2.

- Aislamiento Viral

Inoculacin de Cultivos Celulares

Inoculacin de Animales de Laboratorio Instituto de Virologa - C.I.C.V. - INTA

Aislamiento Viral

1. Inoculacin de Cultivos Celulares

Este mtodo de gran sensibilidad para algunos agentes virales, consiste en poner en contacto el material sospechoso con cultivos celulares susceptibles, para que el virus se multiplique y pueda detectarse su presencia por efecto citoptico (ECP) u otros mtodos (inmunofluorescencia, inmunoperoxidasa, hemoadsorcin, etc.)

1.1.Procesamientos de las muestras

a) Organos: trozos de 2 x 2 cm. se trituran con tijera y luego se morterean con arena o vidrio molido estril. Este macerado se resuspende 1/10 p/v en medio de cultivo de mantenimiento celular con antibiticos (100X) y se centrifuga a 3000 rpm durante 20 minutos a 4C. El sobrenadante constituye el inculo para los cultivos.

b) Hisopados: una vez suspendido el material recogido en medio de cultivo celular con antibiticos (100X) se

elimina el hisopo y la suspensin se centrifuga a 3000 rpm durante 20 minutos a 4C. El sobrenadante se constituye el inculo para cultivo celular.

c) Lquidos transcelulares: (cefalorraqudeo, sinovial, etc.) deben centrifugarse a 3000 rpm, durante 20 minutos a 4C, utilizndose el sobrenadante como inculo para cultivo celular.

d) Sangre: debe emplearse entera aunque puede diluirse 1/10, en medio de cultivo celular a fin de disminuir su citotoxicidad. Si se sospecha de una asociacin viral con poblaciones celulares, es conveniente separar la fraccin celular y luego inocular el cultivo celular.

e) Semen: se diluye la pastilla y/o pajuela 1/10 en medio de cultivo celular, y esta solucin constituye el inoculo para los cultivos. La toxidad del material seminal determina que luego de un perodo de adsorcin de 60 minutos debe descartarse el inculo y debe lavarse la monocapa con medio de cultivo celular (3 veces).

f) Material fecal: se macera y resuspende la materia fecal en medio de mantenimiento 1/10 p/v. Se clarifica por centreifugacin a 5000 rpm, 20 minutos a 4C y el sobrenadante se trata con una solucin de tripsina (10 ug/ml). 1 hora a 37C, inoculando luego el sobrenadante en cultivo celular.

1.2.Inoculacin de los cultivos

Se emplean cultivos en monocapa, primarios o de lnea, susceptibles al virus que se desea aislar (ver cuadro 1) con ms de un 75% de la superficie cubierta y en envases adecuados. Para este propsito se emplean tubos de Leighton o de ensayo comunes con laminillas de vidrio en su interior placas de 24 wells (LABTEK*). Estos cultivos deben estar libres de virus y anticuerpos que interfieran con los virus que se desea investigar. Por ejemplo, es frecuente que los cultivos primarios o de lnea puedan estar infectados con cepas no citopatognicas de BVDV o el suero bovino que se usa en el medio de crecimiento pueda tener anticuerpos y/o virus. Seleccionados los cultivos, se procede a : Inoculacion de la muestra (1 pasaje) , utilizando no menos de 3 tubos o wells por muestra de material, descartando el medio de crecimiento, se inoculan con 0,2 ml de suspensin problema por tubo o 0,1 ml por cada orificio de placa x 24w. En estas condiciones se incuban a 37C durante 45-60 minutos para facilitar la adsorcin del virus. Cumplimentado este perodo se debe volcar el inculo y realizar 2 lavados con medio de mantenimiento, particularmente en el caso de materiales muy txicos para la clulas como sangre, MF, semen, bazo, hgado, etc. Luego se incorpora 1,8 - 2 ml de medio de mantenimiento celular por tubo o 1ml por cada orificio de la placa y se incuba a 37C. Se observan diariamente al microscopio durante 7 das para la deteccin de ECP. Si no se detecta presencia viral al microscopio, se debe realizar un nuevo pasaje en cultivo celular (pasaje ciego). Segundo pasaje: se congela la muestra a 20C durante 1 (+/-) 1/2 hora y se descongela a 37C (BDV,IBR) y de ser necesario se clarificar por centrifugacin. Se procede a inocular como en el primer pasaje. Se considera negativo si cumplido el perodo de incubacin de este segundo pasaje (7dias) no se detecta presencia viral , para el caso de IBR, o se hace otro pasaje (3 pas.) en el caso de BVDV. Al finalizar el procesamiento de las muestras, se deben realizar los controles en tubo o placa aparte, positivo: se inocula el virus referencia conteniendo 100 DICT 50 y el negativo sin el agregado viral. Considerar que si el control positivo no presenta ECP en el tiempo estimado y/o las celulas

del control negativo se presentan anormales o con signos de toxicidad el aislamiento debe ser repetido.

1.3. Identificacin Viral

Para confirmar la replicacin viral y establecer con certeza su identidad, para ello se puede recurrir a varias tcnicas que, haciendo uso de reactivos de referencia, sirven para este fin: seroneutralizacin, fijacin de complemento, inmunofluorescencia, inmunoperoxidasa, ELISA o hemoadsorcin (descriptas en otros captulos).

2.

Inoculacin de Animales de Laboratorio

Se inocula animales de laboratorios (ratones, conejos, cobayos, etc.) susceptibles a la infeccin por el agente viral cuya presencia se sospecha. Este se multiplicar en el hospedador experimental con la produccin de diferente sintomatologa, hasta en algunos casos puede causarle la muerte.

Es un mtodo sencillo, sensible y rpido aunque son pocos los virus animales de nuestro inters que poseen huspedes de laboratorio susceptibles (ver Cuadro 1). No obstante, constituye una importante tcnica en la identificacin y caracterizacin de agentes (diagnstico diferencial).

2.1. Materiales y Mtodos

Procesamiento de la muestra.

Idem 1.1

2.1.1. Inoculacin de Ratn Lactante

a) Va Intracerebral: el punto de inoculacin es la interseccin de dos lneas una que va desde el ojo a la oreja y la otra perpendicular a esta lnea y cortndole por el centro. Se utiliza aguja y jeringa de tuberculina con dosis menor a 0,02 ml.

b) Va Intramuscular: se realiza la inoculacin en la masa muscular del miembro posterior, aspirando previamente pra asegurarse de no estar en vena. Se utiliza aguja y jeringa similar al anterior.

c) Va intraperitoneal: sujetando el animal por la piel de la nuca con el ndice y pulgar y con el resto de los dedos por los miembros posteriores y cola, se lo presenta de cbito dorsal para inocularlo en un punto del lado derecho y centro del abdomen. Se utiliza aguja y jeringa de tuberculina.

2.1.2. Inoculacin de huevos embrionados

Se seleccionan huevos de planteles libre de infecciones virales, observndolos en un ovoscopio o con iluminacin adecuada. De acuerdo al agente viral que se sospecha, ser la va de inoculacin y por ende, la edad del embrin (ver cuadro 1) a utilizar.

Cuadro 1 Aislamiento viral

CULTIVO DE TEJIDOS

ANIMALES DE LABORATOR IO OTROS

Bovine Herpesviru s Type 1

PRIMARIO LINEAS S RFB-TFB MDBK BOV. TURB. MDBK BOV. TURB. MDBK BOV. TURB. MDBK BOV. TURB. BHK MDBK IBRS2 BOV. TURB VERO

(BHV-1) Bovine RFB-TFB Viral Diarhoea Virus(BVDV ) Parainfluen RFB-TFB za Type 3 (PI-3) Bovine RFB-TFB Adenovirus (BAdV) Foot and Mouse Disease (FMDV) RFB-TFB TirFB

Ratn lactante (im., ic. o ip) Cobayo (adap)

Vesicular EP.BOV Stomatitis Virus (VSV) CERDOS

Ratn lactante Huevos embrionados Cobayo-Conejo

Bovine Entero

MONO.CO B. RFB-TFB BHK

Virus (BEV)

MDBK BOV. T (RB) MA 104 Explantos Huevos embrionados. MCA. PK15 (sin ecp)

Bovine RFB Rotavirus (BRV) Bovine Corona Virus (BCV) Pox V Homlogo Clasical Swine Fever Virus (CSFV) African Swine Fever Virus (ASFV) Porcine Parvovirus (PVP) Pseudorabi es Virus (PRV) RFP (sin ecp)

TFP C VERO Leucocito MS s RFP (IF HA) RFP y B TFP y B BHK MDBK Conejo (sc.) Ratn lactante (ic.) Huevo embrionado

Blue Tongue Virus (BTV) Ovine Pulmonar Adenomato sis (OPA)

Fibroblast IBRS2 o de pollo PK15 VERO BHK Histopatol oga

Huevos embrionados (ev.) -

Vas de Inoculacin

a. Cavidad Amnitica: el material inoculado ingresar en el embrin va bucal y respiratoria , pudindose multiplicar en cualquier tejido de ste. El embrin debe ser de 10-14 das de edad. Se desinfecta el extremo del huevo que posee la cmara de aire y all se perforar con un trcar o taladro adecuado. Con una aguja de 4,5 cm. de largo, orientada hacia la sombra del embrin se inocula 0,1-0,2 ml de material (Ver figura 1). Sellar el orificio con parafina fundida u otro sellador no txico.

b. Membrana corioalantoidea: Usada para virus que producen placas, lesiones herpticas o tipo pox. Los embriones deben ser de 10-12 das de edad. Se marca el punto de inoculacin en el costado del huevo donde se observa buena irrigacin de la membrana. Como es necesario hacer caer la membrana para obtener una buena superficie, se desinfecta el extremo del huevo que posee la cmara de aire y el punto de inoculacin . Con sumo cuidado se perfora la cscara y la membrana de la misma en el punto de inoculacin y se hace un orificio en la cmara de aire por donde se succiona con una perilla de goma para que se produzca una falsa cmara de aire. All se depositar el inculo de 0,1 - 0,2 ml con jeringa y aguja de tuberculina (ver figura 1). Sellar los orificios con parafina fundida u otro sellador no txico.

c. Cavidad alantoidea: el virus se difundir en el fluido e infectar las clulas ectodrmicas de la membrana. Se utilizan embriones de 10-11 das de edad, Observndose el ovoscopio, se marca en el extremo de la camara de aire, el punto de inoculacin que debe ser opuesto a la ubicaicn del embrin y con pocos vasos sanguneos. Se desinfecta y se perfora la cscara en dicho punto, inoculando (0,1-0,2 ml) con una aguja de 1,5 cm de largo que se introduce paralela a la pared del huevo (ver figura 2). Se sella con parafina fundida u otro sellador no txico.

d. Saco vitelino: se emplean embriones de 8-12 das de edad con gran saco vitelino, Se desinfecta el extremo de la cmara de aire y se perfora la cscara. Con una aguja en lnea recta (0,1 - 0,2 ml.) (ver figura 2). Se sella con parafina lquida u otro sellador no txico.

e. Endovenosa: se emplean embriones de 8-12 das de edad. Observndose al ovoscopio se selecciona una vena de buen grosor y que se dirija hacia el embrin. Se dibuja en la cscara su ubicacin. Usando un taladro adecuado se marca un rectngulo, enmarcando la vena y que slo interese la cscara, sin romper la membrana que se encuentra por debajo de sta. Se desinfecta la zona y con una aguja bien fina se inocula (debe observarse cmo el inculo al diluir la sangre, circula por la vena). Ver figura 2. Se sella con parafina fundida u otro sellador no txico.

Bibliografa

Proceeding of 75th. Annual Meeting U.S. Animal Health Association, 1971 "Recommended Standard Laboratory Techniques for diagnosing infectious bovino rhinotracheitis. Bovine virus diarrhea and Shipping fever (Parainfluenza-3)".

Edwin H. Lennette, Nathalie J. Schmidt. "Diagnostic Procedures for Viral and Rickettsial Disease". Third Edition.

Aislamiento viral - deteccin del genoma

Tipificacin del virus de la Bronquitis Infecciosa (VBI) por medio del RT-PCR y RFLP
La secuencia de la protena de la espcula del VBI es nica y por tanto puede ser usada para identificar los diferentes tipos del virus. Primero se utiliza el RT-PCR para amplificar el gen de la espcula y luego enzimas restrictivas que funcionan como tijeras moleculares, las cuales cortan el producto amplificndolo en porciones de longitud nica llamados fragmentos de restriccin. Cuando se visualizan en un gel de agarosa, los fragmentos de restriccin forman un patrn que puede ser usado para identificar los diferentes tipos de VBI en la muestra. Esta tcnica puede identificar todos los serotipos conocidos del virus y sus variantes. Adems permite reconocer la presencia de ms de un tipo del virus en la muestra.

Tipificacin del virus de la Bronquitis Infecciosa (VBI) por medio del RT-PCR y RFLP

RFLP

Tipificacin del VBI por la secuencia de los cidos nucleicos

La tipificacin del VBI tambin es posible por medio de la secuencia del cido nucleico. Tpicamente se amplifican en el RT-PCR las regiones hipervariables del gen de la glucoprotena de la espcula, las cuales son zonas de secuencias muy variables que correlacionan con el tipo de VBI. El producto amplificado puede ser directamente secuenciado para determinar el tipo de VBI en la muestra. Adems, la secuencia puede ser utilizada para buscar en GenBank (www.ncbi.nlm.nih.gov/), que es un banco de datos de secuencias de cidos nucleicos provenientes de todo el mundo. El anlisis filogentico que se conduce con los virus en la base de datos permite establecer la relacin entre los virus.

Tipificacin del VBI por el RT-PCR de tiempo real

El RT-PCR de tiempo real es la reaccin de RT-PCR que incluye un tinte fluorescente o prueba etiquetada que se utiliza para la deteccin del ADN amplificado a medida que se va produciendo. La ventaja del RT-PCR de tiempo real es que puede ser hecho en cuestin de minutos y es cuantitativo. Se han desarrollado pruebas de RT-PCR de tiempo real especficas para el VBI (Callison et al. J. Virol. Methods 138:60-65, 2006).

Ct = umbral del ciclo o nmero del ciclo en que la cantidad de fluorescencia indica que la muestra es positiva. Cuanto menor el valor del Ct, mayor la cantidad de virus en la muestra.

Cultivo celular
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Clulas epiteliales en cultivo, con tincin roja para la queratina y verde para el DNA.

El cultivo celular es el proceso mediante el que clulas, ya sean clulas procariotas, eucariotas o vegetales, pueden cultivarse en condiciones controladas. En la prctica el trmino "cultivo celular" se usa normalmente en referencia al cultivo de clulas aisladas de eucariotas pluricelulares, especialmente clulas animales. El desarrollo histrico y metodolgico del cultivo celular est ntimamente ligado a los peptidos cultivares del cultivo de tejidos y el cultivo de rganos. El cultivo de clulas animales empez a ser una tcnica rutinaria de laboratorio durante los aos 50,1 pero el concepto de mantener lneas de clulas vivas separadas del tejido de origen fue descubierto en el siglo XIX.2

Contenido
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1 Historia 2 Conceptos en el cultivo de clulas de mamfero o 2.1 Aislamiento de clulas o 2.2 Mantenimiento de clulas en cultivo o 2.3 Manipulacin de las clulas en cultivo 2.3.1 Cambios de medio 2.3.2 Pase de las clulas

2.3.3 Transfeccin y transduccin 2.4 Lneas celulares humanas establecidas 2.5 Generacin de hibridomas 3 Aplicaciones del cultivo celular o 3.1 Ventajas y desventajas de los cultivos celulares o 3.2 Estudios que emplean cultivos celulares o 3.3 Cultivo de tejidos e ingeniera o 3.4 Vacunas 4 Cultivo de clulas provenientes de organismos no mamferos o 4.1 Mtodos de cultivo de clulas de plantas o 4.2 Mtodos de cultivo de bacterias y levaduras o 4.3 Mtodos de cultivo de virus 5 Lneas celulares comunes o o

6 Referencias

[editar] Historia
El fisilogo ingls Sydney Ringer desarroll a finales del siglo XIX una solucin salina, conocida como solucin de Ringer, que contiene cloruro de sodio, potasio, calcio y magnesio, dicha solucin es capaz de mantener latiendo el corazn de un animal fuera del cuerpo.3 En 1885 Wilhelm Roux extrajo una porcin de la mdula de embrin de pollo y la mantuvo varios das en cultivo en una solucin salina tibia, estableciendo el principio de los cultivos tisulares. Ross Granville Harrison, trabajando en la Escuela de Medicina de la Universidad Johns Hopkins y ms tarde en la Universidad de Yale, estableci la metodologa del cultivo tisular en una serie de trabajos publicados entre 1908 y 1910. Las tcnicas de cultivo celular avanzaron significativamente en los 40 y 50, como soporte a la investigacin en virologa. La utilizacin de cultivos celulares para producir virus permiti preparar virus purificados para ser utilizados en vacunas. La vacuna Salk de la polio fue una de los primeros productos producidos en masa usando tcnicas de cultivos celulares. Esta vacuna fue posible gracias a la investigacin de John Franklin Enders, Thomas Huckle Weller y Frederick Chapman Robbins, quienes fueron galardonados con el Premio Nobel por el descubrimiento de un mtodo de crecimiento de virus en cultivos celulares de rin de mono

[editar] Conceptos en el cultivo de clulas de mamfero

[editar] Aislamiento de clulas

Las clulas pueden ser aisladas de los tejidos para cultivos in vitro de muchas maneras. Las clulas pueden ser purificadas con facilidad de la sangre, sin embargo slo los leucocitos son capaces de crecer en cultivo. Las clulas mononucleares se pueden liberar de los tejidos blandos mediante hidrlisis enzimtica con enzimas como la colagenasa, tripsina o pronasa, que degradan la matriz extracelular. Como alternativa se pueden colocar trozos de tejido en medio de crecimiento, y las clulas que crecen son aptas para el cultivo. Este mtodo es el conocido como cultivo de explantos.

Las clulas que se cultivan directamente desde un sujeto se conocen como clulas primarias. A excepcin de algunos derivados de tumores, la mayora de los cultivos celulares primarios tienen un periodo de vida limitado. Despus de un cierto nmero de divisiones las clulas entran en el proceso de senescencia y dejan de dividirse, generalmente manteniendo la viabilidad
[editar] Mantenimiento de clulas en cultivo

Las clulas se cultivan y mantienen a una apropiada temperatura y mezcla de gases (habitualmente, 37C, 5% CO2 y 95% O2) en un incubador celular. Las condiciones de cultivo varan ampliamente para cada tipo celular, y la variacin de las condiciones para un tipo celular concreto, puede dar lugar a la expresin de diferentes fenotipos. Adems de la temperatura y la mezcla de gases, el factor ms comnmente variado en los sistemas de cultivo es el medio de crecimiento. Las recetas para los medios de crecimiento pueden variar en pH, concentracin de glucosa, factores de crecimiento y la presencia de otros componentes nutritivos. Los factores de crecimiento usados para suplementar a los medios derivan a menudo de sangre animal, como el suero bovino. Estos ingredientes derivados de la sangre plantean una potencial contaminacin con virus o priones de los productos farmacuticos derivados. En la actualidad se tiende a minimizar o eliminar el uso de estos ingredientes cuando sea posible. Estrategias alternativas de abastecimiento involucran la sangre de los animales procedentes de pases con un riesgo mnimo de encefalopata espongiforme bovina, como Australia y Nueva Zelanda, y el uso de nutrientes purificada concentrados derivados de suero en lugar de suero animal entero para el cultivo de clulas.4 Las clulas pueden crecer en suspensin o de manera adherente. Algunas clulas viven de forma natural sin adherirse a una superficie, como las que existen en el torrente sanguneo. Otras necesitan una superficie, como la mayora de clulas derivadas de tejidos slidos. A las clulas que crecen sin unirse a una superficie se las llama cultivos en suspensin. Algunos cultivos celulares adherentes pueden crecer en plstico para el cultivo de tejidos, que puede estar recubierto con componentes de la matriz extracelular para aumentar sus propiedades de adhesin y proporcionar otras seales necesarias para el crecimiento y diferenciacin. Otro tipo de cultivo adherente es el cultivo organotpico que consiste en cultivar las clulas en un ambiente tridimensional a diferencia de las placas de cultivo bidimensionales. Este tipo de cultivo 3D es bioqumica y fisiolgicamente similar al tejido vivo. Sin embargo presenta dificultades tcnicas debido a varios factores (por ejemplo: difusin).
[editar] Manipulacin de las clulas en cultivo

Al estar generalmente las clulas en continua divisin durante el cultivo, es normal que crezcan hasta ocupar toda el rea o volumen disponible. Esto puede generar varios problemas:

Agotamiento de los nutrientes del medio Acumulacin de clulas apoptticas o necrticas Inhibicin de la divisin celular por contacto: los contactos entre clulas pueden desencadenar un arresto del ciclo celular

Diferenciacin celular promiscua provocada por los contactos intercelulares

Estos problemas pueden afrontarse mediante mtodos de cultivo celular en esterilidad. El objetivo de estos mtodos es evitar la contaminacin con bacterias o levaduras que competiran por los nutrientes y/o podran infectar y as eliminar las clulas. Toda manipulacin se lleva a cabo, tpicamente, en una campana de flujo laminar para evitar la entrada de microorganismos contaminantes. Tambin pueden aadirse antibiticos al medio de cultivo. Entre las manipulaciones ms comunes llevadas a cabo en cultivos celulares, se encuentran los cambios de medio, el pase de las clulas y la transfeccin.
[editar] Cambios de medio

El objetivo de los cambios de medio es renovar los nutrientes y evitar la acumulacin de productos metablicos potencialmente txicos y de clulas muertas. En el caso de las suspensiones celulares, las clulas se separan del medio mediante centrifugacin y se resuspenden en medio fresco. En los cultivos adherentes, el medio puede eliminarse directamente mediante aspiracin y reemplazarse por el fresco.
[editar] Pase de las clulas

El pase de las clulas supone transferir un pequeo nmero de clulas a un nuevo continente. Las clulas pueden cultivarse ms tiempo si se pasan regularmente, ya que as se evita la senescencia asociada a situaciones prolongadas de alta densidad celular. Con cultivos en suspensin el pase se hace fcilmente, tomando una pequea cantidad de cultivo que contenga unas pocas clulas y diluyndola en un volumen mayor de medio fresco. En cultivos adherentes, las clulas han de ser inicialmente despegadas; esto se efecta comnmente con una mezcla de tripsina y EDTA, aunque actualmente existen otras mezclas de enzimas para esto. Un pequeo nmero de las clulas despegadas pueden sembrarse en un nuevo continente.
[editar] Transfeccin y transduccin Artculos principales: Transfeccin y Transduccin (gentica)

Otro mtodo comn en la manipulacin de las clulas es la introduccin de un DNA externo por transfeccin. Esto se lleva a cabo a menudo para conseguir que las clulas expresen una protena de inters. Ms recientemente, la transfeccin de RNA interferentes se han llevado a cabo como mecanismos adecuados para suprimir la expresin de un particular gen. El DNA tambin puede ser introducido en las clulas usando virus, en mtodos llamados transduccin, infeccin o transformacin. Los virus, como agentes parsitos, son adecuados para introducir DNA en clulas, ya que esto forma parte de su ciclo normal de reproduccin.

[editar] Lneas celulares humanas establecidas

Una de las primeras lneas celulares humanas, obtenida de Henrietta Lacks, quien falleci de cancer de tero a partir de cul se obtuvieron estas clulas. El cultivo de clulas HeLa que se muestra en la imagen fue teido con Hoescht que se une al ADN coloreando de azul el ncleo.

Las lneas celulares originadas a partir de tejido de seres humanos presentan controversias bioticas, ya que pueden sobrevivir a los organismos parentales y ser utilizadas para el descubrimiento de tratamiento mdicos muy lucrativos luego del falleciemiento de las personas que las produjeron. Una decisin pionera en este aspecto fue el fallo de la Suprema Corte de California que en 1990 determin que los pacientes no tienen derechos propietarios sobre las lneas celulares derivadas de rganos retirados con su consentimiento.5 Se estima que aproximadamente el 20% de las lneas celulares humanas no corresponden al tipo de clulas que generalmente se asume que son.6 Esto se debe a que algunas lneas celulares crecen ms rpido que otras y pueden contaminar cultivos de otras lneas celulares y, con el tiempo, sobrecrecer y desplazar a las clulas originales. El contaminante ms comn es la lnea celular HeLa. Este hecho no es significativo cuando se estudian la propiedades generales del metabolismo celular pero es muy importante en la investigacin mdica enfocada en un tipo especfico de clulas. Los resultados de tales investigaciones contendrn errores, si no estn completamente equivocados en sus conclusiones, con posibles consecuencias para los desarrollos terapeticos basados en ellos.7 8
[editar] Generacin de hibridomas Artculo principal: Hibridoma

Es posible fusionar clulas normales con una lnea celular inmortalizada. Con este mtodo se produce anticuerpos monoclonales. Brevemente, los linfocito aislados del bazo o mdula sea de un ratn inmunizado se combinan con una lnea celular de mieloma inmortalizada (clulas del linaje B) para producir un hibridoma el cual posee la especificidad de anticuerpos de los linfocito primarios y la inmortalidad de la lnea celular de mieloma. Las clulas de mieloma sin fusionar se seleccionan en un medio de cultivo selectivo (HA o HAT), de esta manera los linfocitos primarios mueren rpidamente y solamente las clulas fusionadas sobreviven. Los hibridomas productores

del anticuerpo deseado se seleccionan a partir de grupos hasta llegar a colonias individuales.

[editar] Aplicaciones del cultivo celular

El cultivo masivo de lneas celulares animales es fundamental para la manufactura de vacunas virales y diversos productos biotecnolgicos. Los productos biolgicos producidos mediante la tecnologa del ADN recombinante en cultivo celular incluyen enzimas, hormonas sintticas, inmunobiolgicos (anticuerpos monoclonales, interleucinas, linfoquinas y agentes anticancergenos). A pesar de que muchas protenas pueden producirse mediante ADN recombinante en cultivos bacterianos, las protenas ms complejas que son glicosiladas (modificadas mediante el agregado de carbohidratos) deben producirse en clulas animales. Un ejemplo relevante de tales protenas complejas es la hormona eritropoyetina. Actualmente, se estn realizando investigaciones para producir tales protenas complejas en clulas de insectos o de plantas superiores, debido al alto costo que implica producir tales protenas complejas en clulas de mamferos.
[editar] Ventajas y desventajas de los cultivos celulares

Los cultivos celulares tienen una serie de ventajas innegables, pero al mismo tiempo tienen desventajas que hay que tener en consideracin. Como ventajas podemos citar: - Permiten un control preciso y fino del medio ambiente. En un cultivo se pueden controlar todos los factores del medio: Fsico-qumicos (pH, temperatura, presin osmtica, niveles de O2, CO2, tensin superficial...), y fisiolgicos (hormonas, factores de crecimiento, densidad celular,...) - Caracterizacin y homogeneidad de la muestra. Las clulas en cultivo de una lnea celular, o de una lnea continua son homogneas, con morfologa y composicin uniformes. Se pueden obtener con facilidad un nmero elevado de rplicas idnticas, con lo que se supera el grave problema de heterogeneidad de las muestras inherente asociado al uso de animales de experimentacin. - Economa. Suponen una economa en el uso de reactivos o drogas a estudiar pues al realizarse en volmenes reducidos, y con un acceso directo de las clulas a la droga las concentraciones requeridas son mucho ms bajas que en el animal completo. En cuanto a las desventajas del cultivo celular: - Tcnica sensible. El crecimiento de las clulas animales es mucho ms lento que el de los contaminantes ms habituales (hongos, levaduras, bacterias, micoplasmas...) y adems dado que proceden de organismos pluricelulares son incapaces de crecer en ausencia de una compleja mezcla de nutrientes que simula el plasma o el fluido intersticial. Esto Esto supone la necesidad de mantener las condiciones de asepsia en todo momento, lo cual es limitante a nivel tanto del instrumental requerido como del personal cualificado para su manipulacin. - Cantidad y costo. El costo de produccin de 1 g de tejido en cultivo es ms de 10 veces superior al obtenido en el animal. Asimismo existe una limitacin de produccin,

que es del orden de 10 g de clulas en un laboratorio normal, y que para ser superior a 100 g requiere instalaciones de tipo industrial. - Inestabilidad. Muchas de las lneas celulares continuas son inestables, como consecuencia de la dotacin cromosmica aneuploide. La poblacin celular puede variar su composicin si alguna de las subpoblaciones celulares es capaz de crecer con una tasa ligeramente superior, es decir podemos encontrar diferencias significativas en la lnea celular de una generacin a la siguiente. La nica manera de evitarlo es emplear lneas estables que se resiembran a partir de un stock congelado cada determinado tiempo, o despus de un determinado nmero de generaciones. - La investigacin biomdica supone el sacrificio cada ao de muchos miles de animales de experimentacin. El cultivo celular no puede reemplazar siempre el ensayo "in vivo" pero es una alternativa vlida en muchas situaciones.
[editar] Estudios que emplean cultivos celulares

Los estudios que emplean cultivos celulaes abarcan gran nmero de disciplinas y aproximaciones al estudio del fenmeno celular. Son: Actividad celular. Estudia los mecanismos implicados en los diferentes procesos intracelulares, como por ej: transcripcin de DNA, sntesis de protenas, metabolismo energtico... Flujo intracelular. Estudia los movimientos intracelulares de sustancias y seales asociadas a los diferentes procesos fisiolgicos, como por ejemplo: ensamblaje y desensamblaje de los diferentes componentes intracelulares, movimientos del RNA: ncleo-citoplasma, movimiento de protenas. Ecologa celular. Estudio de las condiciones ambientales responsables del mantenimiento de la funcionalidad celular, de su diferenciacin..., como por ej. estudio de las necesidades nutricionales, infecciones, estudio de la transformacin celular (inducidad por virus o agentes qumicos), cintica de la poblacin celular,... Interacciones celulares. Estudia los procesos de induccin embrionaria, cooperacin metablica, inhibicin por contacto o por adhesin, interacciones clula-clula. Como ejemplo de reas de investigacin fuertemente dependientes de las tcnicas de cultivo celular son: - Virologa: establecimiento de condiciones de cultivo de virus animales y de plantas, produccin de vacunas antivirales,... - Investigacin del cncer - Inmunologa - Ingeniera de protenas. Por la produccin de protenas en lneas celulares: interfern, insulina, hormona de crecimiento.

- Estudios de interaccin y sealizacin celular, en la diferenciacin y en el desarrollo. - Aplicaciones diagnsticas. Por ejemplo en medicina y farmacologa destacan el anlisis cromosmico de clulas crecidas a partir de muestras de amniocentesis, deteccin de infecciones virales, ensayos de toxicidad,... - Aplicaciones mdicas: mantenimiento y produccin de tejido para transplantes. - Aplicaciones industriales y agronmicas: produccin pro reproduccin "in vitro" de clones de plantas de inters cormecial.
[editar] Cultivo de tejidos e ingeniera

El cultivo celular es un componente fundamental del cultivo de tejidos y la ingeniera de tejidos, ya que establece los conocimientos bsicos del crecimiento y mantenimiento de clulas ex vivo.
[editar] Vacunas

En la actualidad las vacunas para enfermedades como el polio, sarampin, paperas, rubola y varicela se producen en cultivos de clulas de mamferos. El peligro que representa una posible pandemia de influenza por la cepa H5N1 se estn realizando activas investigaciones con el fin de producir dicho virus en cultivos celulares, financiadas por el gobierno de Estados Unidos. En 2009 se us esta tcnica para producir la primer partida de vacunas (destinadas al testeo) para la influenza H1N1.9 Entre las ideas novedosas se encuentra el uso de vacunas basadas en ADN recombinante con vectores derivados de adenovirus humanos, causantes del resfro comn,10 11 o el uso de adjuvantes.12

[editar] Cultivo de clulas provenientes de organismos no mamferos

[editar] Mtodos de cultivo de clulas de plantas

Las clulas de plantas se crecen normalmente en suspensiones clulares en medio lquido o como cultivo de callos en medio slido. El cultivo de clulas de plantas no diferenciadas y callos requiere del un adecuado balance de las hormonas de crecimiento vegetales auxina y citoquinina.
[editar] Mtodos de cultivo de bacterias y levaduras Artculo principal: cultivo (microbiologa)

Usualmente, las cantidades pequeas de bacterias y levaduras se crecen en medio slido que contiene los nutrientes necesarios embebidos en un gel, tal como el agar. Mientras que grandes cantidades son crecidas en medio lquido con las clulas en suspensin.

[editar] Mtodos de cultivo de virus

El cultivo de los virus requiere un sustrato de clulas de mamferos, plantas, hongos o bacteria como hospedadores para el crecimiento y replicacin de los virus. En las condiciones adecuadas se pueden generar virus enteros, virus recombinantes o productos virales en clulas diferentes a los hospedadores naturales. Dependiendo de la especie del virus y el tipo clular que se utiliza como sustrato, la replicacin viral puede resultar en la lisis de la clula hospedadora y la formacin de placas de lisis virales.

[editar] Lneas celulares comunes

Lneas celulares humanas

60 lneas de cncer del Instituto Nacional del Cancer de Estados Unidos Base de datos ESTDAB http://www.ebi.ac.uk/ipd/estdab/directory.html (en ingls) Hep-G2(cancer de higado) DU145 (cncer de prstata) Lncap (cncer de prstata) MCF-7 (cncer de mama) MDA-MB-438 (cncer de mama) PC3 (cncer de prstata) T47D (cncer de mama) THP-1 (leucemia mieloide aguda) U87 (glioma) SHSY5Y clulas de neuroblastoma humano, clonadas a partir de mieloma mltiple Saos-2 cells (cncer seo)

Lneas celulares de Primates

Vero (clulas epiteliales de rion de mono verde Africano Chlorocebus. Lnea celular iniciada en 1962)

Lneas celulares de tumor de Rata

GH3 (tumor de hipfisis) PC12 (feocromocitoma)

Lneas celulares de ratn

MC3T3 (embrionaria craneal)

Lneas celulares de plantas

Nicotiana tabaccum cv. BY-2 (mantenida como un cultivo de celulas en suspensin, sirven como modelo de estudio en clulas vegetales)

Lneas celulares de otras especies

pez cebra clulas ZF4 y AB9. Lnea celular de epitelio de rion canino Madin-Darby (MDCK) Clulas epiteliales de rion de Xenopus A6.

[editar] Referencias

Este artculo fue creado a partir de la traduccin del artculo cell culture de la Wikipedia en ingls, concretamente de esta versin, bajo licencia Creative Commons Atribucin Compartir Igual 3.0 y GFDL.

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Cultivo de virus
Muchos virus pueden desarrollarse en cultivos celulares o en huevos frtiles en condiciones estrictamente controladas. Sigue recurrindose al crecimiento de los virus en animales para el aislamiento primario de algunos de ellos, y para los estudios de la patogenia de las enfermedades virales y de la oncognesis viral. En los laboratorios de diagnstico se intenta recuperar a los virus de las muestras clnicas para establecer los aspectos etiolgicos de las enfermedades. En los laboratorios de investigacin se cultivan virus como base de los anlisis detallados de la expresin y la replicacin virales. La disponibilidad de clulas desarrolladas in vitro ha facilitado la identificacin y el cultivo de virus recin aislados y la caracterizacin de los que ya se conocan. Hay tres tipos bsicos de cultivo celular. Los cultivos primarios se efectan mediante dispersin de clulas (por lo general con tripsina) de tejidos huspedes recin extirpados. En general no pueden crecer ms all de unos cuantos pasos en cultivo, como cultivos secundarios. Las lneas celulares diploides son cultivos secundarios que han experimentado un cambio que permite su cultivo limitado (hasta 50 pasos), pero que retienen su patrn cromosmico normal. Las lneas celulares continuas son cultivos capaces de crecimiento ms prolongado, quiz indefinido, y que se han obtenido de lneas celulares diploides o de tejidos malignos. Invariablemente tienen nmeros alterados e irregulares de cromosomas. El tipo de cultivo celular que se emplee para cultivar virus depende de la sensibilidad de las clulas a tal virus particular. Identificacin de clulas infectadas por virus: Es posible vigilar la multiplicacin de un virus de diversas maneras: l. Desarrollo de efectos citopticos, es decir, cambios morfolgicos en las clulas. Los tipos de efectos citopticos inducidos por virus consisten en lisis o necrosis celulares, formacin de inclusiones, formacin de clulas gigantes y vacuolizacin citoplsmica. La mayor parte de los virus producen algn efecto citoptico manifiesto en las clulas infectadas que es, en general, caracterstico del grupo del virus. 2. Aparicin de una protena codificada por el virus, como la hemaglutinina del virus de la influenza. Se pueden emplear antisueros especficos para identificar la sntesis de protenas virales en las clulas infectadas. 3. Adsorcin de eritrocitos a las clulas infectadas, tcnica que se llama hemadsorcin, a causa de la presencia de hemaglutinina codificada por el virus (parainfluenza, influenza) en las membranas celulares. Esta reaccin se vuelve positiva antes que sean visibles los cambios citopticos y, en algunos casos, ocurre en ausencia de stos. 4. Interferencia por un virus no citopatgeno (por ejemplo, el de la rubola) con la replicacin e induccin de efectos citopticos por un segundo virus de carga (por ejemplo, echovirus) que se aade como indicador.

5. Transformacin morfolgica por un virus oncgeno (por ejemplo, virus del sarcoma de Rous), que suele acompaarse de prdida de la inhibicin de contacto y acumulacin de clulas en focos definidos. Durante la multiplicacin de los virus en el interior de las clulas, pueden producirse estructuras especficas de virus, denominadas cuerpos de inclusin. Estas estructuras llegan a ser mucho ms grandes que las partculas individuales del virus, y a menudo muestran afinidad para los colorantes cidos (por ejemplo, la eosina). Pueden situarse en el ncleo (herpesvirus), en el citoplasma (poxvirus) o en ambos (virus del sarampin). En muchas infecciones virales, los cuerpos de inclusin son el sitio de desarrollo del virin (la fbrica del virus). En algunas infecciones (poxvirus, reovirus), el cuerpo de inclusin consiste en masas de partculas virales en el proceso de replicacin. Aun en otros casos ms, como en el cuerpo de inclusin intranuclear del herpes, el virus se multiplica en una etapa ms temprana de la infeccin y el cuerpo de inclusin parece ser un producto residual de la multiplicacin viral. Las variaciones en el aspecto del material de inclusin, dependen de la composicin del fijador tisular empleado. La presencia de cuerpos de inclusin puede ser de considerable utilidad en el diagnstico. Las inclusiones intracitoplsmicas de las clulas nerviosas, denominadas cuerpos de Negri, son patognomnicas de la rabia.

seguir

METODOS DE ESTUDIO Y DIAGNOSTICO VIRAL

Mara Daniela Sandin

INTRODUCCIN | PRINCIPALES TCNICAS: Mtodos directos: Cultivos celulares, tcnicas inmunolgicas, tcnicas de Biologa Molecular, microscopa electrnica y Mtodos indirectos | BIBLIOGRAFA | ENLACES

I. INTRODUCCION
Los mtodos utilizados para reconocer las infecciones por virus humanos pueden clasificarse en DIRECTOS e INDIRECTOS, segn persigan demostrar la presencia del virus o de alguno de sus constituyentes (antgeno o genoma viral) o bien la respuesta de anticuerpos especficos por parte del husped en el curso de la infeccin. Gran parte de las tcnicas utilizadas en el diagnstico clnico se basan en pruebas serolgicas que identifican anticuerpos especficos frente a diversas protenas antignicas. Sin embargo, existen circunstancias en las cuales son necesarias pruebas que detecten precozmente la infeccin viral (tratamientos especficos, medidas profilcticas, etc.). En algunas infecciones virales es posible detectar la presencia de antgenos virales previamente al desarrollo de la seroconversin, siendo esta prueba la nica evidencia de la exposicin al virus cuando no existe aumento de los niveles de anticuerpos circulantes (pacientes inmunodeprimidos). Igualmente la deteccin del genoma viral puede favorecer la precocidad del diagnstico viral y su confirmacin. En la ltima

dcada se han desarrollado una serie de tcnicas para el diagnstico viral basadas en la deteccin de cidos nucleicos. De ellas la Reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) es la ms utilizada. En el momento actual, la tendencia en el diagnstico virolgico consiste en emplear nuevas y ms sensibles tecnologas de deteccin de antgenos y de investigacin de cidos nucleicos con el propsito de lograr un diagnstico viral ms rpido. El desarrollo de quimioterapia antiviral efectiva es responsable de esta tendencia que hace de la identificacin rpida, sensible y especfica de los virus, una necesidad.

PRINCIPALES TCNICAS
METODOS DIRECTOS

Son aquellos que detectan: 1. El virus como agente infeccioso (aislamiento viral). 2. La presencia de antgenos virales (tcnicas inmunolgicas): Inmunofluorescencia (IF), Enzimoinmunoanlisis (EIA), Test de Aglutinacin. 3.La presencia de cidos nucleicos virales (PCR, etc.). 4.El virus como partcula viral (microscopa electrnica).
1. Aislamiento Viral - Cultivos Celulares

La base del diagnstico viral es la deteccin del virus o de sus componentes. El aislamiento del virus era la tcnica standard de oro sobre la cual se medan todas las otras pruebas de diagnstico viral, pero hoy en da con el desarrollo de las nuevas tcnicas de Biologa Molecular ya no es la ms sensible. De igual forma el aislamiento de virus tiene una sensibilidad y una especificidad muy alta. Debido a que slo se amplifica el virus, se aumenta la sensibilidad sin disminuir la especificidad. Sin embargo, existen algunas desventajas en el aislamiento del virus: El proceso suele ser lento, ya que demanda das a semanas para la identificacin, y en consecuencia puede no estar disponible a tiempo para influir en la atencin del paciente. Adems, es un proceso laborioso y caro. Por otra parte requiere el uso de sistemas de cultivos adecuados, por ejemplo, se necesitan varias lneas celulares para la deteccin ptima de virus. Los cultivos celulares son, pues, los biosubstratos ms corrientemente empleados para la propagacin de los virus.

Un cultivo celular es obtenido, de explantes de rganos o de embriones de animales. Estas clulas obtenidas aspticamente se disocian tratndolas con una enzima (tripsina) que rompe el cemento intercelular. La suspencin de celulas libres as obtenidas se coloca en la superficie plana de un recipiente de vidrio o plstico en donde las clulas se adhieren y multiplican formando una fina capa de clulas que se llama MONOCAPA CELULAR. Esta monocapa de clulas crece en un medio de cultivo complejo que contiene albmina, vitaminas, sales, glucosa, etc., en un sistema buffer. Se previene la contaminacin bacteriana adicionndole al medio antibiticos adecuados. Los cultivos celulares en monocapa son los ms usados, aunque hay otros sistemas (cultivos en suspensin, explantos, cultivos de rganos, cultivos en microcarriers, etc.). Los cultivos celulares se dividen en: Cultivos Primarios: Se obtienen a partir de clulas, tejidos u rganos tomados directamente del organismo y pueden subcultivarse una o dos veces. Lneas Celulares Diploides: Son aquellas que crecen en pasajes sucesivos hasta aproximadamente 50 subcultivos y que conservan por lo menos en un 75% el cariotipo correspondiente a la especie de que provienen. Lneas Celulares Continuas: Permite un nmero finito de subcultivos y son heteroploides. Para considerar que se ha logrado establecer una lnea continua, esta debe de haber sido subcultivada por lo menos 70 veces. Las lneas celulares continuas ofrecen las siguientes ventajas: Disponibilidad para todos los investigadores de stocks de clulas idnticas, ya sea congeladas en ampollas o en monocapa de botella de cultivos, con la posibilidad de reconstituirlas cuando sea necesario. Facilidad relativa del pasaje y mantenimiento en todos los laboratorios. Libre de contaminacin con agentes extraos. Los distintos cultivos celulares varan en cuanto a su susceptibilidad a los diferentes virus, ya que existe una relacin especfica husped-virus, y es en funcin de los datos clnicos y del tipo de muestra que se elige el cultivo para inocular el material. Luego de inoculado el cultivo celular, se incuba a 35-37 C por un perodo de hasta 14 das promedio, esperando la aparicin

de efecto citoptico, toxicidad o degeneracin celular, observando el cultivo al microscopio a las 24, 48, 72hs y luego 2 veces por semana. Se usan cultivos celulares no inoculados para control y comparacin con cualquier cambio morfolgico observado en los cultivos inoculados. El efecto citoptico es la visualizacin de cambios morfolgicos ms o menos caractersticos en las clulas inoculadas producidas por la accin del virus sobre el cultivo celular. Cuando los virus no producen efecto citoptico, se puede recurrir a tcnicas que ponen en evidencia la presencia de aquel en el cultivo. Las ms usadas son: hemadsorcin, hemaglutinacin y tinciones con anticuerpos monoclonales. (Ver 2) Hemadsorcin: Hay virus que durante su multiplicacin intracelular, expresan en la membrana de la clula husped elementos estructurales virales llamados hemaglutininas, glicoprotenas capaces de unirse a receptores especficos en la membrana de glbulos rojos de diferentes especies animales. De modo que si se agregan glbulos rojos a un cultivo inoculado, se puede poner en evidencia la infeccin de esas clulas a travs de la unin de los glbulos rojos a la superficie celular. Hemaglutinacin: Las hemaglutininas pueden ponerse en evidencia en el sobrenadante de los cultivos utilizando el mismo fundamento que para la hemadsorcin.
2. Deteccin de Antgenos - Tcnicas Inmunolgicas

Las siguientes tcnicas inmunolgicas pueden utilizarse tanto para la deteccin de antgenos (mtodos directos), como de anticuerpos (mtodos indirectos). En el caso de deteccin de antgenos, se utiliza un anticuerpo especfico antiviral (por lo general IgG) a cuya fraccin Fc se ha conjugado una molcula marcada, que puede ser isotiocianato de fluorescena (Inmunofluorecencia), un istopo radioactivo 125I o 131I (RIA), o una enzima: peroxidasa, fosfatasa alcalina, o biotinaavidina (EIA), para objetivar la reaccin. Para el procedimiento indirecto (deteccin de anticuerpos), se emplea un anti-anticuerpo marcado y la reaccin se realiza sobre un cultivo celular infectado por el virus en estudio. INMUNOFLUORESCENCIA DIRECTA (ID)

Es una de las tcnicas ms antiguas y de uso ms difundido en el laboratorio clnico. El principio bsico de la inmunofluorescencia directa . Muestras clnicas apropiadas son recolectadas y colocadas sobre portaobjetos donde se dejan secar y fijar. Luego se agregan anticuerpos especificos marcados con isotiocianato de fluorescena que difunden a travs de la membrana celular y se combinan con los antgenos vricos en el interior de las clulas. La reaccin antgeno anticuerpo se visualiza con el microscopio de fluorescencia, por la aparicin de fluorescencia de color verde manzana. Esta tcnica se puede utilizar para una identificacin rpida del virus directamente sobre la muestra (por ejemplo: clulas eluidas de un lavado nasal, o de un hisopado nasofarngeo), o se la puede emplear para la confirmacin del efecto citoptico observado en cultivos celulares. Sin embargo la realizacin de la reaccin es laboriosa, depende mucho de la calidad de los reactivos, requiere un microscopio de fluorescencia y de una persona con experiencia para llegar a un diagnstico certero, as como una recoleccin y preparacin de la muestra adecuada. Aun as, el mtodo, en manos de una persona con experiencia resulta til para la identificacin rpida de ciertos virus como los virus respiratorios, ya que nos proporciona un diagnstico etiolgico en el curso de una jornada de trabajo. Adems puede estudiar varias muestras simultneamente. El advenimiento de los anticuerpos monoclonales, ha incrementado la especificidad y en algunos casos la sensibilidad de estos ensayos. Esta tcnica requiere slo 24hs, y se ha reportado una sensibilidad del 70-80 % comparada con cultivos celulares para la identificacin de virus Herpes Simple, 80-95% para VRS y 71% para Influenza A. La tincin con inmunoperoxidasa es similar a la de la inmunofluorescencia y es la tcnica de eleccin en algunos laboratorios. El procedimiento implica unos pocos pasos adicionales ya que en este caso el anticuerpo monoclonal esta marcado con una enzima que requiere la adicin de un substrato para evidenciar la reaccin por un cambio de color que es visible micro y macroscpicamente. TEST DE AGLUTINACION

El test de aglutinacin es un mtodo simple, de un solo paso, que a veces se usa para la deteccin de antgenos virales en muestras clnicas. Los ensayos de aglutinacin, dependen de la fijacin inicial de anticuerpos antivirales especficos sobre eritrocitos o partculas de ltex. Luego este reactivo se incuba con la muestra clnica en la cual se investiga el antgeno y las partculas se aglutinan si el antgeno adecuado se encuentra presente. Estas pruebas en general se complementan o se confirman por medio de otros ensayos debido al elevado porcentaje de reacciones inespecficas. El test de aglutinacin ha sido usado para detectar antgeno de Rotavirus en heces (el ms importante) mostrando una buena sensibilidad cuando se lo compara con el EIA para Rotavirus. Adems es una tcnica rpida y barata. Tambin se la ha usado para detectar antgenos de Adenovirus. RADIOINMUNOENSAYO (RIA) Fue originalmente aplicado para identificar el antgeno de superficie de la Hepatitis B (HBsAg) y el anticuerpo antiHBsAg. Estos ensayos tienen una buena sensibilidad y especificidad, pero la aparicin de un mtodo como el ensayo inmunoenzimtico (EIA) con su mayor tiempo de conservacin de los reactivos, su costo relativamente ms bajo y la ausencia de residuos radioactivos, ha reemplazado las tcnicas de RIA en la mayor parte de los casos de deteccin de antgeno viral. ENZIMOINMUNOANALISIS (EIA) Los EIA para la deteccin de antgeno se basan habitualmente en la captura del antgeno por anticuerpos especficos unidos a una fase slida, en general el pocillo de una microplaca o una pequea esfera de plstico. El antgeno viral presente en la muestra clnica se combina con el anticuerpo fijado a la fase slida y el antgeno viral se detecta mediante la adicin de otro anticuerpo especfico conjugado a una enzima. La enzima conjugada suele ser peroxidasa o fosfatasa alcalina. El substrato para esas enzimas vara. En la reaccin con la peroxidasa el substrato es un perxido capaz de oxidar un compuesto qumico incoloro que en su forma oxidada tiene un color caracterstico. En el caso de la fosfatasa la desfosforilizacin es la responsable directa de la aparicin del color. Por esta tcnica se puede procesar gran nmero de muestras en forma rpida y automatizada, no requiriendo de un observador experimentado para leer los resultados, ya que estos se leen

por medio de espectrofotmetros especialmente diseados, siendo entonces una tcnica ms objetiva. Fig. 2.
3. Tcnicas de Biologa Molecular

Investigacin de cidos nucleicos virales Las tcnicas de estudio y diagnstico que a continuacin se presentan, constituyen una herramienta ingeniosa desarrolladas a partir de los estudios de la Biologa Molecular. SONDAS DE ACIDOS NUCLEICOS Actualmente es posible extraer secuencias especficas de un fragmento de ADN por medio de las endonucleasas de restriccin. Luego estas secuencias extradas, se pueden desnaturalizar y marcar ya sea con una enzima o con un istopo radioactivo. A estas cadenas marcadas y que tienen una secuencia conocida se llaman sondas de cidos nucleicos. Hoy en da se estn produciendo sondas de cidos nucleicos sintticas, con lo que se obtiene sondas de oligonucletidos de muy alta especificidad que estn disponibles comercialmente y son las ms usadas en los laboratorios. DETERMINACION DE ACIDOS NUCLEICOS VIRALES POR SONDA SINTETICA Es un ensayo de hibridacin molecular con una sonda marcada. Las hibridaciones pueden ser: DNA-DNA, RNA-RNA y RNA-DNA. Primero se trata a muestras con reactivos que solubilizan y desnaturalizan los cidos nucleicos. Posteriormente se aade un DNA marcado, complementario del DNA del virus y se incuba en condiciones para que se produzca la hibridacin. La muestra se pasa entonces por una columna que contiene un gel que separa la sonda ligada al DNA viral hibridado de la no hibridada. Dependiendo de como este marcada la sonda, se detecta la hibridacin: Si est marcada con un istopo radiactivo se puede hacer una lectura en un contador gamma de manera que la cantidad de radiacin medida en la columna es directamente proporcional a la cantidad de DNA viral presente en el suero problema o tambin se puede realizar la electroforesis del DNA hibridado con la sonda marcada en gel de poliacrilamida y detectar la radioactividad emitida por la sonda mediante la aplicacin de una placa de rayos X

(Autoradiografa). Si esta marcada con una enzima se detecta por una simple evaluacin colorimtrica. AMPLIFICACION DE ACIDOS NUCLEICOS VIRALES MEDIANTE UNA REACCION EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR) Una nueva tcnica, llamada Reaccin en Cadena de la Polimerasa (PCR), fue desarrollada por Saiki et al., para incrementar el nmero de molculas de DNA blanco en las muestras. Tiene una sensibilidad tan alta que puede amplificar una nica molcula de DNA y una sola copia de genes puede ser extrada, de mezclas complejas de secuencias genmicas y visualizada como bandas diferentes en geles de agarosa. La PCR es, por tanto, una amplificacin de secuencias especficas del DNA. Se basa en la utilizacin de secuencias cortas de nucletidos sintticos llamados primers o cebadores, que se hibridan de forma especifica con cada una de las cadenas de DNA , previamente desnaturalizadas, llamadas moldes o templados. Para que la reaccin tenga lugar se usa una enzima, Taq pol (ADN Polimerasa termoestable obtenida de la bacteria Thermus aquaticus) y deoxinucletidos trifosfatos. La funcin natural de la DNA polimerasa consiste en reparar y replicar el DNA. Los deoxinucletidos trifosfatos se necesitan como ladrillos para la construccin. El nucletido al cual se una la polimerasa ser complementario de la base en la posicin correspondiente de la cadena templado. Se sintetiza as una cadena simple de DNA, complementaria y alineada a cada "primer ". Se realiza una serie repetida de ciclos cada uno compuesto por 3 pasos bsicos: a. Desnaturalizacin del ADN doble cadena por la elevada temperatura (95C). b. Acoplamiento de los primers, desciende la temperatura (entre 55C-72C). c. Elongacin del primers, aqu se eleva la temperatura a 72C permitiendo la incorporacin de los deoxinucletidos. Mientras tanto se van deplecionando los primers y los deoxinucletidos, y se van sintetizando nuevas cadenas de DNA. Al final se consiguen miles de copias de DNA del fragmento de DNA limitado por los "primers ". Los fragmentos de DNA as obtenidos se pueden identificar por varias tcnicas: visualizacin en geles de agarosa o poliacrilamida

mediante tincin con bromuro de etidio y examen con luz ultravioleta, o hibridacin con una sonda marcada. La combinacin de la PCR y las sondas de cidos nucleicos marcadas promete ser el mtodo ms sensible para la deteccin e identificacin de los virus.
4. Microscopa Electrnica

Mediante el microscopio electrnico es posible observar la morfologa de los viriones presentes en muestras clnicas. La limitacin del mtodo adems del costo del microscopio, es que necesita de una alta concentracin de viriones (aproximadamente 109 partculas virales/ml, dependiendo del virus) presentes en la muestra, por ello es poco sensible. Esto hace que sea una tcnica poco utilizada, ms an con el desarrollo de tcnicas alternativas de utilidad similar. Si la concentracin de virus en la muestra clnica es baja, y por tanto no visible directamente por microscopio electrnico, se pueden utilizar tcnicas que aumenten la visualizacin, por ejemplo, la inmunoelectromicroscopa, que consiste en el agregado de anticuerpos especficos antivirales y la formacin de agregados de partculas que son ms fcilmente visibles que las partculas solas. Fig. 5.
METODOS INDIRECTOS

Son aquellos que reconocen la respuesta inmune (humoral o celular) por parte del husped: . Deteccin de anticuerpos especficos antivirales por tcnicas inmunolgicas (EIA, IFI, WB, etc.). Produccin de anticuerpos in vitro. En el curso de una infeccin varan las poblaciones de anticuerpos frente al agente infectante. En una primera fase la clase predominante suele ser IgM, mientras que con el transcurso del tiempo las IgM disminuyen hasta desaparecer o quedar a baja concentracin residual y, en cambio, aumentan las IgG. La bsqueda de anticuerpos clase IgM es de utilidad para hacer diagnstico de infeccin reciente en una sola muestra de suero extrada en el perodo agudo de la enfermedad. Este mtodo se emplea para el diagnstico de enfermedades como: Rubola, Citomegalovirus, Hepatitis a virus A, etc. La bsqueda de anticuerpos clase IgG en una sola muestra se utiliza como tcnica de tamizaje, por ejemplo, para el diagnstico de la infeccin por el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH). Posteriormente los

hallazgos positivos son confirmados en la misma muestra de suero por otra metodologa. La seroconversin es el aumento del ttulo de anticuerpos cuatro veces o ms observado en dos muestras pareadas de suero. La primera muestra se obtendr en el perodo agudo de la enfermedad y la segunda, 15 a 21 das despus de la primera, en el perodo de convalesencia. La seroconversin es til para establecer el diagnstico retrospectivo, pero no para el diagnstico temprano de una infeccin, puesto que debemos esperar al perodo de convalecencia para obtener la segunda muestra del suero. Este tipo de diagnstico es til para estudios epidemiolgicos. Las diferencias de ttulos deben ser mayores de cuatro veces para tener valor estadstico y se debera estudiar ambas muestras simultneamente. Las determinaciones serolgicas tambin nos pueden informar sobre el estado inmune del paciente frente a muchas infecciones virales, como paperas, sarampin y rubola, donde la presencia de anticuerpos especficos indica que el individuo ha estado expuesto previamente al virus y que es inmune para una nueva infeccin. A veces el diagnstico serolgico tiene dificultades, por ejemplo: cuando se realiza en recin nacidos para identificar la causa de una infeccin congnita. La evaluacin de los resultados en este caso es difcil porque los ensayos serolgicos detectan ante todo IgG, y mucha de la IgG presente en el suero del nio provino de la madre por va transplacentaria y no es posible diferenciar la IgG del nio de la IgG de la madre. Tradicionalmente, el diagnstico de las enfermedades virales congnitas se realiza mediante determinaciones seriadas de IgG en el suero. El descenso del titulo de anticuerpos indica que los anticuerpos eran maternos y que el nio no est infectado. El aumento en el ttulo de anticuerpos indica que el nio esta produciendo anticuerpos y por lo tanto esta infectado. Sin embargo, hoy en da el diagnstico serolgico viral se ha simplificado con las nuevas tcnicas que detectan IgM, ya que la deteccin de IgM especfica en el suero del nio confirma que el nio est infectado, porque la IgM no atraviesa la placenta y por tanto no puede ser de origen materno.

A continuacin, se describirn los mtodos serolgicos ms comnmente usados en el diagnstico viral. Los mtodos tradicionales para el diagnstico serolgico de las infecciones virales incluyen: la neutralizacin, la inhibicin de la hemaglutinacin (IHA) y la hemaglutinacin indirecta (HAI). La confirmacin serolgica de una infeccin aguda por cualquiera de estas tcnicas tradicionales esta dada por un aumento de cuatro veces o mayor en el titulo de anticuerpos cuando se emplean diluciones al doble seriadas. En los ltimos aos se han desarrollado nuevos mtodos para la deteccin de anticuerpos virales, y en muchos casos han demostrado ser mejores que las pruebas tradicionales en trminos de economa, sensibilidad, especificidad y rapidez. INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA (IFI) La IFI, es un mtodo rpido y confiable para la determinacin de anticuerpos antivirales en el suero del paciente. Se basa en la unin de anticuerpos antivirales presentes en el suero del paciente a los antgenos virales expresados en la superficie y citoplasma de clulas infectadas, que han sido fijadas a un portaobjeto de vidrio. Como control de especificidad se usan clulas no infectadas. El procedimiento es el que sigue: Se incuba el suero del paciente con las clulas infectadas y no infectadas. Luego se realiza un lavado con PBS y se agrega posteriormente anticuerpo anti IgG humana conjugada con isotiocianato de fluorescena. El isotiocianato de fluorescena es una sustancia que se vuelve fluorescente a la exposicin de la luz ultravioleta y emite una luz verde caracterstica. El conjugado se unir a los anticuerpos del paciente si la reaccin es positiva, leyndose la prueba en un microscopio de fluorescencia. La presencia de Ac se evidencia por la aparicin de fluorescencia en el citoplasma y superficie de las clulas infectadas, mientras que las clulas control no fluorescen. ENZIMOINMUNOANALISIS INDIRECTO (EIA) Los EIA indirectos se han aplicado de forma amplia en los ltimos aos al diagnstico de anticuerpos virales. Tiene las ventajas de ser un mtodo verstil, relativamente econmico, sensible y de lectura objetiva (instrumental).

La metodologa es la siguiente: Los antgenos virales se inmovilizan sobre una fase slida (esferita, policubetas para microtitulacin u otros elementos de plstico) y se agregan los sueros en estudio; se incuban, se lavan y se revela la reaccin Ag-Ac por el agregado de una inmunoglobulina antiespecie conjugada con una enzima, seguida por el substrato apropiado para esta. Los resultados se pueden leer con un espectrofotmetro y en algunos casos de forma visual. TEST DE AGLUTINACION El fundamento y el procedimiento de esta tcnica ya fue descripto para el estudio de Ag viral (mtodo directo). Ahora lo que buscamos es detectar anticuerpos antivirales, por eso se usan partculas de ltex recubiertas con Ag viral. Fig. 8. WESTERN BLOT (WB) Las tcnicas inmunolgicas de Inmunoblot estn encontrando amplias aplicaciones en el diagnstico virolgico. Son particularmente tiles para el diagnstico del HIV. La tcnica de WB se basa en la separacin electrofortica de protenas virales que son posteriormente inmovilizadas en papel de nitrocelulosa con el objeto de determinar la presencia de anticuerpos especficos contra cada una de esas protenas. Esta tcnica se realiza esquemticamente en 3 pasos: 1. Se produce en cultivos celulares grandes cantidades de virus que luego son tratados qumicamente para su disgregacin e inactivacin. Los antgenos resultantes del lisado viral se separan por electroforesis en gel de Poliacrilamida. 2. Se realiza una transferencia (blotting o electrotransferencia) de los Ag separados a membranas de nitrocelulosa. 3. Se coloca el suero del paciente sobre la membrana de nitrocelulosa. Posteriormente se aaden anticuerpos antiinmunoglobulina humana unida a una enzima (peroxidasa o fosfatasa alcalina) y, por ltimo, se agrega el substrato enzimtico para la visualizacin de las bandas reactivas con un producto final coloreado.

La tcnica es muy similar a un EIA, menos sensible pero ms especfica que esta. En la prctica slo el 3er paso es el que se realiza en los laboratorios de diagnstico, ya que los equipos comerciales proveen de las tirillas con los antgenos. (Esto facilita la estandarizacin de las determinaciones). PRODUCCION DE ANTICUERPOS IN VITRO Se trata de una tcnica nueva que ha sido aplicada para el diagnstico de la infeccin perinatal. Este procedimiento revela la presencia de anticuerpos antivirales producidos in vitro a partir de los linfocitos B extrados de sangre total, lo que indicara que el sistema inmune del paciente ha sido estimulado por el virus. La produccin de Ac antivirales in vitro promete ser de gran valor en el diagnstico temprano de nios infectados por VIH.

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