Memoria presentada por

Nieves Santiago Doménech

Para optar al grado de Doctora por la Universidad de Málaga

Caracterización de la pared celular de frutos de fresa (Fragaria x

ananassa Duch.
Duch.): cambios durante el desarrollo y efectos del
silenciamiento de un gen de pectato liasa

Directores: Drs. Miguel Ángel Quesada Felice y

Antonio Javier Matas Arroyo

Departamento de Biología Vegetal

Área de Fisiología Vegetal
Universidad de Málaga
Málaga, 2016
AUTOR: Nieves Santiago Doménech
http://orcid.org/0000-0003-2319-1607

EDITA: Publicaciones y Divulgación Científica. Universidad de Málaga

Esta obra está bajo una licencia de Creative Commons Reconocimiento-NoComercial-

SinObraDerivada 4.0 Internacional:
http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/legalcode
Cualquier parte de esta obra se puede reproducir sin autorización
pero con el reconocimiento y atribución de los autores.
No se puede hacer uso comercial de la obra y no se puede alterar, transformar o hacer
obras derivadas.

Esta Tesis Doctoral está depositada en el Repositorio Institucional de la Universidad de

Málaga (RIUMA): riuma.uma.es
Miguel Ángel Quesada Felice, Catedrático del Departamento de Biología Vegetal de la

Universidad de Málaga, y Antonio Javier Matas Arroyo, Investigador “Ramón y Cajal” del

Departamento de Biología Vegetal de la Universidad de Málaga

INFORMAN:

Que, la Licenciada Dª Nieves Santiago Doménech ha realizado bajo nuestra dirección en este

Departamento el trabajo titulado “Caracterización de la pared celular de frutos de fresa

(Fragaria x ananassa Duch.): cambios durante el desarrollo y efectos del silenciamiento de un

gen de pectato liasa”. La presente memoria recoge los principales resultados obtenidos y se

presenta para su defensa pública para aspirar al grado de Doctora

Para que conste, y tenga los efectos que correspondan, en cumplimiento de la legislación

vigente, extendemos el presente informe autorizando la defensa.

En Málaga, a 13 de noviembre de 2015

Dr. Miguel Ángel Quesada Felice Dr. Antonio Javier Matas Arroyo
 AGRADECIMIENTOS

Mucho tiempo ha pasado desde que empecé a trabajar en esta tesis, y por

distintas circunstancias se ha ido retrasando, pero al fin está aquí. Son muchas las

personas que durante este tiempo he conocido y que de alguna manera me han

ayudado y a las que me gustaría agradecer su apoyo y seguramente a alguien se me

olvidará nombrar y lo siento.

Para empezar me gustaría agradecer a mis directores el ofrecerme esta

oportunidad, especialmente a Miguel Ángel Quesada por contar conmigo y

ofrecerme la oportunidad de realizar este trabajo, gracias por tu gran ayuda, tu

apoyo, tu respaldo y porque no olvidas nunca ese lado más personal. A Antonio

Matas porque siempre está dispuesto a ayudar, por ser un pozo de sabiduría con

quien siempre se aprende algo, y por ayudarme y enseñarme tantas cosas en esta

última etapa. Y como no a José Ángel Mercado, que es parte de este trabajo y

aunque por circunstancias no ha podido ser director yo considero que lo es. Gracias

José Ángel siempre se puede contar contigo y siempre con buena condición.

Muchas gracias a los tres de corazón.

A Fernando, quiero agradecer el dejarme practicar el cultivo in vitro con el

stock de fresas, a partir de ahí vinieron muchas más oportunidades. Y por

contarnos tantas batallitas y proveernos los desayunos.

Varias “generaciones” de compañeros estupendos han pasado por el laboratorio

desde que empecé en este mundillo. Quiero agradecerle a Lara, amiga desde que

despistadas buscábamos a alguien más de vegetal, el que me diera el empujoncillo

para venir al departamento, a Gema, Maca, Sabri, Belén, Adolfo y Lourdes con

quienes tan buenos momentos he pasado, esta etapa empezó con vosotros y fue

muy especial para mí.

A Elena, Sara, Sergio, Fatiha, Candelas aunque ya no estáis por aquí, habéis

crecido como estupendos científicos y mejores personas, ahí están los resultados;
con todos he aprendido algo, gracias por hacer del laboratorio un lugar estupendo

donde trabajar y por darme tantos ánimos con la tesis. A Juan Antonio y Rafa que

empezamos en Genética y luego coincidimos en Fisio, y con quienes tan buenos

momentos he pasado. A Carmen, gracias por esas charlitas rápidas haciendo medio,

a ver si es verdad que conseguimos quedar por Málaga… o San Pedro.

A las nuevas incorporaciones Isa, Dani, Juan, Pablo y Luis gracias chicos por

hacer esto más llevadero y comprenderme estos últimos meses. A José Antonio,

Mª Jesús, Bea, Karima, Delia y Caro por compartir el día a día y esos desayunos tan

animados.

Quiero agradecer especialmente a Lara, Sara, Antonio y Candelas el que me

hayan dejado utilizar algunas de sus fotografías y esquemas para ponerlas en la

memoria. También a Dani del SCAI por hacerme un hueco en la cámara fría para

poder realizar las cromatografías. Al grupo de Eduardo Rodríguez del

Departamento de Genética, que me iniciaron en la parte más molecular,

especialmente a Gabriel que tanto me enseñó.

A Marta gracias por tu apoyo y tus mensajes los fines de semana preguntando

qué tal y haber hecho estos últimos meses más llevaderos, los nervios compartidos

son menos, ¿verdad?

A los vecinos de Fisiología animal: Manolo, Juan, Jesús, Pedro, Marga, Mª

Dolores, Silvia, Mar, que con sus risas y su buen humor hacen del trabajo un lugar

más agradable. A José Esteban que da mucha alegría cuando viene a vernos, a Mª

Dolores por compartir tantos momentos en la facultad y fuera de ella, a Silvia todo

alegría y positividad, gracias amiga.

A mis compañeros de los laboratorios comunes del Severo Ochoa Emilia, Carlos

y Dani y del I+D Ali, Alicia, Carmen, Mª Carmen con quienes tantos ratos he

pasado. A Lucía Cruzado, por esas charlas en los pasillos y su ánimo continuado.
 A mis amigos del parque, que sois mi familia malagueña Paqui, Belén, Mónica,

Jose, Francis y Cándido ¡¡vaya panda de amigos tan apañada!! y como no, a mis niños

Paula, Samuel, Pablo y Mario.

A mis amigas de San Pedro, Luz eres todo un ejemplo de superación, sigue así

guapa. A Mª Paz, Esther, Silvia y Cristina por no olvidar un cumple y aunque nos

veamos poco siempre os llevo conmigo.

Agradecer a mi familia, especialmente a mis padres ya que sin ellos

seguramente no me habría dedicado a esto, me han enseñado a no rendirme y a

luchar por lo que quiero; gracias por vuestro apoyo incondicional siempre. A mis

hermanos Willi, Rocío e Ignacio que sois los mejores y gran apoyo e inspiración, os

quiero mucho guapos, a mis sobrinos Isaac, Lola, Mar, Julia y Lorenzo, y a Rafa,

Rosa y Sandra. A mi familia ubriqueña Paco, Rocío, Mercedes Mª José y Paco por

hacerme sentir parte integrante de esta familia desde el principio y a mis sobrinos

Blanca, María, Paco, Cristina, David y Alejandra y a Juan, David y Paco. Por último

aunque debería haber empezado por aquí a Irene, mi niña, mi vida y a JoseMa,

gracias por estar ahí, comprenderme y quererme.

Gracias a todos aquellos que no habéis permitido que olvidara que tenía la tesis

pendiente.

Gracias!!!
 FUENTES DE FINANCIACIÓN:
FINANCIACIÓN:

El presente trabajo fue parcialmente financiado por los proyectos del Ministerio

de Educación y Ciencia y Fondos FEDER EU (AGL2005-08128) y del Ministerio de

Economía y Competitividad y Fondos FEDER EU (AGL2014-55784-C2-1-R) además

del Plan Propio de la Universidad de Málaga.

 RESUMEN

Los frutos de fresa sufren un rápido reblandecimiento durante su maduración

provocando una importante pérdida de producción en el periodo postcosecha. Se ha

descrito que durante la maduración las paredes celulares de las células

parenquimáticas del fruto sufren modificaciones que alteran su composición y su

estructura produciendo el desmantelamiento que lleva al reblandecimiento, por lo que

es necesario contar con un buen protocolo de extracción de paredes celulares para

poder estudiar estos cambios producidos.

Los resultados de la aplicación de varios protocolos de extracción de paredes

celulares descritos en la bibliografía, además de una modificación propia de uno de

ellos, indicaron que el protocolo de Redgwell y col. (1992) produce mejores resultados
en cuanto a rendimiento, además de provocar una menor degradación en los
polímeros pécticos. Asimismo, las mejoras introducidas han permitido medir la fracción

de pectinas unidas covalentemente a la pared, la eliminación de interferencias en la

fracción de pectinas más solubles de la pared, así como la reducción de la cantidad de
muestra necesaria y el tiempo empleado en la realización de las cromatografías,
principalmente por la disminución del tamaño de la columna.

Aplicando estos protocolos en distintos estadios durante la maduración del fruto de

fresa se observan una serie de cambios importantes. Así, se ha encontrado una

disminución drástica de la cantidad de pared a la vez que las fracciones de pectinas

incrementan su proporción llegando a superar el 50% en fruto maduro. Durante la

maduración se produce, además, una solubilización de las pectinas acompañada de

un incremento en ácidos urónicos al pasar de estadio verde a rojo. Se produce

simultáneamente una despolimerización de las pectinas más fuertemente unidas a la
pared primaria, sobre todo de la fracción unida covalentemente, y también de las

hemicelulosas. Todos estos cambios alteran las interacciones físicas entre los

componentes poliméricos de la pared, aumentando el tamaño de poro y apoyando la

idea de que la pared se degrada durante la maduración.
 Por otra parte, el silenciamiento de la pectato liasa produce frutos en estadio rojo

más duros que los frutos control, como consecuencia de la alteración de las
interacciones y el procesamiento entre los distintos componentes estructurales de la
matriz péctica. En este trabajo se muestra una menor solubilización de pectinas de los
polímeros pécticos, además de producirse una despolimerización de las fracciones

pécticas más fuertemente unidas sobre todo en la fracción unida covalentemente, y de

la fracción de la hemicelulosa. Todo esto indicaría que el silenciamiento de la pectato

liasa modifica el procesamiento de las pectinas, influyendo en las interacciones de

dichos polímeros y en la adhesión entre células parenquimáticas de estos frutos. La
pectato liasa se incluiría en el grupo de pectinasas que, junto a la poligalacturonasa y
la pectin metilesterasa, estarían implicadas en el desmantelamiento de la pared celular

responsables en última instancia del reblandecimiento del fruto.

ABREVIATURAS

Ac Gluc:
Gluc Ácido glucurónico
AGP:
AGP Arabinogalactano
AIS:
AIS Sólido Insoluble en Alcohol
Apel:
Apel Antisentido pectato liasa
Ara:
Ara Arabinofuranosida
Arab:
Arab Arabinosa
AU:
AU Ácidos urónicos
AZU:
AZU Azúcares
CDTA: Ácido trans-1, 2-diamino Ciclohexano N,N,N´,N´ tetraacético monohidrato
CWM: Cell Wall Material

DMSO:
DMSO Dimetil sulfóxido
EDTA:
EDTA Ácido etildiaminotetraacético
EGasa:
EGasa Endoglucanasa
EXP:
EXP Expansina
GalA:
GalA Ácido galacturónico
Gluc:
Gluc Glucosa
GRP:
GRP Proteína rica en glicina
H: Protocolo de Huber

HCl:
HCl Ácido clorhídrico
HGA:
HGA Homogalacturonano
HM:
HM Protocolo de Huber modificado
HRGP:
HRGP Proteína rica en hidroxiprolina
KOH:
KOH Hidróxido potásico
NaBH:
NaBH Sodio borohidrido

O: Oxígeno

PAW:
PAW fenol, acético y agua, por las siglas del inglés

PC:
PC Pared Celular
PG:
PG Poligalacturonasa
PL:
PL Pectato Liasa
PME:
PME Pectin metilesterasa
PRP:
PRP Proteína rica en prolina
R: Protocolo de Redgwell

Ramn:
Ramn Ramnosa
RG I:
I Ramnogalacturonano I
RG II:
II Ramnogalacturonano II
Xyl:
Xyl Xilosa
ÍNDICE
ÍNDICE

CAPÍTULO 1.- Introducción 1

1.1.-
1.1.- Generalidades de la fresa 3

1.2.-
1.2.- Importancia del cultivo de fresa 4
1.3.-
1.3.- Características generales de la planta 5

1.3.1.- Morfología de la planta 5

1.3.2.- Morfología del fruto 8
1.4.-
1.4.- Aspectos generales del crecimiento y maduración del fruto de fresa 9

1.5.-
1.5.- La pared celular 12

1.5.1.- Composición y estructura de la pared celular primaria 13

1.5.1.1.- Fase microfibrilar 15

1.5.1.2.- Matriz de polisacáridos hemicelulósicos 15

1.5.1.3.- Pectinas 16
1.5.1.4.- Proteínas estructurales 20

1.5.1.5.- Componentes fenólicos 21

1.5.2.- Extracción y análisis de la pared celular en fruto 22
1.5.3.- Papel de la pared celular en los cambios de textura de los frutos 23
1.6.-
1.6.- Modificaciones de la pared celular
elular del fruto de fresa durante la
maduración 25
1.7.-
1.7.- Enzimas involucradas en los cambios de textura del fruto 28
1.7.1.- Poligalacturonasa (PG) 29
1.7.2.- Pectato liasa (PL) 31
1.7.3.- Pectin metilesterasa (PME) 33
1.7.4.- Endo β 1-4- D glucanasa (EGasa) 34
1.7.5.- Expansinas (EXP) 35
1.7.6.- Otros genes de pared 36

1.8.-
1.8.- Silenciamiento del gen pectato liasa
liasa en fresa 37

CAPÍTULO 2.-
2.- Objetivos 41

I
CAPÍTULO 3.-
3.- Material y métodos 45

3.1.-
3.1.- Material Vegetal 47
3.2.
3.2.-
2.- Metodología 47

3.2.1.- Extracción de la pared celular 47

3.2.1.1.- Protocolo de extracción de Redgwell 48
3.2.1.2.- Protocolo de Huber 49

3.2.1.3.- Modificación del protocolo de extracción de Huber 51

3.2.2.- Fraccionamiento de la pared celular 53

3.2.3.- Cuantificación de pectinas 55

3.2.4.- Cuantificación de azúcares totales 56

3.2.5.- Cromatografía de filtración en gel 57

3.2.6.- Hinchamiento de la pared celular 58

3.2.7- Medida de poliurónidos totales de la pared celular 60
3.2.8.- Medida de antocianinas 60
3.2.9.- Análisis de elementos esenciales 61
3.2.10.- Medida de la dureza de los frutos 62
3.2.11.- Caracterización histológica de frutos de fresa 62
3.2.12.- Análisis estadístico de los datos 63

CAPÍTULO 4.-
4.- Elección
Elección y puesta a punto del protocolo de
extracción y fraccionamiento de la pared celular 65

4.1.-
4.1.- Extracción de pared celular y fraccionamiento 67

4.2.-
4.2.-Cantidad de poliurónidos obtenidos 71
4.3.-
4.3.- Contenido de elementos esenciales en las paredes obtenida
obtenidas
s 73
4.4.-
4.4.- Cromatografía de filtración en gel de las fracciones de pared celular 75

4.4.1.- Perfiles cromatográficos de las pectinas solubles (fracción PAW y

fracción AGUA 76

4.4.2.- Perfiles de pectinas unidas iónicamente (fracción CDTA) 79

II
 4.5.-
4.5.- Muestras de pectinas unidas covalentamente (fracción CARBONATO) 81
4.6.-
4.6.- Mejoras ulteriores del protocolo de extracción 84

4.7.-
4.7.- Discusión 86

CAPÍTULO 5.-
5.- Efecto de la maduración en la degradación de las
paredes celulares del fruto de fresa 89

5.1.-
.1.- Extracción de pared celular y fraccionamiento 92

5.2.-
5.2.- Cantidad de poliurónidos obtenidos 95
5.2.1.- Medidas de ácidos urónicos 95
5.2.2.- Medidas de azúcares 97
5.3.-
5.3.- Elementos esenciales rojo/verde 99

5.4.- Hinchamiento in vitro de la pared

5.4.- pared celular 100
5.4.1.- Hinchamiento de la pared durante la maduración 101
5.4.2.- Tratamientos con carbonato, CDTA y calcio 102

5.5.-
5.5.- Cromatografía de filtración en gel de las fracciones de pared celular 104
5.5.1.- Perfiles cromatográficos de las pectinas solubles (fracción PAW y
fracción AGUA ) 104

5.5.2.- Perfiles de pectinas unidas iónicamente (fracción CDTA) 108

5.5.3.- Perfiles de pectinas unidas covalentemente (fracción
CARBONATO) 110

5.5.4.- Perfiles de hemicelulosa (fracción KOH 4M) 112

5.6.-
5.6.- Discusión 114

CAPÍTULO 6.-
6.- Efecto de la inhibición por tecnología antisentido
de un gen de pectato liasa en la despolimerización de las
pectinas y el reblandecimiento del fruto de fresa 119

6.1.-
6.1.- Introducción 121

III
 6.2.-
6.2.- Resultados 124
6.2.1.- Estabilidad temporal del fenotipo transgénico “más duro” y

comparación del estado de maduración de los distintos genotipos

estudiados 124
6.2.2.- Extracción y fraccionamiento de la pared celular 126

6.2.3.- Contenido de pectinas y solubilización 128

6.2.4.- Análisis de las fracciones solubles mediante cromatografía de
filtración en gel 130
6.2.5.- Análisis de las fracciones unidas a pared celular por

cromatografía de filtración en gel 132

6.2.6.- Discusión 139

CAPÍTULO 7.- Conclusiones 153

CAPÍTULO 8.-
8.- Bibliografía 157

CAPÍTULO 9.-
9.- Anexos 179

IV
CAPÍTULO 1.

Introducción
 Introducción

1.-
1.- Introducción

1.1.
1.1.-
1.- Generalidades de la fresa

Tanto la fresa cultivada como la silvestre pertenecen al género Fragaria de la

familia Rosaceae y son cultivadas por su fruto comestible. El género Fragaria
comprende al menos 23 especies (Folta y Davis, 2006), y su número básico de
cromosomas es x=7.

La fresa cultivada comercialmente o fresón, Fragaria x ananassa Duch. es, en

realidad, un híbrido estable octoploide (2n=8x=56) y ha reemplazado a nivel de
producción a la especie silvestre, Fragaria vesca, por el mayor tamaño de sus frutos.

Las especies de fresa de las que deriva, fueron introducidas en Europa en el siglo
XVIII. Este híbrido se produjo por un cruzamiento espontáneo en jardín entre dos
especies silvestres, también octoploides, de origen americano: Fragaria virginiana y
Fragaria chiloensis. Con la llegada a Europa de la fresa de Virginia se obtuvieron
nuevas variedades que ganaron en tamaño pero perdieron en sabor. Más tarde la
hibridación entre ésta y la variedad chilena produjo plantas con frutos más grandes y
sabrosos.

El híbrido Fragaria x ananassa Duch. es hermafrodita y presenta un alto grado de

heterocigocidad. Estas características, junto a la posibilidad de cruzamiento entre sus
distintas variedades, han facilitado la mejora de caracteres de interés agronómico tales

como la productividad, precocidad y el tamaño de fruto (Senanayake y Bringurst,

1967), permitiendo mediante mejora genética tradicional la aparición de numerosos

cultivares adaptados a un amplio rango de condiciones ambientales posibilitando que

la fresa se cultive a nivel mundial.

El fruto de fresa se consume como fruto fresco o como producto procesado en

mermeladas y zumos. Las fresas y los fresones no son un elemento esencial de la
dieta. Son frutas que aportan pocas calorías y cuyo componente más abundante,
después del agua, son los hidratos de carbono (fructosa, glucosa y xilitol), destacando

también por el aporte de fibra, como fuente de vitamina C, mayor que la de los cítricos,

3
 Capítulo 1

ácido elágico y flavonoides, compuestos de gran interés por sus propiedades

anticarcinogénicas y preventivas de enfermedades cardiovasculares (Hannum, 2004).

Al ser un fruto estacional que marca el comienzo de la primavera y con una

disponibilidad limitada, su consumo es más deseable que el de otros frutos a los que

se tiene acceso todo el año. Es un fruto muy delicado y con marcado carácter
perecedero y hay que cuidar la calidad, aspecto y textura para evitar su depreciación,

siendo éste el principal reto para productores y distribuidores. Estas características se

encuentran entre los objetivos prioritarios de los programas de mejora de este cultivo
(Faedi y col., 2002).

1.2.
1.2.-
2.- Importancia del cultivo de fresa

La producción mundial de fresa se ha incrementado constantemente desde

mediados del siglo pasado. Así, en el periodo 1980-2004, el área cultivada se
incrementó un 25% y la producción un 73% (Mercado y col., 2007), y desde esa fecha

hasta 2013 la producción ha aumentado un 32%, alcanzando en el año 2013 una

producción total de 4,9 millones de toneladas (FAOSTAT, 2013). España, en el año
2013, con un 4% de la producción mundial, es el quinto país productor de fresa tras

China (38%), Estados Unidos (17,5%), México (4,9%) y Turquía (4,8%).

Según los últimos datos conocidos de 2013, España es el segundo productor

europeo de fresa con 312.500 toneladas tras Turquía con 372.498 toneladas, seguido

de Polonia con 192.647 y Alemania con casi 155.000 toneladas. Debido a la aparición

de nuevos competidores en el cultivo de la fresa, nuestro país está experimentando un

retroceso de la superficie cultivada en los últimos años. En el año 2000 había 11.000

hectáreas de fresa cultivadas y en 2014 se han reducido a 8.000 hectáreas (Datos de

FAOSTAT consultados en octubre de 2015). Aun así, nuestro país muestra una gran
expansión de este cultivo no tanto en términos de superficie como de rendimiento,
encontrándose como el tercer país a nivel mundial, después de EEUU y México.

4
 Introducción

La provincia de Huelva aporta más del 90% de la producción nacional. Desde un

punto de vista agronómico, se importó inicialmente tanto la tecnología de cultivo como

las variedades desarrolladas en California, principal zona productora de fresa a nivel

mundial y también la más activa en cuanto a los programas de mejora para este cultivo

(Sjulin, 2003). Esta tecnología se ha ido adaptando a las condiciones bioclimáticas de

la zona de Huelva, dando lugar a un sistema de cultivo característico y a un tipo de

fruto de gran tamaño que es emblemático en el mercado europeo.

La producción de fresa en España se encuentra, como hemos mencionado,

principalmente en los campos de la provincia de Huelva, donde ocupa unas 7.000
hectáreas en régimen de monocultivo. Menor importancia, pese a su mayor tradición,

tienen los cultivos de la Comunidad Valenciana y otros dispersos por España (Castilla
y León, Galicia y Cataluña) (Tello-Marquina, 1996; Bartual y col., 2006). El 80% de la

producción española se dedica a exportación, siendo nuestro país el principal

abastecedor de fresa en el mercado Europeo durante los meses de invierno.
Solamente el 17% de la producción nacional es destinada a su transformación y
procesado (Olías y col., 1995).

Aunque se carece de estudios detallados, se estima que entre el 5-30% de la

producción de fresa para consumo se pierde debido a contaminación fúngica y/o

deterioro del producto durante la postcosecha. El rápido deterioro y putrefacción que

sufren los frutos es debido, en buena medida, al proceso de reblandecimiento
asociado a la maduración. Por ello, la búsqueda de métodos para alargar la vida

postcosecha y mejorar la textura del fruto es prioritaria en este cultivo (Faedi y col.,
2002; Mercado y col., 2007).

1.3.
1.3.-
3.- Características generales de la planta

1.3.1.
1.3.1.-
3.1.- Morfología de la planta

La planta de fresa (Fragaria x ananassa Duch.) es una planta perenne que

produce brotes nuevos cada año. Aunque de aspecto herbáceo, es en realidad una

5
 Capítulo 1

especie leñosa (Figura 1.1). El tallo está comprimido en una roseta de

aproximadamente 2,5 cm de longitud de donde surgen las hojas y los tallos florales,
ambos de la misma longitud. El tallo, también denominado “corona”, produce hojas en

muy estrechos intervalos, flores en posición terminal y raíces en su base; además

produce en la axila de la hoja yemas o meristemos axiales, que pueden transformarse

en ramas, flores o estolones, dependiendo de las condiciones ambientales. Las hojas

aparecen en roseta y son largamente pecioladas y provistas de dos estípulas rojizas.

Su limbo está dividido en tres foliolos, con bordes aserrados. Sus foliolos tienen un
gran número de estomas (300-400/mm2). El sistema radicular es fasciculado o fibroso

(con aspecto de cabellera) (Figura 1.1) y se origina también en la corona. Las raíces
son responsables del soporte de la planta y de la absorción de nutrientes. Estas
pueden penetrar en el suelo hasta 80 cm pero, generalmente, se encuentran ubicadas
en los 40 primeros cm.

Hojas trifoliadas

Fruto

Corona

Raices fasciculadas

Figura 1.1: Características generales de una planta de fresa. Presenta raíces fasciculadas, un
tallo corto que forma la corona y hojas trifoliadas. Autor: Mark Hofstetter. Fuente Wikimedia
commons. Distribuido bajo una licencia CC-BY-SA 2.5.

6
 Introducción

Las flores se ubican en inflorescencias o ramilletes florales. Las inflorescencias

son largas y se pueden desarrollar a partir de una yema terminal de la corona o de

yemas axilares de las hojas. La flor tiene 5 sépalos, normalmente 5 pétalos de color

blanco rosado, numerosos estambres y varios cientos de pistilos sobre un receptáculo

carnoso (Figura 1.2 A). Las flores son polinizadas por insectos, especialmente abejas
y por el viento (Branzanti, 1989; Chagnon y col., 1993). Cada óvulo fecundado da lugar

a un fruto tipo aquenio (Perkins-Veazie, 1995).

B
A

Figura
Figura 1.2: Detalles vegetativos de la planta de fresa. A: Detalle de una flor de fresa. B:
Fotografía de una planta de fresa estolonando en maceta (Imagen de Gabriela Hernández
Paulín, se encuentra bajo una Licencia Creative Commons. Atribución-CompartirIgual 3.0
Unported). C: Esquema de una planta de fresa con los estolones (Imagen de dominio público).

Los estolones son unos brotes delgados, largos y rastreros que se forman a partir
de las yemas axilares de las hojas situadas en la base de la corona (Figura 1.2 C).
Son la base de la multiplicación vegetativa de la fresa (Figura 1.2 B) y se desarrollan
en gran cantidad en épocas de alta temperatura y fotoperiodos largos. En el extremo

7
 Capítulo 1

del estolón se forma una roseta de hojas que en contacto con el suelo emite raíces,

originando una nueva planta con caracteres idénticos a los de la madre.

1.3.2.
1.3.2.-
3.2.- Morfología del fruto

Botánicamente, una fresa es un falso fruto agregado, originado a partir del tejido
del receptáculo floral engrosado y transformado (Coombe, 1976). Desde el punto de

vista hortícola, el receptáculo con los aquenios se considera el fruto, y a los aquenios

(verdaderos frutos) se los considera las semillas y así lo consideraremos en esta

memoria. Es un fruto de pulpa blanda incluido dentro del grupo denominado “frutos

blandos” junto a la grosella, arándanos, etc. Está cubierto de una piel fina y delicada
que se rompe con cierta facilidad. En general, los frutos blandos se magullan y
aplastan bajo el efecto de presiones relativamente pequeñas que no provocarían
daños en otros frutos.

Los aquenios están constituidos por la combinación de semilla y tejido del ovario
que se origina en la base de cada pistilo (Darrow, 1966). Los aquenios se encuentran

en el tejido epidérmico superficial del receptáculo (Figura 1.3 A) y están conectados

con el interior del mismo mediante haces vasculares (Lis y Antoszewski, 1979). Esta
red vascular suple los nutrientes necesarios para el desarrollo de los aquenios y de las
células del tejido cortical que los rodea. Cada fresa puede tener entre 20 y 500

aquenios, dependiendo del cultivar y las condiciones ambientales (Darrow, 1966). El

desarrollo de los aquenios se completa antes de que el receptáculo alcance su tamaño

de cosecha (Perkins-Veazie, 1995).

El receptáculo es la parte comestible de la fresa y se desarrolla en la base de la

flor. Está formado por tres tipos de tejidos: tejido medular, cortical y epidérmico (Figura
1.3 B). El tejido medular forma el cilindro central, rodeado de tejido cortical
conteniendo las células parenquimáticas y epidérmicas (Havis, 1943). El haz vascular
se extiende desde el pedicelo, atravesando la médula y el córtex y alcanza los

aquenios que se encuentran en la superficie del córtex (Lis y Antoszewski, 1979). La

epidermis está ligeramente encerada, es pubescente, posee estomas protuberantes y

8
 Introducción

abiertos para la transpiración y respiración. El tamaño final de la fresa depende de su

posición en el ramillete floral, del número de aquenios polinizados y de factores

ambientales entre los que destacan la temperatura y las condiciones nutricionales

(Darrow, 1966; Dana, 1980; Albregts y Howard, 1982). Si la polinización no ha sido

completa y quedan pistilos sin polinizar, el fruto resulta deformado. El desarrollo de los
aquenios distribuidos por la superficie del receptáculo carnoso estimula el crecimiento

y la coloración de este, dando lugar al “fruto” que consumimos.

A B

Córtex
Aquenios
Médula

Epidermis

Figura 1.3: Imagen de un fruto de fresa. A: Superficie del fruto con aquenios. B: Corte

longitudinal del fruto en el que se puede observar las diferentes partes del receptáculo.

1.4.
1.4.-
4.- Aspectos generales del crecimiento y maduración del fruto de fresa

La fresa es un fruto de desarrollo y maduración rápida aunque dependiente de la

temperatura. El tiempo que transcurre desde la floración hasta la maduración puede

variar entre los 30 y 60 días, dependiendo del cultivar (Perkins-Veazie y Huber, 1987).

Perkins-Veazie y Huber (1983) sugirieron que el receptáculo presenta un

crecimiento bimodal. El crecimiento del receptáculo es una combinación de división y
expansión celular (Knee y col., 1977). La proliferación celular se completa a los siete
días y posteriormente el incremento de volumen celular es el responsable del tamaño

final del fruto y depende de factores fisiológicos, tanto de carácter hormonal como de
carácter nutricional. El número de haces vasculares y, por tanto, el número de

aquenios funcionales determina la exportación de auxinas hacia el receptáculo (Lis y

Antoszewski, 1979). De este modo, el tamaño final del fruto se correlaciona con el

9
 Capítulo 1

número de aquenios desarrollados, aunque otros aspectos como la posición en la

inflorescencia y la sensibilidad del tejido del receptáculo a las hormonas son también
importantes en este proceso (Moore y col., 1970). La maduración del fruto de fresa,

como en la mayoría de los frutos carnosos, es la suma de una serie de cambios

fisiológicos y bioquímicos que ocurren principalmente durante los estadios finales de

su desarrollo y que afectan al aroma, el sabor, el color y a la textura preparándolo para

la diseminación de sus semillas (Brummell, 2006).

Uno de los cambios más llamativos durante la maduración, es el cambio de color.

Este proceso es debido tanto a la degradación de pigmentos como a la biosíntesis de
otros nuevos que colorean intensamente los frutos. Aprovechando los cambios de

coloración del fruto se suelen distinguir cuatro fases en el desarrollo y maduración del
mismo: fruto verde (distinguiendo entre verde pequeño y verde grande), blanco, rosa

(o intermedio) y rojo (Figura 1.4). Los frutos alcanzan el estadio blanco unos 21 días
postantesis y están totalmente maduros transcurridos unos 30-40 días desde la
antesis (Dennis, 1984). En ese periodo, en paralelo a los cambios de color, ocurren
cambios importantes en la producción de compuestos volátiles responsables del

aroma, y la producción y acumulación de azúcares que mejoran el sabor (Rhodes,

1980). Todos estos cambios están encaminados para hacer la ingestión de los frutos

más apetecible y conseguir con ellos dispersar las semillas, haciéndolo también muy
preciado en el mercado (Kader, 1991), pero hacen los frutos más susceptibles a los
patógenos (Pearkins-Veazie, 1995).

10
 Introducción

Floración V1 V2 B I R

6 días
21 días
30-40 días

Figura 1.4: Estadios de desarrollo y maduración del fruto de fresa: V1, verde; V2, verde
grande; B, blanco; I, intermedio; R, rojo. Imagen cedida por Sara Posé.

Este fruto se considera no climatérico ya que no presenta los picos característicos

de respiración y etileno del proceso conocido como climaterio, que se da en frutos

como el tomate (Perkins-Veazie, 1995). Este carácter no climatérico se considera de

tipo intermedio debido a que, en términos generales, no se observa un declive de la
respiración sino que ésta se mantiene durante la maduración.

El fruto de fresa es extremadamente perecedero y se incluye dentro de los frutos

blandos ya que sufre un importante reblandecimiento en las fases finales de su

maduración, llegando a adquirir una textura semilíquida muy pocos días después de

su cosecha. Esta pérdida de firmeza se inicia en estadio verde y continúa durante las
fases finales de la maduración, hasta alcanzar la textura semilíquida (Manning, 1993).

Se considera que la disminución de la firmeza del fruto de fresa es la principal causa

de la pérdida de calidad de los frutos maduros y supone una importante limitación del
periodo postcosecha. Por este motivo, la manipulación comercial de la fresa durante
su recolección se debe reducir al mínimo para evitar el posible daño físico a los frutos,

siendo aconsejable usar condiciones de refrigeración durante el transporte y el

almacenamiento para disminuir el reblandecimiento del fruto (Kader, 1992).

11
 Capítulo 1

Uno de los factores principales que determinan la calidad de los frutos y,

especialmente, la vida media de éstos tras su recolección, es la extensión y rapidez

con la que tiene lugar la pérdida de firmeza durante el proceso de maduración. Aunque

los cambios de textura mencionados ocurren gradualmente en muchos frutos, el

proceso de reblandecimiento tiene lugar muy rápidamente en el caso de la fresa. Está

ampliamente aceptado que estos cambios de textura están relacionados

principalmente con modificaciones en las características y/o composición de las

paredes celulares de los tejidos que componen los frutos (Brummell, 2006; Posé y col.,
2012). A continuación se describen la estructura de la pared celular así como su

posible relación con los cambios de textura de los frutos.

1.5.
1.5.-
5.- La pared
pared celular
elular

La pared celular es un componente celular complejo que, además de ser parte

responsable de dar soporte y estructura a los tejidos vegetales, condiciona el

crecimiento y desarrollo celular. En general, la forma de las células vegetales viene

determinada por su pared celular. Esta estructura funciona como un exoesqueleto,
determinando la tasa de crecimiento y su dirección y, por tanto, ejerciendo una
profunda influencia en el crecimiento y morfología de la planta. La pared celular está
altamente organizada y compuesta por una mezcla compleja y cambiante de
diferentes polisacáridos, proteínas y compuestos aromáticos, que son secretados por
las células y ensambladas formando una red muy compleja entrelazada por diferentes

tipos de enlaces. Estas secreciones se depositan secuencialmente en el exterior

celular formando una serie de capas (Brummell, 2006).

La pared de las células vegetales está formada por los siguientes componentes
estructurales (Buchanan, 2000) (Figura 1.5):

media es la capa más externa de la pared celular y la primera que se

. Lámina media,
origina. Está formada principalmente por pectinas que actúan a modo de capa
adhesiva, permitiendo la unión de células entre sí.

12
 Introducción

. Pared celular primaria,

primaria presente en todas las células vegetales está formada por
una red de microfibrillas de celulosa embebidas en una matriz amorfa constituida por
fibrillas de hemicelulosa, pectinas y proteínas estructurales.

. Pared celular secundaria, se origina en algunas células especializadas (como las

células del xilema) y aparece una vez se ha detenido el crecimiento. A diferencia de la

pared primaria contiene, además una alta proporción de celulosa, lignina y/o suberina.

PC 1aria Célula
LM

PC 2aria
Célula
LM
Célula
PC 1aria

MB CIT
Célula Célula
MB CIT
A B
ERP

Figura 1.5:
1.5 Esquema de los componentes estructurales de la pared celular. A Pared celular
primaria. B Pared celular secundaria. Siendo: LM: Lámina media; ERP: Esquina rica en
pectinas; MB CIT: Membrana citoplasmática; PC 1aria: Pared celular primaria; PC 2aria: la pared
celular secundaria y Célula: indica el interior celular.

En los frutos de fresa, como en la mayoría de los frutos carnosos, la pared celular
está constituida por la lámina media y la pared celular primaria, que se describe con

más detalle a continuación.

1.5.1.
1.5.1.-
5.1.- Composición y estructura de la pared celular primaria

La pared celular es un compartimento dinámico que sufre numerosos cambios

durante la vida de la célula. En ella se suelen distinguir diferentes componentes en

base a distintos criterios, en algunos casos arbitrarios o metodológicos. Desde el punto

13
 Capítulo 1

de vista de la extracción y en orden de importancia cuantitativa, los polímeros que se

obtienen son polímeros pécticos (35% del peso seco), celulosa (30%), hemicelulosa
(25%) así como proteínas estructurales (10%). Con menor importancia cuantitativa,

pero jugando también un papel estructural importante habría que mencionar la

presencia de fenoles esterificados. Por lo general, el componente péctico adquiere una

relevancia cuantitativa aún mayor en frutos, pudiendo suponer hasta el 60% del total

del peso seco (Redgwell y Fisher, 2001).

A Fase microfibrilar CELULOSA

Pared celular primaria

HEMICELULOSA
PECTINAS
Fase matriz
PROTEINAS ESTRUCTURALES
COMPONENTES FENÓLICOS

Figura 1.6:
1.6: Estructura y composición de la pared celular primaria. A: Composición de la pared
celular primaria. B: Estructura de la pared celular primaria, situada entre la lámina media y la
membrana plasmática. (Fuente: Wikimedia Commons. Obra de dominio público, publicada por
LadyofHats).

Según Carpita y McCann (2000), la pared celular primaria estaría formada por un
esqueleto de celulosa unido por fibrillas de hemicelulosa (xiloglucanos o

14
 Introducción

glucoarabinoxilanos) adheridos a la superficie de la celulosa mediante puentes de

hidrógeno, y todo ello embebido en una matriz de diversos tipos de pectinas y

proteínas estructurales (Figura 1.6).

Se distinguen dos tipos de pared celular primaria, denominadas Tipo I y Tipo II, en

función del tipo de polisacárido que entrecruza las fibrillas de celulosa. El modelo más
aceptado de pared primaria Tipo I es el propuesto por Carpita y Gibeaut (1993). Según

este modelo, la pared está formada por un esqueleto de microfibrillas de celulosa

unidas entre sí a través de xiloglucanos. Este tipo de pared está presente en

dicotiledóneas y muchas monocotiledóneas, siendo el modelo de pared aplicable a la
mayoría de frutos. En las paredes celulares de Tipo II, típica de la familia Poaceae, los

polisacáridos que entrecruzan las fibrillas de celulosa son del tipo glucoarabinoxilanos
(Carpita y Gibeaut, 1993; Carpita y McCann, 2000; Redgwel y Fisher, 2002).

A continuación se describen con más detalle los componentes estructurales de la

pared celular primaria.

1.5.1.1.-
1.5.1.1.- Fase microfibrilar

Formada únicamente por microfibrillas de celulosa. Este polímero está formado por
cadenas de polisacáridos lineales que contienen unos 8.000 residuos de D-glucosa
unidos por enlace β (1→4). Aproximadamente 36 de estas cadenas se unen mediante

puentes de hidrógeno para formar una microfibrilla de celulosa (Taylor, 2008). El

ancho de las fibrillas es de 5 a 15 nm y están espaciadas entre sí unos 20-40 nm. Las
fibrillas son más largas que las cadenas que las forman porque cada cadena comienza

y termina en un lugar distinto.

La región interna de las microfibrillas es cristalina y excluye el agua, siendo las

capas más externas más amorfas, permitiendo la unión de las cadenas de glucanos
(Pauly y col., 1999).

1.5.1.2.-
1.5.1.2.- Matriz de
de polisacáridos hemicelulósicos

Se denomina hemicelulosa a los polisacáridos no celulósicos de la pared que se

extraen a pH fuertemente alcalino. Los glucanos conocidos como hemicelulosas están
15
 Capítulo 1

formados predominantemente por azúcares neutros, ya que de forma mayoritaria sus

componentes son glucosa, xilosa o manosa y no contienen ácido galacturónico (GalA)

(Scheller y Ulvskov, 2010). El Xiloglucano es el polisacárido más abundante de la

matriz hemicelulósica y se encuentran en las paredes Tipo I presentes en la mayoría

de las plantas. Está formado por cadenas lineales de glucosa unidas por enlace β
(1→4), como en la celulosa, pero bastante más corto y con residuos de xilosa unidas

por enlace α (1→6). A veces pueden llevar unidas cadenas laterales de disacáridos

(xilosa - arabinosa) o trisacáridos (arabinosa - fucosa - galactosa). Los xiloglucanos se

unen entre sí y a la superficie de las microfibrillas de celulosa por puentes de

hidrógeno, formando una red que engloba a la celulosa. Las cadenas de xiloglucano
tienen una longitud de 200 nm de media, suficiente para abarcar la distancia entre dos
microfibrillas de celulosa y entrelazarlas (Carpita y Gibeaut, 1993).

Otros tipos de hemicelulosas mucho menos abundantes en la paredes de

dicotiledóneas son los Glucuronoarabinoxilanos, formados por cadenas lineales de

xilosa unidas por enlace β (1→4) con residuos de arabinosa y ácido glucurónico; o los

Glucomananos, formados por regiones alternas de β (1→4) glucosa y β (1→4) manosa

(Carpita y Gibeaut, 1993; Carpita y McCann, 2000).

Esta red formada por las cadenas de celulosa y xiloglucanos está embebida en
una matriz de pectinas que controla la porosidad de la pared (Brett y Waldron, 1996).

1.5.1.3.
1.5.1.3.- Pectinas

Tradicionalmente se consideran pectinas a los polisacáridos de la pared celular en

cuya extracción se utilizan agentes quelantes de calcio o soluciones ácidas diluidas,
aunque también hay una importante fracción péctica extraíble con carbonato sódico.

Así, el término ‘pectinas’ es muy genérico y engloba a un conjunto de polímeros

heterogéneos, altamente hidratados y ricos en ácido D-galacturónico. Estos polímeros

pécticos son cuantitativamente muy importantes en la pared celular primaria,

representando un 30% de la misma. Aún más, como ya hemos comentado, las

paredes celulares de muchos frutos normalmente están enriquecidas en pectinas,
llegando hasta un 60% en algunas especies (Redgwell y col., 1997a).

16
 Introducción

La función de la matriz péctica no es sólo estructural, ya que además de controlar

el tamaño de poro, proveen a la pared de carga superficial, lo que determina el

balance iónico y modula el pH en este compartimento celular. Como se ha

mencionado anteriormente, la lámina media está constituida fundamentalmente por

pectinas, siendo a este nivel donde se regula la adhesión celular. Además de estas
características físico-químicas y funciones estructurales, algunos polisacáridos

pécticos de pequeño tamaño actúan como señal en procesos de interacción entre la

planta y otros organismos, así como en otros procesos fisiológicos, incluida la

maduración del fruto (Carpita y McCann, 2000; Dumville y Fry, 2000).

Los dos polímeros pécticos más abundantes en la pared celular son el

Homogalacturonano (HGA) y el Ramnogalacturonano I (RGI).

1.5.1.3.1.- Homogalacturonano (HGA)

El esqueleto del HGA está compuesto por un homopolímero de ácido galacturónico

(GalA) unido por enlaces α (1→4) altamente metil esterificado. Las cadenas suelen
tener unas 200 unidades de GalA, lo que origina esqueletos de una longitud
aproximada de 100 nm (Figura 1.7).

Ácido galacturónico Grupo metil-ester: -COO-CH3

Grupo hidroxilo: -OH Grupo carboxilo: -COO-

Figura 1.7: Modelo conformacional del homogalacturonano formado por monómeros de ácido
galacturónico (GalA) unidos por enlace α(1→4). Estos polímeros se encuentran metil
esterificados con relativa frecuencia (Modificado con permiso a partir de Matas y col., 2015).

Los HGAs se sintetizan en el aparato de Golgi y son secretados a la pared celular

con el 70-80% de los residuos de ácido galacturónico metil-esterificados en el carbono

17
 Capítulo 1

6-carboxil. Es necesaria la acción de la pectin metilesterasa (PME), una enzima que

modifica este componente de la pared celular in situ escindiendo parte de los grupos
metilo, para que los grupos carboxilos queden libres y puedan interaccionar
iónicamente con el calcio presente en la pared, formando así zonas de unión entre dos

cadenas de poligalacturónicos. Estas zonas de unión se conocen como cajas de

huevo (egg-box) (Morris y col., 1982) (Figura 1.8).

Ca2+ Ca2+ Ca2+

Ácido galacturónico Grupo metil ester: -COO- CH3

Grupo hidroxilo: -OH Grupo carboxilo: -COO-
Ca2+ Ión calcio

Figura 1.8: Modelo caja de huevos “egg-box” de Morris y col. (1982), muestra el nivel máximo
de entrecruzamiento entre residuos de ácido poligalacturónico desmetilados (Modificado con
permiso a partir de Matas y col., 2015).

El tamaño del poro de la pared está determinado por la extensión y frecuencia con
que se den estas zonas de unión, el grado de esterificación, y la mayor o menor
ocupación de estas zonas por las cadenas laterales que ramifican al esqueleto de RG.

Existen dos tipos de modificaciones asociadas a los homogalacturonanos: los

Xilogalacturonanos y los Ramnogalacturonanos II (Figura 1.9). Los xilogalacturonanos

son HGA modificados en los que aproximadamente la mitad de los monómeros de

18
 Introducción

ácido galacturónico (GalA) presentan residuos de α-D-Xilosa (Xil). Por su parte, los

Ramnogalacturonanos II (RG II) son polímeros pécticos relativamente pequeños y muy

conservados con una estructura muy compleja tanto por su composición de azúcares,

como por el tipo de enlaces que se dan en él. Su esqueleto básico es de GalA y

presentan múltiples ramificaciones. Los monómeros de RG II pueden formar dímeros a

través de un éster de borato en el que intervienen los residuos de apiosa. También se

pueden encontrar en sus ramificaciones otros azúcares como L-fucosa, D-arabinosa,

D-manosa, D-xilosa y el D-ácido galacturónico. Esta estructura compleja está

altamente conservada en las paredes celulares de las plantas vasculares (Vincken y

col., 2003).

1.5.1.3.2.- Ramnogalacturonano I (RG I)

Se trata de un heteropolímero formado a partir de la repetición de un disacárido

formado por unidades de α (1→2) -L-Ramnosa -(1→4) -D-GalA (Figura 1.9). Entre un

20 y un 80% de los residuos de las ramnosas del dímero presentan cadenas laterales
formadas por varias galactosas o varias arabinosas y, en ocasiones, pueden presentar

ramificaciones secundarias (Rose y col., 2003) (Figura 1.9). Así, arabinanos,

galactanos y arabinogalactanos son las cadenas laterales más comunes.

Los HGAs se unen covalentemente mediante enlaces glucosídicos a RG I y RG II

los cuales, probablemente, también se enlazan entre sí. Algunos autores, sin embargo,

consideran que las regiones de HGA son cadenas laterales de RG I (Vincken y col.,
2003). Las regiones ricas en RG I se conocen como “hairy pectins” por la cantidad de
ramificaciones que presentan, en comparación con las zonas de HGA, denominadas
como “smooth pectins”.

19
 Capítulo 1

Homogalacturonano Xilogalacturonano Ramnogalacturonano II

Ramnogalacturonano I

Ácido galacturónico Xilosa Ramnosa

Azúcares
Grupo acetilo Galactosa Arabinosa minoritarios

Grupo metilo Apiosa B Borato

Figura 1.9.
1.9 Estructura y composición de los polímeros pécticos de la pared celular primaria.

1.5.1.4.-
1.5.1.4.- Proteínas estructurales

Representan alrededor del 10% de la pared celular y se clasifican en 4 familias de

proteínas denominadas en base al aminoácido más abundante del polipéptido. Así
encontramos glicoproteínas ricas en hidroxiprolina (HRGPs), grupo que incluye la
extensina, una de las más estudiadas, proteínas ricas en prolina (PRPs), proteínas

ricas en glicina (GRPs) y proteoglicanos, grupo identificado en función del carbohidrato

al que está asociado, en vez del aminoácido más abundante. Dentro de este grupo
destaca el arabinogalactano (AGPs).

Estas proteínas tienen una función estructural ya que, al interaccionar con el resto

de los elementos de la pared, contribuyen a sus propiedades mecánicas. Su presencia

puede inducir un aumento en la rigidez de la pared celular. Además de estas proteínas

estructurales, en la pared celular hay otras proteínas con actividad enzimática que
realizan muy diversas actividades, algunas de las cuales se describirán más adelante.

20
 Introducción

1.5.1.5.-
1.5.1.5.- Componentes fenólicos

Entre los componentes fenólicos de la pared celular primaria se encuentran

principalmente el ácido felúrico y el ácido p-cumárico. Estos compuestos se pueden

encontrar esterificados con residuos de arabinosa y galactosa o embebidos en los

polisacáridos pécticos (McNeil y col., 1984).

A continuación se muestra, a modo de resumen, un esquema con todos los

componentes anteriormente descritos (Figura 1.10).

Componentes de la
cadena principal
Fase
microfibrilar CELULOSA
Gluc

Xiloglucano Gluc, Xil,

HEMICELULOSA
Glucuronoarabinoxilano Xil, Arab, Ac Gluc
GalA
Pared celular primaria

Homogalacturonano
Xilogalacturonano GalA, Xil
PECTINAS
Ramnogalacturonano I GalA, puede formar dímeros
mediante éster de borato
Ramnogalacturonano II Ac Gal, Ramn
Fase matriz Ricas en hidroxiprolina
HPRP
PRP Ricas en prolina
PROTEINAS Ricas en glicina
ESTRUCTURALES GRP
Proteoglicanos
AGPs Arabinogalactanos prot

COMPONENTES Ácido felúrico

FENÓLICOS Ácido cumárico

Figura 1.10
1.10:
10 Composición de la pared celular primaria. No todos los componentes de la
matriz enumerados se encuentran en todas las paredes celulares vegetales. Siendo: Gluc:
glucosa; Xil: xilosa; Arab: arabinosa; Ac Gluc: ácido glucurónico; GalA: ácido galacturónico y
Ramn: ramnosa.

Según Jarvis y col. (2003) la pared celular primaria estaría formada por HGA, RG I,
RG II, glucanos y celulosa, pero la lámina media contendría solamente HGA y algunas

proteínas estructurales.

21
 Capítulo 1

De forma genérica se puede decir que el grado de rigidez de la pared aumenta

conforme lo hace el número de interacciones entre los elementos que la componen

(Carpita y Gibeaut, 1993) confiriendo unas propiedades estructurales a nivel de tejidos

y órganos, como los frutos, que determinan su mayor o menor dureza. Durante el

crecimiento y desarrollo de la planta, los distintos tejidos se ven sometidos a cambios

estructurales en la pared celular. En el caso del fruto, distintas actividades enzimáticas

modifican los enlaces en la pared y llevan al reblandecimiento del mismo (Brummell,

2006).

1.5.2.
1.5.2.-
5.2.- Extracción y análisis de la pared celular en frutos

Para poder estudiar en detalle el papel de las pectinas y de algunas enzimas

pectinolíticas, como la pectato liasa o la poligalacturonasa, en el proceso de

reblandecimiento de la fresa conviene optimizar metodologías que permitan valorar el

grado solubilización y despolimerización de estos polímeros pécticos presentes en la
pared celular. Para ello es necesario contar con un buen protocolo de extracción de
pectinas y la puesta a punto de las técnicas de cromatografía para la caracterización

de los grupos de polímeros presentes en las distintas fracciones.

En la bibliografía se describen varios protocolos de extracción de pared celular en

frutos, caracterizados por la manera de inactivación de las enzimas hidrolíticas de la

pared al inicio del procedimiento.

Redgwell y col. (1992) utilizan una solución formada por fenol, ácido acético y agua

(denominada PAW, por sus siglas en inglés) para inactivar las enzimas hidrolíticas de
la pared y evitar así la degradación de los polímeros de la pared durante la extracción.
Con este protocolo se extrae la fracción PAW (en la que se obtendrían las pectinas

más fácilmente solubles). La fracción no soluble contenida en esta solución constituye

la pared celular, a la que denominan CWM (Cell Wall Material).

Otro protocolo ampliamente usado es el descrito por Huber y col. (1993), el cual

emplea disoluciones de etanol para inactivar las enzimas parcialmente y, tras una

22
 Introducción

incubación con tris-fenol, se produce la desnaturalización total de éstas. En este

protocolo se obtiene directamente la pared celular denominada AIS (Sólido Insoluble

en Alcohol, por las siglas en inglés) y no se obtiene una fracción parecida a la fracción

de pectinas más fácilmente solubilizables del protocolo de Redgwell (fracción PAW).

La extracción del tejido en otros disolventes como acetona o etanol a alta

temperatura se ha demostrado poco adecuada ya que no inactiva totalmente las

enzimas, al menos en fruto de tomate (Huber, 1991). Por otro lado, aunque el PAW es

un excelente extractor de proteínas y pobre disolvente de polisacáridos (Fry, 2000),

puede extraer cantidades significativas de calcio de la pared, afectando a la posterior
extracción de pectinas queladas (Huber, 1991).

Este primer residuo de pared es sometido a un fraccionamiento secuencial con

distintas soluciones. Este procedimiento es común en ambos protocolos, tanto para

CWM (Redgwell y col., 1992) como para AIS (Huber y col., 1993). Primero, la pared se
lava con agua, obteniéndose del sobrenadante la fracción soluble en AGUA que
contiene las pectinas más débilmente unidas a la pared. Posteriormente, el residuo
resultante es tratado con un agente quelante de calcio (generalmente Ciclohexano-

trans-1,2-diamina tetra-acetato o CDTA), obteniéndose la fracción soluble en CDTA,

donde se solubilizan las pectinas unidas entre sí por enlaces iónicos. Tras esto, el

residuo se trata con una solución de carbonato sódico que de-esterifica uniones de
tipo covalente, obteniéndose la fracción soluble en CARBONATO, donde se localizan
las pectinas unidas covalentemente. Por último, el residuo se trata secuencialmente

con soluciones de KOH 1M primero y, posteriormente, KOH 4M obteniéndose la

fracción soluble en KOH que se corresponde con la fracción de HEMICELULOSA. El
residuo final, tras todo este proceso, está enriquecido en CELULOSA.

1.5.3
1.5.3.
5.3.- Papel de la pared celular en los cambios de textura de los frutos

La estructura de la pared celular determina las propiedades físicas de los distintos

tejidos de las plantas. En general, se considera que los cambios de textura que
ocurren en los frutos durante su maduración son el resultado de cambios en las

23
 Capítulo 1

características y/o composición de la pared celular. Los frutos de tomate y fresa se han

tomado como modelos de frutos carnosos, climatérico y no climatérico

respectivamente, para el estudio de estos procesos. Si bien la mayoría de estos

estudios se han llevado a cabo en tomate. Haciendo una búsqueda en Web of

Science, con los términos maduración, pared celular y pectinas para tomate y para
fresa observamos que el número de publicaciones hasta el año 2002, que fue cuando
se inició este trabajo, la media en tomate estaba en torno a 12 publicaciones por año,

y estos trabajos eran citados en otros 200 trabajos. En cambio los trabajos en fresa
publicados en ese periodo de tiempo fueron de 2 trabajos por año y se citaban en unos

30 trabajos. De ese tiempo hasta la actualidad en tomate se ha mantenido en cuanto a

número de publicaciones, si bien el número de citas en trabajos aumenta

progresivamente experimentando desde 2006 una subida considerable llegando a ser
citados en unos 1.000 trabajos. Se observa un aumento en el número de publicaciones
en fresa, siendo de media unos 4 trabajos por año. A partir de 2006 se ve un aumento
por el interés en fresa ya que la tendencia a citar estos trabajos aumenta

considerablemente, oscilando entre 100 y 180 citas (Datos según una búsqueda en
Web of Science en octubre de 2015).

En general, durante el reblandecimiento del fruto tiene lugar un proceso de

desmantelamiento de la pared celular que incluye la solubilización y despolimerización
de pectinas y hemicelulosas, la pérdida de azúcares neutros de pared, el incremento
del grado de hinchamiento de la pared y la disolución de la lámina media (Brummell y

Harpster 2001; Brummell 2006; Goulao y Oliveira 2008). Como consecuencia de estos
cambios se produce una modificación significativa de las propiedades mecánicas de la

pared y una reducción de la adhesión celular, dando lugar finalmente a una pérdida de
firmeza. El componente péctico de la pared es el que más se ve modificado durante la
maduración del fruto, siendo la solubilización de pectinas el proceso que mejor se
correlaciona con la pérdida de firmeza y el hinchamiento de la pared celular (Mercado

y col., 2007; Posé y col., 2012). La solubilización de pectinas se refiere al incremento

de pectinas extraídas con disolventes acuosos, es decir, las fracciones PAW y AGUA.

Mientras que la despolimerización representa una disminución de la masa molecular

debida a la acción de enzimas específicas (hidrolasas de pared celular) y/o a la

24
 Introducción

disgregación de los complejos pectínicos mantenidos por fuerzas no covalentes (Lara,

2013), por lo que suele ir acompañado de un decremento en las pectinas extraídas

con el tampón carbonato. Por tanto, se asume en buena medida que la solubilización

de pectinas ocurre a expensas de los poliurónidos más fuertemente unidos a la pared

(Wakabayashi, 2000; Brummell, 2006).

La presencia y extensión de los cambios en la pared antes mencionados dependen

del tipo de fruto. Así, por ejemplo, la despolimerización de pectinas es muy elevada en

tomate y aguacate pero muy baja o prácticamente ausente en banana, fresa o

manzana (Brummell, 2006). En cualquier caso, es difícil la comparación entre los
distintos trabajos debido a las diferentes metodologías utilizadas para el aislamiento y

posterior análisis de la pared celular. En el siguiente apartado se discute con mayor

profundidad el proceso de desmantelamiento de la pared celular durante la

maduración de la fresa.

1.6.
1.6.-
6.- Modificaciones
Modificaciones de la pared celular del fruto de fresa durante su
maduración

Tal como indica Rose (2003), es necesario ampliar los estudios de maduración y
desmantelamiento de pared a frutos distintos del tomate que es, como hemos
mencionado el más estudiado. La importancia económica de la fresa y su maduración
no climatérica ha convertido este fruto en un modelo complementario para el estudio

de los procesos de maduración. El estudio del desmantelamiento de la pared celular

asociado a la maduración se ve dificultado en fresa debido a que el tamaño del fruto

continúa incrementándose durante la maduración. Por tanto, la síntesis neta de

residuos de pared celular durante la maduración podría enmascarar algunos cambios

en los polímeros que la forman (Woodward, 1972; Huber, 1984).

A pesar de existir numerosos estudios (Lara y col., 2004; Rosli y col., 2004; Posé y
col., 2012) las bases fisiológicas de la degradación de la pared celular en la fresa no

están completamente establecidas aún. A nivel histológico, los frutos maduros

25
 Capítulo 1

muestran un adelgazamiento de la pared celular y una casi completa disolución de la

lámina media. Como consecuencia, las células del fruto maduro presentan poco o
ningún contacto entre ellas y un considerable espacio intercelular en comparación con

esos mismos frutos en estadio verde (Redgwell y col., 1997b).

Por otra parte, el grado de hinchamiento in vitro de la pared celular se incrementa

en fruto rojo con respecto a fruto verde, lo que indica que el tamaño del poro de la
pared aumenta durante la maduración, probablemente provocado por la degradación

de la misma. A este nivel, los cambios más significativos detectados durante la

maduración de la fresa son la solubilización de pectinas y la despolimerización de la

hemicelulosa (Rosli y col., 2004).

En cuanto al contenido en pared celular y celulosa, se observa una ligera

disminución por peso de fruto durante la maduración en todos los cultivares de fresa
estudiados, independientemente de su firmeza (El-Zoghbi, 1984; Redgwell y col.,
1997b; Koh y Melton, 2002; Rosli y col., 2004). La disminución de pared celular es más
acusada en el tejido cortical que en la médula (Koh y Melton, 2002) pero según

Figueroa y col. (2010), este parámetro no parece estar relacionado con la firmeza.

Respecto al contenido en hemicelulosas, Koh y Melton (2002) y Rosli y col. (2004)

observaron una disminución de estos polímeros durante la maduración de la fresa en

cultivares con distinto grado de firmeza. Sin embargo, en cuanto a la

despolimerización de la hemicelulosa se han obtenido resultados contradictorios.
Huber (1984) observó una significativa despolimerización de la hemicelulosa durante
la maduración de frutos del cultivar Dover. Sin embargo, Rosli y col. (2004) no
observaron cambios en el tamaño molecular de los polímeros presentes en la fracción
de hemicelulosa en frutos del cultivar Pájaro y sólo una pequeña despolimerización
tanto en frutos de un cultivar duro (Camarosa) como en frutos de un cultivar blando
(Toyonaka). Finalmente, Nogata y col. (1996) detectaron una disminución de los
polímeros hemicelulósicos de alto peso molecular, aunque estos cambios fueron más

evidentes durante el crecimiento del fruto que durante la maduración.

26
 Introducción

Como se ha mencionado anteriormente, una de las características principales de la

maduración de la fresa, detectada en todos los trabajos publicados sobre el tema, es

el incremento en las pectinas solubles. Knee y col. (1977) observaron que en el

periodo comprendido entre los 7 y 21 días tras la caída de los pétalos,

aproximadamente el 90% de los polímeros pécticos estaban unidos a la pared celular.

Sin embargo, la proporción de pectinas unidas a pared decaía al 30% durante la

maduración. Koh y Melton (2002) observaron que las fracciones de pectinas solubles,

extraídas con agua y fenol-HEPES, se incrementan en la transición de fruto verde a

rojo. Paralelamente, las fracciones CDTA y CARBONATO, que incluyen

respectivamente pectinas queladas y unidas covalentemente, disminuyen durante la

maduración y contienen, además, una menor cantidad de poliurónidos. Los mayores
cambios en los polímeros solubles en agua y los covalentemente unidos ocurren en la
transición de fruto verde a blanco en F. x ananassa (cv Chandler) y F. chiloensis

(Figueroa y col., 2010). Finalmente Redgwell y col. (1997a) observaron un incremento

en el contenido de ácidos urónicos en la fracción PAW (pectinas solubles) durante la
maduración del fruto de fresa, aunque este incremento es moderado comparado con
otros frutos como el aguacate y el kiwi. Así, parece claro que la solubilización de
pectinas durante la maduración del fruto de fresa ocurre a expensas de la fracción
covalentemente unida a la pared celular.

Si bien existe consenso sobre el papel de la solubilización de las pectinas durante

la maduración de la fresa, no ocurre lo mismo con la despolimerización de las

pectinas. En el trabajo pionero de Huber (1984) se afirmaba que la solubilización de

las pectinas no era consecuencia de su hidrólisis enzimática. Este autor no encontró

despolimerización de las pectinas queladas, asumiéndose desde entonces que la

despolimerización de las pectinas, y por tanto que las enzimas pectinolíticas, no
juegan un papel importante en el reblandecimiento del fruto de fresa. Sin embargo, en
trabajos posteriores, se ha observado una pequeña despolimerización de las pectinas

solubles en PAW (Redgwell y col., 1997a), así como de las pectinas unidas
covalentemente (Rosli y col., 2004; Figueroa y col., 2010; Posé y col., 2013).

27
 Capítulo 1

El contenido total de azúcares neutros no cambia significativamente durante la

maduración de la fresa (Gross y Sam, 1984; Redgwell y col., 1997b; Koh y Melton,
2002; Figueroa y col., 2010). Los azúcares neutros mayoritarios tanto en fruto

inmaduro como maduro de fresa son arabinosa, xilosa y galactosa. Durante la

maduración se produce una pérdida de arabinosa y galactosa, mientras que la

cantidad de xilosa se incrementa, y la ramnosa, fucosa, manosa y glucosa

permanecen inalteradas (Redgwell y col., 1997b). La mayor parte de la galactosa y

arabinosa está asociada a polímeros de pectinas que permanecen unidos a la pared

celular después de la extracción con KOH 4M (Redgwell y col., 1997b; Koh y Melton,

2002). De acuerdo con Redgwell y col. (1997b) la pérdida de azúcares neutros no se

correlaciona con el reblandecimiento.

Como resumen, se podría decir que la modificación más característica de la pared

celular durante la maduración de la fresa es la solubilización de las pectinas, la cual

ocurre supuestamente a expensas de los poliurónidos unidos covalentemente a la

pared celular. Varias hipótesis pueden explicar este proceso. Huber (1984) sugirió la

idea de que la solubilización podría estar relacionada con la síntesis de pectinas más
solubles durante la maduración. Koh y Melton (2002) postularon que la solubilización
puede estar asociada con el desenmarañamiento de las pectinas en la pared celular
debido a la degradación de cadenas laterales de arabinanos o de rotura de enlaces

entre pectinas y hemicelulosa. Finalmente, ante las evidencias de una pequeña

despolimerización de estos polímeros, Rosli y col. (2004) indicaron que la

solubilización de pectinas podría ser debida a la despolimerización de las pectinas

unidas covalentemente.

1.7.
1.7.-
7.- Enzimas involucradas en los
los cambios de textura del fruto

El desmantelamiento de la pared celular durante la maduración del fruto está

mediado por la expresión de genes que codifican enzimas y proteínas capaces de

modificar los diferentes polisacáridos de pared, especialmente pectinas y

hemicelulosas. Algunas de estas enzimas se encuentran en diversas etapas del

28
 Introducción

desarrollo del fruto, mientras que otras son específicas de la maduración. En cualquier

caso, parece claro que las enzimas hidrolíticas de pared pueden ser buenas
indicadoras del estado de maduración del fruto (Huber, 1983; Tucker y Grierson,

1987), aunque, en líneas generales, sus papeles en los cambios que determinan el

proceso de reblandecimiento de los frutos están poco definidos. Tradicionalmente,

para definir el efecto de las actividades de una serie de enzimas en la maduración del

fruto se recurría al uso de inhibidores (Yoshida y col., 1984; Picton y Grierson, 1988),

mutantes (Hobson, 1967; Tigchelaar y col., 1978) o variaciones de las condiciones

ambientales (Hobson y col., 1984; Yang, 1985; Lincoln y col., 1987; Davies y col.,

1988). Actualmente, se puede determinar el efecto de actividades enzimáticas

individuales en la degradación de la pared celular durante la maduración del fruto a
través de técnicas de ingeniería genética, mediante la transformación de plantas con
genes relacionados con el metabolismo de la pared celular. En este apartado, vamos a

describir las principales proteínas involucradas en los cambios de la pared celular que
tienen lugar durante la maduración de frutos y que son posibles dianas de actuaciones

con esta metodología.

1.7.1.
1.7.1.-
7.1.- Poligalacturonasa (PG)

Esta enzima β-1,4-D-galacturónico glicanohidrolasa (PG) tiene como principal

sustrato la fracción péctica que incluye los homogalacturonanos (Brummell y col.,

1999) y cataliza la hidrólisis de las uniones de ácido galacturónico actuando tanto
como endo- o exo-enzima. La exo-PG (EC 3.2.1.67) elimina las unidades de ácido
galacturónico a partir del extremo no reductor de los poliurónidos, mientras que para la

endo-PG (EC 3.2.1.15) se ha sugerido que rompe estos polímeros en diferentes

posiciones internas. El sustrato de la PG en la pared celular es principalmente el
homogalacturonano, el cual es secretado en la pared altamente metil-esterificado y

debe ser desesterificado para ser sustrato de esta enzima (Carpita y Gibeaut, 1993).

Los cambios en la estructura de las pectinas durante la maduración de muchos

frutos se han atribuido a la acción de las poligalacturonasas. Estas enzimas se han

29
 Capítulo 1

identificado en las zonas de abscisión en plantas de tomate (Tucker y col., 1984) así

como en frutos maduros y en granos de polen de distintas especies (Pressey y Reger,

1989). De las PGs identificadas en frutos, se han caracterizado tanto exo- como endo-

poligalacturonasas (Hadfield y Bennett, 1998). Varios frutos contienen los dos tipos de

enzimas, como el melocotón tipo “freestone”, la pera, el pepino y la papaya (Pressey y

Avants, 1973; 1975; 1976; McFeeters y col., 1980; Chan y Tam, 1982). Otros, por el

contrario, contienen sólo exo-PG, como es el caso de los melocotones tipo “clingstone”

(Pressey y Avants, 1973). El incremento de actividad endo-PG durante la maduración

se ha correlacionado en distintos frutos con un incremento en las pectinas solubles y

un reblandecimiento del fruto. En muchos frutos, como el tomate, la actividad endo-PG

induce una solubilización de las pectinas mientras que la actividad exo-PG completa la
hidrólisis. En tomate, los niveles de mRNA y proteína PG así como la actividad
poligalacturonasa se correlacionan positivamente con la maduración del fruto y el

reblandecimiento, sugiriéndose que las PG juegan un papel esencial en la inducción

del reblandecimiento del fruto (Bennett y DellaPenna, 1987; Brady, 1987).

El fruto de tomate se ha utilizado como modelo para el análisis del papel de

enzimas hidrolasas mediante transgénesis. En el caso concreto de la PG, la inhibición
de un gen de poligalacturonasa mediante antisentido, inesperadamente, no modificó la
firmeza del fruto maduro, y los frutos transgénicos mostraron una menor

despolimerización y solubilización de pectinas (Sheehy y col., 1988; Smith y col.,

1988). Sin embargo, otras características del fruto como la vida postcosecha de frutos

sobremaduros, susceptibilidad a patógenos y viscosidad de la pasta de tomate se

vieron modificados por el silenciamiento de la PG (Smith y col., 1990; Kramer y col.,
1992; Brummell y Labavitch, 1997). Estos estudios dieron lugar a la hipótesis,

ampliamente aceptada, de que el desmantelamiento de las pectinas durante la

maduración mediado por enzimas pectinolíticas no era suficiente, ni necesario para

producir el reblandecimiento del fruto (Brummell y Harpster, 2001).

Gizis (1963) fue el primer investigador que demostró la presencia de endo-PG en

fresa, aunque, por lo general, la actividad endo-PG o exo-PG que se ha encontrado en
fruto es muy baja (Neal, 1965; Barnes y Patchett, 1976; Archer y Fielding, 1979; Gross

30
 Introducción

y Sams, 1984; Huber, 1984; Abeles y Takeda, 1990; Nogata y col., 1993; Hadfield y

Bennett, 1998). Lefever y col. (2004) observaron un papel importante de la PG en la

firmeza del fruto, encontrando una correlación negativa entre dureza de fruto y

actividad PG, de tal forma que las variedades de frutos más duros tenían una baja

actividad PG.

En fresa se han identificado tres genes que codifican PG que se expresan

específicamente durante la maduración del fruto (Redondo-Nevado y col., 2001;

Salentijn y col., 2003; Villarreal y col., 2008). Quesada y col. (2009) obtuvieron plantas
transgénicas con bajos niveles de uno de estos genes, FaPl1, mediante
transformación con antisentido. Los frutos maduros de algunas líneas seleccionadas

fueron significativamente más duros que los controles, manteniéndose además el

incremento en dureza durante la postcosecha del fruto. Por tanto, estos estudios

parecen indicar que la PG sí tendría un papel importante en el reblandecimiento de la

fresa.

1.7.2.
1.7.2.-
7.2.- Pectato liasa (PL)

La enzima pectato liasa (PL, EC 4.2.2.2) ha sido ampliamente estudiada en

bacterias fitopatógenas, las cuales la secretan favoreciendo la degradación de las

pectinas de la lámina media de la planta infectada para así permitir la entrada del
patógeno (Henrissat y col., 1995). La degradación de las pectinas por acción de la PL
ocurre por β-eliminación, a diferencia del mecanismo hidrolítico de las PG. Estas

enzimas catalizan la rotura de los enlaces α (1-4) entre residuos galacturónicos

desmetilados, provocando la despolimerización de las pectinas de la lámina media y
de la pared celular primaria de las células vegetales (Henrissat y col., 1995). Tienen,

por tanto, una función similar a la de la poligalacturonasa, aunque el mecanismo

enzimático de ambas es diferente.

En el caso del fruto de fresa, se han descrito 3 genes de pectato liasa. El primer

gen de PL específico de frutos (plC) fue descrito por Medina Escobar (1997) en fresa.
La expresión de este gen está restringida a frutos en estadio blanco y rojo maduro y se

31
 Capítulo 1

inhibe por tratamiento con auxina. Posteriormente, se comprobó la existencia de otros

dos genes de pectato liasa plA y plB, que presentaban un patrón de expresión similar
al anterior (Benítez-Burraco y col., 2003). También se han aislado genes de pectato

liasa en frutos como banana (Domínguez-Puigjaner y col., 1997; Pua y col., 2001), uva

(Nunan y col., 2001; Ishimaru y Kobayashi, 2002) y en varios tejidos de tomate,

expresándose en niveles elevados durante la maduración del fruto (Marín-Rodríguez y

col., 2002).

Para determinar el papel de los genes de pectato liasa en la maduración de fresa,

Jiménez-Bermúdez y col. (2002) obtuvieron plantas transgénicas que contenían una
secuencia en antisentido de la región conservada de las tres pectato liasas de fruto.

De entre todas las líneas transgénicas obtenidas, se seleccionaron cuatro de ellas en

base al grado de inhibición conseguido y a la producción de frutos. Estas líneas dieron

frutos con una dureza significativamente superior a la de los frutos control. Tras el
análisis de expresión por “Northern Blot” se comprobó que en las líneas seleccionadas
los niveles estacionarios de mRNA correspondientes al gen plC en fruto maduro

estaban reducidos entre el 70 y el 100% con respecto al testigo sin transformar,

dependiendo de la línea. Estas líneas se siguieron cultivando durante varios años

consecutivos y en todas ellas se mantuvo el fenotipo de mayor dureza de fruto en
estadio rojo. En cuanto al efecto de la inhibición del gen pectato liasa en el
desmantelamiento de la pared celular de fresa durante la maduración, en un estudio
preliminar se comprobó que las paredes de los frutos transgénicos contenían una

menor proporción de pectinas queladas y presentaban un menor grado de

hinchamiento cuando se colocaban en agua destilada, lo cual era indicativo de una

reducción de la solubilización de estas pectinas de pared durante la maduración

(Jiménez-Bermúdez y col., 2002). A nivel histológico, estos cambios en la pared se
traducen en una disminución de los espacios intercelulares y un mayor grado de
adhesión celular en los frutos transgénicos maduros. Todo esto sugiere que esta

enzima juega un papel muy importante en el reblandecimiento del fruto de fresa

durante la maduración. En el apartado 1.8 se describe con más detalle la obtención y

caracterización de estas plantas, al ser el objeto de estudio de esta tesis.

32
 Introducción

1.7.3.
1.7.3.-
7.3.- Pectin metilesterasa (PME)

Los homogalacturonanos son secretados en la pared celular altamente metil-

esterificados y son parcialmente desesterificados in muro. En el proceso de

maduración, el grado de metilesterificación de las paredes celulares disminuye (Koch y

Nevins, 1989). La enzima pectin metilesterasa (PME; EC 3.1.1.11) elimina los grupos
metilo de la posición 6 de los residuos de ácido galacturónico de las pectinas; esto

provoca la liberación de grupos carboxilo, cambiando el pH así como la carga de la

pared celular, y permite la unión entre cadenas de poliurónidos por puentes de calcio
(Jarvis, 1984; Seymour y col., 1987; Koch y Nevins, 1989; Carpita y Gibeaut, 1993). La
actividad de esta enzima es esencial para la actuación de las enzimas pectinolíticas,

ya que tanto poligalacturonasa como pectato liasa requieren fragmentos con las
cadenas pécticas demetiladas.

La PME se encuentra en diversos tejidos vegetales (Tucker y col., 1982). Los

efectos de su actividad enzimática en el reblandecimiento no están claros ya que, por
un lado, al desmetilar las pectinas favorecen la acción de las PG y PL, y con ello la
despolimerización de pectinas mientras que, por otra parte, la liberación de grupos
carboxilo promueve la formación de enlaces iónicos en la pared. Los resultados
obtenidos con plantas de tomate con PME en antisentido muestran que las pectinas
presentaron un menor grado de esterificación (15-40%) que las plantas controles y un
menor contenido de pectinas solubles en EDTA (Tieman y col., 1992; Tieman y Handa,
1994), no obstante la dureza de los frutos no se vio afectada. Al igual que en el caso

de la PG, los resultados sugieren que esta enzima está involucrada en la degradación
de la pared celular pero su supresión no es suficiente para modificar la dureza de los

frutos.

En frutos de fresa, se ha detectado actividad PME (Gizis, 1963; Neal, 1965; Barnes
y Patchett, 1976; Archer, 1979) encontrándose que dicha actividad prácticamente se

duplicaba, aproximadamente al pasar del estadio inmaduro al maduro. Posteriormente,

la actividad disminuía hasta niveles basales en frutos muy maduros. En fresa se han
caracterizado cuatro genes de PME, FaPe1 a FaPe4, de los cuales, el FaPe1, se

expresa específicamente en fruto mostrando un incremento de la expresión durante la

33
 Capítulo 1

maduración alcanzando el máximo en el estadio intermedio de maduración (Castillejo

y col., 2004). Mediante líneas transgénicas con una alta actividad PME en fruto, se
observó en el análisis de sus paredes celulares una reducción del 20% de la

metilación de las pectinas solubles y unidas iónicamente, si bien no se pudo mostrar

un aumento en la firmeza ni en la vida postcosecha, sí que mostraron una mejor

resistencia a la infección por hongos (Osorio y col., 2008).

1.7.4.
1.7.4.-
7.4.- Endo-
Endo-β-1,4-
1,4-D-glucanasa (EGasa)

La fracción de hemicelulosa de la pared es despolimerizada durante el

reblandecimiento del fruto (Huber, 1984; Brummell y col., 1999). Una de las enzimas
que se considera responsable de este proceso es la celulasa o glucanasa (EGasa, EC
3.2.1.4). Las EGasas hidrolizan glucanos con uniones β-D-1,4, aunque probablemente
no son capaces de degradar la celulosa cristalina (Brummell y col., 1994). Sus

sustratos en la pared celular podrían incluir al xiloglucano, regiones no cristalinas de la

celulosa y posiblemente glucomananos con suficiente cantidad de β-D-1,4-glucanos

para permitir la unión de la enzima al sustrato (Hatfield y Nevins, 1986; Nakamura y

Hayashi, 1993; Ohmiya y col., 2000). Se ha encontrado actividad EGasa en todos los
frutos examinados (Brummell y col., 1994) pero las cantidades encontradas varían
notablemente según la especie considerada. En la mayoría de los frutos se ha descrito

la existencia de numerosas isoformas de EGasa durante la maduración (Kanellis y

Kalaitzis, 1992).

En el caso de la fresa, la enzima endo 1,4-D-glucanasa parece estar involucrada

en el reblandecimiento del fruto (Abeles y Takeda, 1990). Barnes y Patchett (1976)

detectaron actividad en frutos correspondientes a los estadios maduros y muy

maduros. Además, se ha observado un aumento en la actividad de seis veces entre
los estadios verde y rojo maduro (Abeles y Takeda, 1990). A pesar de la estrecha
relación temporal entre esta actividad celulasa y el reblandecimiento y maduración del

fruto, hay pocas evidencias microscópicas de cambios importantes en la matriz de

celulosa a lo largo del desarrollo del mismo (Al-Jamali, 1973). A nivel génico, se han

34
 Introducción

aislado dos genes de celulasa en frutos de fresa (FaEg1 y FaEg3) que muestran alta

expresión durante la maduración (Manning, 1998; Llop-Tous y col., 1999; Trainotti y

col., 1999). Sin embargo, el papel de estos genes no es todavía conocido (Harrison y

col., 2001).

Para determinar la posible función de estos genes en el proceso de maduración,

Woolley y col. (2001) y Mercado y col. (2010) obtuvieron plantas transgénicas de fresa

conteniendo secuencias en antisentido de FaEg1 y de FaEg3, respectivamente. En

ambos casos no se observó ninguna diferencia en la dureza de frutos en estadio rojo

maduro, entre las líneas transgénicas y el control. Palomer y col. (2006) obtuvieron
plantas transgénicas con un silenciamiento parcial de ambos genes y no observaron

variaciones ni en la composición de la pared celular ni en la dureza del fruto. Por tanto,

los resultados obtenidos con plantas transgénicas no sostienen un papel de estas

enzimas en el proceso de reblandecimiento de frutos de fresa.

1.7.5.
1.7.5.-
7.5.- Expansinas (EXP)

Las expansinas son proteínas que inducen el “relajamiento” de la estructura de la

pared aunque se cree que carecen de actividad hidrolítica y no se las considera

enzimas. Se postula que su mecanismo de actuación es a través de la rotura o

interrupción de puentes de hidrógeno, considerándose que actúan a nivel de la

interacción celulosa-hemicelulosa (MacQueen-Mason y Cosgrove, 1994; 1995;
Cosgrove 2000a; 2000b). Son proteínas cuya presencia se ha descrito en numerosos

tejidos e, inicialmente, su función se relacionó con procesos de crecimiento (Cosgrove,

2000a; 2000b). La disminución del número de enlaces de hidrógeno entre las
microfibrillas de celulosa y las de hemicelulosa posibilitaría una mayor libertad de

movimiento y una nueva disposición de los polímeros durante el crecimiento y

expansión celular. Más recientemente se han descrito también en frutos, donde se

considera que contribuyen a modificar la estructura de la pared incrementando el

acceso de las hidrolasas a zonas de la pared celular que de otro modo no podrían
alcanzar. Ello se traducirá finalmente en un reblandecimiento del fruto.

35
 Capítulo 1

En tomate y fresa se han aislado los genes de expansinas cuya expresión coincide

con los patrones espacio-temporales de maduración del fruto (Rose y col., 1997;
Civello y col., 1999). En fresa, la expresión del gen denominado FaExp1 se detecta en

el estadio blanco, momento en el que comienza el reblandecimiento del fruto,

manteniéndose los niveles altos durante la maduración del fruto (Civello y col., 1999).
Por otro lado, la supresión de la expansina del fruto de tomate (LeExp 1) resultó en

una reducción del reblandecimiento, mientras que la sobreexpresión de LeExp 1

aumentó el reblandecimiento del fruto (Brummell y col., 1999). Ambos resultados
concuerdan con la hipótesis de que la actividad de la expansina contribuye

significativamente a la pérdida de firmeza de los frutos.

1.7.6.
1.7.6.-
7.6.- Otros genes de pared

Se han identificado otros genes que actúan en la pared celular involucrados en el

reblandecimiento del fruto y se ha analizado su expresión en distintos cultivares de
fresa. Martínez y col. (2004) clonaron un fragmento de cDNA que codificaba un

supuesto gen de xilosidasa (FaXyl) de fruto maduro. Posteriormente se aisló el gen

con su secuencia y su región promotora completas (Bustamante y col., 2006;
Bustamante y col., 2009). La xilosidasa libera residuos simples de la xilosa contenida

en los oligosacáridos. La xilosa está presente en la hemicelulosa (xiloglucanos y

principalmente xilanos) y en las pectinas (xilogalacturonanos). La mayoría de la xilosa
que aparece en el fruto de fresa se encuentra en la fracción de hemicelulosa (Koh y
Melton, 2002). Se han encontrado altos niveles de expresión y de actividad xilosidasa
tanto en Camarosa, un cultivar de fruto duro, como en el Toyonaka que es un cultivar
de fruto blando (Bustamante y col., 2006). El patrón de expresión de esta enzima
durante el desarrollo del fruto y su maduración difiere entre los distintos cultivares
estudiados, dificultando la correlación de la expresión de este gen con el
reblandecimiento.

La galactosa y la arabinosa son los azúcares neutros que más disminuyen durante
la maduración del fruto de fresa y se han aislado genes de galactosidasa y

36
 Introducción

arabinofuranosidasa. La actividad arabinofuranosidasa se ha detectado en todos los

estadios de maduración del fruto, excepto en fruto verde pequeño (Rosli y col., 2009).
Esta actividad aumenta con la maduración del fruto, alcanzando en frutos de cultivares

blandos mayores niveles de expresión que en los cultivares duro. La actividad

arabinofuranosidasa se ha detectado en frutos de F. chiloensis aunque, en este caso,

se ha observado la mayor actividad en fruto verde grande (Figueroa y col., 2010). Tres
genes de arabinofuranosidasa son los responsables de esta actividad (FaAra1, FaAra2

y FaAra3). El análisis de su expresión muestra que se expresan durante el desarrollo

completo del fruto, incluyendo todos los estadios de maduración. Aparentemente

ninguno está correlacionado con el reblandecimiento aunque, considerando la

expresión global de los tres genes FaAra, el cultivar blando muestra una expresión
mayor que el cultivar duro (Rosli y col., 2009).

La actividad galactosidasa se incrementa durante el desarrollo del fruto

manteniéndose elevada durante el estadio maduro, lo cual está de acuerdo con la
disminución del contenido de galactosa de la pared celular que se observa (Trainotti y

col., 2001; Figueroa y col., 2010). En el trabajo de Trainotti y col. (2001) se indica la
identificación de tres secuencias completas de galactosidasa (FaGal1 a FaGal3) que
se expresan en fruto maduro. De los tres genes mencionados, sólo FaGal1 muestra un
incremento elevado de expresión durante el proceso de maduración. FaGal1 y FaGal2
contienen un dominio que le sirve de anclaje a un azúcar específico. Este dominio
podría incrementar la eficiencia en la liberación de residuos de galactosa de los
polímeros de la pared celular.

1.8.
1.8.-
8.- Silenciamiento del gen pectato liasa en fresa

Las plantas de fresa con las que hemos trabajado en esta tesis fueron obtenidas
por Jiménez Bermúdez (2005). Para la transformación genética de las plantas de fresa

se siguió el método desarrollado para el cultivar Chandler por Barceló y col. (1998). La
bacteria que se utilizó provenía de la cepa de Agrobacterium tumefaciens LBA4404
(Hoekema y col., 1983) que poseía el plásmido Ti desarmado pAL4404. El T-DNA

37
 Capítulo 1

tenía el gen pectato liasa en antisentido, como gen foráneo, controlado por el promotor

del virus del mosaico de la coliflor con un amplificador, y un terminador en el extremo

3' derecho y como gen marcador, el gen de la neomicina fosfotransferasa (nptII) que le

confiere resistencia al antibiótico kanamicina, con su promotor y su terminador en el

extremo 5' (Figura 1.11).

RB LB
EN-2Ca MW 35S Anti PEL OSC-Ter NOS-Pro NPT II NOS-Ter

Hind III Sca I Kpn I Xba I Kpn I

Figura 1.
1.11: Esquema del T-DNA utilizado para transformar con el gen de pectato liasa en
antisentido. RB: borde derecho, LB: borde izquierdo, ANTI PEL gen de la pectato liasa en
antisentido, con su promotor EN-2Ca MW 35S y su terminador OSC-Ter, NPT II gen que le
confiere resistencia a la kanamicina con su promotor NOS-Pro y su terminador NOS-Ter.

Se obtuvieron más de 70 líneas supuestamente transgénicas de las que se

aclimataron 42 a condiciones de invernadero. De estas últimas se seleccionaron
aquellas líneas transgénicas independientes más parecidas a los testigos en cuanto a
producción y aspecto de los frutos, pero mostrando a la vez mayores valores de
firmeza en fruto maduro. En estas líneas seleccionadas, los valores de inhibición del

gen plC en fruto rojo fueron superiores al 95%, observándose incrementos de dureza
comprendidos entre el 25 y 30% en relación a los testigos (Jiménez-Bermúdez y col.,

2002). A pesar de estos cambios en dureza, los frutos transgénicos no presentaron

variaciones significativas en otros parámetros evaluados como color, forma o sólidos
solubles. Las diferencias en dureza entre los frutos transgénicos y testigos sólo se
observaron a partir de estadio blanco y no en estadios previos de desarrollo. La

inhibición de la expresión de la pectato liasa reduce por tanto el reblandecimiento que

ocurre entre los estadios blanco a rojo de maduración.

38
 Introducción

El incremento de firmeza en los frutos con la pectato liasa silenciada se mantuvo

durante la postcosecha del fruto (Jiménez-Bermúdez y col., 2002; García Gago y col.,
2009). De igual forma, ciertos parámetros de calidad de los procesados de fresa en

forma de mermelada o zumos se vieron modificados en los frutos transgénicos

(Sesmero y col., 2007; 2009).

A nivel de pared celular, análisis preliminares de estos frutos transgénicos

mostraron una reducción del grado de hinchamiento in vitro de la pared, así como una

menor solubilización de pectinas unidas iónicamente (Jiménez-Bermúdez y col., 2002).

Por otro lado, estudios histológicos mostraron que la lámina media de frutos

maduros con el gen de la pectato liasa silenciado estaba menos degradada que en
frutos control (Jiménez-Bermúdez y col., 2002). Estos resultados indican por tanto que
la degradación de las pectinas mediada por la pectato liasa juega un papel importante

en el reblandecimiento de la fresa. Para clarificar el papel de la pectato liasa en el

desmantelamiento de la pared celular durante la maduración de la fresa, es necesario
completar un análisis de estos polímeros pécticos.

39
  

CAPÍTULO 2.
Objetivos
  
 Objetivos

2.-
2.- Objetivos

El objetivo general de esta tesis es el estudio de los cambios que tienen lugar en la
pared celular durante la maduración del fruto de fresa, tanto en frutos con el gen de
pectato liasa silenciado como en frutos control. Este objetivo se concreta en varios
objetivos parciales:

1.- Puesta a punto de una metodología para la extracción, fraccionamiento y

análisis de la pared celular de frutos de fresa.

2.- Análisis comparativo de los polímeros de pared en frutos inmaduros (verdes) y

maduros (rojos) con especial énfasis en los polímeros pécticos.

3.- Estudio del efecto del silenciamiento del gen pectato liasa en el proceso de
desmantelamiento de la pared celular asociado a la maduración del fruto.

43
  

Célula
Célula

Célula

CAPÍTULO 3.
Material y métodos
  
 Material y Métodos

3.-
3.- Material y métodos

3.1.-
3.1.- Material Vegetal

El trabajo de esta tesis se ha realizado con frutos de plantas de fresa Fragaria x

ananasa Duch. cv Chandler. Las plantas de fresa se cultivaron en invernadero, en las
instalaciones del IFAPA de Churriana, Málaga. Los frutos fueron recolectados a
primera hora de la mañana, transportados al laboratorio en contenedores con placas
de hielo para mantener una temperatura baja y posteriormente congelados en
nitrógeno líquido y almacenados a -20ºC.

Se ha trabajado con plantas transformadas genéticamente con la secuencia del

gen de la pectato liasa en antisentido. En concreto, Apel 14, Apel 23 y Apel 39, tres
líneas con el gen silenciado, obtenidas previamente por Jiménez-Bermúdez y col.
(2002). Las líneas Apel 23 y Apel 39 mostraban una inhibición total de la expresión del

gen pectato liasa mientras que Apel 14 mostraba una inhibición de expresión del 95%.
Se ha trabajado con el fruto de estas fresas en dos estadios de maduración: rojo
(como fruto en estadio maduro) y verde (como fruto en estadio inmaduro). Estas tres

líneas se caracterizaban por tener frutos en estadio rojo significativamente más duros
que el control.

Estas tres líneas transgénicas fueron cultivadas junto a las plantas control en

condiciones confinadas en invernadero. Tanto las plantas control no transgénicas

como las líneas transgénicas se propagaban vegetativamente a partir de estolones de
plantas madre anualmente.

3.2.-
3.2.- Metodología

3.2.1.-
3.2.1.- Extracción de la Pared Celular

Debido a la existencia de distintos protocolos de extracción y fraccionamiento de

paredes celulares, se probaron inicialmente tres protocolos. Para la extracción de

47
 Capítulo 3

paredes celulares probamos dos protocolos descritos en la bibliografía: Redgwell y col.

(1992) y Huber y col. (1993), así como una modificación de este último. La principal
diferencia entre ellos era la manera de desactivar las enzimas pectinolíticas, además

de que con el protocolo de Redgwell se obtenía una fracción de pectinas muy solubles

que no se conseguían con el protocolo de Huber. Esto nos llevó a probar una
modificación del protocolo de Huber con el fin de obtener esa fracción de pectinas más

solubles que se obtenían siguiendo el procedimiento de Redgwell y col. (1992).

Las extracciones de la pared celular de los frutos se realizaron por triplicado.

3.2.1.1.
3.2.1.1.-
2.1.1.- Protocolo de extracción de Redgwell

El protocolo de extracción de Redgwell (Redgwell y col., 1992) comenzó con una

pulverización de los frutos en mortero con nitrógeno líquido (Figura 3.1). A

continuación por cada 20 gramos de fruto triturado se añadieron 40 ml de una solución

denominada PAW (fenol:acético:agua en proporción 2:1:1 p/v/v) y se procedió a una
homogeneización con el ULTRA-TURRAX ®, con tres pases de 1 minuto, siempre
manteniendo todo el material en frío. Tras una centrifugación de 15 minutos a 4.000 g,

se filtró el sobrenadante con doble capa de muselina (tejido Miracloth, ref: 475855,
Calbiochem), y el precipitado se lavó resuspendiéndolo previamente en 20 ml de agua

destilada y volviéndose a centrifugar a 4.000 g durante 15 minutos Este paso de

lavado se realizó dos veces. Todos los sobrenadantes obtenidos en los pasos
anteriores se unieron en uno solo para proseguir con el protocolo, mientras que al

precipitado se le añadió DMSO, para eliminar el almidón de la muestra, como se

detalla más adelante.

El sobrenadante conjunto se dializó en agua destilada con una membrana de

diálisis de 7.000 MWCO (SnakeSkin Pleated Tubing, ref: 68700 de la casa PIERCE)
durante una semana y con al menos tres cambios diarios en un volumen 50 veces

mayor de agua. A continuación se centrifugó a 23.000 g, se concentró usando un

rotavapor y se secó mediante liofilización. La fracción así obtenida se denominó

FRACCIÓN SOLUBLE EN PAW.

48
 Material y Métodos

El precipitado resultante de las centrifugaciones anteriores se incubó toda la noche

en 40 ml de DMSO al 90% en agitación suave a temperatura ambiente. Al día

siguiente se centrifugó 15 minutos a 4.000 g. El nuevo precipitado se lavó dos veces

con 20 ml de agua destilada, descartando los sobrenadantes. Con el DMSO se elimina

el almidón de la muestra, por lo que la fracción soluble en DMSO se desechó tras

comprobarse que no contenía pectinas de ningún tipo. El precipitado resultante tras

este tratamiento, se secó mediante liofilización, obteniendo lo que Redgwell denominó

CELL WALL MATERIAL (CWM) O PARED CELULAR (PC).

Redgwell
Pulverización del tejido en N2 líquido

Homogenización en PAW

Fracción soluble en PAW

Incubación en DMSO Pectinas más solubles

Fracción soluble en DMSO

CWM o Extrae el almidón
PARED CELULAR (PC)

Figura 3.1
3.1:
.1 Descripción de los pasos seguidos para la extracción de la pared celular según el
protocolo de Redgwell (Redgwell y col., 1992).

3.2.1.2.
3.2.1.2.-
2.1.2.- Protocolo de Huber

El protocolo de extracción de Huber (Huber y col., 1993) se detalla a continuación

(Figura 3.2):

La extracción comenzó con la pulverización de los frutos en mortero con nitrógeno

líquido. A 20 gramos del pulverizado de fruto se le añadieron 20 ml de etanol al 80%,

49
 Capítulo 3

se homogeneizaron con el ULTRA-TURRAX ® con tres pases de 1 minuto y siempre

manteniendo todo el material en frío, igual que en el caso anterior.

A continuación se realizó un filtrado en doble capa de muselina (tejido Miracloth) y

lo que quedó en el filtro se lavó, añadiendo 100 ml de etanol al 80%. El residuo que

quedó en el filtro se recogió e introdujo en un tubo de 50 ml y se incubó en 20 ml de

TRIS-fenol a pH 7 durante 30 minutos a 23ºC. Se ajustó con etanol al 95% para llevar

el volumen final a una concentración de etanol al 80% y se incubó 1 hora a -20ºC.

Posteriormente, se filtró con GF/C (filtro de microfibra de vidrio, ref: FVC055, de la

casa ALBET) y se lavó con 200 ml de etanol al 95%. Después se continuó con una

incubación en 100 ml de cloroformo: metanol (1:1, v/v) durante 30 minutos a 23ºC. Se

volvió a filtrar con GF/C y se lavó con 200 ml de acetona. El residuo resultante se dejó
secar a 34ºC durante 12 horas para obtener lo que Huber denominó SÓLIDO
INSOLUBLE EN ALCOHOL (AIS) o PARED CELULAR (PC).

La principal diferencia con el protocolo de extracción de Redgwell es que con éste

no se extrae ninguna fracción parecida a la fracción de pectinas más solubles, por eso
incluimos una modificación en este protocolo para obtener una fracción parecida a la
fracción PAW extraída por Redgwell.

50
 Material y Métodos

Huber
Pulverizar el tejido en N2 líquido

Homogeneizar en etanol 80%

Incubación en Tris-Fenol

Ajustar a Etanol 80%

Incubación en cloroformo-metanol

Filtración

AIS o
PARED CELULAR (PC)

Figura 3.2:
3.2 Descripción de los pasos seguidos para la extracción de la pared celular según el
protocolo de Huber (Huber y col., 1993).

3.2.1.3.
3.2.1.3.-
2.1.3.- Modificación del protocolo de extracción de Huber

El protocolo modificado de Huber comenzó como el protocolo de Huber (Huber y

col., 1993) anteriormente mencionado (Figura 3.3).

Se pulverizaron los frutos con nitrógeno líquido y se homogeneizaron 20 gramos

del pulverizado en 20 ml de etanol al 80%. Se filtró con doble capa de muselina (tejido

Miracloth) y se lavó el filtrado con 100 ml de etanol al 80%. Se recogió lo que quedó en
el filtro y se incubó en tris-fenol a pH 7 durante 30 minutos a 23ºC.

La modificación propuesta se introdujo en este punto. La solución se pasó por un

filtro GF/C. El residuo se recogió y se le añadieron 20 ml de agua destilada, se
resuspendió y se centrifugó a 4.000 g durante 15 minutos, repitiéndose este paso de

lavado otra vez. Todos los sobrenadantes obtenidos se unieron y tras una diálisis,

51
 Capítulo 3

concentración y liofilizado como anteriormente se ha descrito, para el protocolo de

Redgwell y se obtiene una FRACCIÓN EQUIVALENTE a la fracción PAW.

El residuo que quedó se ajustó a etanol al 80% y se incubó 1 hora a -20ºC. Los

pasos siguientes son iguales a los descritos con anterioridad; filtrado con GF/C

seguido de un lavado con 200 ml de etanol al 95%. Se siguió con una incubación en
100 ml de cloroformo: metanol (1:1, v/v) durante 30 minutos a 23ºC. Se realizó otro

filtrado con GF/C y posterior lavado con 200 ml de acetona. El residuo se dejó secar a

34ºC durante 12 horas para obtener el SÓLIDO INSOLUBLE EN ALCOHOL (AIS) o

PARED CELULAR.

Huber modificado
Pulverizar el tejido en N2 líquido

Homogeneizar en etanol 80%

Incubación en Tris-Fenol Filtración

Ajustar a Etanol 80% Residuo

Fracción Equivalente a
Incubación en cloroformo-metanol PAW

Filtración

AIS o
PARED CELULAR (PC)

Figura 3.3:
3.3 Descripción de los pasos seguidos para la extracción de la pared celular según la
modificación propuesta para el protocolo de Huber.

Con esta modificación conseguimos una fracción de pectinas solubles, como la

que se obtenía con el protocolo de Redgwell junto con el AIS que correspondería a la
pared celular.

52
 Material y Métodos

3.2.2.
3.2.2.-
2.2.- Fraccionamiento de la Pared Celular

El fraccionamiento de la pared celular (Brummell y Labavitch, 1997) consistió en

una serie de tratamientos secuenciales de la muestra con distintas soluciones. Cada

uno de estos tratamientos permitía solubilizar grupos de polisacáridos diferentes,

ligados más o menos fuertemente a la pared celular. Las soluciones empleadas para
estos tratamientos fueron:

• AGUA: se obtienen las pectinas más solubles, las más débilmente unidas

a la pared.

• CDTA (Ácido trans-1, 2-diamino Ciclohexano N,N,N´,N´ tetraacético

monohidrato 50 mM + Acetato potásico 50 mM a pH 6): agente quelante

de calcio y solubiliza las pectinas unidas por enlace iónico.

• CARBONATO (Carbonato Sódico 100 mM + Sodio Borohidrido (NaBH)

0.1%): rompe enlaces tipo éster y extrae las pectinas unidas por éster

covalente.

• KOH 1M y KOH 4M (Hidróxido potásico a las concentraciones indicadas

con Sodio Borohidrido 0,02M): extrae la hemicelulosa. La fracción KOH

1M es un paso intermedio y puede contener más pectinas que la KOH
4M.

El protocolo del fraccionamiento de la pared celular se describe a continuación

(Figura 3.4): se incubaron 30 mg de pared celular (CWM de Redgwell o AIS de Huber

y Huber modificado) en 15 ml de agua destilada manteniéndolo en agitación suave a

temperatura ambiente durante toda la noche. Tras este tiempo se centrifugó a 4.000 g
durante 15 minutos, el sobrenadante se guardó a 4ºC y el precipitado se volvió a

incubar con otros 15 ml de agua destilada durante toda la noche, volviendo a repetir
todo el proceso anterior. Tras la segunda centrifugación ambos sobrenadantes se
unieron. El volumen final de unos 30 ml, se filtró con filtro de microfibra de vidrio, GF/C

(ref: FVC055, de la casa ALBET), y tras una diálisis frente a agua destilada durante
una semana, (en las mismas condiciones descritas en el apartado anterior para la

53
 Capítulo 3

fracción PAW), se concentró mediante un rotavapor y se secó mediante liofilizado

obteniendo así la FRACCIÓN SOLUBLE EN AGUA.

El precipitado resultante del paso anterior se incubó en 15 ml de tampón acetato

con CDTA 50 mM, teniéndolo en agitación suave a temperatura ambiente toda la

noche. Se centrifuga a 4.000 g durante 15 minutos. El precipitado de la centrifugación

anterior se volvió a incubar en la misma solución con CDTA toda la noche. Tras la

segunda centrifugación el precipitado que quedó se lavó dos veces resuspendiéndolo

en 15 ml de agua destilada, y centrifugándolo a 4.000 g durante 15 minutos. Uniendo

todos los sobrenadantes (los de la incubación con CDTA y los de los lavados en
agua), y siguiendo los pasos descritos con anterioridad de filtrado con GF/C y diálisis

para limpiar la muestra, seguido de la concentración mediante rotavapor y secado en

el liofilizador se obtuvo la FRACCIÓN SOLUBLE EN CDTA.

A continuación el nuevo precipitado resultante se incubó dos veces en 15 ml de

carbonato sódico 0,1M, en agitación suave toda la noche, seguido de dos lavados en
15 ml de agua en las mismas condiciones descritas. Uniendo todos los sobrenadantes
(los de la incubación en tampón carbonato y los de los lavados en agua), y siguiendo

los pasos descritos con anterioridad de filtrado, diálisis, concentración y liofilizado se

obtuvo la FRACCIÓN SOLUBLE EN CARBONATO..

La siguiente incubación del precipitado se llevó a cabo en 15 ml de hidróxido

sódico 1M. Se procedió igual que en los casos anteriores, dos incubaciones del
precipitado con el KOH 1M toda la noche en agitación suave, seguido de dos lavados

con 15 ml de agua destilada. Se unieron los sobrenadantes de todas las

centrifugaciones y tras la diálisis, concentración y secado se obtuvo la FRACCIÓN
SOLUBLE EN KOH 1M..

El precipitado que nos quedó se incubó ahora con hidróxido sódico 4M, en las
mismas condiciones anteriores obteniendo así la FRACCIÓN SOLUBLE EN KOH 4M.

El residuo que quedó tras todo el proceso anterior contenía mayoritariamente

CELULOSA y nada o sólo un residuo de polímeros pécticos.

54
 Material y Métodos

Fraccionamiento
CWM / AIS
Incubación con AGUA

Fracción Soluble en AGUA

Pectinas más solubles
Incubación con CDTA

Fracción Soluble en CDTA

Pectinas unidas por enlaces iónicos
Incubación con CARBONATO

Fracción Soluble en CARBONATO

Incubación con KOH 1M y 4M Pectinas unidas por enlaces covalentes

Fracción Soluble en KOH

Residuo HEMICELULOSA

CELULOSA

Figura 3.4:
3.4 Descripción de los pasos seguidos para el fraccionamiento de la pared celular.

3.2.3.
3.2.3.-
2.3.- Cuantificación de pectinas

La cuantificación de pectinas se realizó aplicando el método que emplea como

reactivo el m-hidroxibifenil. Este protocolo está basado en el protocolo de Van den
Hoogen (1998) y optimizado para nuestro sistema de trabajo siendo adaptados los
volúmenes para la realización de las medidas en placa de Elisa de 48 pocillos. El
ácido galacturónico es el componente principal y mayoritario de las pectinas por lo

que su cuantificación proporciona una buena estimación de la cantidad de pectinas de

la muestra.

Para la realización del ensayo, se mezclan 200 µl de la muestra con 760 µl de

una solución de ácido sulfúrico al 96% con 120 mM de tetraborato sódico. Se incubó
la reacción durante una hora a 80ºC. Transcurrido ese tiempo, se tomó una primera
medida de la densidad óptica a 515 nm en un lector de Elisa (lector ELx800,
controlado con el programa Gen 5, 1.05, Bio-Tek Instrument, Inc).

55
 Capítulo 3

A la mezcla se le añadieron 160 µl del reactivo que le da color rosado (100 mg m-

hidroxibifenil/1ml de DMSO, diluido con ácido sulfúrico al 80% v/v en una proporción
de 1:50 v/v). Tras 15 minutos, se tomó la segunda medida de densidad óptica a 515

nm.

La diferencia de absorbancias entre ambas medidas era mayor cuanto mayor

cantidad galacturónico presentaba la muestra. Para dar los resultados de la cantidad

de ácido galacturónico, se extrapoló este valor de absorbancia en una recta patrón,

previamente obtenida con concentraciones de ácido galacturónico conocido. De cada

medida se realizaron al menos tres repeticiones de muestras independientes.

3.2.4.
3.2.4.-
2.4.- Cuantificación de azúcares totales
totales

Se realizó una estimación de la cantidad de azúcares totales de las muestras con

el método del orcinol-sulfúrico (Dubois y col., 1956) con algunas modificaciones que
se describen a continuación y adaptando los volúmenes para la realización de las
medidas en placa de Elisa de 96 pocillos.

Se mezclaron 40 µl de la muestra con 160 µl del reactivo orcinol-sulfúrico, formado

por ácido sulfúrico al 60% v/v mezclado con orcinol (ref: 15A639.1206, de Panreac) al
1,6% p/v en proporción 7,5:1. Las reacciones se incubaron durante 30 minutos a

100ºC. La reacción se paró en frío y se pasó a una placa a hielo durante 15 minutos.
Posteriormente cuando la mezcla se atemperó se midió la absorbancia a 450 nm.

Para estimar la cantidad de azúcares se extrapolaron los valores de la densidad

óptica de cada muestra en una recta patrón con concentraciones conocidas de

glucosa medidas de igual manera. Se realizaron, al menos, tres medidas
independientes de azúcares en cada muestra.

56
 Material y Métodos

3.2.5.
3.2.5.-
2.5.- Cromatografía de filtración en gel.

Mediante la cromatografía de filtración en gel se separan moléculas según su

masa molecular. La muestra se pasó por una columna que contiene un gel con un

determinado tamaño de poro. Este gel hace que las moléculas más pequeñas pasen a

través del poro y tengan un mayor recorrido que las moléculas de mayor tamaño, las
cuales no pueden pasar a través de él saliendo antes en el eluído por el otro extremo

de la columna.

Hemos empleado columnas de dos tamaños: unas de 95 cm de longitud y un

diámetro de 0,8 cm y otras de 45 cm de longitud y un diámetro de 0,5 cm.

Se utilizaron dos tipos de geles que nos permitían discriminar dos rangos de

tamaños moleculares: Sepharosa CL-6B, que separa moléculas con tamaño

comprendido entre 10 y 1.000 KDa y Sepharosa Cl-2B, que discrimina bien entre 100 y

20.000 KDa.

Se emplearon dos tipos de tampones dependiendo del tipo de muestra que

circulaba por la columna. Se utilizó el tampón acetato 0,2M a pH 5,0 (Redgwell y col.,
1997b), para las fracciones PAW, AGUA y CDTA y el tampón TRIS-HCl 0,1M a un pH

8,4 para las fracciones CARBONATO, KOH 1M y KOH 4M.

Las cromatografías se realizaron en cámara fría a 4ºC, siendo también

conveniente que los tampones acetato y TRIS-HCl estén fríos y desgasificados antes
de utilizarlos. Las columnas se cargaron por la parte superior y estaban conectadas
mediante tubos de teflón a una bomba peristáltica que hacía mantener un flujo

constante en la columna, que se fijó en 14 ml/h. El volumen de elución se recogió

fraccionado mediante un colector de fracciones (Figura 3.5). El volumen de las
fracciones fue de aproximadamente 2 ml para las columnas grandes y en torno a 1 ml

para las pequeñas (Figura 3.5).

A las muestras recogidas en el colector de fracciones se les midió la cantidad de

ácido galacturónico y la cantidad de azúcares totales mediante los protocolos

anteriormente descritos para obtener los perfiles cromatográficos donde se representa

57
 Capítulo 3

la densidad óptica de la medida de galacturónico y/o azúcares frente al volumen de

elución.

Columnas

Colector de fracciones

Bomba peristáltica

Figura 3.5:
3.5 Área y equipo de trabajo de las cromatografías de filtración en gel, con las
columnas, la bomba peristáltica y el colector de fracciones.

Las columnas se caracterizaron con unos estándares de masa molecular conocida.

En ambas columnas se utilizó, en las mismas condiciones de las muestras, el azul de

dextrano, un estándar de 2.000 KDa (Sigma ref: D4772). Para la columna con la
Sepharosa Cl-6B se emplearon además dextranos de 80 y 12 kDa (FLUKA
Biochemika) para su calibrado.

2.6.- Hinchamiento in vitro de la pared

3.2.6.
3.2.6.- pared celular

El estudio del hinchamiento in vitro de la pared celular (PC) del fruto se realizó en
muestras control de fruto rojo y de fruto verde según el procedimiento descrito a
continuación:

58
 Material y Métodos

Se colocaron en viales de cristal de 0,4 cm de diámetro por 5 cm de alto 16 mg de

pared celular pulverizada con nitrógeno líquido. A continuación se le añadieron 200 µl

de agua destilada y se volteó el vial hasta que toda la pared celular estuvo

humedecida con el agua. Después, se rellenó todo el tubo con agua y se dejó reposar

toda la noche a temperatura ambiente. La altura de la pared hidratada, después de

estabilizarse se tomó como medida del hinchamiento in vitro de la pared celular.

Tras el hinchamiento con agua de la pared celular se probaron varios tratamientos

y se evaluaron las alturas obtenidas. Los tratamientos empleados fueron:

• Tratamiento de carbonato (usando la misma solución que para el

fraccionamiento de la pared).

• Tratamiento de calcio (empleando CaCl2, 100 mM al 1%).

• Tratamiento de CDTA (utilizando la misma solución que para el fraccionamiento

de la pared).

• Tratamiento de CDTA, la misma solución que en el fraccionamiento, y luego se

sustituyó por calcio, (CaCl2, 100 mM al 1%).

Para realizar estos tratamientos fue necesario sustituir toda el agua que contenía

la muestra tras el hinchamiento in vitro por la solución con la que se quería tratar. Para
ello se retiró el agua con una pipeta y se añadió la solución correspondiente, se volteó
y se dejó reposar. Cuando se separaron las dos fases, se quitó el líquido y se volvió a

añadir solución, repitiendo este proceso hasta asegurarnos que se había sustituido
toda el agua por la solución (al menos cinco veces). La medida se tomó al

estabilizarse la medida de la altura, una vez completado el procedimiento.

La altura de la pared hidratada se toma como el grado de hinchamiento. Una

mayor altura supondrá un mayor grado de hidratación de la pared y consiguientemente

una mayor desmantelamiento de la misma.

59
 Capítulo 3

3.2.7
3.2.7-
2.7- Medida de poliurónidos totales de la pared celular

La cuantificación de la cantidad de pectinas totales que hay en la pared celular se

basó en el protocolo de Ahmed y Labavitch (1978). Para ello se pesaron de 6 mg de

pared celular y se añadieron 0,83 ml de ácido sulfúrico concentrado y previamente

enfriado. Se mantuvo 5 minutos en agitación suave y se le añadieron 0,26 ml de agua

destilada se dejó 5 minutos en agitación suave. Este proceso se realizó dos veces. A

continuación se añadieron 10 ml de agua destilada y se puso en agitación suave otros

5 minutos. Transcurrido ese tiempo, se centrifugó durante 10 minutos a 4.000 g,

quedando los poliurónidos en el sobrenadante. Para su cuantificación se realizaron las
medidas de azúcares y galacturónicos previamente descritos.

3.2.8.
3.2.8.-
2.8.- Medida de antocianinas
ntocianinas

La medida de antocianinas presentes nos da una estimación del grado de

maduración del fruto (Given y col., 1988). La medida de antocianinas realizado está
basada en la metodología de Giusti y col. (1999), que se describe a continuación:

El fruto se pulverizó en nitrógeno líquido. A 1 gramo de fruto pulverizado se le

añadieron 3 ml de etanol con 1% v/v de ácido clorhídrico, y se homogenizó con el

ULTRA-TURRAX ® se dieron tres pases de 30 segundos manteniéndolo en frío y se

incubó el extracto a 4ºC un mínimo de cuatro horas. Luego se centrifugó 10 minutos a

10.000 g a 4ºC y se midió el volumen del sobrenadante en una probeta de 10 ml. Se
midió la absorbancia del sobrenadante a una longitud de onda de 530 nm y de 657

nm. El contenido de antocianinas se estimó como la diferencia entre el valor de

absorbancia obtenido a 530 nm y el obtenido a 657 nm. Finalmente las medidas se
expresaron como DO x ml extracto/g de peso fresco.

60
 Material y Métodos

3.2.9
3.2.9.- Análisis de elementos esenciales

El análisis de los elementos esenciales de la pared celular se llevó a cabo en los

Servicios Centrales de Apoyo a la Investigación (SCAI) de la Universidad de Málaga,

donde se llevaron las muestras de paredes celulares para su análisis. Se realizaron

dos tipos de análisis: análisis elemental cuantitativo y espectrometría atómica, que

pasamos a describir someramente.

El análisis elemental cuantitativo de muestras sólidas, líquidas viscosas y filtros

permite obtener el contenido de C (carbono), H (hidrógeno), N (nitrógeno), S (azufre) y

O (oxígeno) medido en porcentaje respecto al peso. La técnica de Análisis Elemental
está totalmente automatizada, y se basa en la combustión completa de la muestra, en

condiciones óptimas (950 a 1300 ºC y atmósfera de oxígeno puro), para convertir los
elementos antes mencionados en gases simples (anhídrido carbónico, nitrógeno, agua

y anhídrido sulfuroso). Estos gases, después de ser separados con distintas técnicas
(columna cromatográfica, infrarrojos) según el equipo utilizado, son medidos y se
procesan teniendo en consideración el peso de la muestra y los datos proporcionados
por una muestra patrón obteniéndose de este modo el contenido porcentual de cada

elemento en la muestra.

La espectrometría atómica, en términos generales, está basada en la medición de

los espectros de absorción, emisión o fluorescencia de átomos o iones elementales.

Hay dos regiones del espectro que dan información atómica: la ultravioleta/visible y la
de rayos X. Por otra parte, los iones cargados pueden ser separados y determinados

mediante dispositivos denominados espectrómetros de masas. Los espectros

atómicos ultravioleta y visible se obtienen mediante un adecuado tratamiento térmico
que convierte los componentes de una muestra en átomos o iones elementales

gaseosos. La emisión, absorción o fluorescencia de la mezcla gaseosa resultante sirve

a continuación para la determinación cualitativa y cuantitativa de uno o varios de los

elementos presentes en la muestra.

61
 Capítulo 3

3.2.10.-
3.2.10.- Medida de la dureza de los frutos

La dureza de los frutos se midió empleando un penetrómetro manual (modelo

FT02, Effegi, Italy) (Figura 3.6) que mide la resistencia de un fruto a ser penetrado con

una aguja plana. La dureza se midió en frutos recién recolectados. El aparato se

colocó siempre de manera perpendicular al fruto haciendo una leve presión hasta que
la aguja entraba en el fruto. Estas medidas se realizaron en la zona de mayor diámetro

del fruto, a una profundidad aproximada de 0,5 cm.

La superficie de las agujas varió dependiendo de los estadios de maduración

estudiados, siendo para el fruto verde de 0,78 mm2, para el blanco y el intermedio de

3,14 mm2 y para el fruto rojo de 9,62 mm2.

Figura 3.6: Medición de dureza en frutos de fresa con el penetrómetro (autor: Silvia Jiménez-

Bermúdez. Fotografía usada con permiso del autor).

3.2.11.
3.2.11.- Caracterización histológica de frutos de fresa

La caracterización histológica que se muestra en esta tesis y que aparece como

resultado en el capítulo 6: “Efecto de la inhibición por tecnología antisentido de un gen

de pectato liasa en la despolimerización de las pectinas y el reblandecimiento del fruto

de fresa”, se corresponde al artículo publicado (anexo I) y sirve para apoyar nuestros

resultados. Esta caracterización histológica fue realizada por Silvia Jiménez-

Bermúdez.

62
 Material y Métodos

Las muestras analizadas se cortaron en fragmentos de 0,5 cm de frutos recién

recogidos procedentes de diferentes tejidos y de la zona de máximo diámetro,

separando los bloques de inclusión en Epidermis-Córtex por un lado y Médula por otro.

Los cortes histológicos del fruto se realizaron utilizando el Kit comercial Historesin

embedding de Leica. El proceso al que se sometieron los frutos consistió en una

inmersión en una solución fijadora comercial Bouin durante 24 horas. Posteriormente

se deshidrataron en una serie de etanoles diluidos (primero se colocaron en etanol

70%, 30 minutos 2 veces, luego en etanol 80%, 30 minutos 2 veces y por último etanol
95% 1 hora 2 veces). Posteriormente se pasó a la solución de preinfiltración-infiltración
(incluida en el Kit). Como último paso se embebieron en la solución polimerizante

Embedding medium que incluía el Kit. Los bloques y la polimerización de la parafina se

realizaron a temperatura ambiente. Una vez endurecida la resina, se obtuvieron

secciones transversales de 4µm empleando un microtomo de deslizamiento (HN 340

Micro Heidelberg). Se colocaron los cortes en una gota de agua destilada a 37ºC para
que se estiraran en el mismo portaobjetos y se dejaban secar en una plancha
calefactora a 37ºC.

Para teñir las muestras se empleó rojo rutenio para las pectinas, a una
concentración 0,2g/l durante dos horas; pasado ese tiempo se enjuagó con agua

destilada. Para la tinción de celulosa se utilizó tionina a una concentración de 0,25 g/l
durante 1 minuto; pasado ese tiempo, la muestra se enjuagaba con una solución de
NaHCO3 (1 g/l).

Las muestras se visualizaron mediante microscopio óptico con distintos aumentos.

En algunos casos se estimó el área celular mediante el programa informático Visilog 6.

3.2.
3.2.12
2.12.
12.- Análisis estadístico de los datos.
datos.

Los datos fueron analizados en SPSS statitics 22 o R (versión 3.1.2) mediante

análisis de varianza (ANOVA) y comparación de medias (T de Student y Test HSD de

Tukey), según el caso, y previa verificación de la homogeneidad de las varianzas (Test

63
 Capítulo 3

de Levene) y normalidad (Shajuro-Wilk) o igualdad de varianzas respectivamente.

Para la comparación estadística se tomó un intervalo de confianza del 95% y se

usaron al menos tres réplicas. Los datos fueron representados gráficamente usando

SigmaPlot 11.0 Notebook.

64
  

CAPÍTULO 4.
Elección y puesta a punto del protocolo de
extracción y fraccionamiento de la pared celular
 
  
 Elección del protocolo

4.-
4.- Elección y puesta a punto del protocolo de extracción y
fraccionamiento de la pared celular

La elección de un protocolo de extracción de pared celular se realizó con frutos

de fresón del cultivar Chandler no transgénicos en estadio rojo. Se ensayaron tres
protocolos de extracción: dos previamente empleados en distintos frutos, incluida la

fresa, a los que denominamos protocolo de Redgwell y protocolo de Huber, y una

modificación del método empleado por Huber que consistió en añadir al original un

paso previo de extracción (detalles en el capítulo 3 “Material y Métodos”). El objetivo

era conocer qué protocolo era más adecuado para frutos de fresa en cuanto a la

cantidad de pared celular extraída y su posterior fraccionamiento, ya que en aquellos

momentos estaba menos estudiado que otros frutos. Además, también se evaluó a
efectos comparativos la cantidad de pectinas y de azúcares de las distintas fracciones,
la presencia de distintos elementos esenciales y el comportamiento en cromatografía
de filtración en gel de las fracciones. Esta última técnica permite estimar la masa
molecular de los principales polímeros presentes en las fracciones y ver posibles
diferencias.

Durante el fraccionamiento de la pared celular descrito en el capítulo 3 “Material

y Métodos”, se obtenían las fracciones denominadas AGUA, CDTA, CARBONATO,

KOH 1M y KOH 4M. En la elección del protocolo se tuvieron en cuenta

preferentemente las fracciones en las que se solubilizaban de forma mayoritaria las
pectinas, en concreto, las fracciones AGUA, CDTA y CARBONATO. Las fracciones
solubilizadas con KOH 1M y 4M, ricas en hemicelulosa, también contienen una
pequeña proporción de pectinas pero no fueron consideradas a la hora de comparar y
elegir protocolo.

4.1.
.1.- Extracción de pared celular y fraccionamiento
fraccionamiento

En la Figura 4.1 A se muestra la cantidad de pared celular referida a peso de

fruto. Se observó que las cantidades obtenidas mediante el protocolo de extracción de

67
 Capítulo 4

Redgwell y el de Huber fueron muy similares, en torno a 0,7-0,8 g por 100 g fruto y no

se observaron diferencias significativas entre ambos métodos. En el caso de la

modificación ensayada del protocolo de Huber se registró una disminución muy

significativa de la cantidad de pared celular extraída, con valores alrededor de 0,3 g

por cada 100 g de fruto.

1,0
A a
R
H
0,8 HM
a
g fracción / 100 g fruto

0,6

0,4 b

0,2 a a

0,0
PC PAW

0,5
B R
H
0,4 a
HM
g fracción / 100 g fruto

0,3 a a

0,2
b
b b
0,1
a
b

0,0
AGUA CDTA CARBONATO

Figura 4.1
4.1: Cantidad de pared celular y fraccionamiento obtenido. A: Cantidad de pared
celular (PC) y de fracción PAW, expresado en g/ 100 g fruto. B: Fraccionamiento de la pared
celular, expresado en g fracción /100 g de fruto. R corresponde al protocolo de Redgwell, H al
de Huber y HM,
HM al de Huber modificado. En la comparación de los tres protocolos, para cada
fracción, los valores medios no fueron significativamente diferentes si comparten la misma letra,
según un análisis de ANOVA y Test HSD de-Tukey, con un límite de confianza de 95%.

68
 Elección del protocolo

También comparamos la cantidad de material que queda solubilizado en el

medio de extracción que contiene fenol, acético y agua, (fracción PAW). Se obtuvieron
valores en torno a los 0,15 g por 100 g de fruto y esta cantidad fue similar con los

protocolos de Redgwell y de Huber modificado. Recordemos que esta fracción no se

extraía con el protocolo de Huber.

En lo que se refiere al fraccionamiento de la pared celular podemos observar

en la Figura 4.1 B las cantidades de fracción soluble en agua, en CDTA y en carbonato

referidas también a fruto. Se observó que la cantidad de fracción AGUA de la

extracción de Huber fue estadísticamente superior (0,12 ± 0,013 g/100 g fruto) a las
obtenidas usando el protocolo de Redgwell (0,04 ± 0,005 g/100 g fruto) y el modificado

de Huber (en torno a 0,025 g/100 g fruto). Esto se pudo deber a que con el agua se
extraían, en el caso de Huber, más cantidad de polímeros de pared solubles, ya que

no se habían solubilizado previamente con el paso de PAW, como en el caso de

Redgwell y de Huber modificado.

La cantidad más alta de fracción soluble en CDTA se obtuvo usando el

protocolo de Redgwell, pero sin llegar a ser estadísticamente distinta a la de Huber.

Por el contrario, la cantidad de fracción obtenida con el protocolo modificado de Huber

fue significativamente menor que las obtenidas con los otros dos protocolos. De igual

forma, en el caso de la fracción CARBONATO, no se apreciaron diferencias entre los

protocolos de Redgwell y de Huber en cuanto a cantidad de fracción obtenida, pero
esta fracción fue significativamente inferior en la modificación del protocolo de Huber.

Al tratarse de un fraccionamiento de la pared celular es conveniente expresar

los datos obtenidos del fraccionamiento no solo por peso de fruto, sino también por
cantidad de pared celular de partida (Figura 4.2).

69
 Capítulo 4

70
R
a H
60

mg Fracción / 100 mg PC
HM
50
b
b a
40 a
a
30

20 b
a
a
10

0
AGUA CDTA CARBONATO

Figura 4.2
4.2: Fraccionamiento de la pared celular, expresado en mg fracción /100 mg de pared
celular (PC). R corresponde al protocolo de Redgwell, H al de Huber y HM,
HM al de Huber
modificado. En la comparación de los tres protocolos, para cada fracción, los valores medios no
fueron significativamente diferentes si comparten la misma letra según un análisis de ANOVA y
Test HSD de-Tukey, con un límite de confianza de 95%.

Calculada de este modo, la fracción soluble en agua sigue siendo superior con la
extracción de Huber y no se aprecian diferencias significativas entre el protocolo de
Redgwell y la modificación de Huber. En el caso de la fracción soluble en CDTA, se
observó que con el protocolo de Redgwell se obtuvo una cantidad de fracción
estadísticamente mayor que la obtenida con el protocolo de Huber y con la
modificación del protocolo de Huber, siendo estas dos últimas extracciones

estadísticamente similares. En cuanto a la fracción soluble en tampón carbonato no se

encontraron diferencias significativas entre los tres protocolos cuando se refirieron los
datos a cantidad de pared.

70
 Elección del protocolo

4.2.
.2.- Cantidad de poliurónidos obtenidos

La cantidad de pectinas (poliurónidos) en una muestra se puede estimar

midiendo el contenido de ácido galacturónico. Nosotros lo hemos cuantificado con el

protocolo de Van den Hoogen (1998). En la Figura 4.3 se representa la cantidad de

ácidos urónicos (AU) referida a 100 mg de fruto, tanto en la pared celular, como en la
fracción PAW.

50
R
H
40 b HM
mg AU / 100 g Fruto

a
30
a
a
20 a

10

0
PC PAW

Figura 4.3
4.3: Cantidad de pectinas de la pared celular (PC) y de la fracción PAW, expresada en
mg de AU /100 g fruto; con el protocolo de Huber no se extrae fracción PAW. R corresponde al
protocolo de Redgwell, H al de Huber y HM,
HM al de Huber modificado. En la comparación de los
tres protocolos, para cada fracción, los valores medios no fueron significativamente diferentes
si comparten la misma letra, según un análisis de ANOVA y Test HSD de-Tukey, con un límite
de confianza de 95%.

No se aprecian diferencias significativas en la cantidad de pectinas presentes en

la pared celular (PC) entre los tres protocolos evaluados. Dichos valores oscilaron
entre los 23,05 ± 5,43 mg AU/100mg de fruto con el protocolo de Redgwell y los 15,51
± 4,64 mg de AU/100 mg de fruto de la modificación del protocolo de Huber. La

cantidad de pectinas de la fracción PAW extraída con el protocolo de Redgwell

oscilaba alrededor de los 13 mg por cada 100 mg de fruto, siendo superior la cantidad
71
 Capítulo 4

de pectinas obtenida con el protocolo de Huber modificado, en torno a 30 mg

AU/100mg de fruto.

En la Figura 4.4 se representa la cantidad de ácidos urónicos referida a 100 mg

de pared celular, en las tres fracciones de pared evaluadas.

16
R
14 H
a
HM
12
mg AU / 100 mg PC

10
b a
8

6 a
a
4 a
a
a
a
2

0
AGUA CDTA CARBONATO

Figura 4.4
4.4: Cantidad de pectinas en el fraccionamiento de la pared celular (PC). Expresada
en mg de ácidos urónicos (AU) por 100 mg de pared celular. R corresponde al protocolo de
Redgwell, H al de Huber y HM,
HM al de Huber modificado. En la comparación de los tres
protocolos, para cada fracción, los valores medios no fueron significativamente diferentes si
comparten la misma letra, según un análisis de ANOVA y Test HSD de-Tukey, con un límite de
confianza de 95%.

Con el protocolo de Redgwell y el de Huber modificado no se apreciaron

diferencias significativas en la fracción solubilizada con agua y los valores rondaban

los 2 mg de ácidos urónicos por cada 100 mg de pared celular. Con el protocolo de
Huber, el contenido péctico de la fracción AGUA era mayor, alcanzando los 7,40 ±
1,06 mg AU por 100 mg de pared celular, lo que muy probablemente se debe a que
este fraccionamiento no emplea el paso previo con PAW que solubiliza pectinas en los

otros dos métodos. De hecho, estas diferencias se minimizan si se comparan los tres

72
 Elección del protocolo

protocolos usando la suma de la fracción PAW y la de AGUA, ambas representativas

de las pectinas más solubles (nada o muy débilmente ligadas a la pared celular).

En la fracción péctica soluble en CDTA no se observaron diferencias

significativas entre los tres protocolos, con un rango comprendido entre los 4 mg

AU/100mg de pared celular con Huber modificado y los casi 8 mg obtenidos

empleando el protocolo de Huber. A pesar de no existir diferencias estadísticas debido

a la gran desviación, se observó de forma consistente la tendencia de una menor

presencia péctica usando la modificación del protocolo de Huber.

En la fracción soluble en CARBONATO, no se encontraron diferencias

significativas entre los protocolos, con valores medios en torno a los 2 mg de ácidos

urónicos por cada 100 mg de pared celular.

Los resultados obtenidos nos llevaron a descartar la modificación del protocolo

de Huber debido a su bajo rendimiento a la hora de obtener pared celular y a que el

fraccionamiento posterior de esa pared no mostró ningún beneficio con respecto a los
otros dos protocolos.

4.3 Contenido de elementos esenciales en las paredes obtenidas

El contenido de distintos elementos esenciales se estimó en las paredes

celulares obtenidas con los protocolos de Redgwell y Huber y los resultados se

muestran en la Figura 4.5 A para los más abundantes, como son el oxígeno, carbono,
hidrógeno y nitrógeno, y en la Figura 4.5 B para el boro, calcio, potasio, magnesio y

sodio que son menos abundantes.

73
 Capítulo 4

50
A R
H
40

mg/100 mg PC 30

20

10

0
C O H N
6
B * R
5 H

4
mg/g PC

*
3

2 *
*
1
*

0
B Ca K Mg Na

Figura 4.5
4.5: Abundancia de elementos esenciales de la pared celular extraída con el protocolo
de Redgwell y con el de Huber. A: Contenido en C, O, H y N, expresado en mg por 100 mg de
pared celular. B: Contenido en B, Ca, K, Mg y Na, expresado en mg por g de pared celular. En
la comparación de los dos protocolos, para cada elemento, el asterisco indica que fueron
significativamente diferentes, según un análisis de t-Student, con un límite de confianza del
95%.

Como se puede observar, el contenido de los cuatro elementos más abundantes

es similar en los dos protocolos pero la presencia de los elementos metálicos es

superior en el caso del protocolo de Huber. Según Huber (1991), el tratamiento con
PAW puede llegar a reducir de un 35 a un 40% el contenido de calcio de la pared

celular. En la gráfica 4.5 B observamos que en la muestra obtenida con el protocolo de

Redgwell, el calcio tiene un valor próximo a 2,1 mg/g de pared celular y en el obtenido

74
 Elección del protocolo

con el protocolo de Huber de 5,29 ± 0,09 mg/g de pared, lo que concuerda con los

valores obtenidos por Huber (1991). Observamos también una reducción importante
de la cantidad extraída con el protocolo de Redgwell respecto al de Huber en el

potasio, magnesio y sodio, no evaluados por Huber (1991). El paso de extracción con

PAW, a pH relativamente bajo, parece facilitar la extracción de parte de estos

elementos que se encuentran como cationes en la pared celular y disminuyendo, por

tanto, su contenido en el residuo seco de pared obtenido con el protocolo de Redgwell.

4.4.
.4.- Cromatografía de filtración en gel de las fracciones de pared celular

La cromatografía de filtración en gel proporciona una estimación de la masa

molecular de los polímeros o grupos de polímeros más representados en las distintas

fracciones. Es una técnica usada por distintos autores para caracterizar las fracciones

(Brummell y col., 1999; Rosli y col., 2004) pero requirió de una fase de optimización
para aplicarla al material procedente de fruto de fresa. Inicialmente se utilizaron
columnas de longitud considerable (95 cm de altura y un diámetro de 0,8 cm) pues
eran las que estaban descritas en la bibliografía para este uso (Redgwell y col., 1997b;

Rose y col., 1998). Se utilizaron dos tipos de geles para las columnas con diferente
rango de fraccionamiento de masas moleculares.

Recordamos que, en el caso de las pectinas de las fracciones solubles, las

fracciones PAW y AGUA se separaron por cromatografía en columnas que contenían
el gel de Sepharosa CL-6B que separa polímeros con un tamaño comprendido entre

los 10 y 1.000 KDa. Para las pectinas obtenidas en las fracciones de CDTA y
CARBONATO, se usaron las columnas con Sepharosa CL-2B, que discrimina
polímeros con tamaño comprendido entre los 100 y 20.000 KDa.

75
 Capítulo 4

4.4.1.
.4.1.- Perfiles cromatográficos de las pectinas solubles (fracción PAW y fracción
AGUA)
AGUA)

Los perfiles de pectinas más solubles, los más fácilmente extraíbles de la pared

celular, se muestran en la Figura 4.6. Los dos primeros cromatogramas (4.6 A y 4.6 B)

corresponden a pectinas extraídas aplicando el protocolo de Redgwell. El primero, en

concreto, pertenece a la fracción PAW (Figura 4.6 A) y en él aparecen dos bloques

bien definidos de azúcares. El de mayor masa molecular, que eluye entre los 65 y 100

ml, corresponde con un componente péctico, como pone en evidencia su coincidencia

con el perfil de ácido galacturónico. Este primer pico contiene polímeros cuya masa
molecular hace que se queden en el volumen de vacío de esta columna donde eluye el

azul de dextrano de 2.000 KDa. El resto del perfil está constituido por polisacáridos no
pécticos que se distribuyen por un amplio rango de la columna.

En la fracción AGUA extraída mediante el protocolo de Redgwell (Figura 4.6 B)

se observó que las pectinas eluían en un amplio rango de la columna y que el perfil
era paralelo al de azúcares totales lo que indican que estos azúcares probablemente
son pectinas. El volumen al que eluyen estas pectinas muestran que son de menor

masa molecular que las presentes en la fracción PAW, ya que eluyeron entre los 110 y
los 180 ml, correspondiendo la zona del pico de esta fracción a una masa molecular

próxima a los 12 KDa.

La fracción de AGUA extraída mediante el protocolo de Huber (Figura 4.6 C)

presentó un bloque de azúcares que se correspondían con pectinas al inicio de la

columna; estos polímeros presentaban un pico en torno a los 80 KDa. Al final de la

columna se observan azúcares de menor tamaño molecular (entre los 160 y los 180
ml) que no estaban formados por ácido galacturónico.

76
 Elección del protocolo

0,30
A AU
AZU
0,25

Absorbancia
0,20

0,15

0,10

0,05

B AU
40 60 80 100 120 140 160 180
AZU
0,25
Vol (ml)
0,20
Absorbancia

0,15

0,10

0,05

C 60 80 100 120 140 160 180AU

0,25 AZU

0,20
Absorbancia

0,15

0,10

0,05

0,00
40 60 80 100 120 140 160 180 200

Volumen (ml)

Figura 4.6.
4.6. Perfiles cromatógraficos de las pectinas solubles.. A:
A Perfil cromatográfico de la
fracción PAW extraída con el protocolo de Redgwell. B: Perfil de la fracción AGUA extraída
mediante el protocolo de Redgwell. C: Cromatografía de la fracción AGUA extraída con el
protocolo de Huber En color gris se representan las medidas de azúcares, en color morado y
verde las de ácidos urónicos. Las absorbancias de los ácidos urónicos se miden a una longitud
de onda de 515 nm y los azúcares a 450 nm. Las flechas indican el volumen al que eluyeron
los estándares de pesos moleculares: azul de 2.000 KDa, rosa de 80 KDa, verde de 12 KDa.

77
 Capítulo 4

Las diferencias comentadas quedan patentes en una sola figura de forma más

clara, representando juntos los perfiles de ácido galacturónico de las fracciones PAW y
AGUA extraídas con el protocolo de Redgwell y comparándolos con el de Huber para

la fracción AGUA (Figura 4.7). Las tres fracciones se diferencian en sus componentes

pécticos de una manera clara. Las pectinas de mayor tamaño se detectan en la

fracción PAW (con un pico en torno a los 2.000 KDa) y las más pequeñas proceden de

la fracción de AGUA extraída con el protocolo de Redgwell con un pico de masa

molecular próxima a los 12 KDa. Las pectinas de la fracción AGUA extraídas con el
protocolo de Huber se encontrarían en una zona intermedia, con el pico próximo a una

masa molecular de 80 KDa, siendo el perfil bastante más suave y redondeado lo que
puede interpretarse como una evidencia de degradación que ha provocado que los
polímeros pécticos solubles de mayor tamaño no se detecten con este protocolo
porque posiblemente hayan sido parcialmente procesados, desplazando el perfil a la

derecha.

1,2
PAW-R
AGUA-R
1,0 AGUA-H
Absorbancia (515 nm)

0,8

0,6

0,4

0,2

0,0
40 60 80 100 120 140 160 180 200

Volumen (ml)

Figura
Figura 4.7
4.7: Perfil cromatográfico de las fracciones PAW y AGUA extraídas con el protocolo de
Redgwell y Huber. Se representan las medidas de ácidos urónicos (relativizados) (en verde el
correspondiente al protocolo de Redgwell y en morado a protocolol de Huber). Las flechas
indican las masas moleculares correspondientes a los tres estándares con los que se calibró la
columna: azul de 2.000 KDa, rosa de 80 KDa y en verde el de 12 KDa.

78
 Elección del protocolo

Mediante el protocolo de extracción de Redgwell fue por tanto posible solubilizar

pectinas de gran tamaño que se extraían con el PAW y otras más pequeñas y más
entremezcladas con la pared, extraídas con el agua. Con el protocolo de Huber, al no

tener fracción similar al PAW, se extraían todas esas pectinas con el agua, y lo que se

obtenía era un perfil intermedio que parecía ser una mezcla de las pectinas extraídas
con Redgwell, pero donde estaban ausentes las pectinas de elevada masa molecular

extraídas con el PAW. Este resultado sugiere la posibilidad de una peor preservación

de ese componente péctico cuando se usa el procedimiento de Huber.

4.4.2.-
.4.2.- Perfiles de pectinas unidas iónicamente (fracción CDTA)

El CDTA es un agente quelante de calcio que acaba retirando este catión de los
enlaces iónicos que unen cadenas de pectinas posibilitando una solubilización de

éstas, a las que nos referimos como iónicamente unidas a la pared.

Se observó en la fracción CDTA extraída con la metodología de Redgwell

(Figura 4.8 A) que los perfiles de azúcares y de ácidos urónicos fueron muy similares,
por lo que se trataría de una fracción compuesta mayoritariamente por pectinas. Sólo

se observó una pequeña fracción de azúcares de pequeño tamaño cuyo perfil no

coincidía con el péctico en la zona de bajo peso molecular del cromatograma. Se

podría decir que el grueso de esta fracción se corresponde con pectinas mayores de
2.000 KDa que eluyen de la columna entre los 75 ml y los 140 ml.

En la fracción CDTA extraída con el protocolo de Huber (Figura 4.8 B) se

observó que, al igual que en el caso anterior, que la primera parte del perfil
correspondía con polímeros de naturaleza péctica y al final de la columna eluían
azúcares de menor masa molecular. La mayoría de las pectinas de esta fracción son

pectinas mayores de 2.000 KDa.

79
 Capítulo 4

0,20 A AU
AZU

Absorbancia 0,15

0,10

0,05

B60 80 100 120 140 160 180 200

AU
0,3 AZU
Vol (ml)
Absorbancia

0,2

0,1

0,0
40 60 80 100 120 140 160 180 200 220

Volumen (ml)

Figura
Figura 4.8
4.8: Perfiles cromatográficos de la fracción CDTA. A: Perfil obtenido de la fracción
extraída con el protocolo de Redgwell. B: Perfil obtenido con el protocolo de Huber. En línea de
color gris se representa el perfil correspondiente a los azúcares y en color morado y verde los
ácidos urónicos. En ambos perfiles, la flecha indica el volumen de elución correspondiente al
estándar de 2.000 KDa. Las absorbancias de los ácidos urónicos se miden a una longitud de
onda de 515 nm y los azúcares a 450 nm.

La representación en el mismo gráfico de los dos perfiles pécticos (Figura 4.9)

permite concluir que el perfil correspondiente al protocolo de Redgwell está algo

desplazado a la izquierda y, por ello, más enriquecido en polímeros de mayor masa

molecular; además el perfil es algo más estrecho. Ambas observaciones pueden

indicar una mayor degradación de las pectinas con la extracción de Huber.

80
 Elección del protocolo

1,2
AU-R
AU-H
1,0

Absorbancia (515 nm)

0,8

0,6

0,4

0,2

0,0
40 60 80 100 120 140 160 180 200 220

Volumen (ml)

Figura
Figura 4.9
4.9: Perfil cromatográfico de los ácidos urónicos (relativizados) de la fracción CDTA
extraída con el protocolo de Redgwell (AU-R) y Huber (AU-H). Se representan las medidas de
ácido urónico (en verde la del protocolo de Redgwell y en morado la de Huber). La flecha indica
el volumen de elución correspondiente al estándar de 2.000 KDa.

El conjunto de resultados obtenidos hasta aquí, junto al hecho que el protocolo

de Redgwell se había utilizado por otros autores en fresa (Redgwell y col., 1997b; Lara
y col., 2004) nos llevó a la adopción del protocolo de Redgwell para la extracción de

las paredes celulares de nuestros frutos de fresa.

4.5.
.5.- Muestras de pectinas unidas covalentemente (fracción CARBONATO)

Inicialmente tuvimos problemas de solubilización de la fracción extraída con

carbonato sódico lo que nos impedía separarla mediante cromatografía de filtración en

gel. Ensayando distintas posibilidades concluimos que el problema era el pH

relativamente bajo del tampón acetato (pH 5,0) y que se conseguiría una buena
solubilización a pH superiores. En concreto, con tampón TRIS-HCl (pH 8,4) se
consiguió una mejor solubilización de la fracción CARBONATO sin interferir en la
medida de los ácidos urónicos presentes en las muestras. La fracción CARBONATO
había sido menos estudiada y caracterizada por cromatografía de filtración en gel en

81
 Capítulo 4

trabajos previos y el hecho de la menor presencia de pectinas en ella también

dificultaba su detección al diluirse la muestra en las columnas. Esto nos llevó a tener
que optimizar las condiciones de análisis cambiando también el volumen de las

columnas. Ensayamos en columnas de 25 ml y se probó su comportamiento con

estándares con los dos geles disponibles, usando como tampón de elución TRIS-HCl
(pH 8,4). Como estándar se empleo el azul de dextrano de 2.000 KDa. En este caso

se mide la absorbancia del azul directamente a 630 nm ya que el dextrano comercial

tiene color azul con un pico de absorbancia en esta longitud de onda. Con la
Sepharosa Cl-6B se obtuvo el perfil que se muestra en la Figura 4.10 A.

0,4
A
Absorbancia (630 nm)

0,3

0,2

0,1

B 10 20 30
Absorbancia (630 nm)

Vol (ml)
0,15

0,10

0,05

0,00
5 10 15 20 25 30 35 40

Volumen (ml)

Figura 4.10
4.10 Perfiles obtenidos para el azul de dextrano en columnas de 25 ml con el tampón
de elución TRIS pH 8,4. La figura A: con el gel de Sepharosa CL6B y la B: con Sepharosa CL-
2B.

82
 Elección del protocolo

El azul de dextrano eluyó en un volumen de 14 ml en la columna con Sepharosa

CL6B (Figura 4.10 A) y en el caso de la columna de 25 ml con Sepharosa Cl-2B, el

estándar de 2.000 KDa salía a los 26,5 ml (Figura 4.10 B).

El siguiente paso fue separar por cromatografía las muestras de la fracción

CARBONATO en ambas columnas (Figuras 4.11 y 4.12). El perfil en la columna con

Sepharosa CL-6B, mostrado en la Figura 4.11, fue muy parecido al obtenido con el

estándar de 2.000 KDa e indicaba que los polímeros presentes en esta fracción tenían

una masa molecular mayor de 2 millones de Daltons y eluían mayoritariamente en el

volumen de vacío de la columna en torno a los 14 ml.

0,6
Absorbancia (515 nm)

0,4

0,2

0,0
10 20 30 40

Volumen (ml)

Figura 4.11
4.11:
11 Perfil cromatográfico en columna de 25 ml con gel de Sepharosa CL6B de los
ácidos urónicos de una muestra de CARBONATO. La flecha indica el volumen de elución del
estándar de 2.000 KDa.

Cuando se utilizó el gel de Sepharosa Cl-2B observamos que gran parte de la

muestra eluyó antes del estándar de 2.000 KDa, (Figura 4.12) indicando así, la
presencia de polímeros de masa molecular muy superior a los 2.000 KDa,

detectándose al menos dos picos anteriores al pico del estándar.

83
 Capítulo 4

0,14

0,12

Absorbancia (515 nm)

0,10

0,08

0,06

0,04

0,02

0,00
0 10 20 30 40 50

Volumen (ml)

Figura 4.12
4.12:
12 Perfil cromatográfico en columna de 25 ml con gel de Sepharosa CL2B de los
ácidos urónicos de una muestra de CARBONATO. La flecha indica el volumen de elución del
estándar de 2.000 KDa.

El buen comportamiento observado en estas columnas de menor tamaño al

optimizar las condiciones de análisis de esta fracción nos llevó a probar su uso y
generalizarlo al resto de fracciones. Ello supuso un ahorro importante de tiempo,
material y cantidad de muestra, además de proporcionar una resolución suficiente para
la comparación de las distintas fracciones y muestras.

4.6.
.6.- Mejoras ulteriores del protocolo de extracción

La aplicación del protocolo de extracción de Redgwell a distintos estadios de

desarrollo y la realización posterior de cromatografías puso en evidencia ciertas
discrepancias en los resultados obtenidos en las fracciones solubles (PAW y AGUA)

difíciles de interpretar. En concreto, se detectó un pico de pectinas presente en la

muestra de PAW proveniente de fruto en estadio verde que no aparecía en las

muestras de PAW en estadio rojo. En la fracción AGUA del estadio verde también se
observó un pico de masa molecular algo inferior. Se realizó una extracción de pared

84
 Elección del protocolo

celular y posterior fraccionamiento pero evitando con cuidado la presencia de los

aquenios del fruto. Al realizar las cromatografías con esta precaución comprobamos
que el pico mencionado de la fracción PAW desaparecía (Figura 4.13 A), ocurriendo

algo similar también ocurría con la fracción AGUA (Figura 4.13 B).

1,2
A PAW Sin Aquenios
PAW Con Aquenios
1,0
Absorbancia (515 nm)

0,8

0,6

0,4

0,2

0,0
10 20 30 40
B
Vol (ml)
AGUA Sin Aquenios
1,0
AGUA Con Aquenios
Absorbancia (515 nm)

0,8

0,6

0,4

0,2

0,0
5 10 15 20 25 30 35 40 45

Volumen (ml)

Figura 4.13.
4.13. Perfiles cromatográficos de ácidos urónicos de muestras en estadio verde. A:
Cromatografía de ácidos urónicos de la fracción PAW. B: Cromatografía de ácidos urónicos de
muestras de la fracción AGUA. En línea continua representa las muestras sin los aquenios y en
línea discontinua las muestras con los aquenios.

En el resto de fracciones, ni en el estadio verde ni en rojo, se observaron

diferencias al comparar cromatogramas de las extracciones con y sin aquenios. De
cualquier modo, el hecho de que si se observaran diferencias en las dos fracciones

85
 Capítulo 4

mencionadas hace necesario una eliminación cuidadosa de los aquenios a la hora de

extraer la pared de los frutos.

4.7.
.7.- Discusión

Desde un punto de vista cuantitativo, los rendimientos de extracción de pared

celular y de las distintas fracciones son parecidos con los protocolos de extracción de

Redgwell y de Huber. Tampoco se observan diferencias en la cantidad de pectinas

presentes en estas fracciones. Donde observamos una caída notable en los

rendimientos de extracción fue al modificar el protocolo de Huber incorporando al

principio de la extracción un paso similar al PAW de Redgwell. Este bajo rendimiento

en la obtención de pared celular fue probablemente debido a que se incluyó una
filtración adicional que, además de ser instrumentalmente complicada, produjo una
importante pérdida de material. La disminución en el rendimiento es muy evidente y

afecta a todas las fracciones en lo que se refiere a la cantidad extraída. Si bien,

cuando se parte de la misma cantidad de pared las diferencias entre la modificación

propuesta y el protocolo de Huber se suavizan, a excepción de la fracción AGUA, que

es menor, debido a que ya se había obtenido con la filtración previa. Esto nos llevó a
descartar la modificación que ensayamos para el protocolo de Huber.

Desde un punto de vista cualitativo, los perfiles cromatográficos mostraron

algunas diferencias entre las fracciones obtenidas con los protocolos de Huber y
Redgwell. Con relación al tamaño de los polímeros más solubles de la pared

encontramos polímeros de diferente tamaño (Figura 4.7), unas pectinas de alto peso
molecular que se extraen con el PAW muy solubles y otras que muestran una menor

masa molecular media y algo más de interacción con la pared, extraídas con agua.
Con el protocolo de Huber, al no tener fracción similar al PAW, se extraen todas esas
pectinas con agua, y lo que se obtiene parece ser una mezcla de las pectinas
extraídas con el protocolo de Redgwell, ya que tienen un tamaño intermedio aunque la

forma de los cromatogramas pueda interpretarse en el sentido de que las pectinas

86
 Elección del protocolo

solubles de mayor masa molecular extraídas con el protocolo de Huber están algo

despolimerizadas.

Las pectinas unidas iónicamente, están formadas por polímeros que

mayoritariamente superan los 2.000 KDa (Figuras 4.8 y 4.9), observándose que los

que se han obtenido con el protocolo de Huber están desplazados hacia el marcador
de los 2.000 KDa respecto a la fracción extraída con el protocolo de Redgwell,

indicando que son polímeros más pequeños que los extraídos con el protocolo de

Redgwell. Ello, junto a la forma del perfil, puede interpretarse también en el sentido de
una mayor despolimerización en las fracciones provenientes de las paredes celulares
extraídas siguiendo el protocolo de Huber.

Con estos datos, podemos decir que el protocolo de extracción de Redgwell

parece evitar algo la degradación de las pectinas. La inactivación de enzimas

hidrolíticas de la pared (Rose y col., 1998) parece ser más efectiva con este protocolo
que con el de Huber en nuestras condiciones de trabajo. Atendiendo a este hecho y a
que existían trabajos previos de fresa que incluían fraccionamientos parecidos al de
Redgwell (Koh y Melton, 2002) se decidió adoptar este método como protocolo de

extracción de paredes celulares para nuestro material.

En el momento de inicio del trabajo había pocos trabajos que realizaran análisis

cromatográficos de la fracción CARBONATO, probablemente debido a la dificultad de

solubilización de esta fracción. Por ello, se ha puesto a punto una metodología
consistente en solubilizar la fracción CARBONATO en tampón alcalino (tampón TRIS-

HCl a pH 8,4) y usar este mismo tampón para las columnas de cromatografía.
También se cambió el tamaño de las columnas, optando por un menor tamaño de
columna que mantiene una resolución suficiente de picos, que abarata y acorta

temporalmente el trabajo. Siendo este método el empleado ahora de modo estándar

en el laboratorio.

En cuanto a los elementos esenciales, a los mayoritarios que forman la

estructura molecular de los constituyentes básicos de la pared celular (C, H, O y N) no

les afecta el que se use un protocolo u otro, debido a que prácticamente no varían en

87
 Capítulo 4

cantidad. En cuanto a los elementos esenciales minoritarios sí que se observa una

disminución importante de los extraídos con el protocolo de Redgwell, respecto al de

Huber, especialmente los que se encuentran en forma de cationes en la pared (Ca,

Mg, K, Na). Según Huber (1991), el pH de la solución PAW, en torno a 1,3 sería lo

suficientemente bajo como para desplazar el calcio de la pared, por lo que su adición
durante la extracción de la pared celular puede ocasionar una reducción del 35 al 40%

del calcio en la misma. Es muy probable que sea este mismo efecto el que explique la

significativa disminución del resto de cationes.

Otro aspecto a tener en cuenta a la hora de comenzar la extracción de la pared

celular es la eliminación de los aquenios del fruto ya que se observó que producen

interferencias en los cromatogramas de las fracciones de pectinas más solubles (PAW

y AGUA) que mostraban picos que no podíamos explicar. Esto ocurría sobretodo en

fruto verde donde la presencia de aquenios es más representativa por peso de fruto.
Por eso recomendamos su eliminar cuidadosamente los aquenios antes de comenzar
la extracción.

88
  

CAPÍTULO 5.
Efecto de la maduración en la degradación
de las paredes celulares del fruto de fresa
  
 Maduración

5.-
5.- Efecto de la maduración en la degradación de las paredes
celulares del fruto de fresa.

Durante la maduración de los frutos, las paredes de las células parenquimáticas

sufren modificaciones que alteran su composición y sus propiedades mecánicas. Entre

otras, cabe destacar la disminución de la adhesión celular como resultado de la

disolución de la lámina media. Esto junto a diversas modificaciones en la pared

primaria resulta a nivel macroscópico en el reblandecimiento del fruto.

Buena parte de estas modificaciones son el resultado de la acción de enzimas de

pared, que actúan in muro provocando lo que se conoce como “desmantelamiento” de

la pared celular. Son especialmente notables los cambios provocados por la actuación
de enzimas pectinolíticas en la fracción péctica de la pared, que es cuantitativamente

la mayoritaria en muchos frutos maduros. Entre las consecuencias de estas

modificaciones resulta bastante frecuente la mención a la “solubilización” de las
pectinas. Con este término se hace referencia a la liberación de “bloques” de

polímeros pécticos que dejan de formar parte de la matriz sólida, entretejida mediante
enlaces de diversa índole con el resto de componentes de la pared, y pasan a la fase
soluble del apoplasto. También se mencionan como causas del reblandecimiento, la
despolimerización de las pectinas y de la matriz de glucanos, junto a la pérdida de
azúcares neutros de las cadenas laterales de las pectinas (Brummell, 2006). Más

recientemente, se ha sugerido que la integridad estructural de la red de xiloglucanos

podría ser importante durante el reblandecimiento del fruto (Mercado y col., 2011).
También se ha observado que el grado de hinchamiento in vivo e in vitro de la pared
celular se incrementa en fruto rojo respecto a fruto verde, lo que se suele relacionar

con un incremento del tamaño del poro que ocurre durante el proceso de
desmantelamiento ordenado que sufre, la pared celular (Redgwell y col., 1997b).

El objetivo de este capítulo de la tesis es documentar los cambios que sufre la

matriz péctica durante la maduración del fruto de fresa usando para ello la
comparación de las paredes obtenidas de frutos verdes pequeños con las que

provienen de fruto rojo. Es decir, compararemos la composición y características de

91
 Capítulo 5

las paredes y de su componente péctico de frutos en estadio inmaduro con las de

frutos maduros.

5.1 Extracción de pared celular y fraccionamiento

Los resultados mostraron que el contenido en pared celular disminuye

significativamente durante la maduración cuando se compararon los estadios verde y
rojo (Figura 5.1 A) con un rendimiento aproximado a 8 g de pared por 100 g de fruto

verde y unas ocho veces menos en fruto rojo.

12
FRUTOVERDE
A
g fracción / 100 gfruto

FRUTO ROJO
10
*
8

0
PC

1,4
B * FRUTO VERDE
1,2 FRUTO ROJO
g Fracción / 100 g fruto

1,0 **

0,8

0,6

0,4

0,2

0,0
PAW AGUA CDTA CARBONATO KOH1M KOH 4M

Figura 5.1.
5.1 Cantidad de fracción expresada en g por 100 g de fruto. A: Gramos de pared
celular por 100 g de fruto en estadio verde y en estadio rojo. B: Gramos de fracción por 100 g
de fruto. Para cada fracción, el asterisco indica que se han encontrado diferencias significativas
entre ambos estadios, según un análisis de ANOVA y Test HSD de-Tukey, con un límite de
confianza de 95%.

92
 Maduración

También se observó que todas las fracciones de pared celular tienden a ser

menores en las paredes de fruto rojo (Figura 5.1 B). Así, el rendimiento de la fracción

PAW procedente de fruto verde tuvo un valor de 0,3 ± 0,04 g por 100 g de fruto y el de
fruto rojo 0,2 ± 0,03 g por 100 g de fruto, sin llegar a ser estas diferencias

significativas. La cantidad de la fracción AGUA fue similar en ambos estadios, en fruto

verde mostró un valor de 0,14 ± 0,03 y en fruto rojo de 0,13 ± 0,04 g por 100 g de
fruto. La fracción más abundante es la fracción CDTA, especialmente en fruto verde,

con una valor de 1,09 ± 0,18 g/100 g fruto mientras que en fruto rojo alcanza los 0,29 ±

0,046 g/100 g. En la fracción CARBONATO también se aprecia una disminución

significativa, el valor alcanzado en fruto verde es de 0,65 ± 0,24 g/100 g fruto, mientras
que en fruto rojo es de 0,13 ± 0,018 g/100 g fruto. Las fracciones solubles en KOH 1M

y 4M son las menos abundantes, en fruto rojo la cantidad obtenida se aproxima a los
0,05 g por 100 g fruto en ambos casos. En el fruto verde, la cantidad de fracción

obtenida oscila entre los 0,2 g/ 100 g fruto del KOH 1M y los aproximadamente 0,1 g/
100 g fruto en el caso del la fracción KOH 4M, sin que estas diferencias lleguen a ser
estadísticamente significativas. En términos generales, el que la cantidad de las
distintas fracciones por peso de fruto sea inferior en fruto rojo es consecuencia directa

de la menor cantidad de pared.

De hecho, al estimar los rendimientos de las fracciones de pared celular

respecto a la cantidad de pared celular inicial se observa un incremento generalizado

de las distintas fracciones en el estadio rojo (Figura 5.2).

93
 Capítulo 5

40

* FRUTO VERDE

mg fracción/100 mg PC
FRUTO ROJO
30

20
*

10

0
AGUA CDTA CARBONATO KOH 1M KOH 4M

Figura 5.2. Rendimiento en las fracciones de pared celular expresada como mg de fracción
por 100 mg de pared celular. Para cada fracción, el asterisco indica que se han encontrado
diferencias significativas entre ambos estadios, según un análisis de ANOVA y Test HSD de-
Tukey, con un límite de confianza de 95%.

La fracción AGUA en fruto verde tiene un valor muy bajo de 1,85 ± 0,39 mg/100
mg de pared celular, siendo estadísticamente inferior que en el estadio rojo en el que
alcanzan los 13,33 ± 4,01 mg por 100 mg de pared celular. La fracción CDTA sigue
siendo la mayoritaria, observamos en fruto verde un valor de 14,0 ± 2,40 y en fruto rojo
prácticamente el doble, 29,26 ± 4,62 mg/100 mg de pared celular, siendo estas
diferencias significativas. En las fracciones unidas covalentemente, vemos que en
estadio verde se obtienen alrededor de 8 mg /100 mg de pared celular y en el rojo
alcanza los 13 mg/100 mg de pared. Las fracciones KOH 1M y 4M son las más

escasas, llegando en fruto verde a los 2,5 ± 0,89 y aproximadamente 1 mg/100 mg de

pared y en fruto rojo en torno a los 4,4 mg/100 mg de pared celular en ambas
fracciones. Las diferencias encontradas en las fracciones CARBONATO, KOH 1M y

KOH 4M, no fueron estadísticamente significativas.

Se confirma así un aumento en la cantidad de pectinas en las fracciones,

AGUA y CDTA en estadio rojo. Además, la fracción CDTA es la más abundante en
ambos estadios y las dos fracciones de hemicelulosa las menos abundantes.

94
 Maduración

5.2 Cantidad de poliurónidos obtenidos

Los protocolos de Van den Hoogen (1998) y Dubois y col. (1956) permitieron

estimar la cantidad de ácidos urónicos y de azúcares totales, respectivamente, en las

distintas fracciones obtenidas, tal como se describe en el Capítulo 3 “Material y

Métodos”.

5.2.1.-
.2.1.- Cantidad de ácidos urónicos

En los frutos en estadio rojo, observamos en todas las fracciones una

disminución en la cantidad de pectinas obtenidas referidas a 100 g de fruto, siendo las

diferencias estadísticamente significativas en todos los casos. Esto se debe de nuevo

a la menor cantidad de pared celular por peso fresco de fruto observada en estadio
rojo. Así en la fracción AGUA se produce una disminución de 67,81 ± 7,44 mg AU/100
g de fruto a los 51,24 ± 7,32 mg AU/100 g de fruto que presenta en rojo (Figura 5.3 A).

Los mayores descensos son en la fracción CDTA, que pasa de tener en fruto verde
alrededor de 150 mg de AU/100 g fruto a sólo 57 mg/100 g fruto en rojo, y en la
fracción CARBONATO que baja prácticamente un 75%. Lógicamente el contenido
péctico de las fracciones KOH son los menos abundantes pero también encontramos
una reducción de pectinas estadísticamente significativa en los frutos rojos.

95
 Capítulo 5

200
A *
FRUTO VERDE
* FRUTO ROJO

150

mg AU /100 g Fruto 100

*

50 *
*

0
AGUA CDTA CARBONATO KOH 1M KOH4M

10
B
FRUTO VERDE
FRUTO ROJO
8
*
mg AU / 100 mg PC

*
2
*

0
AGUA CDTA CARBONATO KOH 1M KOH4M

Figura 5.3. Cantidad de ácidos urónicos en las fracciones de pared celular. A: Ácidos
urónicos expresados como mg por 100 g de fruto. B: Ácidos urónicos en mg relativizados por
100 mg de pared celular. Para cada fracción, el asterisco indica que se han encontrado
diferencias significativas entre ambos estadios, según un análisis de ANOVA y Test HSD de-
Tukey, con un límite de confianza de 95%.

Al representar los datos de ácidos urónicos referidos a 100 mg de pared celular

(Figura 5.3 B) se pone de manifiesto que en estadio maduro todas las fracciones se

enriquecen en el componente péctico, siendo la presencia de ácido urónico

lógicamente mayor en las fracciones pécticas (AGUA, CDTA y CARBONATO). En la
fracción AGUA encontramos un aumento que es estadísticamente significativo durante
la maduración del fruto pasando de 0,87 ± 0,09 mg de AU por 100 mg de pared celular
en estadio verde a 5,25 ± 2,05 mg de AU /100mg de pared celular del estadio rojo. La
misma tendencia se observa en las fracciones CDTA y CARBONATO, con

96
 Maduración

incrementos en torno al 100% en ambas, pero la variabilidad entre muestras hace que

estas diferencias no sean estadísticamente significativas. Las dos fracciones

enriquecidas en el componente hemicelulósico, KOH 1M y 4M, también muestran un

aumento muy significativo de ácidos urónicos por contenido de pared celular que,

prácticamente, en un caso quintuplica y en el otro cuadruplica el contenido observado

en fruto verde

5.2.2.-
.2.2.- Cantidad
Cantidad de azúcares totales.

Como muestra la figura 5.4 A se observa una disminución generalizada en fruto

rojo en la cantidad de azúcares referida a peso de fruto con la maduración del fruto. En
la fracción más soluble, (fracción AGUA), se pasa de 180,34 ± 23,46 a unos 55 mg de

azúcares por 100 g de fruto tras la maduración. Encontramos también una disminución
significativa en las fracciones KOH 1M y 4M, pasando de 231,13 ± 99,53 en paredes

del fruto verde a 84,42 ± 13,28 mg de azúcares por 100 g de fruto en rojo en el caso
de KOH 1M, mientras que en la fracción KOH 4M disminuye drástica y
significativamente; en estadio verde pasa de tener 738,90 ± 315,63 a 60,13 ± 7,96 mg
por 100 mg de estadio rojo. Al igual que ocurría con el caso de los ácidos urónicos,

esta tendencia generalizada de disminución del contenido de azúcares por peso fresco
en las fracciones de fruto rojo se debe al hecho de que la cantidad de pared celular

extraída por peso de fruto es muy inferior en el estadio maduro.

97
 Capítulo 5

1200 A FRUTO VERDE

FRUTO ROJO
*
*
1000

mg AZU/100 g Fruto
800

600
*

400
*
*
200

0
AGUA CDTA CARBONATO KOH1M KOH4M

16
B FRUTO VERDE
14 FRUTO ROJO

12
mg AZU / 100g PC

*
10

8
*
6

0
AGUA CDTA CARBONATO KOH 1M KOH4M

Figura 5.4.
5.4. Cantidad de azúcares totales en las distintas fracciones de pared celular. A:
Azúcares expresados como mg por 100 g de fruto. B: Azúcares expresados como mg por 100 g
de pared celular. Para cada fracción, el asterisco indica que se han encontrado diferencias
significativas entre ambos estadios, según un análisis de ANOVA y Test HSD de-Tukey, con un
límite de confianza de 95%.

De hecho, cuando se normalizan los datos de medida de azúcares a la cantidad

de pared celular inicial, observamos que sólo las fracciones consideradas

hemicelulósicas (KOH 1M y 4M) muestran un incremento en estadio rojo frente al

verde inmaduro (Figura 5.4 B). En ambas fracciones el contenido de azúcares
prácticamente se duplica en fruto rojo.

98
 Maduración

5.3 Elementos esenciales rojo/verde

El análisis de los elementos esenciales mayoritarios (O, C, H y N) en frutos en

estadio verde y rojo no mostró diferencias significativas relativas a la maduración

(Figura 5.5 A), así, encontramos que el oxígeno (con un 44%) y el carbono (40%) son
los elementos más abundantes en la pared celular y el hidrógeno (7%) y el nitrógeno
(1,3%) presentan menor abundancia.

60
A FRUTO VERDE
FRUTO ROJO
50
g / 100g Pared celular

40

30

20

10

0
O C H N
5
B FRUTO VERDE
* FRUTO ROJO
4
mg/g PC

1
* *
* *
0
B Ca K Mg Na

Figura 5.5:
5.5 Cantidad de elementos esenciales de la pared celular extraída en fruto rojo y en
fruto verde. A: Contenido en C, O, H y N, expresado en g por 100 g de pared celular. B:
Contenido en B, Ca, K, Mg y Na, expresado en mg por g de pared celular. Para cada elemento,
el asterisco indica que se han encontrado diferencias significativas entre ambos estadios,
según un análisis de t.Student, con un límite de confianza de 95%.

99
 Capítulo 5

Por otro lado, en cuanto a los elementos minoritarios (Figura 5.5 B), el boro no fue

detectable en fruto verde con la metodología empleada mientras que en fruto rojo,

muestra un valor próximo a 0,3 mg por gramo de pared. Algo parecido ocurre con el
sodio, siendo la cantidad obtenida prácticamente indetectable en el fruto inmaduro

(0,01 mg por gramo de pared celular) alcanzando en fruto maduro los 0,32 ± 0,01 mg

por gramo de pared celular. Tanto el potasio como el magnesio tienen mayor
representación en fruto verde que en fruto rojo, mostrando el potasio un valor de 0,45

± 0,02 mg de potasio por g de pared en fruto verde y de 0,29 ± 0,02 mg por gramo de

pared celular en el rojo. En lo que se refiere al magnesio, presenta unos 0,25 mg en

fruto verde y 0,13 ± 0,01 mg por gramo en fruto rojo. En todos los casos las diferencias
encontradas entre ambos estadios fueron estadísticamente significativas. El elemento

más abundante en este grupo fue el calcio, en fruto verde su contenido se aproxima a
los 4 mg de calcio por gramo de pared celular y en fruto rojo se reduce hasta

prácticamente la mitad.

5.4.- Hinchamiento in vitro de la pared durante la maduración

5.4.-

Recordamos que para estudiar el hinchamiento in vitro de la pared hay que

hidratarla (Capítulo 3: “Material y Métodos”), para ello se añade agua en unos viales

de cristal de diámetro reducido, se mezcla bien y se deja reposar. La pared va

sedimentando a la vez que se hidrata, al estabilizarse esta sedimentación la altura a la
que queda la columna de pared hidratada se toma como medida del hinchamiento. La
Figura 5.6 muestra como quedaría la pared hinchada una vez estabilizada,

transcurrido el tiempo de hidratación.

100
 Maduración

A B

FRUTO ROJO FRUTO VERDE FRUTO ROJO FRUTO VERDE

Hinchamiento con agua Tratamiento con CDTA

Figura 5.6:
5.6 Hinchamiento de fruto rojo y fruto verde una vez estabilizada la altura. A:
Hinchamiento con agua. B: Hinchamiento de la pared tras uno de los tratamientos.

5.4.1.-
5.4.1.- Hinchamiento de la pared durante la maduración

Se obtuvieron diferencias significativas al comparar el hinchamiento de la fracción

pared celular en los estadios verde y rojo del fruto (Figura 5.7).

25
FRUTO VERDE
Altura del sedimento (mm)

FRUTO ROJO
20 *

15

10

Figura 5.7. Medida (en mm) de la altura de la columna de pared celular hidratada de fruto
verde y fruto rojo. Para cada fracción, el asterisco indica que se han encontrado diferencias
significativas entre ambos estadios, según un análisis de ANOVA y Test HSD de-Tukey, con un
límite de confianza de 95%.

101
 Capítulo 5

En fruto rojo observamos un valor de altura de la columna de 18,55 ± 0,88 mm

mientras que en verde el valor fue significativamente inferior, 11,33 ± 0,50 mm. Esto

indicaría que en fruto rojo los distintos polímeros que forman la pared celular estarían
más débilmente y menos entrelazados que en fruto verde. Permitiendo más huecos

moleculares que ocuparía el agua provocando un hinchamiento mayor.

5.4.2.-
5.4.2.-Tratamientos con carbonato, CDTA y calcio

Una vez hinchada la pared, evaluamos el efecto de cuatro tratamientos en el

hinchamiento. Estos tratamientos fueron: carbonato, calcio, CDTA y CDTA con

posterior adición de calcio (mencionados en el Capítulo 3 de “Material y Métodos”).

Para cada estadio y tratamiento se estimó la diferencia media entre la altura de la
pared hinchada tras el tratamiento y la altura de esa misma muestra alcanzada tras el

hinchamiento inicial con agua (Figura 5.8).

No se observaron variaciones significativas tras los tratamientos con soluciones de

CaCl2 o CDTA respecto al hinchamiento inicial con agua ni en pared celular aislada de
fruto verde ni de fruto rojo. Si bien en el fruto verde se ponía de manifiesto una leve
tendencia a mostrar un mayor hinchamiento, en rojo no variaba o incluso se reducía.
Sí que aparecieron diferencias en el hinchamiento para los tratamientos con
soluciones de carbonato y el tratamiento combinado de CDTA seguido de CaCl2, con
incrementos de hinchamiento entre el 20 y el 50% respecto al hinchamiento inicial en

agua. Aunque no hubo diferencias significativas entre las muestras provenientes de

fruto verde y rojo para el doble tratamiento CDTA-CaCl2, sí se mantenía la tendencia a

un hinchamiento mayor en las muestras de fruto verde. En el caso de las muestras
tratadas con carbonato, los frutos verdes presentaron un incremento significativo de

casi el 50% de media respecto al hinchamiento original en agua siendo, más del doble
que el incremento observado en muestras provenientes de fruto rojo.

102
 Maduración

60
a FRUTO VERDE
FRUTO ROJO
50

Porcentaje de variación
40
b

30
b
b
20

c c
10
c c

-10
UA GU
A
GU
A DTA
-AG l2-A A-A l2-C
NATO CaC CDT CaC
BO
CAR

Figura 5.8:
5.8 Porcentajes de variación en hinchamiento al aplicar los tratamientos carbonato,
CaCl2, CDTA y CDTA con lavado posterior con CaCl2. Letras diferentes indican que se han
encontrado diferencias significativas entre tratamientos, según un análisis de ANOVA y Test
HSD de-Tukey, con un límite de confianza de 95%.

Sabemos que el carbonato rompe enlaces covalentes (Redgwell y col., 1997b) y

probablemente solubiliza pectinas de toda la pared celular primaria creando más

huecos en el entretejido polimérico que pueden ser ocupados por el agua produciendo
el hinchamiento. Este mayor hinchamiento en fruto verde es esperable si
consideramos que la pared de fruto rojo ya ha sido parcialmente desmantelada in vivo.
Este hecho se traducía en la mayor capacidad de hinchamiento in vitro observada y ya

comentada (Figuras 5.6 y 5.7). En paredes de fruto verde habría un mayor número de
enlaces ésteres afectados por el tratamiento químico empleado en el ensayo que, en

cambio, ya habrían sido modificados in vivo por el procesamiento in muro que han
tenido las paredes durante el proceso de maduración del fruto.

Con nuestro diseño experimental, la adición de Cl2Ca o CDTA de forma

independiente no tienen efecto en cuanto al hinchamiento, pero al añadir calcio a

paredes que han sido pretratadas con CDTA ya hemos comentado que sí se observa

103
 Capítulo 5

un aumento significativo del hinchamiento (29% y 19% de media respectivamente en

muestras de frutos verde y rojo). No es fácil explicar este resultado experimental ya

que el CDTA es un quelante de calcio y este tratamiento desestructuraría en teoría la

caja de huevos formada por enlaces iónicos en los que interviene el calcio,

permitiendo que solubilicen las pectinas de la lámina media o de la superficie de la

pared celular (Redgwell y col., 1997b). El que un tratamiento posterior adicionando

calcio provoque un mayor hinchamiento no era esperable. Salvo que esa adición de

calcio provoque una reestructuración y formación de enlaces iónicos diferentes de la

original que propicie una mayor hidratación de la pared. Serían necesarios

experimentos adicionales para dilucidar este punto.

5.5. Cromatografía de filtración en gel de las fracciones de pared celular

5.5.1.-
5.5.1.- Perfiles cromatográficos de las pectinas solubles
solubles (fracción PAW y fracción
AGUA)
AGUA)

En la Figura 5.9 se muestran los perfiles de pectinas de las fracciones solubles:

PAW y AGUA. La Figura 5.9 A se corresponde con el estadio verde de la fracción

PAW y se observa que el perfil de azúcares ocupa todo el rango de la columna
mostrando dos picos bien diferenciados. El primero eluye a los 12 ml y se

correspondería con polímeros con una masa molecular superior pero próxima a los
2.000 kDa. La coincidencia de este pico con el que se observa en la misma figura de
ácidos urónicos sugiere que este pico de azúcares es de naturaleza péctica. El
segundo pico de azúcares lo encontramos a los 25 ml y se correspondería con
polímeros de menor tamaño molecular. Vemos que es un pico mucho más abundante

que el de los ácidos urónicos y podría corresponderse principalmente con azúcares

neutros. Por otro lado, el cromatograma obtenido para la fracción PAW en estadio rojo
(Figura 5.9 B) muestra también un perfil con dos picos de azúcares pero la importancia

del primero se incrementa con respecto a lo observado en estadio verde. Este pico
coincide con el presente en el perfil de ácidos urónicos y con una masa molecular
próxima pero algo superior a los 2.000 KDa. El segundo pico de polímeros cuyo

104
 Maduración

volumen de elución coincide con el observado en estadio verde es relativamente

menos abundante en estadio rojo.

Por su parte, en la fracción AGUA (Figuras 5.9 C y 5.9 D) observamos que el

estadio verde presenta un pico de azúcares de gran tamaño en torno a los 2.000 KDa

y una serie de picos de menor tamaño e importancia cuantitativa. Los picos de este

perfil muestran una buena correspondencia con el perfil de ácidos urónicos. Por su
parte, las muestras de estadio rojo presentan un único pico cuya masa molecular está

próxima a la del estándar de 2.000 KDa. Esta parte de perfil es coincidente con la de

los ácidos urónicos y en ambos perfiles se observa que los picos de menor tamaño
observados en estadio verde están muy disminuidos en estadio rojo. En el caso del

perfil de ácidos urónicos prácticamente desaparecen.

Observamos en los perfiles de ambas fracciones que el pico principal de pectinas

en estadio rojo es más ancho que en verde, hecho que implicaría un menor tamaño de
los polímeros probablemente debida a una cierta despolimerización (Redgwell y col.,

1997a). Se aprecia también en los perfiles de ambas fracciones, especialmente en los

perfiles de azucares, que los picos posteriores al de mayor tamaño que aparecen

disminuyen muy significativamente e incluso desaparecen en estadio rojo. En términos

generales los perfiles muestran que la fracción AGUA está relativamente más
enriquecida en pectinas que la fracción PAW, especialmente en estadio verde.

105
 Capítulo 5

1,2
A AU B AU
1,0 AZU1,0 AZU
Absorbancia

0,8 0,8

Abs
0,6 0,6

0,4
0,4

0,2
0,2

0,0
C 10 15 20 25 30 35
AU 5
40 D 10 15 20 25 30 35
AU
1,0 AZU1,0 AZU
Volumen (ml) Vol (ml)
Absorbancia

0,8 0,8

0,6 Y Data
0,6

0,4
0,4

0,2
0,2

0,0
5 10 15 20 25 30 35 5 10 15 20 25 30 35 40

Volumen (ml) Volumen (ml)

Figura 5.9:
5.9 Perfiles cromatográficos de las fracciones solubles (PAW y AGUA). A: Perfil
cromatográfico de la fracción PAW del estadio verde. B: Perfil cromatográfico de la fracción
PAW de estadio rojo. C: Perfil cromatográfico de la fracción AGUA en estadio verde. D: Perfil
cromatográfio de la fracción AGUA en estadio rojo. En color rojo y verde se representan las
medidas de ácidos urónicos y en color gris las medidas de azúcares. Las absorbancias de
ácidos urónicos se miden a una longitud de onda de 515 nm y las de azúcares a 450 nm. La
flecha indica el volumen al que eluyó el estándar de peso molecular de 2.000 KDa.

Para facilitar la comparación de los perfiles de los ácidos urónicos en ambos

estadios y fracciones se muestran de forma simultánea en la misma figura (Figura
5.10). La Figura 5.10 A corresponde a la fracción PAW y en ella se aprecia que ambos

perfiles tienen un solo pico en torno a los 2.000 KDa. Observamos que las muestras
procedentes de fruto rojo presentan un perfil más redondeado y más abierto que las de
fruto verde donde el perfil aparece más puntiagudo. Esto podría indicar que las

pectinas de fruto rojo están algo más degradadas que las de verde, como ya hemos
mencionado.

106
 Maduración

1,2
A PAW-V B AGUA-V
PAW-R AGUA-R
Absorbancia (515 nm)

1,0 1,0

Absorbancia (515 nm)

0,8 0,8

0,6 0,6

0,4 0,4

0,2 0,2

0,0
5 10 15 20 25 30 35 5 10 15 20 25 30 35 40

Volumen (ml) Volumen (ml)

Figura 5.10. Perfil cromatográfico de los ácidos urónicos de la fracción soluble. A: Perfil
cromatográfico de los ácidos urónicos de la fracción PAW. B: Perfil cromatográfico de la
fracción AGUA. En color verde los ácidos urónicos del estadio verde y en color rojo los ácidos
urónicos del estadio rojo. Las absorbancias de ácidos urónicos se miden a una longitud de
onda de 515 nm. La flecha indica el volumen al que eluyó el estándar de peso molecular de
2.000 KDa.

La representación de los perfiles de ácidos urónicos de la fracción AGUA de

ambos estadios (Figura 5.10 B) muestra, además de un pico más ancho en estadio
rojo, un desplazamiento hacia la derecha del pico en estadio rojo, indicando que las

pectinas del fruto rojo son algo más pequeñas que las del fruto verde. Esto podría
significar que se ha producido una leve despolimerización de las pectinas durante la
maduración.

Podemos concluir que las fracciones de pectinas solubles (PAW y AGUA)

incluyen de forma mayoritaria polímeros pécticos de tamaño próximo a los 2.000 KDa
y que, en el caso de fruto rojo, están algo más degradadas que en el fruto verde lo que

coincidiría con lo descrito en la bibliografía (Redgwell y col., 1997b; Rosli y col., 2004;
Huber, 1984; Posé y col., 2013).

107
 Capítulo 5

5.5.2.-
5.5.2.- Perfiles de pectinas unidas iónicamente (fracción CDTA)

Los cromatogramas de la fracción soluble en CDTA, representados en la Figura

5.11 A, muestran como los perfiles de azúcares y ácidos urónicos del estadio verde
coinciden prácticamente durante toda la columna. Se observa, a groso modo, una

curva más o menos redondeada distribuida por todo el perfil que se corresponde con

un tamaño de polímeros mayor de 2.000 KDa. Por su parte, el perfil de ácidos urónicos
presenta una pequeña subida sin poder considerarse un pico, en torno a los 13 ml que

se corresponden con polímeros de gran tamaño. El perfil de azúcares muestra también

un pico a los 15 ml. En las muestras provenientes de fruto rojo (Figura 5.11 B), los
cromatogramas de la fracción CDTA muestran que también ambos perfiles de

azúcares y ácidos urónicos están solapados; se observa un único pico que está más
cercano al estándar de 2.000 KDa con respecto al observado en estadio verde,
indicando que son polímeros de menor peso molecular.

En esta fracción vemos que, tanto en el estadio verde como en el rojo, los perfiles

de azúcares coinciden casi en su totalidad con los de ácidos urónicos. Se podría decir
que la fracción soluble en CDTA está formada mayoritariamente por pectinas.

Comparando los perfiles de ácidos urónicos en la misma gráfica (Figura 5.12)

observamos que ambos perfiles prácticamente están solapados con alguna pequeña
diferencia. La curva que se corresponde con el estadio verde asoma en la zona de la
izquierda de la gráfica y en el estadio rojo por la derecha. Esto sugiere que las

pectinas en estadio verde podrían ser de tamaño ligeramente mayor que en el estadio
rojo.

108
 Maduración

1,2
A AU 1,0 B AU
1,0 AZU AZU

0,8
Absorbancia

0,8

Y Data
0,6 0,6

0,4 0,4

0,2
0,2

0,0
5 10 15 20 25 30 35 40 5 10 15 20 25 30 35 40 45

Volumen (ml) Volumen (ml)

Figura 5.11:
5.11 Perfiles cromatográficos de la fracción CDTA. A: Perfil cromatográfico de la
fracción CDTA en estadio verde. B: Perfil cromatográfico de la fracción CDTA en estadio rojo.
En color rojo y verde se representan las medidas de ácidos urónicos y en color gris las de
azúcares. Las absorbancias de ácidos urónicos se miden a una longitud de onda de 515 nm y
las de azúcares a 450 nm. La flecha indica el volumen al que eluyó el estándar de peso
molecular de 2.000 KDa.

1,2
CDTA-V
CDTA-R
1,0
Absorbancia (515nm)

0,8

0,6

0,4

0,2

0,0
5 10 15 20 25 30 35 40

Volumen (ml)

Figura 5.12: Perfil cromatográfico de los ácidos urónicos de la fracción CDTA. En color verde
los ácidos urónicos del estadio verde y en color rojo los ácidos urónicos del estadio rojo. Las
absorbancias de ácidos urónicos se miden a una longitud de onda de 515 nm. La flecha indica
el volumen al que eluyó el estándar de peso molecular de 2.000 KDa.

109
 Capítulo 5

Estos resultados parecen indicar que durante la maduración ocurre una ligera

degradación de pectinas en la fracción de pectinas unidas iónicamente y coincide con

resultados anteriores (Redgwell y col., 1997b).

5.5.3.-
5.5.3.- Perfiles de pectinas unidas Covalentemente (fracción CARBONATO).

La fracción CARBONATO se muestra en la Figura 5.13. Los cromatogramas de la

fracción CARBONATO en estadio verde se representan en la Figura 5.13 A. Vemos

que tanto el perfil de azúcares como el de los ácidos urónicos presentan dos picos
bien definidos. Los azúcares muestran un pico al principio de la columna de gran
tamaño molecular que eluye a los 13 ml, que es muy abundante, y otro que se
corresponde con polímeros de menor tamaño que eluye entre los 23 y 25 ml. Por su

parte, el perfil de ácidos urónicos muestra dos picos que coinciden en el volumen de
elución con los del perfil de azúcares. Las abundancias relativas, estimadas por los

valores de absorbancia, sugieren que el pico de azúcares de menor masa molecular

estaría formado principalmente por pectinas.

1,2
A AU B AU
1,0 AZU 1,0 AZU
Absorbancia

0,8 0,8
Y Data

0,6 0,6

0,4
0,4

0,2
0,2

0,0
5 10 15 20 25 30 35 5 10 15 20 25 30 35 40

Volumen (ml) Volumen (ml)

Figura 5.14:
5.14 Perfiles cromatográficos de la fracción CARBONATO. A: Perfil cromatográfico de
la fracción CARBONATO en estadio verde. B: Perfil cromatográfico de la fracción
CARBONATO en estadio rojo. En color rojo y verde se representan las medidas de ácidos
urónicos y en color gris las de azúcares. Las absorbancias de ácidos urónicos se miden a una
longitud de onda de 515 nm y las de azúcares a 450 nm. La flecha indica el volumen al que
eluyó el estándar de peso molecular de 2.000 KDa.

110
 Maduración

En el cromatograma de la fracción CARBONATO en estadio rojo (Figura 5.14 B) el

perfil de pectinas muestra dos picos bien definidos, al igual que ocurría en el estadio

verde. El de mayor peso molecular eluye a los 10 ml y el otro, de menor masa

molecular, lo hace entre los 22 y 24 ml aproximadamente. El perfil de azúcares

obtenido muestra tres picos diferenciados que eluyen a los 13, a los 17 y, el de menor

masa molecular, a los 26 ml coincidiendo con el estándar de 2.000 KDa. Observamos

que esta fracción, además de pectinas, tiene una gran proporción de otro tipo de

azúcares. Parece que el pico de alto peso molecular en el perfil de azúcares del

estadio verde, al degradarse durante la maduración, dando lugar a todos los picos de
azúcares más pequeños que aparecen en el estadio rojo.

Al comparar los perfiles de ácido galacturónico de la fracción covalente (Figura

5.15) vemos que ambos perfiles tienen dos picos muy bien definidos. Uno de mayor
masa molecular que aparece a los 11 ml en el caso del estadio verde y en torno a los

13 ml en el caso del estadio rojo. El otro pico se registra en torno a los 24 ml y está
prácticamente solapado en los dos estadios.

1,2
CARBONATO-V
CARBONATO-R
1,0
Absorbancia (515nm)

0,8

0,6

0,4

0,2

0,0
5 10 15 20 25 30 35 40

Volumen (ml)

Figura 5.15: Perfil cromatográfico de los ácidos urónicos de la fracción CARBONATO. En

color verde los ácidos urónicos del estadio verde y en color rojo los ácidos urónicos del estadio
rojo. Las absorbancias de ácidos urónicos se miden a una longitud de onda de 515 nm. La
flecha indica el volumen al que eluyó el estándar de peso molecular de 2.000 KDa.

111
 Capítulo 5

La principal diferencia entre ambos perfiles la encontramos en la zona de las

moléculas de mayor tamaño. Observamos que el perfil de los ácidos urónicos en el

estadio verde empieza en un volumen anterior al del estadio rojo, unos 2 ml antes.
Esto, unido al desplazamiento del primer pico que hemos mencionado antes de mayor

tamaño, puede ser indicativo de una despolimerización de las pectinas unidas

covalentemente durante la maduración del fruto.

5.5.4.-
5.5.4.- Perfiles de HEMICELULOSA
HEMICELULOSA (fracción KOH 4M)

Se espera que el contenido de las fracciones KOH 1M y 4M se corresponda

principalmente con la hemicelulosa y donde las pectinas deberían tener muy baja

representación, por eso al representar los perfiles de ácidos urónicos y de azúcares

obtenidos de la cromatografía (Figura 5.16), se observa como la cantidad de ácidos
urónicos es muy baja en comparación a la de azúcares, por lo que se empleará el

perfil de azúcares para representar esta fracción. La extracción con KOH 1M es un

paso intermedio y presenta un comportamiento intermedio por lo que se usará la
fracción KOH 4M como más característica del componente hemicelulósico y en ella el
componente péctico es prácticamente residual.

Los perfiles de los azúcares de la fracción KOH 4M en estadio rojo y en verde

(Figura 5.17) presentan ambos dos picos bien definidos; uno de azúcares de menor

masa molecular, próximo a los 2.000 KDa que se solapa en ambos perfiles y eluye a

los 25 ml, y otro pico de mayor masa molecular y menos abundancia en ambos casos
pero con marcadas diferencias. Mientras que el pico de mayor masa molecular

correspondiente al estadio verde se sitúa en los 8 ml, el del estadio rojo no aparece
hasta los 11 ml.

112
 Maduración

0,8
A AZU-V B AZU-R
AU-V
0,5 AU-R

0,6
0,4
Absorbancia

Absorbancia
0,4 0,3

0,2
0,2
0,1

0,0
0 5 10 15 20 25 30 35 40 5 10 15 20 25 30 35 40

Vol (ml) Vol (ml)

Figura 5.16: Perfiles cromatográficos de la fracción KOH 4M. A: Perfil cromatográfico de la

fracción KOH 4M en estadio verde. B: Perfil cromatográfico de la fracción KOH 4M en estadio
rojo. En color rojo y verde se representan las medidas de ácidos urónicos y en color gris las de
azúcares. Las absorbancias de ácidos urónicos se miden a una longitud de onda de 515 nm y
las de azúcares a 450 nm. La flecha indica el volumen al que eluyó el estándar de peso
molecular de 2.000 KDa.

1,2
KOH 4M-V
KOH 4M-R
1,0
Absorbancia (450nm)

0,8

0,6

0,4

0,2

0,0
10 20 30 40

Volumen (ml)

Figura 5.17: Perfil cromatográfico de los azúcares de la fracción KOH 4M. En color verde los
azúcares del estadio verde y en color rojo los azúcares del estadio rojo. Las absorbancias de
azúcares se miden a una longitud de onda de 450 nm. La flecha indica el volumen al que eluyó
el estándar de peso molecular de 2.000 KDa.

113
 Capítulo 5

Este desplazamiento de picos al comparar el estadio verde con el rojo es

probablemente debido a una despolimerización de las hemicelulosas durante la

maduración del fruto. Esta despolimerización en la hemicelulosa también ha sido

observada por otros autores anteriormente (Rose y col., 2004; Brummell, 2006).

5.6 Discusión

La comparación entre fruto verde y rojo que hemos realizado en este trabajo pone

de manifiesto importantes cambios cuantitativos y cualitativos en las paredes celulares

de los frutos de fresa entre estos dos estadios de desarrollo. Desde el punto de vista

cuantitativo, el contenido de pared celular por peso de fruto fresco disminuye

drásticamente a la vez que, cualitativamente, las pectinas incrementan su proporción
de manera muy significativa, lo que las lleva a que su peso relativo en la pared supere

claramente el 50%. Estos datos estarían de acuerdo con las tendencias observadas
por otros autores para la fresa (Rosli y col., 2004; Koh y Melton, 2002). También, en
términos generales, parece lógico pensar que una disminución de 8 veces en el

contenido de pared celular con la maduración se traduzca en un debilitamiento

estructural importante resultando en un reblandecimiento del fruto. Pero no sólo la
cantidad de andamiaje estructural es importante, también lo es el comportamiento

físico de esas estructuras ya que en ellas se llevan a cabo las relaciones hídricas a
nivel celular y tisular determinando el comportamiento mecánico de los tejidos. De
hecho, la disminución en la cantidad de pared no fue el único cambio observado, las
interacciones físicas entre sus componentes poliméricos también habían cambiado en

los frutos rojos como demuestra la mayor capacidad de hidratación/hinchamiento de

las paredes extraídas en este estadio. Este hinchamiento de la pared celular se ha

observado previamente en fresa y otros frutos (Redgwell y col., 1997b) y se relaciona

con un incremento del tamaño medio de poro en la pared celular causado,

probablemente, por el desmantelamiento ordenado de la matriz péctica provocado por

la actuación coordinada de las pectinasas (Redgwell y col., 1997b; Hadfield y Bennett,

1998; Santiago-Doménech y col., 2008).

114
 Maduración

Este comportamiento físico diferencial y, probablemente, también el

reblandecimiento del fruto está causado por los cambios en la composición y en las

interacciones entre los componentes de la pared celular. Ya hemos comentado que el

componente péctico se incrementa al doble en las paredes de fruto rojo pero no es

sólo eso, su distribución entre fracciones de extracción es distinta en estos frutos. Esta

distribución desigual puede ser interpretada como una solubilización de grupos de

polímeros pécticos. La solubilización de pectinas es un proceso observado con

bastante frecuencia en la maduración de frutos carnosos y blandos (soft). Este

proceso consiste en un incremento del contenido de pectinas solubles de la pared

celular (fracción AGUA) y, en algunos casos, las pectinas iónicas. En paralelo, puede
ocurrir una disminución de la cantidad de las unidas covalentemente. Según Koh y

Melton (2002), en fresa, el mayor incremento de pectinas solubles ocurre al pasar del
estadio verde a los intermedios y luego no se incrementan mucho o permanecen

constantes en el estadio rojo (si se considera como porcentaje de pared aislada).

Nosotros no hemos evaluados estadios intermedios pero sí verificamos en buena
medida ese incremento de pectinas solubles en nuestras muestras de frutos rojos. La
cantidad de polímeros solubles en agua aumenta de estadio verde a rojo. Por el

contrario, la cantidad de pectinas unidas covalentemente disminuyen durante la

maduración, quedando patente que se produce una solubilización de las pectinas

durante la maduración de nuestros frutos. Esta solubilización ocurre a expensas de las

pectinas covalentemente unidas a la pared (Wakabayashi, 2000; Brummell, 2006;
Mercado y col., 2011; Paniagua y col., 2014). Una interpretación alternativa o

complementaria al hecho experimental de la solubilización fue la propuesta de Huber

(1984). Este autor sugería a la síntesis di novo de pectinas más solubles como la
causa de la observación de una mayor proporción de pectinas solubles, no ligadas o
débilmente ligadas a la fase sólida de la pared celular. Sin embargo, parece que la
causa más probable sea el resultado de una pérdida y/o degradación (Inari y Takeuchi,
1997) de pectinas no esterificadas y muy ramificadas durante la maduración. Otros

autores también sugieren que las pectinas en realidad se solubilizarían al degradarse

las hemicelulosas a las que estarían unidas en la pared primaria (Koh y Melton, 2002).

Esta degradación de la hemicelulosa podría ser un proceso constante desde los

115
 Capítulo 5

estadios iniciales hasta el comienzo de la coloración del fruto como se refleja por una

disminución gradual de los azúcares neutros en las fracciones CDTA y CARBONATO

(Koh y Melton, 2002) que nosotros no observamos (Figura 5.4 B) y, además, el

contenido relativo de azúcares neutros se incrementan en las dos fracciones

hemicelulósicas (KOH 1 y 4 M). Si bien es cierto que los perfiles cromatográficos que

hemos obtenido de la fracción KOH 4M muestra una despolimerización de las

hemicelulosas durante la maduración del fruto que también ha sido observada por

otros autores anteriormente (Rose y col., 2004; Brummell, 2006). También, en relación

con esta cuestión, conviene recordar que nosotros hemos encontrado que el
silenciamiento de la pectato liasa, que actúa específicamente sobre la matriz péctica,
tuvo también como efecto colateral en las dos fracciones de hemicelulosa.

Observamos un menor contenido del pico mayoritario de azúcares neutros presentes

en los perfiles cromatográficos de las dos fracciones (Capítulo 6, Figura 6.10;

Santiago-Doménech y col., 2008). Como ya hemos comentado, la complejidad del

metabolismo de la pared celular y la multiplicidad de agentes que actúan en ella al
mismo tiempo interactuando entre sí dificultan el que, en muchos ocasiones, sea
posible distinguir causas de efectos con claridad.

Volviendo a las pectinas, hemos encontrado que, el contenido de ácidos urónicos

referidos a pared celular, en términos generales, presentan un mayor contenido en

fruto rojo coincidiendo con Woodwards (1972). Si bien otros autores han observado
una disminución en la cantidad total de ácidos urónicos (Rosli y col., 2004; Koh y
Melton, 2002), mientras que Huber (1984) no observó cambios. Aunque cuando los

resultados se expresan como total de AU con respecto a peso de pared celular, Rosli y
col., (2004) también observan un incremento al pasar de estadio verde al blanco y de
éste al estadio rojo permanece constante. Nosotros no hemos evaluado contenidos en

estadios intermedios pero si hemos verificado el ya mencionado mayor contenido de

ácidos urónicos en fruto rojo con respecto al verde.

Además de los procesos de solubilización, en determinados frutos la

despolimerización de polímeros pécticos por la actuación de poligalacturonasas y otros

enzimas pectinolíticos (Brummell y col., 1988) puede jugar un papel importante en el

116
 Maduración

desmantelamiento de la pared celular durante la maduración. Aunque en fresa se

consideraba inicialmente este proceso de menor importancia debido a que los

primeros estudios experimentales que abordaron la cuestión encontraron una

relativamente baja actividad poligalacturonasa y escasas evidencias de

despolimerización (Huber, 1984; Nogata y col., 1996; Brummell, 2006). Este

posicionamiento inicial se ha visto modificado al aportarse evidencias de

despolimerización cuantitativamente importante y alta actividad poligalacturonasa en

cultivares especialmente blandos, como Toyonaka (Rosli y col., 2004; Villarreal y col.,

2008) y nuestros propios resultados usando una aproximación transgénica (Capítulo 6;

Santiago-Doménech y col., 2008). Nuestro estudio comparativo de los estadios verde y
rojo en el cultivar Chandler también indica que se produce una despolimerización

paulatina de las pectinas al alcanzar el fruto la madurez. Ello se pone de relieve por los
cambios en los cromatogramas de las fracciones CDTA y, sobretodo, en los perfiles de

la fracción CARBONATO cuando se comparan las muestras extraídas de fruto verde y

rojo. Los picos asociados con polímeros ricos en AU y alta masa molecular tienden a
desplazarse hacia zonas de menor peso molecular, lo que indicaría una degradación
de las pectinas. Esta posible despolimerización afecta a la estructura de las pectinas y

su interacción con otros componentes de la pared, afectando al comportamiento físico

de la red y, en última instancia, a la textura del fruto, propiciando probablemente su

reblandecimiento. Tampoco podemos descartar, que además de los procesos

enzimáticos, las diferencias encontradas en los iones presentes en la pared,
especialmente el calcio, que disminuye en fruto rojo significativamente, contribuyan

también a cambios importantes en la estructura de la matriz péctica y sus propiedades

físicas, propiciando, por ejemplo, la solubilización de grupos poliméricos de la lámina
media en estadio rojo y afectando al hinchamiento de la pared celular.

En conjunto, nuestros resultados ponen de manifiesto que en frutos de fresa del

cultivar Chandler la solubilización y, en menor medida, la despolimerización de las
pectinas, son parte significativa del proceso de desmantelamiento ordenado de la

pared celular. Si junto a estos dos hechos consideramos:

117
 Capítulo 5

• que el componente péctico supone prácticamente el 60% de los polímeros

presentes en la pared en fruto rojo,

• que el comportamiento físico de esta pared se ve modificado por estos

cambios,

• que estos cambios son de alguna manera contrarrestados al silenciar una

pectato liasa (Capítulo 6) y una poligalacturonasa (Quesada y col., 2009),

• y que los frutos transgénicos de estas líneas transgénicas son más duros

que los de planta control no transgénicas en el mismo estadio de desarrollo

Contamos con un conjunto de evidencias que permiten proponer que existe algo
más que una correlación entre el procesamiento de pectinas asociado a la maduración
de los frutos de fresa y el reblandecimiento de este fruto.

118
  

  CONTROL APEL

CAPÍTULO 6.
Efecto de la inhibición por tecnología
antisentido de un gen de pectato liasa en la
despolimerización de las pectinas y el
reblandecimiento del fruto de fresa
  
 Silenciamiento pectato liasa

6.-
6.- Efecto de la inhibición por tecnología antisentido de un gen
de pectato liasa en la despolimerización de las pectinas y el
reblandecimiento del fruto de fresa.

Los resultados de esta sección se corresponden en su selección y formato de

presentación con los publicados en la revista Journal of Experimental Botany (adjunto

en el anexo I).

6.1.-
6.1.- Introducción

La maduración de los frutos carnosos suele coincidir con un importante

reblandecimiento de sus tejidos para cuya causa se han propuesto tanto mecanismos
de tipo enzimático (Brummell y Hapster, 2001; Brummell, 2006), como no enzimáticos

(Dumville y Fry, 2003) de degradación y/o modificación de la pared celular. También

existe evidencia experimental de que la modificación de la turgencia celular durante el
periodo de maduración juega un papel importante en este reblandecimiento (Saladié y

col., 2007), aunque el hecho es que son mucho más numerosos los trabajos que se
han dedicado a investigar los cambios en la composición y estructura de la pared
celular, así como los referidos a las proteínas y enzimas que modifican este
compartimento celular (Vicente y col., 2007). Estos trabajos han puesto de manifiesto
un cierto número de modificaciones específicas del proceso de reblandecimiento, tanto

a nivel estructural como de composición, lo que ha permitido la propuesta de un

modelo de desmantelamiento de la pared celular para frutos. Si bien, este modelo está
algo sesgado debido al hecho de que determinados frutos como el tomate han recibido

bastante más atención que otros como la fresa. De hecho, cuando se baja un poco
más al detalle de los procesos bioquímicos relacionados con este desmantelamiento
de la pared celular y los cambios texturales correlacionados con ellos comparando
distintos frutos, aparecen diferencias reseñables entre especies (Brummell y Hapster,
2001; Rose y col., 2003). Una parte de esa variabilidad se puede relacionar con las
diferentes texturas que muestran los frutos carnosos al alcanzar la madurez. Los dos

121
 Capítulo 6

principales tipos a considerar serían los de textura blanda, como las fresas, que en

fase muy terminales de la maduración pueden presentar textura líquida (soft-melting) o

aquellos con textura crujiente (crisp), mantenida incluso en fases terminales y que no
muestran esa textura blanda/líquida. Un ejemplo de fruto con este tipo de textura

“crisp” en maduración sería la manzana.

Como hemos indicado, la fresa cultivada (Fragaria x ananassa Duch.) está incluida
en el grupo de frutos que desarrollan una textura blanda durante la maduración. Este
reblandecimiento implica cambios físicos y químicos en la pared celular que incluyen la

degradación de la lámina media, un incremento significativo en la solubilización de las

pectinas, reducción en la masa molecular de los polímeros de xiloglucanos y un

hinchamiento de la pared celular (Redgwell y col., 1997a; Koh y Melton, 2002). El

hinchamiento in vitro de la pared celular se suele correlacionar con la solubilización de

las pectinas y también, en condiciones in vivo, con un una relajación de las
interacciones que existen entre la red de xiloglucano y la de celulosa (Redgwell y col.,

1997b; Brummell, 2006). En fresa, además de las reestructuraciones y modificaciones

de la pared celular que implican a las pectinas y su solubilización (Lara y col., 2004;
Rosli y col., 2004), también hay estudios que describen cambios de la matriz
hemicelulósica. Entre ellos destacan un incremento de polímeros de bajo peso
molecular (Huber, 1984), una disminución de los de alto peso molecular (Nogata y col.,

1996) y una despolimerización (Rosli y col., 2004).

En lo que concierne a la celulosa, los estudios previos sugieren que no existe una
degradación de este componente durante la maduración del fruto de fresa y que, por

tanto, no juega un papel importante en el proceso de reblandecimiento (Koh y col.,

1997; Koh y Melton, 2002). A pesar de ello, conviene ser cautos ya que se suele
evaluar la degradación de la fracción cristalina de la celulosa y no la que se puede

desarrollar en la fracción de celulosa no cristalina que puede ser importante pero difícil
de estimar (Rose, 2003). Desde el punto de vista de las posibles enzimas implicadas,
también se ha encontrado que la inhibición de la expresión de varios genes de
endonucleasas incluidos en la familia “Glicosil-Hidrolasas 9” (GH9) no afecta la firmeza
del fruto (Woolley y col., 2001; Palomer y col., 2006). De todos modos, hay que indicar

122
 Silenciamiento pectato liasa

también que no está claro cuál es in vivo el sustrato de las enzimas de esta familia
(Urbanowicz y col., 2007).

A diferencia de lo descrito para la celulosa, hay bastante más información sobre

los cambios mediados por enzimas en la matriz péctica durante la maduración de

frutos. Siendo el más mencionado el conocido de modo genérico como “solubilización
de las pectinas”. Existen varias causas posibles para explicar esta solubilización (Koh

y Melton, 2002), como son la despolimerización de las pectinas, la pérdida del calcio
que estabiliza la estructura gel de las pectinas (Knee y col., 1977; Lara y col., 2004), la

rotura de uniones entre pectinas y hemicelulosa (Nogata y col., 1996) o el

desmantelamiento/desestructuración de la matriz de pectinas debido a la degradación

de las cadenas laterales de arabinanos y, posiblemente, galactanos (Redgwell y col.,

1997b; Trainotti y col., 2001; Koh y Melton, 2002). En el caso de la fresa parece que
varios de estos procesos interactúan entre si durante la maduración originando la
solubilización de las pectinas pero, tradicionalmente, el papel de la despolimerización
de las pectinas se ha considerado un factor de menor importancia. Esta asunción
descansaba en las afirmaciones publicadas en los primeros trabajos que abordaron
esta cuestión en fresa ya que encontraron un bajo grado de despolimerización de
pectinas y una baja actividad poligalacturonasa en frutos maduros, al compararlos con
los obtenidos en otros frutos (Huber, 1984; Nogata y col., 1996; Brummell, 2006). Sin
embargo, trabajos como el de Rosli y col. (2004), sí que describen una

despolimerización cuantitativamente importante y una alta actividad poligalacturonasa,

especialmente en el cultivar japonés Toyonaka que es muy blando (Villarreal y col.,
2008).

Además de las poligalacturonasas, otra enzima que podía estar involucrada en la

despolimerización de las pectinas es la pectato liasa que rompe el enlace entre los
residuos de galacturónico por una reacción de β-eliminación y no por el mecanismo

hidrolítico que emplean las poligalacturonasas (Marín-Rodríguez y col., 2002).

Las pectato liasas, inicialmente más conocidas como enzimas bacterianas, han
sido identificadas en distintos frutos mostrando un patrón de expresión en el que sus

niveles de ARNm se incrementan en paralelo a la maduración del fruto (Dominguez-

123
 Capítulo 6

Puigjaner y col., 1997; Medina-Escobar y col., 1997; Nunan y col., 2001). Su posible

papel en los procesos de maduración de frutos está bastante menos documentado que

el de las poligacturonasas. En el año 2002, Jiménez-Bermúdez y col. (2002) lograron

silenciar la expresión de un gen de pectato liasa en fresa mediante tecnología

antisentido y correlacionarlo con la producción en estas plantas de frutos

significativamente más duros en el estadio rojo de maduración y un mejor

comportamiento postcosecha de los mismos. Este fenotipo se observó a pesar de que

en este material se han descrito 3 genes de pectato liasa que comparten el patrón de

expresión (Benítez-Burraco y col., 2003). Sin embargo, la similitud de las tres

secuencias génicas y el diseño de la secuencia antisentido permitió que en las plantas
transgénicas la expresión de los tres genes quedara inhibida significativamente

(Benítez-Burraco y col., 2003). Estos frutos, además de la mencionada mayor firmeza,

poseían paredes celulares que se hinchaban menos in vitro y también una aparente

menor solubilización de las pectinas (Jiménez-Bermúdez y col., 2002). Por tanto, este

material transgénico es muy valioso para profundizar en la caracterización de los

cambios en los polímeros pécticos presentes en las paredes de estos frutos mediante
un análisis más profundo y ese es nuestro objetivo en este trabajo. Mostraremos
resultados que evidencian el papel de la pectato liasa en la despolimerización y
solubilización de las pectinas de la pared primaria y/o la lámina media y con ello

reforzamos la necesidad de incluir a esas enzimas en los modelos que pretenden

describir el desmantelamiento ordenado de la pared celular durante el proceso de
maduración de frutos.

6.2.-
6.2.- Resultados

6.2.1.-
6.2.1.- Estabilidad temporal del fenotipo transgénico “Más Duro” y comparación del
estado de maduración de los distintos genotipos estudiados

La Figura 6.1 A muestra la consistencia y estabilidad del fenotipo “Más Duro” en

dos líneas transgénicas con la pectato liasa silenciada (Jiménez-Bermúdez y col.,

2002) en comparación con una línea control no transgénica durante 4 años

124
 Silenciamiento pectato liasa

consecutivos, del 2002 al 2005. Durante estos cuatro ciclos independientes de cultivo,
las dos líneas transgénicas produjeron frutos significativamente más duros en estadio

rojo (R). Este es el estadio en el que se centra el estudio y dado que el tiempo de

maduración se podía ver afectado en los frutos transgénicos se usó como estimador
de madurez el contenido de antocianina. En la Figura 6.1 B se muestran los

resultados, los niveles de antocianinas fueron similares en las plantas utilizadas como

plantas control y en las líneas transgénicas 23 y 39 y ligeramente mayor en la línea 14,

indicando que los frutos transgénicos muestreados para el análisis de pared celular no

eran más duros por estar su maduración más retrasada.

Dureza (% relativo al control)

2002 2003 2004 2005

Año
Contenido en antocianina (Abs 530 nm -

B
Abs 657 nm /g de peso fresco

Control Apel 14 Apel 23 Apel 39

Figura 6.1.
6.1 Dureza y niveles de antocianina de frutos control y frutos transgénicos con la
pectato liasa silenciada (Apel). A: Dureza del control y de los frutos transgénicos Apel 14 y 39
cosechados en 4 ciclos de cultivo independientes. B: Contenido en antocianina de los frutos
maduros usados para la extracción y análisis de la pared celular. En este caso, las medidas se
corresponden a frutos controles y a las líneas transgénicas Apel 14, 23 y 39. Las barras de
error corresponden a desviaciones estándar.

125
 Capítulo 6

6.2.2.-
6.2.2.- Extracción y fraccionamiento de la pared

El contenido de pared celular estimado como peso seco y referido a 100 gramos

de fruto fresco osciló entre los 0,92 y los 1,43 gramos. El mayor valor correspondió a la
línea transgénica 23, y fue estadísticamente diferente del obtenido en frutos controles

(P= 0,05). El contenido de pared celular de las otras dos líneas transgénicas fue

similar al que se obtuvo en el control siendo el valor medio de 1,0 ± 0,1 g por 100 g de
peso fresco de fruto.
mg de fracción/100 mg pared celular

PAW AGUA CDTA CARBONATO KOH1M KOH 4M

Figura 6.2. Rendimiento relativo del fraccionamiento secuencial de la pared celular

incluyendo la fracción PAW a partir de frutos control (C) y tres líneas transgénicas
independientes con la pectato liasa silenciada (Apel 14, 23 y 39). Las barras de error
corresponden a desviaciones estándar.

Con el protocolo de extracción empleado, basado en el protocolo de Redgwell y

col. (1992) ligeramente modificado como se indica en el capítulo 2 “Material y

Métodos”, los polímeros de pared celular no sólo están presentes en los extractos de

pared celular, sino que también se detectan en la fracción extraída con PAW. Por ello,
en la Figura 6.2, junto al contenido de las distintas fracciones extraídas
secuencialmente del residuo de pared celular, también se muestra el contenido de
esta fracción PAW tras ser dializada y secada. A efectos comparativos, este contenido

126
 Silenciamiento pectato liasa

se relativizó a 100 mg de pared celular, como el resto de fracciones presentadas. Los

valores medios de contenido de fracción PAW fueron más bajos en las tres líneas

transgénicas pero las diferencias fueron estadísticamente significativas sólo en las

líneas 23 y 39 (P= 0,05). Se observa una tendencia similar cuando el contenido de

PAW se relativiza al peso fresco del fruto.

Esa menor cantidad relativa de fracción PAW en las líneas transgénicas puede ser

interpretada como un reflejo de una menor solubilización de polímeros de pared celular

en estos frutos transgénicos, al menos en las líneas 23 y 39. En todos los genotipos

estudiados el contenido de polímeros de la fracción PAW fue mayor en fruto rojo que
en verde pero el incremento observado al comparar un estadio con el otro fue menor
en los frutos transgénicos de media un 99% (128, 27 y 142% para las líneas Apel 14,
23 y 39, respectivamente) frente a un 427%, cuatro veces más, en la línea control.

Este es otro dato que apoya la limitación de la solubilización (desmantelamiento) de la

pared en los frutos transgénicos.

En lo que se refiere a las fracciones de pared, desde el punto de vista del

rendimiento de extracción se puede deducir a partir de la Figura 6.2 que se pierde algo
de material de pared. De hecho, el conjunto de todas las fracciones obtenidas,
incluyendo el residuo que queda después de la extracción con KOH 4M (no

representado en la Figura 6.2), suponen el 76 ± 4% (p/p) de la cantidad del peso inicial

de pared celular usado para la extracción. Por tanto, tenemos una pérdida debida a la

manipulación del material y los distintos pasos de fraccionamiento próximo al 25%. La

fracción más abundante de pared es la solubilizada con CDTA 50 mM y no existen en
ella diferencias entre los genotipos analizados. Sólo en la fracción extraída con agua

se observan diferencias significativas entre el control y las 3 líneas transgénicas,

siendo la cantidad de fracción significativamente mayor en el control. Esto se puede
interpretar en el mismo sentido que lo hemos hecho al referirnos a la fracción PAW.

127
 Capítulo 6

6.2.3.-
6.2.3.- Contenido de pectinas y solubilización

En todos los genotipos, el mayor contenido en ácidos urónicos (AU) se encontró en

los extractos de PAW, con un valor medio más bajo en las tres líneas transgénicas,
aunque estas diferencias sólo fueron estadísticamente significativas para la línea 23

(Figura 6.3 A). Entre las fracciones de pared celular los niveles mayores de AU

estaban en la fracción CDTA y los más bajos se encontraban en la fracción de

hemicelulosa KOH 4M.

La cantidad de pectinas (estimada como la cantidad de AU) fue significativamente

mayor en la fracción CDTA y en la fracción CARBONATO de las paredes celulares de

las 3 líneas transgénicas que la obtenida en las fracciones del control (Figura 6.3 A).

Esta diferencia es relevante ya que hemos comentado previamente que, en términos

de peso, estas dos fracciones son similares a las del control (Figura 6.2). Si se
calculan las relaciones de las pectinas más solubles (fracción PAW y AGUA) respecto
a las pectinas más unidas (fracción CDTA y CARBONATO) en los distintos genotipos,

vemos que es significativamente mayor en el control (3,0) que en las transgénicas

(1,8) y esta diferencia es aún mayor si la fracción soluble se compara sólo con la

fracción covalentemente unida (CARBONATO) (8,2 en el control y 4,0 en las

transgénicas).

Además de los ácidos urónicos, medimos en paralelo azúcares totales en las

mismas fracciones pero no se encontraron diferencias significativas entre el control y

las líneas transgénicas. Sí se observó, en cambio, que la relación AU/Azúcares totales

fue mayor en las tres líneas transgénicas en las fracciones PAW, AGUA, CDTA,

CARBONATO y KOH 1M. Esto indica que las fracciones de pared están enriquecidas

en pectinas en el caso de los frutos transgénicos (Figura 6.3 B). La única excepción a
esta tendencia fue la fracción CDTA de la línea transgénica 39.

128
 Silenciamiento pectato liasa

mg de AU/100 mg pared celular

PAW AGUA CDTA CARBONATO KOH1M KOH4M

B
Relación AU/Azúcares (mol/mol)

PAW AGUA CDTA CARBONATO KOH1M KOH4M

Figura 6.3 A: Contenido en ácidos urónicos (AU) de la fracción PAW y de las otras fracciones
secuencialmente extraídas de la pared celular en frutos control (C) y tres líneas transgénicas
independientes con la pectato liasa silenciada (Apel 14, 23 y 39). B: Relación de los AU
respecto a los azúcares totales contenidos en estas mismas fracciones. Las barras de error
corresponden a desviaciones estándar.

El conjunto de estos resultados evidencian la existencia de una menor

solubilización de las pectinas en las paredes extraídas de las líneas transgénicas con

la pectato liasa silenciada. Esta interpretación además está apoyada por evidencias de
índole microscópica (Figura 6.4).

En las micrografías de cortes de tejido de fruto de transgénicas se observa una

tinción de pectinas más densa (más color rosado) entre las células del tejido cortical

de frutos transgénicos que en el tejido del fruto control. Además, existen menos
espacios intercelulares en el tejido de los frutos transgénicos, los cuales muestran más

129
 Capítulo 6

zonas de contacto entre células que en los frutos control. Esta aparente mayor

“adhesión” célula-célula en frutos transgénicos sugiere una mayor integridad de la

lámina media que tiene una naturaleza eminentemente péctica en su composición.

Figura 6.4.
6.4 Secciones de tejido cortical de fruto maduro de control y de dos líneas
transgénicas independientes, Apel 14 y 39, teñidas para la visualización de pectinas. Las
barras representan 50 µm.

6.2.4.-
6.2.4.- Análisis de las fracciones solubles mediante cromatografía
cromatografía de filtración en
gel

Los perfiles cromatográficos de los polímeros pécticos presentes en la fracción

PAW y AGUA se muestran en la Figura 6.5. Como carácter general, los perfiles
correspondientes a la fracción PAW presentan un pico principal asimétrico de

polímeros con una masa molecular mayor de 500 KDa que cae hacia la derecha
formando una cola de material de masas moleculares inferiores, extendiéndose
prácticamente por todo el rango de separación de la columna. La comparación de los

perfiles de los tres frutos transgénicos con el correspondiente al control sugiere un

pequeño incremento en la masa molecular media de las pectinas más solubles de los
frutos con la pectato liasa silenciada. Los tres perfiles de las muestras transgénicas, a

pesar de presentar una forma en conjunto similar al control, aparecen ligeramente

desplazados hacia la izquierda.

130
 Silenciamiento pectato liasa

Fracción PAW Fracción AGUA

Densidad óptica relativa (515 nm)

Volumen de elución (ml) Volumen de elución (ml)

Figura 6.5.
6.5 Perfiles cromatográficos de las fracciones PAW y AGUA de las paredes celulares
de frutos control y de las tres líneas Apel independientes con la pectato liasa silenciada. Los
perfiles se obtuvieron por cromatografía de filtración en gel usando Sepharosa CL-6B. A las
fracciones se les midió el contenido en ácidos urónicos, normalizando el valor a la máxima
absorbancia obtenida en cada perfil para facilitar las comparaciones cualitativas. El volumen de
vacío y la calibración de la columna se realizaron mediante dextranos de masa molecular
conocida y el volumen correspondiente a su pico de elución se indica con flechas en la parte
superior de la figura.

La fracción AGUA de los distintos genotipos muestran en cambio una población de

polímeros pécticos incluidos en un pico más simétrico que en el presente en las

fracciones PAW. Estos polímeros eluyen mayoritariamente entre los volúmenes que

van de 100 y 180 ml. La masa molecular media de estos picos es claramente inferior a
la de las pectinas solubilizadas con PAW. Los perfiles de las cuatro muestras

comparten un rango de elución similar, aunque en el control aparecen tres picos

diferenciados, con masas moleculares entre los 20 y 80 KDa, que no se observan en

131
 Capítulo 6

las líneas transgénicas. La mayoría de los poliurónidos solubilizados con agua migran

con masas moleculares aparentes comprendidas entre los 20 y 50 KDa.

6.2.5.-
6.2.5.- Análisis de las fracciones unidas a pared celular por cromatografía
cromatografía de
filtración en gel

El solvente CDTA se usa para extraer polímeros pécticos iónicamente unidos a

entre sí mediante enlaces en los que interviene el Ca2+, los perfiles cromatográficos

correspondientes a esta fracción de cada uno de los genotipos estudiados se

muestran en la Figura 6.6. Los polímeros eluyen a lo largo de todo el rango de la
columna aunque buena parte del perfil se encuentra por encima de los 2.000 KDa. La
principal diferencia entre el control y las líneas transgénicas es la presencia de un pico
de masa molecular elevada que eluye en el entorno de los de los 13 ml, ausente en las
tres líneas transgénicas estudiadas. En el perfil del control además se diferencian
claramente dos picos adicionales que eluyen a 18 y 23 ml y que no coinciden con los
picos de las líneas 14, 23 y 39, especialmente el pico que eluye a 18 ml.

Los perfiles obtenidos con los poliurónidos solubilizados con CARBONATO (Figura
6.6, columna derecha) muestran la presencia de un primer pico que eluye entre 10 y
15 ml y que corresponde a pectinas de muy alto peso molecular. En las tres líneas
transgénicas este primer pico tiene una masa molecular ligeramente superior a la que

se deduce del perfil de la muestra control. Este pico es más importante

cuantitativamente en las líneas 14 y 23. Se observa también un segundo grupo de

polímeros pécticos (fracciones comprendidas entre los 15 y los 20 ml) en las tres

líneas transgénicas que está ausente en el perfil del control, donde sólo se visualiza un
pequeño hombro en esa zona. El conjunto de polímeros que eluyen entre los 20 y los
30 ml representa cuantitativamente, al menos, la mitad de los poliurónidos totales
presentes en esta fracción y los perfiles de las líneas transgénicas sugieren que el
procesamiento de las pectinas es distinto en estos frutos.

132
 Silenciamiento pectato liasa

Fracción CDTA Fracción CARBONATO

Densidad óptica relativa (515 nm)

Volumen de elución (ml) Volumen de elución (ml)

Figura 6.6.
6.6 Perfiles cromatográficos de las fracciones CDTA y CARBONATO de las paredes
celulares de frutos control y de las tres líneas Apel independientes con la pectato liasa
silenciada. Los perfiles se obtuvieron por cromatografía de filtración en gel usando Sepharosa
CL-2B. A las fracciones se les midió el contenido en ácidos urónicos, normalizando el valor a la
máxima absorbancia obtenida en cada perfil para facilitar las comparaciones cualitativas. El
volumen de elución para el azul de dextrano (2.000 kDa) se muestra en la parte superior de la
figura.

De hecho, si comparamos los perfiles de la fracción CARBONATO con los de la

fracción CDTA, llama la atención que las muestras transgénicas muestren picos
resueltos a 13 y 18 ml, ausentes en control, y que se observe lo contrario en la
fracción CDTA. Esto sugiere que el silenciamiento de las pectato liasas modifica el

procesamiento de las pectinas de la pared primaria. Haciendo que determinado

conjunto de polímeros aparezcan en la fracción de CARBONATO en los frutos

transgénicos y que ello no ocurra en los frutos control quizá porque la pectato liasa sí
haya actuado en estos frutos.

133
 Capítulo 6

Peso de fruto (g)

Dureza (g—mm-1)
Peso
Dureza

V1 V2 B I R RM

B
Dureza (% incrementado
sobre frutos control)

V1 V2 B I R RM

Figura 6.7.
6.7 Peso y dureza de frutos de planta control y de dos líneas transgénicas durante el
desarrollo del fruto. A: Peso del fruto y dureza de frutos control en diferentes estadios: V1,
verde pequeño; V2, verde grande; B, blanco; I, intermedio (con al menos el 25% de la
superficie roja; R, Maduro (totalmente rojo); y RM, sobremaduro (fruto maduro almacenado 3
días a 25ºC en una cámara de crecimiento). B: Comparación porcentual de la dureza de frutos
de las líneas Apel 14 y 39 con respecto a la dureza de los frutos control en cada uno de los
estadios mencionados. La flecha del panel A indica el estadio después del cual las diferencias
entre los frutos control y las dos líneas transgénicas evaluadas son significativas.

Para apoyar esta hipótesis se obtuvieron los perfiles cromatográficos de pectinas

de la fracción CARBONATO de frutos verdes. Estos frutos fueron recolectados en el
estadio previo al momento en que se observa un decremento de la dureza. Este

reblandecimiento empieza normalmente a ponerse de manifiesto en la transición de

fruto verde a blanco (Figura 6.7 A). De hecho, sólo se observan diferencias
significativas en la dureza de los frutos, siendo mayor en las líneas transgénicas, con

posterioridad a ese momento (Figura 6.7 B). Con este experimento se intenta poner de

134
 Silenciamiento pectato liasa

manifiesto que las diferencias observadas en los cromatogramas de la fracción

CARBONATO de frutos rojos son el resultado de un procesamiento distinto en la pared

celular debido al silenciamiento de la pectato liasa durante la maduración. En

contrapartida, los cromatogramas de las paredes de los distintos genotipos en fruto

verde deberían ser similares y, por esta razón, se obtuvieron.

Los perfiles correspondientes a la fracción CARBONATO de fruto verde se

muestran en la Figura 6.8. Los cromatogramas de los cuatro genotipos muestran dos
picos bien definidos. El perfil de la línea Apel 39 se distingue un poco del resto por

presentar un primer pico menos prominente que los que aparecen en los otras tres
muestras. El primer pico eluye próximo a los 10 ml de la columna y su masa molecular
es próxima a la del primer pico observado en los extractos de CARBONATO de
plantas transgénicos en fruto rojo. El segundo pico formado por un conjunto de

polímeros de menor masa molecular es más ancho e importante cuantitativamente que

el primero y la masa molecular de su máximo es próxima a los 2.000 kDa.

Si comparamos estos perfiles con los de fruto rojo (Figura 6.6) lo que resulta
evidente es la pérdida de importancia relativa del primer pico de polímeros pécticos,
con volúmenes de elución entre los 8 y los 12 ml, frente al segundo grupo de
polímeros que eluyen formando el segundo pico entre los 18 y los 30 ml. Conviene

destacar que esta disminución es, desde el punto de vista cuantitativo, más importante
en las fracciones de los frutos control, donde supone un 50%, en comparación con las

líneas transgénicas Apel 14 y 23, donde este decremento sólo supone un 12 y un 23%
respectivamente. Además, en fruto rojo, también destaca en las fracciones
transgénicas la presencia de un pico entre los 15 y los 20 ml que está ausente en el

perfil la fracción CARBONATO control.

135
 Capítulo 6

Fracción CARBONATO de paredes celulares de fruto verde

Densidad óptica relativa (515 nm)

Volumen de elución (ml) Volumen de elución (ml)

Figura 6.8.
6.8 Perfiles cromatográficos de las fracciones CARBONATO de las paredes
celulares de frutos verdes de plantas control y de tres líneas Apel independientes con la
pectato liasa silenciada. Los perfiles se obtuvieron por cromatografía de filtración en gel usando
Sepharosa CL-2B. A las fracciones se les midió el contenido en ácidos urónicos, normalizando
el valor a la máxima absorbancia obtenida en cada perfil para facilitar las comparaciones
cualitativas. El volumen de elución para el azul de dextrano (2.000 kDa) se muestra en la parte
superior de la figura.

El hecho de que las fracciones enriquecidas en hemicelulosas extraídas con KOH

también contuviesen pectinas (basado en sus niveles de ácidos urónicos (AU)) y que

además existiesen diferencias en la relación AU/Azúcares totales entre el control y las

tres líneas transgénicas (Figura 6.3 B) nos llevó a considerar la necesidad de obtener
los cromatogramas de polímeros pécticos de las fracciones KOH 1M y KOH 4M

(Figura 6.9). Los perfiles de KOH 1M para el control y las líneas Apel 14 y 23, sugieren
que la presencia de pectinas en esta fracción es más bien residual pero la línea Apel
39 de nuevo presenta un comportamiento distinto al resto. En ella, la presencia péctica
es cuantitativamente mayor presentando un perfil con valores de absorbancia

claramente superiores y varios picos bien definidos.

136
 Silenciamiento pectato liasa

Fracción KOH 1M Fracción KOH 4M

Densidad óptica (515 nm)

Volumen de elución (ml) Volumen de elución (ml)

Figura 6.9. Perfiles cromatográficos de las fracciones KOH 1M y 4M de las paredes

celulares de frutos control y de las tres líneas Apel independientes con la pectato liasa
silenciada. Los perfiles se obtuvieron por cromatografía de filtración en gel usando Sepharosa
CL-2B. A las fracciones se les midió el contenido en ácidos urónicos y se presentan los valores
de densidad óptica a 515 nm directamente. El volumen de elución para el estándar azul de
dextrano (2.000 kDa) se muestra en la parte superior de la figura.

En lo que se refiere a los cromatogramas de las fracciones de KOH 4M, la cantidad

de pectinas fue baja y los picos residuales. Aun así, conviene destacar la existencia de
picos residuales de masa molecular elevada en las tres líneas transgénicas que están

ausentes en los perfiles control. Nos estamos refiriendo a los picos residuales que
eluyen entre los 10 y 13 ml y a los que lo hacen entre los 18-20 ml. Estos polímeros

pueden corresponder a los observados en la fracción CARBONATO de fruto ya que

eluyen en la misma posición.

137
 Capítulo 6

Cuando en estas mismas columnas se miden azúcares totales se obtiene el

conjunto de cromatogramas que presentamos en la Figura 6.10. Estos cromatogramas

presentan un pico muy mayoritario de azúcares en todas las muestras y columnas que
es cuantitativamente más importante de forma destacada y consistente en las

fracciones KOH 1M de los frutos control. De nuevo el comportamiento la línea Apel 39

es algo diferente al resto.

Fracción KOH 1M Fracción KOH 4M

Densidad óptica (450 nm)

Volumen de elución (ml) Volumen de elución (ml)

Figura 6.10
6.10.
10 Perfiles cromatográficos de las fracciones KOH 1M y 4M de las paredes
celulares de frutos control y de las tres líneas Apel independientes con la pectato liasa
silenciada. Los perfiles se obtuvieron por cromatografía de filtración en gel usando Sepharosa
CL-2B. A las fracciones se les midió el contenido de azúcares totales y se presentan los
valores de densidad óptica a 450 nm directamente. El volumen de elución para el estándar azul
de dextrano (2.000 kDa) se muestra en la parte superior de la figura.

138
 Silenciamiento pectato liasa

En relación a la naturaleza de los azúcares neutros de estas fracciones, un análisis

mediante cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas (GC-MS) de la

fracción KOH 4M hidrolizada con ácido trifluoracético (TFA) muestra que los azúcares

neutros que predominan son la glucosa, la xilosa y la ramnosa, con una relación molar
de 6:2,5:1, respectivamente. Ello supone, como se esperaba, una presencia

cuantitativamente importante de xiloglucanos (hemicelulosas) pero también la

existencia de ramnogalacturonanos (pectinas).

6.2.6.-
6.2.6.-Discusión

El principal objetivo de este trabajo era poner de manifiesto los cambios a nivel de
pared celular asociados con el silenciamiento de la pectato liasa en frutos de fresa.
Este objetivo complementaba el desarrollado en el trabajo previo de Jiménez-
Bermúdez y col. (2002), donde ya mostramos que este silenciamiento se
correlacionaba con un menor reblandecimiento de los frutos transgénicos en un estado
de maduración similar (fruto rojo). En esa misma publicación se describía una
caracterización muy preliminar de la pared celular que hemos ampliado en este trabajo
con vistas a poner de manifiesto si esa mayor dureza de los frutos pudiera estar
relacionada con un distinto procesamiento de la matriz péctica de sus paredes
celulares.

Para ello, hemos aplicado un procedimiento de extracción secuencial que nos

permite distinguir fracciones enriquecidas en pectinas dentro de un rango que va de

menor a mayor afinidad (enlace) con la pared celular. Este rango de afinidades viene
determinado por el orden temporal del protocolo de extracción: fracciones menos
ligadas a la pared y, por tanto, más fácilmente extraíbles son obtenidas antes que
aquellas con mayor afinidad que son extraídas después. Este procedimiento también

permite proponer una localización más probable de las pectinas extraídas en lámina
media o pared primaria en función del solvente empleado para solubilizar las pectinas,

como comentamos más adelante.

139
 Capítulo 6

Como ejemplo podemos citar la fracción extraída con Fenol:Acético:Agua, (PAW

por sus siglas en inglés). De acuerdo con Fry (1988), “el PAW” es un mal solvente de

polisacáridos pécticos por lo que se considera que las pectinas que aparecen en esta
fracción se encontraban previamente solubles en la fracción líquida de la pared, en el

apoplasto, por mecanismos que actúan in vivo. Estos mecanismos se consideran en

buena medida ajenos al medio de extracción empleado (Redgwell y col., 1992; 1997a).
En cambio, las extracciones con CDTA y carbonato sódico promueven

respectivamente la solubilización y/o extracción de pectinas ligadas iónica y

covalentemente a la pared celular como resultado del propio procedimiento, jugando
un papel importante el solvente o tratamiento químico utilizado.

En lo que se refiere a los datos de la fracción PAW, la cantidad media de fracción

obtenida respecto a la cantidad de pared celular utilizada es inferior en las tres líneas
transgénicas estudiadas que en las muestras control. También es menor el contenido

de ácidos urónicos de esta fracción en los extractos provenientes de las plantas

transgénicas, pero no hubo diferencias estadísticas con respecto a los extractos
control en la relación ácidos urónicos/azúcares totales (Figura 6.3 B). El proceso de

solubilización in vivo de las pectinas es considerable en todos los genotipos ya que

ésta es la fracción con más contenido péctico de las extraídas a pesar de que, como
hemos mencionado, el tratamiento con PAW las solubiliza muy escasamente (Fry,

1988). Además de este hecho, conviene hacer notar que las medias del contenido son
menores en las muestras transgénicas. Ello sugiere una menor solubilización péctica
in vivo en estas líneas, aunque estadísticamente esta tendencia sólo es significativa en
el caso de la línea Apel 23. Las diferencias no son sólo cuantitativas, también se

observan ligeras diferencias en el grado de polimerización de los polímeros resueltos

en los cromatogramas. En todos los genotipos, el pico principal de los perfiles se
encontraba entre los 500 KDa y el volumen de vacío de la columna. Los perfiles
obtenidos fueron muy similares a los obtenidos por Redgwell y col. (1997b) para frutos
de fresa. Estos autores observaban un pequeño decremento en el peso medio de las

pectinas solubles cuando se comparaba fruto inmaduro con maduro, nosotros

observamos este pequeño decremento al comparar fruto transgénico con no

140
 Silenciamiento pectato liasa

transgénico. Ello puede ser interpretado en el sentido de una menor despolimerización

en las líneas silenciadas.

Por su parte, la fracción AGUA contiene polímeros fácilmente extraíbles que

interactúan débilmente con otros componentes de la pared celular, pero que no son
solubilizados con el PAW ya que las diferencias son evidentes al comparar los perfiles

cromatográficos de ambas fracciones. Las masas moleculares medias de la fracción

solubilizada con AGUA son claramente inferiores a las de las pectinas de la fracción
PAW. Hay pequeñas diferencias entre los cromatogramas del control y las

transgénicas pero consideramos más relevante el que la cantidad extraída de fracción

AGUA en el control por unidad de peso de pared celular sea mayor y presente una
baja relación ácidos urónicos/azúcares totales (Figura 6.3 B). Esto indica una mayor
solubilización por el agua de los polímeros pécticos en la pared del control.

En lo que se refiere a las fracciones CDTA y CARBONATO, que representan

fracciones enriquecidas en pectinas más ligadas a la pared, las diferencias fueron más

relevantes. El contenido de AU de la fracción CDTA fue superior en las tres líneas

transgénicas con un porcentaje medio de incremento del 52%. Por otro lado, existe un
cierto consenso en torno a la idea de que las pectinas solubilizadas con CDTA
corresponden con el homogalacturonano localizado in vivo en la lámina media

(Redgwell y col., 1992; Lara y col., 2004). Junto al hecho de este mayor contenido en
ácidos urónicos, nuestros resultados histológicos muestran una mayor tinción de

pectinas en la lámina media en los cortes de frutos transgénicos que podría deberse a

una menor solubilización y/o degradación de este componente en los frutos con la
pectato liasa silenciada. Debemos mencionar que el trabajo previo (Jiménez-

Bermúdez y col., 2002) incluía un caracterización preliminar de la pared celular de una

de las líneas transgénicas en la que encontramos un menor contenido de polímeros
pécticos solubilizados con CDTA. Sin embargo, esa fracción no se correspondería a la

del presente trabajo ya que la obtención de paredes y el fraccionamiento fue diferente.

La obtención de fracciones se inició a partir de un residuo insoluble en alcohol y los

lavados y procesamientos de material fueron distintos. Probablemente la fracción

soluble en quelante de aquel trabajo contenía también parte de las pectinas

141
 Capítulo 6

solubilizadas en fracciones PAW y AGUA en el presente estudio, de ahí la falta de

correspondencia entre aquél y este resultado. Es un hecho que al aplicar protocolos

diferentes se obtienen resultados distintos (Redgwell y col., 1992; Rosli y col., 2004) y
que también puede haber cambios en los polímeros extraídos como resultado de la

propia metodología empleada (Mort y col., 1991; Rose y col., 2003; Brummell, 2006).

Fue por ello que antes de este trabajo dedicamos esfuerzos y tiempo a probar distintos
protocolos y buscar un procedimiento que fuese robusto y permitiera comparaciones

con otros autores que hubieran publicado resultados en fresa (Redgwell y col., 1997b;

Koh y Melton, 2002; Lara y col., 2004) (para detalles ver capítulo 4 “Elección y puesta
a punto del protocolo de extracción y fraccionamiento de la pared celular”).

El análisis cromatográfico de la población de poliurónidos de las muestras de

CDTA y CARBONATO también evidenció diferencias cuantitativas y cualitativas entre
los perfiles control y los correspondientes a las muestras de las líneas transgénicas.

Entre ellas, una mayor representación de poblaciones de polímeros de alta masa

molecular en los perfiles de la fracción CARBONATO, especialmente evidente en el
caso de la línea Apel 14. También sugerimos que la comparación de los perfiles de la

fracción CDTA y CARBONATO puede interpretarse en el sentido de un diferente

procesamiento en las líneas transgénicas. Esta sugerencia se fundamenta en el hecho
de que determinados grupos de polímeros aparezcan en los cromatogramas de

fracciones más ligadas en el caso de las muestras transgénicas. El dato en concreto

es que el perfil de la fracción CDTA de la muestra control presenta dos picos, con
máximos en los 13 y 18 ml, que son residuales o no aparecen como tales en las

muestras transgénicas. Sin embargo, encontramos picos con estos mismos máximos

en los perfiles de la fracción CARBONATO de las muestras Apel 14, 23 y,

parcialmente, en Apel 39, donde estos picos aparecen claramente en la fracción KOH

4M. Es decir, parece que las familias de los polímeros de alta masa molecular
representadas en estos picos bien diferenciados se solubilizasen en menor medida en
las líneas transgénicas y por eso aparecen en fracciones más ligadas a la pared.

Nuestra hipótesis es que el silenciamiento de la pectato liasa ha disminuido la

despolimerización de las fracciones pécticas más fuertemente unidas y/o ha alterado

142
 Silenciamiento pectato liasa

las interacciones y procesamiento entre distintos componentes estructurales de esta

matriz resultando el conjunto de estos efectos en una menor solubilización de

pectinas. Este resultado se puede explicar cómo causado directamente por una menor

actividad pectato liasa in muro en sitios específicos y/o ser también resultado de la
menor acción de otras enzimas de pared celular que encuentren más dificultades para
acceder a esqueletos pécticos específicos en las líneas transgénicas. Estas otras

enzimas podrían ser la poligalacturonasa y la pectin metilesterasa. Ello podría explicar

las diferencias mencionadas en la masa molecular media de los polímeros pécticos y

la presencia de picos con volúmenes de elución similares en distintas fracciones.

También se debe considerar que la acumulación de poliurónidos no se detiene

durante la maduración del fruto de fresa (Huber, 1984). Por tanto, no se puede
descartar que el silenciamiento de la pectato liasa interfiera el ensamblaje de estos
poliurónidos recién incorporados afectando la composición y arquitectura de la pared
en los frutos maduros transgénicos. Por otro lado, la inmunolocalización de la pectato

liasa con anticuerpos policlonales muestra que la expresión ocurre en la pared celular
primaria de células parenquimáticas del receptáculo (Benítez-Burraco y col., 2003)
pero nuestros resultados a nivel de microscopía muestran también que la pérdida de
lámina media está limitada en las líneas transgénicas lo que sugiere que este
componente de la pared es también un lugar de actuación de la pectato liasa. Además,
en relación a la cuestión de la adhesión celular, conviene destacar que un estudio
donde se evalúa la adhesión celular en células parenquimáticas de raíz de remolacha
sugiere que los polímeros pécticos presentes en la fracción CARBONATO son también
importantes para mantener las uniones célula a célula (Marry y col., 2006). Este último
resultado encaja bien con la menor despolimerización y solubilización observada en

esa fracción en el presente estudio ya que ello se podría correlacionar con una mayor
adhesión.

Nuestros resultados también muestran un contenido hemicelulósico menor en las

líneas transgénicas de la fracción KOH 1M y KOH 4M que, de acuerdo al análisis de

azúcares, están enriquecidas en xiloglucanos. Además, en los cromatogramas de la

fracción KOH 4M de las líneas transgénicas se observa un ligero decremento de la

143
 Capítulo 6

masa molecular media del pico de hemicelulosas, principalmente en Apel 14. Este

efecto inesperado del silenciamiento de la pectato liasa en el contenido de polímeros

de xiloglucanos no es fácil de explicar, aunque no es nuevo, ya que existen referencias

de efectos pleiotrópicos similares (Brummell y col., 1999). Este resultado pone de

manifiesto la complejidad del metabolismo de la pared celular donde la cooperación e

interacción entre las enzimas que procesan la pared y las redes de polisacáridos que
la constituyen son determinantes y deben ser muy tenidos en cuenta (Rose y Bennett,

1999; Vicente y col., 2007).

En resumen, hemos demostrado que la mayor dureza de los frutos en estadio rojo
de tres líneas transgénicas independientes con una fuerte supresión en la expresión

de la pectato liasa se correlaciona consistentemente con un metabolismo péctico

modificado, así como en diferencias en la interacción entre los polímeros presentes en
la pared y en la adhesión entre las células parenquimáticas de estos frutos. Estos
resultados, junto a los aportados por Rosli y col. (2004) y Villarreal y col. (2008),

sugieren que las enzimas implicadas en la despolimerización de las pectinas juegan

un papel más importante de lo que se creía en el reblandecimiento del fruto de fresa.

Además, este estudio pone de manifiesto que la pectato liasa, bastante menos
estudiada que otras enzimas pectinolíticas como la poligalacturonasa y la pectin
metilesterasa, es un miembro importante del equipo de pectinasas que actúan
sinérgicamente en el desmantelamiento de la pared celular.

Desde el momento de la realización de este trabajo hasta el de la confección de la

memoria escrita, nuestro grupo de investigación y otros interesados en el tema han

completado la caracterización fenotípica de estas plantas y han ampliado el número de

enzimas estudiadas funcionalmente. Esto ha permitido documentar más cambios

asociados con la sobreexpresión o el silenciamiento de distintos genes, tanto a nivel
del fenotipo de los frutos y sus procesados, como del componente péctico de sus

paredes celulares.

En lo que se refiere a la pectato liasa, Youssef y col. (2009), mediante una

construcción que pretendía la sobreexpresión de este gen en el mismo cultivar,

obtuvieron plantas en las que la expresión estaba, sin embargo, co-suprimida. La

144
 Silenciamiento pectato liasa

limitación de la expresión fue menor que la de las plantas silenciadas de nuestro

estudio y ello se tradujo a nivel fenotípico en frutos más duros que los controles pero

algo más blandos que los analizados en este trabajo, confirmando por tanto nuestros

resultados con una construcción génica distinta en frutos transgénicos obtenidos

independientemente. Otros trabajos han ampliado la caracterización fenotípica de los

frutos con la pectato liasa silenciada poniendo de manifiesto un comportamiento

textural diferente durante el almacenamiento postcosecha y también de los productos

obtenidos al procesar frutos. En lo que se refiere a lo primero, los frutos transgénicos

almacenados a 5ºC durante una semana fueron más duros que los controles al

principio y final del periodo de almacenaje, siendo además su tasa de

reblandecimiento diaria menor (García-Gago y col., 2009). A nivel de procesamiento

para mermeladas, las obtenidas de frutos transgénicos mantenían fragmentos de

frutos de mayor tamaño y más firmes que las obtenidas de frutos controles (Sesmero y
col., 2007). Esto se considera un factor de calidad en este tipo de productos. En
cuanto a los zumos obtenidos de estos frutos, fueron más viscosos que los obtenidos

de frutos controles y ello se asoció a un mayor contenido de partículas grandes en la

fracción sólida de este producto (Sesmero y col., 2009). Estos resultados apoyan la

consistencia del papel propuesto para la pectato liasa en el desmantelamiento del

componente péctico de la pared y las consecuencias que ello tiene en la textura de los
frutos y sus procesados. A nivel estructural, también se ha realizado un gran esfuerzo
para incrementar las evidencias experimentales en favor de nuestra hipótesis. De

hecho, nuestra interpretación de los resultados obtenidos con las columnas de

cromatografía se ha confirmado en buena medida usando la microscopía de fuerza

atómica (conocida como AFM por sus siglas en inglés). Esta técnica permite la

caracterización topográfica de muy distintos tipos de muestras biológicas con un

mínimo procesamiento “sintiéndolas más que viéndolas”. Fue inicialmente descrita por
Binnig y col. (1987) y empleada posteriormente con muestras de pectinas (Kirby y col.,

1995). La resolución que permite es de nivel nanoestructural y nuestro grupo la ha

empleado para caracterizar las distintas fracciones pécticas a las que nos hemos

estado refiriendo en esta memoria. Permite obtener imágenes de cadenas aisladas,

ramificaciones y agregados micelares presentes en las distintas muestras. La técnica

145
 Capítulo 6

se aplicó con éxito a las fracciones CDTA y CARBONATO de nuestro material no

transgénico y se empleó en paralelo una caracterización cualitativa de estas fracciones

mediante espectroscopía infrarroja por transformada de Fourier (Posé y col., 2012).

Esta última técnica evidenció algunas pequeñas diferencias espectrales en el rango de

longitudes de onda comprendido entre los 1.200 y los 900 cm-1 indicativas de que la

fracción CARBONATO estaba posiblemente enriquecida en ramnogalacturonano I, tal

y como hemos sugerido previamente en esta memoria. En ambas fracciones, la

población de cadenas visualizadas mediante AFM mostraba una distribución log

normal con medianas significativamente diferentes, 85 vs 65 nm, para las fracciones

CDTA y CARBONATO, respectivamente. Un nueve por ciento de las cadenas
presentes en ambas fracciones estaban ramificadas, aunque en la fracción

CARBONATO era más frecuentemente la presencia de más de una ramificación por

cadena. La longitud de las ramificaciones también fue mayor en el caso de la fracción

CDTA. En las muestras de ambas fracciones se visualizó de forma consistente y

repetida la presencia de unas estructuras no lineares denominadas agregados
micelares, también observados en otros trabajos (Morris y col., 2009). Una vez
optimizadas las condiciones para aplicar la técnica y para realizar el tratamiento de los

resultados obtenidos, se aplicó a las fracciones extraídas de los frutos con la pectato
liasa silenciada (Posé y col., 2015). Las medianas de las longitudes de las cadenas

aisladas fueron mayores en los frutos transgénicos que en las muestras de frutos
controles, siendo las diferencias significativas en la fracción CDTA. Esto apoyaría la
menor despolimerización de estas fracciones, algo que nosotros sugerimos para la

fracción CARBONATO basándonos en los resultados cromatográficos. Si bien hay que

indicar que la filtración en gel diferencia más en nuestras muestras el comportamiento
de grupos de polímeros que de cadenas aisladas. Además, las imágenes de AFM

también mostraban que las cadenas de la fracción CARBONATO estaban más

ramificadas y había una mayor presencia de agregados micelares. Esto pone en
evidencia que el silenciamiento de la pectato liasa modifica, no sólo la longitud de las

cadenas, sino su nivel de ramificación y el nivel de agregación observado en las

muestras. Este conjunto de resultados estructurales apoya también el papel propuesto

146
 Silenciamiento pectato liasa

para la pectato liasa en el desmantelamiento de la matriz péctica que ocurre durante el

reblandecimiento de los frutos de fresa.

Otras enzimas que comparten con la pectato liasa el hecho de actuar sobre las

cadenas de homogalacturonano son la pectin metilesterasa (PME) y la

poligalacturonasa (PG). Cómo ya detallamos en el capítulo de introducción, la

actividad pectin metilesterasa es necesaria para que puedan actuar la pectato liasa y

la poligalacturonasa, ya que ambas requieren fragmentos de homogalacturonanos

demetilados. En Fragaria vesca, la sobreexpresión de uno de los cuatro genes

identificados de PME en la fresa cultivada provocó una disminución del 20% en la

metilación de las pectinas solubles y extraídas con CDTA (Osorio y col., 2008). El perfil
cromatográfico de la fracción CARBONATO de las dos líneas transgénicas analizadas
mostró, en contra de lo esperado, que la masa molecular media de los polímeros
pécticos fuese mayor que la observada en la fracción control correspondiente. En este
caso, a diferencia de lo que ocurre en nuestras plantas, este hecho no se correlacionó
con un aumento de la firmeza de los frutos que sí mostraron una mayor tolerancia a la
infección por Botrytis cinerea. En parte, ello podría ser consecuencia de un efecto
barrera de la pared celular pero los autores del trabajo correlacionaron más bien este

hecho con la expresión constitutiva en los frutos transgénicos de los genes de

patogénesis. Por último, se propuso que esta expresión constitutiva era inducida por
una mayor presencia de oligogalacturónidos de pequeño tamaño (OGAs) en las
plantas transgénicas a causa de la sobreexpresión de la PME. En lo que se refiere a la

poligalacturonasa, como comentamos en el capítulo introductorio, nuestro grupo ha

caracterizado los frutos de plantas de fresa con el gen FaPg1 silenciado (Quesada y

col., 2009). Estos frutos fueron más duros que los de plantas controles y, también, que
los frutos con la pectato liasa silenciada descritos en el presente trabajo. Los frutos
transgénicos también mostraron un mejor comportamiento postcosecha (Quesada y
col., 2009; García-Gago y col., 2009), al igual que ocurría con nuestros frutos. Otros

autores, en Fragaria chiloensis, han demostrado que los niveles de expresión de PG

correlacionan positivamente con el reblandecimiento (Figueroa y col., 2008). En lo que
se refiere al procesamiento de las pectinas en los frutos con la PG silenciada, se ha
visto que el menor reblandecimiento de nuevo se correlacionó con una menor

147
 Capítulo 6

solubilización de las pectinas y una mayor proporción de pectinas en la fracción

CARBONATO (Quesada y col., 2009). Las paredes celulares obtenidas de los frutos

transgénicos se hinchaban menos in vitro y las cromatografías de filtración en gel de

las fracciones CDTA y CARBONATO mostraron en los dos casos un desplazamiento

de los picos presentes hacia menores volúmenes de elución en comparación con los

cromatogramas controles (Posé y col., 2013). Esto es indicativo de masas moleculares

medias mayores de los grupos de polímeros en el caso de los frutos transgénicos,

siendo posiblemente resultado de una menor despolimerización de las pectinas en

estas muestras. El perfil de la muestra CDTA transgénica mostró los tres picos que
también aparecen en las muestras control, a diferencia de lo observado en nuestros
perfiles para las muestras con la pectato liasa silenciada. Esto sugiere que, aunque

ambas enzimas actúan sobre cadenas de homogalacturonano demetiladas, sus

lugares de actuación in muro no son coincidentes. Pareciendo que en el caso de la PG

la actuación es menos localizada. En esta dirección apuntan también las pruebas

estructurales obtenidas mediante AFM (Posé y col., 2015). Las medianas de las
cadenas aisladas visualizada en la muestras de la PG silenciada son
significativamente mayores que las de muestras control en el caso de la fracción

CDTA y CARBONATO. Sin embargo, sólo era así en el caso de la fracción

CARBONATO de las muestras con la pectato liasa silenciada. Sin ser

estadísticamente significativo, estas medianas de las muestras de frutos con la PG

silenciada son numéricamente mayores que las de fracciones con la pectato liasa
silenciada. Las muestras con la PG silenciada también mostraron una mayor

complejidad estructural a nivel de la existencia de ramificaciones en las cadenas. Los

porcentajes de cadenas con ramificaciones fueron prácticamente del 18% en ambas
fracciones (PG silenciada). En controles y muestras Apel de la fracción CDTA, sólo un

7,2% de cadenas estaban ramificadas y en la fracción CARBONATO estos valores

fueron del 9,4% (control) y del 14,3% (Apel). También fue superior el porcentaje de
cadenas que presentaban más de una ramificación en las plantas con la PG

silenciada, en ambas fracciones, y esto sólo se observó en la fracción CARBONATO

para las muestras Apel (Posé y col., 2015). Poniendo de manifiesto que los cambios

observados en las plantas con la pectato liasa silenciada son más evidentes en la

148
 Silenciamiento pectato liasa

fracción CARBONATO (pared primaria) que en la fracción CDTA (lámina media),

mientras que se observaban cambios significativos en las dos fracciones cuando las

muestras provenían de frutos con la poligalacturonasa silenciada.

Las pectinasas no sólo actúan sobre el homogalacturonano, sino que también son
importantes los efectos de su actividad enzimática en el ramnogalacturonano I (RGI).

Especialmente, las que se dan en las ramificaciones laterales de galactanos y

arabinanos que se encuentran enlazadas a los residuos de ramnosa del disacárido

que constituye la unidad estructural básica del esqueleto de RGI. Como comentamos

en el capítulo introductorio, la galactosa y la arabinosa son los azúcares neutros que

más disminuyen durante la maduración del fruto de fresa y esa pérdida se
corresponde con la digestión de las cadenas laterales mencionadas. Esta pérdida
también se ha relacionado con el incremento de la solubilización de las pectinas

durante la maduración de los frutos (Koh y Melton, 2002; Brummell, 2006). Entre las
enzimas involucradas en este desmantelamiento están las β-galactosidasas y las α-

arabinofuranosidasas (Rosli y col., 2009; Figueroa y col., 2010). En el caso concreto

de las β-galactosidasas, se habían descritos en fresa tres genes con una expresión
compleja en fruto (Trainotti y col., 2001). De ellos, sólo el denominado FaβGal1 mostró
valores de expresión más elevados en fruto maduro. Más recientemente, se ha

descrito un cuarto gen, FaβGal4, cuyo silenciamiento por nuestro grupo de trabajo ha
permitido la obtención de dos líneas, de un total de nueve líneas independientes

transgénicas, que manifestaron a nivel fenotípico un incremento de la dureza de los

frutos del 30% con respecto a frutos controles (Paniagua y col., 2015). Este gen se
expresa preferentemente en el receptáculo de frutos maduros, estando regulado

positivamente por el ácido abscísico y negativamente por auxinas. A nivel de la

caracterización de las paredes de estos frutos, se encontró un incremento de las
pectinas presentes en la fracción CARBONATO, como ocurre en el caso de las plantas

con la pectato liasa y la poligalacturonasa silenciadas. La cantidad de galactosa en las

paredes extraídas fue un 30% superior que en las paredes de plantas control, siendo
especialmente evidente en la fracción KOH 1M. Esto podría sugerir que estas pectinas

con galactanos pueden estar interaccionando de algún modo con la matriz de

xiloglucanos de la pared. Estos resultados son una evidencia experimental de que el

149
 Capítulo 6

desmantelamiento de las cadenas laterales de galactanos juega un papel en la

solubilización de las pectinas. El silenciamiento de otras β-galactosidasas también se

ha evaluado en tomate pero los resultados obtenidos a nivel de reblandecimiento no

han sido tan concluyentes debido a una compleja expresión temporal de los distintos

genes de β-galactosidasa silenciados y no silenciados en estos frutos (Smith y col.,

2002; Moctezuma y col., 2003; Paniagua y col., 2015). El efecto del silenciamiento de
la β-galactosidasa en el reblandecimiento puede ser indirecto, causado por la

limitación del acceso a zonas de actuación de otras enzimas, como la pectato liasa y la

poligalacturonasa, que serían las verdaderas responsables del reblandecimiento. De

todos modos, no se puede descartar un efecto directo en la firmeza de los frutos, ya
que en guisante el incremento de cadenas de galactanos que ocurre en la última fase

del desarrollo de los cotiledones se traduce en un incremento de la firmeza del tejido

(McCartney y col., 2000). Otra enzima silenciada transitoriamente en fresa que actúa

sobre RGI y con efecto en la solubilización de pectinas asociadas a la lámina media es

la ramnogalacturonasa liasa 1 (FaRGLyase1) (Molina-Hidalgo y col., 2013). Para
explicar su actuación en lámina media se propone también un efecto indirecto similar
al comentado anteriormente. Aunque, una posibilidad alternativa sería asumir el

modelo de pared celular propuesto por Vincken y col. (2003) que considera a RGI el
esqueleto péctico principal al que se anclan cadenas de homogalacturonano. En este

modelo, el desmantelamiento de RGI por actuación de la RG-liasa tendría

consecuencias evidentes en la lámina media ya que las cadenas de
homogalacturonano dejarían de estar ancladas a la pared primaria, donde se

encuentra la cadena principal de RGI, y sería más fácil su solubilización.

Además de estas pectinasas, también se ha silenciado en frutos de fresa dos

endo-glucanasas FaEG1 (Wooley y col., 2001) y FaEG3 (Mercado y col., 2010) sin

que ello tuviera efecto en la firmeza de los frutos en los dos casos. En el caso de las
plantas de FaEG3, a nivel de pared celular se observó que las líneas silenciadas
contenían más hemicelulosa y esta era de una masa molecular media ligeramente

superior a la extraída de frutos controles (Mercado y col., 2010). También se

obtuvieron plantas doblemente silenciadas, frente a la endoglucanasa FaEG3 y la

pectato liasa (Youssef y col., 2013) y los resultados a nivel de firmeza de fruto fueron

150
 Silenciamiento pectato liasa

similares a los que se obtenían silenciando sólo con la pectato liasa. Por último, indicar
que esta aproximación funcional también se ha empleado para silenciar una

expansina, FaExp2, en fresa (García-Gago y col., comunicación personal) sin observar

que este silenciamiento tuviera efecto en la firmeza de los frutos, aunque bastantes de
las líneas obtenidas eran poco vigorosas y tenían un crecimiento limitado. Lo que

sugiere que FaExp2 puede estar más involucrada en regular el crecimiento que en

firmeza.

El conjunto de estas aproximaciones funcionales indican que el desmantelamiento

de las pectinas, a nivel del homogalacturonano y/o del ramnogalacturonano I, con

distintas enzimas actuando de forma temporal y espacialmente coordinada explica, al
menos en parte, el reblandecimiento del fruto de fresa. Los resultados que emplean el
análisis funcional mediante transgénesis en fresa y manzana (Atkinson y col., 2012) no

son coincidentes con los obtenidos en otros modelos, como él del tomate. A pesar de
este hecho, durante años se ha asumido que los resultados obtenidos en este último

fruto eran generalizables, algo que nuestros resultados y los de otros autores han
puesto en cuestión.

151
 CAPÍTULO 7.

Conclusiones
 Conclusiones

7.- Conclusiones

1.- De los tres protocolos evaluados, dos basados en procedimientos publicados y

el tercero una modificación de ellos, optamos por adoptar la metodología de extracción
propuesta por Redgwell y col., (1992). Basamos esta elección en que su rendimiento,

preservación de las fracciones y facilidad de comparación con otros trabajos

publicados iguala o supera a los otros dos.

2.- La cantidad de pared celular por peso de fruto extraída en estadio rojo es ocho
veces inferior a la presente en fruto verde y esta tendencia se mantiene en todo el

fraccionamiento posterior. En cambio, el porcentaje de pectinas presentes en la pared

se duplica pasando de un 30% en fruto verde a un 60% en rojo. Las paredes en fruto
rojo también presentan una mayor capacidad de hinchamiento in vitro.

3.- Las fracciones más enriquecidas en pectinas en fruto rojo son la fracción AGUA
y CDTA lo que se puede interpretar como una solubilización de este componente que
es paralela a una ligera despolimerización, también observada en la fracción
CARBONATO. En estadio rojo, las fracciones hemicelulósicas (KOH 1 y 4M) se
encuentran enriquecidas en azúcares neutros y también sufren una despolimerización

en su componente de mayor masa molecular.

4- El silenciamiento de la pectato liasa en estadio rojo provoca una reducción en la

solubilización de los polímeros pécticos y una limitación en la despolimerización de las

pectinas, especialmente evidente en las unidas covalentemente. Como un efecto

colateral, también se observa una disminución del principal componente

hemicelulósico presente en los perfiles cromatográficos. Por tanto, el silenciamiento

contrarresta parte de los procesos de desmantelamiento de la pared celular que
ocurren en los frutos rojos no transgénicos y, probablemente, este hecho esté
relacionado con la mayor dureza de los frutos silenciados.

155
CAPÍTULO 8.

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8.-
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CAPÍTULO 9.

Anexos
Anexo I
Journal of Experimental Botany, Vol. 59, No. 10, pp. 2769–2779, 2008
doi:10.1093/jxb/ern142 Advance Access publication 2 June, 2008
This paper is available online free of all access charges (see http://jxb.oxfordjournals.org/open_access.html for further details)

RESEARCH PAPER

Antisense inhibition of a pectate lyase gene supports a role

for pectin depolymerization in strawberry fruit softening

Nieves Santiago-Doménech1, Silvia Jiménez-Bemúdez1, Antonio J. Matas1, Jocelyn K. C. Rose2,

Juan Muñoz-Blanco3, José A. Mercado1 and Miguel A. Quesada1,*
1
Departamento de Biologı´a Vegetal, Facultad de Ciencias, Universidad de Málaga, Campus de Teatinos s/n, 29071
Málaga, Spain
2
Department of Plant Biology, Cornell University, Ithaca, NY 14850, USA
3
Departamento de Bioquı´mica y Biologı´a Molecular, Universidad de Córdoba, 14071 Córdoba, Spain

Received 25 January 2008; Revised 20 April 2008; Accepted 21 April 2008

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Abstract pectate lyase plays an important degradative role in
the primary wall and middle lamella in ripening
Cell wall disassembly in softening fruits is a complex
strawberry fruit, and should be included in synergistic
process involving the cumulative action of many
models of cell wall disassembly.
families of wall-modifying proteins on interconnected
polysaccharide matrices. One strategy to elucidate the Key words: Cell wall, Fragaria, fruit ripening, pectate lyase,
in vivo substrates of specific enzymes and their pectinases, strawberry.
relative importance and contribution to wall modifica-
tion is to suppress their expression in transgenic fruit.
It has been reported previously that inhibiting the
Introduction
expression of pectate lyase genes by antisense tech-
nology in strawberry (Fragaria3ananassa Duch.) fruit The ripening of fleshy fruits is commonly accompanied by
resulted in prolonged fruit firmness. This suggested pronounced softening, which has been mechanistically
that pectin depolymerization might make a more im- linked with both enzyme-mediated (Brummell and Harpster,
portant contribution to strawberry fruit softening than 2001; Brummell, 2006) and non-enzymatic (Dumville and
is often stated. In this present study, three indepen- Fry, 2003) cell wall degradation. Recent evidence sug-
dent transgenic lines were identified exhibiting gests that ripening-related changes in fruit cell turgor
a greater than 90% reduction in pectate lyase tran- pressure also have a critical influence on fruit firmness
script abundance. Analyses of sequential cell wall (Saladié et al., 2007), but to date far more studies have
extracts from the transgenic and control fruit collec- focused on changes in wall composition, architecture, and
tively showed clear quantitative and qualitative differ- associated wall-modifying proteins (Vicente et al., 2007).
ences in the extractability and molecular masses of A number of specific changes in wall structure appear
populations of pectin polymers. Wall extracts from common to most ripening fruits and a general model for
transgenic fruits showed a reduction in pectin solubil- cell wall disassembly can be widely applied. However,
ity and decreased depolymerization of more tightly more detailed studies of wall metabolism have revealed
bound polyuronides. Additional patterns of differential clear examples of interspecific variability (Brummell and
extraction of other wall-associated pectin subclasses Harpster, 2001; Rose et al., 2003). Some of these can be
were apparent, particularly in the sodium carbonate- correlated with differences in the texture of the ripe fruit
and chelator-soluble polymers. In addition, microscopic that can, for example, be classified as soft and melting, or
studies revealed that the typical ripening-associated crisp.
loss of cell–cell adhesion was substantially reduced in Strawberry (Fragaria3ananassa Duch.) is included in
the transgenic fruits. These results indicate that a group of fruits that develop a soft melting texture during
growth and ripening. This coincides with numerous

* To whom correspondence should be addressed. E-mail: quefe@uma.es

ª 2008 The Author(s).

This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License (http://creativecommons.org/licenses/by-nc/2.0/uk/) which
permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.
2770 Santiago-Doménech et al.
modifications of the primary cell wall and degradation of Several pectate lyase genes have been identified in
the middle lamella, including an increase in pectin different fruits, with expression patterns increasing during
solubilization, depolymerization of xyloglucan, and cell ripening (Domı́nguez-Puigjaner et al., 1997; Medina-
wall swelling (Redgwell et al., 1997b; Koh and Melton, Escobar et al., 1997; Nunan et al., 2001), but in general
2002). The swelling phenomenon in turn correlates far less is known about pectate lyase activity, localization,
in vitro with pectin metabolism and possibly loosening of regulation, or contribution to pectinolysis than PG
the xyloglucan–cellulose network in vivo (Redgwell et al., (Brummell and Harpster, 2001). It has been reported
1997b; Brummell, 2006). A number of other studies have previously that inhibiting the expression of a strawberry
reported particular aspects of wall restructuring in ripening pectate lyase gene by antisense transformation resulted in
strawberry fruit (e.g. Lara et al., 2004; Rosli et al., 2004) firmer fruits with an extended post-harvest shelf-life
and, in addition to the widely reported increase in pectin (Jiménez-Bermúdez et al., 2002). Three fruit-specific
solubilization, several have described hemicellulose de- pectate lyase genes with similar expression patterns have
polymerization (Huber, 1984; Nogata et al., 1996; Rosli been described (Benı́tez-Burraco et al., 2003), and in-
et al., 2004). It has been suggested that cellulose is not troduction of the antisense transgene resulted in the
degraded during strawberry ripening and thus may not suppression of all three in ripe fruits (Benı́tez-Burraco
play a significant role in fruit softening (Koh et al., 1997; et al., 2003). This therefore represents a potentially valu-
Koh and Melton, 2002) and recent reports showed that the able experimental system in which to better understand
inhibition of several endoglucanase genes [from glycosyl the contribution of pectate lyases to ripening-related

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hydrolase family 9 (GH9)] did not perceptibly affect fruit pectin degradation. A preliminary study of the cell wall
firmness (Woolley et al., 2001; Palomer et al., 2006). composition of the pectate lyase antisense fruits suggested
However, it should be noted that assays to evaluate a lower degree of cell wall swelling and possibly pectin
cellulose levels have typically targeted only levels of solubilization (Jiménez-Bermúdez et al., 2002), but a de-
crystalline cellulose and significant degradation of para- tailed analysis of wall structure was not described. The
crystalline cellulose may occur (Rose et al., 2003), which goal of this present analysis was to extend the study and
is much more difficult to measure. Moreover, the in vivo evaluate more fully the consequences of pectate lyase
substrates of plant GH9 enzymes have still not been suppression on strawberry fruit cell wall architecture and,
determined (Urbanowicz et al., 2007) and the mismatch particularly, the pectin polymer network. Data are pre-
between substrates and enzyme activities in this case sented that support a role for pectate lyase in pectin
clearly complicates data interpretation. depolymerization and solubilization in the cell wall and/or
By contrast, relatively more is known about the middle lamella, and it is suggested that these enzymes
enzymology of ripening-related pectin modification and, should be included in models of synergistic ripening-
as discussed by Koh and Melton (2002) and references related cell wall disassembly.
herein, pectin solubilization can be ascribed to a range of
different processes: pectin depolymerization; loss of
Materials and methods
calcium stabilized pectin gel structure (Knee et al., 1977;
Lara et al., 2004); cleavage of linkages between pectins Plant material, growth conditions, and firmness measurements
and hemicellulose (Nogata et al., 1996); and disentangle- Control, non-transformed strawberry (Fragaria3ananassa Duch.
ment of pectin complexes following the hydrolysis of cv. Chandler) plants and three independent transgenic pectate
arabinan and possibly also galactan side chains (Redgwell antisense lyase lines (Apel 14, Apel 23, and Apel 39; described in
et al., 1997a; Trainotti et al., 2001; Koh and Melton, Jiménez-Bermúdez et al., 2002) were grown in a screenhouse under
natural light. Transgenic ripe fruits showed a strong reduction in
2002). Of these processes, pectin depolymerization has pectate lyase mRNA levels, ranging from 90% in Apel 14 to 99% in
sometimes been considered of minor importance in Apel 23 and Apel 39. Fruits were harvested at different de-
ripening strawberry fruit, due to the limited degree of velopmental stages [small green, G1; large green, G2; white, W;
depolymerization compared with that seen in some other turning (meaning at least 25% surface red), T; totally red ripe fruit,
fruits, which is consistent with the low or undetectable R; and overripe fruit (ripe fruits stored 3 d at 25
C in a growth
chamber), OR], frozen in liquid nitrogen, and stored at –25
C until
polygalacturonase (PG) activity (Huber, 1984; Nogata used. Firmness was measured in fresh fruits using a hand
et al., 1996; Brummell, 2006). However, other studies penetrometer with 3.1 or 9.6 mm2 end surface area cylindrical
have detected more substantial depolymerization of probes, puncturing twice, on opposite sides, per fruit. A minimum
certain pectin fractions (Rosli et al., 2004), and a recent of 25 fruits per developmental stage was measured. Anthocyanin
paper described a soft-fruited strawberry cultivar (cv. content was assayed in ripe fruits as previously described (Jiménez-
Bermúdez et al., 2002) and expressed as the difference of
Toyonaka) with high PG activity (Villareal et al., 2007). absorbance between 530 nm and 657 nm per gram fresh weight.
Another enzyme that may contribute to ripening-related
pectin degradation is pectate lyase, which catalyses the Cell wall isolation
cleavage of unesterified galacturonosyl linkages by Cell walls from green (G2) or ripe (R) fruits were isolated according
a b-elimination reaction (Marı́n-Rodrı́guez et al., 2002). to Redgwell et al. (1992), with some minor modifications. Briefly,
 Pectin modifications in transgenic strawberry fruit 2771
10–15 fruits were powered in liquid nitrogen and 20 g homogenized used to fractionate material in the CDTA, Na2CO3, and the two
in 40 ml of PAW (phenol:acetic acid:water, 2:1:1, w:v:v). The KOH fractions. In the case of the CDTA extract, gel medium was
homogenate was centrifuged at 4000 g for 15 min and the equilibrated in the same buffer as above, but for the other extracts
supernatant filtered through Miracloth (Merck, Bioscience, Nottingham, the columns were equilibrated with TRIS–HCl 0.1 M buffer, pH
UK). The pellet was resuspended in 20 ml of water and the 8.5. Samples were dissolved in equilibration buffer (6–8 mg ml
1)
supernatant recovered as above. This step was performed twice. All and 200 ll loaded on the column, then eluted at a 14 ml h
1 flow
supernatants were combined and dialysed (mol. wt cut-off 8000) rate. One millilitre fractions were collected and assayed for UA and
against distilled water for 5 d at 4
C. After dialysis, the PAW total sugar contents.
extract was centrifuged at 23 000 g for 20 min, and the supernatant Neutral sugar composition of the polymers present in the 4 M
was concentrated in a rotary evaporator to ;5 ml, and finally freeze KOH extract was determined by GC-MS of their alditol acetates
dried. This extract constitutes the PAW fraction. The residue from following hydrolysis in 2 M trifluoroacetic acid as described in Fry
the first centrifugation, containing the cell wall material (CWM), (1988).
was incubated overnight in 20 ml 90% DMSO to solubilize starch.
The extract was then centrifuged at 4000 g, the pellet washed twice Statistical analyses
with 20 ml distilled water, and the CWM recovered after freeze
drying. A minimum of three independent extractions per line and The SPSS software package (SPSS Inc., Chicago, IL, USA) was
developmental stage were performed. used for all the statistical analyses. Mean comparisons between
control and transgenic samples were performed using a t-test,
a¼0.05. When data did not fulfil the requirement for this parametric
Cell wall fractionation test, a Mann–Whitney U-test was employed to determine differ-
The CWM was sequentially extracted with water, 50 mM trans-1,2- ences. Unless stated otherwise, data are presented as means and the

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diaminocyclohexane-N,N,N#N#-tetraacetic acid (CDTA) in 50 mM bar represents standard deviations.
sodium acetate (pH 6), followed by 100 mM Na2CO3 containing
0.1% NaBH4 to provide pectin-enriched fractions, and then with
1 M KOH and 4 M KOH to generate hemicellulose-enriched Results
fractions. The procedure was as follows: CWM from the three
extractions was pooled and 90 mg was incubated overnight in 45 ml Stability of the phenotype and ripening stage
of distilled water on an orbital shaker. The extract was then
centrifuged at 6000 g for 15 min and then the process was repeated Figure 1A shows the consistency and stability of the
with another 45 ml of water. The supernatants were combined, ‘firmer fruit’ phenotype that was previously reported for
filtered through a GF/C (Whatman, UK) glass-fibre filter, and pectate lyase antisense transgenic strawberry lines (Jiménez-
dialysed against water in the same conditions as described for PAW Bermúdez et al., 2002). During several growing seasons,
extract. After dialysis the extract was concentrated with a rotary
evaporator and finally freeze dried. Water-insoluble residue was transgenic fresh fruits were consistently significantly
washed twice with distilled water and extracted with the next firmer than control fruits during ripening. The present
reagent, following the same procedure to obtain the CDTA-, study focused on the cell walls of red ripe (R) fruit at
Na2CO3-, and KOH-soluble fractions. At least three independent harvest and so special care was taken when sampling the
fractionations were performed per CWM sample. fruits to avoid differences in ripening stage which might
The uronic acid (UA) content in the different fractions was
estimated using the assay of Blumenkrantz and Asboe-Hansen influence the results. Figure 1B shows the mean values for
(1973), as modified by Van den Hoogen et al. (1998), and total anthocyanin content, which was used to monitor ripening
sugars by the orcinol-sulphuric method (Dubois et al., 1956). in control and transgenic fruits. Anthocyanin levels were
similar in control and transgenic lines 23 and 39, and
Anatomical sections of fruit parenchyma slightly higher in line 14, indicating that transgenic fruits
Small cortical tissue fragments were obtained from ripe fruits of sampled for cell wall analysis were harvested at equiva-
control and transgenic lines, a minimum of five independent fruits lent ripening stages.
per genotype being processed. Cortical tissue corresponded to
cylinders obtained from the zone of maximum diameter of the
fruits. Tissue samples were fixed in Bouin reagent (Panreac Cell wall yield and fractionation
Quı́mica, Spain) for 24 h and dehydrated in an increasing Cell wall content (dry mass CWM) per 100 g of fruit fresh
concentration series of ethanol:water to 95%. Embedding was weight ranged from 0.92 g to 1.43 g. The highest value
performed in Historesin (Historesin Embedding Kit, Leica) follow-
ing the manufacturer’s instructions. When polymerized, 4-lm-thick
(transgenic line 23) was statistically different from the
sections were obtained with a microtome, mounted on glass slides, control (P¼0.95) while the other two transgenic lines
and stained with 0.2 g l
1 ruthenium red for 2 h. were similar to control fruits (average ¼ 1.060.1 g per
100 g fresh fruit weight). Cell wall polymers were not
Size exclusion chromatography only present in the CWM extract but were also detected in
A manually poured column (0.8395 cm) of Sepharose CL-6B the PAW fraction, and so, after dialysis and drying, the
(Sigma-Aldrich Quı́mica SA, Spain) was used to fractionate the content of this fraction was related to cell wall weight and
polymers presents in the PAW and water fractions. Gel medium presented together with the amounts of the different
was equilibrated with 0.2 M acetate buffer, pH 5, and cell wall fractions that were sequentially extracted from the CWM
extracts (10–14 mg) were dissolved in 1 ml buffer, loaded on the
column, and eluted at 14 ml h
1. Two millilitre fractions were (Fig. 2) The mean values of PAW contents were lower in
collected and assayed for UA and total sugar contents. Similarly, the three transgenic lines and the differences were
manually poured columns (0.5345 cm) of Sepharose CL-2B were statistically significant for lines 23 and 39. A similar trend
2772 Santiago-Doménech et al.
was observed when the PAW contents were related to in green fruit, but the ripening-related increase was less in
fresh fruit weight. This lower content of PAW fraction can the transgenic lines (128%, 27%, and 142% for Apel lines
be interpreted as reflecting lower solubilization of cell 14, 23, and 39, respectively) than in the control fruit
wall polymers in the transgenic fruits. In all the genotypes (427%), which further supports the idea of a lower
the PAW fraction polymer content was higher in red than solubilization in the transgenic fruits.
Figure 2 also shows the yield of the different CWM
fractions. The pool of all the fractions obtained, including
the remaining material after 4 M KOH extraction,
represented on average 7664% (w/w) of the initial cell
wall weight used for sequential extraction, suggesting low
losses during processing. The most abundant fraction was
the CWM solubilized with 50 mM CDTA. Statistical
differences between control and the three transgenic lines
were only observed for the water-extracted fraction, where
the amount was higher from the control cell walls.

Pectin content and solubilization

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In all the genotypes, the highest content of UA was found
in the PAW extracts, with mean values lower for the three
transgenic lines, although the differences were only
statistically significant for line 23 (Fig. 3A). Among the
various cell wall fractions, the highest UA levels were

Fig. 1. Firmness and anthocyanin content of control and transgenic

Apel fruits. (A) Firmness of control and transgenic fruits, Apel 14 and
39, at harvest in four growing seasons. (B) Anthocyanin contents of ripe
fruits used for cell wall extraction and analysis. Measurements
correspond to control and transgenic fruits from lines 14, 23, and 39.

Fig. 3. (A) Uronic acid (UA) contents in PAW and other sequentially
Fig. 2. Yield of fractions after sequential extraction of the cell wall extracted fractions of the cell wall material (CW) isolated from control
material (CW) isolated from fruits of control (C) and transgenic Apel (C) and three independent transgenic Apel lines. (B) Ratio of UA
lines. relative to total sugar contents in these fractions.
 Pectin modifications in transgenic strawberry fruit 2773
present in the CDTA fraction and the lowest amounts in mass material extending throughout the separation range
the ‘hemicellulosic’ 4 M KOH fraction. The amount of of the column. Comparisons of profiles from the three
pectin (inferred from UA abundance) was significantly transgenic fruits with the control sample suggested a slight
higher in the CDTA and sodium carbonate (CO3) extracts increase in the average molecular mass of the soluble
from the cell wall of all three transgenic lines than from pectin in the transgenic samples. A more symmetrical
those of the control fruits (Fig. 3A). It is noteworthy that population of water-solubilized polymers eluted mostly
the weights of these two fractions were not quantitatively between 100 ml and 180 ml in all the genotypes, with an
different between control and transgenic lines in Fig. 2. average molecular mass that was clearly lower than those
The ratio of more soluble (PAW+water fractions) to solubilized with PAW. The profiles appeared similar,
bound (CDTA+CO3 fractions) pectins was significantly although three distinct peaks were observed in the control
higher in the control (3.0) than the transgenic lines (1.8), sample between approximately 20 kDa and 80 kDa, which
and this difference was even higher if the soluble fraction were not resolved in the transgenic lines. The majority of
was related to the covalently bound fraction (CO3) alone the water-solubilized polyuronides migrated with apparent
(8.2 and 4.0 in control and transgenic lines, respectively). masses of 20–50 kDa.
Total sugars were also measured in the different cell wall
factions but no significant differences were found between
control and transgenic lines (results not shown). Interest- Analysis of the bound fractions by gel permeation
ingly, the UA/sugar ratios were higher for the three chromatography

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transgenic lines in PAW, water, CDTA, carbonate, and A CDTA solvent was used, ostensibly to extract polymers
1 M KOH fractions, indicating that the cell wall fractions that were ionically bound to the cell wall, and the
were enriched with pectins in the case of transgenic fruits resulting polyuronide profiles for the different genotypes
(Fig. 3B). The only exception to this trend was in the are shown in Fig. 6 (left side). Polymers eluted throughout
CDTA fraction of the Apel 39 line. Collectively, these much of the fractionation range of the column, with most
results suggest a lower pectin solubilization in the trans- exhibiting a mass in excess of 2000 kDa. The main
genic Apel lines. difference between control and transgenic lines was the
This interpretation of decreased pectin solubilization presence of a substantial peak of high molecular-weight
was supported by microscopic evidence (Fig. 4) since material in the control line, which was not apparent in
a denser pectin staining was observed between cells in wall extracts from the transgenic fruits. Two additional
cortical tissues from transgenic fruits than in control fruits. peaks were present in the control fraction (eluting at 18 ml
Additionally, fewer intercellular spaces were observed in and 23 ml) that were not evident in lines 14, 23, and 39.
the transgenic fruit tissues, whose cells showed greater The profiles obtained for polyuronides solubilized with
cell adherence than those in sections from control fruit. Na2CO3 (CO3 fraction; Fig. 6, right side) showed the
This apparently greater cell to cell adhesion in the presence of a first peak eluting between 10 ml and 15 ml
transgenic samples suggests a greater integrity of the which corresponds to very high molecular-weight pectic
pectin-rich middle lamella. polymers. The three transgenic lines showed a slight
increase in the average molecular weight of this first peak
Analysis of the soluble fractions by gel permeation and it was sharper and more pronounced in lines 14 and
chromatography 23. A second group of pectic polymers (fractions eluting
The profiles of the pectic polymers present in the PAW between 15 ml and 20 ml) was present in the three
and water fractions are shown in Fig. 5. Size exclusion transgenic lines and essentially absent in the control,
chromatography revealed that the PAW-soluble polyur- although a small shoulder was observed. The pool of
onides formed a main peak of polymers with molecular polymers eluting between 20 ml and 30 ml represented at
mass >500 kDa, together with a tail of lower molecular- least 50% of the polyuronides present in this fraction and
the profiles of the transgenic lines suggest that pectin
processing is different in these fruits. It was observed that
the CO3 fractions from the transgenic fruit had peaks
(resolved at 13 ml and 18 ml) that were not present in the
control fruit CO3 profiles, but that similarly eluting peaks
were differentially present in the control fruit CDTA
fraction. It should also be noted that in the CO3 transgenic
profiles the elution time of the first peak suggested a higher
molecular mass. These observations could be conceptually
related with a reduced pectin depolymerization as a result
Fig. 4. Sections of cortical fruit tissue at the ripe stage of control and
two independent transgenic lines, Apel 14 and 39, stained for pectin of pectate lyase silencing. To gain further support for this
visualization. Bars represent 50 lm. hypothesis, the pectin profiles of the CO3 fraction were
2774 Santiago-Doménech et al.

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Fig. 5. Molecular mass profiles of polyuronides extractable by PAW and water from fruit cell walls of control and three independent Apel transgenic
lines. Profiles were obtained by size exclusion chromatography on Sepharose CL-6B. Fractions were assayed for uronic acid content. Uronic acid
content of the fractions was normalized to the maximum absorbance value obtained in each profile. Dextran standards were used for void volume
determination and column calibration, as indicated by arrows on the figure.

analysed from green fruits collected prior to the decrease (12% and 9% for lines 14 and 23, respectively).
in firmness that occurs in the transition from green to Additionally, the profiles of cell walls obtained from red
white fruits (Fig. 7A). Increased fruit firmness was only transgenic fruits showed the presence of a pool of
observed in the transgenic fruits after this transition (Fig. polymers eluted between 15 ml and 20 ml that was absent
7B), and it was reasoned that the differences in cell wall in the control cell wall of red fruits (Fig. 6).
must be minor at the green stage, and would not be related The KOH extracts were enriched in hemicellulose but
to the effects of the transgene, since the expression of the also contained pectins, based on the levels of UA, and
pectate lyases is ripening specific. The profiles obtained differences were observed in the UA/total sugar ratio
for the CO3 fractions from the cell wall of green fruits are between the control and the three transgenic lines
shown in Fig. 8. The extracts from all four genotypes had (Fig. 3B). The profiles obtained for UA content in these
two predominant populations of polyuronides, one of two fractions in red fruits are shown in Fig. 9. The 1 M
which eluted close to the first range mentioned for red KOH profiles for control, line 14, and line 23 suggested
fruits with a peak maximum at 10 ml, while the second of relatively low amounts of residual polymers, but line 39
which comprised medium molecular-weight polymers. As again exhibited different characteristics with significantly
expected, the profiles from the control and transgenic lines higher absorbance values and several well-defined peaks.
were similar, although line 39 had proportionally less high Although the amount of pectin was low in the 4 M KOH
molecular-weight material. A comparison of the CO3 fractions, the profiles indicated the presence of high
profiles from green fruits (Fig. 8) with those from red molecular-weight polymers in the three transgenic lines
fruits (Fig. 6) revealed a reduction of the first peak that were absent in the control profile (10–13 ml and
(eluting between 8 ml and 12 ml) relative to the second 18–20 ml elution volumes). These polymers may corre-
(eluting between 18 ml and 30 ml) in both the control and spond to those observed in the CO3 fractions as they
transgenic lines 14 and 23 during ripening. However, eluted in the same position.
these decreases were much more evident in extracts from Analyses of total sugar levels in the same fractions of
the control fruits (50%) than from the transgenic lines the two KOH extracts (Fig. 10) revealed consistent
 Pectin modifications in transgenic strawberry fruit 2775

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Fig. 6. Molecular mass profiles of polyuronides extractable by CDTA and sodium carbonate from fruit cell walls of control and three independent
Apel transgenic lines. Profiles were obtained by size exclusion chromatography on Sepharose CL-2B. Fractions were assayed for uronic acid content.
Uronic content of the fractions was normalized to the maximum absorbance value obtained in each profile. The elution volume for the blue dextran
standard (2000 kDa) is shown on the figure.

quantitative differences in that the peak heights were ionically or covalently bound into the wall matrix,
lower in the transgenic lines. An analysis of TFA- respectively.
hydrolysable neutral sugars in the 4 M KOH fraction by The amount of material in the PAW fraction relative to
GC-MS showed that glucose, xylose, and rhamnose the total cell wall was lower in all three transgenic lines,
predominated (with a molar ratio of 6:2.5:1, respectively) as was the UA content, although the ratio of UA:total
suggesting, as expected, a substantial enrichment in sugars was not statistically different from the control fruit
xyloglucan, but also the presence of rhamnogalacturonan (Fig. 3). Additionally, the Apel lines showed less of
pectins. a ripening-related increase in polysaccharide levels in the
PAW fraction (Fig. 2) as well as an increase in average
polymer size (Fig. 5). Similar results were obtained with
Discussion
the water-soluble fraction, which also contains more
The goal of this study was to characterize the effects on readily extractable polymers that interact relatively weakly
the strawberry fruit cell wall of suppressing the expression with other cell wall components. The polyuronide molecular-
of ripening-related pectate lyase, and to relate pectin weight profiles were similar in the control and transgenic
metabolism to the previously reported prolonged fruit profiles (Fig. 5), but the higher amount of material in the
firmness of the transgenic fruits. A sequential series control water fraction (Fig. 2), which was pectin rich,
of solvents was used to obtain fractions enriched in based on the increased UA:total sugar ratio (Fig. 3),
pectins that differed in how readily they were extracted. further suggests that pectins were less soluble from walls
This approach can indicate their relative affinity with the of the transgenic fruits.
wall and middle lamella, and thus provide an indirect Conversely, the CDTA and CO3 fractions comprise
measure of pectin macromolecular disassembly. For polymers that show a greater wall association. Clear
example, PAW is considered a poor solvent for pectic quantitative differences between control and transgenic
polysaccharides (Fry, 1988) unless they have been fruits were observed in the CDTA-soluble ionically bound
solubilized by in vivo processes within the wall (Redgwell pectin fraction (Fig. 3). This fraction is believed to be
et al., 1992, 1997b), while CDTA and sodium carbonate particularly enriched in homogalacturonan pectin from the
(CO3) are typically used to enrich for pectins that are middle lamella (Redgwell et al., 1992; Lara et al., 2004)
2776 Santiago-Doménech et al.
weight polymers in the CO3 fraction were substantially
higher in Apel 14 and somewhat greater in the other two
transgenic lines, and as described in Results, some peaks
were differentially seen in the CDTA and CO3 profiles.
For example, the CDTA control fruit extract had a profile
with two peaks of high molecular-mass polymers (elution
volumes 13 ml and 18 ml), which were diminished or
absent in the transgenic profiles. However, peaks at
similar elution volumes were extracted with Na2CO3
(Apel 14, Apel 23, and partially in Apel 39) or 4 M KOH
(Apel 39). This suggests differential processing of the
pectic polymers in the transgenic lines resulting in a lower
solubilization of the highest molecular-mass group of
polymers.
The substantial quantitative and qualitative changes in
the various cell wall fractions found to occur in Na2CO3-
and KOH-solubilized fractions lead to the proposal of
a model whereby pectate lyase silencing leads to de-

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creased depolymerization of the strongly bound pectins
fractions, alters the interactions between various compo-
nents of the pectic matrix, and increases the solubility of
a subset of pectins. This may be either a direct conse-
quence of reducing pectate lyase activity, or also in-
directly by altering the action of other pectinolytic
enzymes, such as PG and pectin methylesterase, for
example by influencing access to their substrates. It is
also noted that polyuronide accumulation continues during
strawberry fruit ripening (Huber, 1984), and so it is
Fig. 7. Fruit weight and firmness of control and transgenic lines during possible that suppressing pectate lyase expression could
fruit development. (A) Fruit weight and firmness of control fruits at affect wall composition and architecture by perturbing
different stages: small green, G1; large green, G2; white, W; turning
(meaning at least 25% surface red), T; totally red ripe fruit, R; and
normal wall assembly. Immunolocalization studies have
overripe fruit (ripe fruits stored 3 d at 25
C in a growth chamber, OR. suggested that pectate lyase proteins are present in the
(B) Effect of antisense down-regulation of pectate lyase on fruit primary walls of strawberry receptacle parenchyma cells
firmness during these developmental stages. In this case, the values of
firmness are expressed as a percentage of control untransformed fruits.
(Benı́tez-Burraco et al., 2003), but the microscopy results
The arrow indicates the stage after which differences between control shown here (Fig. 4) indicate that degradation of the
fruits and the two transgenic lines become significant. middle lamella is significantly reduced in the transgenic
fruits, which suggests that this is also the site of pectate
lyase action. Moreover, a recent study of cell–cell
and, relative to control cell walls, the UA content of this adhesion in root parenchymatous tissue suggested that
fraction was on average 52% higher in the three trans- Na2CO3-soluble pectic polymers play an important role
genic lines. Microscopic analyses also suggested reduced (Marry et al., 2006), which is congruent with the reduced
degradation of the middle lamella in the transgenic fruits depolymerization and solubilization of this wall fraction in
(Fig. 4). In a preliminary study of the Apel cell walls the transgenic strawberry lines.
using a different extraction protocol, a lower amount of The cell wall analyses also suggested a decreased
CDTA-soluble polyuronides had previously been found in content of hemicelluloses in the three transgenic lines in
one of the transgenic lines (Jimenéz-Bermúdez et al., the 1 M KOH fractions, which according to sugar
2002). However, in that case, the starting material for the composition analysis was likely to be rich in xyloglucan,
sequential extraction was an alcohol-insoluble residue, and a similar decrease and reduction in polymer average
and it is likely that the chelator-soluble fraction contained molecular weight in the 4 M KOH fractions. It is not
pectins that were partitioned between the PAW and water immediately obvious why suppressing the expression of
fractions in the present study; hence the discrepancy. a pectinase would affect the xyloglucan polymer profile;
Chromatographic analyses of the polyuronide popula- however, there are precedents for such pleiotropic effects
tions in the CDTA and CO3 fractions also suggested (e.g. Brummell et al., 1999). Such results underline the
qualitative and quantitative differences between the con- complexity of wall metabolism, the cooperative action of
trol and transgenic fruits. The levels of high molecular- wall-modifying enzymes and the interactions that exist
 Pectin modifications in transgenic strawberry fruit 2777

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Fig. 8. Molecular mass profiles of polyuronides extractable by sodium carbonate from cell walls of control and transgenic green fruits. Profiles were
obtained by size exclusion chromatography on Sepharose CL-2B. Fractions were assayed for uronic acid content. Uronic content of the fractions was
normalized to the maximum absorbance value obtained in each profile. The elution volume for the blue dextran standard (2000 kDa) is shown on the
figure.

Fig. 9. Molecular mass profiles of polyuronides extractable by 1 M and 4 M KOH from fruit cell walls of control and three independent Apel
transgenic lines. Profiles were obtained by size exclusion chromatography on Sepharose CL-2B. Fractions were assayed for uronic acid content and
presented as optical density values at 515 nm. The elution volume for the blue dextran standard (2000 kDa) is shown on the figure.

between the major cell polysaccharide networks (Rose and genes is correlated with consistent differences in pectin
Bennett, 1999; Vicente et al, 2007). metabolism, polymeric interactions, and cell–cell adhe-
In summary, it has been demonstrated that the increased sion. These results, as well as those reported by Rosli
firmness of three independent transgenic lines of straw- et al. (2004) and Villareal et al. (2007), suggest that
berry fruit exhibiting strong suppression of pectate lyase enzymes involved in pectin depolymerization play a more
2778 Santiago-Doménech et al.

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Fig. 10. Molecular mass profiles of cell wall polymers extractable by 1 M and 4 M KOH from fruit of control and three independent Apel transgenic
lines. Profiles were obtained by size exclusion chromatography on Sepharose CL-2B. Fractions were assayed for total sugar content and presented as
optical density values at 450 nm. The elution volume for the blue dextran standard (2000 kDa) is shown on the figure.

significant role in strawberry fruit softening than pre- Brummell DA. 2006. Cell wall disassembly in ripening fruit.
viously appreciated. Furthermore, this study emphasizes Functional Plant Biology 33, 103–119.
Brummell DA, Harpster MH. 2001. Cell wall metabolism in fruit
that pectate lyase, although far-less studied than other softening and quality and its manipulation in transgenic plants.
pectinolytic enzymes such as PG and pectin methylester- Plant Molecular Biology 47, 311–340.
ase, is an important member of the likely synergistic suite Brummell DA, Harpster MH, Civello PM, Palys JM,
of pectinases that contribute to cell wall disassembly. Bennett AB, Dunsmuir P. 1999. Modification of expansin
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wall polymer metabolism during ripening. The Plant Cell 11,
2203–2216.
Acknowledgements Domı́nguez-Puigjaner E, LLop I, Vendrell M, Prat SA. 1997.
cDNA clone highly expressed in ripe banana fruit shows
This work was supported by the Ministerio de Educación y Ciencia homology to pectate lyases. Plant Physiology 114, 1071–1076.
of Spain and Feder EU Funds (grant reference: AGL2005-08128). Dubois M, Gilles KA, Hamilton JK, Smith F. 1956. Colorimetric
The authors thank Dr Fernando Pliego-Alfaro for his kind support method for determination of sugars and related substances.
and suggestions during research work and preparation of the Analytical Biochemistry 28, 350–356.
manuscript. We thank Dr Jose M López-Aranda (IFAPA, Centro Dumville JC, Fry SC. 2003. Solubilisation of tomato fruit pectins
de Churriana, Málaga, Spain) for his support and advice on growing by ascorbate: a possible non-enzymatic mechanism of fruit
the plants. We thank Mari C Molina for her work in plant growth softening. Planta 217, 951–961.
and maintenance. Fry SC. 1988. The growing plant cell wall: chemical and
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Bellido ML, Moyano E, Caballero JL, Munoz-Blanco J. Caballero JL, Lopez-Aranda JM, Valpuesta V, Pliego-
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Anexo III