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Wuolah Free Tecnicas Fundamentales en Biologia
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Microscopía
Las lentes de los microscopios aumentan la resolución de los objetos que vemos y el
microscopio es el resultado de combinar dichas lentes para poder potenciar dicha
capacidad de aumento.
Gracias a la capacidad de visión y al sistema óptico somos capaz de proyectar
imágenes, pero nuestros ojos tienen un límite de resolución (0.1 mm, 100 μm).
- Este límite es el tamaño mínimo de un objeto para poder ser visto.
- El problema es que el tamaño de las células animales ya se encuentra por debajo
del límite del ojo humano por tanto necesitamos de una ayuda para poder verlas.
- Las lentes pueden producir imágenes aumentadas de los objetos, aumentando la
resolución. Pueden combinarse y así potencian su capacidad de aumento.
- Un microscopio es un instrumento formado por lentes combinadas.
Dos grandes tipos de microscopios:
1. Microscopios Ópticos:
- Utilizan radiación electromagnética, normalmente luz visible.
- Límite de resolución: 0.2 μm.
- Hay muchos tipos de microscopios ópticos, aportando cada tipo información
complementaria.
1.1. De campo claro
1.2. De campo oscuro
1.3. De contraste de fases
1.4. De luz polarizada
1.5. De fluorescencia
1.6. De láser confocal
2. Microscopios Electrónicos:
- Utiliza electrones acelerados mediante campos eléctricos.
- Límite de resolución: 0.001 μm, 1nm.
- Dos tipos principales:
2.1. ME de transmisión (MET)
2.2. ME de barrido (MEB)
Preparaciones y muestras.
- Las muestras histológicas son cortes finos de tejido colocados en láminas de
cristal.
- No pueden ser observadas directamente en un microscopio. Precisan un proceso
previo.
- El tratamiento de las muestras implica tres procesos principales: Fijación, Corte
y Tinción
1. FIJACIÓN.
- Las células son elementos altamente organizados y termodinámicamente
inestables, por ello, requieren energía para mantener su organización.
- Cuando una célula o un tejido se separa del organismo esta muere ya que cesa el
aporte de energía y empieza un proceso de desorganización, alterando de forma
drástica la estructura.
- La fijación es un tratamiento físico o químico que inmoviliza las
macromoléculas celulares. Proteínas y lípidos. Evita la desorganización,
manteniendo la estructura parecida a la del estado vivo/funcional.
- Hay dos tipos:
1.1 Fijación física: Congelación.
1.2 Fijación química: Tratamiento con productos citotóxicos que inducen el
establecimiento de enlaces covalentes cruzados entre proteínas solubles y
estructurales provocando así inmovilización.
2. CORTE
- Se precisa obtener secciones finas de las muestras para observarlas al
microscopio. Deben ser finas para que la luz las atraviese, si la muestra es
gruesa resulta opaca a la luz y no se forma imagen.
- Se cortan gracias al microtomo. Antes del corte se realiza un tratamiento para
endurecer el tejido. Congelación. Inclusión.
- El microscopio forma una imagen plana de una proyección vertical. Los
elementos en distintos planos de un eje vertical se proyectan en el mismo punto.
Se produce un solapamiento que impide resolver los elementos.
3. TINCIÓN
- Las células y los tejidos tienen en general coeficientes de absorción muy bajos.
Absorción: disminución de la amplitud de la onda (intensidad) al atravesar el
objeto Si no hay absorción, la luz no se modifica al atravesar la muestra, es
transparente. No se forma una imagen. Es necesario realizar un proceso de
tinción con colorantes para aumentar la absorción diferencial.
- Un colorante reacciona químicamente con determinados compuestos de un
tejido. El colorante modifica la absorbancia del objeto y transforma diferencias
químicas invisibles en diferencias de color. Un mismo tejido teñido con
diferentes colorantes puede mostrar un aspecto muy variable.
- Agua, n=1,33
- Aceite de cedro, n=1,515
- Monobromonaftaleno n=1,66.
4. El ángulo de apertura que forma los rayos más externos que entran en la lente.
Se define el semiángulo de apertura como la mitad del ángulo de apertura, (θ = α/2)
El límite de resolución es inversamente proporcional al seno del semiángulo de apertura
El producto del denominador, nsenθ recibe el nombre de apertura numérica (AN).
El límite de resolución será menor cuanto más pequeño sea el numerador (λ) y mayor el
denominador (AN).
El poder de resolución será mayor cuanto más pequeño sea el límite de resolución.
Ángulo máximo de incidencia que la lente es capaz de focalizar, α = 2θ.
- Una lente convergente recoge rayos lumínicos procedentes de un objeto y los
focaliza en un punto.
- Cuanto mayor es el ángulo de apertura mayor es la cantidad de luz emitida por el
objeto que se utiliza para formar la imagen.
Determina la luminosidad de la imagen. La luminosidad es crítica para formar
imágenes aumentadas porque el aumento produce un descenso de la densidad de luz.
El ángulo de apertura es mayor cuanto más cerca se encuentre la lente del objeto.
- Los objetivos de mayor resolución enfocan muy cerca de la muestra.
- Los objetivos de 40X y 100X presentan un mecanismo de amortiguación.
Se denomina apertura numérica (A.N.) al producto de n por el seno de θ.
La apertura numérica de la lente objetivo es el parámetro óptico más importante de un
microscopio.
Marca el límite del aumento útil.
- El aumento final debe estar entre 500X (A.N.) y 1000X (A.N.) de la lente
objetivo
- Si se pasa de 1000X AN se entra en el aumento vacío.
- La lente objetivo es crítica porque determina la calidad de la imagen intermedia.
El valor máximo obtenido para la A.N en un objetivo es de 1,4. Corresponde a:
- Ángulo de apertura de 143,6º. Sen 71,8=0,95
- Índice de refracción 1,5. Inmersión en aceite.
- Construido en 1886 por Carl Zeiss según diseño de Ernst Abbé
Lente condensadora:
No afecta al aumento pero sí a la resolución.
Condensa luz hacia la muestra.
- Incrementa la intensidad de luz que llega al objeto.
- Aumenta la luz emitida por el objeto para la formación de la imagen.
- Incrementa la luminosidad.
- Incrementa la resolución
Acción aditiva de las lentes condensador y objetivo
Aberraciones ópticas
Distorsión de la imagen en relación al objeto.
- Alteración de la distancia relativa de los puntos del objeto.
Proyección de un punto del objeto en una región más extendida.
- Solapamiento en la imagen de puntos próximos del objeto.
- Pérdida de resolución.
Dos tipos de causas de las aberraciones.
- Imperfecciones de la lente. Problemas técnicos.
- Intrínsecas a la naturaleza de la luz. Aberraciones ópticas.
Tipos de aberraciones ópticas.
- Aberración cromática.
- Aberración esférica.
- Curvatura de campo.
- Astigmatismo.
- Distorsión.
- Coma.
Tres son muy importantes en microscopía.
- Aberración cromática.
- Aberración esférica.
- Curvatura de campo
Se desarrollan mecanismos de corrección.
- El nivel de corrección da lugar a diferentes tipos de lentes.
Aberración cromática
Se produce cuando se usa luz blanca, λ 380-780 nm.
La disminución de la velocidad en un medio n>1 es diferente para cada λ.
- La luz de mayor λ disminuye menos su velocidad. Tiene menor ángulo de
desviación.
- La luz de menor λ disminuye más su velocidad. Tiene mayor ángulo de
desviación.
Un punto del objeto se focaliza para cada color en un punto distinto de la imagen.
Se produce superposición en la imagen de puntos próximos en el objeto. Imagen
difusa. Se corrige combinando varias lentes con distinta geometría e índice de
refracción.
- Una lente biconvexa de vidrio Flint se combina con una lente cóncava de vidrio
Crown.
- Las aberraciones de cada lente se compensan y anulan.
No es posible formar imágenes nítidas utilizando una sola lente.
- La construcción de lentes precisas implica el diseño de sistemas complejos de
lentes
Aberración esférica
Los rayos de un punto se focalizan de modo distinto dependiendo de la distancia al
eje óptico.
- Los próximos al centro del eje (rayos paraxiales) se focalizan más lejos.
- Los lejanos del centro del eje (rayos marginales) se focalizan más próximos.
Dos focos:
- Foco paraxial. Más lejano de la lente.
- Foco marginal. Más próximo a la lente.
La distancia entre los focos paraxial y marginal se denomina aberración de
esfericidad longitudinal (mm)
- Cuanto mayor es la distancia (aberración de esfericidad), menor es la resolución.
La aberración de esfericidad es inversamente proporcional al cubo de la longitud
focal.
- Mayor cuanto menor es la distancia focal. Lentes de alto aumento.
Microscopio.
El uso de diafragmas en las lentes (condensador, objetivo y ocular) suprime rayos
periféricos.
- Disminuye la aberración esférica.
- Disminuye la luminosidad y la definición.
Las aberraciones cromática y esférica se potencian entre sí. Se corrigen de forma
conjunta. Se corrigen combinando varias lentes con distinta geometría e índice de
refracción.
Corrección conjunta de las aberraciones cromática y esférica.
Las aberraciones cromática y esférica se potencian entre sí.
Se corrigen de forma conjunta combinando varias lentes con distinta geometría e
índice de refracción.
Las correcciones implican un aumento del número y complejidad de las lentes.
Proceso muy costoso.
Se aplica principalmente a las lentes objetivo, lentes más importantes del sistema.
En función del nivel de corrección se distinguen tres tipos de lentes objetivo:
- Objetivos acromáticos.
Corrección de la aberración cromática para dos colores: rojo y el azul. Extremos
del espectro.
Corrección de la aberración esférica sólo para el verde. Zona central del
espectro.
- Objetivos semi-apocromáticos.
Corrección cromática completa desde el azul al rojo.
Corrección de la aberración esférica para el rojo y el azul.
Contienen lentes de fluorita y por ello se les denomina también objetivos de
fluorita.
- Objetivos apocromáticos.
Tienen corrección completa de las aberraciones cromática y esférica.
Son los más perfectos. Alta complejidad de lentes.
Curvatura de campo.
Distintos puntos localizados en un mismo plano vertical del objeto se focalizan en
planos distintos.
- Los puntos próximos al centro del eje óptico se focaliza más lejos.
- Los puntos alejados del centro del eje óptico se focalizan más cerca.
El plano focal de una lente es una superficie cóncava hacia la lente, superficie de
Petzval.
- Un objeto plano vertical da lugar a una imagen curvada hacia la lente.
- No se puede enfocar todo el campo visual simultáneamente.
Se corrigen combinando varias lentes con distinta geometría e índice de refracción.
Corrección de la curvatura de campo
En función de la corrección o no de la curvatura de campo se distinguen dos tipos de
lentes objetivo
- Objetivos de campo curvo
Sin corrección de la curvatura de campo.
Lentes objetivo
Combinando la corrección de aberraciones esféricas, cromáticas y curvatura de
campo, 6 tipos:
- Acromáticos.
- Semiapocromáticos.
- Apocromáticos
- Plan Acromáticos.
- Plan Semiapocromático.
- Plan Apocromáticos.
Lentes oculares
Sistema óptico que forma la imagen final.
Aumenta la imagen intermedia y la transforma en una imagen virtual.
Estructura básica.
- Lente superior u ocular. Produce el aumento de la imagen intermedia.
- Diafragma. Elimina rayos marginales.
- Lente inferior o colectora. Aplana y aclara el campo.
Su estructura se puede complicar dependiendo del grado de corrección de
aberraciones.
Dos parámetros ópticos principales.
- Aumento lineal
- Índice de campo visual.
Bioquímica
Puentes de Hidrógeno
Por su distribución electrónica, en las moléculas de agua el átomo de O tiene carga
parcial negativa y los átomos de H cargas parciales positivas, por lo que se genera
un momento dipolar.
Debido a ello, entre esas moléculas se forman puentes o enlaces de H, que son
atracciones electrostáticas entre las cargas de sus dipolos.
Cada molécula de agua puede formar hasta 4 puentes de H con otras, actuando en
dos de ellos como donadora (carga +) y en otros dos como aceptora (carga -), por lo
que se forman agrupaciones reticulares de múltiples moléculas.
Los enlaces de H en el agua son cooperativos: su fortaleza es mayor cuantos más
haya. En el agua líquida se hacen y deshacen continuamente formando redes
dinámicas, con un promedio de 3,4 puentes de H por molécula.
En el hielo se forman 4 puentes de H por molécula, dando redes estáticas y
estructuras sólidas con un volumen mayor para una misma masa de agua, lo que
hace que tenga menor densidad que el agua líquida y flote en ella.
La formación de puentes de H condiciona las propiedades químico-físicas y la
reactividad del agua.
Propiedades físico-químicas del agua
Al compararla con compuestos similares, presenta propiedades poco corrientes
debido a la formación de puentes de H, que atraen a las moléculas entre sí
Tiene puntos de fusión y ebullición muy elevados, por lo que mayoritariamente está
en estado líquido a la temperatura de la superficie terrestre.
La mayoría de los compuestos de peso molecular similar son gases a temperatura
ambiente.
Además, las propiedades coligativas del agua como disolvente (como el descenso
crioscópico o la presión osmótica), que dependen de la concentración del soluto,
tienen valores mucho mayores que los de otros solventes. Ello se debe a su gran
entropía y a la formación de puentes de H con otras moléculas de agua.
También tiene un valor de tensión superficial muy superior a los de otros líquidos
comparables, como metanol, etanol, éter o acetona.
Su alto calor específico es muy útil en el contexto vital, ya que permite que actúe
como tampón térmico.
Puentes de H en biomoléculas.
No sólo se dan en el agua. Son atracciones electrostáticas que se producen por la
interacción entre un grupo donador, formado por un átomo de H unido
covalentemente con O o con N, y un grupo aceptor formado por O o N con un par
de e- libres.
Las biomoléculas con grupos cargados y no cargados polares se disuelven bien en
agua porque forman puentes de H con las moléculas de agua y ello tiene un efecto
estabilizador.
Los puentes de H también son muy importantes para la estructura de las
macromoléculas
2. Equilibrios iónicos
Este proceso se favorece porque los enlaces de hidrógeno y covalente del agua son
fácilmente intercambiables.
Esta cualidad permite una gran movilidad de los H+, vía salto de protones entre
un H3O+ y moléculas de agua unidas por puentes de H, que transcurren en
picosegundos.
¿Qué es el pH?
El pH representa la concentración molar de H+ de una disolución acuosa en escala
logarítmica, y se define como el valor negativo del logaritmo decimal de la [H+]:
pH = - log [H+]
De manera similar se define el pOH: pOH = - log [OH-]
Según el valor determinado experimentalmente de la Keq para la ionización del agua:
Keq = [H+] [OH-] / [H2O] = 1,8 · 10-16 M
y como el valor del agua [H2O] = (1000 g / 18 g/mol) / 1 litro = 55,5 M
el producto iónico del agua Kw = Keq · [H2O] = 1 · 10-14 M2 = [H+] [OH-]
y por tanto, - log [H+] - log [OH-] = 14 pH + pOH = 14
En el agua pura, cada molécula de H2O que se disocia provoca la aparición de un H+ y
de un OH-, por lo que [H+] = [OH-] = 10-7 M, y hay pH = 7, que es el valor de pH
neutro.
Cuanto mayor sea la [H+] menor será el pH y la disolución será más ácida Las
soluciones ácidas tienen pH < 7, y las básicas pH > 7. Las neutras, pH = 7
Una diferencia de 1 unidad de pH supone una de 10 veces en [H+]
El pH puede ser negativo (p.e., [H+] = 6 M, pH = - 0,78). Esas condiciones no suelen
darse en los seres vivos
La disociación de un ácido tiene como resultado la hidratación del H+, que favorece
energéticamente el proceso, mientras que a esa disociación se opone la atracción
electrostática entre el H+ y la base conjugada cargada negativamente.
Un ácido (o una base) fuerte es el que se disocia (casi) totalmente: HCl → H+ + Cl
Equilibrios de ácidos y bases débiles: Ka y pKa
La constante de equilibrio de la disociación de un ácido o base débil, o constante de
disociación Ka, es característica de cada uno y se define como:
HA ↔ A- + H+ Ka= [H+]·[A- ] / [HA] Cuando [A- ] = [AH] -> Ka =
[H+]
Cuanto mayor sea Ka mayor es la tendencia del ácido a disociarse (es más fuerte) De
forma similar al pH, en la disociación de ácidos y bases se trabaja con el pKa, que es el
pH al que [A-] = [AH]: pKa = - log Ka
También MOPS (pKa = 7,2), MES (pKa = 6,15), PIPES (pKa = 6,76)
- Absorbancia a 280 nm
- Detección con colorantes en solución: métodos de Lowry, Bradford o BCA
- Análisis en geles: tinciones con Azul de Coomassie, plata, fluorescentes
4. Técnicas preparativas:
CENTRIFUGACIÓN
Los métodos de centrifugación o ultracentrifugación tienen muchas aplicaciones, que
van desde la recogida de materiales en suspensión como primer paso de una
purificación hasta algunos análisis de tamaño, forma o interacciones moleculares.
Al girar un rotor se crea un campo centrífugo con una aceleración gravitacional g =
ω2 r Cualquier partícula o molécula sometida a él está sujeta a una fuerza centrífuga
Fc:
Fc = m g (1 - ρ/ρp)
Fc = m ω2 r (1 - ρ/ρp) Si ρp > ρ ; Fc es positivo, la partícula sedimentará
Si ρp = ρ; Fc = 0, la partícula no se moverá
Si ρp < ρ ; Fc es negativo, la partícula flotará
Sometida al campo centrífugo, la partícula o molécula se desplazará por el medio con
una velocidad de sedimentación: v = Fc / f = m g (1 - ρ/ρp) / f
f: coeficiente de fricción, relacionado con la forma y el tamaño de la partícula.
Coeficiente de sedimentación:
El coeficiente de sedimentación s de una partícula o molécula es su velocidad de
sedimentación por unidad de campo centrífugo s = v / g s = m (1 - ρ/ρp) / f
Depende de la masa, la densidad y la forma, que se relaciona con el coeficiente de
fricción f. En general, a mayor masa y mayor densidad, mayor s, pero la forma y
estructura condicionan mucho su valor.
Es característico de cada molécula o partícula, e independiente del campo centrífugo
aplicado: a mayor valor de s, la molécula se moverá más rápidamente en cualquier
campo centrífugo que se le aplique
Se mide en Svedberg: 1 S = 10-13 seg
Tipos de centrífugas
Centrífugas preparativas
Ultracentrífugas: Preparativas // Analíticas
Microcentrífugas
Airfuge
Según las características de las moléculas o partículas que queramos separar o
recoger, usaremos una fuerza centrífuga Fc mayor o menor
Fc = m ω2 r (1 - ρ/ρp)
Los dos términos con los que se puede condicionar Fc por parte de la centrífuga son
el radio r y la velocidad de giro ω
Para ello existen rotores intercambiables de tamaños y radios distintos, a los que se
aplican velocidades de giro mayores o menores
Fc = m g (1 - ρ/ρp)
Según las características de las moléculas o partículas que queramos separar o
recoger, aplicaremos una aceleración mayor o menor, que producirá una Fc mayor
o menor.
La fuerza centrífuga relativa o rcf se expresa en x g, es decir, veces la aceleración
de gravedad. Como g = ω2 r, para obtener la rcf adecuada se usan rotores de
distintos radios y capacidades, a los que se aplican velocidades de giro (en
revoluciones por minuto, rpm) mayores o menores
Rotores
Suelen ser de aleaciones de titanio o de aluminio. Cada centrífuga puede usar uno o
más. Con ellos no se puede sobrepasar el límite establecido de velocidad (rpm)
Hay que mantenerlos bien limpios, para evitar contaminaciones y corrosión, y es
esencial cargarlos de forma equilibrada
a) Flotantes: al girar el rotor, los tubos basculan, dando radios de giro muy
diferentes entre ambos extremos. Permiten una cantidad de muestra reducida
b) Angulares: los tubos están en posiciones angulares fijas dentro del cuerpo del
rotor. Permiten un mayor volumen de muestra
c) Verticales: tubos fijos en vertical, y campo centrífugo es más uniforme. Permiten
una rápida sedimentación de la muestra
d) Zonales: todo el interior del rotor está hueco para permitir un mayor volumen de
muestra. La carga y recogida del material puede ser con el rotor en movimiento
(dinámicos) o con el rotor parado (estáticos)
Para evitar accidentes, los rotores deben ser mantenidos limpios de agentes
corrosivos, y sobre todo, cargarse siempre de forma equilibrada, con tubos del
mismo peso en las posiciones enfrentadas
Modos de centrifugación
Hay dos tipos de centrifugación, dependiendo del objetivo de la separación y la
cantidad de muestra a procesar:
- Analítica: se usa con muestras pequeñas para evaluar el grado de pureza de una
preparación o bien para estudiar parámetros de una molécula ya purificada,
como su coef. de sedimentación, asociaciones con otras moléculas o cambios
estructurales en distintas condiciones químicas. Se realiza en una
ultracentrífuga analítica, que tiene un sistema óptico incorporado que realiza
las medidas durante la centrifugación.
- Preparativa: sirve para separar y recoger parte o todos los componentes de una
mezcla de interés. Es la más frecuente en laboratorios de Bioquímica. Existen
tres modalidades de centrifugación preparativa: -
diferencial: la mezcla se centrifuga y se separan dos componentes
heterogéneos: un precipitado o sedimento con las partículas de mayor tamaño
y coeficiente de sedimentación, y un sobrenadante con las de menor
zonal: la mezcla se aplica en la zona superior de un tubo con una solución más
densa, que puede ser homogénea o tener un gradiente de densidad. La
centrifugación separa los distintos componentes en bandas a lo largo del tubo
según sus coeficientes de sedimentación
isopícnica: la muestra se pone en un medio adecuado (como CsCl), que al ser
centrifugado se va concentrando hacia el fondo, generando un gradiente de
densidad y permitiendo la separación de los distintos componentes según su
densidad
Diferencial =>
Zonal =>
Isopícnica =>
Centrifugación diferencial
En esta técnica, la muestra ocupa la totalidad del tubo. Al aplicar el campo centrífugo,
los componentes con mayor coeficiente de sedimentación avanzarán a mayor
velocidad hasta el fondo del tubo
Tras la centrifugación se separan dos fracciones:
Tanto los sedimentos como los sobrenadantes suelen estar formados por partículas de
distinto coeficiente de sedimentación y no son homogéneos, aunque los sobrenadantes
pueden llegar a serlo si se centrifuga el tiempo suficiente
Se suele realizar en rotores angulares o verticales, porque permiten procesar mayor
volumen de muestra y la sedimentación se consigue en un tiempo menor
Habitualmente, en los procesos de centrifugación diferencial se aplican a una
mezcla etapas sucesivas de centrifugación con campos centrífugos y períodos de
tiempo crecientes, con objeto de separar sus componentes en fracciones
Homogeneización y fraccionamiento celular por centrifugación diferencial
Las células o tejidos se rompen y el homogeneizado celular se somete a
centrifugación a baja velocidad y durante un tiempo corto.
Se obtiene un precipitado con la llamada fracción nuclear y un sobrenadante, que se
puede volver a centrifugar.
Centrifugando los sobrenadantes de pasos sucesivos cada vez a mayor velocidad y
tiempo, se van obteniendo precipitados con las distintas fracciones subcelulares.
Para purificar una proteína se suele partir de una u otra de estas fracciones,
dependiendo de su localización subcelular.
Centrifugación zonal
Los componentes de una mezcla compleja se pueden separar completamente en un
único paso: la mezcla se aplica en una zona situada en la parte superior del tubo, y los
componentes se separan en bandas según sus coeficientes de sedimentación
Este sistema solo es capaz de separar bien componentes cuyos coef. de sedimentación
difieran por un factor ≥ 2.
Para evitar la sedimentación y mezcla sobre las paredes del tubo se usan rotores
flotantes o bien zonales, por lo que esta técnica suele permitir poco volumen de
muestra.
Para que no haya mezcla por difusión y convección de la muestra con el medio sobre
el que se deposita, éste debe tener mayor densidad (se llama colchón). Si la densidad
de algún componente de la mezcla es menor que la del colchón, no entrará y flotará
sobre él.
El tiempo de centrifugación es esencial. Si es muy largo, todas las partículas acaban
sedimentando
En la centrifugación zonal en gradiente de densidad el medio o colchón de
separación tiene una densidad creciente desde la boca al fondo del tubo, cuya misión
principal es favorecer más la separación disminuyendo las corrientes de convección.
Para formar los gradientes de densidad se usan sales de metales alcalinos (CsCl,
LiBr), hidratos de carbono (sacarosa, glucógeno, glicerol, dextranos, Ficoll), coloides
de sílice (Percoll), y otros. Se escoge uno u otro según las particularidades del proceso.
Gradientes de densidad
Discontinuos
Depósito escalonado de soluciones de distinta densidad.
Mediante centrifugación zonal, permiten separar y concentrar en las interfases de los
escalones fracciones subcelulares de densidad conocida, que no pueden entrar en el
escalón siguiente
Continuos
- Preformados
Se usan para separar, mediante c. zonal, los componentes de una mezcla en
base a diferencias en sus coef. de sedimentación.
Los más utilizados son gradientes con aumento lineal de la densidad, pero
también pueden ser con aumento en curva. Se generan con un gradientador y
soluciones de baja y alta densidad
- Autogenerados: centrifugación isopícnica (de igual densidad)
Los gradientes se generan durante la centrifugación. Sólo algunos
compuestos, que se concentran por centrifugación (como el CsCl), permiten
generarlos.
En este caso, lo determinante para la separación de los componentes de la
mezcla son sus diferencias de densidad: cada uno se enfoca en una banda en la
zona del gradiente que tenga su densidad.
La separación es independiente del tiempo y permite aplicación de la muestra
de forma zonal o en todo el tubo: cada componente acabará en la zona de su
densidad.
Cromatografía
Es el proceso durante el cual los componentes o solutos de una mezcla, disueltos en
una fase móvil, se van separando entre sí a medida que se desplazan con diferente
velocidad a través de un lecho fijo o fase estacionaria en una dirección definida.
Hay cromatografía plana y en columna, que a su vez puede ser cr. líquida o cr.
gaseosa.
Para la purificación de proteínas se suele usar cromatografía líquida (es decir, con
fase móvil líquida), bien con fase estacionaria sólida o con fase estacionaria
líquida. La matriz es el soporte sólido inerte que constituye o que fija la fase
estacionaria.
5. Técnicas analíticas
Electroforesis
Cuando se aplica un campo eléctrico a una solución, las moléculas de soluto con
carga positiva se desplazan hacia el cátodo (-), y las moléculas con carga negativa
lo hacen hacia el ánodo (+). Este desplazamiento se llama electroforesis.
Si ponemos las condiciones para que todas las moléculas tengan carga negativa,
todas irán hacia el ánodo, y si las hacemos pasar a través de las estructuras
reticulares de un gel, las interacciones con ellas retardarán su movimiento. En la
electroforesis, las moléculas de proteína, DNA o RNA son impulsadas por el
campo eléctrico más o menos en función de su relación carga/masa, y son
retardadas por la red tridimensional del gel más o menos en función de su tamaño
y forma, todo lo cual permite separarlas.
Las electroforesis de ácidos nucleicos se suelen hacer en geles de agarosa, mientras
que las de proteínas se suelen hacer en geles de poliacrilamida (PAGE).
En la técnica de PAGE nativa la carga es la propia de la proteína al pH de la
solución que se use, y la proteína mantiene su estructura tridimensional.
Electroforesis de DNA
Para los procesos de clonación, manejo y análisis del DNA, es necesario usar un
sistema que permita separar los fragmentos de DNA según su tamaño. En una
electroforesis en gel de agarosa, los fragmentos de DNA se ven impulsados por el
campo eléctrico y retardados por la malla tridimensional del gel Todas las moléculas
de DNA tienen la misma forma de doble hélice con esqueletos de desoxirribosa-
fosfato. Debido a la presencia regular del fosfato, todas tienen una fuerte carga
negativa distribuida uniformemente.
Como tienen la misma relación carga/masa y la misma forma, se separan sólo por
su tamaño: hay una relación semilogarítmica inversa con la movilidad, avanzando
más cuanto menor es su tamaño.
Espectrofotometría y colorimetría
Espectro de radiaciones electromagnéticas
Las radiaciones del espectro electromagnético se pueden clasificar en base a su longitud
de onda (λ). Éstas presentan un rango continuo de variación a lo largo del espectro, por
lo que las λ que definen los límites de cada región corresponden a valores orientativos,
pudiendo haber radiaciones con cualquier valor posible de λ
Energía asociada a la radiación: E = h f = h · c / λ
h: cte. de Planck f: frecuencia (hercios o ciclos/seg)
c: velocidad de la luz λ: longitud de onda
Intensidad, I: cantidad de energía que atraviesa la unidad de área, perpendicular a la
dirección de propagación, por unidad de tiempo
Espectroscopías: técnicas de análisis molecular basadas en el estudio de las
interacciones entre las radiaciones electromagnéticas y las moléculas
Ecuación de Lambert-Beer.
La espectrofotometría es la medición de la cantidad de energía radiante que absorbe un
sistema químico en función de la longitud de onda. Para medir esta absorción en la
región ultravioleta-visible-infrarrojo del espectro se usan los espectrofotómetros.
En los estudios espectrofotométricos no se mide directamente la luz absorbida, sino
magnitudes basadas en las intensidades de la luz incidente (I0) y transmitida (I o It),
como la Absorbancia (A o Abs) y la Transmitancia (T), ambas adimensionales:
A = log ( I0 / I ) T = ( I / I0 ) 100 A = log 1 / T
Según la Ley y ecuación de Lambert-Beer: A = ε · c · l y T = 10 –εc l
La absorbancia es directamente proporcional a la concentración de soluto c y al espesor
del medio l (o camino óptico). Por tanto, si conocemos el factor e, con un camino óptico
constante, la medida de A se puede usar para hacer medidas de concentración
El coeficiente de extinción molar ε se define como la Abs de una disolución 1 M de un
soluto para un paso óptico de 1 cm, a la longitud de onda que se esté midiendo. Los
espectrofotómetros permiten medir Abs y T a diferentes longitudes de onda.
Variación de la Absorbancia y la Transmitancia en función de la concentración
La absorbancia varía de forma directamente proporcional a la concentración de soluto.
La transmitancia varía de forma exponencial inversa en función de la concentración de
soluto.
La absorbancia de una disolución es la suma de las absorbancias de sus componentes
Ello permite descontar la contribución del disolvente al realizar la medida experimental
de la Abs de un soluto en disolución
También se puede medir la Abs de un solo compuesto en una mezcla que contiene
varios, restando la Abs del llamado tubo blanco, que contiene todos menos el de interés
Turbidimetrías
Ensayos enzimáticos
Enzimoinmunoensayo (ELISA)
Espectrofotometría de proteínas
La región de mayor absorción por las proteínas es el intervalo 180-220 nm, debido a las
transiciones electrónicas que provoca la absorción de energía por los enlaces
peptídicos. Sin embargo, esta zona no se suele usar para realizar medidas, porque hay
muchos otros compuestos biológicos que también absorben en ella
En el intervalo de 230-300 nm hay absorción por los grupos aromáticos de Trp, Tyr y
Phe. Por ello, para medir la concentración proteica normalmente se suele usar la A280,
ya que a esa l no absorben muchos otros compuestos. Aunque varía con las proteínas
porque depende de su composición en aminoácidos, aproximadamente: 1 U A280 ≈ 1 mg
de proteína / ml
Como mencionamos, algunas proteínas tienen grupos prostéticos o iones metálicos, que
suelen presentar absorción en la zona del visible, con lmax características de cada uno a
las que se pueden medir y estudiar las proteínas correspondientes
Colorimetría. Determinación de la concentración de proteína
Además de la medida directa, la concentración de proteína se puede medir mediante
métodos colorimétricos basados en la generación de cromóforos por un método
químico. En general, estos métodos dan mayor especificidad y sensibilidad
Turbidimetrías
Un turbidímetro mide la turbidez de una muestra, que se debe a la presencia de
partículas sólidas en suspensión en una solución. Éstas absorben o dispersan la luz,
provocando una absorbancia aparente. Como en este caso no se mide solo absorción de
luz, se suele hablar de densidad óptica (OD)
Un ejemplo clásico es la medida de la A600 para estimar la concentración o densidad de
bacterias en un cultivo, que suele ser un parámetro experimental de interés para medir
su tasa o fase de crecimiento. Ésta suele afectar a muchos parámetros del ciclo vital y
del metabolismo celular
Ensayos enzimáticos
Consisten en realizar una medida de la velocidad inicial V0 de una reacción enzimática
mediante la medida del aumento de la absorbancia del producto de la reacción en
función del tiempo, que es proporcional a su aumento de concentración. Se puede hacer
usando productos coloreados, fluorescentes o luminiscentes
Cuando la concentración de sustrato es saturante, V0 es proporcional a la cantidad o
concentración de enzima
Sustratos cromogénicos
Lo más habitual es usar un sustrato cromogénico sintético que no absorbe luz de una λ
determinada, y que el enzima transforma en un producto que sí la absorbe
Entre los sistemas cromogénicos más empleados están los que usan el para-nitrofenol
o la para-nitroanilina (pNA) como producto final coloreado, que tienen un máximo de
absorción a 405-410 nm
Para ello se sintetiza un sustrato en el que el cromógeno esté unido a un radical
mediante un enlace susceptible de ser atacado por el enzima que se desea medir. Esa
unión provoca que el cromógeno no absorba, pero al romper el enlace lo hace
Hay distintas variantes de ELISA, en función del tipo de análisis que se haga
Fisiología animal
PRNCIPIOS ÉTICOS DE LA EXPERIMENTACIÓN ANIMAL
1. INTRODUCCIÓN:
Cabe recalcar que cualquier persona que utilice animales para experimentación
debe tener unos conocimientos previos y haber pasado unos exámenes
El uso de animales de laboratorio está perfectamente regulado por legislación
Antes era poco habitual hablar de la ética de la investigación.
- El científico no tenía que adoptar ninguna postura moral particular
- No necesitaba sentirse especialmente comprometido con la sociedad que lo
sustentaba
- No creía que tuviera que responder ante las consecuencias de la actividad
en investigación
No cualquiera puede decidir o aplicar los valores con los que se debe proceder
para tratar estos animales, por tanto, se cree que lo más beneficioso para ambas
partes sea que la persona que decida esta manera de proceder sea una persona
que tenga mucho conocimiento en animales y que los conozca muy bien tanto a
nivel de organismo cómo a nivel físico por ello se delega este trabajo al hombre
de ciencia. Más si está especializado en animales o trabajó con ellos.
- Esta persona puede elegir, ya que dispone de los medios más adecuados
para interrogar a la naturaleza y esto le permite situarse en una posición de
autoridad y privilegio cognoscitivo.
- La persona que experimenta con animales y el profesional que le dio esos
conocimientos para poder realizar el trabajo, deben asumir la mayor
repercusión de sus propios actos y por ello la mayor obligación ética en su
trabajo.
En los últimos años se ha dado más a conocer este trabajo con animales, lo que
ha suscitado diferentes opiniones tanto en la comunidad científica como en
población. Entre ellas nos encontramos intensos debates opiniones encontradas y
acciones marcadas con vehemencia. Ante este tema, como otros muchos, la
población está dividida en varios grupos según su opinión:
- Grupos que son totalmente contrarios a experimentar con animales y entre
ellos nos encontraríamos dos subgrupos: moderados y extremistas
- Otra parte ve necesario y acepta esa experimentación con animales
siempre y cuando esté justificada y haya una razón por la que se deba
proceder a experimentar con ellos.
- Un tercer grupo en la población que no se involucran en el tema
Dentro de los grupos contrarios nos encontramos:
- Grupos moderados (PETA, People for the ethical treatment of the animals)
se denominan moderados, ya que no proceden de maneras violentas para
poder eliminar esa experimentación animal. Ellos buscan liberar o defender
a esos animales ya que actúan en base a un sentimiento de amor hacia esos
animales. Lo que hacen es sesgar la información para evitar que estos
sufran y así defenderlos. No solo intentan evitar la experimentación animal,
sino que también intentan que no se utilicen como comida, vestimenta o
entretenimiento. Ellos defienden que los animales son capaces de sufrir al
igual que los humanos y esos animales también tienen interés en dirigir sus
propias vidas, por lo tanto, los humanos no somos nadie para utilizarlos
como medio y así obtener un fin.
- Dentro de los grupos radicales recalcamos el papel de un filósofo: Peter
Singer que escribió Animal Liberation. Este libro defiende que todos los
animales somos iguales: seres vivos, y que no hay diferencia cualitativa
radical entre hombres y el resto de animales, ya que todos somos células
que funcionan coordinadamente. Por tanto, estos grupos no se rigen por un
sentimiento de afecto, sino que se rigen por una fundamentación teórica la
cual defiende que somos totalmente iguales y que no tenemos derecho a
imponernos o creernos superiores los seres humanos frente a otros grupos
animales.
A raíz del movimiento anti-experimentación animal también hay asociaciones o
grupos que se proclaman como defensores de los derechos animales y defienden
los derechos morales de estos diciendo que son iguales que los del hombre. Por
ello están en contra de cualquier utilización de los animales.
- La Liga francesa contra la vivisección
- El frente de liberación animal (ALF) en Inglaterra y USA
2. LEGISLACIÓN:
Ética de la responsabilidad:
- Autorregulación: balance riesgo/ beneficio
- Legislación sobre experimentación animal
- Evaluación y seguimiento por comités de ética
- Regla de las 3 Rs: reducción, reemplazo y refinamiento
Para poder realizar una evaluación correcta imparcial y equilibrada hay que tener
muy claro el valor de lo que estamos comparando, pondremos en una balanza:
- Perjuicio que se le ocasiona al ser vivo en el experimento
- Beneficio que obtendremos de la investigación y de las prácticas con ese
ser vivo
Fases de producción de una vacuna:
- Primera fase en la que se hace una revisión de la bibliografía científica que
hay sobre el tema, es decir, experimentos realizados ver hacia donde
podemos progresar en ese estudio y una vez que tienes clara la parte teórica
luego está la práctica.
- En el laboratorio el primer paso siempre suele ser el uso de programas
estadísticos, cálculos matemáticos, también ensayos in vitro con tejidos o
células.
- Si es un fármaco lo primero haces diseños sobre el
- Después de diseñarlo se prueba su eficacia, primero en animales, siempre
se eligen los animales que mejor se adapten y sean más idóneos a ese
fármaco
- Ante los resultados obtenidos probaremos en humanos, ambos géneros y
diferentes grupos de edad.
- Tras confirmar su eficacia ya podemos permitir la comercialización.
4. ALTERNATIVAS:
1. Reemplazo (técnicas):
- Sustitución de animales vivos vertebrados por embriones de animales
invertebrados ya que debido a su menor desarrollo del sistema nervioso se
cree que tienen menos capacidad de sentir dolor o tener sentimientos, estos
embriones deben estar en una fase de edad concreta y también recurrimos a
cultivos celulares de microorganismos.
- Trabajos con órganos o humores (fluidos como sangre o líquido
cefalorraquídeo) asilados de animales.
- Técnicas “in vitro” utilizando cultivos de órganos, tejidos o células. A
partir de una pequeña muestra del animal.
- Sistemas físico-químicos mimetizantes de funciones biológicas, intentar
recrear un ambiente como puede ser un órgano concreto replicando la
temperatura, acidez, fluidos y en ese caso se prueba a ver cómo reacciona
ente los cambios que nosotros queremos producirle pero totalmente aislado
al animal obteniendo los mismos resultados.
- Simulaciones de procesos fisiológicos y modelos matemáticos de
relaciones estructura actividad basados en propiedades fisicoquímicas de
principios activos, con ordenadores. Programas que recrean las condiciones
de la zona del animal o de la cavidad u órgano de estudio, es muy útil para
docencia, pero en el caso de la investigación, no tanto, ya que para realizar
el modelo final del programa necesitamos habernos basado en un estudio
piloto para el que necesitamos el uso de animales para desarrollar el
proyecto basándonos en información de las muestras del animal, el
ambiente y condiciones que luego recrearemos con el software. Por lo que
no se reemplaza, sino que solo reduces. Modelos matemáticos predictivos.
2. Reducir (técnicas):
- El ajuste de la calidad genética, sanitaria y ambiental de los animales para
lograr una mejor dispersión de los datos y como consecuencia la
disminución de los animales necesarios para la utilización de técnicas de
diseño experimental sofisticadas para la misma finalidad. Coger solos los
individuos mejor adaptados a nuestro experimento, con la calidad genética
buena la cual vienen garantizada por los lugares de los que obtenemos los
animales. Basarnos en cálculos estadísticos del tamaño muestral para poder
ajustar el número exacto para nuestro experimento.
- Planificación de las experiencias para compartir los mismos animales a lo
largo de las diferentes pruebas que haremos durante el exp.
- Establecimiento de bancos de datos, facilitando el acceso a literatura
especializada y estímulo de la publicación de los resultados negativos con
la finalidad de evitar repetición de experimentos.
En muchos casos las revistas no quieren publicar los resultados negativos, pero
esto sería básico y muy necesario ya que antes de hacer un experimento los
investigadores lo que hacen es consultar la información en artículos ya
publicados y en función de que ya haya dicho experimento el proyecto se anula,
pero si no obtenemos información dado que el exp. ya se ha realizado, pero ha
obtenido resultados negativos volveríamos a repetirlo fallando de nuevo y no
estaríamos contribuyendo a dicha reducción.
3. Refinamiento (técnicas):
- Perfeccionamiento de métodos para detectar el dolor
- Utilización de técnicas no invasivas o telemétricas, con dispositivos
externos al cuerpo.
- Empleo de análisis radiológicos para detectar tumores o deterioro orgánico
sin espera sintomatología aparente. Nos permite anticipar la eutanasia
evitando así el padecimiento prolongado del animal.
- Uso de analgésicos, tranquilizantes o anestésicos cuando las circunstancias
lo permiten teniendo en cuenta no alterar el experimento.
- El aprendizaje y la experiencia que realice los procedimientos. Cuanta
mayor es la experiencia se espera un manejo y precisión durante los
procesos a seguir.
6. RADIACIONES IONIZANTES:
¿Qué es son las radiaciones ionizantes? Y sus tipos
La radioactividad es la desintegración espontánea de átomos inestables
denominados radionucleidos y la energía excedente emitida de dichas
desintegraciones es radiación ionizante.
- Radiación α
- Radiación β
- Radiación γ
- Rayos X
-Radiación de neutrones
Conceptos y términos básicos
Actividad: toda la energía emitida por un isótopo radioactivo hacia un objeto u
organismo
Dosis absorbida: la cantidad de radiación recibida por el cuerpo u organismo
desde el isótopo
Dosis equivalente: el daño biológico que produce la radiación en el organismo o
cuerpo y depende del tipo de radiación (α, β, γ …)
Dosis efectiva: daño biológico real que sufre la zona concreta del organismo
cuerpo que ha sido alcanzado por la radiación
Terrestres
Naturales
Cósmicas
Medicina
Artificiales
Investigación
Industria
Radioterapia: usa partículas similares a las de los rayos X pero con una mayor
energía capaz de penetrar en el cuerpo se utiliza para tratar el cáncer ya que
actúa sobre el tumor destruyendo las células malignas e impidiendo que crezcan
y se reproduzcan.
Medicina nuclear: basado sobre todo en pruebas del tracto intestinal o del
estómago y para ello las personas deben tomar un control que no es más que un
contraste que no es más que un radiofármaco el cual contiene uno o más átomos
radioactivos ligados a una molécula transportadora esto es ingerido por el
paciente y se va observando el avance de estos átomos radioactivos debido a la
radioactividad que liberan a medida que van avanzando por el tracto intestinal
para poder detectar si hay estrechamientos o demás problemas
Radioinmunoanálisis
Aplicaciones en la agricultura
Se radian los suelos o campos de cultivo para mejorar la producción, así como
también se irradian los productos que se obtienen de la tierra para mejorar la
conservación de dicho alimento.
Aplicaciones medioambientales
Se utiliza la radiación para erradicar plagas, detectar la calidad de aguas
subterráneas, conocer la calidad de los suelos y estimar cálculos sobre la
contaminación del aire y del agua.
Efectos biológicos
Puede ser de dos modos:
Acción indirecta sobre la célula:
Al no actuar directamente sobre la célula actúa sobre la molécula que más
abundante es en los organismos vivos, el agua. La interacción con el agua da
como resultado, radicales libres. Son altamente reactivos y crean daños en el
organismo dado que estas moléculas son muy inestables y tienden a oxidar a
otras moléculas como proteínas haciendo que pierdan funcionalidad llegando a
producir lecciones en la célula.
Acción directa sobre la célula:
En este caso de la radiación interactúa con macromoléculas como ADN, ARN o
proteínas; ionizandolas y dando lugar a moléculas alteradas. Tiene como
resultados daños en el ADN siendo éstos los que tienen mayor transcendencia
biológica porque esta es la molécula que guarda la información para un correcto
funcionamiento celular y la cual se transmite a la descendencia.
Irradiación
Externa
SIn contacto con la
SOL
fuente de radiación
Inhalación
Efectos biológicos Externa AEROSOLES O GASES
PIEL
Contaminación
Ingestión
Interna
Penetración
HERIDAS DE LA PIEL
Radiotoxicidad:
toxicidad debida a las radiaciones ionizantes emitidas por un radionucleido
incorporado al organismo o por los productos resultantes. Depende de las
características radiactivas del isótopo inestable, de su estado físico químico y del
metabolismo del organismo.
Esta radiotoxicidad se ve reducida si la semivida del isótopo es corta por tanto se
elimina rápido del organismo también si la energía desprendida por el isótopo no
es muy grande o si el organismo es capaz de metabolizar dicho radionucleido.
En base a si afecta a la célula directa o indirectamente los efectos serán distintos.
Los dividiremos en dos grupos:
1. Somáticos:
A corto plazo: enrojecimiento de la piel o muerte del organismo
A medio plazo: efectos retardados como el cáncer
2. Genéticos:
A largo plazo: ya que solo los podemos ver en la siguiente generación
debido a que se transmiten a la descendencia
Artículos científicos
¿Qué es un artículo/documento científico?
- Es un informe escrito y publicado, que describe resultados originales de una
investigación. Además, debe ser preciso claro y breve.
Fisiología vegetal
Homogeneización y extracción
Queremos extraer de un tejido o conjunto de células una o varias moléculas para su
posterior análisis”. Por lo tanto, el proceso de extracción deberá permitirnos obtener
la mayor cantidad de moléculas, con la mayor pureza posible, a la vez que
preservamos su integridad estructural y, si es requerida, funcional.
¿Qué tipo de biomoléculas podemos querer purificar?
- Metabolitos: primarios como el almidón, celulosa, aminoácidos y secundarios
como alcaloides terpenoides, esteroles, fenoles.
- Ácidos nucleicos: DNA genómico, DNA plasmídico, DNA mitocondrial, RNA
mensajero, RNA ribosómico y RNA regulador.
- Proteínas: totales, específicas a un orgánulo o ara recuperar una actividad
enzimática específica.
- Otros: determinar valores de pH, Redox…
Fraccionamiento celular
- Por fraccionamiento celular se entienden una serie de técnicas basadas en la
ruptura de las células y la separación orgánulos o moléculas en función de sus
propiedades biofísicas. Este fraccionamiento puede ser total (recuperamos todos
los orgánulos en distintas fracciones) o parcial (recuperamos solo aquellos que
nos interese analizar). En función del tipo de recuperación deseada se emplearán
unos u otros métodos.
- Si queremos recuperar un solo tipo de orgánulos la estrategia es más sencilla
Ejemplo de extracción de núcleos:
1. Se homogeneizan las células a intensidad baja. Solo queremos romper
membrana celular y pared.
2. Una vez homogeneizado, añadimos detergente, a una concentración que va a
romper cloroplastos y mitocondrias, pero no núcleos. Tras varios lavados
obtendremos una fracción nuclear más o menos limpia.
3. El empleo de un gradiente de densidad nos permitirá separar nuestros núcleos de
los contaminantes que aun queden en la muestra
Fraccionamiento celular: gradiente de densidad
- Esta estrategia se basa en la creación de un gradiente empleando un densificante
(sacarosa, ficoll, percoll ) el cual se define superponiendo capas a concentración
decreciente.
- Por ejemplo, un gradiente de sacarosa puede consistir en una capa al 70%, otra al
30% y otra al 10% (esto varía en función del orgánulo o molécula a purificar).
- La muestra se coloca en la parte superior del gradiente, y se centrifuga a elevadas
rpm. Las partículas atravesarán el gradiente hasta que alcanzan un punto en que
su densidad se corresponde con la capa que los rodea (o esta es menor que la
siguiente capa). La fracción podrá ser purificada y analizada
Solución de extracción
- La solución de extracción ha de permitir una correcta solubilización de la
partícula problema, a la vez que la preserva de cualquier tipo de alteración que
pudiese ocurrir durante el proceso extractivo (oxidaciones, digestiones, rupturas).
- Principales componentes de las soluciones de extracción:
1. Solvente (agua, metanol, cloroformo, diclorometano, acetonitrilo…)
2. Tampón (cada molécula requerirá un rango de pH específico para ser estable)
3. Detergentes (necesarios para la correcta solubilización de proteínas y membranas)
4. Antioxidantes (DTT, Beta-mercaptoetanol,…)
5. Quelantes (EDTA, EGTA,… capturan iones metálicos bivalentes. Protegen
ácidos nucleicos al inactivar las nucleasas mediante la captura de su cofactor.)
6. Sal (NaCl, KCl, necesaria para la precipitación de ácidos nucleicos)
7. Agente caotrópico(sales de guanidina, urea,. Desorganizan la red tridimensional
del agua que rodea a las macromoléculas, afectando las interacciones no covalentes
y ayudando a solubilizar proteínas y ác. nucleicos. Permite los puentes salinos)
8. PVP o PVPP (requerido para secuestrar y eliminar polifenoles y otros pigmentos)
9. Inhibidores específicos (inhibidores de nucleasas, fosfatasas, proteasas, etc.
1 Solventes
El solvente universal para la mayor parte de las extracciones es el agua. No obstante, en
determinadas situaciones se deberán emplear otro tipo de solventes:
Del mismo modo podremos emplear inhibidores específicos cuando deseemos proteger
una biomolécula específica. Empleando inhibidores de RNasas, de Proteasas, de
fosfatasas, etc. Uno de los inhibidores más empleados en la extracción de ácidos
nucleicos es el EDTA. Este compuesto es un quelante, es decir, va a unirse a cationes
metálicos bivalentes. Estos cationes son cofactores de las nucleasas. Al retirar del medio
a los cofactores, la actividad de las nucleasas se reduce.
6 Antioxidantes y otros compuestos
Los antioxidantes van a prevenir la oxidación de las muestras debido a su alta capacidad
reductora. Esto es especialmente importante en muestras vegetales, puesto que algunos
pigmentos tienen tendencia a unirse de forma covalente a ácidos nucleicos y proteínas.
Los antioxidantes más comúnmente empleados son el 2-mercaptoetanol y el Ditiotreitol
(DTT). Concentraciones altas desnaturalizarán las proteínas, pero a baja concentración
preservarán la oxidación de residuos sulfidrilo.
A la solución de extracción se le podrán añadir sales (>3M NaCl reduce la
solubilización de azúcares). El cloruro de litio se emplea para precipitar el RNA o en
gradientes de densidad. Otros compuestos pueden ser necesarios para la estabilidad de
moléculas particulares o para mantener la actividad enzimática (i.e. Espermidina como
estabilizante del ARN).
Soluciones de extracción clásicas
Análisis de biomoléculas
Colorimetría
¿Por qué es útil la colorimetría en biología vegetal?
Es útil ya que cada compuesto químico interacciona de forma específica con la
luz. Por ello, podemos utilizar esta propiedad de la materia para identificar
compuestos químicos y determinar su abundancia en una muestra.
¿Por qué vemos los colores? Radiación electromagnética.
La radiación electromagnética es un campo electromagnético variable que lo que
hace es transportar energía de un lugar a otro y nosotros somos capaces de
percibir los colores nosotros somos capaces de distinguir los colores debido a que
una parte de la radiación emitida es absorbida por las partículas del objeto que
estamos mirando y eso es percibido por los conos y los bastones que tenemos en
nuestros ojos. En función de la longitud de onda con la que se transmita esa
radiación percibiremos unos colores u otros.
¿Qué le puede ocurrir a la luz?
Refracción se produce un cambio en la dirección de la onda al pasar de un medio
a otro
dispersión cuando atraviesa un material las ondas de luz se separan en relación a
las longitudes de onda de cada 1 los arco iris
difracción es un fenómeno físico y en él las ondas se desvían cuando encuentran
un obstáculo o al atravesar una rejilla
Qué ocurre cuando la radiación atraviesa nuestra muestra
Absorción los analíticos de la muestra absorben parte de la radiación esto es
propio de cada molécula
Transición electrónica la luz V puede ser absorbida por los electrones de
Valencia promocionándolos a un estado excitado si la energía de la onda es la
correcta esos electrones ocuparán un orbital vacío la energía que absorben se
disipa en forma de calor o calor + fluorescencia o fosforescencia
Emisión proceso en el que los electrones excitados vuelven al estado
fundamental emitiendo luz qué estás emisiones son radioactivas y pueden ser
fluorescentes o fosforescentes la energía de la luz emitida siempre va a ser
menor que la longitud de la onda incidente.
Transmitancia y absorbancia
Transmitancia óptica (T)fracción de luz incidente a una longitud de onda
definida que pasa a través de una muestra T igual AY partido de y sub cero
Absorbancia óptica(A) grado en el que se atenúa la luz cuando atraviesa una
muestra menos logaritmo de 10 te
Ambas son útiles en una región específica del campo electromagnético de 160 a
780 nanómetros
Ley de Lambert-Beer
Limitaciones de la ley de Lambert
Limitaciones reales cuando hay altas concentraciones la distancia entre las
moléculas que van a absorber esa radiación disminuye hasta tal punto que cada
molécula altera la distribución de la carga de las moléculas vecinas
limitaciones químicas se produce cuando el analito reacciona con el disolvente
dando lugar a productos y estos tienen propiedades de absorción diferentes a las
del analito
limitaciones instrumentales la ley solo se cumple de forma estricta con
radiaciones monocromáticas es decir que solo poseen una única longitud de
onda y éstas en la práctica no se consiguen ya que debido a los instrumentos que
se poseen solo se obtienen radiaciones con bandas de longitudes de onda más o
menos simétricas
Espectrometría
Monocromado
r
Fuente de radiación
- Lámpara de Deuterio: longitud de onda corta
- Lámpara de Tungsteno: región visible
- Arco de Xenón: longitud de onda larga
Selector de longitudes de onda: monocromadores
Recipiente para muestra: cubetas de cuarzo sílice y plástico
Detector de radiación: fotodiodos o fotomultiplicadores
Tipos de espectrofotómetros
- Haz sencillo
- Doble haz
- Diodos: la diferencia es que toda la luz que atraviesa de la muestra en lugar
de pasar por una única ranura de salida sale por un agujero dividido entre 64
a 4096 ranuras
- Fibra óptica
- Lectores de placas (UV-Vis/Fluo): capaz de medir fluorescencia
Cuantificación de ADN y proteínas
Medición entre la relación de absorbancia a 260 contra barra 280 nanómetros
si la pureza sale de 1,8 hacia arriba tenemos ADN puro
Método de Bradford el reactivo aislado es rojo y cuando reacciona con
proteínas vira a azul dependiendo de la intensidad del color que tome la
muestra lo mediremos con un espectrofotómetro y detectaremos la cantidad
de proteínas que contiene nuestra muestra
Cuantificación por fluorescencia los ácidos nucleicos y las proteínas
desnaturalizadas no presentan fluorescencia, pero son capaces de interactuar
con moléculas F dos horas produciendo así esa fluorescencia
Clorofila
La clorofila produce florescencia y gracias a ello se puede utilizar como
indicador del Estado fisiológico de las plantas haciendo una relación entre la
florescencia variable partida de la florescencia máxima de la planta nos indica
unos valores estando los óptimos entre 079 a 084 y los valores menores a estos
indican que la planta está sufriendo algún tipo de estrés.
Cultivo in vitro de tejidos vegetales
Es un cultivo en un medio nutritivo, bajo condiciones estériles y controladas, de
semillas, embriones, órganos, explantos, tejidos células y protoplastos de plantas
superiores y algas. Con unas condiciones de temperatura, luz, humedad, pH…
A partir de un cultivo celular animal no podemos obtener de manera natural un
organismo completo dado que las células se diferencian en distintos niveles y del
más complejo que alcanzan que sería las células madre no pueden volver a
niveles inferiores de manera natural por el contrario en plantas mediante un
esqueje si podemos obtener un organismo completo y esto se debe a que la
planta de manera natural puede hacer y deshacer los diferentes niveles de
diferenciación celular.
La clave de los cultivos vegetales es la manipulación de las hormonas vegetales:
ya que el exceso de algunas de ellas provocan procesos como enraizamiento o
caulogénesis, y debemos conseguir un balance entre las concentraciones de cada
una conseguiremos obtener un callo que son masas de células no diferenciadas
vegetales.
Tipos de cultivos
Cultivos histotípicos: un único tipo de células
Cultivos órganotípicos: dos o más tipos celulares
Cultivo de órganos: puede ser un órgano completo o un fragmento para
mantenerlo debemos aislarlo en una interfase líquido gas y en un ambiente
húmedo
Cultivo de explante: poco habitual en cultivos animales y de lo que consta es
coger un trozo del tejido de un órgano y dejar que las células de éste se
propaguen por la placa del cultivo de manera autónoma
Cultivo de disgregación: se elimina la estructura del órgano y la matriz
extracelular lo obteniendo así una monocapa de células