Desarrollo de Una Metodología Analítica para Determinación Simultánea de Vincristina y Doxorrubicina en Preparaciones Farmacéuticas para Oncología Por HPLC

Desarrollo de una metodologa analtica para
determinacin simultnea de vincristina y

doxorrubicina en preparaciones farmacuticas para
oncologa por HPLC UV.
Objetivo.
Desarrollar una metodologa analtica para la
determinacin simultanea de vincristina y doxorrubicina
en preparaciones oncolgicas por tcnica de HPLC-UV.
Introduccin.
Vincristina y doxorrubicina (Figura 1 ) son dos
medicamentos usados en oncologa. La vincristina es un
alcaloide obtenido de Catharanthus roseus, cuya accin
citosttica no se entiende completamente, pero
aparentemente resulta de su capacidad para formar
B
complejos con tubulina, inhibiendo su polimerizacin en
el acromtico huso mittico y por lo tanto la inhibicin
de la divisin celular. La doxorrubicina o adriamicina es
un
antibitico
antraciclinico
,
aislado
desde
coeruleorubidus Streptomyces o Streptomyces peucetius. Su efecto citostticos
resultados de diversos mecanismos como inhibicin de Figura 1 A. Vincristina, B.
la replicacin y la transcripcin de la clula ADN , la Doxorrubicina.
interaccin con la topoisomerasa II con la consiguiente rotura del ADN , la
desregulacin de calcio y sodio transportes a nivel de la membrana celular, y la
generacin de radicales libres de oxgeno.
Este estudio presenta un nuevo y optimizado mtodo HPLC UV para la
determinacin simultnea de vincristina y doxorrubicina en preparaciones
farmacuticas utilizando una columna de fase inversa por elucin isocrtica.
Hoy en da, los mtodos cromatogrficos son los ms frecuentemente
utilizados en la evaluacin cualitativa y cuantitativa de medicamentos. El
mtodo descrito fue validado de acuerdo con las normas de la Conferencia
Internacional sobre Armonizacin de los Requisitos Tcnicos para el Registro de
Productos Farmacuticos para Uso Humano (ICH), a fin de ser utilizado de
forma rutinaria en el laboratorio, pruebas de documentos de suministro que
llevar a cabo las tareas para las que est indicado y asegurarse de que es, por
lo menos, exacta (recuperacin > 98 % ) , precisa [ coeficiente de variacin
( CV) < 15 %] , reproducible (CV < 20 %) y robusto dentro de la variacin
especificada en las normas.
METODOLOGA.
REACTIVOS.
Los reactivos utilizados fueron acetonitrilo grado HPLC , SDS ( Peypin ,
Francia) , hidrogenofosfato de potasio anhidro , pa , Merck (Darmstadt,
Alemania) , cido fosfrico al 85 % , RPEACS , cloruro de sodio 0,9 % , B. Braun
Medical ( Melsungen , Alemania ) , agua purificada obtenida con una Sistema

Milli -Q (Millipore , Bedford , MA).
Hidrocloruro de doxorrubicina (2 mg / ml) en solucin salina fisiolgica al 0,9%
( pH = 3 ) , el ster metlico de p - amino benzoico ( metilparabeno ) , y npropil -p- hidroxi- benzoato de etilo (propilparabeno ) fueron adquiridos de
Sigma- Aldrich (St. Louis , MO) y, junto con sulfato de vincristina ( Fluka Chemie
, Buchs , Blgica ), fueron utilizado como estndares.
Vincristina Irex ( 2 mg / 2 ml, PCH Pharmachemie , Haarlem , Pases Bajos) y
Adriblastine CS ( 50 mg / 25 ml, Pharmacia Corporation, Peapack , NJ ) se
utilizaron para preparar las soluciones de muestra.
EQUIPO.
Determinacin de la vincristina y doxorubicina se hizo en un sistema
Gilson HPLC -UV, que consiste en una bomba Modelo 321, un Modelo
151 UV -vis detector, y un inyector , con un loop de 100 L (Villiers-le
Bel , Francia ) .
La separacin se logr a travs de una columna C18 Waters Spherishorb
ODS 4,6 250 mm, 5 micras (Milford, MA ) y los datos se proces por un
UniPoint 2.10 software ( Gilson , Villiers -le -Bel, Francia).
Los siguientes artculos tambin se utilizaron:
Balanzas de precisin por Mettler Toledo AG285 ( Greifensee ,
Suiza ).
pH metro WPA CD7400 (Cambridge, Reino Unido )
UniEquip vortex (Munich , Alemania ) ;
B- 169 bomba de vacio por Bchi ( Flawil , Suiza ) ;
SONOREX RK / 100 Bandelin bao de ultrasonidos ( Berln,
Alemania );
micropipetas por Gilson.
Filtros de membrana by Schleicher & Schuell, 0.2 m, 50 mm (Dassel,
Germany).
PREPARACION DE ESTANDARES.
Las soluciones estndar se prepararon en cloruro de sodio ( 0,9
%).
Para sulfato de vincristina,se preparo una solucin stock de 100
g / mL.
Para clorhidrato de doxorrubicina, una concentracin de 2,000 g /
mL, en cloruro de sodio ( 0,9 %) , se utiliz como como solucin
Stock.
Las soluciones de trabajo se prepararon a partir de soluciones

stock, con concentraciones de 0,5 a 10 g / ml de vincristina y 2100 g / ml para la doxorrubicina .
Para metilparabeno y propilparabeno, se prepararon soluciones madre

de 100 g / mL , y a partir de estas cinco soluciones intermedias de 40 ,
20 , 5 , 2 , y 1 g /mL . Finalmente, las soluciones de trabajar con
concentraciones de 0.1-1.1 g / mL se prepararon a partir mencionado
previamente la soluciones. Las soluciones se almacenaron en botellas de
vidrio de color mbar, en el refrigerador, a una temperatura de 2-8 C.
Las soluciones de muestra

Las mezclas de vincristina y doxorubicina en cloruro de sodio 0,9 % se
prepar a partir de la dosis comercial que contienen 1 mg / mL y 2 mg /
ml de los frmacos, respectivamente.
Se prepararon tres muestras con las siguientes concentraciones:
1,5 g / ml vincristina y 42,6 g / ml de doxorrubicina (muestra A);

15,2 mg / ml vincristina y 857,1 g / ml de doxorrubicina(muestra
B);y
30,3 mg / ml de vincristina y 1700 g / mL doxorrubicina (muestra
C).
De estas concentraciones se es establecieron las dosis diarias de los

medicamentos, el rea de superficie corporal (BSA ) de los pacientes, el
perodo de la infusin , y el volumen y flujo de las bombas de infusin
disponibles en el mercado .
Antes de la inyeccin en el sistema de HPLC , las muestras B y C se
diluyeron 10 y 20 veces en cloruro de sodio ( 0,9 % ), respectivamente,
para permitir cuantificacin.
Cromatografa
Se llevaron a cabo anlisis y cuantificaciones de las muestras por LC de

fase inversa, acoplada a deteccin UV ( = 230 nm).
La elucin se realiz isocrticamente hecha por una velocidad de flujo de
1,5 mL / min.
La fase mvil consisti en una mezcla de acetonitrilo (90 %) en agua y
potasio 50 mM tampn de hidrogenofosfato (pH 3,2 0,1 ) ajustado con
cido fosfrico al 85 % ( 32:68, v/v) , filtrada y desgasificada
previamente . Se realiz la identificacin de medicamentos a travs de
los tiempos de retencin y su cuantificacin del rea del pico, que
intersecta el valor ledo en una curva de calibracin construido a partir
de los patrones inyectados en el mismo da.
Resultados y discusin.
Se desarrollo y optimizo la metodologa analtica:
Las condiciones cromatograficas fueron optimizadas para mejorar

el rendimiento del mtodo, inicialmete se haba probado una
columna de 150 mm, pero no fue capaz de separar la vincristina
de propilparabeno, eluyeron juntos y sus tiempos de retencin
fueron muy cortos. Requiriendo una columna de 250 mm
separando de forma adecuada los componentes, obteniendo picos
mejores.
Se selecciono la fase mvil en base a literatura y caractersticas de
solubilidad de los medicamentos en porcentajes acetronilo al 90%
en agua y tampn de hidrofosfato de potasio 50mM pH 2.1+/- 0.1
obteniendo la mezcla adecuada 32:68.
Longitud de onda de deteccin se define desde el espectro de
absorcin de vincristina y doxorrubicina en el UV-vis (Figura 2) .
Las longitudes de onda de probadas inicialmente de 227 , 230 , y
233 nm, pero el segundo demostr ser ms adecuada para la
cuantificacin simultnea de los dos frmacos .
las soluciones estndar de metilparabeno y propilparabeno ,

presente en las formulaciones comerciales de vincristina,
fueron inyectados con el fin de verificar su injerencia en
la respuesta analtica del mtodo. El cromatograma obtenido
presenta cuatro picos perfectamente resueltos con buena
tiempos de retencin separadas (Figura 3 ) . Estos resultados
demuestran
que el mtodo desarrollado no sufre
la interferencia de los parabenos presentes
en formas farmacuticas , siendo especfica
para vincristina y doxorubicina .
Linealidad
Linealidad (17,18) se evalu en la
intervalo de concentraciones de 5-100
g / ml para la doxorrubicina y 1-5 g / mL
para vincristina, utilizando siete soluciones estndar .
Una curva de calibracin estndar se construy , y la linealidad fue

evaluada por la correlacin
coeficiente obtenido a travs del tratamiento de los resultados. cada
estndar se analiz por triplicado.
Los resultados obtenidos demostraron
que el mtodo fue lineal en el intervalo de concentracin
de 1-5 g / ml para vincristina y 5-100 g / ml para la doxorrubicina ,
con coeficientes de correlacin promedio ( r2 ) de 0.9967 y
0,9958 , respectivamente. Los valores medios de las ecuaciones de
regresin
para la vincristina y la doxorrubicina fueron, respectivamente ,
m = 159.333 , b = 81,853 , ym = 113893 , b = 386588 , donde m
es la pendiente yb la ordenada al origen .
Precisin
La precisin se considera en dos niveles, repetibilidad y
precisin intermedia, de acuerdo con las recomendaciones de la ICH
La repetibilidad se evalu por triplicado con
las concentraciones de 1,5, 2,2, y 3,0 mg / ml de la vincristina y
42, 64 y 84 mg / ml de doxorrubicina. En la evaluacin de la
precisin intermedia, cinco niveles de concentracin (9 replicado)
se utilizaron, determinado en cuatro das diferentes, y / o por tres
diferentes operadores.
Reproducibilidad, de acuerdo con el concepto ICH
(17,18), no fue evaluado, ya que el mtodo todava tiene que ser
aplicado en diferentes laboratorios.
Tablas I y II resumir los resultados obtenidos en relacin con
repetibilidad y precisin intermedia. Los datos obtenidos CV
se consideraron aceptables, de acuerdo con Bressolle y compaeros de trabajo
(20). Estos autores consideran datos de CV de 15% y
20%, respectivamente, para la repetibilidad y precisin intermedia,
valores como tolerables para las concentraciones de acercarse a la
lmite de cuantificacin, como concentraciones ensayadas.

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determinacin simultnea de vincristina y

Medical ( Melsungen , Alemania ) , agua purificada obtenida con una Sistema

Las soluciones de trabajo se prepararon a partir de soluciones

Para metilparabeno y propilparabeno, se prepararon soluciones madre

Las soluciones de muestra

1,5 g / ml vincristina y 42,6 g / ml de doxorrubicina (muestra A);

De estas concentraciones se es establecieron las dosis diarias de los

Se llevaron a cabo anlisis y cuantificaciones de las muestras por LC de

Las condiciones cromatograficas fueron optimizadas para mejorar

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