TEMA 1.

MICROSCOPIO ÓPTICO

Hans y Zacharias Jansen y Hans Lippersky (1590 – 1608) fueron los inventores del
primer microscopio óptico.

COMPONENTES DEL MICROSCOPIO

PARTE MECÁNICA
Base: en él se localiza el sistema de iluminación, el interruptor y el regulador de
intensidad de iluminación (reóstato)
Brazo: sostiene el revólver (pieza a la que están enroscado los objetivos), la platina y el
cabezal del microscopio, así como las ruedas de enfoque (1º foco burdo, 2º foco
micrométrico)
Cabezal: localizado en la parte superior del brazo, es el lugar donde se insertan los
oculares.
Platina: superficie horizontal donde se coloca la preparación. La preparación se sujeta
mediante las pinzas de la platina. El sistema de corredera de la platina permite el
desplazamiento de la preparación. Debajo de la platina hay soportes para el condensador
del diafragma y filtros. En algunos microscopios aparecen con escala.
PARTE ÓPTICA
Condensador: se trata de una lente móvil situada debajo de la platina. Consta de una
palanca, que se puede abrir o cerrar, denominada diafragma. La luz del bombillo es
recogida e incide sobre la preparación.
El diafragma tiene que estar abierto al máximo si la preparación está teñida, así como el
condensador debe estar pegado a la platina.
Para preparaciones no teñidas, nos interesa contrastar, luego cerraremos el diafragma.
Lentes: son las lentes objetivo (insertados en el revólver) y las lentes oculares
(insertadas en el cabezal).
 - Compuesto  posee más de una lente
- De campo claro  la muestra se ve en color sobre un fondo blanco
- Fotónico  funciona con fotones

LENTES
Son superficies de vidrio pulido. En el microscopio, las lentes son convergentes o
positivas.
La distancia focal de una lente depende de su geometría y del índice de refracción del
material.
Cuanto más esférica es la lente, menor es la distancia focal.
A mayor índice de refracción, menor es la distancia focal.

Cálculo del aumento:

Aumento lente objetivo * Aumento lente ocular
A mayor distancia focal, mayor aumento.
La posición del objeto respecto a la focal interviene en el aumento. Cuanto más cerca
está el objeto del punto focal, mayor es el aumento.

Imagen real  imagen invertida. Se forma en el lado opuesto de la muestra.

Imagen virtual  se forma en el mismo lado de la muestra. No son invertidas.
En el caso del microscopio óptico, al haber dos lentes, la primera imagen que se forma
es la imagen real y posteriormente, la virtual. Por eso, la imagen final está invertida.
A veces, se añaden lentes adicionales de un aumento relativamente bajo (1,25x, 1,5x…)
En ese caso, el aumento se obtiene multiplicando los aumentos del objetivo, el ocular y
la lente adicional.
El aumento no es lo mismo que la resolución, pues una muestra muy aumentada puede
tener poca resolución (nitidez).

PODER DE RESOLUCIÓN
Se denomina poder de resolución (PR) a la capacidad de distinguir dos puntos próximos
como entidades separadas.
Se denomina límite de resolución (LR) a la distancia mínima a la cual dos puntos
próximos se distinguen como entes separadas.

PR=1/LR LR=cte. Abber*(λ/AN) AN=n*senµ

cte. Abber=0,61
λ: longitud de onda
AN: apertura numérica (cantidad de luz que le llega a la lente)
n: índice de refracción
senµ: seno del semiángulo del cono de luz que le llega al objetivo

Para modificar PR hay que modificar AN.

Aumento útil  rango (500 – 1000 * AN del objetivo)

Ejemplo:
Si AN=0,08  (0,08*500 – 0,08*1000)  (40 -80)
Solo serán útiles los aumentos que estén comprendidos en este intervalo
 TIPOS DE MICROSCOPIO ÓPTICO

Microscopio de iluminación transmitida o diascópica  fuente de luz en la base

Microscopio de iluminación reflejada o episcópica  fuente de luz en la parte superior
del brazo
Microscopio óptico de campo oscuro  la iluminación es transmitida de forma oblicua
Microscopio óptico de luz polarizada  utiliza las propiedades birrefrigerantes de las
estructuras cristalinas. Consta de filtros polarizadores.
Microscopio óptico de contraste de fase  alrededor de las estructuras aparecen aros
blancos. Aprovecha las propiedades fásicas de los objetos (retrasa la luz ¼ de su
longitud de onda). Consta de una placa fásica que acentúa la desviación ¼, sumándose a
la anterior y llegando a dar un retraso de ½. La desviación de la luz se traduce en
diferencias de amplitud (más o menos brillo).
Microscopio óptico de contraste por diferencia interferencial (DIC)  utiliza luz
polarizada. Las muestras pueden ser objetos fásicos no teñidos. Se forman imágenes
pseudotridimensionales.
Microscopio óptico de fluorescencia  incorpora moléculas fluorescentes a la muestra,
aunque algunas muestras tienen fluorescencia endógena (pigmentos…)
Microscopio óptico CF/fluorescencia y microscopio óptico DIC/fluorescencia 
combinaciones de varios tipos.
Microscopio óptico confocal  es el de mayor resolución. Recoge información de un
único plano de foco.
Microscopio óptico invertido  el revólver se encuentra debajo de la muestra.
 TEMA 2. MICROSCOPIO ELECTRÓNICO

La fuente de iluminación es un cañón generador del haz de electrones. Este genera una
nube de electrones que se transmite por vacío. Esta fuente de iluminación es siempre
monocromática.
Las lentes electromagnéticas son un hilo de cobre por las que pasa la corriente de
electrones, condensándose.
La imagen final es aumentada y real. La imagen se proyecta sobre una pantalla de
fósforo verde.
La longitud de onda de los electrones depende del voltaje (20 – 200 kV). La distancia
focal de las lentes y su AN también dependen del voltaje.
La distancia de trabajo (distancia entre la muestra y la lente) es fija.
El aumento depende del voltaje aplicado a las lentes intermedia y proyectora (oculares).
 MICROSCOPIO ELECTRÓNICA DE TRANSMISIÓN
Se basa en la utilización de electrones primarios.

Al aplicar un determinado voltaje, los electrones que están en el filamento de Tungsteno

se liberan, formando un nube electrónica.
Primero se limita la cantidad de electrones del haz mediante la aplicación de un
potencial negativo. Posteriormente son atraídos por un gran voltaje positivo,
disparándose a gran velocidad hacia abajo.
Para modificar la trayectoria de los electrones se utilizan unas lentes electromagnéticas
cilíndricas, que llevan por dentro un bobinado de cobre. Al ser recorridas por una
corriente eléctrica se crea un campo electromagnético que obliga a los electrones que
entran a gran velocidad a girar hacia el centro de la lente. Variando la corriente
modificamos el grado de convergencia de los electrones (distancia focal).
Para que los electrones viajen por la columna y no se desvíen, se provoca un alto vacío
en el interior utilizando tres bombas en cascada: rotatoria, difusora e iónica.
Una vez que el haz electrónico ha sido afinado por las lentes, encuentra en su camino la
muestra que se quiere observar, atravesándola estos y formando una imagen en una
pantalla fluorescente.

El microscopio electrónico de alto voltaje utiliza voltajes de 200 a 1000 kV.

MICROSCOPIO ELECTRÓNICO DE BARRIDO

En este tipo de microscopios, los electrones no atraviesan la muestra, sino que arrancan
otros electrones de los átomos más externos de la muestra. Por eso se dice que su
funcionamiento se basa en los electrones secundarios.
Estos electrones arrancados son atraídos por un detector polarizado con un potencial
positivo y convertidos en una señal eléctrica. Esta señal es captada y se forma la imagen
en una pantalla.
Microscopio electrónico de barrido/de transmisión ambiental  permite visualizar
células vivas
Microscopio electrónico de transmisión-barrido  combina los dos tipos de
microscopios, utilizando tanto los electrones primarios como los secundarios.

MÉTODOS INDIRECTOS PARA LA OBTENCIÓN DE IMÁGENES

Microscopios con resolución atómica (de efecto túnel y de fuerza atómica) y
cristalografía de rayos X.
 TEMA 3. PROCESADO DE MUESTRAS EN MO
Protocolo general:

Disección: obtención del material biológico bajo condiciones de anestesia

Fijación: detener los procesos de autolisis que conducen al deterioro de las estructuras
celulares
Inclusión: meter el material fijado en un material acuoso que se solidifique

FIJACIÓN
Los objetivos de la fijación son:
- Detener los procesos de autolisis y así preservar los materiales que constituyen
las estructuras celulares y tisulares de manera que se asemejen, lo mejor posible,
a como se presentan “in vivo”
- Proteger frente a los tratamientos a los que se someterán las muestras en los
pasos siguientes del protocolo
- Proporcionar dureza al material
La fijación se basa en la inmovilización de los componentes químicos de las células y
los tejidos convirtiendo en insolubles sustancias que eran solubles.

Hay dos tipos de fijación:

Fijación física: criofijación, uso de microondas, uso de altas temperaturas…
Criofijación: preservación de forma casi instantánea de la distribución original de
elementos y moléculas por medio del frío
No se introducen sustancias químicas extrañas para inmovilizar los componentes
celulares. No hace falta inclusión si se sigue este método.
Para evitar la formación de cristales de hielo que rompan la célula, se utiliza una serie
de crioprotectores (glicerina o sacarosa) que favorezcan la vitrificación (paso de líquido
a sólido sin formación de cristales).
Se utilizan gases que licúan a bajas temperaturas (propano, nitrógeno, isopentano, freón
13, etano, helio).
Fijación química:
Se divide en fijación simple y fijación compuesta.
Fijadores simples: soluciones acuosas o tampones de un único reactivo.

Fijadores compuestos: mezcla de reactivos que por sí solo son fijadores.

Ej: Líquido de Zenker, líquido de Helly, fijador de Bouin, fijador de Carnoy, zamboni,
alcoholo-formalina.

Para efectuar una buena fijación hay que tener en cuenta varios factores: rapidez (ha de
ser lo más rápido posible), osmolaridad, volumen (el volumen del fijador ha de ser 40
veces mayor que el de la muestra), tiempo de fijación (24 – 48 horas), temperatura de
fijación (temperatura ambiente), tamaño de la muestra (tamaño pequeño), pH,
coeficiente de difusión del fijador.
Para fijar químicamente se pueden utilizar tres métodos:
1) Inmersión  introducir la muestra en un vaso de precipitado con el fijador
2) Perfusión  inyectar el fijador en el torrente circulatorio Se introduce la aguja
en el ventrículo izquierdo. Esta aguja está conectada a una bomba peristáltica
3) Combinación perfusión-inmersión

Como resultado de la fijación obtenemos:

- Inmovilización de las estructuras celulares y tisulares
- Se detiene la dinámica celular con lo que se evitan los procesos de autolisis
- Protección de los componentes celulares y tisulares
- Leve endurecimiento de las piezas

Para asegurar la detención del fijador, se procede al lavado posfijación, que elimina el
exceso de fijador. Dura de 24 a 48 horas y se utiliza agua, alcohol o soluciones
tamponadas.
Algunas muestras como los huesos están demasiado duras. Por ello se procede a la
descalcificación mediante una solución de ácido pícrico, nítrico 4%, líquido de Fol o
líquido de Ebner.

INCLUSIÓN
El líquido en que se incluye la muestra se denomina medio de inclusión. En microscopía
óptica suele usarse la parafina.
Sin embargo, antes de incluir la muestra hay que deshidratarla mediante una serie
creciente de alcoholes.
Posteriormente llega el aclaramiento, que consiste en introducir la muestra deshidrata en
un líquido intermediario que se disuelve tanto el alcohol como en parafina (disolvente
orgánico  xileno o tolueno).
Para finalizar, la muestra se sumerge en parafina líquida (imbibición).
La parafina líquida se vuelca dentro de un molde y solidifica.

CORTE Y MONTAJE
Microtomo: aparato que realiza los cortes
Hay varios tipos de microtomos: criostato, microtomo de desplazamiento, microtomo de
mano y vibrotomo (cortes gruesos de 20 – 40 µm) y microtomo de parafina (cortes finos
5 – 10 µm).

Los cortes manuales en parafina tienen la finalidad de eliminar la parafina que rodea el
bloque. Se denominan retallado (bordes) y desbastado (superficie)
El montaje puede realizarse de varias maneras:

COLORACIÓN
Un colorante (cromógeno + grupo auxocromo) es una molécula orgánica capaz de
absorber radiaciones electromagnéticas dentro de la región del espectro de luz visible.

Los colorantes ácidos reaccionan con los componentes básicos que se encuentran
fundamentalmente en el citoplasma. Los colorantes básicos reaccionan con los
componentes ácidos que se encuentran fundamentalmente en el núcleo. Los colorantes
neutros se utilizan para teñir la sangre.
Estos tres tipos de colorantes se fijan mediante el grupo auxocromo, mientras que los
colorantes indiferentes se disuelven dentro de determinadas sustancias de la muestra.
Los colorantes metacromático tiñen determinadas estructuras con un color que no es el
suyo. Ej: azul de toluidina tiñe de color rojo.
Los colorantes vitales no matan la célula que colorean.
También hay distintos procedimientos para teñir una muestra:
Mordiente: molécula que
favorece que el colorante
se ajuste al sustrato.

Dependiendo de las estructuras que queramos observar haremos una coloración:

El protocolo general a seguir es:

1) Desparafinado (omitir en caso de cortes de muestras incluidas en medios
hidrofílicos y criosecciones)
2) Hidratación
3) Colorante 1
4) Lavado en agua
5) Colorante 2
6) Lavado en agua
7) Deshidratación
8) Aclaramiento
9) Montado del cubreobjetos con Eukitt
Coloración histoquímica
Pone de manifiesto determinadas sustancias en las células y tejidos. Se basa en la
tinción con hematoxilina-eosina y PAS-hematoxilina. Mediante la técnica del PAS
ponemos de manifiesto polisacáridos simples, glucoproteínas neutras o ligeramente
ácidas, glucoproteínas de la membrana basal, fibras reticulares, glucolípidos y
pigmentos.

Técnicas especiales:
Inmunohistoquímica: uso de anticuerpos para detectar proteínas
Hibrifación in situ: uso de sondas para detectar ácidos nucleicos

Procedimientos:
Directo  el anticuerpo se adhiere al antígeno y estimula la sustancia que lleva
adherida, poniendo de manifiesto ese antígeno
Indirecto  el anticuerpo primario se adhiere al antígeno. A ese anticuerpo se la adhiere
otro anticuerpo llamado anticuerpo secundario (desarrollado en una especie diferente
del anticuerpo primario) y estimula la sustancia adherida o el complejo PAP, poniendo
de manifiesto el antígeno
Doble marcaje: poner de manifiesto dos Ac a la vez
Colocalización: detectar dos antígenos diferentes en una misma célula
Autorradiografía: marcar una molécula con un isótopo radiactivo

TEMA 4. PROCESADO DE MUESTRAS EN ME

Sigue el mismo protocolo que el procesado de muestras en MO, pero con algunos
matices.
MET
Medios de inclusión más duros y consistentes que la parafina

Los microtomos (ultramicrotomo y croultramicrotomo) hacen cortes ultrafinos (600 –

800 Å). Tienen cuchillas de vidrio o diamante.
Es muy común usar un corte semifino (2 µm) como un corte control que se estudia y
determina qué parte ha de ser estudiada. Este corte se retalla y nos quedamos solo con la
parte de la muestra que nos interesa.

Montaje:
No se utilizan tintes, se utilizan contraste con sales de metales pesados.

Tinción negativa: el metal pesado forma una capa alrededor de la partícula a observar
Tinción positiva: el metal pesado es absorbido por la partícula
Sombreado metálico: consiste en pulverizar la partícula con una fina capa de metal
pesado desde un ángulo. Los objetos de la preparación producen sombras en la capa de
metal dando lugar a una imagen con una cierta apariencia tridimensional.
Criofractura: consiste en la congelación de muestras biológicas con nitrógeno líquido,
seguido de una fractura en la muestra y el sombreado metálico de la superficie. La
imagen formada es observada al microscopio
Criograbado: en la criofractura, las células se congelan en un bloque de hielo que a
continuación se rompe con una cuchilla. Para más detalles se puede seguir la técnica de
criograbado: las células se someten a vacío y se elimina el agua por sublimación. Esto
hace que las estructuras sobresalgan en la superficie.
Inmunohistoquímica: igual que en MO. Las moléculas que se unen al Ac son oro
coloidal, ferritina, hierro dextrano, hemocianina y cabeza del T4.

MEB

Las muestras se fijan al portamuestras con la ayuda de una cinta adhesiva de doble cara
que es conductora.