Informe de PCR
Informe de PCR
Informe de PCR
INTRODUCCIN
Introduccin La invencin de la reaccin en cadena de la polimerasa
(PCR) por K. Mullis y sus colaboradores en 1985 ha revolucionado la
biologa molecular y la medicina molecular (Saiki et al., 1985). La
reaccin en cadena de la polimerasa es una tcnica in vitro utilizada
para amplificar enzimticamente una regin determinada de ADN
situada entre dos regiones de ADN cuya secuencia se conoce. Mientras
que antes solo podan obtenerse cantidades mnimas de un gen
especfico,
ahora
incluso
un
nico
ejemplar
de
un
gen
puede
Una enzima capaz de generar una copia de DNA a partir del DNA molde:
una DNA polimerasa. La reaccin se lleva a cabo en un tampn
apropiado para el funcionamiento de la enzima polimerasa. Adems,
como cofactores de la polimerasa se aaden cationes divalentes,
generalmente en forma de cloruro de magnesio (MgCl2).
Iniciadores de la reaccin: Las enzimas DNA polimerasas nicamente
son capaces de aadir nucletidos al extremo 3 libre de una doble
cadena de DNA. Son necesarios por tanto molculas cortas (entre 10 y
30 bases) de DNA de cadena sencilla. Estas
molculas son los cebadores o primers de la
Reaccin, ellos son los que van a delimitar el
fragmento a amplificar. Nucletidos libres: las
enzimas DNA polimerasas van a crear una
cadena complementaria a la cadena molde
mediante la incorporacin de nucletidos al
extremo 3 libre del cebador que se ha unido a la
cadena molde. Los nucletidos se aaden en
forma de desoxirribonuclesidos trifosfato (dNTPs). Estos cuatro
componentes son los elementos bsicos que es necesario incorporar a la
reaccin para que se complete una PCR.
MATERIALES:
dNTPs.
Dos cebadores o iniciadores (en ingls, primers).
Iones divalentes. Se suele usar magnesio (Mg2+), (Mn2+)
Iones monovalentes, como el potasio.
Una solucin tampn o buffer que mantiene el pH adecuado para el
funcionamiento de la ADN polimerasa.
ADN polimerasa (Taq).
ADN molde.
Termociclador.
Micropipetas
Tips o puntas plsticas.
Tubos
PROCESO
METODOLOGICO
Cada ciclo
PCR consta
de
de
tres fases:
1. Desnaturalizacin: En esta el ADN blanco de doble cadena se
somete a una temperatura de 90 a 95 C durante 30 segundos;
permitiendo la separacin de las dos cadenas.
2. Hibridizacin: En esta la temperatura de la mezcla se
disminuye hasta alcanzar la temperatura adecuada para favorecer el
apareamiento de los primers con la secuencia blanco, lo cual
generalmente ocurre entre 45 a 55 C (dependiendo de la
temperatura de Fusin o Tm de los primers) durante 20 a 30 segundos
3. Elongacin o extensin: En este la temperatura de la mezcla se
eleva hasta
72 C para que la Taq polimerasa (DNA polimerasa) comience el proceso
de extensin en direccin 5 a 3 agregando los nucletidos
correspondientes, obtenindose la hebra complementaria de DNA o
AMPLICN.
En cada ciclo de PCR se duplica todo el ADN presente en la reaccin, de
manera que en unas pocas horas se obtienen millones de copias de un
solo fragmento.
M. tuberculosis
Marcador: IS6110 (123pb), IS (89)
Procedimiento:
M1: control positivo
M2: control negativo
M3:.
FACULTAD DE CIENCIAS BIOLGICAS
M4:.
M5:..
IS 6110
REACTANTES
VOLUMEN(ul {FINAL}
)
Agua destilada
25,6
5X buffer
10,0
1X
25 mM MgCl
3,0
1,5 mM
2,5 uM dNTPs
4,0
200uM
25 uM cebador
2,0
1uM
Enzima
0,2
1U/tubo
ADN
MIX (ul)
50ul
Condiciones de PCR:
Pre-denaturacion: 95C x 3
Denaturacion: 95C x 30
Hibridacin: 67C x 45
Extensin: 72C x 30
30
Ciclos
Post-extensin: 72C x 3
5.4 Visualizar el resultado en gel de agarosa de acuerdo al tamao del
producto amplificado en la siguiente clase
FACULTAD DE CIENCIAS BIOLGICAS
SECUENCIA
IS6110
IS 3
IS 4
Temperatura de metilacin:
T=4(G+C)+2(A+T) C
PARA IS 3 : T= 4(3+8)+2(6+3) C
=62 C
CONCLUSIONES
En conclusin, la PCR es una nueva herramienta de investigacin y
diagnstico de laboratorio muy potente que abre todo un nuevo
mundo de posibilidades. Su aplicacin ha de ser limitada a
aquellos casos o estudios que lo permitan y en ningn momento
su aplicacin ha de desmerecer y suplir la tcnica oficial de
deteccin y enumeracin de Legionella (ISO 11731)
RECOMENDACIONES:
CUESTIONARIO
FACULTAD DE CIENCIAS BIOLGICAS
1.
BIBLIOGRAFIA
-Revista Nature Protocolos Aos 2009-2013
-Articulo Bodas de Plata de la PCR Revista Nova UCMC. 2008.
Gladys Pinilla
-PCR protocols second edition Jhon M.S. BARLETT DAVID STIRLIN
HUMANA PRESS TOOWA NEW YERSEY. VOL 226 2003
-RAPID CICLE REAL TIME PCR METHODS AND APPLICATION
MICROBIOLOGY AND FOOD ANALISIS. SPRINGER
U. REISTHL
C.WITTWER F. TOTKERILL 2002.