, cáncer de colon, cáncer de tiroides, cáncer de vejiga, gliomas, melanoma, cáncer de pulmón como el cáncer de pulmón de células no pequeñas, cáncer colorrectal y / o cáncer de mama incluyendo el cáncer de mama metastático. En algunos casos, tal combinación puede ser administrada después de fracasar con un tratamiento previo con una antraciclina o taxanos, por ejemplo. En algunas realizaciones preferidas, Ul-49, Ul-53 o Ul de 59 puede ser utilizado en el tratamiento de pacientes con cánceres como el cáncer de mama y el cáncer de mama metastático cuyos tumores sobre-expresan o expresa la proteina HER-2 y que han recibido quimioterapia previa como una antraciclina (p. e., doxorrubicina o agente relacionado), y / o un taxano (p. e., el paclitaxel o docetaxel) , y trastuzumab, en combinación con lapatinib y capecitabina.
El Docetaxel ( (2R, 3S) -N-carboxi-3-phenylisoserine, ester de N-terc-butilo, de 13 ester con 5, 20-epoxi-l, 2, 4, 7, 10, 13 hexahydroxytax-ll-en -9-4-un acetato de 2-benzoato, trihidrato) y paclitaxel ((2a, 4a, 5ß, 7ß, 10ß, 13a) -4,10-bis (acetilsalicílico) -13 - { [ (2R, 3S) -3 - oxi] (benzoylamino) -2-hidroxi-3-phenylpropanoyl } -1, 7-dihidroxi-9-???-5 , 20-epoxytax-ll-en-2-il ser) son agentes quimioterapéuticos . El docetaxel se comercializa como Taxotere por Sanofi Aventis. Paclitaxel es comercializado como Taxol por Bristol-Myers Squibb. En la formulación de paclitaxel, paclitaxel se disuelve en Cremophor EL y etanol, como un agente de administración. Una formulación en la que el paclitaxel se une a la albúmina se comercializa como Abraxane. En algunas realizaciones, una combinación para el tratamiento de las enfermedades asociadas al HER3 pueden ser: Ul-49, Ul-53 o Ul-59 en combinación con un segundo agente como se describe en este documento (p.e., el trastuzumab) y el docetaxel o paclitaxel y otros agentes (s ) como el trastuzumab, para el tratamiento del cáncer, en donde el cáncer es, el cáncer gastrointestinal, cáncer de páncreas, cáncer de próstata, cáncer de ovario, cáncer de estómago, cáncer de endometrio, cáncer de glándula salival, cáncer de riñon, cáncer de colon, cáncer de tiroides, cáncer de vejiga, glioma, melanoma, cáncer de pulmón como el cáncer de pulmón de células no pequeñas, cáncer colorrectal y / o cáncer de mama como el cáncer de mama metastático. En algunas realizaciones preferidas, Ul-49, Ul-53 o el 59-U1 se puede utilizar en el tratamiento de pacientes con cánceres como el cáncer de mama y el cáncer de mama metastático cuyos tumores sobre-expresan o expresa la proteina HER-2 y que no hayan recibido quimioterapia para su (metastático) enfermedad, en combinación con trastuzumab y paclitaxel, en combinación con T-DMl y paclitaxel, en combinación con trastuzumab y docetaxel, o, en combinación con T-DMl y docetaxel.
- - La inyección de clorhidrato de doxorrubicina liposomal se comercializa como Doxil, que es una formulación liposomal constituida por cloruro doxorrubicina. En algunas realizaciones, un tratamiento combinado para las enfermedades asociadas al HER-3 pueden incluir la administración de Ul-49, Ul-53 o Ul de 59 en combinación con un segundo agente como se describe en este documento y la inyección de clorhidrato de doxorrubicina liposomal, con o sin uno o varios de los demás agentes como paclitaxel o agentes quimioterapéuticos basados en el platino, para el tratamiento de cáncer, como el cáncer de mama, cáncer gastrointestinal, cáncer de páncreas, cáncer de próstata, cáncer de ovario, cáncer de estómago, cáncer de endometrio, cáncer de glándula salival, cáncer de pulmón, cáncer renal, cáncer de colon , el cáncer colorrectal, cáncer de tiroides, cáncer de vejiga, gliomas, melanoma, cáncer de mama metastático, el cáncer de pulmón de células no pequeñas, el carcinoma epidermoide, el fibrosarcoma, el melanoma, el carcinoma nasofaríngeo, y el carcinoma de células escamosas. En algunas realizaciones preferidas, Ul-49, Ul-53 o el 59-U1 se puede utilizar en el tratamiento de algunos pacientes con cánceres como el cáncer de ovario, cuya enfermedad ha progresado o recidivado después de la quimioterapia basada en platino, en combinación con la inyección liposomal con cloruro de doxorrubicina, (Doxil) .
Hidrato de clorhidrato de irinotecán (irinotecán: (+)-( 4S) -4, ll-dietil-4-hidroxi-9- [ (4-piperidinopiperidino) carbonyloxy] -lH-pirano [3 ', 4': 6,7] indolizino [1-2-b] quinolina-3, 14 (4H, 12H)-diona hidrocloruro trihidrato) (Yakult, EP Publicación N ° 137.145 y 56.692) se comercializa - - como Campto, Camptosar y Ircan. En algunas caracterizaciones, un tratamiento combinado para la enfermedad asociada HER-3 pueden incluir la administración de Ul-49, Ul-53 o Ul de 59 en combinación con un segundo agente como se describe en este documento y hidrato de clorhidrato de irinotecán, o Ul-49, Ul-53 o Ul -59 en combinación con un segundo agente como se describe en este documento, el hidrato de clorhidrato de irinotecán, y uno o más otro agente (s) como el 5-FU (5'-deoxi-5-fluorouridina o 5-fluoro-2, 4 (1H, 3H) -pyrimidinedione) , folinato de calcio (N-[4 - [ [ (2-amino-5-formil-1-, , 5, 6, 7 , 8 hexahidro-4-oxo-6-pteridinyl ) benzoilo] metilamino ácido] -L-glutámico sal de calcio (1:1)) o calcio levofolinate ((-)- calcio N-[4 -[[[( 6S) -2-amino-5-formil-l, 4,5,6 , 7, 8-hexahidro-metil] 4-oxo-6-pteridinyl] amino] benzoil] -L-glutamato) , y sus combinaciones, para el tratamiento de cáncer como el cáncer de mama, cáncer gastrointestinal, cáncer de páncreas, cáncer de próstata, de ovario cáncer, cáncer de estómago, cáncer de endometrio, cáncer de glándula salival, cáncer de pulmón, cáncer renal, cáncer de colon, el cáncer colorrectal, cáncer de tiroides, cáncer de vejiga, gliomas, melanoma, cáncer de mama metastático, el cáncer de pulmón de células no pequeñas, el carcinoma epidermoide, fibrosarcoma, melanoma, carcinoma nasofaríngeo, y el carcinoma de células escamosas.
En algunas caracterizaciones principales, Ul-49, Ul-53 o el 59-U1 se puede utilizar en el tratamiento de pacientes con cánceres como el cáncer colorrectal y el cáncer colorrectal metastásico, tras fracaso de quimioterapia basada en 5-fluorouracilo, en combinación quimioterapia basada en con 5- - - fluorouracilo . En algunas caracterizaciones posteiores, Ul-49, Ul-53 o el 59-U1 se puede utilizar en el tratamiento del tratamiento de los pacientes con cánceres como el cáncer colorrectal y el cáncer colorrectal metastásico con el tipo-salvaje K-RAS después de un fallo de quimioterapia basada en 5-fluorouracilo, en combinación con cetuximab e irinotecán.
En algunas representaciones, los agentes adicionales que se utilizan en las composiciones y métodos descritos en este documento, que son intercambiables con el segundo agente, como se describe en este documento, puede ser un andamio artificial o natural, que no es un anticuerpo, pero tiene una actividad propia de un anticuerpo (p. e., tiene una actividad similar a la de un anticuerpo) .
En algunas otras epresentaciones, dichos agentes adicionales, que son intercambiables con el segundo agente mencionado en este documento, pueden ser agentes inhibidores, que bloquean o reducen (actúan como antagonistas a) , o, activan, estimulan o aceleran (actúan como agonista hacia) una actividad de otros objetivos, incluyendo pero no limitado a aquellas que afectan el crecimiento celular y / o vías de supervivencia, como los inhibidores de PI3K, los inhibidores de AKT, los inhibidores de mTOR, inhibidores de RAF/B-RAF, los inhibidores del RAS, los inhibidores de MEK, los inhibidores del receptor de muerte como los agonistas DR4 y DR5 asi como los anticuerpos agonistas anti-DR4 o DR5 (por ejemplo, cedelizumab, tigatuzumab, drozirumab, conatumumab) , agonistas PPAR gamma (por ejemplo, efatutazone, troglitazona, la pioglitazona, rosiglitazona) , inhibidores de c-MET, los inhibidores de HSP-90 y los inhibidores de la telomerasa. - - En algunas otras representaciones, dichos agentes adicionales, que son intercambiables con ekl segundo agente, como se describe en este documento, pueden ser anti-angiogénicos, incluyendo pero no limitado a, los antagonistas/inhibidores del VEGF (por ejemplo, el bevacizumab, vandetanib) .
En posteriores representaciones, dichos agentes adicionales, que son intercambiables con el segundo agente, pueden ser inmunoterápeutico asi como vacunas o terapias celulares.
Como se describe más adelante, estos y otros agentes pueden ser contenidos dentro de las composiciones en este documento y se puede administrar en una variedad de diferentes formas, combinaciones y dosis 5. Composición Este documento también proporciona las composiciones farmacéuticas que comprenden un agente de unión HER-3 como se describe en este documento, en combinación con un segundo agente que actúa directamente contra otra proteína de la familia HER, o es un compuesto de quimioterapia, así como también uno o más portadores farmacéuticamente aceptables, diluyentes y / o adyuvantes. El término "Farmacéuticamente aceptable" como es usado aquí en este documento, Se refiere a un compuesto químico o a una composición capaz de inducir un efecto terapéutico deseado, cuando se administra de forma apropiada a un paciente (El Diccionario de Términos Químicos - - McGraw-Hill Parker, Ed., McGraw-Hill, San Francisco (1985)). La potencia de las composiciones farmacéuticas con la que normalmente esta provista, se basa en la unión de por lo menos un enlace de proteina a HER-3. En algunas realizaciones, este enlace puede llevar a una reducción de la transducción de la señal del HER-3-mediador .
Un "Portador Farmacéuticamente aceptable" (también se refiere aquí, como a un "excipiente" o a un "portador") es un disolvente farmacéuticamente aceptable, un factor de suspensión, un factor estabilizador, o cualquier otro vehículo farmacológicamente inerte para transportar uno o mas compuestos terapéuticos (p. e., Proteínas de Unión HER) a un sujeto, el cual es no toxico a la célula o al mamífero que ha sido expuesto a la dosis y concentraciones empleadas. El portador farmacéuticamente aceptable puede ser liquido o solido, y se puede ser seleccionar de la forma como se ha previsto y se ha tenido en mente con el fin de proporcionar la producción en masa deseada, la consistencia y otros medios de transporte y propiedades químicas cuando se combina con uno o más de los compuestos terapéuticos y cualquier otro componente de una composición farmacéutica dada. Portadores usualmente farmacéuticamente aceptables, que no reaccionan perjudicialmente con aminoácidos, incluyen a modo de ejemplo y no lo limita: Agua, solución salina, agentes de unión (p. e., polivinilpirrolidona o hidroxipropil metil celulosa), relleno (p. e., la lactosa y otros azúcares, gelatina, o sulfato de calcio), lubricantes (p. e., el almidón, el glicol de polietileno, o acetato de sodio), desintegra (p. e., almidón, fécula o almidón, glicolato de sodio) y agentes - - humectantes (p. e., lauril sulfato de sodio). Los vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen también las soluciones acuosas de buffer de pH o liposomas (pequeñas vesículas compuestas por diversos tipos de lípidos, fosfolípidos y / o los agentes tensioactivos los cuales son útiles para la administración de un medicamento a un mamífero) . Otros ejemplos de portadores farmacéuticamente aceptables incluyen amortiguadores, como el fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos, antioxidantes como el ácido ascórbico, de bajo peso molecular (menos de 10 residuos) , polipéptidos, proteínas como la albúmina, gelatina, o inmunoglobulinas, los polímeros hidrofílicos, tales como polivinilpirrolidona, aminoácidos, tales como la glicina, glutamina, asparagina, arginina o lisina, monosacáridos, disacáridos, y otros carbohidratos como la glucosa, la mañosa o dextrinas, agentes quelantes, tales como el EDTA, alcoholes de azúcar como el manitol o el sorbitol, contraiones formadores de sales tales, como el sodio, y / o tensioactivos no iónicos como TWEEN ™, glicol de polietileno (PEG) , y PLURONICS ™.
Los liposomas son vesículas que tienen una membrana formada de un material lipofilico y un interior acuoso que puede contener la composición que se administrara. Los liposomas pueden ser particularmente útiles debido a su especificidad y la duración de la acción que ofrecen desde el punto de vista de la administración de fármacos. La composición de los liposomas puede ser formado, por ejemplo, de la fosfatidilcolina, dimiristoil fosfatidilcolina, fosfatidilcolina dipalmitoil, fosfatidilglicerol dimiristoil o fosfatidil etanolamina dioleoyl. Numerosos agentes - - lipofílicos están disponibles comercialmente, incluyendo LIPOFECTIN ® (Invitrogen / Life Technologies, Carlsbad, CA) y EFFECTENETM (Qiagen, Valencia, CA) .
En algunas realizaciones, por lo menos uno de los agentes que figuran en una composición farmacéutica (p. e., un HER-3 de unión o un agente que se une y / o inhiba a otro miembro de la familia HER) puede ser acoplado a un efector tal como caliqueamicina, duocarmycins, auristatins, maytansinoids, un radioisótopo, o un agente quimioterapéutico tóxicos como geldanamicina y maytansine. Los cuales conjugados, pueden ser especialmente útiles para atacar a las células (p. e., las células cancerosas) que expresen HER-3.
Las proteínas de unión vinculadas a radioisótopos pueden proporcionar ventajas a los tratamientos de tumores. A diferencia de la quimioterapia y otras formas de tratamiento contra el cáncer, la radio inmunoterapia o la administración de la combinación de proteínas de radioisótopos de unión pueden dirigirse a las células cancerosas con daño mínimo a los tejidos circundantes, normales y saludables. Con esta "bala mágica", los pacientes pueden ser tratados con cantidades mucho menores de los radioisótopos que con otras formas de tratamiento con las que se disponen en la actualidad. Los radioisótopos adecuados incluyen, por ejemplo, yttrium90 (90Y), indiumlll (lllln), 1311, 99mTc, radiosilver-111, radiosilver-199, y Bismuto 213. La vinculación de los radioisótopos a las proteínas de unión se puede realizar, por ejemplo, con convencionales quelatos bifuncionales convencionales. Dado que la plata es monovalente, para radiosilver-111 y la vinculación - - radiosilver-199, enlazadores a base de azufre puede ser utilizado (Hazra et al. (1994)Cell Biophys. 24-25:1-7. Vinculaciones de radioisótopos de plata puede implicar la reducción de la inmunoglobulina con ácido ascórbico. Por otra parte, el tiuxetan es un quelante X-DTPA vinculador unido al ibritumomab para formar ibritumomab tiuxetan (Zevalin) (Witzig (2001) Cáncer Chemother. Pharmacol. 48 (Suppl 1):91-95) . El ibritumomab tiuxetan puede reaccionar con radioisótopos como el indiumlll (lllln) o para formar 90Y ibritumomab tiuxetan y Illln-90Y ibritumomab tiuxetan-, respectivamente..
Las proteínas de unión descritos en este documento, especialmente cuando se utilizan para tratamiento contra el cáncer, se pueden conjugar con fármacos quimioterapéuticos tóxicos como maytansinoids, (Hamann et al. (2002) Bioconjug. Chem. 13:40-46), geldanamycinoids (Mandler et al. ( 2000) J. Nati. Cáncer Inst. 92:1549-1551) y maytansinoids, como por ejemplo, la droga maytansinoids, DM1 (Liu et al. (1996) Proc. Nati. Acad. Sci. U.S. A 93:8618-8623). Vinculantes que liberen los medicamentos en condiciones de acidez o la reducción o bajo la exposición a las proteasas especificas se pueden emplear con esta tecnología. Una proteína de unión se puede conjugar como se describe en la materia.
En algunas realizaciones, una proteína de unión puede ser conjugada con auristatin-PE . Auristatin-PE, p. e., es un agente antimicrotubular que es una modificación estructural del péptido dolastatin constituyente 10 de los moluscos marinos. Auristatin-PE tiene tanto la actividad anti-tumoral y la actividad anti-tumoral vascular (Otani et al. (2000) - - Jpn. J. Cáncer Res. 91:837-44). Por ejemplo, auristatin-PE inhibe el crecimiento celular e induce la detención del ciclo celular y apoptosis en líneas celulares de cáncer de páncreas (Li et al. (1999) Int. J. Mol. Med. 3:647-53). En consecuencia, para dirigirse específicamente a la actividad anti-tumoral y la actividad anti- tumor vascular del auristatin-PE hacia los tumores específicos, el auristatin-PE puede ser conjugado con una proteína de unión según lo establecido anteriormente.
Las composiciones farmacéuticas establecidas en este documento pueden estar hechas de por lo menos otro agentes activo. Ejemplos de otros agentes activos incluyen anticuerpos o inhibidores de bajo peso molecular de otras proteínas quinasas receptoras, tales como IGFR-1 y c-met, receptores ligandos tales como, factor vascular endotelial (VEGF) , agentes citotoxicos, tales como, doxorrubicina, cisplatino o carboplatino, citoquinas o agentes anti-neoplásicos. Varios agentes anti-neoplásicos son conocidos dentro de la materia. En algunas representaciones, un agente anti-neoplásico, pueden ser seleccionados del grupo de Proteínas terapéuticas, incluyendo, pero no limitado a, anticuerpos y proteínas inmunomodulatorias . En algunas representaciones un agente anti-neoplásico puede ser seleccionado del grupo de pequeñas moléculas inhibidoras y agentes quimioterapéuticos que consisten de inhibidores mitóticos, inhibidores quinasa, agentes alquilantes, antibióticos anti-metabolitos intercalantes, inhibidores del factor del crecimiento, inhibidores del ciclo celular, enzimas inhibidoras de la topoisomerasa, inhibidores de la - - histona deacetilasa, agentes anti-supervivencia, modificadores de la respuesta biológica, anti-hormonas (por ejemplo, anti-andrógenos ) , los estimulantes de microtúbulos , antraciclinas y agentes anti-angiogénesis . Cuando el agente antineoplásico es radiación, el tratamiento se puede lograr ya sea con una fuente interna (por ejemplo, la braquiterapia) o una fuente externa (por ejemplo, radioterapia de haz de luz externa) . Uno o mas agentes activos (s) pueden ser administrados con el agente HER3 vinculante y el segundo agente puede ser o no administrado simultáneamente o por separado, en una formulación única o formulación individual (por separado) para cada agente activo.
La composición farmacéutica suministrada en este documento puede ser especialmente útil para el diagnostico, o tratamiento de una enfermedad hiperproliferativa . La enfermedad hiperproliferativa puede estar asociada con la transducción de la señal de la familia HER. En particular, la enfermedad puede estar asociada con un aumento de la fosforilación de HER-3, el aumento de la formación de complejos entre HER-3 y otros miembros de la familia HER, el aumento de la actividad de la quinasaPl3, el aumento de la actividad de la quinasac-jun terminal y/o actividad de A T, el aumento de la actividad ERK2 y / o PYK2, o de cualquier combinación de éstos. La enfermedad hiperproliferativa puede ser, por ejemplo, seleccionado del grupo que consiste de cáncer de mama, cáncer gastrointestinal, cáncer de páncreas, cáncer de próstata, cáncer de ovario, cáncer de estómago, cáncer de endometrio, cáncer de glándula salival, cáncer de pulmón, cáncer de riñon, cáncer de colon, cáncer colorrectal, - - cáncer de tiroides, cáncer de vejiga, gliomas, melanoma, o de otro tipo HER-3 que exprese o sobreexprese cánceres, y la formación de metástasis tumorales.
Las composiciones farmacéuticas se pueden formular mediante la mezcla de uno o más portadores fisiológicamente aceptables, diluyentes y / o adyuvantes, y opcionalmente otros agentes que son incorporados usualmente en las formulas, para asi proporcionar una mejor transferencia, entrega, tolerancia, etc. Una composición farmacéutica puede se formulada, p. e., en formulas liofilizadas, soluciones acuosas, dispersiones, o en la preparación de sólidos tales como tabletas, grageas o capsulas. Una gran cantidad de formulas adecuadas se pueden encontrar en el formulario conocido por todos los químicos farmacéuticos: Remington' s Pharmacéutical Sciences (18 a ed, Mack Publishing Company, Easton, PA (1990)), especialmente el Capítulo 87 de Block, Lawrence, el mismo. Estas formulas incluye, por ejemplo, polvos, pastas, ungüentos, geles, ceras, aceites, lípidos, vesículas (cationes o aniones) que contienen lípidos (como LIPOFECTIN™) , ADN conjugados , pastas de absorción anhidra, el agua de aceite y emulsiones de aceite en agua, , emulsiones carbowax (glicol de polietileno de varios pesos moleculares), gel semi-sólido, y mezclas de semi-sólidos que contengan carbowax.. Cualquiera de las mezclas anteriores pueden ser apropiadas en los tratamientos y terapias como se describe en este documento, siempre y cuando que el agente activo en la formula no este inactivado por la formula y la formulación sea fisiológicamente compatibles y tolerable con la vía de administración. Ver, también, Baldrick (2000) - - Regul. Toxicol. Pharmacol. 32:210-218; Wang (2000) Int.. J. Pharm. 203:1-60; Charman (2000) J. Pharm. Sci . 89:967-978; y Powell et al. (1998) PDA J. Pharm. Sci . Tecnol. 52:238-311), y las citas del mismo para obtener información adicional acerca de las formulas, excipientes y portadores bien conocidas por los químicos farmacéuticos.
Este documento también hace referencia a la utilización de al menos un agente (p. e., en aislamientos de proteínas de unións HER-3) como se describe en este documento, y al menos otro agente activo (p. e., un agente que se une a otro miembro de la familia HER o un compuesto de quimioterapia ) en mezcla con portadores farmacéuticamente aceptables, diluyentes y / o adyuvantes, para la fabricación de una composición farmacéutica para el diagnóstico, prevención o tratamiento de una enfermedad hiperproliferativa (p. e., una enfermedad asociada con HER-3) . La composición farmacéutica puede ser una composición farmacéutica como se describe en este documento, y la enfermedad hiperproliferativa puede ser una enfermedad hiperproliferativa como se describe en este documento.
Métodos para la formulación, y administración subsecuente de los compuestos terapéuticos son bien conocidos para aquellos expertos en la materia. La dosificación general depende de la severidad y la sensibilidad del estado de la enfermedad a se tratada, con un tiempo de tratamiento que puede durar desde varios días hasta varios meses, o menos de que la cura sea efectuada o se logre una disminución en el estado de la enfermedad. Personas de habilidades ordinarias en la materia determinan dosis óptimas, metodologías de dosis - - y promedios de repetición. Las dosis óptimas pueden variar dependiendo de la potencia relativa de los polipéptidos del individuo, y generalmente es estimado basado en EC50 entendido para se efectivo en modelos animales in vivo e in vitro. Generalmente la dosis es desde 0.1 µ? hasta 100 mg por kilogramo de peso corporal, y puede ser suministrado una o mas veces por dia, cada dos semanas, cada semana, cada mes o inclusive de forma menos seguida. Siguiendo un tratamiento exitoso, es apreciable el tener una terapia de mantenimiento para prevenir la recurrencia del estado de la enfermedad.
Las composiciones farmacéuticas se puede administrar por varios métodos, dependiendo de si el tratamiento que se desea es local o sistémico sobre el área que se quiere tratar. La administración puede ser, por ejemplo, tópica (p. e., transdérmica, sublingual, oftálmica, o intranasal) , pulmonar (p. e., por inhalación o insuflación de polvos o aerosoles); oral o parenteral (p. e., por via subcutánea, por vía intratecal, intraventricular, intramuscular, o inyección intraperitoneal, o por goteo intravenoso) . La administración puede ser rápida (p. e., por inyección) o puede ocurrir en un periodo de tiempo (p. e., por infusión lenta o la administración de formulaciones de liberación lenta) . Para el tratamiento de los tejidos del sistema nervioso central, las proteínas de unión HER - 3 se pueden administrar mediante inyección o infusión en el líquido cefalorraquídeo, por lo general con uno o más agentes capaces de ayudar a la penetración de los polipéptidos a través de la barrera sangre-cerebro.
- - Las composiciones farmacéuticas y las formulaciones para ser administradas por vía parenteral, intratecal o intraventricular pueden llevar incluidas soluciones acuosas estériles, las cuales también pueden contener soluciones buffer, diluentes y otros aditivos apropiados (p. e., Potenciadores de penetración, compuestos portadores y otros portadores farmacéuticamente aceptables) .
Las composiciones farmacéuticas incluyen, sin limitación, soluciones, emulsiones, suspensiones acuosas, y las formulaciones que contienen liposomas. Estas composiciones se pueden generar a partir de una variedad de componentes que incluyen, por ejemplo, líquidos preformados, sólidos auto- emulsionantes y semisólidos auto-emulsionante. Las emulsiones son a menudo sistemas bifásicos que son comprendidos por dos fases líquidas inmiscibles que son íntimamente mezclados y dispersas entre sí; en general, las emulsiones son tanto en una variedad de agua en aceite ( / 0) o aceite en agua (0 / W) . Las formulaciones de emulsión han sido ampliamente utilizadas para la administración oral de la terapéutica debido a su facilidad de preparación y eficacia de solubilización, absorción y biodisponibilidad.
Los agentes de unións HER pueden abarcar las sales farmacéuticamente aceptables, esteres o sales de esteres, o cualquier otro compuesto que, después de la administración a un animal el cual puede ser, un ser humano, es capaz de proporcionar (directa o indirectamente) el metabolito biológicamente activo o residuos del mismo. En consecuencia, por ejemplo, este documento contiene las sales farmacéuticamente aceptables de moléculas pequeñas y - - polipéptidos, Profármaco y sales farmacéuticamente aceptables de dichos Profármacos, otros bioequivalentes . El termino "Profármaco" nos indica un agente terapéutico que es preparado de manera inactiva y convertido a una forma activa (por ejemplo fármacos) conteniendo el cuerpo o las células en si, por la acción de las enzimas endógenas u otros químicos y/o condiciones. El termino "Sales farmacéuticamente aceptables" hace referencia a sales fisiológica y farmacéuticamente aceptables, de los polipéptidos provistos aquí (p. e. sales que retienen la actividad deseada biológicamente de la familia de los polipéptidos sin impartir efectos tóxicamente indeseados) . Ejemplos de sales farmacéuticamente aceptables incluye, pero no esta limitado a sales formadas con cationes (p. e. sodio, potasio, calcio, poliaminas tales como la espermina) ; Sales con adición de ácidos formados con ácidos inorgánicos (p. e. acido hidroclorhidrico, acido hidrobromico, acido sulfúrico, acido fosfórico, o acido nítrico) ; y sales formadas con ácidos orgánicos (p. e acido acético, acido cítrico, acido oxálico, acido palmítico, o acido fumarico) .
Algunas realizaciones provistas aquí incluyen composiciones farmacéuticas que contienen (a) uno o mas agentes de uniones HER 3; (b) Uno o mas agentes que se unen a otros miembros de la familia HER; y (c) uno o mas agentes que funciones por mecanismos diferentes. Por ejemplo, uno o más agentes de (c) son intercambiables con algunos de (b) ; medicamentos anti- inflamatorios, incluidas pero no limitadas a medicamentos anti- inflamatorios no-esteroidales corticosteriodes y drogas antivirales incluidas pero no - - limitadas al ribivirin, vidarabine, acliclovir y ganciclovir pueden estar incluidas en estas composiciones.
Otros agentes no polipéptidos (p. e. agentes quimioterapéuticos) están también contenidos en le estudio de este documento. Tales compuestos combinados pueden ser usados juntos secuencialmente .
Composiciones adicionales pueden contener otros componentes adicionales convencionalmente encontrados en composiciones farmacéuticas. De esta manera las composiciones además pueden incluir material farmacéuticamente activo tal como, por ejemplo, antipruriginosos, astringentes, anestésicos locales o agentes anti- inflamatorios, o material adicional útil físicamente formulado en varia s dosis de las composiciones provistas aquí, tales como colorantes, agentes saborizantes, preservativos, antioxidantes, opacificantes, espesantes y estabilizadores. Mas aun la composición puede ser combinada con agentes auxiliares, p. e. lubricantes, preservativos, estabilizadores, agentes humectantes, emulsificantes, sales para influenciar la presión osmótica, soluciones tampones, colorantes, saborizantes, y sustancias aromáticas. Cuando se añade, sin embargo, tales materiales no deben interferir de manera indebida con las actividades biológicas de los componentes del polipéptido con las composiciones dispuestas aquí. Las formulaciones pueden ser esterilizadas, si así se desea.
Las formulaciones farmacéuticas, las cuales pueden ser presentadas convenientemente en forma de dosis unitaria, pueden ser preparadas de acuerdo a técnicas convencionales - - muy conocidas en la industria farmacéutica. Dichas técnicas incluyen el paso de traer a asociación los ingredientes activos (p. e. formulaciones de la familia HER dispuestas aquí) con el portador farmacéutico deseado (s) o excipiente (s) . Usualmente, las formulaciones pueden ser preparadas por uniformidad y trayendo los ingredientes activos en una ligada asociación con portadores líquidos o portadores de sólidos finamente divididos o ambos, luego, de ser necesario moldeando el producto. Las formulaciones pueden ser esterilizadas si así se desea, previendo que le método de esterilización no interfiera con efectividad de los polipéptidos contenidos en la formulación.
Las composiciones que se describen en este documento pueden ser formuladas en alguna o muchas posibles dosificaciones tales pero no limitado a, como tabletas, cápsulas, jarabes líquidos, geles suaves, supositorios y enemas. Las composiciones también se pueden formular como suspensiones en medio acuosas, no acuosas o mixtas. Las Suspensiones acuosas que pueden contener más sustancias que incrementan la viscosidad de la suspensión, incluyendo, como por ejemplo, carboximetilcelulosa de sodio, sorbitol, y / o dextrano. Las suspensiones también pueden contener estabilizadores .
Las proteínas de unión HER pueden ser combinadas con material de embalaje y se venden como kits para el tratamiento de enfermedades asociadas a HER -3. Los Componentes y métodos para la producción de artículos de fabricación son bien conocidos. Los artículos de producción pueden combinar uno o más de los polipéptidos y los - - compuestos que figuran en los apartados anteriores. Además, el artículo de la fabricación de dichos productos puede incluir, por ejemplo, tampones u otros reactivos de control para la reducción o formación monitoreada de complejos inmunoreducidos . Las Instrucciones que describen cómo los polipéptidos son eficaces para el tratamiento de enfermedades asociadas HER-3 se pueden incluir en dichos kits. Cualquiera de los agentes primarios, agentes secundarios y agentes adicionales podrían ser entregados en nano partícula (s) o de lisosoma (s) , o cualquier otra forma (s) adecuada. 6. Métodos Este documento también provee métodos para el tratamiento o prevención de enfermedades y condiciones asociadas con expresiones HER-3. Por ejemplo, un método puede contener contacto con una partícula o una muestra biológica de una partícula, (p. e. un mamífero tal como un humano) con una proteína de aglomeración HER-3 en combinación con un segundo agente como se ha descrito aquí. La muestra puede ser una célula que muestra características de HER-3, tales como células tumorales, una muestra de sangre o cualquier otra muestra adecuada. En algunos casos, el contacto ocurre en vivo, así como cuando un compuesto que contiene un agente aglutínate HER-3 y un agente secundario que liga a otro miembro de la familia HER y es administrado al sujeto que tiene la necesidad de este. Las enfermedades o condiciones asociadas con expresiones de HER-3 que pueden ser tratadas mediante la utilización de métodos descritos aquí, como por ejemplo, enfermedades hiperproliferantes tales como cáncer de ceno, cáncer gastrointestinal, cáncer pancreático cáncer de - - próstata, cáncer de ovarios, cáncer de estomago, cáncer endometrial cáncer de glandular salivales, cáncer pulmonar, cáncer de riñon, cáncer de colon, cáncer colorrectal, cáncer de tiroides, cáncer de vejiga, gliomas, melanomas, cáncer renal, cáncer renal, cáncer de mama metastático, el cáncer de pulmón de células no pequeñas, carcinoma epidermoide, fibrosarcoma, el melanoma, el carcinoma nasofaríngeo, carcinoma de células escamosas, y otros HER-3 positivos, que expresan o sobre-expresan los cánceres.
El termino "tratamiento o prevención", cuando es utilizado en el presente, se refiere a ambos tratamientos terapéuticos y profilácticos o medidas preventivas, que son utilizadas para prevenir, detener, perder los efectos del la condición patológica especifica o desorden, así como también aquellos que podrían llegar a desarrollar el desdoren, o aquellos en los que el desorden se va a prevenir. El paciente que necesita la prevención o el tratamiento puede ser un paciente mamífero (p. e., cualquier animal clasificado como mamífero, incluyendo humanos, animales domésticos o de granja, animales de zoológicos, deportivos, o animales mascota tales como los perros, gatos, ganado bobino, caballos, ovejas, cerdos, cabras, conejos, etc.) En algunas ocasiones, el paciente que tiene la necesidad del tratamiento es un paciente humano.
Los métodos de prevención o de tratamiento de enfermedades o condiciones asociadas con la expresión de HER-3 en un paciente necesitado, puede incluir la administración al paciente de cantidades efectivas o al menos un aglomerante HER-3 tal como se describe aquí y al menos algún otro agente - - en contra de otro miembro de la Familia HER o un compuesto quimioterapéutico (p. e. al menos uno de los agentes adicionales descritos anteriormente, los cuales son canjeables con los agentes aglomerantes secundarios a inhibir cualquier otra familia HER) Tales tratamientos pueden, por ejemplo, inhibir las células de crecimiento anormal, migraciones o invasiones. El agente en contra de HER-3 y el al menos otro agente puede ser administrado simultáneamente (p. e. cuando están contenidos en la misma composición, o por la adición y mezcla en una bolsa i.v. común.), o separada (p. e. secuencialmente) . Las enfermedades o condiciones asociadas con la expresión de HER-3 que pueden ser tratadas con el uso de métodos provistos anteriormente incluyen, por ejemplo, las enfermedades hiperproliferativa mencionadas anteriormente. El paciente que necesita la prevención o el tratamiento puede ser un paciente mamífero (p. e., cualquier animal clasificado como mamífero, incluyendo humanos, animales domésticos o de granja, animales de zoológicos, deportivos, o animales mascota tales como los perros, gatos, ganado bobino, caballos, ovejas, cerdos, cabras, conejos, etc.) En algunas ocasiones, el paciente que tiene la necesidad del tratamiento es un paciente humano.
Como se ha usado anteriormente, el termino "cantidad efectiva" es una cantidad de un agente que da como resultado una disminución o estabilización de uno o mas de los síntomas o características clínicas de las condiciones asociadas a la HER - 3 en tratamiento. Por ejemplo, el suministro de una cantidad efectiva de una composición como se describió aquí en este documento pude resultar en el retraso de la - - progresión del crecimiento de un tumor, en la disminución del tamaño del tumor, en la disminución de la activación del HER - 3 o en la respuesta de los biomarcadores HER-3 (p. e. Akt, HER-2, ERK, o EGF-R) . El retraso o disminución puede ser cualquier reducción a comparación de un valor previo, (p. e. un 5%, 10%, 20%, 25% o una reducción de mas de un 25% en síntomas o características) . En algunas realizaciones, una "cantidad efectiva" puede dar como resultado la estabilización de la enfermedad.
Además de la manera clásica de la administración de las proteínas de unións potenciales terapéuticas, p. e., a través de las fórmulas antes mencionadas, las modalidades recientemente desarrolladas de la forma como se administra, también pueden ser útiles. Por ejemplo, la administración local de un anticuerpo monoclonal marcado-I131 para el tratamiento de los tumores de cerebro primarios después de que la resección quirúrgica ha sido reportada. Además, la inyección intracerebral estereotáctica directa de anticuerpos monoclonales y sus fragmentos también está siendo estudiada clínica y pre-clínicamente . La perfusión hiperosmolar intracarotídeo, es una estrategia experimental cuyo objetivo principal son los tumores malignos primarios del cerebro que se hace con fármacos que contienen anticuerpos de humano monoclonales conjugados.
Como se describió anteriormente, la dosis de los agentes administrados puede depender de una variedad de factores. Estos incluyen, por ejemplo, la naturaleza de los agentes, el tipo de tumor y la vía de administración. Cabe destacar que los métodos actuales no se limitan a una dosis determinada. - - Los métodos para determinar las dosis adecuadas son conocidos en la técnica, e incluyen a aquellos descritos en los ejemplos .
Dependiendo de la clase y gravedad de la enfermedad a ser tratada, aproximadamente 20 mg / kg de cada anticuerpo de unión HER pueden ser administrados a un paciente que lo necesite, p. e., por una o más administraciones separadas o por infusiones continuas. Una dosis diaria típica puede estar en el rango de 1 mg / día a 100 mg / día o más, dependiendo de los factores mencionados anteriormente. Para que la administración se haga de manera repetida durante varios días o más, se debe tener en cuenta el estado del paciente que se va a tratar, y el tratamiento puede mantenerse hasta que haya la supresión deseado de los síntomas producidos por la enfermedad.
En algunas realizaciones, un método como el suministrado en el presente documento, puede incluir el análisis de un marcador específico (p. e., HER-3) en una muestra biológica de un paciente para determinar si el paciente tiene una enfermedad asociada con la expresión de HER-3. Estos métodos se pueden utilizar para seleccionar a los pacientes con enfermedades asociadas con HER-3. En estos métodos, el paso del análisis, se puede realizar primero que el paso de la administración, en donde el escaneo o análisis de los pacientes puede evitar tratamientos que probablemente no resulten eficaces. De esta manera en algunos casos, la metodología suministrada aquí, también pueden incluir la detección de un antígeno HER- 3 en una célula, para determinar la concentración del antígeno HER-3 en pacientes - - que sufran de una enfermedad hiperproliferativa tal como se menciona anteriormente, o para demostrar la enfermedad hiperproliferativa en un paciente. Con el fin evidenciar la progresión de una enfermedad hiperproliferativa en un paciente en estudio, o para caracterizar la respuesta del paciente con una terapia en curso, una muestra de sangre puede ser extraída del paciente y así de esa manera poder evidenciar la concentración del antígeno HER-3 presente en la muestra. La concentración así obtenida puede ser utilizada para identificar en qué rango de concentración se encuentra el valor. El rango obtenido se puede correlacionar con una etapa de progresión o una etapa de la terapia identificada en las distintas poblaciones de pacientes diagnosticados, lo que nos establece la etapa en la que esta el paciente objeto de estudio. Una biopsia de la enfermedad, p. e., por ejemplo, una muestra del tejido canceroso, obtenida del paciente, también puede ser utilizada para evaluar la cantidad de antígeno presente HER-3. La cantidad de antígeno HER-3 presente en el tejido enfermo puede ser detectado, utilizando, por ejemplo, inmunohistoquímica, la técnica de ELISA, o la matriz de anticuerpos, utilizando anticuerpos HER-3 como se describe en este documento. Otros parámetros de interés para el diagnóstico son el estado DE dimerización, así como los patrones de la dimerización de la proteína HER-3 y el estado de activación de la misma y sus patrones. Los Métodos de análisis de proteínas y para determinar los parámetros son bien conocidos en la técnica y entre otros están las técnicas western blot y técnicas de inmunoprecipitacion el análisis de FACS, reticulación química, transferencia de energía por resonancia de - - bioluminiscencia (BRET) , transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET) y similares (p. e., Price et al. (2002) Métodos Mol. Biol.. 218:255-268, o la tecnología e Tag (WO 05/03707, O 04/091384 y WO 04/011900) .
En ciertos casos, un método como el que se suministro aquí, puede incluir uno o más pasos para el seguimiento de los resultados terapéuticos del tratamiento. Por ejemplo, un paciente puede ser monitoreado para poder detectar los síntomas de su enfermedad, para determinar si hay una reducción en los síntomas. El tema también se puede controlar, por ejemplo, por los posibles efectos secundarios del tratamiento. El seguimiento se puede hacer después del paso de la administración, y, en algunas ocasiones, se puede hacer varias veces (p. e., entre las administraciones, si las dosis se administran más de una vez) . Estos métodos se pueden utilizar para evaluar la eficacia y la seguridad de los métodos de tratamiento descritos en este documento, por ejemplo.
La invención podrá ser descrita mas adelante en los siguientes ejemplos, los cuales no limitan el campo de acción de la invención que se describe en las reivindicaciones.
EJEMPLOS EJEMPLO 1; HER-3 La preparación de líneas antígenas y celulares Recombinantes de proteínas HER-3 fueron preparados. El dominio extracelular de HER-3 (ECD) cDNA fue clonado por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) a partir del - - pcDNA3-HER-3 (vector de expresión con HER-3 humano de completa longitud, Wallasch et al. (1995) EMBO J. 14: 4267-4275) con cebadores basados en la secuencia de HER-3 (Accession No. NM_001982) : Iniciador hacia adelante: 5'-CGGGATCCATGTCCTAGCCTAGGGGC-3' (SEQ ID NO: 233); Iniciador reverso: 5' -GCTCTAGATTAATGATGATGATGATGATG TTGTCCTAAACAGTCTTG-3' (SEQ ID NO: 234) .
El producto de la PCR fue digerido con BamHl y Xbal y ligado dentro del pcDNA3 (Invitrogen) digerido con BamHl y Xbal. Los plásmidos fueron transfectados dentro de las células HEK293 usando un método CaP04. La proteína de fusión HER-3-HIS fue purificada a partir de medios cosechados condicionados a través de cromatografía de afinidad de Ni-NTA.
Las células Ratl HER-3 fueron generadas a partir de la transferencia de genes retrovirales . Brevemente, células GP+E 86 (3x105) fueron sembradas en un disco de cultivo de 60 mm y transfectadas con un vector 2 g/ml plXSN o plXSN-HER-3 cDNA (C. Wallasch, PhD Thesis, Max-Planck Institute of Biochemistry, Martinsried, Germany) usando el método de fosfato de calcio. Después de 24 horas, el medio fue remplazado por un medio fresco y las células GP+E 86 fueron incubadas por 4-8 horas. Las células sub confluentes Ratl (2x105 células por cada 6 cm del plato) fueron posteriormente incubadas con sobrenadantes de células GP+E 86 dando a conocer un alto titulo de pLXSN o pLXSN-HER-3, p virus (>1 X 106 G418 c.f.u. /mi; m.o.i. de 10) por 4-12 horas en la presencia de Polybrene (4 mg/ml; Aldrich) . Después de haberse cambiado el medio, se inicio la selección de las - - células Ratl con G418. Usualmente, los clones estables se escogieron después de una selección de 21 días.
EJEMPLO 2: HER-3 La expresión en lineas de células cancerígenas humanas La expresión HER-3 fue cuantificada en un panel de líneas de células cancerígenas humanas para dilucidar el papel que juega HER-3 en la formación de cáncer en humanos. Las líneas de células cancerígenas fueron cultivadas según lo recomendado por la ATCC. Detalladamente, 105 células fueron cosechadas con 10 mM EDTA en PBS, lavadas una vez con un amortiguador FACS (PBS, 3 % FCS, 0.4 % azida) y sembradas en una placa de fondo redondo de 96-pozos. Las células fueron giradas por 3 minutos a 1000 rpm para remover los sobrenadantes y posteriormente resuspenderlas con anticuerpo -HER-3 2D1D12 (WO03013602) (3 pg/ml) . Las suspensiones celulares fueron incubadas en hielo por 1 hora, lavadas dos veces con un amortiguador FACS, y resuspendidas con un anticuerpo secundario (100 µ?/well) donkey-anti-human-PE (Jackson) diluido a 1:50 en un amortiguador FACS. Las suspensiones celulares fueron incubadas en hielo y en la oscuridad por 30 minutos, lavadas dos veces con un amortiguador FACS y analizadas (FACS, Beckman Coulter) . La HER-3 fue expresada en una variedad de líneas de células cancerígenas humanas, incluyendo diferentes líneas celulares mamarias, de colon, de la epidermoide, de melanoma, nasofaríngeas, ovarías, del páncreas, y prostéticas. Ver, las figures de la published U.S. Publication No. 20080124345, las cuales se incorporaron en la presente por referencia. - - EJEMPLO 3: Inmunización y titulación La proteina HER-3 ECD, la cual fue preparada como se describió en el ejemplo 1 y las células C32 (melanoma humano); ATCC#CRL-1585 ) fueron utilizadas como antigenos. Anticuerpos monoclonales contra la HER-3 fueron desarrollados por la inmunización de forma secuencial de ratones XENOMOUSE® (cepas de XMG1 y XMG4 ; Abgenix, Inc., Fremont, CA) . Los animales XENOMOUSE® fueron inmunizados a través de la pata para todas las inyecciones. El volumen total de cada inyección fue de µ? por cada ratón, 25 µ? por cada pata.
Para el cohort # 1 (10 ratones XMG1) , la inmunización inicial fue con 10 µg de proteina HER-3 ECD mezclado 1:1 (v/v) con TiterMax Gold® (Sigma, Oakville, ON) por cada ratón. Los cinco subsiguientes estímulos fueron hechos con 10 µg de la proteína HER-3 ECD mezclada 1:1 (v/v) con 100 µg de gel de alumbre (Sigma, Oakville, ON) en D-PBS libre de pirógenos. El sexto estimulo que consiste de 10 µg de proteína HER-3 ECD mezclada 1:1 (v/v) con TiterMax Gold®. La séptima inyección que consiste de 10 µg de la proteína HER-3 ECD mezclada 1:1 (v/v) con gel de alumbre. Un ultimo estimulo fue hecho con 10 µg de la proteína HER-3 ECD en DPBS libre de pirógenos, sin adyuvante. Los ratones XENOMOUSE® fueron inmunizados los días 0, 4, 7, 11, 15, 20, 24 y 29 para este protocolo, y las fusiones fueron llevadas a cabo el día 33. Las dos hemorragias se realizaron a través del procedimiento Retro-Orbital Bleed el día 13 después del cuarto estimulo y el día 19 después del sexto estimulo. No hubo cohorte #2 alguno. Para el cohorte # 3 (10 ratones XMG1) y el cohort # 4 - - (10 ratones XMG4), la primera inyección fue con 107 células C32 en Dulbecco' s PBS (DPBS) libre de pirógenos mezclada 1:1 (v/v) con TiterMax Gold® por cada ratón. Los cuatro estímulos siguientes fueron con 107 células C32 en DPBS libre de pirógenos, mezclado con 25 µg de Adju-Phos y 10 µg CpG por cada ratón. El sexto estimulo fue con 107 células C32 en DPBS libre de pirógenos, mezclado 1:1 (v/v) con TiterMax Gold® por cada ratón. Los estímulos siete, ocho y nueve fueron con 107 células C32 en DPBS libre de pirógenos, mezclado con 25 µg de Adju-Phos y 10 µg CpG por cada ratón. Los estímulos del diez al catorce fueron con 5 µg de la proteína HER-3 ECD en DPBS libre de pirógenos, mezclado con 25 µg de Adju-Phos y 10 g CpG por cada ratón. Un estimulo final que consiste de 5 µg de la proteína HER-3 ECD en DPBS libre de pirógenos, sin adyuvante. Para los cohorts #3 y #4, los ratones fueron inmunizados los dias 0, 3, 7, 11, 14, 17, 21, 24, 28, 33, 35, 38, 42 y 45, y las fusiones se llevaron a cabo el día 49. Las tres hemorragias de realizaron a través del procedimiento Retro-Orbital Bleed el día 12 después del cuarto estimulo, el día 19 después del sexto estimulo y el día 40 después del doceavo estimulo.
Selección de animales para cosecha por títulos: Para el cohorte #1, los títulos de anticuerpos anti-HER-3 en el suero de ratones inmunizados fueron determinados por ELISA contra la proteína HER-3 ECD. El titulo específico de cada animal XENOMOUSE® fue de determinado a partir de la densidad óptica a 650nm, y se muestra en la TABLA 1 más abajo. El valor del título es el reciproco de la mayor dilución de los sueros con una lectura OD dos veces mayor que la de fondo. - - Por lo tanto, cuanto mayor sea el número, mayor será la respuesta inmune humoral a la proteina HER-3 ECD .
TABLA 1 Cohorte #2, XMGl - - Para los cohortes #3 y #4, los títulos de anticuerpos anti-HER-3 en el suero de ratones inmunizados fueron determinados por _ FACS usando células Ratl/HER-3 (línea celular de antígeno positivo) y células Ratl/pLSXN ( línea de células de antígeno negativo) . Los datos se muestran en los cuadros 2 y 3, y se presentan como la media geométrica (MEDIA. GEOM) de la intensidad de fluorescencia de células anti-HER-3 de tinción por diluciones seriadas de las muestras de suero.
- - TABLA 2 Cohorte #3, XMGl - - TABLA 3 Cohorte #4, XMG4 - - - - EJEMPLO 4: Recuperación de Linfocitos, Aislamiento de Células -B, Fusiones Y Generación de Hibridomas Los ratones inmunizados fueron sacrificados y los ganglios linfáticos fueron cosechados y agrupados de cada cohorte. Las células linfoides fueron disociadas por molienda en DMEM para liberar las células de los tejidos, y las células fueron suspendidas en DMEM. Las células fueron contadas y 0.9 mi DMEM por cada 100 millones de linfocitos fue agregado al pellet de células para re suspender las células suavemente pero completamente. Usando 100 µ? de CD90+ granos magnéticos por cada 100 millones de células, las células fueron etiquetadas por la incubación de las células con los granos magnéticos a una temperature de 4°C por 15 minutos. La suspensión de células magnéticamente etiquetadas la cual contiene cerca de 108 células positivas (o cerca de 2x109 células totales) fue cargada sobre una columna LS+ y la columna fue lavada con DMEM. El efluente total se recogió como la fracción CD90-negativa (se esperaba que la mayoría de estas células fueran células B) La fusión fue llevada a cabo mediante la mezcla de células B lavadas enriquecidas a partir de células de mieloma por encima y no secretoras P3X63Ag8.653 adquiridas a partir de ATCC (Cat. No. CRL 1580) (Kearney et al. (1979) J. Immunol. 123:1548-1550) at a ratio of 1:1. La mixtura celular fue suavemente sedimentada por la centrifugación a 800 g. después de la completa eliminación de los sobrenadantes, la células fueron tratados con 2 a 4 mi de solución de pronasa (CalBiochem, Cat. No. 53702; 0.5 mg/ml en PBS) por no mas de 2 minutos. Posteriormente 3a 5 mil de FBS fueron agregados - - para parar la actividad de la enzima, y las suspensión fue ajustada a 40 mi de volumen total usando una solución de electro fusión celular, ECFS (0.3 M sucrose, Sigma, Cat . No. S7903, 0.1 mM magnesium acétate, Sigma, Cat. No. 2545, 0.1 mM acetato de calcio, Sigma, Cat. No. C4705) . El sobrenadante fue eliminado después de la centrifugación y las células fueron resuspendidas en 40 mi de ECFS. Este paso de lavado se repitió y las células fueron resuspendidas nuevamente en ECFS en una concentración de 2x106 células/ml.
La fusión electro-celular fue llevada a cabo mediante un generador de fusión, modelo ECM2001, Genetronic, Inc., San Diego, CA. El tamaño de la cámara de fusión fue 2.0 mi, y se uso el siguiente reglaje de instrumentos: Alineación de las condiciones: voltaje: 50 V, tiempo: 50 segunmdos: rompimiento de la membrana: voltaje: 3000 V, tiempo: 30 segundos; tiempo de mantenimiento post-fusion: 3 segundos.
Después de ECF, las suspensiones celulares fueron eliminadas de la cámara de fusión bajo condiciones estériles y transferidas a un tubo estéril que contiene el mismo volumen del Medio de la Cultura de Hibridoma (DMEM (JRH Biosciences) , 15 % FBS (Hyclone) , suplementada con L-glutamina, pen/strep, OPI (oxaloacetato, piruvato, insulin bovina) (todos a partir de Sigma) y IL-6 (Boehringer Mannheim) . Las células fueron incubadas por 15 a 30 minutos a una temperatura de 37 °C, y porsteriormente centrifugadas a 400 g por cinco minutes. Las células fueron suavemente resuspendidas en un volumen pequeño de Medio de Selección de Hibridoma (Medio de Cultura de Hibridoma suplementado con 0.5x HA (Sigma, Cat. No. A9666)), y el volume fue ajustado adecuadamente con mas Medio de Selección de Hibridoma, basada en un enchapado final de 5x106 células B en total por cada placa 96-pozo y 200 µ? por cada pozo. Las células fueron mezcladas suavemente y pipetadas dentro de places 96-pozo y dejados en crecimiento. En el dia 7 o 10, la mitad del medio fue eliminado, y las células fueron re-alimentadas con Medio de Selección de Hibridoma.
EJEMPLO 5 : Selección de anticuerpos candidates por ELISA Después de 14 dias de cultivo, las primera detección de sobrenadantes de hibridoma del cohort #1 (los ratones en el cohorte uno fueron divididos arbitrariamente en fusión #1 y fusion#2) para los anticuerpos específicos HER-3 fue llevado acabo por ELISA usando his-tagged HER-3 ECD purificada y detección contraria contra una proteína his-tagged irrevelante por ELISA usando anti-huIgGFc-HRP de cabra (Caltag Inc., Cat. No. H10507,las concentración en uso fue de una dilución de 1:2000) para detector IgG humano uniendo HER-3 ECD inmovilizado en placas de ELISA. Los sobrenadantes de cultura vieja de las células de hibridoma de crecimiento positivo de los posos, basada en basados en la pantalla principal fueron eliminados y las células HER-3 de hibridoma positivo fueron suspendidos con medio de cultura de hibridomas frescos y fueron transferidos a placas 24-well. después de 2 dias de cultivo, estos sobrenadantes fueron usados para una pantalla de confirmación secundaria. En la pantalla de confirmación secundaria para la HER-3 especifica IgGr anticuerpos completamente humanos, los positives en la - - primera detección fueron detectados por ELISA con dos sets de anticuerpos detectores: anti-huIgGFc-HRP de cabra (Caltag Inc., Cat. No. H10507, usando una dilución al 1:2000) para la detección de la cadena gama humana, y anti-hlg kappa-HRP de cabra (Southern Biotechnology, Cat. No. 2060-05) para la detección de la cadena kappa clara humana. A partir del cohorte #1, 91 anticuerpos monoclonales IgG/kappa HER-3 específicos completamente humanos fueron generados.
EJEMPLO 6: Selección de Anticuerpos Candidatos por FMAT/FACS Después de 14 dias de cultivo, los sobrenadantes de hibridoma del cohort #3 y #4 (fusión #3 y #4) fueron seleccionados para los anticuerpos monoclonales HER-3 específicos por FMAT. En la pantalla primaria, los sobrenadantes de hibridoma a una dilución final de 1:10 fueron incubados con células Ratl-HER-3 expresando HER-3 humano y 400 ng/ml Cy5-conjugado de cabra F(ab')2 anticuerpo IgG, Fc-específico anti-human (Jackson ImmunoResearch, Cat. No. 109-176-098) a una temperatura ambiente por 6 horas. La unión de anticuerpos y la detección de anticuerpos para las células fueron medidos por FMAT (Applied Biosystems) . La unión no especifica con las células fue determinada por sus uniones con células paternales Ratl. Un total de 420 hibridomas productores de anticuerpos HER-3 específicos, fueron seleccionados de la pantalla primaria de fusión #3. Los sobrenadantes de estas amplias culturas fueron puestas a prueba nuevamente, usando el mismo protocolo FMAT, y 262 de estos fueron confirmados que se unen específicamente con células expresadoras HER-3. Un total de 193 hibridomas productores de anticuerpos HER-3 específicos, fueron seleccionados de la pantalla primaria de la fusión #4. Los sobrenadantes de estas amplias culturas fueron puestos a prueba por FACS, y 138 de estos fueron confirmados que se unen específicamente a células expresadoras HER-3. En el ensayo de confirmación de FACS, células Ratl-XHER-3 y células paternales Ratl (como control negativo) fueron incubadas con sobrenadantes de hibridoma a dilución de 1:2 por 1 hora a una temperature 40°C en PBS que contiene 2 % FBS. Seguido de un lavado con PBS, la unión anticuerpos con las células fue detectado por 2.5 µg/ml Cy5-conjugado de cabra F(ab')2 anticuerpo IgG, Fc-específico anti-humano (JIR#109-176-098) y 5 µ?/ l PE-conjugated Goat F(ab')2 anticuerpo kappa-específico anti-human (SB# 2063-09) . después de remover anticuerpos no unidos por medio del lavado con PBS, las células fueron fijadas por cytofix (BD# 51-2090KZ) en una dilución de 1:4 y analizado por FACSCalibur.
EJEMPLO 7: Selección de Hibridomas para Clonar Los anticuerpos de la cohorte # 1 fueron seleccionados para clonación de hibridomas basada en la especificidad de HER-3 sobre HERI (EGF-R) , HER-2 y HER-4 en ELISA usando dominios extracelular de recombinante purificados (disponible en, por ejemplo, la R&D Biosystems, Minneapolis, MN) , el análisis basado en FACS en líneas celulares tumorales humanas que expresan diferentes miembros de la familia HER, y un aumento de más de 5 veces en la intensidad de fluorescencia media en FACS tinción para células HER-3 positivas sobre el fondo. Con base en estos criterios, un total de 23 lineas de hibridoma fueron seleccionados para la clonación mediante la limitación de dilución de células en las placas.
Los anticuerpos de los cohortes 3 y 4 fueron seleccionados para clonación de hibridomas basada en la especificidad de HER-3 sobre el HER-1 (EGF-R) , HER-2 y HER-4 mas otros tres criterios. El primer criterio era una pantalla de ELISA para anticuerpos con epitoposcontenidos en el dominio L2 de HER-3 (ver ejemplo 8) .
El segundo criterio fue la neutralización de la unión de biotina heregulin-alfa con células que expresan HER-3 en un ensayo basado en FACS. Células SKBR-3 fueron cosechadas, lavadas en medio de cultivo, granulado a través de centrifugación y resuspendidas en medio de cultivo. Las células resuspendidas fueron alicuotadas en placas de 96 pozos. Las placas fueron centrifugadas para sedimentar las células. Anticuerpos de prueba fueron agregados en sobrenadantes de hibridomas de escape a 25 µ?/???? y fueron incubados durante 1 hora en el hielo para permitir la unión de los anticuerpos. Cincuenta µ? de una solución de herlegulina-alfa de 10 nM (R&D Biosystems) fue añadida a cada pozo para una concentración final de 5 nM he incubados en hielo durante 1,5 hora. Las células fueron lavadas en 150 µ? de PBS, sedimentadas por medio de centrifugación y el sobrenadante fue eliminado. Las células fueron resuspendidas en 50 µ? de anticuerpos anti-HRG-alfa policlonal de cabra a - - 10 mg / mi he incubado durante 45 minutos en hielo. Las células fueron lavadas en 200 µ? de PBS, sedimentadas por medio de centrifugación y el sobrenadante fue removido. Cincuenta µ? de una solución de anticuerpos policlonales anti-cabra con etiqueta Cy5 de conejo a 5 mg / mi mas 7AAD a 10 mg / mi fue agregada he incubada en hielo durante 15 minutos. Las células fueron lavadas en 200 µ? de PBS, sedimentadas por medio de centrifugación y el sobrenadante fue eliminado. Las células feuron resuspendidas en 100 µ? de amortiguador de FACS y leídas en FACS. Anticuerpos HER-3 de prueba que redujeron la unión de herlegulina-alfa fueron los que tuvieron la menor intensidad de fluorescencia. Como controles positivos fueron usados, soluciones seriadas de 1:5 de 10.000 ng / mi a 16 ng / mi de HER-3 mAb de un ratón (105,5) o el IgGl HER-3 mAb, Ul-49 humano. Los controles negativos fueron herlegulina-alfa solitario, células solitarias, anticuerpo policlonal anti-alfa-herlegulina de cabra solitario y anticuerpo policlonal anti-cabra de conejo marcado Cy5 solitario.
El tercer criterio es el ranking relativo de afinidad y / o mayor intensidad relativa de fluorescencia media en FACS usando líneas de células expresadorar de HER-3. El ranking relativo para la afinidad se realizó mediante la normalización de las concentraciones de anticuerpos HER-3-específicos y el trazado frente a los datos de limitación de pruebas ELISA de la siguiente manera.
La normalización de las concentraciones del antigeno especifico de anticuerpos usando antigeno alto de ELISA: Por medio de un método de ELISA, los sobrenadantes para la concentración del antigeno especifico de anticuerpos fueron normalizados. Usando dos anticuerpos anti-HER-3 IgGl humanos del cohorte 1 de concentración conocida se titula en paralelo, una curva estándar fue generada y la cantidad de antigeno especifico de anticuerpos en los sobrenadantes del hibridoma de prueba de los cohortes 3 y 4 fueron comparados con la norma. De esta manera, la concentración de anticuerpos humanos HER-3 IgG en cada cultura de hibridoma fue estimada.
Placas neutravidin fueron hechas mediante el recubrimiento de neutravidin a 8 µg/ml en azida de sodio IXPBS/O.05% en placas de unión de medio Costar 3368 a 50 µ?/por pozo y con la incubación durante una noche a una temperatura de 4 0 C. Al dia siguiente, las placas fueron bloqueadas con 1XPBS / 1% de leche desnatada. Photobiotinylated his-tagged-HER-3 ECD a 500 ng/ml en 1XPBS/1% de leche desnatada fue unido con las placas de neutravidin a través de incubación durante 1 hora a temperatura ambiente. El sobrenadante del hibridoma, diluido en serie a 1:2,5 a partir de una dilución inicial de 1:31 a una dilución final de 1:7568 inlXPBS/1% leche descremada/0.05% azida,, se agregó a 50 µ?/???? y posteriormente fue incubada durante 20 horas a temperatura ambiente. Diluciones seriadas fueron utilizados para asegurar la obtención de lecturas de OD para cada desconocido en el rango lineal del ensayo. A continuación, un anticuerpo d detección secundaria, IgG Fe HRP anti humano de cabra a 400 ng / mi en 1XPBX / 1% de leche desnatada se ha añadido a 50 µ?/????. Después de 1 hora a temperatura ambiente, las placas se lavaron de nuevo cinco veces con agua y 50 µ 1 de sustrato de TMB de un solo componente fueron añadidos a cada pocilio. La reacción se detuvo después de 30 minutos por la adición de 50 µ? 1M de ácido clorhídrico a cada pocilio y las placas se leyeron a 450 nm de longitud de onda. Una curva estándar fue generada a partir de los dos IgGl HER-3 mAbs de la cohorte # 1, diluido en serie a 1:2 a partir de 1000 ng / mi a 0,06 ng / mi y evaluado en ELISA utilizando el protocolo anterior. Para cada desconocido, lecturas de OD en el rango lineal del ensayo se utilizaron para estimar la concentración de HER-3 IgG humano en cada muestra.
El análisis limitado de antigenos es un método que con afinidad clasifica a los antigenos específicos de anticuerpos preparados en sobrenadantes de cultivos celulares de tipo B en relación con todos los otros antigenos específicos de anticuerpos. En presencia de una capa muy baja de antígenos, solo la más alta afinidad de los anticuerpos debe ser capaz de obligar a todos los niveles detectables al equilibrio, (ver, e.g., PCT Publication No. WO/03048730A2) . En este caso, dos mAbs de la cohorte # 1, ambos de concentraciones conocidas y D conocido, fueron utilizados como puntos de referencia en el ensayo.
Las placas de neutravidin fueron hechas mediante el recubrimiento de neutravidin a 8 ug/ml en azida de sodio - - IXPBS/O.05% en placas de unión media Costar 3368 50 µ 1 /pozo con incubación durante una noche a una temperatura de 4 ° C. Al día siguiente, las placas fueron bloqueadas con 1XPBS / 1% de leche desnatada. Biotinylated his-tagged-HER-3 ECD (50 µ?/well) fue destinado a placas de neutravidin 96-pozo en cinco concentraciones: 125, 62.5, 31.2, 15.6 y 7.8 ng / mi en 1XPBS / 1% de leche desnatada por 1 hora a temperatura ambiente. Cada placa fue lavada cinco veces con agua. Sobrenadantes de hibridoma diluidos a 1:31 en 1XPBS / 1% de leche descremada /O.05% azida fueron agregados a 50 ul /pozo. Después de 20 horas de incubación a temperatura ambiente en un agitador, las placas se lavaron de nuevo cinco veces con dH20. A continuación, un anticuerpo de detección secundario, IgG Fe HRP anti humano de cabra (Horse Radish Peroxidase) a 400 ng / mi en 1XPBS / 1% de leche desnatada se ha añadido a 50 µ?/well. Después de 1 hora a temperatura ambiente, las placas se lavaron de nuevo cinco veces con dH20 y 50 µ L de sustrato TMB de un solo componente fueron añadidos a cada pozo. La reacción se detuvo después de 30 minutos mediante la adición de 50 µ 1 de ácido clorhídrico 1 M a cada pocilio y las placas se leyeron a una longitud de onda de 450 nm. Las lecturas de OD de una concentración de antígenos que produjo valores de OD en el rango lineal se utilizaron en el análisis de datos.
[0001] Graficando los datos del antígeno de alta (que comparativamente calcula las concentraciones de anticuerpos específicos, véase más arriba para más detalles) contra el antígeno limitado OD ilustrado que es relativamente más alto de anticuerpos de afinidad, por ejemplo, aquellos que se - - unieron tuvieron OD mas alto en el ensayo del antigeno limitado a la vez que se tiene menores cantidades de anticuerpos IgG HER-3 en el sobrenadante. Los hibridomas de las cohortes # 3 y # 4 para los 33 anticuerpos de mejor realización en estas series de ensayos fueron adelantados a la clonación mediante la dilución de limitación de hibridomas en las placas.
Por otra parte, el análisis de FACS de expresión del HER-3 expresión de células of Ratl/pLXSN and RatI/HER-3 mostraron resultados similares (sin reactividad cruzada con epitoposendógenos de ratón) . En detalle, 1x105 células fueron cosechadas con 10 mM EDTA en PBS, lavadas una vez con amortiguador de FACS (PBS, 3 % FCS, 0.4 % azida) y sembradas en un plato de fondo redondo 96-well. Las células se giraron durante 3 minutos a 1000 rpm para eliminar el sobrenadante y posteriormente resuspendidas con los anticuerpos específicos de la familia HER (3 pg/ml) . Suspensiones celulares fueron incubadas en hielo durante 45 minutos, lavadas dos veces con un amortiguador de FACS y resuspendidas con el anticuerpo secundario (100 µ?/well) donkey-anti-human-PE (Jackson Immunoresearch, PA) diluido a 1:50 en un amortiguador de FACS. Las suspensiones de células fueron incubadas en hielo y en la oscuridad durante 30 minutos, lavadas dos veces con un amortiguador de FACS y analizadas (FACS, Beckman Coulter) .
EJEMPLO 8: Análisis Estructural de Anticuerpos anti HER-3 La siguiente discusión proporciona información estructural relacionado con anticuerpos preparados como se describe en este documento. Con el fin de analizar las estructuras de los anticuerpos, genes que codifican los fragmentos de las cadenas pesadas y ligeras fueron amplificados por el hibridoma particular. La secuenciación se llevó a cabo de la siguiente manera: Las transcripciones VH y VL fueron amplificados a partir de clones de hibridoma individuales en una placa 95-pozo utilizando la reacción en cadena de polimerasa transcriptasa reversa (RT-PCR) . Poly (A) +-mRNA fue aislado de aproximadamente 2x105 células de hibridoma utilizando un kit de Via Rápida (Fast-Track kit) (Invitrogen) . Cuatro reacciones de PCR se llevaron a cabo para cada hibridoma: dos para la cadena ligera (kappa (?) , y dos para la cadena pesada gamma (?) .El OneStep QIAGEN temperatura ambiente-PCR kit se utilizó para la amplificación (Qiagen, Catalog No.210212). En la sala de junta las reacciones de temperatura de PCR, los ADNc fueron sintetizados con mezcla de enzimas a temperatura ambiente (Omniscript and Sensiscript) utilizando cebadores específicos de secuencia antisentido correspondiente al C-K, o a un consenso de las regiones CH1 de los genes Cy. La transcripción inversa fue realizada a una temperatura de 50 ° C durante 1 hora seguida por la amplificación por PCR del cDNA por la polimerasa HotStarTaq DNA de alta especificidad y sensibilidad. Cada reacción de PCR utilizo una mezcla de cebadores de 5' -sentido; secuencias de cebadores se basaron en las secuencias líder de VH and VK disponible en el Vbase website ( http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/) .
Las reacciones de PCR se realizaron a una temperatura de 94° C durante 15 minutos, una marcha inicial caliente seguido de 40 ciclos de 94° C de temperatura durante 30 segundos (desnaturalización) , 60 ° C de temperatura durante 30 segundos (hibridación) y 72 ° C de temperatura durante 1 minuto (elongación) .
Los productos de PCR fueron purificados y secuenciados directamente con iniciador reverso y hacia adelante de PCR utilizando el ciclo de terminación ABI PRISM BigDye secuenciando la reacción lista de Kit (Perkin Elmer) . Ambas lineas fueron secuenciadas utilizando Prism dye-terminator sequencing kits y una máquina de secuenciación ABI 377.
El análisis de secuencia: Los análisis de las secuencias V pesado y V kappa del cDNA humano de los anticuerpos HER-3 fueron logrados mediante la alineación de las secuencias HER-3 con secuencias V heavy and V kappa humana usando un software Abgenix in-house (5AS) . El software identifica el uso de los genes V, de los genes D y de los genes J, asi como la inserción de nucleótidos en las uniones de recombinación y mutaciones somáticas. Secuencias de aminoácidos fueron generadas también in silico para identificar las mutaciones somáticas. Resultados similares podrían ser obtenidos con softwares de análisis de secuencias comercialmente disponibles y con información a disposición del público acerca de la secuencia de los genes humanos V, D, J, por ejemplo, Vbase (http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/).
Clonación molecular de mAb Ul-59: El ARN total fue extraído del cultivo de tejidos que contiene múltiples linajes de hibridomas, incluyendo el linaje de hibridomas secretores de anticuerpos Ul-59. Una región variable de la cadena pesada fue amplificada utilizando cebadores 5 '-líder de la familia VH específicos, con un cebador 3'-C-gamma. Un grupo importante fue amplificado usando un cebador VH4, ningún otro grupos fueron visibles. El fragmento gamma VH4-34 fue clonado en el vector de expresión pCDNA en el marco con gen humano gamma 1 de la región constante.
Una región variable de IgM de cadena pesada fue amplificada utilizando cebadores 5' VH específicos de familia con cebadores 3' mu de región constante. Un grupo importante fue amplificado utilizando cebadores VH2, ningún otro grupo fue visible. El fragmento VH2-5 mu fue clonado en el vector de expresión pCDNA en el marco con un gen humano mu de región constante . Las cadenas V kappa fueron amplificadas y secuenciadas . Cuatro productos kappa de cadenas RT-PCR fueron identificadas. Los productos fueron secuenciados y después del análisis de secuencia a través de la traducción in silico, sólo tres de ellos tenían marcos abiertos de lectura. Estas tres cadenas funcionales kappa fueron clonadas fuera del oligoclonales Ul-59 hibridoma bien definidos en función del uso del gen kappa V como (1) VK1 A3-JK2, (2) VK1 A20-JK3 y (3) B3 JK1. Todos los V-kappa fueron clonados en un vector de expresión pCDNA en el marco con un gen humano de región constante de cadena ligera kappa.
Transfecciones : Cada cadena pesada fue transfectada con cada una de las cadenas kappa en Transíecciones transitorias para un total de 6 pares de cadena pesada /cadena ligera kappa. La transfección de la cadena gamma con la cadena kappa A20 dio una pobre expresión de anticuerpos, mientras que no anticuerpo alguno fue segregado o detectado cuando la cadena kappa A20 fue co-transfectada con la cadena mu. Un total de tres sopas de IgG y dos sopas de IgM se hallaron disponibles para la unión de ensayo de HER-3.
La actividad de enlace de HER-3 + líneas celular fue detectada en FACS con el IgGl mAb que consiste de la cadena VH4-34 y la cadena kappa B3. Ninguna otra conbinacion VH/Vk dio señal de fluorescencia por encima del fondo en FACS utilizando HER-3 + líneas de células.
Competencia de Enlace de anticuerpos anti-HER -3; Unión de anticuerpos competitivos multiplexados fue realizada como - - se publicó en Jia et al. (2004) J Immunol Methods. 288, 91-98 para evaluar las agrupaciones de anticuerpos HER-3 que compitieron por la unión con HER-3. Una vez probados los anticuerpos HER-3 de la cohorte 1 agrupados en 5 compartimentos basado en la competencia por la unión.
Caracterización de epitopo de anticuerpos anti-HER-3: Los epitopos de los anticuerpos humanos anti-HER-3 fueron caracterizados. En primer lugar un análisis dot blot de la reducida, desnaturalizados proteina purificada ECD HER-3-His tagged mostró ausencia de la unión por medio de los anticuerpos testados anti-HER-3 (Ul-59, Ul-61, Ul-41, Ul-46, Ul -53, Ul-43, Ul-44, Ul-47, Ul-52, Ul-40, Ul-49)), demostrando que todos tenían epitopos sensibles a la reducción de los enlaces de disulfuro, lo que sugiere que todos tenían epitopos discontinuos. A continuación, los anticuerpos fueron asignados a los dominios definidos en la molécula HER-3 mediante la ingeniería de diversas moléculas quiméricas humano-roedor HER-3, basado en la división de dominio extracelular HER-3 en cuatro dominios: 1) Ll (DI) : el dominio de unión al ligando de menor importancia, 2) SI (D2): el primer dominio rico en cisteína, 3) L2 (D3) : el dominio principal de unión al ligando, y 4) S2 (D4): el segundo dominio rica en cisteína.
El dominio extracelular (ECO) del cDNA humano HER-3 fue amplificado a partir de células RAT1-HER-3. El cDNA HER-3 de rata fue amplificado por RT-PCR a partir de RNA de un hígado de rata y confirmado por secuenciación . El cDNA que expresa el ECD de HER-3 humano y de rata fue clonado en vectores de expresión de mamíferos como proteínas de fusión V5-His. Dominios del ECD de HER-3 humano fueron intercambiados en el andamio proporcionado por ECD HER-3 de rata mediante el uso de sitios de restricción interna Mfel, BstXl y DralII. De este modo, varias proteínas quiméricas de fusión roedor/humano HER-3 ECD HIS (aminoácidos 1-160, 161-358, 359-575, 1-358, 359-604) fueron construidas y expresadas a través de la transfección transitoria de células HEK 293T. La expresión de las construcciones fue confirmada mediante el uso de un anticuerpo policlonal de rata contra HER-3 humano. - - Los anticuerpos monoclonales humanos fueron probados en ELISA para unirlos a la ECD quimérica secretada.
Dos de los anticuerpos humanos, incluyendo el anticuerpo Ul-59, que entro en reacción cruzada con HER-3 de rata. Para asignar dominios de unión, estos mAbs fueron probados contra una forma truncada de HER-3 que consiste en proteínas purificadas L1-S1-V5 his tagged a partir del sobrenadante de células HEK 293T transíectadas con un plásmido de ADN que codifica la expresión de los dominios extracelulares Ll-Sl de HER-3. mAb Ul-59 unido a la proteína Ll-Sl en ELISA, lo que implica que su epítopo esta en Ll-Sl. mAb 2.5.1 no se unió a la proteína Ll-Sl, lo que implica que su epítopo esta en L2-S2. Una asignación adicional de anticuerpos Ul-59 fue llevada a cabo utilizando el tiempo de SELDI de la espectroscopia de masas de vuelo con digestión on-chip proteolítica de los complejos mAb-HER-3 ECD.
Asignación de Ul-59 epítopes con SELDI: asignación adicional de anticuerpos Ul-59 se llevó a cabo utilizando un tiempo de SELDI de la espectroscopia de masas de vuelo con digestión on-chip proteolítica de complejos mAb-HER-3 ECD. La proteína A fue unida covalentemente a una matriz de proteína PS20 y fue utilizada para la captura de mAb Ul-59. A continuación, el complejo de la proteína PS20 y el anticuerpo monoclonal fue incubado con antigenos purificados HER-3-His. A continuación, el complejo antígeno-anticuerpo fue digerido con una alta concentración de Asp-N. El chip fue lavado, lo - - que resulta en la retención de sólo el peptido de HER-3 unido al anticuerpo en el chip. El epítopo fue determinado por SELDI e identificado por la masa del fragmento. El fragmento identificado 6814D corresponde a dos péptidos posiblemente esperados generados a partir de una digestión parcial del ECD HER-3-his. Ambos péptidos superpuestos asignados para el dominio SI. Mediante el acoplamiento de los resultados SELDI con el enlace a un HER-3 supresión construir, el epítopo fue asignado a los residuos de 251 a 325.
La ubicación de los dominios de unión en la parte extracelular de HER-3 que son reconocidos por el anti-HER-3 mAbs humano se resumen en la Tabla . Los resultados del asignamiento de dominios de epitopos fueron consistentes con los resultados de los contenedores de competencia de unión de anticuerpos competencia, con los anticuerpos que contra-compitieron entre sí para unirse a HER-3 también asignando a los mismos dominios de HER-3.
- - TABLA 4 Un resumen de dominios de unión mAb basado en los resultados del ensayo ELISA XR = reacción cruzada EJEMPLO 9: Determinación de las clases Canónica de anticuerpos La estructura del anticuerpo ha sido descrita en términos de "clases canónica" para las regiones hipervariables de cada cadena de inmunoglobulina (Chothia et al. (1987) J. Mol. Biol. 196:901-17). Las estructuras atómicas de los fragmentos Fab y VL de una variedad de inmunoglobulinas fueron analizados para determinar la relación entre sus secuencias de aminoácidos y las estructuras tridimensionales de sus sitios de unión al antigeno. Chothia, et al. encontró que habían relativamente pocos residuos que, a través de su embalaje, puentes de hidrógeno o la capacidad de asumir phi inusual, psi o conformaciones omega, fueron los principales responsables de las conformaciones de la cadena principal de las regiones hipervariables. Estos residuos se encontró que se producen en los sitios dentro de las regiones hipervariables y en el marco conservado ß-sheet. Mediante el examen de secuencias de inmunoglobulinas que tienen estructura desconocida, Chothia, et al. Muestran que muchas inmunoglobulinas tiene regiones hipervariables que son similares en tamaño a una de las estructuras conocidas y, además, contenía residuos idénticos en los sitios responsables de la conformación observada.
Su descubrimiento implica que estas regiones hipervariables tienen conformaciones cercanas a las de las estructuras conocidas. Para cinco de las regiones hipervariables, el repertorio de las conformaciones parecía limitarse a un número relativamente pequeño de clases estructurales discretas. Estas conformaciones ocurren - - comúnmente principales de la cadena de las regiones hipervariables fueron denominadas "estructuras canónicas." Investigaciones posteriores por Chothia et al. (Nature (1989) 342:877-83) y otros (Martin et al. (1996) J. Mol. Biol.. 263:800-15) confirmó que hay un pequeño repertorio de las conformaciones de la cadena principal de al menos cinco de las seis regiones hipervariables de los anticuerpos.
Los CDR de cada anticuerpo anteriormente descritos han sido analizadas para determinar su clase canónica. Como se sabe, las clases canónica sólo han sido asignadas para CDR1 y CDR2 de la cadena pesada del anticuerpo, junto con CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena ligera del anticuerpo. Los siguientes cuadros resumen los resultados de los análisis. Los datos de la clase canónica está en la forma de HCDR1-HCDR2-LCDR1-LCDR2-LCDR3, en donde "HCDR" se refiere a los CDR de la cadena pesada y "LCDR" se refiere a los CDR de la cadena ligera. Asi, por ejemplo, una clase canónica de 1-3-2-1-5 se refiere a un anticuerpo que tiene un HCDR1 que cae en la clase canónica 1, un HCDR2 que cae en la clase canónica 3, un LCDR1 que cae en la clase canónica 2 , un LCDR2 que cae en la clase canónica 1, y un LCDR3 que cae en la clase canónica 5 Asignaciones fueron realizadas a una clase particular canónica donde habla un 70% o más la identidad de los aminoácidos en el anticuerpo con los aminoácidos definidos para cada clase canónica. Los aminoácidos definidos por cada anticuerpo se pueden encontrar, por ejemplo, en los artículos de Chothia, et al. que se refiere el párrafo anterior. Las tablas 5 y 6 los reportan los datos de la clase canónico para cada uno de los HER-3 anticuerpos. Donde había menos de 70% de identidad, la asignación de clase canónica está marcada con un asterisco ("*") para indicar que la mejor estimación de la clase canónica adecuada se hizo, con base en la longitud de cada CDR y la totalidad de los datos . Donde no había clase con la misma longitud de CDR, la asignación de clase canónica está marcada con una letra y un número como por ejemplo "S18", es decir, el CDR es de tamaño 18. Cuando no había datos de la secuencia para una de las cadenas pesadas o ligeras, la clase canónica está marcada con "Z".
- - TABLA 5 - - El CUADRO 6 se presenta un análisis del número de anticuerpos por clase. El número de anticuerpos que tienen la clase particular canónica designada en la columna de la izquierda se muestra en la columna de la derecha. Los cuatro mAbs que carecen de una secuencia de datos de la cadena y por lo tanto tienen la "Z" en la misión canónica no están incluidos en este conteo.
La estructura más común es 3-1-2-1-1: Veinte y uno de los cuarenta y un mAbs que reúnen las dos secuencias de la cadena pesada y ligera tuvieron esta combinación.
- - TABLA 6 EJEMPLO 10: Determinación de la afinidad de los anticuerpos Las mediciones de la afinidad de anti-HER-3 anticuerpos se realizaron por análisis de Scatchard indirecta FACS. Por lo tanto, 105 células de interés o SK-Br-3 células fueron cosechadas con 10 mM EDTA en PBS, se lava una vez con amortiguador FACS (PBS, FCS 3%, 0,4% de azida) y sin semillas en un plato redondo 96-pozo fondo. Las células se giraron durante 3 min a 1000 rpm para eliminar el sobrenadante y se resuspendieron con cc-HER-3 de anticuerpos (3 µg / mi) o con las diluciones de anticuerpos (100 µ? / well), comenzando con 20 mcg / mi de anticuerpos monoclonales humanos en amortiguador FACS, se diluyó en 1:02 pasos de dilución. Las suspensiones celulares se incubaron en hielo durante 1 hora, se lavó dos veces con amortiguador FACS y se resuspendió con el anticuerpo secundario (100 µ?/well) donkey-anti-human-PE ( Jackson) 01:50 diluido en amortiguador FACS. Las suspensiones de células se incubaron en hielo y en la oscuridad durante 30 min, se lavaron dos veces con amortiguador FACS y analizado (FACS, Beckman Coulter) . De acuerdo con el análisis de Scatchard FACS, la media de fluorescencia se calculó para cada medición. Tinción de fondo (= sin primero anticuerpos) se resta de cada media de fluorescencia. La representación de Scatchard con valor x = media de fluorescencia y valor de y = media de fluorescencia o concentración de anticuerpos monoclonales (nm) se ha generado. El KD se tomó como el valor absoluto de 1 / m de la ecuación lineal. mediciones de la afinidad de ciertos anticuerpos seleccionados de esta manera se proporcionan en TABLA 7 Clon KD (nm) Ul-38 n.d.
Ul-39 102 Ul-40 6.7 Ul-41 0.18 Ul-42 n.d.
Ul-43 0.57 - - Clon KD (nm) _____ _ Ul-52 16.8 Ul-61 0.13 Ul-62 20.4 Ul-46 13.8 Ul-47 9.38 Ul-49 1 Ul-50 39.3 Ul-51 131.6 Ul-53 0.082 Ul-55.1 3.7 Ul-58 6.4 Ul-59 3.69 Ul-24 0.06 Ul-7 0.02 - - EJEMPLO 11: Anticuerpos Anti HER-3 inducen Endocitosis de receptores de HER-3 HER-3 ha sido identificado como un factor que puede influir en la iniciación y progresión de las enfermedades hiperproliferativas mediante la actuación como un guardián importante de la célula de señalización media de la familia HER. Por lo tanto, si HER-3 es efectivamente retirado de la superficie/membrana de la célula por la internalización del receptor, la señalización celular y por lo tanto la transformación y / o mantenimiento de las células de tumor maligno puede ser en última instancia, disminuida o suprimida .
Con el fin de investigar si los anti-HER-3 anticuerpos son capaces de inducir la Endocitosis acelerada de HER-3, la cantidad relativa de las HER-3 moléculas en la superficie celular después de 0,5 y 4 horas de incubación de las células con anticuerpos anti-HER -3 fueron comparados. 3x105 células fueron sembradas en un medio de crecimiento normal en el plato 24-pozo y dejado crecer durante la noche. Las células fueron pre incubadas con 10 µg/ml de anti-HER-3 mAbs en medio de crecimiento normal para los tiempos indicados a una temperatura de 37° C. Las células fueron separadas con 10 mM EDTA e incubadas a 10 µg/ml de anti-HER-3 mAbs en amortiguador de lavado (PBS, FCS 3%, 0.04% de azida) por 45 min a una temperatura de 4o C. Las células fueron lavadas dos veces con amortiguador de lavado, se incuban con el anticuerpo secundario donkey-anti-human-PE (Jackson) diluido 1:100 durante 45 min a una temperatura de 4°C, se lavaron dos veces con amortiguador de lavado y analizados por FACS (BeckmanCoulter, la EXPO) . La internalización por ciento se calculó con base en la reducción de la intensidad de fluorescencia media de muestras anti-HER-3 tratadas con respecto a las muestras tratadas de control. Estos experimentos demostraron que el tratamiento de células con anticuerpos anti-HER-3 llevó a la internalización del receptor. Véase, Figura 5 de EE.UU. publicación N° 20080124345, incorporada en este documento por referencia.
EJEMPLO 12; Inhibición de la unión del ligando de las células cancerígenas humanas SKBR3 por anticuerpos Anti-HER-3 Experimentos de competición radioligandos se realizaron con el fin de cuantificar la capacidad de los anti-HER-3 anticuerpos para inhibir la unión del ligando con HER-3 en un ensayo basado en células. Por lo tanto, el ensayo de la HER-3 de unión al receptor se realizó con 4x105 células SK-BR-3 las cuales fueron incubadas con diferentes concentraciones de anticuerpos durante 30 minutos en hielo. 1.25 nM
[1125] - oc-HRG / [125I]-p-HRG se añadieron a cada pocilio y se continuó la incubación durante 2 horas en el hielo. Las placas se lavaron cinco veces, se secaron al aire y se contaron en un contador de centelleo. Los anticuerpos fueron capaces de reducir específicamente la unión de
[1251] -a-HRG /
[1251] -ß-HRG a las células que expresan endógena HER-3. Véase, Figuras 6a-6e de EE.UU. publicación N° 20080124345, incorporada en el documento aquí por referencia.
EJEMPLO 13: Inhibición de la fosforilación HER-3 inducida por ligando por los anticuerpos humanos HER-3 Experimentos ELISA se realizaron con el fin de investigar si los anticuerpos son capaces de bloquear la activación ligando ß-HRG-mediada de HER-3. LA activación de HER-3 mediada por ligando fue detectada por aumento de la fosforilación del receptor de la tirosina.
Día 1: 1 x plato 96-pozo y se revistió con 20 mg / mi de colágeno I en 0,1 M de ácido acético durante 4 horas a una temperatura 37 0 C. 2.5x105 células fueron sembradas en un medio de crecimiento normal Dia 2: Las células fueron no alimentadas en 100 µ? de suero libre durante 24 hr.
Dia 3: Las células fueron pre incubadas con 10 mg / mi anti-HER-3 mAbs durante 1 hora a una temperatura de 37 0 C y luego tratados con 30 ng /mi de dominio de ß-HRG-EGF (R & D Systems) durante 10 minutos. El medio fue sacado y las células fueron fijadas con solución de formaldehido al 4% en PBS durante 1 hora a temperatura ambiente. La solución de formaldehido fue removido y las células fueron lavadas con buffer de lavado (PBS/0.1% de Tween 20). Las células fueron apagadas con el 1% de H202, 0.1% NaN3 en buffer de lavado y se incubó durante 20 min a temperatura ambiente, posteriormente fueron bloqueadas con NET-Gelantina durante 5 horas a una temperatura de 4 0 C. Un anticuerpo primario de fosfato -HER-3 (Tyrl289) (policlonal de conejo; Señalización celular # 4791, 1:300) se añadió por toda la noche a una temperatura de o C.
- - Dia 4: La placa se lavó 3 veces con buffer de lavado, se incubó con anti-conej o-POD diluida a 1:3000 en PBS - 0,5% BSA se añadió a cada pocilio y se incubo durante 1,5 horas a temperatura ambiente. La placa se lavó 3 veces con buffer de lavado y una vez con PBS. Tetrametilbenzidina (TMB, Calbiochem) fue agregada y monitoreada a 650 nm. La reacción se detiene mediante la adición de 100 µ? HC1 250 nm y la absorbancia fue leida a 450 nm con una longitud de onda de referencia de 650 nm utilizando un lector de placas de Vmax (Thermo Laboratorio de Sistemas) .
Estos experimentos demostraron que los anti-HER-3 anticuerpos fueron capaces de reducir la activación de HER-3 mediada de ligando según lo indicado por la fosforilación de la tirosina del receptor de disminución. Véase, Figura 7a de EE.UU. publicación N° 20080124345, que se incorpora en el presente documento por referencia.
Para probar la potencia de mAb Ul-53 para inhibir la activación de HER-3 inducida de ligando, células MCF-7 fueron sacrificadas de hambre durante 24 horas, se incubaron con el anticuerpo monoclonal Ul-53 durante 1 hora a una temperatura de 37 0 C y estimuladas con 10 nM HRG- ß durante 10 minutos. Lisados fueron trasladados a placas de ELISA 1B4 (ratón anti-HER-3 MAB) y la fosforilación de HER-3 se analizó con el anticuerpo 4G10. La fosforilación de HER-3 fue casi completamente inhibida de una manera de dependencia de la dosis con una IC50 de 0.14 nM. Véase, Figura 7b de EE.UU. publicación N° 20080124345, incorporada aquí por referencia.
EJEMPLO 14: Inhibición de la fosforilación de quinasa p42/p44 MAP inducida por ligando por el anticuerpo humano anti-HER-3 Después de ELISA se realizaron experimentos con el fin de investigar si los anticuerpos son capaces de bloquear la activación mediada por ligando ß-HRG de quinasa p42/p44 MAP.La activación HER-3 mediada por ligando fue detectada por aumento de fosforilación de proteínas (Thr202/Tyr20 ) .
Día 1: 1 x plato 96-pozo fue revestido con 20 pg/ml de colágeno I en 0,1 M de ácido acético durante 4 horas a una temperatura de 37 ° C. 3x105 células fueron sembradas en un medio de crecimiento normal Día 2: Las células fueron sacrificadas de inanición en medio de 100 1 de suero durante 24 horas.
Día 3: Las células se incubaron con 5 mg / mi de anti-HER-3 mAbs durante 1 hora a una temperatura de 37 ° C y luego tratados con 20 ng /mi de dominio ß-HRG-EGF (R & D Systems) durante 10 minutos. Medio fue sacado y las células fueron fijadas con una solución de formaldehido al 4% en PBS durante 1 hora a temperatura ambiente. La solución de formaldehido fue removida y las células fueron lavadas con buffer de lavado (PBS/0.1% de Tween 20). Las células se apagan con el 1% de H202, 0.1% NaN3 en amortiguador de lavado y se incubó durante 20 min a temperatura ambiente, a continuación, posteriormente bloqueados con BSA PBS/0.5% durante 5 horas a 4o C. Anticuerpo primario phospho-p44/p42 MAP quinasa (Thr202/Tyr20 ) (policlonal de conejo; Señalización celular # 9101; 1:3000) se añadió durante la noche a 4 ° C.
- - Día 5: La placa se lavó 3 veces con buffer de lavado, se incubó con anti-conej o-HRP diluido a 1:5000 en PBS - 0,5% BSA se añadió a cada pocilio y se incubo durante 1,5 horas a temperatura ambiente. La placa se lavó 3 veces con buffer de lavado y una vez con PBS. Tetrametilbenzidina (TMB, Calbiochem) fue agregado y monitoreada a 650 nm. La reacción se detiene mediante la adición de 100 1 HC1 250 nm y la absorbancia se leyó a 450 nm con una longitud de onda de referencia de 650 nm utilizando un lector de placas de Vmax (Thermo Laboratorio de Sistemas) . Estos experimentos revelaron que los anticuerpos fueron capaces de reducir la activación de kinasa p42/p44 MAP mediante por ligando como se indica en la fosforilación disminuido. Véase la figura 8 de los EE.UU. publicación N ° 20080124345, incorpora aquí por referencia.
EJEMPLO 15: La inhibición de la fosforilación de la ß-HRG-inducida fosfo-AKT por anticuerpos humanos anti-HER-3 En el siguiente experimento ELISA se determinó si los anti-HER-3 anticuerpos son capaces de bloquear la activación mediada por ligando de ß-HRG de AKT-quinasa. La activación AKT mediada por ligando fue detectada por la fosforilación proteina crecida (Ser473) .
Día 1: 1 x plato 96-pozo y se revistió con 20 mg / mi de colágeno I en 0,1 M de ácido acético durante 4 horas a 37 0 C. 3x105 células fueron sembradas en un medio de crecimiento normal .
Dia 2: Las células se mueren de inanición en medio de 100 µ? de suero durante 24 horas.
Día 3: Las células se incuba con 5 mg / mi anti-HER-3 Acm durante 1 hora a 37 ° C y luego tratados con 20 ng /mi de dominio de ß-HRG-EGF (R & D Systems) durante 10 minutos. El medio fue sacado y las células fueron fijadas con solución de formaldehido al 4% en PBS durante 1 hora a temperatura ambiente. La solución de formaldehido fue removida y las células fueron lavadas con buffer de lavado (PBS/0.1% de Tween 20). Las células se apagaron con el 1% de H202, 0.1% NaN3 en buffer de lavado y se incubó durante 20 min a temperatura ambiente, a continuación, fueron bloqueadas con BSA PBS/0.5% durante 5 horas a una temperatura de 4 0 C. Anticuerpo primario de fosfo-Akt (Ser473) (policlonal de conejo; Señalización celular # 9217; 1:1000) se añadió durante la noche a una temperatura de 4 0 C.
Día 4: La placa se lavó 3 veces con buffer de lavado, se incubó con anti-conej o-HRP diluido a 1:5000 en PBS-0.5% BSA se añadió a cada pocilio y se incubo durante 1,5 horas a temperatura ambiente. La placa se lavó 3 veces con buffer de lavado y una vez con PBS. Tetrametilbenzidina ( MB, Calbiochem) fue agregado y monitoreada a 650 nm. La reacción se detiene mediante la adición de 100 µ? HC1 250 nm y la absorbancia se leyó a 450 nm con una longitud de onda de referencia de 650 nm utilizando un lector de placas de Vmax (Thermo Laboratorio de Sistemas) . Los anti-HER-3 anticuerpos fueron capaces de reducir AKT ß-HRG mediada según lo indicado por la fosforilación disminuida. Véase la figura 9 de los - - EE.UU. publicación N° 20080124345, incorpora aquí por referencia .
EJEMPLO 16; La inhibición de la proliferación celular MCF7 ot-HRG/^-HRG-mediated por anticuerpos humanos anti-HER-3 Experimentos in vitro se llevaron a cabo con el fin de determinar la capacidad de los anticuerpos para inhibir la proliferación celular estimulado HRG. 2000 MCF7 células fueron sembradas en un medio que contiene FCS en placas 96-pozo durante la noche. Las células se incubaron en cuadruplica con anticuerpos diluidos en un medio con 0,5% de FCS durante 1 hora a una temperatura de 37 ° C. Las células se estimularon con 30 ng / mi de a-o 20 ng / mi de ß-HRG (R & D Systems) , añadiendo ligando directamente a la solución de anticuerpos y se dejaron crecer durante 72 horas. ALAMAREBLUETM (Biosource) fue añadido e incubado a una temperatura de 37 0 C en la oscuridad. Absorbancia fue medida a 590 nm cada 30 minutos. Los datos se tomaron 90 minutos después de la adición de Alamar azul. Estos estudios demostraron que los anticuerpos representantes podrían inhibir el crecimiento celular inducida por HRG en las células de cáncer humano. Véase, Figura 10 de los EE.UU. publicación N ° 20080124345, incorpora aquí por referencia.
EJEMPLO 17: La inhibición de la migración celular MCF7 inducida por ß-HRG por anticuerpos HER-3 humanos Experimentos de Transmigración se realizaron con el fin de investigar si los anticuerpos bloquean la migración de las - - células. MCF7 células en Suero de hambre fueron pre incubadas mediante la adición de la cantidad indicada de anticuerpos a la suspensión de la célula y la incubación de ambos durante 45 min a una temperatura de 37 ° C. 500 µ de suspensión celular 1 (50.000 células) se colocó en la cámara superior de colágeno transwells I-revestido (BD Falcon, 8 µ m de poros) . 750 medianas (MEM, aminoácidos, Na-piruvato, Pen . -strept . , 0,1% de BSA, sin suero fetal bovino) por sí sola o con los ligandos de dominio ß-HRG-EGF (R & D Systems) fueron utilizadas en la cámara inferior. Las células se dejaron migrar durante 8 horas a una temperatura de 37 0 C y se tiñeron con DAPI . Los núcleos teñidos se contaron manualmente; el porcentaje de inhibición se expresó como la inhibición en relación con un anticuerpo de control. Estos experimentos demostraron que, contra el representante de anti-HER-3 anticuerpos podría reducir la migración celular inducida por HRG . Véase, Figura 11 de los EE.UU. publicación N ° 20080124345, incorporada aquí por referencia.
EJEMPLO 18: Ensayo de Formación de Colonia (ensayo de aqar blando) Ensayos de agar blando se llevaron a cabo con el fin de investigar la capacidad de los anti-HER-3 anticuerpos para inhibir el crecimiento de células de anclaje independientes. El ensayo de formación de colonia de agar blando es un estándar en el ensayo in vitro para detectar las células transformadas, ya que sólo estas células transformadas pueden crecer en agar blando. 750 a 2000 células (dependiendo de la linea celular) se pre incubaron con anticuerpos indicados a 10 µ? / mi en medio IMDM (Gibco) durante 30 min y se re suspendió en 0,4% de agar noble Difco. La suspensión celular se sembró en el 0,75% de la capa inferior de agarosa la cual contiene 20% de FCS en cuatro ejemplares en una placa 96-well. Las colonias se dejaron formar durante 14 días, y fueron teñidas con 50 µ? de MTT (0,5 mg / mi en PBS) durante la noche, y contó con un sistema de cámaras Scanalyzer HTS (Lemnatec, uerselen) . Anti-HER-3 anticuerpos fueron capaces de reducir el crecimiento celular independiente de anclaje de la MDA-MB361 y las células NCI-ADR de cáncer de mama, MKN-28 células de cáncer gástrico, HT144 las células del melanoma, carcinoma de células de ovario SKOV3, PPC-1 las células del cáncer de próstata, BX PC3-las células de cáncer de páncreas, las células A431 carcinoma epidermoide y carcinoma de células de los pulmones. Véase, Figuras 12a-12i de EE.UU. publicación N ° 20080124345, incorporadas aquí por referencia.
EJEMPLO 19: Anticuerpos humanos HER-3 inhiben el crecimiento de carcinoma humano de mama en ratones desnudos La eficacia antitumoral de los anticuerpos terapéuticos a menudo es evaluada en estudios de tumores xenoinjerto humanos. En estos estudios, los tumores humanos crecen como xenoinjerto en ratones inmunodeficientes y la eficacia terapéutica se mide por el grado de inhibición del crecimiento tumoral. Con el fin de determinar, si los anti-HER-3 anticuerpos interfieren con el crecimiento del tumor de las células humanas de cáncer de mama en ratones desnudos, 5x106 células T47D fueron implantadas en hembras IRMN de ratones desnudos. Los tumores fueron subcutáneos, y crecieron en la parte posterior del animal. Los tratamientos comenzaron cuando los tumores alcanzaron un volumen medio de 20 mm3, ocho días después de la implantación. Antes del primer tratamiento, los ratones fueron asignados al azar y pruebas estadísticas fueron realizadas para asegurar la uniformidad en el inicio de los volúmenes del tumor (media, mediana y desviación estándar) a través de los grupos de tratamiento. El tratamiento se inició con una dosis de carga de 50 mg / kg seguido de inyecciones de 25 mg / kg una vez por semana mediante inyección intraperitoneal . Un brazo de control recibió doxorrubicina (grado farmacéutico) . Todos los animales fueron suplementados con 0,5 mg / kg / semana de estrógenos inyectados por vía intraperitoneal Los detalles de los grupos de tratamiento se dan en la TABLA 8. Estos estudios demostraron que la administración de anti-HER-3 anticuerpos resultó en la reducción del crecimiento del tumor. Véase, Figura 13 de los EE.UU. publicación N 0 20080124345, incorporada aquí por referencia.
- - TABLE 8 * Tratamiento de doxorubina como se describe en Boven et al., Cáncer Research, 1992.
EJEMPLO 20: Anticuerpos anti-HER-3 humanos inhiben el crecimiento del tumor pancreático humano en ratones SCID Para probar el potencial terapéutico de los anti-HER-3 anticuerpos en otros tipos de tumores sólidos los anti-HER-3 anticuerpos, Ul-53 y de Ul- 59, fueron probados en ratones con derivados de tumores establecidos de las lineas celulares de tumores pancreáticos humanas BxPC3. Como sets de controles de ratones tratados con ya sea el control del vehículo, PBS, o el anticuerpo terapéutico establecido, Erbitux, fueron incluidos. 5x106 células BxPC3 fueron inoculados por via subcutánea, sin Matrigel en ratones CB17 SCID. Ratones portadores de tumores establecidos con un volumen medio de 140mm2 recibieron 50 mg / kg de Ul-53, 59-U1, Erbitux o el volumen equivalente de PBS a través de la inyección intraperitoneal . A partir de entonces los ratones recibieron - - inyecciones de 25 mg / kg una vez por semana durante la duración del estudio.
Ul-53 y Ul-59 redujeron el crecimiento de los tumores de páncreas humanos de una manera citostáticos . Véase, Figura 14 de U.S. publicación N ° 20080124345, incorporada aqui por referencia. Cabe destacar que en este experimento, Ul-53 y Ul de 59 fueron más efectivos que el EGF-R de metas de Erbitux anticuerpos a retrasar el crecimiento del tumor. Estos estudios demostraron la eficacia terapéutica de los anti-HER-3 anticuerpos en comparación con un agente terapéutico de referencia.
EJEMPLO 21: La combinación de anticuerpos humanos anti-HER-3 con anticuerpos anti-EGF-R Aumenta la actividad anti-tumoral La monoterapia de enfermedades hiperproliferativas con anticuerpos específicos es a menudo obstaculizada por problemas tales como, por un lado, el desarrollo de resistencia a las drogas, y por otro lado, un cambio en la antigenicidad. Por ejemplo, la pérdida de antigenicidad después del tratamiento prolongado puede hacer que las células tumorales insensible a anticuerpos terapéuticos, ya que las células tumorales que no expresan o han perdido el antígeno específico tienen una ventaja de crecimiento selectivo. Estos problemas pueden ser eludidos mediante el uso de los anticuerpos en combinación con un anticuerpo terapéutico que se dirige a un receptor diferente en las células tumorales, o cualquier otro agente antineoplásico . Intervenir en múltiples vías de señalización o incluso las - - vías relacionadas, pero en los pasos de intervención múltiple también puede proporcionar un beneficio terapéutico. Estas modalidades de tratamiento combinado es probable que sean más eficaces, porque combinan dos agentes anti-cáncer, cada uno de ellos a través de un mecanismo diferente de acción.
Con el fin de demostrar la viabilidad de los anti-HER-3 anticuerpos Ul-53 y Ul-59 como agentes de combinación adecuada, se compararon las administraciones monoterapia de Ul-53 o de Ul-59 con aquellos en los que o bien Ul-53 o Ul-59 fue combinada con el anticuerpo especifico anti-EGR, Erbitux. 5x106 células BxPC3 fueron inoculados por via subcutánea con Matrigel CB17 en ratones SCID. Después de que los volúmenes tumorales han llegado a 200 mm3, los ratones fueron distribuidos aleatoriamente en los grupos de tratamiento individuales. Administraciones Semanales intraperitoneales de Ul-53, Ul-59 y Erbitux como agente único o una combinación de cualquiera de los anti-HER-3 anticuerpos con Erbitux o como un cóctel de dos anti HER-3 anticuerpos se realizaron. Todos los anticuerpos fueron dosificados a una dosis de carga única de 50 mg / kg / semana, seguida de inyecciones semanales de 25 mg / kg durante seis semanas. Brazos de control recibieron administraciones bi-semanal de gemcitabina (120 mg / kg) , IgG semanales agrupados humanos o (PBS) inyecciones vehículo semanales. Los regímenes se detallan en la Tabla 9 a continuación.
TABLE 9 Los anticuerpos Ul-53 y Ul- 59, cuando se administran como agentes únicos, retrasan el crecimiento de los tumores de páncreas humanos para el mismo grado que la gemcitabina, que se utiliza a menudo como la quimioterapia estándar contra el cáncer de páncreas. La administración conjunta de Erbitux con Ul-53 o Ul -59 resultó en una reducción - - significativamente mayor del crecimiento de tumores que la observada con la administración como agente único de Ul-53, Ul-59 o Erbitux. Por lo tanto, una respuesta terapéutica beneficiosa se puede lograr mediante la combinación de los anti-HER-3 anticuerpos con los anticuerpos adecuados que se dirigen a los antigenos del tumor por separado. Véase la figura 15 de los EE.UU. publicación N ° 20080124345, incorporada aquí por referencia.
En resumen, los anti-HER-3 anticuerpos tuvieron una eficacia terapéutica potente contra los tumores humanos in vivo. Pueden ser eficaces en combinación con otras terapias anti-neoplásicas de mayor actividad antitumoral.
EJEMPLO 22: Anticuerpos humanos HER-3 inhiben el crecimiento de tumores de melanoma humanos en ratones nu/un Los miembros de la familia erbB de los receptores, incluyendo HER-3, son anormalmente expresados en una gran variedad de cánceres epiteliales y se sabe que juegan un papel importante en el crecimiento y la supervivencia de muchos de estos tumores sólidos. Estos tumores son los melanomas, cánceres de cabeza y cuello de células escamosas, el cáncer de células no pequeñas de pulmón y de próstata, el glioma, gástrico, de mama, colorrectal, cáncer de páncreas, de ovario. Con el fin de comprobar que los anti-HER-3 anticuerpos no están restringidos en su actividad contra el cáncer de tipos de tumores individuales, por ejemplo, el cáncer de páncreas (ver Ejemplo 21), pero puede ser utilizado como terapéutica contra muchos tumores HER-3 dependientes, - - hemos probado Ul-53 y Ul-59 en los estudios de xenoinjerto adicionales. Las células humanas de melanoma (5 x 105), HT144, fueron inyectadas por via subcutánea en ratones SCID CB17, seguida de inyecciones intraperitoneales de secuencias inmediatas de 50 mg / kg de Ul-53 y 59-Ul, el volumen equivalente de PBS o Dacarbacin (DITC) a 200 mg / kg. A partir de entonces, los ratones recibieron 25 mg / kg de Ul-53 o Ul-59 una vez por semana, mientras que DITC fue administrada una vez cada dos semanas a 200 mg / kg.
El volumen tumoral promedio de cada grupo de tratamiento fueron calculados. La administración de los anticuerpos resulto en reducción del crecimiento de los melanomas humanos en comparación con los tumores que habían sido tratados con el control del vehículo. Véase, Figura 16 de los EE.UU. publicación N 0 20080124345, incorporada aquí por referencia. Estos resultados demuestran que los anticuerpos no son restringidos en su potencial terapéutico y eligen como blanco una amplia variedad de cánceres HER-3 expresados.
EJEMPLO 23: Anticuerpos humanos anti-HER-3 inhiben el crecimiento de xenoinjertos de carcinoma de colon en ratones Células humanas de carcinoma de colon HT-29 fueron suspendidas en medio con una relación de 2:1 de Matrigel a una concentración final de 10 x 106 células / mi. 0,2 mi de suspensión de células se inyectaron s.c. en el flanco derecho de ratones nu/nu CD1 de 4-5 semanas de edad. Un total de 95 ratones fueron utilizados.
- - Los ratones fueron asignados al azar a los grupos control y tratamiento. El tratamiento se inició el mismo día. La duración del tratamiento fue de 29 días. Al finalizar el estudio, tres tumores por cada grupo se colectaron tres horas después de la administración del tratamiento. Los tumores fueron rápidamente congelados y se mantiene a una temperatura de -80 ° C.
El siguiente protocolo de tratamiento se llevó a cabo: - Grupo control: IgG humana no específicos de 25 mg / kg, dos veces por semana, por vía intraperitoneal - Grupo de Tratamiento: anticuerpos Ul-53, 25 mg / kg, dos veces por semana, por vía intraperitoneal - Grupo de Tratamiento: anticuerpos Ul-7, 25 mg / kg, dos veces por semana, por vía intraperitoneal - Grupo de Tratamiento: anticuerpos Ul-59, 25 mg / kg, dos veces por semana, por vía intraperitoneal - Grupo de tratamiento con 5-FU: 5-fluorouracilo, 50 mg / kg, 9d x 5, intraperitoneal El volumen tumoral promedio de cada grupo fue calculado. La administración de los anticuerpos resulto en una reducción del crecimiento de los tumores de carcinoma de colon HT-29 en comparación con los tumores que habían sido tratados con la IgGl humana no específica. Véase, Figura 17 de los EE.UU. publicación N ° 20080124345, incorporada aquí por referencia.
EJEMPLO 24: Anticuerpos humanos anti-HER-3 inhiben el crecimiento del cáncer de pulmón en ratones Células del cáncer de pulmón humanas Calu-3 en medio con una proporción de 1:1 de Matrigel a una concentración final de 5 x 106 células / mi. 0,05 mi de la suspensión de células se inyectaron s.c. en el flanco derecho, de ratones femeninos CB17 SCID de 9 semanas de edad. Un total de 60 ratones fueron utilizados .
Los ratones fueron seleccionados al azar a los grupos de control y tratamiento. El tratamiento comenzó el mismo dia. La duración del tratamiento fue de 32 dias.
El siguiente protocolo de tratamiento se llevó a cabo: PBS grupo de vehículos -Grupo de control HG: IgG humana no específica: 25 mg / kg, dos veces por semana, por vía intraperitoneal - Grupo de tratamiento de anticuerpos Ul-53, 25 mg / kg, dos veces por semana, por vía intraperitoneal - Grupo de tratamiento de anticuerpos Ul-7, 25 mg / kg, dos veces por semana, por vía intraperitoneal - Grupo de tratamiento de anticuerpos Ul-59, 25 mg / kg, dos veces por semana, por vía intraperitoneal El volumen tumoral medio de cada control y cada grupo de tratamiento fue calculado. La administración de los anticuerpos resulto en una reducción del crecimiento de los xenoinjertos de cáncer humano no microcítico de pulmón en - - comparación con los tumores que habían sido tratados con el control del vehículo PBS o IgG humana no específica. Véase, Figura 18 de los EE.UU. publicación N ° 20080124345, incorporada aquí por referencia.
EJEMPLO 25; Anticuerpos humanos anti-HER-3 inhiben el crecimiento del tumor de páncreas humano en ratones Balb / C Células tumorales pancreáticas humanas BxPC3 se suspendieron en medio con una proporción de 2:1 de Matrigel a una concentración final de 5 x 106 células por mi. 0,2 mi de suspensión de células se inyectaron s.c. en el flanco derecho de ratones femeninos BalbC nu/nu de 5-7 semanas de edad. Un total de 100 ratones fueron utilizados.
Los ratones fueron distribuidos al azar en grupos de control y tratamiento. El tratamiento se inició el mismo día. La duración del tratamiento fue de 27 días.
El siguiente protocolo de tratamiento se llevó a cabo: -Grupo de control hlgG: IgG2 humana no específica, 25 mg / kg, dos veces por semana, por vía intraperitoneal - Grupo de tratamiento de anticuerpos Ul-53, 25 mg / kg, dos veces por semana, por vía intraperitoneal - Grupo de tratamiento de anticuerpos Ul-7, 25 mg / kg, dos veces por semana, por vía intraperitoneal - Grupo de tratamiento de anticuerpos Ul-59, 25 mg / kg semanalmente, por vía intraperitoneal - - - Grupo de tratamiento Gemzar, gemcitabina, 80 mg / kg, cada semana, por vía intraperitoneal El volumen tumoral medio de los controles y el grupo de tratamiento feron calculados. La administración de los anticuerpos resulto en una reducción del crecimiento de los tumores de páncreas humanos en comparación con los tumores que habían sido tratados con IgG humana no específicos o con Gemzar. Véase, Figura 19 de los EE.UU. publicación N ° 20080124345, incorporada aquí por referencia.
La inhibición de HER-3 en los tumores de páncreas humanos también puede ser demostrado en un experimento farmacodinámico. Los xenoinjertos tumorales BxPC3 se cultivaron como se describe anteriormente. 3 ratones fueron tratados con 500 mg de un anticuerpo IgGl de control y tres ratones fueron tratados con 500 mg de anti-HER-3 anticuerpos Ul-59. Los ratones fueron tratados en el día 1 y el día 4 y se sacrificaron el día 5 para medir la inhibición dependiente de anticuerpos de fosforilación HER-3 (PHER-3) .
Los tumores se homogeneizaron en un buffer estándar de RIPA con inhibidores de la proteasa. 50 pg lisado claro fue separado en un gel de Tris-glicinaa al 4.20%, transferido a una membrana de nitrocelulosa y bloqueado con albúmina sérica bovina al 3% (BSA) . La inmunotransferencia se realizó con un anti-PHER-3 anticuerpo (anticuerpo 21D3, la tecnología de señalización de la célula) . Un anticuerpo anti-actina (AB A-2066, Sigma) se utilizó como control.
La expresión se detectó por quimioluminiscencia (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) . Las imágenes fueron - - capturadas con la Versadoc 5000 Imaging System (BioRad, Hercules, CA) . Después de la administración de los antihumanos SU-3-anticuerpos Ul-59, la fosforilación de HER-3 ya no era detectable. Véase, Figura 20 de los EE.UU. publicación N ° 20080124345, incorporada aquí por referencia. Por lo tanto, los anticuerpos fueron capaces de reducir significativamente la activación de HER-3 en las células del tumor de páncreas.
EJEMPLO 26: Ul-59 inhibe el crecimiento tumoral en combinación con un agente de segunda en Estudios Xenoinjerto Modelos de xenoinjerto tumoral Calu-3 CPCNP fueron utilizados para evaluar la eficacia de un anticuerpo anti-HER-3 (Ul-59) , ya sea solo o en combinación con panitumumab o Erlotinib. Para determinar la eficacia in vivo, ratones portadores de ~ 200 mm3 Calu-3 xenoinjertos CPNM fueron tratados dos veces por semana con inhibidores de la familia de los anti-HER o control. Otros experimentos se realizaron con células A549. En los estudios de combinación con panitumumab, IgGl se utilizó como control negativo para Ul-59, e IgG2 se utilizó como control negativo de panitumumab. Como se muestra en la Figura 1, mientras que 100 mg de Ul-59 o 100 mg de panitumumab solo redujo enormemente el crecimiento tumoral en comparación con el control, la combinación de 100 mg de cada uno de los dos agentes completamente inhibido el crecimiento del tumor (p <0,0001 para la combinación frente a cada fármaco por separado) . En los estudios de combinación con Erlotinib, IgGl se utilizó - - como control negativo para Ul-59, y el vehículo Erlotinib se utilizó como control negativo de Erlotinib. Como se muestra en la Figura 2, la combinación de 100 µg Ul-59 y 25 µg Erlotinib tuvo un mayor efecto inhibitorio que cada fármaco por separado. La combinación de IU-59 con Erlotinib fue significativamente más eficaz que el Ul-59 por separado (p = 0, 0376) .
EJEMPLO 27: Ul-59 en combinación con inhibidores de HER inhibe el crecimiento independiente anclado de células cancerígenas de mama y de ovario Se realizaron experimentos para evaluar el efecto de Ul-59 en combinación con los inhibidores de la pertuzumab HER, trastuzumab, o cetuximab en el crecimiento independiente de anclaje de células cancerígenas (básales) SKBR 3 (HRG básales o estimuladas) y MDA-MB-435. IgG se utilizó como control negativo para todos los estudios. Colonias de las células tumorales se formaron en la ausencia o presencia de HRG de 6 a 10 días y se tiñeron con MTT por 4 a 6 horas y cuantificados . Ul-59 como agente único no inhiben el crecimiento de colonias de células MDA-MB 435, sino que inhibe el crecimiento de colonias en un 50% en células SKBR-3 (p <0,001), y hasta un 95% cuando se combina con inhibidores de otros HER ( p <0,05). Por ejemplo, la combinación de 5 g / mi o pertuzumab trastuzumab con 5 9 / mi Ul-59 redujo el crecimiento independiente del anclaje basal en células SKBR-3 de cáncer de mama mucho más que cada fármaco por separado (Figura 3) . Pertuzumab, trastuzumab, o cetuximab en - - combinación con Ul-59 fueron significativamente (p <0,006) más eficaz que el Ul-59 por separado en células SKBR-3 estimuladas por HRG (Figura 4) . Del mismo modo, las combinaciones de Ul-59, ya sea con pertuzumab, trastuzumab o cetuximab inhibe la formación de colonias de células básales de cáncer de ovario (MDA-MB-435) significativamente (p <0,002) que Ul-59 por separado ( Figura 5).
EJEMPLO 28; Ul-59 en combinación con HER-2 inhibidores o agentes quimioterapéuticos reduce la proliferación de células cancerígenas Se realizaron estudios para evaluar el efecto de Ul-59 en combinación con HER-2 inhibidores o agentes quimioterápeuticos sobre la proliferación de células cancerígenas. En particular, los siguientes experimentos se llevaron a cabo en las células de cáncer de mama MDA-MB-175VII: Ul-59 y Trastuzumab Control = DMSO + 75 µ?/p?? IgGl + PBS 10 µ?/p?? Ul-59 75 µg/ml Trastuzumab 10 µg/ml Ul-59 + 75 µg/ml Trastuzumab Ul-59 y Lapatinib Control = DMSO + 150 µg/ml IgGl - - 73.5 µ?/p?? Ul-59 0.1 µ? Lapatinib 73.5 µ9 p?1 Ul-59 + 0.1 µ? Lapatinib Ul-59 y Gemcitibin Control = DMSO + 75 µg/ml IgGl + PBS 10 µ?/p?? Ul-59 1 µg/ml Gemcitibin 10 µg/ml Ul-59 + 1 µ9/??1 Gemcitibinin Ul-59 y Cisplatinin Control = DMSO + 75 µ?/??? IgGl + PBS 10 µ?/ta? Ul-59 1 µg/ml Cisplatin 10 µ?/?a? Ul-59 + 1 µ?/?a? Cisplatin Las células del cáncer de mama MDA-MB-175VII fueron incubadas con Ul-59 y / o de otros agentes durante 1 hora antes de la estimulación HRG. Después de cuatro días, el crecimiento de las células tratadas se midió con ALOMAR BlueTM. En estos ensayos, Ul-59 reduce la proliferación de MDA-MB-175VII estimulado por HRG hasta el 40% (p <0,05) como agente único, y hasta el 80% (p <0,05) cuando se combina con (trastuzumab o lapatinib Figuras 6A y 6B) . Es de destacar que la actividad de aditivos también se observó en las células MDA-MB-175VII - - cuando Ul-59 se combinó con el estándar de cuidado quimioterapéutico (gemcitabina y cisplatino, p <0.05 vs sea un único agente) (Figuras 6C y 6D) . En cada uno de estos experimentos, la combinación de Ul-59 con el inhibidor de HER-2 fue más eficaz para reducir la proliferación de las células MDA-MB175VII que cada fármaco por separado.
Experimentos similares se llevaron a cabo con Ul-59 y pertuzumab, trastuzumab o lapatinib en células de cáncer de mama ZR-75-30 estimuladas por HRG y células de cáncer de mama BT474 estimuladas por HRG (figuras 7 y 8, respectivamente) . En cada caso, la combinación de Ul-59 y lapatinib tuvieron el mayor efecto inhibidor sobre la proliferación celular. Comparado con el tratamiento en monoterapia, la combinación de Ul-59 con pertuzumab o trastuzumab o lapatinib fue significativamente (p <0,004) más eficaz que el Ul-59 por separado. La combinación de Ul-59 con uno o más de pertuzumab, trastuzumab, y cetuximab en células del cáncer de colon DLD-1 estimuladas por HRG y células de cáncer de mama HCC-1569 estimuladas por HRG tuvieron efectos similares, tal como se muestra en las figuras 9 y 10. Además, las combinaciones de Ul-59 con trastuzumab o lapatinib en células de cáncer de mama SKBR-3 estimuladas por HRG también fueron más efectivos que Ul-59 por separado(p <0,004) (Figura 11).
En experimentos adicionales, en células de cáncer de cabeza y cuello (FADU) fueron cultivadas en un medio de crecimiento (FBS MEM + 10% + IX PSG) y tratados con los controles de IgG, Ul-59, panitumumab o una combinación de Ul-59 con panitumab. Después de la incubación durante 5 días a una temperatura de 37 0 C, la proliferación se midió con ALOMAR BlueTM. Como - - agente único, Ul-59 redujo la proliferación de las células FADU en un 15% a 20%, mientras que la combinación de Ul-59 con panitumumab resulto en la reducción de más del 80%. La combinación de Ul-59 con panitumumab dio como resultado una disminución significativa (p = 0,001 vs mejor actividad como agente único) mejora con respecto al uso de cada fármaco por separado (Figura 12) .
EJEMPLO 29: Ul-59 en combinación con otros inhibidores de HER inhibe la transducción de la señal El efecto de Ul-59 ya sea solo o en combinación con cetuximab, pertuzumab, trastuzumab o lapatinib en la transducción de señales se midió en células de cáncer de mama MDA- B-175VII sin estimular, células de cáncer de mama SKBR-3 estimuladas con HRG, células de cáncer de colon LS174T estimuladas con HRG, y células de cáncer de mama HCC-1569 estimuladas con HRG. Las células fueron tratadas con agentes como se indica en las figuras 13-16, y la fosforilación de HER-3, Akt y ERK se evaluó por Western Blot con anticuerpos fosfo-especificos . La combinación de Ul-59, ya sea con pertuzumab, trastuzumab o lapatinib posteriormente redujo la fosforilación de HER-3, Akt y ERK en todos los tipos de células probados en comparación a los tratamientos de monoterapia. La combinación de Ul-59 con cetuximab parecía sinergizar con menos eficiencia en estos ensayos.
Estudios similares se realizaron en células epiteliales alveolares A549 (Figura 17) y células Calu3 NSCLC (Figura 18) tratados con Ul-59 solo o Ul-59 en combinación con - - panitumumab o lapatinib, a través de Western blot para evaluar la fosforilación de Akt, EGF-R, HER-2, HER-3, HER- , y ERK. La combinación de Ul-59 con panitumumab tuvieron el mayor efecto aparente en la fosforilación de HER-3 en las células A549, mientras que la combinación era más eficaz en lo que respecta a la fosforilación Akt y EGF-R en células Calu3.
Experimentos adicionales fueron realizados para evaluar la eficacia in vitro y el crecimiento independiente del anclaje de las células A549 tratadas con 10 mg / mi Ul-59, otros HER family Abs, o mAb de control en medio contenedor de suero. Las colonias de las células tumorales se formaron en la ausencia de ligando exógeno durante 10 días y se tiñeron con MTT y cuantificadas mediante una cámara de sistema de imagen Scanalyzer HTS. Ul-59 inhibe el crecimiento de colonias en un 50% (p <0,001) en la linea celular A549 y dio lugar a la inmovilización del tumor en el modelo xenoinjerto A549 CPN vs IgG de control u otros HER mAbs (p <0.05).
Estos resultados demuestran que Ul-59 inhibe señales oncogénicas distales y proximales HER-3 en lineas celulares de mama in vitro, y que las células de cáncer de mama son sensibles al tratamiento con Ul-59 en monoterapia y en combinación con agentes anti-HER.
- - EJEMPLO 30: Ul-59 sensibiliza lapatinib para una actividad in vivo Para evaluar los efectos combinados de Ul-59 y lapatinib en vivo, los ratones fueron implantados con células humanas de cáncer de mama (HCC-1569) y tratados con Ul-59 y lapatinib solo o en combinación. Los tumores se les permitió llegar a tamaños mayores o iguales a 100 mm3, y los ratones fueron tratados posteriormente con control, lapatinib, Ul-59, o una combinación de Ul-59 y lapantinib. Como se muestra en la Figura 19, Ul-59 por si solo no inhibe el crecimiento del tumor HCC-1569, y lapatinib solo causa alguna, pero no una inhibición significativa del crecimiento tumoral en comparación con el control (p = 0,16). La combinación de lapatinib con Ul-59, sin embargo, dio lugar a una inhibición significativa del crecimiento del tumor (p <0,02 versus control o de p <0,05 vs lapatinib).
Estos resultados indican que la combinación de Ul-59 y lapatinib dieron como resultado la inhibición sinérgica del crecimiento del tumor HCC-1569 en vivo. Este resultado es especialmente interesante y alentador, ya que demuestra que incluso los tipos de tumores que no pueden responder a Ul-59 o lapatinib solo, puede ser eficazmente tratado con la combinación de ambos.
- - EJEMPLO 31; El uso de anticuerpos anti-HER-3 como agentes de diagnóstico Anti-HER-3 mAb puede ser usado en el diagnóstico de enfermedades malignas. HER-3 se expresa en las células tumorales de una manera muy distinta en comparación con el tejido normal y, por tanto, un análisis de la expresión de HER-3 ayudaría en el diagnóstico primario de los tumores sólidos, la estadificación y la clasificación de los tumores sólidos, la evaluación de los criterios pronósticos de enfermedades proliferativas y las neoplasias y gestión del riesgo en pacientes con tumores HER-3 positivo.
A. Detección del antígeno HER-3 en una muestra Un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) para la detección del antígeno HER-3 en una muestra es desarrollado. En el ensayo, los pozos de una placa de microtitulación, tal como una placa 96-pozo de microtitulación o una placa de 384-pozo de microtitulación, son absorbidos por varias horas con el primer anticuerpo monoclonal totalmente humano dirigido contra el antígeno HER-3. El anticuerpo inmovilizado sirve como anticuerpo de captura para cualquiera de los antígenos HER-3 que pueden estar presentes en una muestra de prueba. Los pozos se lavan y se tratan con un agente de bloqueo como la proteína de la leche o la albúmina para evitar la adsorción no específica de la sustancia analizada.
Posteriormente, los pocilios se tratan con una muestra de ensayo que se sospecha contienen el antígeno HER-3, o con una solución que contiene una cantidad estándar de antígeno - - HER-3. Esta muestra es, por ejemplo, una muestra de suero de un sujeto que se sospecha tiene los niveles circulantes de antigeno HER-3 considerado para el diagnóstico de una patología. Después de enjuagar la muestra o estándar, los pocilios se tratan con un segundo anticuerpo anti-HER-3 plenamente humano monoclonal que está marcado por la conjugación con la biotina. La etiqueta anti-HER-3 sirve como anticuerpo de un anticuerpo de detección. Después de enjuagar el exceso de anticuerpo secundario, los pozos son tratados con peroxidasa avidina conjugada (HRP) y un sustrato cromogénico adecuado. La concentración del antígeno HER-3 en las muestras de prueba se determinará mediante comparación con una curva estándar desarrollado a partir de las muestras patrón.
B. La detección del antigeno HER-3 en inmunohistoquímica (IHC) Con el fin de determinar antígeno HER-3 en secciones de tejido por IHC, tejidos embebidos en parafina son los primeros desparafinados en xileno durante 2 5 minutos y luego hidratado con 100% etanol 2 3 min, 95% de etanol y 1 minuto enjuagados con agua destilada. Epítopos antigénicos enmascarados por la fijación en formol e inclusión en parafina, se exponen al desenmascarar epitopo, la digestión enzimática o saponina. Para epitopo desenmascarar los cortes de parafina se calienta en un barco de vapor, baño de agua o el horno microondas durante 20-40 minutos en una solución de recuperación del epitopo como por ejemplo 2N solución de HCl (pH 1.0). En el caso de una digestión enzimática, cortes de tejido se incubaron a 37 ° C durante 10-30 minutos en diferentes soluciones de enzima como la proteinasa K, la tripsina, pronasa, pepsina, etc Después de enjuagar la solución de recuperación del epitopo o el exceso de la enzima, cortes de tejidos se tratan con un buffer de bloqueo para evitar interacciones no especificas. El anticuerpo primario se incuba en diluciones adecuadas en buffer de dilución de 1 hora a temperatura ambiente o durante la noche. El exceso de anticuerpos primarios se enjuaga y las secciones se incuban en una solución de bloqueo de la peroxidasa durante 10 minutos a temperatura ambiente. Tras otro paso de lavado, cortes de tejido se incuban con un anticuerpo secundario marcado con un grupo que podría servir como un ancla para una enzima. Ejemplos de tal forma son anticuerpos de biotina secundarios marcados que son reconocidos por estreptavidina junto peroxidasa de rábano. La detección de los complejos anticuerpos / enzima se consigue mediante la incubación con un sustrato cromogénico adecuado.
C. Determinación de la concentración de antígeno HER-3 en el suero de los pacientes Un sándwich ELISA se desarrolla para cuantificar los niveles de HER-3 en el suero humano. Los dos anticuerpos monoclonales completamente humanos anti-HER-3 utilizados en el ELISA de captura, reconoció dominios diferentes de la molécula de HER-3 y no compete por la unión, por ejemplo (ver ejemplo 8) . El ELISA se realiza de la siguiente manera: 50 1 de captura contra el HER-3 anticuerpo en buffer de recubrimiento (NaHC03 0,1 M, pH 9,6) a una concentración de 2 mg / mi revestido en placas de ELISA (Fisher) . Después de la incubación a 4° C durante la noche, las placas son tratadas con 200 µ? de buffer de bloqueo (BSA al 0,5%, 0,1% de Tween 20, 0,01% de timerosal en PBS) durante 1 hora a 25° C. Las placas fueron lavadas (3x) con 0,05% de Tween 20 en PBS (buffer de lavado, WB) . Suero normal o del paciente (Clinomics, Bioreclaimation) se diluyen en buffer de bloqueo que contiene 50% de suero humano. Las placas se incuban con muestras de suero de la noche a 4o C, se lava con WB, y se incubaron con 100 µ? / pozo de detección biotinilado de anticuerpo anti-HER-3 durante 1 hora a 25 0 C. Después del lavado, las placas se incuban con HRP-estreptavidina durante 15 minutos, se lava como antes, y después se trata con 100 µ? / pozo de fenilendiamina o-en H202 (solución de Sigma en desarrollo) para la generación de color. La reacción se detuvo con 50 µ? / pozo de H2S04 (2 M) y se analizaron mediante un lector de placas ELISA a 492 nm. La concentración de antígeno HER-3 en muestras de suero se calcula por medio de comparación con diluciones de antigeno HER-3 purificado mediante un programa de cuatro curvas de parámetro de ajuste.
La estadificación del cáncer en un paciente: Basado en los resultados expuestos y discutidos en los puntos A, B y C, es posible llevar a cabo un cáncer en un sujeto en función de los niveles de expresión del antigeno HER-3. Para un determinado tipo de cáncer, las muestras de sangre tomadas de pacientes diagnosticados como en las diversas etapas en la progresión de la enfermedad, y / o en los varios puntos en el - - tratamiento terapéutico del cáncer. La concentración del antigeno HER-3 presentes en las muestras de sangre se determina mediante un método que determina con precisión la cantidad de antigeno que está presente. Este método incluye un método de ELISA, como el método descrito en los puntos A y B. Con una población de muestras que proporciona resultados estadísticamente significativos para cada etapa de la progresión o la terapia, una gama de concentraciones del antígeno HER-3 que pueden se consideran característicos de cada etapa que ha sido designada.
Con el fin de estratificar la progresión del cáncer en un tema en estudio, o para caracterizar la respuesta del sujeto a un curso de terapia, una muestra de sangre se toma de la materia y la concentración del antígeno HER-3 presentes en la muestra se determina. La concentración así obtenida se utiliza para identificar en qué rango de concentraciones el valor cae. El rango ya identificado se relaciona con una etapa de progresión o una etapa de la terapia identificada en las distintas poblaciones de pacientes diagnosticados, proporcionando así una etapa en el tema objeto de estudio.
Anticuerpos anti-HER-3 como se describe en este documento se utilizan para el tratamiento de ciertos hiperproliferativas o HER-3 trastornos asociados sobre la base de una serie de factores, tales como HER-3 de expresión, por ejemplo. Tumor de tipos como el cáncer de mama, cáncer gastrointestinal, cáncer de páncreas, cáncer de próstata, cáncer de ovario, cáncer de estómago, cáncer de endometrio, cáncer de glándula salival, cáncer de pulmón, cáncer de riñon, cáncer de colon, el cáncer colorrectal, cáncer de tiroides, cáncer de vejiga, el glioma, el melanoma , y otros que expresan HER-3 o la sobreexpresión de los cánceres son ejemplos de indicios de que son tratados con una terapia de combinación como se describe en este documento, aunque las indicaciones no se limitan a los de la lista anterior. Además, los siguientes grupos de pacientes pueden beneficiarse del tratamiento como se describe en este documento : • Los pacientes no elegibles para el tratamiento con anti-HER-2 mAb • Los pacientes con resistencia a los anti-HER-1 MAB o un inhibidor de pequeña molécula anti-EGF-R • Los pacientes con CPNM resistente al Erlotinib o Gefitinib Anticuerpos anti-HER-3 se utilizan en combinación con uno o más agentes adicionales en lo que se denomina "terapia de combinación." Tal terapia de combinación incluye, pero no se limita a, los agentes de divulgación de este documento. La terapia combinada con anticuerpos anti-HER-3 y otros agentes pueden prolongar la supervivencia del paciente, aumentar el tiempo hasta la progresión del tumor, o mejorar la calidad de vida del paciente, diseño del protocolo y la administración se ocupará de la eficacia terapéutica, así como la capacidad de reducir las dosis habituales de las terapias estándar, como la quimioterapia o la radioterapia, por ejemplo.
El tratamiento de las personas con anticuerpos anti-HER- 3 : Para determinar los efectos in vivo del tratamiento con anticuerpos anti-HER-3 en pacientes con tumores humanos, - - tales pacientes humanos son inyectados sobre cierta cantidad de tiempo con una cantidad eficaz de anticuerpos anti-HER-3. Periódicamente durante el tratamiento, los pacientes humanos son monitoreados para determinar si sus tumores han progresado, en particular, o si los tumores crecen he hicieron metástasis.
Un paciente con tumores tratados con anticuerpos anti-HER-3 tiene un menor nivel de crecimiento del tumor y / o metástasis en comparación con el nivel de crecimiento del tumor y la metástasis tumoral en los pacientes tratados con el estándar actual de la terapéutica médica.
El tratamiento con anti-conjugaciones de anticuerpos HER-3 : Para determinar los efectos in vivo de conjugaciones de anticuerpos anti-HER-3, los pacientes humanos o animales que exhiben los tumores se inyectan más de una cierta cantidad de tiempo con una cantidad eficaz de anticuerpo conjugado anti-HER -3. Por ejemplo, el anticuerpo conjugado anti-HER-3 administrado es el anticuerpo conjugado DM1-anti-HER -3, un auristatin anti-HER-3 anticuerpos conjugados o con radioisótopos anti-HER-3 con anticuerpos conjugados. A veces periódicamente durante el tratamiento, los pacientes humanos o animales son monitoreados para determinar si sus tumores progresaron, en particular, si los tumores crecieron e hicieron metástasis.
Un paciente humano o animal que tenga tumores y se encuentra bajo tratamiento, por ejemplo, anticuerpo DMl-anti-HER-3 o anticuerpo anti-radioisótopos-HER-3 conjugados tienen un menor nivel de crecimiento del tumor y de metástasis, en - - comparación con un paciente de control o los tumores de los animales y en tratamiento con una terapia alternativa. Anticuerpos de Control DM1 que pueden ser utilizados en los animales incluyendo conjugados de DM1 vinculados a los anticuerpos del mismo isotipo de los anticuerpos anti-HER-3, pero más específicamente, sin tener la capacidad para unirse al antígeno del tumor HER-3. Anticuerpos radioisótopos de control que pueden ser utilizados en los experimentos con animales incluyendo conjugados de radioisótopos vinculados a los anticuerpos del isotipo de los mismos anticuerpos anti-HER-3, pero más específicamente, sin tener la capacidad para unirse al antígeno del tumor HER-3. Nota: los conjugados de control no se debe administrar a los seres humanos.
EJEMPLO 33: Identificación de una Primera dosis y programa en pacientes Humanos de Anti-HER-3 mAb basado en datos preclínicos farmacocinéticas, farmacodinámicas , y datos de eficacia Se realizaron estudios para usar modelos preclínicos con el fin de predecir un régimen de dosis mínima eficaz de respuesta objetiva utilizando farmacocinética preclínica (PK) , eficacia antitumoral de ratones xenoinjerto BxPC3, y datos de farmacodinámica (DP) .
Los ratones portadores de ~ 200mm3 xenoinjertos pancreáticos BxPC3 establecido, fueron tratados dos veces por semana con Ul-59 a 25, 100, 200, 500 µg / ratón. La inhibición de la PHER en los tumores xenoinjerto BxPC3 se analizaron por Western Blot. Un PK / PD / modelo de eficacia - - (en base a Simeoni et al. (2004) Resolución del Cáncer. 64:1094-1101) se utilizó para seleccionar de forma prospectiva, la dosis y el calendario para su análisis posterior. Para confirmar el PK / PD / modelo de eficacia, ratones BxPC3 portadores de tumores de páncreas fueron tratados con 400 µ? / ratón cada dos semanas y 200 µg / ratón quincenales, semanales y dos veces por semana. Entre especies de escala basada en el peso corporal (PC) se utilizó para predecir Ul-59 parámetros farmacocinéticos en humanos sobre la base de las concentraciones de suero obtenidas en ratones, ratas y monos. La relación entre la concentración de la droga, la inhibición de PHER-3 en los animales, y la correspondencia entre PK se utilizó para seleccionar la dosis mínima efectiva para el primer estudio en humanos.
El tratamiento con Ul-59 de xenoinjertos BxPC3 dio como resultado a una inhibición significativa del crecimiento tumoral y los niveles de PHER-3 en un horario de dosis y la forma dependiente (p <0,05). El tratamiento con Ul-59 a 400 µg / ratón cada dos semanas y 200 g / ratón quincenales, semanales y dos veces a la semana resultó en un 50%, 33%, 74% y 70% de inhibición del crecimiento tumoral (p <0,05), un 30%, 58%, 23% y 20% de inhibición de PHER-3 (Western blot cuantitativo) frente al grupo control tratado con IgG, respectivamente. Las concentraciones séricas de Ul-59 en la necropsia de los grupos de dosis respectivas fueron (media (SD)) de 2,07 (0,97), 0,45 (0,21), 3,08 (0,82) y 34.9 (9.1) µg / mL, respectivamente. La concentración mínima estimada - - necesaria para alcanzar el 90% máximo PHER-3 inhibición (IC90) se estimó en ~ 3 mg / mi . La PK / PD / modelo de eficacia desarrollado predijo que el volumen tumoral medio (R2 = 0.925). El aclaramiento (CL) y el volumen inicial de distribución (Vd) en el hombre se estima en 11 mL / día / kg y 28 mi / kg. La comparación de los perfiles simulados PK humanos sugiere que las dosis cada dos semanas de> 3 mg / kg, lo que debe exhibir PK lineal, puede resultar en más del 90% PHER-3 inhibición durante dos semanas de intervalo de dosis.
La eficacia antitumoral en el modelo de xenoinjerto de páncreas BxPC3 se correlacionó con un aumento de la concentración sérica de Ul-59 y una disminución en PHER-3, lo que permite el desarrollo de un PK / PD / relación de eficacia. Esta relación se utilizó para determinar la dosis y periodicidad de Ul-59 para investigar por primera vez en humanos (FIH) de estudio.
- - EJEMPLO 34: Estudios de Reactivación Las células A549 se sembraron en medios Ham's F-12 (Gibco) , todos los medios se suplementaron con FBS al 10% (Hyclone, Logan, UT) y IX L glutamina (Gibco) . Las células fueron sumergidas en suero de hambre durante la noche. Los medios se cambiaron por medios frescos libres de suero y las células fueron tratadas con 50 µg/ml Ul-59 o 5 µ? Gefitinib solo, o una combinación de Ul-59 y Gefitinib, por 1 o 24 horas a 37° C. Las células fueron lavadas con PBS frío después de sus respectivos puntos de tiempo de tratamiento y se lisaron con buffer RIPA (20 mM Tris-HCl pH 7,5, 1% Igepal, 1% desoxicolato sódico, NaCl 150 mM, SDS 0,1%, 1% Tritón X 100) que contiene 200 µ? phenylmethanesulfonylfluoride (PMSF) (Fluka Biochemica), 200 µ? del kit coctel del inhibidor de la proteasa Halt (Pierce Biotechnology) , y 200 µ? ortovanadato de sodio (Sigma Aldrich, St. Louis, MO) . Los lisados se pasaron por columnas desfibradoras QIA (Qiagen) y el flujo-continuo se cuantifico mediante un espectrofotómetro (Beckman Coulter, Fullerton, CA) . Las Proteínas, 50 µ? por pozo, se analizaron por duplicado en pHER3 mediante la técnica ELISA DuoSet (I + D de sistemas) , según el protocolo del fabricante. Los resultados se muestran en la Figura 20 OTRAS REALIZACIONES Se ha de entender que, si bien la invención se ha descrito en relación con la descripción detallada de la misma, la descripción precedente se destina a ilustrar y no limitar el alcance de la invención, que se define por el alcance de las reivindicaciones adjuntas. Otros aspectos, las ventajas, y las modificaciones son en el ámbito de las siguientes reivindicaciones.
TABLA 10: Secuencias CDR - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -

Claims (50)

REIVI DICACIONES
1. Un método para tratar o prevenir una enfermedad asociada con HER-3 en un sujeto, que comprende la administración al sujeto de un primer agente y un segundo agente, en donde el primer agente se une a HER-3 y el segundo agente se une al y / o inhiben el actividad de otro miembro de la familia HER.
2. El método de la reivindicación 1, en donde el primer agente es un compuesto de moléculas pequeñas o de una proteina de unión al antigeno que se une al HER-3.
3. El método de la reivindicación 1, en donde el primer agente es una proteina de unión al antigeno que se une al HER-3, e incluye: una secuencia de aminoácidos de cadena pesada que comprende un CDRHl seleccionado del grupo formado por SEQ ID NO: 236, 251, 252, y 256, un CDRH2 seleccionado del grupo formado por SEQ ID NO: 258, 278, 280, y 282, y un CDRH3 seleccionado del grupo formado por SEQ ID NO: 283, 285, 309, 313 y 315; y una cadena ligera de la secuencia de aminoácidos que comprende una CDRL1 seleccionado del grupo formado por SEQ ID NO: 320, 334, 337, y 340, un CDRL2 seleccionado del grupo formado por SEQ ID NO: 343, 356, 351, y 344 , y un CDRL3 seleccionado del grupo formado por SEQ ID NO: 360, 381, 385 y 387.
4. El método de la reivindicación 1, en donde el primer agente es una proteina de unión al antigeno que se une al HER-3, y comprende una secuencia de la cadena pesada de aminoácidos que comprende al menos uno de los CDR, seleccionado del grupo que consiste de (a) CDRH1 como se muestra en la SEQ ID NO: 236, 251, 252 y 256, (b) CDRH2 como se muestra en la SEQ ID NO: 258, 278, 280, y 282, y (c) CDRH3 como se muestra en la SEQ ID NO: 283, 285 , 309, 313 y 315.
5. El método de la reivindicación 1, en donde el primer agente es una proteina de unión al antígeno que se une al HER-3, y comprende una secuencia de la cadena ligera de aminoácidos que comprende al menos uno de los CDR, seleccionado del grupo que consiste en: (d ) CDRL1 como se muestra en la SEQ ID NO: 320, 334, 337 y 340; (e) CDRL2 como se muestra en la SEQ ID NO: 343, 356, 351, y 344, y (f) CDRL3 como se muestra en la SEQ ID NO: 360, 381, 385 y 387.
6. El método de la reivindicación 1, en donde el primer agente es una proteina de unión al antigeno que se une al HER-3, y comprende una secuencia de la cadena pesada de aminoácidos que comprende al menos uno de los CDR, seleccionado del grupo que consiste de (a) CDRH1 ' s, como se muestra en la SEQ ID NO: 236, 251, 252 y 256, (b) CDRH2 como se muestra en la SEQ ID NO: 258, 278, 280, y 282, y (c) CDRH3 como se muestra en la SEC No.: 283, 285, 309, 313 y 315, y una secuencia de la cadena ligera de aminoácidos que comprende al menos uno de los CDR, seleccionado del grupo que consiste en: (d) CDRLl como se muestra en la SEQ ID NO: 320, 334 , 337 y 340; (e) CDRL2 como se muestra en la SEQ ID NO: 343, 356, 351, y 344, y (f) CDRL3 como se muestra en la SEQ ID NO: 360, 381, 385 y 387.
7 . El método de la reivindicación 1, en donde el primer agente es una proteina de unión al antigeno que se une al HER-3, y comprende una secuencia de aminoácidos de cadena pesada que comprende un CDRHl seleccionado del grupo formado por SEQ ID NO: 236, 251, 252 , y 256, un CDRH2 seleccionado del grupo que consiste de SEQ ID: 258, 278, 280 , y 282 , y un CDRH3 seleccionado del grupo que consiste de SEQ ID: 283, 285, 309, 313 y 315, o una cadena ligera secuencia de aminoácidos que comprende una CDRLl seleccionado del grupo formado por SEQ ID NO: 320, 334, 337, y 340, un CDRL2 seleccionado del grupo formado por SEQ ID NO: 343, 356, 351, y 344, y un CDRL3 seleccionado del grupo formado por SEQ ID NO: 360, 381, 385 y 387.
8 . El método de la reivindicación 1, en donde el primer agente es una proteina de unión al antigeno que se une al HER-3, y comprende una secuencia de la cadena pesada de aminoácidos seleccionada del grupo formado por SEQ ID NO: 42, 54, 70, 92, y 96.
9. El método de la reivindicación 8, en donde dicha proteina de unión al antigeno comprende una secuencia de la cadena ligera de aminoácidos seleccionada del grupo formado por SEQ ID NO: 44, 56, 72, 94 y 98.
10. El método de la reivindicación 1, en donde el primer agente es una proteina de unión al antigeno que se une al HER-3, y comprende una secuencia de la cadena pesada de aminoácidos seleccionada del grupo formado por SEQ ID NO: 42, 54, 70, 92, y 96; y una secuencia de aminoácidos de cadena ligera seleccionado del grupo formado por SEQ ID NO: 44, 56, 72, 94 y 98.
11. El método de la reivindicación 1, en donde el primer agente es una proteina de unión al antigeno que se une al HER-3, y comprende la secuencia de aminoácidos de cadena pesada de la SEQ ID NO: 42 y la secuencia de aminoácidos de cadena ligera de la SEQ ID NO: 44 .
12. El método de la reivindicación 1, en donde el primer agente es una proteina de unión al antigeno que se une al HER-3, y comprende la secuencia de aminoácidos de cadena pesada de la SEQ ID NO: 54 y la secuencia de aminoácidos de cadena ligera de la SEQ ID NO: 56 .
13. El método de la reivindicación 1, en donde el primer agente es una proteína de unión al antígeno que se une al HER-3, y comprende la secuencia de aminoácidos de cadena pesada de la SEQ ID NO: 70 y la secuencia de aminoácidos de cadena ligera de la SEQ ID NO: 72 .
14. El método de la reivindicación 1, en donde el primer agente es una proteína de unión al antígeno que se une al HER-3, y cuenta con un CDRH3 seleccionado del grupo formado por SEQ ID NO: 283, 285, 309, 313 y 315.
15. El método de la reivindicación 1, en donde el primer agente es una proteína de unión al antígeno que se une al HER-3, y cuenta con un CDHL3 seleccionado del grupo formado por SEQ ID NO: 360, 381, 385 y 387.
16. El método de cualquiera de las reivindicaciones 3-15, en donde dicha proteína de unión al antígeno se dirige contra el dominio extracelular de HER-3.
17. El método de cualquiera de las reivindicaciones 3-15, en donde la unión de dicha proteína de unión al antígeno a HER-3 reduce la transducción de señales SU-3-mediada .
18. El método de cualquiera de las reivindicaciones 3-15, en donde la unión de dicha proteína de unión al antígeno a HER-3 reduce SU-3 fosforilación.
19. El método de cualquiera de las reivindicaciones 3-15, en donde la unión de dicha proteína de unión al antígeno a HER-3 reduce la proliferación celular.
20. El método de cualquiera de las reivindicaciones 3-15, en donde la unión de dicha proteína de unión al antígeno a HER-3 reduce la migración celular.
21. El método de cualquiera de las reivindicaciones 3-20, en donde la unión de dicha proteína de unión al antígeno a HER-3 aumenta la regulación a la baja de HER-3.
22. El método de cualquiera de las reivindicaciones 3-20, en donde dicha proteína de unión al antígeno que se une al HER-3 es un anticuerpo.
23. El método de la reivindicación 22, en donde dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo policlonal, un anticuerpo recombinante, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo humano, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo multiespecífico, o un fragmento de anticuerpo de la misma.
24. El método de la reivindicación 23, en donde el fragmento de anticuerpo es un fragmento Fab', fragmento, un F (ab' un Fab) 2 fragmento, un fragmento Fv, diacuerpo o una molécula de anticuerpo de cadena sencilla.
25. El método de la reivindicación 22, en donde dicho anticuerpo es de la IgGl, IgG2, IgG3 o IgG4 tipo.
26. El método de la reivindicación 1, en donde el primer agente es una proteína de unión al antigeno que se une al HER-3, y en donde dicha proteína de unión al antígeno se junta a un grupo de efectos.
27. El método de la reivindicación 26, en donde el grupo es un efector de radioisótopos o radionúclidos, una toxina o un grupo terapéutico o quimioterapéutico .
28. El método de la reivindicación 27, en donde el grupo terapéutico de quimioterapia o se selecciona del grupo que consiste en caliqueamicina, auristatin-PE, geldanamicina, maytansine y sus derivados.
29. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-15, en donde el segundo agente es un compuesto de moléculas pequeñas o de una proteina de unión al antígeno.
30. El método de la reivindicación 29, en donde el trastuzumab segundo agente.
31. El método de la reivindicación 29, en donde el segundo agente se selecciona entre el grupo de lapatinib y neratinib .
32. El método de la reivindicación 29, en donde el segundo agente es panitumumab.
33. El método de la reivindicación 29, en donde el segundo agente es Erlotinib.
34. El método de la reivindicación 29, en donde el segundo agente es Cetuximab.
35. El método de la reivindicación 29, en donde el segundo agente es pertuzumab.
36. El método de la reivindicación 2, en el segundo agente es Erbitux.
37. El método de la reivindicación 29, en donde el segundo agente es T-D l .
38. Un método para tratar o prevenir una enfermedad asociada con HER-3 en un sujeto, que comprende administrar al sujeto un agente de primer y un segundo agente, en donde el primer agente es una proteina de unión al antigeno que se une al HER-3 y cuenta con la pesada secuencia de la cadena de aminoácidos de la SEQ ID NO: 42 y la secuencia de aminoácidos de cadena ligera de la SEQ ID NO: 44, y en donde el segundo agente es seleccionado del grupo que consiste de Erlotinib, lapatinib, neratinib y pertuzumab.
39. Un método para tratar o prevenir una enfermedad asociada con HER-3 en un sujeto, que comprende administrar al sujeto un agente de primer y un segundo agente, en donde el primer agente es una proteina de unión al antigeno que se une al HER-3 y cuenta con la pesada secuencia de la cadena de aminoácidos de la SEQ ID NO: 42 y la secuencia de aminoácidos de cadena ligera de la SEQ ID NO: 44, y en donde el segundo agente es seleccionado del grupo que consiste de trastuzumab, T-DMl, panitumumab, Erbitux, y cetuximab.
40. El método de la reivindicación 1, opcionalmente, que comprende administrar un agente terapéutico más y / o radioterapia .
41 . El método de la reivindicación 40, en donde el agente terapéutico más es un agente anti-neoplásicos .
42 . El método de la reivindicación 40, en donde el agente anti-neoplásica es un anticuerpo anti-tumor o un agente quimioterapéutico.
43 . El método de la reivindicación 42, en donde el agente quimioterapéutico se selecciona del grupo que consiste de capecitabina, antraciclinas, doxorrubicina, ciclofosfamida, paclitaxel, docetaxel, cisplatino, gemcitabina y carboplatino .
44 . El método de la reivindicación 29, en donde el agente de primer y segundo agente dijo que se administran por vía intravenosa, subcutánea, intramuscular u oral.
45 . El método de la reivindicación 29, en donde dicha enfermedad es una enfermedad hiperproliferativa .
46 . El método de la reivindicación 29, en donde dicha enfermedad es seleccionado del grupo que consiste en el cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer de próstata, cáncer de colon, cáncer renal, cáncer de pulmón, cáncer de páncreas, el carcinoma epidermoide, el fibrosarcoma, el melanoma, el carcinoma nasofaríngeo y de células escamosas carcinoma.
47. El método de la reivindicación 29, que comprende la administración de dicho agente por primera vez en una dosis de 1 a 20 mg / kg de peso corporal, por lo menos una vez cada 6 semanas.
48. El método de la reivindicación 29, que comprende la administración de dicho segundo agente en una dosis de 1 a 20 mg / kg de peso corporal, por lo menos una vez cada 6 semanas .
49. El método de la reivindicación 29, más lejos, antes de la administración, usando un método que comprende el análisis de un marcador predictivo para seleccionar un tema que tiene una enfermedad asociada con HER-3.
50. El método de la reivindicación 29, más lejos, después de la administración, la supervisión de los resultados terapéuticos.
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