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Biología Celular
Biología Celular
Biología Celular
MICROSCOPIO ÓPTICO
Hans y Zacharias Jansen y Hans Lippersky (1590 – 1608) fueron los inventores del
primer microscopio óptico.
LENTES
Son superficies de vidrio pulido. En el microscopio, las lentes son convergentes o
positivas.
La distancia focal de una lente depende de su geometría y del índice de refracción del
material.
Cuanto más esférica es la lente, menor es la distancia focal.
A mayor índice de refracción, menor es la distancia focal.
PODER DE RESOLUCIÓN
Se denomina poder de resolución (PR) a la capacidad de distinguir dos puntos próximos
como entidades separadas.
Se denomina límite de resolución (LR) a la distancia mínima a la cual dos puntos
próximos se distinguen como entes separadas.
cte. Abber=0,61
λ: longitud de onda
AN: apertura numérica (cantidad de luz que le llega a la lente)
n: índice de refracción
senµ: seno del semiángulo del cono de luz que le llega al objetivo
La fuente de iluminación es un cañón generador del haz de electrones. Este genera una
nube de electrones que se transmite por vacío. Esta fuente de iluminación es siempre
monocromática.
Las lentes electromagnéticas son un hilo de cobre por las que pasa la corriente de
electrones, condensándose.
La imagen final es aumentada y real. La imagen se proyecta sobre una pantalla de
fósforo verde.
La longitud de onda de los electrones depende del voltaje (20 – 200 kV). La distancia
focal de las lentes y su AN también dependen del voltaje.
La distancia de trabajo (distancia entre la muestra y la lente) es fija.
El aumento depende del voltaje aplicado a las lentes intermedia y proyectora (oculares).
MICROSCOPIO ELECTRÓNICA DE TRANSMISIÓN
Se basa en la utilización de electrones primarios.
FIJACIÓN
Los objetivos de la fijación son:
- Detener los procesos de autolisis y así preservar los materiales que constituyen
las estructuras celulares y tisulares de manera que se asemejen, lo mejor posible,
a como se presentan “in vivo”
- Proteger frente a los tratamientos a los que se someterán las muestras en los
pasos siguientes del protocolo
- Proporcionar dureza al material
La fijación se basa en la inmovilización de los componentes químicos de las células y
los tejidos convirtiendo en insolubles sustancias que eran solubles.
Para efectuar una buena fijación hay que tener en cuenta varios factores: rapidez (ha de
ser lo más rápido posible), osmolaridad, volumen (el volumen del fijador ha de ser 40
veces mayor que el de la muestra), tiempo de fijación (24 – 48 horas), temperatura de
fijación (temperatura ambiente), tamaño de la muestra (tamaño pequeño), pH,
coeficiente de difusión del fijador.
Para fijar químicamente se pueden utilizar tres métodos:
1) Inmersión introducir la muestra en un vaso de precipitado con el fijador
2) Perfusión inyectar el fijador en el torrente circulatorio Se introduce la aguja
en el ventrículo izquierdo. Esta aguja está conectada a una bomba peristáltica
3) Combinación perfusión-inmersión
Para asegurar la detención del fijador, se procede al lavado posfijación, que elimina el
exceso de fijador. Dura de 24 a 48 horas y se utiliza agua, alcohol o soluciones
tamponadas.
Algunas muestras como los huesos están demasiado duras. Por ello se procede a la
descalcificación mediante una solución de ácido pícrico, nítrico 4%, líquido de Fol o
líquido de Ebner.
INCLUSIÓN
El líquido en que se incluye la muestra se denomina medio de inclusión. En microscopía
óptica suele usarse la parafina.
Sin embargo, antes de incluir la muestra hay que deshidratarla mediante una serie
creciente de alcoholes.
Posteriormente llega el aclaramiento, que consiste en introducir la muestra deshidrata en
un líquido intermediario que se disuelve tanto el alcohol como en parafina (disolvente
orgánico xileno o tolueno).
Para finalizar, la muestra se sumerge en parafina líquida (imbibición).
La parafina líquida se vuelca dentro de un molde y solidifica.
CORTE Y MONTAJE
Microtomo: aparato que realiza los cortes
Hay varios tipos de microtomos: criostato, microtomo de desplazamiento, microtomo de
mano y vibrotomo (cortes gruesos de 20 – 40 µm) y microtomo de parafina (cortes finos
5 – 10 µm).
Los cortes manuales en parafina tienen la finalidad de eliminar la parafina que rodea el
bloque. Se denominan retallado (bordes) y desbastado (superficie)
El montaje puede realizarse de varias maneras:
COLORACIÓN
Un colorante (cromógeno + grupo auxocromo) es una molécula orgánica capaz de
absorber radiaciones electromagnéticas dentro de la región del espectro de luz visible.
Los colorantes ácidos reaccionan con los componentes básicos que se encuentran
fundamentalmente en el citoplasma. Los colorantes básicos reaccionan con los
componentes ácidos que se encuentran fundamentalmente en el núcleo. Los colorantes
neutros se utilizan para teñir la sangre.
Estos tres tipos de colorantes se fijan mediante el grupo auxocromo, mientras que los
colorantes indiferentes se disuelven dentro de determinadas sustancias de la muestra.
Los colorantes metacromático tiñen determinadas estructuras con un color que no es el
suyo. Ej: azul de toluidina tiñe de color rojo.
Los colorantes vitales no matan la célula que colorean.
También hay distintos procedimientos para teñir una muestra:
Mordiente: molécula que
favorece que el colorante
se ajuste al sustrato.
Técnicas especiales:
Inmunohistoquímica: uso de anticuerpos para detectar proteínas
Hibrifación in situ: uso de sondas para detectar ácidos nucleicos
Procedimientos:
Directo el anticuerpo se adhiere al antígeno y estimula la sustancia que lleva
adherida, poniendo de manifiesto ese antígeno
Indirecto el anticuerpo primario se adhiere al antígeno. A ese anticuerpo se la adhiere
otro anticuerpo llamado anticuerpo secundario (desarrollado en una especie diferente
del anticuerpo primario) y estimula la sustancia adherida o el complejo PAP, poniendo
de manifiesto el antígeno
Doble marcaje: poner de manifiesto dos Ac a la vez
Colocalización: detectar dos antígenos diferentes en una misma célula
Autorradiografía: marcar una molécula con un isótopo radiactivo
Montaje:
No se utilizan tintes, se utilizan contraste con sales de metales pesados.
Tinción negativa: el metal pesado forma una capa alrededor de la partícula a observar
Tinción positiva: el metal pesado es absorbido por la partícula
Sombreado metálico: consiste en pulverizar la partícula con una fina capa de metal
pesado desde un ángulo. Los objetos de la preparación producen sombras en la capa de
metal dando lugar a una imagen con una cierta apariencia tridimensional.
Criofractura: consiste en la congelación de muestras biológicas con nitrógeno líquido,
seguido de una fractura en la muestra y el sombreado metálico de la superficie. La
imagen formada es observada al microscopio
Criograbado: en la criofractura, las células se congelan en un bloque de hielo que a
continuación se rompe con una cuchilla. Para más detalles se puede seguir la técnica de
criograbado: las células se someten a vacío y se elimina el agua por sublimación. Esto
hace que las estructuras sobresalgan en la superficie.
Inmunohistoquímica: igual que en MO. Las moléculas que se unen al Ac son oro
coloidal, ferritina, hierro dextrano, hemocianina y cabeza del T4.
MEB
Las muestras se fijan al portamuestras con la ayuda de una cinta adhesiva de doble cara
que es conductora.