Universidad Autónoma del Estado de México

Facultad de Ciencias
Licenciatura en Biología

Materia:

MÉTODOS DE LABORATORIO Y CAMPO

Práctica

Práctica No. 5 Técnicas de microbiología

Integrantes:

· Diana Pamela Fabela Dominguez

· Hugo Andres Garcia Ramirez

· Adrian Yoltic Barrera Flores

· Anthony Tello Garcia

· Andrea Fidel De Jesús

Catedrático:

M. en C. Xochilt Aguilar Miguel.

1 SEMESTRE GRUPO: “B”

INTRODUCCIÓN
La microbiología es la ciencia encargada del estudio y análisis de los
microorganismos, (del griego «μικρος» mikros "pequeño", «βιος» bios,
"vida" y «-λογία» -logía, tratado, estudio, ciencia), también conocidos
como microbios. Ciencia que estudia los organismos que son sólo
visibles a través del microscopio: organismos procariotas y eucariotas
simples.
En el estudio y manejo de microorganismos, se han desarrollado con
una infinidad de técnicas las cuales se pueden llevar a la práctica,
considerando siempre el objetivo y las características propias de los
mismos.
Los pasos esenciales son:
1) Eliminación y desinfección del material. La esterilización es el
proceso de destruir todas las formas de vida microbiana; un objeto
esterilizado, en el sentido microbiológico, está libre de microorganismos
vivos. Los términos estéril, esterilizar y esterilización se refieren a la
ausencia o destrucción completa de los microorganismos.
2) Bioseguridad. Se define como el conjunto de medidas preventivas
destinadas a mantener el control de factores de riegos laborales,
procedentes de agentes biológicos, físicos o químicos logrando la
prevención de impactos nocivos.
3) Preparación de medios de cultivo. Él medio de cultivo constituye el
aporte de nutrientes indispensables para el crecimiento de los
microorganismos, la composición precisa dependerá de la especie que
se quiera cultivar, porque las necesidades nutricionales varían
considerablemente.
4) Siembra de microorganismos. Sembrar o inocular es introducir
artificialmente una porción de muestra (inóculo) en un medio adecuado,
con el fin de iniciar un cultivo microbiano, para su desarrollo y
multiplicación. Una vez sembrado, el medio de cultivo se incuba a una
temperatura adecuada para el crecimiento.
5) Técnica de tinción. Las técnicas de tinción son de gran importancia
en microbiología puesto que son el proceso mediante el cual uno
puede identificar en primera medida el tipo de microorganismo.
Dentro de las que se tienen en cuenta en el manual son técnicas
básicas, como lo son la técnica de tinción gram, que debido a su
colorante y al proceso permite identificar grampositivas y
gramnegativas, según la composición de la pared de las bacterias,
también encontramos tinción simple, tinción con verde malaquita entre
otros.
Uno de los sistemas más importantes para la identificación de
microorganismos es observar su crecimiento en sustancias alimenticias
artificiales preparadas en el laboratorio. El material alimenticio en el que
crecen los microorganismos es el Medio de Cultivo y el crecimiento de
los microorganismos es el Cultivo. Se han preparado más de 10.000
medios de cultivo diferentes.
Para que las bacterias crezcan adecuadamente en un medio de cultivo
artificial debe reunir una serie de condiciones como son: temperatura,
grado de humedad y presión de oxígeno adecuado, así como un grado
correcto de acidez o alcalinidad. Un medio de cultivo debe contener los
nutrientes y factores de crecimiento necesarios y debe estar exento de
todo microrganismo contaminante.
La mayoría de las bacterias patógenas requieren nutrientes complejos
similares en composición a los líquidos orgánicos del cuerpo humano.
Por eso, la base de muchos medios de cultivo es una infusión de
extractos de carne y Peptona a la que se añadirán otros ingredientes. El
agar es un elemento solidificante muy empleado para la preparación de
medios de cultivo. Se licúa completamente a la temperatura del agua
hirviendo y se solidifica al enfriarse a 40 grados. Con mínimas
excepciones no tiene efecto sobre el crecimiento de las bacterias y no
es atacado por aquellas que crecen en él.
La Gelatina es otro agente solidificante pero se emplea mucho menos
ya que bastantes bacterias provocan su licuación. En los diferentes
medios de cultivo se encuentran numerosos materiales de
enriquecimiento como hidratos de carbono, suero, sangre completa,
bilis, etc. Los hidratos de Carbono se adicionan por dos motivos
fundamentales: para incrementar el valor nutritivo del medio y para
detectar reacciones de fermentación de los microorganismos que
ayuden a identificarlos. El suero y la sangre completa se añaden para
promover el crecimiento de los microorganismos menos resistentes.
También se añaden colorantes que actúan como indicadores para
detectar, por ejemplo, la formación de ácido o como inhibidores del
crecimiento de unas bacterias y no de otras (el Rojo Fenol se usa como
indicador ya que es rojo en pH básico y amarillo en pH ácido. La Violeta
de Genciana se usa como inhibidor ya que impide el crecimiento de la
mayoría de las bacterias Gram-positivas)

OBJETIVOS
● Desarrollar las técnicas de estudio para organismos
microscópicos.
● Demostrar los métodos de siembra en medios de cultivo sólidos.
● Distinguir los microorganismos hongos y bacterias en cultivo.
● Describir las características de las colonias de bacterias y el
● crecimiento de hongos.
● Describir la morfología de hongos en preparación.

METODOLOGÍA

1. Nos ponemos el equipo de seguridad necesario (bata, cubrebocas, lentes de

seguridad y cubrebocas).

2. Conectamos y encendemos los mecheros Bunsen para crear un ambiente

estéril.

3. Tomamos la caja con el agar y marcamos con un plumón nuestras iniciales y

4 secciones en la parte inferior de esta.

4. Ponemos el asa de inoculación en el mechero bunsen hasta que esta este al

rojo vivo. En seguida, enfriamos y con esta misma, tomamos un poco de muestra
de tortilla, fresa o papaya y realizamos siembra por estría en un segmento con
una muestra, siembra lineal en otro con una muestra diferente, una por verrugas
y finalizamos repitiendo una de las muestras con

5. Tras realizar este proceso, metemos las cajas Petri a la incubadora durante
una semana a una temperatura constante de 20° a 30° Celsius. El monitoreo de
la temperatura debe ser constante para un desarrollo correcto de las bacterias y
el micelio.

6. Pasada la semana, sacamos las cajas de la incubadora y analizamos las

muestras obtenidas.

7. Colocamos un pedazo de Diurex sobre un portaobjetos, y con cuidado lo

ponemos encima del micelio para que este quede pegado sobre el Diurex.

8. Una vez este en el portaobjetos, añadimos tinte (azul de metileno o verde

malaquita), dejamos actuar durante 5 minutos y escurrimos el excedente.

9. Colocamos un cubreobjetos y analizamos la muestra en el microscopio.

Realizamos las anotaciones correspondientes.

10. En otro portaobjetos, colocamos una muestra de una de las bacterias de los
segmentos.

11. Repetimos el proceso de tinción.

12. Colocamos el portaobjetos y analizamos la muestra bajo el microscopio.

RESULTADOS
Anthony:
El micelio se desarrolló exitosamente, surgió una capa que permitió un análisis
aceptable en cuanto a lo observable.

El cultivo fue exitoso, se monitoreo que tuviese a una temperatura adecuada y

constante de 21° Celsius durante una semana, lo que favoreció el desarrollo de las
bacterias que, en su mayoría, fueron de Penicillium; en los segmentos, 3 y 4 pueden
observarse bacterias, sin embargo, no fueron identificadas en laboratorio, mientras
que en segmento 2, no parece haberse desarrollado nada.

Observación del desarrollo del micelio en la capa superior Cultivo bacteriano sobre una matriz de fresa, papaya y de
de la muestra de Penicillium cultivada sobre fresa podrida, Penicillium en base a una tortilla enmohecida.
papaya y tortilla enmohecida.
Anthony Tello García
Anthony Tello García

Se realizó una primera tinción con Verde Malaquita para la muestra de micelio, sin
embargo, sedimentan mucho y no pudo observarse correctamente.
 Imagen del micelio de Penicillium a 400x de aumento, teñido con verde
malaquita.

Anthony Tello García

Se observan manchas negras, que indican una anormalidad en el teñido, en este

caso, es una sedimentación por el secado inadecuado en la tinción.

Se realizó una segunda prueba con Azul de Metileno y fue exitosa.

Imagen del micelio de Penicillium a 400x de aumento, teñido con

azul de metileno

Anthony Tello García

Al observarse el micelio a detalle pudo determinarse que las líneas son esporangios,
también se observan algunas esporas que son los puntos repartidos alrededor de la
imagen. Las zonas blancas son zonas donde no hay tinción.

Se realizó lo mismo para el Penicillium cultivado a partir de la tortilla enmohecida.

Imagen del Penicillium extraído de tortilla enmohecida, capturada

a 1000x de aumento, teñido con azul de metileno

Anthony Tello García

No pudo analizarse bien por la imprecisión; ya que hay zonas que no se tiñeron
completamente, por lo tanto, no tenemos un resultado concreto.

Hugo Andrés:

Primeramente empezamos cultivando el hongo de la fresa, seguido de la tortilla y de

la papaya haciendo un cuadrante de 4 cada uno con diferentes técnicas de cultivo
(estrías, lineal puntos y nuevamente estrías).

Metiendo la caja petri a la incubadora teniendo una temperatura en un rango de 20°

y 30°.

Lo dejamos en la incubadora 1 semana esperando el resultado de dicha muestra de

hongo.
 Presencia de hongo en el cultivo, extraído de tortilla, papaya y fresa.

Hugo Andrés García Ramírez

Ya pasada la semana saque la maestra de la incubadora y teniendo en cuenta que

si había presencia de hongo pase a abrir la caja petri y así extraer una parte del
micelio para verlo bajo el microscopio. Los resultados fueron los siguientes:

Imagen de micelio Penicillium a 1000x de aumento, teñido con azul de metileno

Hugo Andrés García Ramírez

Resultados de: Diana P. Fabela D.

Debido a restricciones de carácter técnico, no pude realizar la documentación

fotográfica que constatara el estado inicial y final de mi cultivo. No obstante, a
simple vista, el desarrollo de mi muestra parecía equivalente al de mis compañeros.
En adición, todos nosotros logramos alcanzar resultados exitosos. En mi caso
particular, el micelio prosperó de manera más significativa en aproximadamente tres
cuartas partes del área de la caja Petri donde se encontraba el hongo de la fresa y
las tortillas. A continuación, procedimos a realizar la tinción del micelio de
Penicillium de la tortilla con moho en la cinta transparente utilizando Azul de
Metileno, asegurándonos de aplicar la tinción de manera precisa y adecuada.

Imagen del Penicillium extraído de tortilla enmohecida, Imagen del Penicillium extraído de tortilla enmohecida,
capturada a 40x de aumento en un microscopio Laica, capturada a 100x de aumento en un microscopio Laica,
teñido con azul de metileno. teñido con azul de metileno.
Diana Pamela Fabela Dominguez. Diana Pamela Fabela Dominguez.

En este caso, la falta de precisión en el análisis impidió una evaluación adecuada,

ya que se observaron áreas con una tinción incompleta. En consecuencia, no se
pudo obtener un resultado definitivo.
 Imagen del micelio de Penicillium a 100x de aumento en
un microscopio Laica, teñido con azul de metileno.
Imagen del micelio de Penicillium a 40x de aumento en un
microscopio Laica, teñido con azul de metileno. Diana Pamela Fabela Dominguez.

Diana Pamela Fabela Dominguez.

Cuando se examinó minuciosamente el micelio, se pudo concluir que las estructuras

en forma de líneas corresponden a esporangios, además, se identificaron algunas
esporas dispersas en la imagen. Las áreas blancas representan las regiones
desprovistas de tinción.

Resultados de: Andrea Fidel De Jesús

Después de una semana en la que el cultivo estuvo a una temperatura de 21° C se

pudo observar el surgimiento de hongos, cabe destacar que hubo mayor
surgimiento en el cuadrante donde se realizó la siembra de la tortilla, de la cuál
surgió el hongo Penicillium, por ello, se optó por tomar la muestra del micelio de
dicho cuadrante.

Medio de cultivo de hongo de fresa, papaya y tortilla

Andrea Fidel De Jesús

Posteriormente se realizó la tinción, para ello se utilizó Azul de Metileno.

Proceso de tinción

Andrea Fidel De Jesús

Finalmente se observó la muestra en el microscopio, se puede visualizar la

presencia de esporangios y esporas.
 Micelio de Penicillium,tinción azul de Metileno 40 X

Andrea Fidel De Jesús

Resultados: Adrián Yoltic Barrera Flores

Se preparo una siembra con agar macconkey en una caja Petri en la que se insertó
esporas de diferentes hongos, la muestra estuvo en la incubadora aproximada
mente por una semana a una temperatura no menor a 21°C.

Durante la segunda practica pudimos observar los resultados el agar se mantudo en

una buena temperatura lo que proporciono los medios para la proliferación de
hongos entre los que se encuentra PENICILLIUM (Penicillium spp)

Cultivo de Tortilla, Fresa fermentada y

Papaya fermentada

Posterior mente se extrajo una muestra de los hogos que se desarrollaron en el agar
y se utilizaron tintes como el azul de metileno y la verde malaquita para poder verlos
en el microscopio

Imagen del micelio de Penicillium a 400x de

aumento, teñido con verde malaquita
 Imagenes del micelio de Penicillium a 400x
de aumento, teñido con azul de metileno

CONCLUSIÓN

En todos los casos se desarrolló un micelio encima del agar, el cual fue
analizado con un microscopio.

Los resultados indican que la descomposición de alimentos es causada

por un proceso de fermentación bacteriana.

El micelio es una estructura formada por las hifas de las bacterias, que
crecen y se ramifican para formar una red.

El uso del microscopio permitió observar con mayor detalle las

características del micelio.
En este reporte de laboratorio se realizó un cultivo bacteriano en agar a
partir de papaya podrida, tortilla podrida y fresas podridas. Se observó
que en todos los casos se desarrolló un micelio encima del agar, el cual
fue analizado con un microscopio.
En el caso de la papaya podrida, se observaron colonias de bacterias
con una forma circular y una coloración blanca. El micelio era de color
blanco y de una textura filamentosa.

En el caso de la tortilla podrida, se observaron colonias de bacterias con

una forma irregular y una coloración amarilla. El micelio era de color
amarillo y de una textura filamentosa.

En el caso de las fresas podridas, se observaron colonias de bacterias

con una forma irregular y una coloración roja. El micelio era de color rojo
y de una textura filamentosa.

Los resultados de este experimento indican que la descomposición de

alimentos es causada por un proceso de fermentación bacteriana. El
micelio es una estructura formada por las hifas de las bacterias, que
crecen y se ramifican para formar una red.

El uso del microscopio permitió observar con mayor detalle las

características del micelio. Se pudo observar que las hifas eran de un
tamaño y una forma variable, dependiendo del tipo de bacteria.

Este experimento es una demostración de cómo el uso de técnicas de

laboratorio puede ayudar a comprender los procesos biológicos que
ocurren en nuestro entorno.
CUESTIONARIO
1. Describa los diferentes métodos de siembra

Siembra en sustrato: Método tradicional: En este método, los hongos se cultivan

en sustratos naturales o artificiales. El sustrato puede ser una mezcla de materiales
orgánicos como paja, aserrín, cáscara de arroz, entre otros. El micelio se inocula en
el sustrato y luego se permite que crezca en condiciones controladas de humedad y
temperatura.
Cultivo en troncos: Algunos hongos, como los shiitakes y los maitakes, se pueden
cultivar en troncos de árboles. En este método, se perforan agujeros en los troncos
de madera, y se introduce micelio o esporas en estos agujeros. A medida que el
hongo crece, se desarrollan setas en la superficie del tronco.
Cultivo en bloques de sustrato: En este método, se crean bloques compactos de
sustrato inoculado con micelio. Estos bloques se mantienen en condiciones
controladas de temperatura y humedad para permitir que el hongo crezca y forme
setas.
Siembra en placas Petri: Este método se utiliza en la investigación y propagación
de hongos. El micelio se siembra en placas de Petri que contienen un medio de agar
nutritivo. Luego, se permite que el hongo

2. Menciona 5 métodos de cultivo específicos y para que

microrganismos están elaborados.

Cultivo de bacterias en agar nutritivo: Este método se utiliza para cultivar

bacterias. El agar nutritivo es un medio de cultivo que proporciona los nutrientes
necesarios para el crecimiento bacteriano. Se emplea en microbiología para aislar y
estudiar diferentes tipos de bacterias.

Cultivo de hongos en agar Sabouraud: El agar Sabouraud es un medio de cultivo

específico para hongos, especialmente levaduras y hongos filamentosos. Se utiliza
en microbiología médica y micología para el aislamiento y la identificación de
hongos patógenos y no patógenos.

Cultivo de células animales en medio DMEM: El medio Águila Modificada por

Dulbecco (DMEM) es utilizado para el cultivo de células animales en cultivos
celulares. Es adecuado para una variedad de líneas celulares y se utiliza en
investigación biomédica y biotecnología para estudiar células animales en
condiciones controladas.
Cultivo de células vegetales en medio MS: El medio de Murashige y Skoog (MS)
es un medio de cultivo específico para el crecimiento de células vegetales, como
cultivos de tejidos y callos. Se usa en la propagación de plantas in vitro y en la
investigación de biotecnología vegetal.

Cultivo de levaduras en medio YPD: El medio YPD (levadura extracto de peptona

dextrosa) es un medio de cultivo comúnmente utilizado para el cultivo de levaduras,
incluyendo la levadura de panadería y la levadura de cerveza. Se emplea en la
industria

3. Describa en 5 tipos de hongos, su estructura microscópica, con

esquemas o dibujos originales.

Aspergillus: Los conidios de Aspergillus son estructuras microscópicas

que se asemejan a cadenas de esporas. Estos conidios están
dispuestos en una cabeza en forma de vesícula y se conectan por un
delgado tallo.
Penicillium: Penicillium presenta conidios en forma de pincel, que se
agrupan en cadenas largas llamadas cadenas conidiales. Cada conidio
tiene una estructura característica de cabeza en forma de globo y un
tallo delgado.

Candida: La estructura microscópica de Candida incluye levaduras

ovales o esféricas. Pueden mostrar brotes (yemas) en su superficie, lo
que es una característica distintiva.
Mucor: Mucor es un hongo con esporangios, que son estructuras
redondeadas que contienen esporas. Estos esporangios se producen en
esporangióforos que se elevan por encima del micelio.

Agaricus (hongo de champiñón): La estructura microscópica de Agaricus

incluye láminas que contienen esporas llamadas basidios. Los basidios
están dispuestos en las láminas y liberan esporas al ambiente.
4. Integre en secuencia los materiales o equipos utilizados en la práctica
con nombres.
Equipo de protección personal y de
limpieza. XV. Incubadora

II. Agua. XVI. Charola de tinción

Agar.
XVII. Portaobjetos
IV. Parrilla eléctrica y mosca.
XVIII. Cinta trasparente
V. Matraz y algodón.
XIX. Colorante azul de
VI. Autoclave lactofenol

VII. Cajas Petri XX. Cubreobjetos

VIII. Mechero Bunsen XXI. Microscopio

IX. Parafilm

X. Mechero Bunsen

XI. Caja Petri

XII. Marcador

XIII. Asa

XIV. Tortilla echada a perder

BIBLIOGRAFÍA

‌Insst (sin fecha) Penicillium spp.

https://www.insst.es/agentes-biologicos-basebio/hongos/penicillium-

spp#:~:text=Penicillium%20es%20un%20hongo%20filamentoso,rosados%2C

%20con%20reverso%20amarillo%20cremoso.

Asale, R.- (sin fecha) Esporangio | Diccionario de la Lengua Española.

https://dle.rae.es/esporangio.

Martínez-Córdova, L. M., & Sánchez-Hernández, M. A. (2022). Técnicas de teñido

en el laboratorio. Madrid, España: Editorial Síntesis.