La Nitrato Reductasa A Unida A La Membrana de Escherichia Coli NarGHI

Muchas proteínas de membrana, incluida la adenosina trifosfato sintasa (ATP
sintasa) y transportadores secundarios, son impulsados por la fuerza protón motriz

(p.m.f. o gradiente electroquímico de protones) a través de biomembranas. Es
comun pensar en la maquinaria molecular especial, como una bomba de protones
o el Q-cycle, que son necesarios para generar el p.m.f. Sin embargo, estos son
casos excepcionales y, de hecho, no existe en la teoría quimiosmótica original
propuesto por Mitchell. Esto describe la cadena respiratoria de oxígeno como una
serie de ciclos redox, donde los electrones son transferidos desde el lado "fuera"
de la membrana hasta el lado "dentro" en cada complejo respiratorio y son
cotransportados de regreso con H+, en forma de quinol, del lado “dentro” al lado
“fuera” de la membrana entre los complejos. Aunque esta idea ha sido modificada
posteriormente por agregando bombas de protones y el Q-cycle, el ciclo redox
simple sigue pareciendo el mecanismo más común para p.m.f. generación y es
utilizado por una amplia gama de organismos.
Escherichia coli proporciona un sistema ideal para estudiar la base estructural del
ciclo redox mecanismo, que aún no se ha explicado completamente. Durante el
crecimiento anaeróbico de E.coli en presencia de nitrato, el principal donador de
electrones al sistema de respiración de nitrato es el formiato, que se produce a
partir del piruvato a través de la acetil-coenzima A. En esta condición, dos
proteínas integrales de membrana son inducida: nitrato reductasa disimilatoria
(Nar) y formiato deshidrogenasa-N (Fdh-N, N 5 inducible por nitrato) . Ambas
enzimas tienen dos subunidades asociadas a la membrana (una alfa y beta) y una
subunidad de membrana integral (gamma), una composición de subunidad común
entre enzimas respiratorias unidas a la membrana. Jones demostró la p.m.f.
generación por el sistema Nar/Fdh-N y ha propuesto un redox mecanismo de ciclo
responsable de esta energía conservación (Fig. 1) (6).
Fig. 1. Una propuesta de cómo la fuerza motriz de protones es generado por Fdh-
N y nitrato reductasa en Escherichia coli interior membrana. MK, menaquinona;
MKH2, reducido forma de menaquinona; MGD, molibdopterina-dinucleótido de
guanina; b, hemo b; FeS, hierro-azufre grupo.
Sin embargo, quedan por resolver las dos cuestiones principales siguientes:
respondió para entender cómo pmf es generado por estas enzimas. (i) Topología
de membrana de la menaquinona sitio de unión en Fdh-N. paramagnético de
electrones Los estudios de resonancia (EPR) mostraron que el sitio de unión de la
menaquinona en Nar está cerca proximidad a un hemo b en el lado periplásmico.
Sin embargo, el lado de la membrana desde qué protones son llevados hasta el
Fdh-N El sitio de unión de menaquinona aún no se ha determinado. Este es un
tema crítico para resolver si Fdh-N y Nar están, de hecho, formando un ciclo redox
acoplado por menaquinona. (ii) Topología de membrana de la subunidad Fdh-N a.
Generalmente se acepta que la subunidad a de Nar existe en el lado
citoplasmático (5). Aunque la subunidad Fdh-N a es altamente homóloga a la
contraparte Nar, su membrana la topología aún no se ha determinado. Este
escrítico para dilucidar si la reacción de transferencia de electrones de formiato a
nitrato contribuye a la generación de potencial de membrana.
Aquí, presentamos la estructura de Fdh-N en 1,6 Å. Un estudio comparativo de la
Fdh-N con otras enzimas respiratorias relacionadas, en incluyendo Nar y [NiFe]
hidrogenasa, tiene explicó con éxito cómo el p.m.f. es generado por el sistema
Fdh-N/Nar.
Estructura general. Detalles de la muestra la preparación, la cristalización y la
determinación de la estructura se proporcionan en el material complementario (8).
Estadísticas para la recopilación de datos y la determinación de la estructura se
resumen en la Tabla 1.
Se muestra la estructura general de Fdh-N en la Fig. 2. Fdh-N se empaqueta
como un trímero (total masa molecular 5 510 kD) con los monómeros relacionados
por un eje de simetría triple cristalográfica (Fig. 2, A y B). Él el trímero muestra una
forma de "hongo" con las dimensiones más grandes de 125 Å (junto con la
membrana) por 150 Å (a lo largo de la membrana normal). Dos observaciones
sugieren que este es un trímero fisiológico: (i) El Los monómeros están muy
apretados con un superficie de contacto de ;5254 Å2, y (ii) un molécula de
cardiolipina, un fosfolípido derivado de la membrana original de E. coli, es
mantenido en la interfaz del trímero.
La estructura cristalina indica que a y b subunidades de Fdh-N están en el
periplasma lado de la membrana (Fig. 2C). el a y b subunidades existen en el lado
opuesto de la membrana de los terminales NH2 y COOH de la subunidad g, que
han sido consistentes Se determina que está ubicado en el citoplasma.

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