Instituto Politécnico

Nacional
Escuela Nacional De
ciencias Biológicas
Práctica No.2 “DETERMINACIÓN
DE PROTEÍNAS POR EL MÉTODO
DE BRADFORD”

5QV2
Profesora: Rodríguez Páez Lorena

Ciudad de México
Septiembre 2021
OBJETIVOS:
 Realizar la cuantificación de proteínas por el método de Bradford y a partir de los
valores obtenidos realizar una curva tipo.
 Determinar las diferencias estadísticas presentes entre el método de Lowry y el
método de Bradford en la precisión y exactitud.
 Determinar cómo es que las sustancias no proteicas interfieren en el método.

RESULTADOS:

1) CURVA DE CALIBRACIÓN DE ALBÚMINA POR EL MÉTODO DE BRADFORD

Tabla 1. Datos para la curva de

calibración de albúmina por el método de 0.7
Bradford.
0.6 f(x) = 0.003684 x + 0.1618
R² = 0.991637191962305
0.5
Absorbancia (nm)

0.4

0.3

0.2

0.1

0
20 40 60 80 100 120 140
Albumina (μg)
Figura 1. Curva de calibración de albúmina por el método de Bradford

2) ANÁLISIS ESTADÍSTICO PARA EL MÉTODO DE BRADFORD.

Tabla 2. Replica para el análisis estadístico para el método de

Bradford.

Tabla 3. Resultado del análisis estadístico para el método de

Bradford.
 3) EFECTO DE SUSTANCIAS NO PROTEÍNICAS QUE INTERFIEREN EN EL
MÉTODO DE BRADFORD.

Tabla 4. Efecto de sustancias no proteínicas que interfieren en el método de Bradford.

Tabla 5. Comparación del método de Lowry y método de Bradford.

No. de tubo Cantidad de Cantidad de Diferencia Di-D (Di-D) ²

proteína (μg) proteína (μg) Lowry-
Lowry Bradford Bradford
1 86.76 77.35 -9.41 -1.85 3.43
2 82 85.46 3.46 -4.09 16.78
3 81.04 88.43 7.39 -0.16 0.02
4 74.85 87.08 12.23 4.67 21.84
5 75.33 89.78 14.45 6.89 47.51
6 72.47 91.94 19.47 11.91 142.01
7 81.52 86.54 5.02 -2.53 6.44
8 73.9 83.84 9.94 2.38 5.68
9 74.38 77.08 2.7 4.85 23.59
10 76.76 87.08 10.32 2.76 7.63

Tabla 6. Resultados estadísticos del método de Lowry

(X) S (S)² CV μ
77.90 4.63 21.43 5.94 Valor (+) = 78.61
Valor (-) = 77.18

Tabla 6.1 Resultados estadísticos del método de Bradford

(X) S (S)² CV μ
85.45 4.88 23.83 5.71 Valor (+) = 88.95
Valor (-) = 81.96
 T DE STUDENT

7.55 √ 10
Se acepta Ho si tcal < tcrit DE=7.55 t crit =4.32
5.53

Se acepta Ha si tcal > tcrit

SD=
√ 274.94
9
=5.527 gl= 9 = tcrit = 2.26

 Se acepta Ha: tcal > ttab = 4.31 > 2.262

 Por lo tanto, se acepta Ha, debido a que existe diferencia significativa en la
exactitud entre ambos métodos.

F DE FISHER

Se acepta Ho si tcal < tcrit

23.832
F= 2
=1.236
21.43

Se acepta Ha si tcal > tcrit gl= 9= f crit= 4.02

 Se acepta Ho: tcal < t crit = 1.24 < 4.026

 Por lo tanto, se acepta Ho, debido a que no existe diferencia significativa en la
precisión entre ambos métodos.

DISCUSION :
Los métodos colorimétricos para la cuantificación de proteínas se basan en medir la
absorbancia del complejo colorido que se forma tras la reacción de la proteína con el
colorante. Para un método colorimétrico se necesita una curva de calibración, la cual es
un marco de referencia que se construye con cantidades conocidas de proteína, esta se
utiliza para determinar cantidad de proteína presente en una muestra desconocida. En las
determinaciones colorimétricas, existe una relación directamente proporcional entre la
intensidad de color y la cantidad de proteína.
Con el desarrollo de la práctica se obtuvo como primer punto la curva de calibración para
cada uno de los métodos realizados, en el método de Lowry se observa una mejor
tendencia lineal de los datos, siendo observable en el coeficiente de correlación 0.9903,
en comparación de la curva de calibración del método de Bradford, coeficiente de
correlación igual a 0.9916, asi mismo la pendiente es mayor en el método de
Bradford,0.0037, indicando una mayor sensibilidad del método, esto debido a la siguiente
interpretación: la pendiente matemáticamente es 𝐴 /𝐶𝑎𝑛𝑡𝑖𝑑𝑎𝑑 𝑑𝑒 𝑝𝑟𝑜𝑡𝑒í𝑛𝑎 , con lo que se
deduce que en la misma cantidad de proteína la absorbancia es mayor, y que en menores
concentraciones de proteína el método las puede detectar con una absorbancia
considerable.
Como parte de análisis estadístico se presenta un coeficiente de variación, para que este
valor se encuentre en un nivel aceptable de confianza, se debe de encontrar en los
valores sugeridos del 3 al 5 % en condiciones de rutina en este caso arrojó el análisis un
resultado de 5.71 por lo tanto no se encuentra en los límites de confianza el coeficiente de
varianza, este tipo de errores se pueden adjudicar a malas prácticas o a un error
sistemático personal.
Existen sustancias que pueden interferir en el resultado esperado, esto debido a que el
colorante puede reaccionar de una u otra manera dando un falso resultado. Se evaluaron
distintas sustancias que determinaron si eran interferencias al método o no, usando el
intervalo de confianza que nos proporcionó el análisis estadístico. Para el método de
Lowry se observa que se tienen inferencias positivas al usar Fenol al 1% y urea al 5%,
esto debido a que estos agentes producen la reducción del reactivo, por ejemplo, el fenol
es un análogo estructural de la tirosina la cual es un aminoácido que reduce al reactivo de
Folin-Ciocalteau. Mientras que en el método de Bradford las interferencias negativas son
gracias a los detergentes en este caso el SDS el cuál actúa rompiendo enlaces no
covalentes en las proteínas, desnaturalizándolas, provocando que estas moléculas
proteicas pierdan su conformación inicial. Esto ocurre porque el SDS se une a las zonas
apolares del polipéptido. Además, la cantidad de SDS unido es similar para muchas
proteínas y solamente se tuvo una interferencia positiva, que corresponde al Fenol al 1%.

CONCLUSIONES:
 Gracias al análisis estadístico de los métodos de Bradford y Lowry podemos
deducir que, si existe diferencia estadísticamente significativa en la exactitud, pero
no en la precisión.
 Algunas sustancias no proteínicas presentan interferencias en el desarrollo de
color, esto es debido a la reacción que tienen al entrar en contacto con el colorante
dando un falso error en la cantidad de proteína.

PREGUNTA EXTRA

Busque en bases de datos de referencias bibliográficas (Pubmed, Scopus, Google

académico, Medline, etc.) un artículo donde se proponga un nuevo método para la
determinación (cuantificación) de proteínas, en los últimos 21 años (del 2000 al 2021) y
describa el fundamento.
Se modificó el método mencionado en APHA, AWWA, WPCF “Métodos normalizados
para el análisis de aguas potables y residuales” 1992 y estandarizado por Tamayo y col.,
[2013]; para ello se tomaron 3.125 ml de cada digerido (para la curva) y 470µl de cada
digerido para el caso de las muestras de escamas, se colocaron en vasos de precipitados
con agua desionizada, aplicando agitación magnética y utilizando soluciones de NaOH a
diferentes concentraciones (0.001 a 1.0 M) para llevarlos a pH neutro, finalmente se
aforaron a 50 ml con agua desionizada. A partir de cada solución neutralizada se tomaron
10 ml, se colocaron en un vaso de precipitados con agitación magnética, se añadieron en
orden los siguientes reactivos: 50 μL de MnSO4, 600 μL de HClO, y 750 μL de
C6H5ONa+; se dejó reaccionar durante 10 minutos para el desarrollo de la coloración, por
último se leyó la absorbancia a 630 nm en un espectrofotómetro USB 4000® marca
Ocean Optics®. Se Llevaron a cabo 4 tinciones por especie. Las cantidades tomadas de
los digeridos de las muestras de escamas fueron calculadas partiendo del supuesto de
que las escamas contenían un 50% de proteína, esto de acuerdo a lo mencionado a la
literatura, para que los valores que se obtuvieran, se ubicaran dentro de la curva.
Curva de calibración: Para determinar la concentración de proteína en las escamas, se
diseñó una curva de calibración con cloruro de amonio (NH4Cl) como estándar, a partir de
una solución madre se prepararon 4 puntos de la curva, cada punto representa una
concentración de proteína en mg/ml; siendo éstos: 0.00125; 0.00250; 0.00375 y 0.00500

BIBLIOGRAFÍA:
Skoog D.A. Holler F.J. y Crouch S.R. (2008). Principios de análisis instrumental. Sexta
edición. Cengage Learning Editores. México D.F
Harris Daniel C. “Análisis Químico Cuantitativo”, 2ª edición. Editorial Reverte, España
2001.