Poly TP S1

Classification bactérienne
Etapes du diagnostic
bactériologique
1ère séance de TP (DCEM1)

Section de Microbiologie
Département des Sciences de Base B
Faculté de Médecine de Tunis
PROGRAMME DE LA 1ère SEANCE
9h00 – 9h 30 : Présentation du topo à la salle de Staff
9h30 – 9h45 : Présentation des différents milieux de culture (liquides et solides)

utilisés en bactériologie
9h45 – 10h00 : Préparation de l’étalement pour la coloration de Gram

Ensemencement d’un germe pur sur gélose ordinaire
10h00 – 10h30: Réalisation de la coloration de Gram & Lecture au microscope optique

(objectif 100)
LES MILIEUX DE CULTURE
Un milieu de culture est une préparation, liquide ou gélosée, au sein de laquelle des micro-
organismes peuvent se multiplier. Il doit donc satisfaire les exigences nutritives du micro-
organisme étudié.
D’une manière générale, on distingue :
1. Les milieux ordinaires permettant la multiplication des germes peu exigeants et à

multiplication rapide.
- Gélose nutritive ordinaire & Bouillon ordinaire
- Gélose Mueller Hinton (MH) utilisée pour l’étude de la sensibilité d’une bactérie aux
antibiotiques.
2. Les milieux enrichis : Ils sont obtenus en incorporant à un milieu de base adéquat
des liquides ou suspensions riches en molécules organiques diverses.
a. Gélose au sang frais (GS): L’addition de sang frais au milieu de base permet

d’apporter des facteurs de croissance nécessaires à la croissance des streptocoques.
Il permet la lecture d’un caractère important: le type d’hémolyse. Ainsi, les colonies
peuvent être β hémolytiques: entourées d’une zone claire d’hémolyse signant
l’hémolyse totale des GR contenus dans la gélose; α hémolytiques entourées d’une
zone floue et verdâtre témoignant de l’hémolyse partielle des GR contenus dans la
gélose ou non hémolytiques.
b. Gélose au sang cuit (GC) : milieu enrichi préconisé pour l’étude des Neisseria et
Haemophilus influenzae).
3. Les milieux sélectifs pour une espèce bactérienne sont des milieux satisfaisant les
exigences nutritives et les conditions de développement particulières à cette espèce.
i. Gélose Chapman : Ce milieu contient un inhibiteur correspondant à de fortes
concentrations en chlorure de sodium (75 g/l), ce qui permet un isolement sélectif de
Staphylococcus tolérant les fortes concentrations en NaCl ; On peut étudier la
fermentation du mannitol par virage au jaune de l’indicateur coloré, le rouge de phénol,
autour des colonies.
ii. Gélose Salmonella-Shigella (SS): Milieu sélectif permettant l’isolement des
Salmonella et Shigella. Les inhibiteurs contenus dans ce milieu empêchent la pousse
de toutes bactéries Gram+, et rendent difficile la croissance des bactéries Gram - autres
que Salmonella et Shigella. Le milieu contient du lactose pouvant être fermenté et
contient du thiosulfate pouvant donner du H 2S. Trois types de colonies peuvent être
observés :
Colonies rouges : lactose +

Colonies incolores : lactose -
Colonies à centre noir : H2S +
iii. Gélose Désoxycholate Lactose (GDL) : gélose contenant du lactose et 2 inhibiteurs

des bactéries Gram+. Elle permet de rechercher le caractère « utilisation du lactose ».
Les bactéries fermentant le lactose formeront des colonies rouges et celles ne
fermentant pas le lactose donneront des colonies incolores.
iv. Gélose au sang négram (GSN) : gélose au sang additionné de négram (antibiotique
actif sur les BGN) : gélose sélective sur laquelle ne pousseront que les GP.
ENSEMENCEMENT SUR GELOSE
L’ensemencement consiste à déposer dans un milieu stérile des germes prélevés à partir
d’un milieu de culture mère (bouillon de culture). Le transport est effectué avec une anse de
platine (Figure 1).
Figure 1 : Anse de platine
- Réalisation de l’ensemencement par la technique des stries

(Epuisement de 3 quadrants):
- La manipulation doit se faire dans la zone stérile autour du bec Bunsen (Figure 2)
1. Prendre dans la main gauche, le tube de culture microbienne en bouillon, agiter

la culture par rotation entre les paumes de la main.
2. De la main droite, saisir l’anse, la tenir verticalement dans la flamme et la

chauffer au rouge. Flamber aussi l'extrémité du manche portant le fil, laisser
refroidir une vingtaine de secondes en la gardant toujours dans la main droite.
3. Enlever le bouchon avec l'auriculaire et la paume de la main droite et flamber

l'orifice du tube aussi verticalement que possible (pour éviter l'entrée de l'air).
Plonger le fil bouclé dans la culture puis replacer le bouchon après avoir flambé
de nouveau l'ouverture du tube. Déposer le bouillon dans le portoir.
4. Diviser mentalement la boîte en 3 secteurs égaux. Tenir la boîte de la main

gauche et déposer l'échantillon en laissant traîner l'extrémité de l'anse en zig zag
dans le premier secteur de la périphérie vers le centre de la boîte. Repasser
l'anse à la flamme, la laisser refroidir, faire tourner la boîte d'un secteur et
repasser avec l'anse dans la partie supérieure du dépôt initial qu'on étalera dans
le deuxième secteur comme précédemment sans croiser de nouveau le premier
dépôt. Procéder de la même façon pour le 3ème secteur de la boîte (Figure 3).
Placer la boîte à l'étuve (25 à 30°C), posée à l'envers c'est à dire sur le
couvercle.
Figure 2 : Zone de stérilité
Figure 3 : Méthode d’ensemencement en strie
COLORATION DE GRAM
Principe : C’est une coloration différentielle tenant compte des différences structurales de la
paroi bactérienne.
Réalisation :
1- Etalement et fixation du frottis : fixation simple à l’eau et à la flamme selon les indications
suivantes :
- Sur une lame, déposer une goutte de la suspension bactérienne
- Étaler la goutte, laisser sécher et fixer à la flamme du bec Bunsen (3 passages
successifs)
- Poser la lame sur le portoir reposant sur un bac de coloration
2- Réalisation de la coloration
a) Déposer du violet de gentiane ou cristal violet. Laisser agir de 30 secondes à 1
minute puis rincer à l'eau.
b) Verser du lugol (solution d'iode iodo-iodurée): et laisser agir 20 secondes ; Rincer à
l'eau.
c) Décolorer à l'alcool : verser goutte à goutte l'alcool sur la lame inclinée obliquement,
et surveiller la décoloration (5 à 10 secondes). Le filet doit être clair à la fin de la
décoloration. Rincer sous un filet d'eau
d) Recolorer à la fuchsine et laisser agir 30 secondes à 1 minute. Laver doucement à
l'eau.
e) Sécher la lame avec du papier absorbant
f) Déposer une goutte d'huile à immersion sur la lame
g) Observer au microscope avec objectif 100 (grossissement ×1000).
3- Explications des différentes étapes :

- Les étapes « a et b » colorent en violet le contenu de la bactérie. Le violet de
gentiane se fixe sur les composants cytoplasmiques de toutes les bactéries. Le lugol
permet de fixer cette coloration interne.
- L'étape « c » (alcool) sert à décolorer le cytoplasme des bactéries qui seront dites à «
Gram négatif ». En effet, celles-ci ont une paroi pauvre en peptidoglycane, donc plus
fine, qui va laisser passer l'alcool (molécule lipophile), et qui décolorera le cytoplasme
en éliminant le violet de gentiane. Au contraire, pour les bactéries dites à « Gram
positif » la paroi constitue une barrière imperméable à l'alcool car elle est composée
d'une « couche » de peptidoglycane plus importante donc de ce fait ; plus épaisse.
Elles resteront alors violettes.
- L'étape « d » est une contre-coloration ayant pour but de donner aux bactéries à
Gram négatif précédemment décolorées, une teinte rose permettant de les visualiser
au microscope. Les bactéries à Gram positif restées violettes seront évidemment
insensibles à cette contre-coloration plus pâle que le violet imprégnant leur
cytoplasme. La coloration de Gram permet de différencier la paroi bactérienne et de
scinder les bactéries en deux grands groupes:
o Gram+ qui ont un peptidoglycane épais (ex : Staphylococcus, Streptococcus)
o Gram- qui ont un peptidoglycane fin, surmonté d’une membrane externe
lipidique (ex : Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa).
PARTIE POUR L’ENSEIGNANT :
Samedi :
Préparer pour démonstration les milieux de culture suivants:
- GO – MH – GS- GSN- GC- SS- GDL- G. Chapman (une boîte stérile de chaque)
- 1 BO et 1 tube de Reilly (stériles)
Ensemencer pour démonstration:
- 3 GS : bactéries non hémolytiques, β-hémolytiques et -hémolytiques
- 2 G Chapman : S aureus et Staphylococcus mannitol –
- SS : colonies H2S+, lactose-
- 2 GDL : colonies lactose + et colonies lactose –
- 1 BO et 1 tube de Reilly
Lundi :
Ensemencer des BO avec un germe pur (S aureus et E coli)
(pour l’ensemencement des GO par les étudiants et pour la réalisation de la coloration de
Gram)

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9h00 – 9h 30 : Présentation du topo à la salle de Staff

9h30 – 9h45 : Présentation des différents milieux de culture (liquides et solides)

9h45 – 10h00 : Préparation de l’étalement pour la coloration de Gram

10h00 – 10h30: Réalisation de la coloration de Gram & Lecture au microscope optique

D’une manière générale, on distingue :

1. Les milieux ordinaires permettant la multiplication des germes peu exigeants et à

a. Gélose au sang frais (GS): L’addition de sang frais au milieu de base permet

Colonies rouges : lactose +

iii. Gélose Désoxycholate Lactose (GDL) : gélose contenant du lactose et 2 inhibiteurs

Figure 1 : Anse de platine

- Réalisation de l’ensemencement par la technique des stries

1. Prendre dans la main gauche, le tube de culture microbienne en bouillon, agiter

2. De la main droite, saisir l’anse, la tenir verticalement dans la flamme et la

3. Enlever le bouchon avec l'auriculaire et la paume de la main droite et flamber

4. Diviser mentalement la boîte en 3 secteurs égaux. Tenir la boîte de la main

Figure 3 : Méthode d’ensemencement en strie

3- Explications des différentes étapes :

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