Acta Farm.

Bonaerense 18 (2): 135-9 (1999) Metodología

Recibido el 15 de septimbre de 1998
Aceptado el 12 de febrero de 1999

Determinación de Vitamina B 12 en una Formulación Multivitamínica

por Espectrofotometría de Derivada de Primer Orden
Lissette Sordo MARTÍNJ~z,Laritza SOTO MüLET y Rolando GONZALEZ HERNANDEZ*

Centro de Química Farmacéutica, Laboratorio Análisis Químico y Control de la Calidad,

Calle 200 esquina 21, Atabey, Playa, Apartado Postal 16042, Ciudad de la Habana, Cuba.

RESUMEN. Se desarrolló un método por espectrofotometría de derivadas de primer orden para la deter-
minación de vitamina B12 en una formulación multivitamínica compuesta por vitamina B1, B6 y B12. La
amplitud de la señal de la primera derivada se determinó a 378 nm. La validación prospectiva del método
demostró que fue lineal (r=0,999), preciso (repetibilidad CV= O y 132%; reproducibilidad CV=2,7 y 1,67
%), exacto y selectivo (se determinó B12en presencia de las vitaminas B1, B6 y en presencia de los produc-
tos de degradación de cada una de ellas).
SUMMARY. "Determiiiation of vitamin B12in a multivitamin pharmaceutical by first order derivate spectropho-
tometry". A method by first derivative spectrophotometry for the determination of vitamin B12 in a multivitamin
pharmaceutical, composed by vitamins Bl, B6 and Bi?, was developed. The amplitude of the first derivative sig-
nal was measured at 378 nm. The prospective validation of the method showed that it was linear (r=0,999),pre-
cise (repeatability CV= O and 1,52%;reproducibility CV= 2.7 and 1,67 %), accurate and selective (vi~minBI2
could be determinated in presence of vitamin Bl, B6 and degradation products of each one of them).

INTRODUCCI~N en preparaciones multivitamínicas mediante un

De las vitaminas hidrosolubles del complejo sistema de gradientes de la fase móvil compues-
B, cianocobalamina (B12), tiamina (B,) y pirido- ta por agua, metano1 y acetonitrilo. La segunda
xina (B6) generalmente forman parte en su con- técnica describe la determinación de vitamina
junto de formulaciones farmacéuticas inyecta- B12 en presencia de otras vitaminas hidrosolu-
bles, debido a su utilización e n el tratamiento y bles como vitamina C, nicotinamida, ácido nico-
prevención de diversas enfermedades como la tínico, ácido fólico, y vitamina B2 e n dos etapas.
neuritis periférica, la anemia perniciosa y mega- La primera etapa incluye una separación utili-
loblástica 1. zando la extracción de fase sólida usando cartu-
En la literatura se han reportado métodos chos de C18 para eliminar las vitaminas liposo-
cromatográficos 2.3 para el análisis simultáneo de lubles. En la segunda etapa se realiza la separa-
algunas vitaminas hidrosolubles, pero presentan ción cromatográfica mediante un sistema de gra-
como inconveniente que utilizan aditivos de dientes de una fase móvil compuesta por meta-
apareamiento iónico como componentes de la no1 y una disolución amortiguadora (buffer) de
fase móvil. Estos reactivos provocan el marcaje acetato de amonio. Comercialmente se encuen-
de las columnas, lo cual reduce su tiempo de vi- tra disponible una columna que asegura la sepa-
da y limita su campo de aplicación 4. Reciente- ración de vitamina B12 de otras vitaminas hidro-
mente se han reportado dos técnicas de HPLC solubles, tales como B, y B6 '. La fase estacio-
que permiten la determinación de vitamina B12 naria recomendada está compuesta por fase re-
5,6. La primera técnica describe su determinación versa (C18) y la fase móvil por una mezcla de

PALABRAS CLAVE: Determinación de vitairiiiia B12, Espectrofotometría de derivadas, Vitamina B1, Vitamina
B6. Validación.
KEY WORDS: Determination of vitamiii B12. Derivative Spectrophotometry, Vitamiii B1, Vitamin B6,
Validation.
*Autor a quien dirigir la correspondencia.E-niail: cqf@infoined.sld.cu.Fax: +53 - 7 -33 64 71

ISSN 0326-2383
Sordo Martínez, L., L. Soto Mulet & R. González Hemández

acetonitrilo y una disolución amortiguadora de MATERTAIES Y MÉTODOS

acetato de amonio (0,05 mM). Estas técnicas Se utilizaron como materiales de referencia
emplean sistemas cromatográficos y reactivos para los análisis: cianocobalamina materia prima
muy específicos, por lo que su reproducibilidad 96,05% de pureza (Medicuba), tiamina 99% de
puede verse seriamente afectada al cambiar lige- pureza (Merck) y piridoxina 99,5% d e pureza
ramente algunos de éstos, ya que no aparece re- (Merck). Las mediciones se realizaron en un es-
portado un estudio de robustez de los mismos. pectrofotómetro UV-Vis BioChrom 4060 y para
La técnica de espectrofotometría ultravioleta el análisis de los datos experimentales se eni-
de orden cero no puede llevarse a cabo de for- pleó el paquete de programas BioChrom 4060
ma satisfactoria debido al gran solapamiento de 11. Se utilizaron formulaciones inyectables liofili-
los espectros de absorción (Figura 1). Reciente- zadas (Empresa Farmacéutica Carlos J. Finlay,
mente, Morelli 8 ha desarrollado varios métodos Cuba) de composición: vitamina B1 (100 mg),
basados e n el uso de la espectrofotometría de vitamina B6 (100 mg) y vitamina B12 (5 mg). El
derivadas de segundo y quinto orden con el ob- correcto funcionamiento del equipo se compro-
jetivo de determinar varias vitaminas hidrosolu- bó mediante un filtro de óxido de holmio y va-
bles presentes en mezclas ternarias y cuaterna- pores de benceno (para el control de la longi-
rias. Este método constituye uno de los más uti- tud de onda) 12 y con una disolución de dicro-
lizados en el análisis de mezclas y consiste en mato de potasio (para el control de la absorban-
medir la señal derivada del componente de inte- cia) 13. Se utilizó el paquete de programas esta-
rés a la longitud de onda e n la que el espectro dístico Origin 14 para la determinación de la de-
derivado del compuesto interferente corta al eje rivada de primer orden y para el ajuste de la
de las abcisas, es decir se anula 9. La especuofo- recta de la curva de calibración.
tometría de derivadas es un método cuya practi-
cabilidad se ve incrementada, ya que -a diferen- Reactivos utilizados
cia de la técnica de HPLC- no genera gran canti- Dicromato de potasio p.a., ácido sulfúrico
dad de reactivos residuales y además, al no re- p.a, tetraborato de sodio p.a, hidrógeno fosfato
querirse separación previa, el tiempo de análisis de potasio p.a., peróxido de hidrógeno al 30%,
se acorta. acetoniuilo para cromatografia y ácido fosfórico
p.a fueron adquiridos a Merck.
Abs
Evaluación de los parámetros de
vaiidac~n
Linealidad
A partir de una disolución de B12 (1 mg/mL)
se prepararon 5 disoluciones en un rango de
33-166% sobre la base de una concentración
teórica de 0,03 mg/mL. A cada una de estas di-
soluciones se le añadió una cantidad constante
d e la mezcla B1-B6 (correspondiente a 0,6
mg/mL). Este procedimiento se realizó por tri-
Longitud d e o n d a (nin)
plicado. A todas las disoluciones se le registró
- el
espectro de absorción de 200 a 400 nm y se de-
Figura 1.Espectros de las disoluciones de vitamina B1
(B), Bg (C) y B12 (A) a 0,01 mgímL cada una. terminó la amplitud de la señal de la primera
derivada a 378 nm. Con estos valores y los de
concentración se construyó la curva de calibra-
En el presente trabajo se desarrolló un méto- ción y se determinaron los parámetros funda-
do espectrofotométrico basado en la derivada mentales de la ecuación de la recta obtenida.
de primer orden para la determinación de vita-
mina B12 e n una formulación inyectable com- Precisión
puesta además por vitaminas B1, B6 y B12. Para A partir de una disolución de vitamina B12 (1
comprobar la fiabilidad del mismo se analizaron mg/mL), se preparó una disolución de concen-
los parámetros analíticos de linealidad, preci- tración 0,02 mg/mL y una de 0,03 mg/mL. A
sión, exactitud y selectividad, lo cual responde a ambas se les añadió una cantidad constante de
las exigencias legales establecidas de acuerdo a la mezcla B1-B6 igual a 0,6 mg/ml. Este procedi-
la clasificación del método 10. miento se realizó por triplicado el inismo día
 acto farmacéutica bonaerense - vol. 18 no 2 - año 1999

(ensayo de repetibilidad) y durante dos días por una disolución mezcla de vitaminas Bl-B6 (0,6
dos analistas diferentes para el estudio de repro- mg/mL) cada una; estas concentraciones se re-
ducibilidad. A todas las disoluciones se le regis- fieren a las cantidades en que ellas están pre-
tró el espectro de absorción de 200 a 400 nm y sentes en la mezcla (Figura 2). A estos últimos
se determinó la amplitud de la señal de la pri- espectros le fueron determinadas las primeras
mera derivada a 378 nm. Con estos se calcula- derivadas. Las longitudes de onda a las cuales la
ron las concentraciones mediante la ecuación de primera derivada de la mezcla Bl-B6 tomó valo-
la recta obtenida en el ensayo de linealidad. res cero fueron: 212, 218, 220, 230, 235, 236,
240, 242, 255, 260, 366, 373 y 378 nm (Figura 3).
Exactitud La primera derivada de la vitamina BI2 no tomó
Se utilizaron los datos experimentales obteni- valores cero a ninguna de las longitudes de on-
dos en el ensayo de repetibilidad. Se determinó da anteriores (Figura 4). A partir de estos resul-
el porciento de recobrado y el intervalo de con- tados se seleccionó la longitud de onda de 378
fianza del mismo. nm para la determinación de vitamina B12, ya
Selectividad que este valor se encontraba en el rango de me-
La selectividad se evaluó mediante la compa- nor ruido.
ración de la amplitud de la señal de la primera
Abs
derivada a 378 nm de una disolución patrón de
B12 (0,03 mgímL) y de varias disoluciones que
tenían la misma cantidad de B12 que la disolu-
ción anterior, pero que se encontraban contami-
nadas con: 1) sus propios productos de degra-
dación obtenidos en medio básico (tampón pH
9) [[I,2) con los productos de degradación de la
vitamina B1 (degradada a reflujo en medio neu-
tro) [III y 3) con los productos de degradación
de la vitamina B6 obtenidos en medio oxidante
(peróxido de hidrógeno) [IIII. Los valores pro- Longitud d e onda (nm)
medios de la amplitud de la señal de la primera
Figura 2. Espectros de las disoluciones acuosas de vi-
derivada de las disoluciones 11 y 111 se compara-
tamina BI2 (A: 0,03 mgírnl) y mezcla B1-B6 (B: 0,6
ron mediante una prueba t de Student con los mgímL cada una). Concentraciones correspondientes
de la disolución de vitamina B12 (0,03 mgímL). a la cantidad en que las vitaminas están presentes en
la formulación.
Determinacidn del contenido de vitamina
B,, en Iaformulación comerckal
Se tomó el contenido de 10 bulbos de liofili-
zado y se disolvió de forma independiente en d A /
a
25 mL de agua destilada. Luego se tomaron alí- 0.06
cuotas de 1,5 mL de cada uno por separado y se
0.00
llevaron a matraces aforados de 10 mL. A cada
disolución se le registró el espectro de absor- -0.06
ción de 200 a 400 nm y se determinó la ampli-
tud de la señal de la primera derivada a 378 nm. -0.12
Con estos valores se procedió a determinar el
contenido de vitamina B12 en la formulación -0.1 8
mediante la ecuación de la recta obtenida en el 200 250 300 350 400 450 500
ensayo de linealidad. Longitud de onda (nm)
Figura 3. Derivada de primer orden del espectro de
RESULTADOS
la disolución de vitamina B12 (0,03 mgímL).
Desarrollo dkl métoab analftico
Se registraron los espectros de 200 a 400 nni
de las disoluciones acuosas de vitaminas B1, B6 Valiáución
y B12 a 0,01 mg/mL cada una ( ~ i ~ u r1).
a Tam- En la Tabla 1 se muestran los parámetros es-
bién se registraron los espectros de una disolu- tadísticos correspondientes a la curva de calibra-
ción acuosa de vitamina B12 (0,03 mg/nlL) y de ción de vitamina B12.
 Sordo Martínez, L., L. Soto Mulet & R. González Hemández

DISCUSI~N
Los resultados del estudio de linealidad (Ta-
bla l) demostraron la existencia de una correla-
ción linealmente positiva entre los valores de
concentración estudiados y las respuestas obte-
nidas (tr calculado >> ttab). El coeficiente de
correlación fue cercano a la unidad. El coefi-
ciente de variación de la pendiente fue menor
del 2%, límite establecido 15.
-0.18 El intercepto fue no significativo y su inter-
200 3 O0 400 500 valo de confianza incluyó al cero para un 95%
Longitud de onda (nm) de confiabilidad, lo que permite descartar la
presencia de errores sistemáticos y confirmar el
Figura 4. Derivada de primer orden del espectro de
la disolución mezcla de las vitaminas Bi-B6 (1,2 cumplimiento de la ley de Lambert-Beer.
mgímL de cada una). En el estudio de precisión (Tabla 2) los coe-
ficientes de variación, tanto para repetibilidad
como para reproducibilidad, fueron menores
Parámetro Valor que los limites establecidos ' 5 (2 y 3%, respecti-
vamente) para las dos concentraciones estudia-
Rango lineal (mg/mL) 0,Ol - 0,05 das.
Curva de calibración Y = 0,525X En el ensayo de exactitud (Tabla 3) el inter-
Pendiente, b 0,525 valo de confianza del porciento de recobrado
Desviación típica de b, Sb 0,0078 incluyó al 100% para los dos niveles de concen-
Coeficiente de variación de b, CVb 1,4857 % tración estudiados, por lo que el método se
considera exacto.
Intercepto, a -0,0003
En el ensayo de selectividad la amplitud de
Desviación tipica de a, Sa 0,0002 la señal de la primera derivada a 378 nm de la
Intervalo de confianza de a [-0,00021;0,000911 disolución 1 es menor que la de la disolución
Coeficiente de correlación, r 0,9996 patrón de B12 0,03 mg/mL (Tabla 4). Esto de-
Tr 80,54 muestra que el método propuesto puede ser uti-
lizado para el control de pureza del producto.
Tabla 1. Resultados del ajuste de la recta de la curva Por otra parte, el método propuesto fue selecti-
de calibración por el método de los minimos cuadra- vo para la determinación de la vitamina B1, en
dos, donde: td=2,160 (a=0,05; n=15; f=n-2=13)-Va-
lor de ttab para el cálculo del intervalo de confianza presencia de los productos de degradación de
y para evaluar la linealidad. tr: Valor experimental las vitaminas B1 y B6, ya que la amplitud de la
del estadígrafo t con n-2 grados de libertad para eva-
luar la linealidad. señal de la primera derivada de las disoluciones
11 y 111 n o difieren significativamente [texp
En las Tablas 2, 3, 4 y 5 se muestran los re- (1,8345 para 11) y (2,001 para 111) < ttab (2,776)l
sultados obtenidos e n los ensayos de precisión, de la disolución patrón de B120,03 mg/mL (Ta-
de exactitud, de selectividad y del contenido de bla 4).
vitamina B12 en la formulación comercial, res- El método desarrollado fue utilizado para de-
pectivamente. terminar el contenido de B1, en el inyectable, el

Repetibüidad Reprodudbilidad
Día 1 Analista 1 Día 2 Anaiista 2
Concentración Concentración 0,03 Concentración Concentración 0,03
0,02 mg/mL mg/M1 0,02 mg/mL mgímL

Media 0,020 0,029 0,019 0,029

S 0 0,0004 0,0005 0,0005
cv 0% l,5Z0h 2,7% 1.67%

Tabla 2. Resultados del estudio de precisión (repetibilidad y reproducibilidad) en la deterriiuiacion de 13 con-

centración de vitamina BI2.S: desviación típica. CV:coeficiente de variación

138
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Cantidad Cantidad Porciento Cantidad Cantidad Porciento

añadida media recuperada medio de &&da media recuperada medio de
CmdmL) (mg/mL) recobrado (mg/mL) (mg/mL) recobrado

0,020 0,021 103 0,030 0,029 98

IC 97; 109 IC 95; 101
Tabla 3. Resultados del estudio de exactitud en la determinación de la concentración de vitamina B12.
IC: intervalo de confianza del recobrado.

Amplitud de la señal de la primera derivada

B12 Disolución 1 Disolución 11 Disolución 111

media
S

Tabla 4. Resultados obtenidos en la determinación de la amplitud de la seiial de la primera derivada de la vita-

mina Blz en el ensayo de selectividad. S:desviación típica, ttab (0,05; 4) = 2,776- valor de la t de Student para la compa-
ración de las medias.

Cantidad media (mg) 5,68 2. Maeda, Y., K. Owada, J. Sato, T. Masui y H.

Nakazawa (1989) J. Assoc. 0 3 Anal. Chem. 72:
244-7
3 Huan, X. y Z. Li (1991) Zhongguo Yaoxue Zaz-
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Tabla 5. Resultados de la determinación de vitamina 4. Quattrochi Oscar A., S.I. Abelaria y R.F. Laba
BI2 en la formulación comercial. S: desviación típica y (1992) 'introducción a la HPLC. Aplicación y
CV:coeficiente de variación.
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pág. 76
cual se encontró con una probabilidad de un 5. Stefova M., T. Stafilov, K. Stojanoski y B. Ce-
95% entre 5,30 y 6,06 mg. La cantidad expresa- preganovaKrstic (1997) Anal. Lett. 30: 2723-31
da por el productor es de 5 mg, aproximada- 6. Papadoyannis I.N., G.K. Tsioni, y V.F. Samani-
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para la determinación de vitamina B12 en la for- ch@alltechmail.com, http://www.alltechmail-
mulación comercial en presencia de las vitami- .com/
nas Bl y B6. 8. Morelli, B. (1%) J.Anal. Chem. 354: 97-102
El método validado es lineal, preciso y exac- 9. Sánchez Rojas F., C. Boch Ojeda y J.M. Cano
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