UNIVERSIDAD DE SALAMANCA

CENTRO HISPANO LUSO DE INVESTIGACIONES AGRARIAS

DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGA Y GENTICA























Aislamiento, caracterizacin y anlisis funcional del gen
Thpg1 de Trichoderma harzianum






Mara Eugenia Morn Diez


2008













UNIVERSIDAD DE SALAMANCA

CENTRO HISPANO LUSO DE INVESTIGACIONES AGRARIAS
DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGA Y GENTICA










Aislamiento, caracterizacin y anlisis funcional del gen
Thpg1 de Trichoderma harzianum









Memoria presentada por Mara Eugenia Morn Diez para optar al grado
de Doctor en Ciencias Biolgicas








Salamanca, 24 de julio de 2008

Enrique Monte Vzquez, Catedrtico del Departamento de Microbiologa y Gentica
de la Universidad de Salamanca, y M. Rosa Hermosa Prieto, Profesor Doctor
Contratado Permanente del mismo Departamento,






CERTIFICAMOS:






Que la memoria titulada Aislamiento, caracterizacin y anlisis funcional
del gen Thpg1 de Trichoderma harzianum presentada por Mara Eugenia Morn Diez
para optar al grado de Doctor en Ciencias Biolgicas, ha sido realizada bajo nuestra
direccin en el Departamento de Microbiologa y Gentica de la Universidad de
Salamanca.







Y para autorizar su presentacin y evaluacin por el tribunal correspondiente,
firmamos este certificado en Salamanca a 24 de julio de 2008.










Fdo.: Enrique Monte Vzquez Fdo.: M. Rosa Hermosa Prieto

ngel Domnguez Olavarri, Catedrtico de Microbiologa y Director del
Departamento de Microbiologa y Gentica de la Universidad de Salamanca,






CERTIFICA:






Que la memoria titulada Aislamiento, caracterizacin y anlisis funcional
del gen Thpg1 de Trichoderma harzianum presentada por Mara Eugenia Morn Diez
para optar al grado de Doctor en Ciencias Biolgicas, ha sido realizada bajo la direccin
de los Drs. Enrique Monte Vzquez y M. Rosa Hermosa Prieto, en el Departamento de
Microbiologa y Gentica de la Universidad de Salamanca.







Y para autorizar su presentacin y evaluacin por el tribunal correspondiente,
firmo este certificado en Salamanca a 24 de julio de 2008.










Fdo.: ngel Domnguez Olavarri




































No te inclines ante la adversidad, ms bien oponte audazmente a ella, tanto cuanto tu
suerte te lo permita

Virgilio (poeta de la antigua Roma)



AGRADECIMIENTOS

Quiero agradecer que ahora pueda estar escribiendo estas palabras a muchas
personas que han estado conmigo durante estos aos de Tesis.

Quiero dar las gracias a Enrique y a Rosa, mis directores de Tesis, por darme la
oportunidad de trabajar con vosotros. Gracias Enrique por tu optimismo, incluso en los
momentos ms difciles, siempre brujuleando en busca de soluciones y por creer en mis
posibilidades desde el principio. Gracias Rosa por tu paciencia (sobre todo al
comienzo), por encontrar siempre unos minutos de tu escaso tiempo para echarme una
mano y por escucharme cuando lo he necesitado. Muchas gracias a los dos.

De manera general quiero dar las gracias a toda la gente con la que he
compartido horas de laboratorio, antes en el CB208 y ahora en el L2. En particular a la
persona con la que ms horas he compartido, gracias Marta, por dedicarme parte de tu
tiempo a solucionar mis dudas cientficas, por tantas charlas y cigarros compartidos (y
fro tambin), por tu buen humor (y tambin por el malo), no me cabe la menor duda de
que algn da sers una gran directora de tesis (no les des mucha caa). Gracias al resto
de compaeros/as que en algn u otro momento han estado ah, y con los que he
compartido buenos momentos, con los que an siguen y con los que ya se fueron: Beln
Rubio, Beln Surez, Isabel Grondona, Isabel Chamorro, Emma, lvaro, Juanan, Luis,
Marcela, Natalia, Sara, Ilanit, Rebeca, Mariela. Con algunas he compartido muchas
horas de comidas y agradables charlas en estos ltimos meses; gracias por las clases de
comida internacional peruana, costarricense y varias ms, aunque todava nadie ha
superado a los pimientos rellenos.

Tambin quiero agradecer a la gente de Fisiologa Vegetal su inestimable ayuda.
En particular, a Ana, compaera de recta final de tesis; gracias por tu amistad y por
aguantar mis penas. Gracias tambin a Carlos, David, Chuchi y Roco, por su buen
humor y por su ayuda con el complejo mundo de la fisiologa vegetal (las hormonas
vegetales me han traido de cabeza). Y del otro lado del pasillo, a Loli y Mari-Paz por
aconsejarme al principio de mi andadura en este mundo de la investigacin.

A toda la gente del pasillo en el edificio viejo, con la que he compartido
muchas risas, sobre todo a Ral por tener siempre la frase que me alegraba algunas
maanas; a Lorena, Paula, Inma (por esas cortas charlas de pasillo), y al resto de la
gente de los laboratorios de al lado. No quiero olvidarme de M Eugenia, gracias por
preocuparte por m en los malos momentos, espero que puedas regresar a tu pas con
una tesis bajo el brazo.

No me quiero olvidar de Manoli y Paco, siempre dispuestos a echar una mano,
sobre todo al principio, cuando llegamos a este estupendo edificio llamado CIALE. A
todos con los que estos ltimos meses he compartido charlas en la sala de precarios

sobre lo maravilloso que es el mundo de la investigacin: Ral, Jose, Sergio, Blanca,
etc., y al resto de la gente de los laboratorios vecinos.

Gracia a la gente que desde fuera de Salamanca tambin han hecho posible esta
memoria. A Santi y Rosa Elena, por su gran ayuda con esos trasnformantes que se
resistan y por su hospitalidad cuando he estado con ellos. A Cndido y Enrique
Quesada por ayudarme con los tediosos trmites burocrticos y por preocuparse desde la
distancia.

No quiero olvidarme de esas personas con las que he vivido durante estos aos
en Salamanca y que ya forman parte de mi familia: Natalia, Anglica, Raquel, Nuria y
Ruth. Muchas gracias a todas por vuestra amistad, a algunas por aguantarme durante
tantos aos compartiendo piso (no fue tan malo, verdad?), tantas risas y alguna que
otra pena. Gracias Nuria por escucharme en los ltimos meses, los ms difciles de la
Tesis.

Y sobre todo, quiero dar las gracias a las personas que ms han contribuido a la
realizacin de esta Tesis, a mi familia, por ser lo ms bonito de mi vida, por no dudar
nunca de mis decisiones, por darme la mejor herencia que se puede recibir, la
educacin. Gracias por estar ah y por vuestra compaa en esos momentos que
necesitaba desconectar del trabajo, gracias de todo corazn a todos, Alicia, Narciso,
Tere, Edu, M Teresa y Eugenio.

No quiero terminar estas palabras sin dar las gracias a mi amiga paciencia,
gracias por no cejar en el empeo siempre junto a m.

Una vez llegados a este punto parece que el duro camino de escribir una Tesis
Doctoral llega a su fin, ahora comienza lo mejor, el papeleo.







En algn lugar sobre el arco iris, los cielos son azules y los sueos que te atreves a
soar se vuelven realidad. Algn da pedir un deseo a una estrella y despertar muy
lejos de las nubes dejndolas atrs, donde los problemas son como gotas de limn... Si
los pjaros vuelan alegremente ms all del arco iris... por qu yo no podra?

El Principito Antoine de Saint-Exupry (escritor y aviador francs)
























A mi familia



Siglas y abreviaturas

2D-PAGE electroforesis bidimensional en gel de acrilamida
ABA cido abscsico
ADN cido desoxirribonucleico
ADNc cido desoxirribonucleico complementario
ANOVA anlisis de la varianza
APS persulfato amnico
ARN cido ribonucleico
ARNc cido ribonucleico complementario
ARNm cido ribonucleico mensajero
ARNr cido ribonucleico ribosmico
ATCC American Type Culture Collection
atm atmsferas
ATP adenosn trifosfato
BLAST Basic Local Alignment Search Tools
CaMV virus del mosaico de la coliflor
CAZy CArbohydrate-Active enZymes
CECT Coleccin Espaola de Cultivos Tipo
CHAPS cido 3[(3-cholamidopropil)dimetilamonio]propanosulfnico
CIA cloroformo-alcohol isoamlico
CM carboximetilcelulosa
c.s.p. cantidad suficiente para
CWDEs cell wall degrading enzymes
dCTPs desoxicitosina trifosfato
DEPC dietil pirocarbonato
DMSO dimetilsulfxido
dNTPs desoxirribonucletidos trifosfato
D.O. densidad ptica
DTT ditiotreitol
EC Enzyme Commission number
EDTA cido etilendiamino-tetractico
EE.UU. Estados Unidos
endoPGs endopoligalacturonasas
ESTs expressed sequence tags
exoPGs exopoligalacturonasas
FDR False Discovery Rate
g gramos
g aceleracin de la gravedad terrestre
GTP guanosina-5-trifosfato
h horas
HGA homogalacturonano
HPLC cromatografa lquida de alta resolucin

IEE isoelectroenfoque
IMI International Mycological Institute
IPTG isopropil-1-tio--D-galactopiransido
ISR respuesta sistmica inducida
ITS internal transcribed region
JA cido jasmnico
JGI Joing Genome Institute
kb kilobase
kDa kilodalton
kV kilovoltio
k kiloohmio
L litro
mg miligramo
mL mililitro
M molaridad
MALDI-TOF Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization-Time-Of-Flight
Mb megabase
MM medio mnimo
MOPS cido 3-(N-morfolino) propano-sulfnico
F microfaraday
m micrometro
NAG N-acetil--D-glucosamina
NBT Newbiotechnic
NCBI Nacional Center for Biotechnology Information
NJ neighbour-joining
nm nanometros
OGAs oligogalacturnidos
ORF fase de lectura abierta
PAGE electroforesis en gel de acrilamida
pb pares de bases
PCR reaccin en cadena de la polimerasa
PEG polietilnglicol
PGs poligalacturonasas
PGA cido poligalacturnico
PGIPs protenas inhibidoras de poligalacturonasas
PMF peptide mass fingerprint
ppm partes por milln
p/v peso/volumen
RAPD random amplification of polymorphic DNA
RFLP restriction fragment lengthpolymorphism
RG ramnogalacturonano
RISC RNA-inducing silencing complex
RISR repuesta sistmica inducida por rizobacterias

RNAsa ribonucleasa
rpm revoluciones por minuto
SA cido saliclico
SAR respuesta sistmica adquirida
SCAR sequence characterized amplified region
SDS dodecil sulfato sdico
siRNA cido ribucleico de interferencia
spp. especies
TCA cido tricloroactico
T-DNA ADN de transferencia
Tris tri-(hidroximetil)-aminometano
U unidad de actividad enzimtica
UV ultravioleta
V voltio
v/v volumen/volumen
X nmero de veces de concentracin
X-Gal 5-bromo-4-cloro-3-indol--D-galactopiransido

Aminocidos

A (Ala) Alanina
C (Cys) Cistena
D (Asp) cido asprtico
E (Glu) cido glutmico
F (Phe) Fenilalanina
G (Gly) Glicina
H (His) Histidina
I (Ile) Isoleucina
K (Lys) Lisina
L (Leu) Leucina
M (Met) Metionina
N (Asn) Asparragina
P (Pro) Prolina
Q (Gln) Glutamina
R (Arg) Arginina
S (Ser) Serina
T (Thr) Treonina
V (Val) Valina
W (Trp) Triptfano
Y (Tyr) Tirosina

Bases nitrogenadas

A Adenina
C Citosina
G Guanina
T Timina
U Uracilo
I Inosina

R G/A
Y C/T
W A/T
S G/C
K G/T
M A/C
B C/G/T, pero no A
D A/G/T, pero no C
H C/A/T, pero no G
V C/G/A, pero no T
N A/C/G/T
ndice

INTRODUCCIN 1

1. BIOLOGA DEL GNERO Trichoderma 2

1.1. Morfologa 2
1.2. Sistemtica 3
1.3. Ecologa 4

2. MECANISMOS DE ACCIN DE Trichoderma COMO AGENTE DE
CONTROL BIOLGICO 5

2.1. Micoparasitismo 5
2.1.1. Quitinasas 7
2.1.2. Glucanasas 8
2.1.3. Proteasas 9
2.2. Antibiosis 10
2.3. Competencia con el patgeno 11
2.4. Promocin del crecimiento de las plantas 12
2.5. Induccin de mecanismos de resistencia en plantas 12

3. APLICACIONES DEL GNERO Trichoderma 14

4. SISTEMA PECTINOLTICO DE HONGOS FILAMENTOSOS 15

4.1. Estructura de la pectina 16
4.2. Clasificacin de las pectinasas 19
4.3. Endopoligalacturonasas fngicas 20

5. GENMICA FUNCIONAL 26

5.1. Concepto 26
5.2. Genmica funcional de hongos filamentosos 27
5.3. Genmica funcional de Trichoderma 28

6. ESTRATEGIAS PARA EL ESTUDIO DE LA FUNCIN GNICA 30

6.1. Silenciamiento gnico 30
6.2. Expresin en sistemas homlogos y heterlogos 32
6.3. Tecnologa de microarrays 32
6.4. Protemica 33


OBJETIVOS 34
ndice

MATERIALES Y MTODOS 36

1. ORGANISMOS UTILIZADOS 37

1.1. Bacterias 37
1.2. Hongos filamentosos 37
1.2.1. Cepas de Trichoderma 37
1.2.2. Hongos fitopatgenos 37
1.3. Material vegetal 37

2. VECTORES 38

2.1. Vectores plasmdicos 38
2.2. Vectores fgicos 40

3. MEDIOS DE CULTIVO 41

3.1. Medios de cultivo para bacterias y bacterifagos 41
3.2. Medios de cultivo para hongos 42
3.3. Medios de cultivo para plantas 44

4. CULTIVO DE LOS ORGANISMOS 45

4.1. Trichoderma 45
4.1.1. Recogida de esporas 45
4.1.2. Cultivo para la obtencin de germnulas 45
4.1.3. Cultivos para la extraccin de ADN 45
4.1.4. Cultivos para el anlisis de la expresin gnica 45
4.1.5. Cultivos para el anlisis de la expresin gnica en un sistema de tres
componentes 47
4.1.6. Cultivos para la obtencin de protenas intracelulares en un sistema de tres
componentes 47
4.2. A. thaliana 47
4.2.1. Desinfeccin de semillas 47
4.2.2. Cultivo en placa 47
4.2.3. Cultivo en maceta 48
4.2.4. Cultivo en medio lquido 48
4.3. Tomate 48
4.3.1. Desinfeccin de semillas 48
4.3.2. Cultivo en tubos 48



ndice

5. MANTENIMIENTO 49

5.1. Bacterias 49
5.2. Hongos filamentosos 49
5.3. Bacterifagos 49
5.4. Plantas 49

6. CONSTRUCCIN DE LOS VECTORES UTILIZADOS EN ESTE
TRABAJO 50

6.1. Construccin del vector pJL43b1-Thpg1 50
6.2. Construccin del vector pBI121-Thpg1 50

7. TRANSFORMACIN DE ORGANISMOS 53

7.1. Transformacin de bacterias 53
7.1.1. E. coli 53
7.1.1.1. Preparacin de clulas competentes 53
7.1.1.2. Transformacin 53
7.1.2. A. tumefaciens 54
7.1.2.1. Preparacin de clulas competentes 54
7.1.2.2. Transformacin 54
7.2. Transformacin de hongos filamentosos 55
7.2.1. Preparacin de protoplastos 55
7.2.2. Transformacin 56
7.3. Transformacin de plantas de A. thaliana 56
7.3.1. Transformacin 56
7.3.2. Seleccin de semillas transgnicas 57

8. MANIPULACIN DE BACTERIFAGOS 58

8.1. Preparacin de bacterias para la transduccin 58
8.2. Infeccin de clulas con el bacterifago lambda 58
8.3. Aislamiento de calvas de lisis de fagos en medio slido 58
8.4. Amplificacin de fagos en medio slido 58

9. EXTRACCIN DE CIDOS NUCLEICOS 59

9.1. Extraccin de ADN 59
9.1.1. Extraccin de ADN plasmdico de bacterias 59
9.1.1.1. Minipreparaciones (boiling minipreps) 59
9.1.1.2. Lisis alcalina a pequea escala 60
9.1.1.3. Lisis alacalina a gran escala 60
ndice

9.1.2. Extraccin de ADN del bacterifago lambda 60
9.1.3. Extraccin de ADN genmico de Trichoderma 61
9.1.3.1. Extraccin a pequea escala 61
9.1.3.2. Extraccin a gran escala 62
9.1.4. Extraccin de ADN genmico de A. thaliana 62
9.1.4.1. Extraccin rpida 62
9.1.4.2. Extraccin a gran escala 63
9.2. Extraccin de ARN 63
9.2.1. Mtodo del Tri Reagent 63
9.2.2. ARN para microarrays 63

10. MANIPULACIN DE CIDOS NUCLEICOS 64

10.1. Cuantificacin y calidad de los cidos nucleicos 64
10.1.1. En ensayos generales 64
10.1.2. En microarrays 64
10.2. Manipulacin enzimtica de cidos nucleicos 64
10.2.1. Tratamiento enzimtico de ADN 64
10.2.1.1. Digestin 64
10.2.1.2. Generacin de extremos romos 65
10.2.1.3. Defosforilacin de plsmidos 65
10.2.1.4. Ligacin 65
10.3. Reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) 66
10.3.1. Reaccin clsica 66
10.3.2. Reaccin de cadena larga 66
10.3.3. Reaccin con polimerasa de alta fidelidad 66
10.3.4. RT-PCR 67
10.3.5. PCR a tiempo real (Real Time PCR) 67
10.3.6. Oligonucletidos empleados en este trabajo 68
10.4. Electroforesis de cidos nucleicos 70
10.4.1. Electroforesis de ADN 70
10.4.2. Electroforesis de ARN 70
10.4.2.1. En condiciones no desnaturalizantes (geles de agarosa) 70
10.4.2.2. En condiciones desnaturalizantes (geles de agarosa-formaldehido) 71
10.5. Purificacin de fragmentos de ADN a partir de geles de agarosa 71
10.6. Secuenciacin de ADN 71
10.7. Primer walking 72

11. EXPERIMENTOS DE HIBRIDACIN EN MEMBRANA 72

11.1. Transferencia de cidos nucleicos a membrana 72
11.1.1. Transferencia de ADN de geles de agarosa (Southern blot) 72
11.1.2. Transferencia de ARN de geles de agarosa (Northern blot) 73
ndice

11.1.3. Transferencia de ADN de bacterifagos (escrutinio) 73
11.2. Marcaje de sondas 73
11.2.1. Marcaje radiactivo de ADN 73
11.2.2. Marcaje no radiactivo de ADN 74
11.2.3. Marcaje de ADNc con uracilo biotinilado 74
11.3. Prehibridacin, hibridacin y lavados 74
11.3.1. Prehibridacin 74
11.3.2. Hibridacin y lavados 74
11.3.2.1. Hibridacin con sondas radiactivas 75
11.3.2.2. Hibridacin con sondas no radiactivas 75
11.3.2.3. Hibridacin con sondas no radiactivas (GeneChip) 75
11.4. Deteccin 76
11.4.1. Radiactiva 76
11.4.2. No radiactiva 76
11.4.3. No radiactiva (GeneChip) 77
11.5. Reutilizacin de membranas 77
11.5.1. Hibridacin radiactiva 77
11.5.2. Hibridacin no radiactiva 77

12. MANIPULACIN DE PROTENAS 78

12.1. Obtencin de protenas intracelulares 78
12.1.1. Condiciones de cultivo 78
12.1.2. Concentracin y dilisis de las muestras 78
12.2. Obtencin de protenas intracelulares de A. thaliana 79
12.3. Obtencin de protenas extracelulares 79
12.3.1. Condiciones de cultivo 79
12.3.2. Concentracin y dilisis de los sobrenadantes 79
12.4. Cuantificacin de protenas 79
12.5. Ensayos de actividad endopoligalacturonasa 79
12.5.1. En medio slido 79
12.5.2. En medio lquido 80
12.6. Tcnicas electroforticas: Electroforesis unidimensional de
protenas en condiciones desnaturalizantes (SDS-PAGE) 81
12.5.1. Determinacin de la actividad endopoligalacturonasa en geles
de acrilamida 81
12.7. Tcnicas electroforticas: Electroforesis bidimensional de protenas en
condiciones desnaturalizantes (2D SDS-PAGE) 82
12.7.1. Primera dimensin (isoelectroenfoque, IEE) 82
12.7.2. Equilibrado de las tiras 82
12.7.3. Segunda dimensin 82
12.7.4. Tratamiento informtico de las imgenes 83

ndice

12.8. Tincin de protenas en geles de acrilamida: Tincin con
azul de Coomassie 83
12.9. Identificacin de protenas 84
12.9.1. Espectrometra de masas 84
12.9.2. Identificacin por huella peptdica 84

13. ENSAYOS DE CRECIMIENTO Y GERMINACIN 84

13.1. Ensayos con Trichoderma 84
13.2. Ensayos con A. thaliana 85

14. DETERMINACIN DE FITOHORMONAS 85

15. HERRAMIENTAS BIOINFORMTICAS Y SOFTWARE
UTILIZADO 86

15.1. Bsqueda de secuencias similares en bases de datos 86
15.1.1. FASTA 86
15.1.2. BLAST 86
15.2. Alineamiento de secuencias 87
15.3. Otras manipulaciones de secuencias 87
15.4. Anlisis estructural de protenas 88
15.5. Anlisis de los dominios de unin a factores de transcripcin 88
15.6. Otras herramientas de prediccin 88
15.7. Anlisis filogenticos 89
15.8. Anlisis estadstico 89
15.8.1. Datos obtenidos en microarrays 89
15.8.2. Datos obtenidos en otros ensayos 90
15.9. Herramientas de edicin 90

16. CASAS COMERCIALES 90


Captulo 1: CLONACIN Y CARACTERIZACIN
DEL GEN Thpg1 DE T. harzianum T34 93

RESULTADOS 94

1. TRABAJO PREVIO 95
2. AISLAMIENTO DE Thpg1 A PARTIR DE LA EST 10663 96
3. ANLISIS in silico DE LA SECUENCIA NUCLEOTDICA Y
AMINOACDICA 97
3.1. Identificacin de intrones en la secuencia de Thpg1 97
ndice

3.2. Estudio de la secuencia del promotor de Thpg1 98
3.3. Anlisis de la estructura primaria, secundaria y terciaria de la
protena ThPG1 100
4. ANLISIS FILOGENTICO 106
5. ESTUDIO DE LA EXPRESIN DEL GEN Thpg1 107
6. ANLISIS SOUTHERN DE Thpg1: PRESENCIA EN OTRAS CEPAS DE
Trichoderma 109
7. CARACTERIZACIN DE LA ACTIVIDAD ENDOPOLIGALACTURONASA
EN LOS CULTIVOS DE T. harzianum T34 110
7.1. Ensayo en placa 111
7.2. Determinacin de azcares reductores (Somogyi-Nelson) 111
7.3. Determinacin de la actividad endopoligalacturonasa en geles
de acrilamida 112
8. SISTEMAS DE INTERACCIN T. harzianum-PLANTA-PATGENO 114
8.1. Anlisis de la expresin de Thpg1 114
8.2. Anlisis protemico: ThPG1 115

DISCUSIN 117


Captulo 2: SILENCIAMIENTO DE LA EXPRESIN
DEL GEN Thpg1 EN T. harzianum T34. 130

RESULTADOS 131

1. TRABAJO PREVIO 132
2. OBTENCIN DE CEPAS DE T. harzianum T34 QUE SILENCIAN
EL GEN Thpg1 132
3. CARACTERIZACIN DE LAS CEPAS TRANSFORMADAS
CON pJL43b1-Thpg1 132
3.1. Comprobacin y seleccin de los transformantes 133
3.2. Confirmacin de los transformantes: anlisis tipo Southern 134
3.3. Anlisis de la expresin de Thpg1 en los transformantes
seleccionados 135
3.4. Ensayos de crecimiento en placa 136

DISCUSIN 138






ndice

Captulo 3: ESTUDIO DE LA FUNCIN GNICA
DE Thpg1 MEDIANTE TECNOLOGA DE
MICROARRAYS DE A. thaliana 143

RESULTADOS 144

1. DISEO EXPERIMENTAL Y PREPARACIN DE LAS MUESTRAS 145
2. TRATAMIENTO DE LAS MUESTRAS 146
3. ANLISIS DE LOS RESULTADOS 147
4. CONFIRMACIN DE LOS RESULTADOS MEDIANTE Northern 151

DISCUSIN 154


Captulo 4: SOBREEXPRESIN DEL GEN
Thpg1 EN PLANTAS DE A. thaliana 160

RESULTADOS 161

1. OBTENCIN DE PLANTAS DE A. thaliana QUE
EXPRESAN EL GEN Thpg1 162
1.1. Construccin del vector de expresin pBI121-Thpg1 162
1.2. Transformacin de A. tumefaciens con pBI121-Thpg1 162
1.3. Infeccin de plantas de A. thaliana con las cepas
transformadas de Agrobacterium 163
2. CARACTERIZACIN DE LAS LNEAS TRANSFORMADAS
CON pJL43b1-Thpg1 164
2.1. Comprobacin y seleccin de los transformantes 164
2.2. Confirmacin de los transformantes: anlisis tipo Southern 165
2.3. Anlisis de la expresin de Thpg1 en los transformantes
seleccionados 165
2.4. Anlisis de la actividad endopoligalacturonasa en los
transformantes seleccionados 166
2.5. Ensayos de resistencia a estreses abiticos 167
2.6. Anlisis morfolgico (fenotpico) 168
2.7. Anlisis de hormonas en las lneas seleccionadas 170

DISCUSIN 172





ndice

CONCLUSIONES 177


APNDICE 180


BIBLIOGRAFA 182































































INTRODUCCIN






Introduccin
2





1. BIOLOGA DEL GNERO Trichoderma


1.1. Morfologa

Trichoderma agrupa hongos filamentosos anamrficos (mitticos) que de forma
artificial han venido clasificndose en la Divisin Deuteromicota (Gams y col., 1987) y
dentro de sta, en la clase de los Hifomicetos. Se reproducen de forma asexual mediante
un ciclo en el que se alternan micelio y esporas, tambin llamadas conidios. Estos
conidios o esporas asexuales se forman a partir de clulas desnudas, sin la envoltura
adicional de un cuerpo fructfero. En algunos aislamientos se ha descrito el estado
perfecto o sexual, o teleomrfico (meitico), dentro del gnero Hypocrea y gneros
relacionados como Podostroma, Sarawakus, Aphysiostroma y Protocrea (Gams y
Grfenhan, 2006), representando Trichoderma un grupo de derivados clonales que ha
perdido la capacidad de completar un ciclo sexual (Kuhls y col., 1996). Recientemente,
se ha identificado a Hypocrea lixii como el estado teleomrfico de Trichoderma
harzianum, una de las especies del gnero ms citadas en el control biolgico (Chaverri
y col., 2003).

La mayora de las especies de Trichoderma se desarrollan rpidamente sobre
sustratos muy diversos y emiten grandes cantidades de conidios verdes (Figura 1)
formados a partir de clulas conidigenas enteroblsticas fialdicas (Kirk y col., 2001).
Los conidiforos son muy ramificados (asemejndose a arbustos con forma piramidal),
estn tabicados y sus clulas contienen ms de un ncleo. Los conidios son ovoides, con
pared normalmente lisa y con un solo ncleo. En determinadas condiciones
nutricionales o frente a la desecacin, se producen unas estructuras de resistencia
denominadas clamidosporas. stas, se forman sobre el micelio, son globosas, con pared
rugosa y ms gruesa que la de los conidios, y tienen gran importancia en la
supervivencia del hongo (Lewis y Papavizas, 1984). El nmero de cromosomas por
ncleo y el tamao del genoma varan segn la especie, de 3 a 7 y de 30,5 a 38,8 Mb,
respectivamente (Goldman y col., 1998; C. M. Kenerley, comunicacin personal).







Introduccin
3












Figura 1. Aislamiento de T. harzianum CECT 2413 (A) e
imgenes de la misma cepa captadas con un microscopio de
contraste de fases (B) y electrnico de barrido (C), tomado
de (Bentez y col., 2004).


1.2. Sistemtica

El gnero Trichoderma se describi hace ya ms de 200 aos (Persoon, 1794) y
desde entonces y hasta la aplicacin de tcnicas moleculares, la taxonoma del gnero se
bas en criterios morfolgicos, lo que llev a una gran confusin e imprecisin a la hora
de asignar nombres a los nuevos aislamientos dentro de los grupos establecidos. Entre
las primeras clasificaciones, basadas en criterios morfolgicos, se encuentran las de
Rifai (1969) y Bissett (1991). Rifai estableci nueve "agregados especficos", en cada
uno de los cuales encuadr especies fisiolgicamente distintas pero con una morfologa
similar. Ms tarde, Bissett revis las especies de Trichoderma existentes, los "agregados
especficos" y algunas formas anamrficas de Hypocrea, y propuso la divisin del
gnero Trichoderma en cinco nuevas secciones: TRICHODERMA, PACHYBASIUM,
LONGIBRACHIATUM, SATURNISPORUM e HYPOCREARUM (formas
anamrficas de Hypocrea) (Bissett, 1991).

Los primeros estudios orientados a caracterizar cepas de Trichoderma, no
basados en criterios morfolgicos, aplicaron caractersticas fisolgicas y/o bioqumicas
(Zamir y Chet, 1985; Stasz y col., 1989; Grondona y col., 1997). Actualmente, el uso de
tcnicas moleculares como perfiles RFLP, perfiles RAPD-PCR, secuencias de distintas
zonas del genoma o marcadores SCAR (Muthumeenakshi y col., 1994; Arisan-Atac y
col., 1995; Hermosa y col., 2000, 2001; Rubio y col., 2005) se estn imponiendo, tanto
para la identificacin de cepas como para la sistemtica del gnero. Particularmente
tiles resultan los datos de secuencias obtenidos de las regiones ITS y de genes como el
que codifica el factor de elongacin de la transcripcin 1 (tef1), el ADNr 18S, el ADNr
28S o la endoquitinasa 42 (ech42), ya que han permitido desde establecer nuevos
Introduccin
4
taxones (Kullnig-Gradinger y col., 2000; Kubicek y col., 2003), describir nuevas
especies como Trichoderma asperellum (Lieckfeldt y col., 1999) o Trichoderma
pleurotum (Komon-Zelazowska y col., 2007), relacionar especies como T. harzianum
con su fase sexual H. lixii (Chaverri y col., 2003), hasta distinguir y tipificar aquellas
formas que son dainas para los cultivos de champin (Hermosa y col., 1999, 2000).

En la actualidad, se aceptan cuatro secciones dentro del gnero Trichoderma:
PACHYBASIUM (T. harzianum y T. virens), TRICHODERMA (T. asperellum, T.
atroviride, T. hamatum, T. koningii y T. viride,), LONGIBRACHIATUM (T.
longibrachiatum y T. saturnisporum) e HYPOCREARUM (estados anamrficos de
Hypocrea) (Samuels, 1996; Hermosa y col., 2004). Las especies de las dos primeras
secciones constituyen las principales especies utilizadas en control biolgico. No
obstante, el nmero de especies contenido en cada una de las secciones depende de los
continuos cambios que sufre su sistemtica

1.3. Ecologa

El gnero Trichoderma comprende un grupo de hongos de rpido crecimiento
que son habituales de suelos forestales y agrcolas. Trichoderma se adapta a todo tipo de
climas pero aparece de forma abundante sobre restos vegetales de zonas hmedas (Klein
y Eveleigh, 1998). Los sustratos que Trichoderma puede utilizar en su crecimiento son
muy variados aunque muestra preferencia por los suelos cidos y ricos en materia
orgnica (Hubbard y col., 1983; Klein y Eveleigh, 1998). En cuanto a los parmetros
ambientales necesarios para su crecimiento, Trichoderma puede crecer dentro de un
amplio rango de temperaturas. Otro aspecto a destacar, es la resistencia relativa de
varias especies de Trichoderma a numerosos fungicidas qumicos utilizados en
agricultura como son los pesticidas organoclorados de tipo endosulfano (Katayama y
Matsumura, 1993; Shaban y El-Komy, 2001) o los bencimidazoles (Mukherjee y col.,
2003). Este hecho, junto con su velocidad de crecimiento y su fcil adaptacin a
diversas condiciones climticas y edficas (Lpez-Errasquin y Vzquez, 2003), dara a
Trichoderma ventaja sobre otros muchos hongos filamentosos en la colonizacin de
suelos despus de la aplicacin de estos tratamientos.











Introduccin
5
2. MECANISMOS DE ACCIN DE Trichoderma COMO AGENTE DE
CONTROL BIOLGICO


Hace ms de 70 aos que Weindling (1932) describi la capacidad antagonista
de Trichoderma lignorum (ahora T. viride). Desde entonces se han observado diferentes
mecanismos por los cuales Trichoderma previene y protege a las plantas contra el
ataque de otros hongos. Actualmente, los mecanismos de accin de Trichoderma
descritos son cinco (Hjeljord y Tronsmo, 1998; Howell, 2003; Harman y col., 2004): (i)
micoparasitismo, (ii) antibiosis, (iii) competencia, (iv) promocin del crecimiento y/o
(v) induccin de resistencia en la planta hospedadora. Estos mecanismos no son
excluyentes entre s, y la importancia relativa de cada uno de ellos an no est bien
establecida, aunque parece que depende de la cepa de Trichoderma, del patgeno diana
y de las condiciones edficas y ambientales.

2.1. Micoparasitismo

Se define el micoparasitismo como la relacin que un organismo establece con
un hongo husped de manera que se beneficia del mismo, normalmente obteniendo
nutrientes sin aportarle nada a cambio y, en ocasiones, causando su muerte. Cuando
ocurre esto ltimo se habla de micoparsitos necrotrficos para diferenciarlos de los
biotrficos, que mantienen su relacin con clulas vivas durante largos periodos de
tiempo.

Los eventos que conllevan al micoparasitismo son complejos y tienen lugar de
una manera ordenada (Figura 2). En primer lugar, Trichoderma localiza al patgeno y
comienza a crecer por tropismo hacia l (Chet y col., 1981; Lu y col., 2004). Esta
deteccin a distancia se debe, al menos parcialmente, a la expresin secuencial de
enzimas que degradan la pared celular de los hongos (CWDEs). Aunque las diferentes
cepas de Trichoderma pueden seguir distintos patrones de induccin de CWDEs, parece
seguro que una exoquitinasa extracelular, que se produce de forma constitutiva en
pequeas cantidades, podra estar implicada en este proceso. Esta exoquitinasa provoca
la liberacin de algunos oligmeros de la pared del hongo diana. Estos compuestos son
los que inducen la expresin de endoquitinasas txicas (Brunner y col., 2003; Harman,
2006) que, al ser liberadas por Trichoderma, difunden y comienzan el ataque al hongo
diana antes de que se haya producido el contacto fsico (Zeilinger y col., 1999; Viterbo
y col., 2002b).






Introduccin
6











Figura 2. Trichoderma parasitando al fitopatgeno Rhizoctonia solani.
(A) Hifa de Trichoderma (T) parasitando una hifa de R. solani (R), se
observa una reaccin tpica de enrollamiento. (B) Fotografa ampliada de
la interaccin Trichoderma-Rhizoctonia donde pueden observarse las
estructuras de tipo apresorio (A). La barra equivale a 10 m. (C) Hifa de
R. solani de la que se ha retirado la hifa de Trichoderma. Pueden
observarse los poros provocados por el micoparsito en algunos puntos de
unin entre ambas hifas. Tomado de (Harman y col., 2004).


Una vez que los hongos entran en contacto, Trichoderma puede enroscarse
alrededor del hongo diana y formar estructuras especializadas de tipo apresorio, con las
que podr penetrar posteriormente en el interior de las hifas del patgeno. La unin
parece estar mediada por la interaccin entre carbohidratos de la pared celular de
Trichoderma y lectinas del hongo diana (Inbar y Chet, 1996; Rocha-Ramrez y col.,
2002). Una vez en contacto, Trichoderma produce varias CWDEs y antibiticos, como
los peptaiboles (Schirmbck y col., 1994; Degenkolb y col., 2003), que generaran
agujeros en la pared celular.

Finalmente, Trichoderma digiere el contenido intracelular del hongo, fase que va
acompaada de algunos cambios morfolgicos como vacuolizacin, prdida de
citoplasma y desintegracin de las hifas del hospedador (Benhamou y Chet, 1996). En
algunos casos, tambin se observa la esporulacin de Trichoderma tras la completa
digestin del hongo atacado (Elad y col., 1984).

El mecanismo micoparastico de Trichoderma implica la accin de diversas
CWDEs (Elad y col., 1982; Papavizas, 1985; Chet y col., 1998; Sanz y col., 2004), entre
las cuales se encuentran quitinasas, -1,3-glucanasas, -1,6-glucanasas y proteasas.
Debido a que la quitina y el -1,3-glucano son los principales componentes
estructurales de las paredes celulares de hongos [los oomicetos, con pared de celulosa
(Bartnicki-Garca, 1968), han dejado de ser considerados hongos para pasar a ser
cromistas], se ha propuesto que las quitinasas y las -1,3-glucanasas son las enzimas
Introduccin
7
claves en este proceso (Elad y col., 1982; Papavizas, 1985; de la Cruz y col., 1993). Sin
embargo, se ha visto que otras enzimas que hidrolizan otros componentes minoritarios
de las paredes fngicas (protenas, -1,6-glucanos, -1,3-glucanos) tambin estn
implicadas en el proceso (Viterbo y col., 2002a; Sanz y col., 2005; Surez y col., 2005).

2.1.1. Quitinasas

La quitina, homopolmero de N-acetil--D-glucosamina (NAG) con uniones -
1,4 es, tras la celulosa, uno de los polmeros ms abundante en la naturaleza (Li, 2006).
Las quitinasas, enzimas que degradan quitina, se clasifican habitualmente dentro de las
familias 18, 19 y 20 de las glicosil hidrolasas, segn la similitud de sus secuencias
aminoacdicas (Dahiya y col., 2006).

En funcin de los productos de reaccin que generan en la degradacin de la
quitina, las quitinasas se clasifican (Sahai y Manocha,1993) en: (i) endoquitinasas (EC
3.2.1.14), que cortan aleatoriamente el polmero de quitina dando lugar a una mezcla de
oligmeros de distinto tamao y bajo peso molecular, principalmente (NAG)
2
, (ii)
exoquitinasas o quitobiosidasas (EC 3.2.1.29), que liberan dmeros de NAG a partir del
extremo no reductor de la quitina y (iii) 1,4--N-acetil glucosaminidasas (EC 3.2.1.30),
tambin denominadas hexosaminidasas (EC 3.2.1.52) o quitobiasas, cuyo modo de
accin es de tipo exo y cortan el oligmero de quitina dando lugar a monmeros de
NAG. Muchas de estas enzimas se han purificado y se han clonado muchos de los genes
que las codifican (Kubicek y col., 2001; Limn y Bentez, 2002).

Se han encontrado quitinasas en muchas especies de Trichoderma, e incluso
explorado su presencia potencial en los genomas de Trichoderma ya secuenciados
(Seidl y col., 2005), pero es en T. harzianum donde el sistema quitinoltico se ha
estudiado ms detalladamente. Se han clonado, en diferentes cepas, los genes que
codifican algunas quitinasas como CHIT37, CHIT42 y CHIT33 de T. harzianum
(Garca y col., 1994; Limn y col., 1995; Viterbo y col., 2001) y CHIT36 de T.
asperellum (Viterbo y col., 2002a).

Inicialmente, el efecto antifngico de la quitinasas se demostr, en ensayos in
vitro, tras observar que su presencia en la mezcla de reaccin inhiba el crecimiento o la
germinacin de las esporas de distintos hongos patgenos (Lorito y col., 1993).
Posteriormente, la sobreexpresin de genes que codifican quitinasas mejoraba la
capacidad antagonista de las cepas de Trichoderma, confirmando el efecto antifngico
de estas enzimas (Limn y col., 1999; Viterbo y col., 2001; Limn y col., 2004).
Tambin, se ha observado un sinergismo en el efecto antifngico frente a Botrytis
cinerea, cuando se combinaron quitinasas, con distintos mecanismos de accin y
procedentes de diferentes cepas de Trichoderma, con otras quitinasas obtenidas de
diversos hongos, plantas y bacterias (Lorito y col., 1996b). Incluso, las quitinasas de
Trichoderma se han llegado a describir como unas herramientas moleculares que
Introduccin
8
permiten aumentar la capacidad de biocontrol tanto de cepas de Trichoderma como de
otros microorganismos o plantas frente a enfermedades fngicas (Woo y col., 2001). Un
estudio reciente demuestra que la sobreexpresin en T. atroviride, del gen ThEn-42, que
codifica una endoquitinasa de T. harzianum, aumenta su capacidad de biocontrol frente
al patgeno Penicillium digitatum (Deng y col., 2007). A su vez, plantas transgnicas de
limonero, transformadas con este mismo gen, muestran mayor tolerancia al patgeno
foliar B. cinerea y, tambin, muestran mayores niveles de expresin de otros genes
relacionados con defensa (Distefano y col., 2008). De manera similar, la sobreexpresin
de dos endoquitinasas de T. harzianum, chit33 y chit42, en plantas de tabaco, determin
una mayor resistencia de estas lneas transgnicas a diferentes estreses biticos y
abiticos (Dana y col., 2006).

Durante el proceso de micoparasitismo se ha observado una transcripcin
secuencial de los genes que codifican quitinasas, de forma que a veces la prdida de
expresin de uno de estos genes conlleva una desregulacin del sistema quitinoltico
(Inbar y Chet, 1995; Zeilinger y col., 1999; Brunner y col., 2003).

2.1.2. Glucanasas

Las glucanasas agrupan un gran nmero de enzimas que degradan
homopolmeros lineales o ramificados de D-glucosa unidos mediante enlaces y/o .
Estas enzimas estn involucradas en diversas funciones morfogenticas, llevando a cabo
procesos de diferenciacin o nutricionales, para la obtencin de energa a partir de
polmeros de reserva. En Trichoderma se les ha atribuido un papel importante en el
micoparasitismo aunque el sistema ha sido menos estudiado que para las quitinasas
(Benhamou y Chet, 1993; Lorito y col., 1996a).

Las glucanasas se clasifican segn el tipo de enlace sobre el que actan y su
modo de accin. Las ms estudiadas, en Trichoderma, corresponden al grupo de las -
1,4-glucanasas o celulasas, -1,3-glucanasas y -1,6-glucanasas, aunque tambin se han
descrito otras como las -1,3-glucanasas.

Las celulasas rompen los enlaces -1,4 de la celulosa, un polmero de D-glucosa.
Las celulasas se clasifican en un amplio nmero de familias dentro las glicosil
hidrolasas, en funcin de la similitud de secuencias o de sus dominios catalticos (Bayer
y col., 1998). A su vez, en funcin de los productos de reaccin que generan, se
clasifican en: (i) -1,4-D-glucancelobiohidrolasas (EC 3.2.1.91), que liberan dmeros de
D-glucosa del extremo no reductor de la celulosa, (ii) endo--1,4-D-glucanasas (EC
3.2.1.4), que digieren aleatoriamente la celulosa y (iii) -1,4-glucosidasas (EC 3.2.1.21),
que liberan monmeros de D-glucosa. En T. reesei se han identificado al menos tres
formas diferentes de endoglucanasas (EGI, EGII y EGIII), dos glucancelobiohidrolasas
(CBHI y CBHII) y distintas -glucosidasas, que actan sinrgicamente en la
degradacin de la celulosa (Hui y col., 2001).
Introduccin
9

Las -1,3-glucanasas degradan -1,3-glucanos tanto lineales como ramificados,
y tanto en modo exo (EC 3.2.1.58) como endo (EC 3.2.1.39). Se han identificado
numerosas -1,3-glucanasas dentro del gnero Trichoderma (Vazquez-Garcidueas y
col., 1998) que han demostrado, in vitro, inhibir el crecimiento o la germinacin de
distintos hongos (Lorito y col., 1994a; El-Katatny y col., 2001).

Las -1,6-glucanasas degradan polmeros de glucosa unidos mediante enlaces -
1,6, tanto en su modo endo (EC 3.2.1.75) como exo (EC 3.2.1.21). Se han purificado
varias endo--1,6-glucanasas de la cepa T. harzianum T34 (de la Cruz y col., 1992; de
la Cruz y Llobell, 1999; Montero y col., 2005) y clonado los genes relativos: bgn16.2
(Lora y col., 1995; Delgado-Jarana, 2001), bgn16.1 y bgn16.3 (Montero y col., 2007).
Estos trabajos las han relacionado directamente con el micoparasitismo, ya que
transformantes que sobreexpresan alguno de estos genes tienen mayor actividad
antifngica frente a hongos patgenos, como R. solani o B. cinerea, respecto a la cepa
silvestre.

Tambin, las -1,3-glucanasas o mutanasas se han relacionado con la actividad
antagonista de Trichoderma frente a distintos hongos fitopatgenos (Ait-Lahsen y col.,
2001; Sanz y col., 2004).

2.1.3. Proteasas

Las funciones de las proteasas son muchas y de diversa naturaleza. Participan en
procesos de morfognesis, nutricin, metabolismo y procesamiento de protenas
extracelulares para su activacin (Howell, 2003). PRB1 fue la primera proteasa descrita
en Trichoderma, una sern proteasa bsica aislada y caracterizada en T. harzianum
(Gerema y col., 1993). La incorporacin de transformantes de T. harzianum que
sobreexpresan el gen prb1 a suelos infectados con R. solani reduca significativamente
la enfermedad causada por este patgeno en plantas de algodn, en invernadero (Flores
y col., 1997). Tambin, otra sern proteasa de T. harzianum T34, PRA1, con efecto
nematicida, se ha relacionado, por su patrn de expresin, con micoparasitismo (Surez
y col., 2004). En esa misma cepa, se han aislado dos aspartil proteasas cidas y se ha
comprobado que la expresin de los genes correspondientes es inducible por quitina
(Delgado-Jarana y col., 2002) y por paredes celulares de hongos fitopatgenos (Surez y
col., 2005), aunque no se ha demostrado su papel directo en el micoparasitismo.
Recientemente, mediante una aproximacin genmica, se han descrito 11 nuevas
peptidasas de T. harzianum T34 cuya relacin con la capacidad de biocontrol se ha
analizado por medio del estudio de la expresin de sus respectivos genes en condiciones
de micoparasitismo simulado (Surez y col., 2007).



Introduccin
10
2.2. Antibiosis

La antibiosis consiste en la inhibicin del crecimiento de un organismo por el
producto metablico de otro, sin que medie contacto fsico entre ellos. Muchas cepas de
Trichoderma liberan metabolitos secundarios, voltiles y no voltiles, que producen este
efecto (Figura 3). La actividad antibitica de Trichoderma fue detectada por primera
vez por Weindling (1932) y desde entonces se han descrito numerosos antibiticos
producidos por las especies de este gnero.




Figura 3. Imagen del resultado de un
ensayo de antibiosis donde se muestran
los halos de inhibicin del crecimiento de
colonias bacterianas producidos por
filtrados extracelulares de Trichoderma.




Los metabolitos secundarios se dividen, en funcin de su ruta biosinttica, en los
siguientes grupos (Sivasithamparam y Ghisalberti, 1998): derivados de los cidos
tricarboxlicos, no derivados de acetatos, cidos grasos, compuestos heterocclicos de
oxgeno, poliqutidos, terpenos y derivados, derivados de aminocidos y pironas. La
produccin de estos antibiticos es dependiente de cada aislado y de las condiciones
ambientales, que determinan qu compuestos se sintetizarn y en qu cantidad. Una
revisin de los metabolitos de Trichoderma y su importancia en procesos de biocontrol
se recoge en Cardoza y col. (2005).

El papel de estos compuestos en el antagonismo es fundamental, ya que
mutantes de T. virens deficientes en la produccin de gliotoxina pierden totalmente la
capacidad de inhibir a R. solani (Howell y Stipanovic, 1995). Los mecanismos de
antagonismo que Trichoderma utiliza no son independientes, sino que interactan unos
con otros. Un ejemplo de este sinergismo se ha observado sobre el efecto antifngico
frente a varios gneros de hongos fitopatgenos como Botrytis, Fusarium o Alternaria,
que se incrementa, tras una aplicacin conjunta de antibiticos y CWDEs de
Trichoderma (Lorito y col., 1996b).





Introduccin
11
2.3. Competencia con el patgeno

La competencia es un aspecto importante del control biolgico y ocurre cuando
dos o ms microorganismos requieren de un mismo recurso ms de lo que est
disponible de forma inmediata. Estos requerimientos o recursos pueden ser nutrientes,
oxgeno, espacio fsico, luz, etc. (Paulitz, 1990). La ubicuidad de Trichoderma en suelos
naturales y agrcolas de todo el mundo (Hermosa y col., 2004) es una prueba de que es
un buen competidor por el espacio y por los recursos nutritivos. Aparece en casi todos
los suelos y tambin en hbitats naturales que contienen grandes cantidades de materia
orgnica, donde se comporta como un excelente descomponedor de material vegetal y
fngico. Adems, muchas especies del gnero Trichoderma muestran una gran
versatilidad metablica que les permite crecer utilizando un amplio abanico de fuentes
de nitrgeno y carbono (Grondona y col., 1997). Por otra parte, la capacidad para
colonizar la rizosfera de las plantas es un punto clave en este proceso ya que un agente
de control biolgico que no sea capaz de crecer en la rizosfera no podr competir por el
espacio y los nutrientes de ese ecosistema (Howell, 2003).

Por ejemplo, la competicin por el espacio es el mecanismo que asegura la
proteccin de los racimos de uvas contra la podredumbre gris causada por B. cinerea,
ya que este patgeno no puede instalarse sobre los capuchones florales de vides que han
sido colonizados por T. harzianum (Dubos y col., 1982). En la bibliografa se pueden
encontrar otros casos en los que se alude a la competencia por los nutrientes como
responsable directa del efecto antagonista de Trichoderma (Howell y Stipanovic, 1995;
Handelsman y Stabb, 1996; Lo y col., 1996). En la Figura 4 se muestra un cultivo dual
de Trichoderma (izquierda) y el hongo patgeno Colletotrichum acutatum.




Figura 4. Imagen de un
enfrentamiento dual de
Trichoderma (izquierda) y el
hongo patgeno C. acutatum
(derecha).




A pesar de todo, es difcil determinar si solamente mediante la competencia
Trichoderma es capaz de ejercer su accin antagonista o si, por el contrario, otros
mecanismos como el micoparasitismo o la antibiosis preparan el escenario para que la
competencia se lleve a cabo de una forma ms eficaz (Harman, 2000). Es mucho lo que
falta por aprender sobre el orden secuencial de estos eventos.
Introduccin
12
2.4. Promocin del crecimiento de las plantas

En los ltimos aos se ha comprobado la capacidad de ciertas cepas
Trichoderma para estimular el crecimiento y el desarrollo de las races de las plantas
(Figura 5), lo que se traduce en un incremento de la productividad (Harman y col.,
2004). Plantas de pepino inoculadas con la cepa de biocontrol T. harzianum T-203,
mostraron un incremento del 75-95% en el sistema radical, y un aumento de la
superficie foliar del 80% (Yedidia y col., 2001). Para explicar este hecho se han
sugerido varios mecanismos como son la produccin de factores de crecimiento y
vitaminas, el control de patgenos menores o la conversin de material no utilizable en
formas que puedan ser asimiladas por las plantas. Por ejemplo, Trichoderma posee la
capacidad de solubilizar metales como el zinc, el manganeso, el hierro o el cobre,
convirtindolos en nutrientes asimilables por las plantas (Altomare y col., 1999).

Otras propiedades identificadas en Trichoderma a lo largo del proceso de
interaccin con la planta, son la resistencia a diferentes tipos de estrs abitico y
cambios en el estado nutricional (Howell, 2003). Estudios recientes demuestran que
algunas cepas de Trichoderma pueden regular los niveles de auxina en la rizosfera y
estimular el crecimiento de las plantas y, por extensin, proteger el sistema radical e
inducir la defensa sistmica frente al ataque de patgenos (Bjrkman, 2004).






Figura 5. Imagen de una planta de pepino
tratada con T. harzianum T22 (+T22) y no
tratada (-T22).







2.5. Induccin de mecanismos de resistencia en planta

La capacidad de distintas cepas de Trichoderma para proteger a las plantas
frente a patgenos de raz, se atribuy durante mucho tiempo a un efecto directo contra
el patgeno (Chet y col., 1998). Sin embargo, se ha comprobado que la asociacin
directa de Trichoderma con las races de la planta, estimula los mecanismos de defensa
de la misma (Yedidia y col., 1999), lo que conlleva una resistencia contra un variado
Introduccin
13
tipo de microorganismos fitopatgenos e incluso nematodos (Harman y col., 2004). Esta
resistencia inducida no es especfica de un determinado tipo de planta y puede ser
localizada o sistmica, capacitndola para ejercer una respuesta mayor y ms rpida
ante el ataque de patgenos (Conrath y col., 2002). Esta respuesta incluye la secrecin
de peroxidasas, la sntesis de fitoalexinas, la expresin de genes que codifican protenas
relacionadas con la patognesis o PR, la biosntesis de compuestos terpnicos
(Howell, 2006) o el aumento de los niveles de cido saliclico (Meyer y col., 1998) y
cido jasmnico (Segarra y col., 2007). Un estudio reciente realizado por Navazio y col.
(2007) determina la importancia de los cambios en la concentracin del calcio citoslico
en la planta, para la deteccin de Trichoderma.

La capacidad colonizadora de Trichoderma se realiza a travs de la germinacin
y colonizacin de la superficie de las races, y la posterior penetracin en las primeras
capas de clulas de la epidermis (Yedidia y col., 1999; Zeilinger y col., 1999; Harman y
col., 2004; Woo y col., 2006). En esta etapa de la interaccin Trichoderma-planta
muchos genes como los que codifican hidrofobinas, necesarias posiblemente para la
adherencia a las races, se activan de forma especfica (Bentez y col., 2004; Rosado y
col., 2007). Este contacto da como resultado la activacin de los mecanismos de defensa
de la planta. Trichoderma permanece en ella como un microoganismo avirulento y
simbionte, que estimula su crecimiento (y con ello aumentan los exudados de la raz que
son nutrientes para Trichoderma) y la protege de los patgenos directamente y a travs
de una respuesta inducida (Harman y col., 2004; Woo y col., 2006). Por medio de
estudios transcriptmicos se ha podido comprobar que algunas cepas de Trichoderma
inducen de forma activa cambios sistmicos en la fisiologa y la resistencia de la planta
a los patgenos, modulando la expresin de genes relacionados con el estrs y el
metabolismo de la misma (Alfano y col., 2007).

En los ltimos aos se est analizando el papel que juega Trichoderma en su
relacin con la planta y el patgeno, desde el punto de vista de la produccin de
molculas que podran actuar como elicitores de la respuesta de defensa en plantas
(Woo y col., 2006; Vinale y col., 2008). Se han establecido, al menos, tres vas de
elicitacin de esta respuesta: mediante enzimas o pptidos, por protenas avr, o bien,
mediante oligosacridos de bajo peso molecular liberados por la accin de enzimas
especficas de Trichoderma sobre la pared celular del patgeno y/o la planta.
Recientemente, se han aislado genes del tipo avr, similares a los que poseen los
patgenos avirulentos, o del tipo de transportadores ABC, relacionados con la
resistencia de Trichoderma a molculas txicas que secretan las plantas o los hongos
fitopatgenos (Harman y col., 2004; Woo y col., 2006). En la actualidad, las
investigaciones se estn centrando en determinar la funcin de las enzimas que
degradan la pared celular de las plantas aunque la redundancia, en el genoma de
Trichoderma, de este tipo de genes supone una dificultad aadida (Woo y col., 2006).
Algunas de estas molculas parecen ser enzimas del tipo xilanasas cuya accin debe
inducir la biosntesis de fitoalexinas y de peroxidasas por parte de la planta (Harman y
Introduccin
14
col., 2004). Celulasas activas o inactivadas por calor, son capaces de estimular la ruta
del cido saliclico o la del etileno, respectivamente (Martnez y col., 2001). As, las
enzimas secretadas por Trichoderma son usadas como una herramienta para inducir una
respuesta ISR en la planta.


3. APLICACIONES DEL GNERO Trichoderma


Las especies del gnero Trichoderma poseen caractersticas que las convierten
en organismos con un gran inters industrial. La habilidad de T. reesei para producir
enzimas celulolticas capaces de degradar el material celulsico ha dirigido su
explotacin comercial hacia reas tan diversas como las fermentaciones alcohlicas, los
detergentes para el lavado de ropa, el blanqueo del papel reciclado, la alimentacin
animal o la produccin de combustibles (Reese y Mandels, 1989; Kubicek y col., 1990).
Por otro lado, la capacidad de Trichoderma para secretar protenas lo presenta como una
alternativa a los organismos empleados hoy en da como fbricas celulares para la
produccin de protenas con fines farmacuticos (Rey y col., 2004).

Del mismo modo, las quitinasas de Trichoderma se emplean en la degradacin
de los restos de quitina de diversas industrias, como las que trabajan con crustceos,
para obtener N-acetil-glucosamina, que se emplea como suplemento alimenticio, (Cosio
y col., 1982).

En la industria del vino se ha encontrado una posible aplicacin para las -1,3-
glucanasas en la clarificacin de caldos (Dubordieu y col., 1985), proceso que se ve
favorecido por la degradacin de polmeros que pueden aparecer en los mostos, como el
cinerean, cuyo principal componente es el -1,3-glucano. Tambin se estn utilizando
metiltransferasas producidas por Trichoderma para mejorar las caractersticas
organolpticas del vino (Coque y col., 2003).

Algunas especies de Trichoderma se usan en biorremediacin. La cepa F6 de T.
atroviride aplicada a suelos con plantas de Brassica juncea, detoxifica metales pesados
como cadmio, niquel o una combinacin de ambos (Cao y col., 2008).

Una de las aplicaciones que ms inters despierta es la utilizacin de diferentes
especies de Trichoderma como agentes de control biolgico en agricultura para el
control de enfermedades de plantas producidas por hongos (Monte, 2001; Bentez y
col., 2004; Harman y col., 2004). El control biolgico se puede definir como el empleo
de organismos distintos al hombre con capacidad para reducir la poblacin del agente
causante de una enfermedad o evitar sus efectos (Hjeljord y Tronsmo, 1998). Estos
organismos pueden ser patgenos hipovirulentos que compiten por el espacio y por los
nutrientes, variedades de plantas ms resistentes a la enfermedad, o microorganismos
Introduccin
15
antagonistas que interfieren con la supervivencia del patgeno o con sus mecanismos
para provocar la enfermedad, como es el caso de Trichoderma.

Trichoderma se ha empleado como modelo de estudio en la mayor parte de las
investigaciones realizadas sobre el control de enfermedades de origen fngico, ya que se
trata de un organismo ubicuo, fcil de aislar y cultivar. Numerosas especies clasificadas
dentro de este gnero se han utilizado en experimentos de control biolgico de hongos
patgenos de plantas o en experimentos de control integrado que, en la mayora de los
casos, se basa en la combinacin de agentes biolgicos y qumicos, reduciendo la dosis
de estos ltimos hasta niveles subletales, gracias al efecto sinrgico de la accin de
ambos tipos de tratamientos (Chet e Inbar, 1994; Monte, 2001). Tampoco debe
obviarse, el potencial de los genes y productos gnicos de Trichoderma para el
desarrollo de estrategias de biocontrol (Lorito y col., 1994b).

T. harzianum, T. viride y T. virens son las especies de Trichoderma ms citadas
en control biolgico (Papavizas, 1985; Chet, 1987). Actualmente, T. harzianum, sola o
en combinacin con otras especies de Trichoderma, est siendo utilizada en
preparaciones comerciales para el control de numerosas enfermedades de plantas
producidas por hongos. Estas formulaciones se aplican directamente al suelo, a las
semillas (coating) o, mediante diferentes sistemas de riego, a plntulas para trasplante
en semilleros y en cultivos definitivos (Cook, 1997; Grondona y col., 2001).


4. SISTEMA PECTINOLTICO DE HONGOS


Son numerosos los estudios realizados en el gnero Trichoderma sobre CWDEs
y su relacin con el micoparasitismo, como es el caso de las enzimas del sistema
quitinoltico, celuloltico o proteoltico (Viterbo y col., 2002b). Hasta la fecha, no
existen estudios del sistema pectinoltico de este hongo y su implicacin en la
degradacin de la pared celular de las plantas. En la mayora de hongos fitopatgenos,
se ha relacionado su sistema pectinoltico con procesos de patognesis.

Tanto los hongos saprofticos como los fitopatgenos producen una batera de
enzimas extracelulares capaces de degradar los distintos componentes de la pared
celular de las plantas. Estos hongos digieren la pared, no slo para obtener una fuente de
carbono, sino para penetrar el tejido vegetal en el proceso de infeccin (Annis y
Goodwin, 1997).

Desde el punto de vista de los hongos fitopatgenos, se considera las
endopoligalacturonasas (endoPGs) como importantes factores de virulencia (DOvidio y
col., 2004a). Esto es debido a que dentro de la amplia batera de enzimas pectinolticas
que poseen estos hongos, las endoPGs son las enzimas que se producen en primer lugar
Introduccin
16
(DOvidio y col., 2004a). Estudios realizados sobre pectinasas de B. cinerea indican que
las endoPGs son las primeras CWDEs detectadas en el proceso de infeccin (ten Have y
col., 2001). Si tenemos en cuenta este hecho, es lgico que dentro del gran nmero de
estudios realizados sobre enzimas pectinolticas, la mayora se centren en el estudio de
las endoPGs.

Pero las endoPGs no actan slo como factores de virulencia, tambin se ha
descrito el importante papel que desempean en la produccin de molculas elicitoras
como los oligogalacturnidos (OGAs), que adems de suponer una fuente de carbono
para el hongo, desencadenan una respuesta de defensa en la planta (Ridley y col., 2001).

De manera general, las pectinasas se utilizan como enzimas lticas en las
industrias alimentaria, para la clarificacin de zumos o produccin de purs, y del vino
(Lang y Drnenburg, 2000; Kashyap y col., 2001). Tambin se aplican distintas
formulaciones a base de pectinasas de Aspergillus, entre otras enzimas, en el proceso de
maceracin de la aceituna (Galante y col., 1993). Se ha descrito que la utilizacin de
pectinasas en la separacin de la corteza de la madera disminuye el consumo de energa
necesaria para realizar este proceso (de Vries y Visser., 2001).

Son numerosas las referencias que se pueden encontrar acerca de las pectinasas,
sobre todo en el gnero Aspergillus, por su potencial en la industria alimentaria. Se han
descrito ramnogalacturonasas en Aspergillus aculeatus (Suykerbuyk y col., 1995),
pectin liasas en Aspergillus niger (Harmsen y col., 1990), pectato liasas principalmente
en bacterias (Herron y col., 2000) o pectin metilesterasas en A. niger (Khanh y col.,
1991). Sin embargo, los trabajos sobre pectinasas en Trichoderma son muy escasos. La
primera referencia describe la actividad pectinoltica en dos cepas de este hongo
(Calistru y col., 1997); y, ms recientemente, dos trabajos recogen la purificacin de dos
endoPGs en T. reesei (Mohamed y col., 2003) y otras dos en T. harzianum (Mohamed y
col., 2006).

4.1. Estructura de la pectina

La pared celular de las plantas es una estructura perfectamente organizada, cuya
composicin molecular (polisacridos, protenas y sustancias aromticas) vara entre las
distintas especies, a nivel de los diferentes tejidos e incluso entre distintas partes de una
misma clula. La complejidad que presenta esta estructura sugiere que la pared celular
posee mltiples funciones. Actualmente, los estudios sobre pared celular estn
encaminados al anlisis de su funcin, no desde un punto de vista estructural en la
clula sino en relacin a su capacidad para desencadenar respuestas defensivas en la
planta a travs de molculas elicitoras (Vorwerk y col., 2004).

Introduccin
17
Los polisacridos son los principales componentes de la pared celular vegetal
constituyendo una compleja matriz formada por celulosa, hemicelulosas y pectina
(Figura 6).



















Figura 6. Representacin esquemtica de la pared celular vegetal,
tomado de (Cosgrove y col., 2005).


La celulosa es el polisacrido ms abundante y representa entre el 15% y el 30%
del peso seco de la pared celular vegetal, siendo ms abundante en la pared celular
secundaria. Se encuentra formando microfibrillas, dispuestas paralelamente,
constituidas por cadenas de -1,4-glucano.

Las microfibrillas de celulosa se encuentran ligadas por carbohidratos no
fibrilares que se denominan genricamente hemicelulosas. Hay dos tipos de
carbohidratos que estn en todas las angiospermas, los xiloglicanos (XiGs) y los
glucuronoarabinoxilanos (GAXs). Otros polisacridos no celulsicos, menos
abundantes, son glucomananos, galactoglucomananos y galactomananos.

La pectina es el componente ms importante de la pared celular. Se localiza
principalmente en la pared primaria, aunque tambin se encuentra en la lmina media
desarrollando un importante papel de adherencia entre las clulas (Willats y col., 2001).
La pectina est constituida por un grupo de polisacridos, complejo y heterogneo, ricos
en cido galacturnico, formando una matriz en la que se disponen el resto de
componentes de la pared celular. Estos polisacridos se encuentran formando tres
Introduccin
18
dominios principales: ramnogalacturonano-I (RG-I), ramnogalacturonano-II (RG-II) y
homogalacturonano (HGA), que se unen de manera covalente y con enlaces con
cationes divalentes, como el calcio y el boro (Cosgrove y col., 2005) (Figura 7).


Figura 7. Representacin esquemtica de la estructura de la pectina (A). En la figura
(B) se muestra detallada la disposicin del dominio de homogalacturonano (HGA)
formando las denominadas cajas de huevo, tomado de (Cosgrove y col., 2005).


Ramnogalacturonano-I: es un dominio formado por repeticiones de -1,2-L-
ramnosa y cido -1,4-D-galacturnico. El anlisis de su estructura ha desvelado que
slo un 2% de los residuos de cido galacturnico presentan cadenas laterales unidas al
C-3, mientras que entre un 20 y un 80% de los residuos de ramnosa estn sustituidos en
el C-4 por complejas cadenas de polisacridos (Ridley y col., 2001).

Ramnogalacturonano-II: es un dominio formado principalmente por residuos de
cido -1,4-D-galacturnico sustituido en los carbonos C-2 y C-3 por complejas
cadenas de polisacridos y, en menor medida, por residuos de ramnosa (Ridley y col.,
2001). Hay estudios que demuestran que este dominio se encuentra formando dmeros a
travs de enlaces dister con el borato (Ishii y col., 2001) (Figura 7A) y que la presencia
de boro contribuye al grado de porosidad de la matriz pctica (Willats y col., 2001).

Homogalacturonano: es un dominio formado por cadenas de entre 100 y 200
residuos de cido galacturnico unidos por enlaces -1,4. Alrededor del 75% de estos
residuos presentan esterificaciones en los grupos carboxilo (COO) con metanol
(Cosgrove y col., 2005) aunque, dependiendo del tipo de planta, tambin puede
Introduccin
19
presentar esterificaciones con cido actico en los carbonos C-2 y C-3 (Ridley y col.,
2001). La disposicin espacial ms favorable, en trminos de mnima energa, que
puede adoptar el HGA es la helicoidal, no obstante, la unin de dos cadenas de HGA no
esterificadas crea estructuras denominadas cajas de huevo (Figura 7B), donde la carga
negativa de los grupos carboxilo permite la unin de iones calcio. Estas uniones hacen
que se formen geles, estructuras importantes para el mantenimiento y la integridad de la
pared celular (Willats y col., 2001).

La degradacin microbiana de la pared celular es un proceso complejo que
implica la participacin de un gran nmero de enzimas que son producidas de manera
secuencial, siendo las pectinasas las primeras en actuar para debilitarla y permitir el
acceso a la hemicelulosa y la celulosa al resto de CWDEs (Annis y Goodwin, 1997).

4.2. Clasificacin de las pectinasas

La pectina puede adoptar distintas conformaciones, por lo que se aceptan
diversos nombres a la hora de describirla (Kashyap y col., 2001). Se denomina
protopectina a la pectina insoluble tal y como se encuentra en los tejidos vegetales.
cido pctico o pectato es el trmino que se aplica a la pectina que esta principalmente
formada por cadenas de cido galacturnico no esterificado. Por otro lado, las cadenas
de cido galacturnico que presentan un elevado grado de esterificacin por grupos
metilo reciben el nombre de cido pectnico o de manera ms genrica pectina. Estos
cidos pectnicos presentan la capacidad de formar geles con azcares o cidos y, si el
grado de esterificacin es bajo, con otros compuestos como las sales de calcio (Hoondal
y col., 2002).

La pectinolisis no slo tiene un papel fundamental para los microorganismos,
sino tambin para las plantas, adquiriendo suma importancia en todos aquellos procesos
que requieren la elongacin de la pared celular (Hadfield y col., 1998). Por ejemplo, se
ha descrito actividad pectinasa asociada con procesos de abscisin (Taylor y col., 1990),
maduracin de fruto (Downs y col., 1992), desarrollo del polen (Pressey y Reger, 1989)
y germinacin de semillas (Sitrit y col., 1999).

De manera general, las pectinasas se pueden clasificar atendiendo a varios
criterios: (i) segn el sustrato sobre el que actan, (ii) segn el mecanismo de accin,
trans-eliminacin o hidrlisis y (iii) por el mecanismo de accin, modo endo,
rompiendo la molcula al azar y liberando oligmeros de diferentes tamaos, o modo
exo, actuando sobre el extremo no reductor y liberando dmeros o monmeros (Kashyap
y col., 2001). En funcin de estos criterios, los principales tipos de pectinasas se
detallan en la Tabla 1.



Introduccin
20
Tabla 1. Clasificacin de las pectinasas.
Enzima
EC
nmero
Sustrato Producto Modo de accin
protopectinasa n.d.* protopectina pectina solubiliza la protopectina
pectinesterasa (PE) o
pectinmetilhidrolasa
3.1.1.11 pectina cido pctico
desesterificacin de los
grupos metilo
pectinesterasa (PE) o
pectinacetilesterasa
n.d. pectina cido pctico
desesterificacin de los
grupos acetilo
polimetil-
poligalacturonasa
(PMG)
n.d. pectina
oligogalacturonato
metilado
hidrlisis de enlaces -
1,4-glicosdicos
poligalacturonasa (PG)
3.2.1.15
(endo)
3.2.1.67/82
(exo)
cido pctico oligogalacturonato
hidrlisis de enlaces -
1,4-glicosdicos
polimetilgalacturnico
liasa (PMGL)
4.2.2.10 pectina
oligogalacturonato
insaturado
trans-eliminacin de
enlaces -1,4-
glicosdicos
poligalacturnico liasa
(PGL)
4.2.2.2
(endo)
4.2.2.9
(exo)
cido pctico
oligogalacturonato
insaturado
trans-eliminacin de
enlaces -1,4-
glicosdicos
n.d.*: no definido


4.3. Endopoligalacturonasas fngicas

Las endoPGs (EC 3.2.1.15) son enzimas que hidrolizan los enlaces -1,4 del
cido pctico. Segn la clasificacin de Henrissat (1991), basada en la similitud de las
secuencias aminoacdicas, estas enzimas forman parte de la familia 28 de las glicosil
hidrolasas. Esta familia adems incluye otras enzimas como exo-poligalacturonasas (EC
3.2.1.67) y exo-poligalacturonosidasa (EC 3.2.1.82) que actan sobre el extremo no
reductor del cido pctico, liberando monogalacturonatos o digalacturonatos,
respectivamente. Tambin estn incluidas en esta familia: ramnogalacturonasas (EC no
definido), endo-xilogalacturonano hidrolasas (EC no definido) y ramnogalacturonano -
L-ramnopirano hidrolasas (EC 3.2.1.40).

Actualmente, hay descritas numerosas endoPGs de un gran nmero de hongos
fitopatgenos (Aspergillus flavus, A. niger, B. cinerea, Colletotrichum lindemuthianum,
Fusarium oxysporum, Sclerotinia sclerotiorum) (Whitehead y col., 1995; Fraissinet-
Introduccin
21
Tachet y Fevre, 1996; Di Pietro y Roncero, 1998; Centis y col., 1997; Wubben y col.,
1999, Parenicov y col., 2000a), as como de bacterias (Erwinia carotovora, Xylella
fastidiosa) (Pickersgill y col., 1998; Roper y col., 2007). En muchos casos, se ha
comprobado la existencia de familias multignicas de endoPGs como es el caso de B.
cinerea (Wubben y col., 1999) y S. sclerotiorum (Fraissinet-Tachet y col., 1995) y, ms
recientemente, en el oomiceto Phytophthora cinnamomi (Gtesson y col., 2002) y el
basidiomiceto Chondrostereum purpureum (Williams y col., 2002).

La mayora de las poligalacturonasas (PGs) pertenecientes a la familia 28 y
descritas en la base de datos CArbohydrate-Active enZymes (CAZy) (Coutinho y
Henrissat, 1999) (http://www.cazy.org/), pertenecen a bacterias, plantas y hongos,
siendo las de estos ltimos principalmente endoPGs. Entre las pocas referencias
bibliogrficas sobre exopoligalacturonasas (exoPGs) fngicas se encuentran las de
Cochliobolus carbonum (Scott-Craig y col., 1998), F. oxysporum (Garca-Maceira y
col., 2000) y las de los aspergilli, A. niger (Martens-Uzunova y col., 2006) y Aspergillus
tubingensis (Kester y col., 1996).

Un estudio realizado por Markovic y Janecek (2001) sobre el alineamiento de
115 secuencias aminoacdicas de endoPGs y exoPGs de bacterias, plantas y hongos,
obtenidas de la base de datos CAZy, muestra la relacin evolutiva que existe entre este
grupo de enzimas. Este estudio muestra la separacin de PGs de bacterias, plantas y
hongos, en tres grupos principales, quedando perfectamente separados los dos modos de
accin enzimtica, exo y endo, de las PGs fngicas.

Estos tipos de anlisis demuestran el alto grado de homologa que presentan las
endoPGs a nivel aminoacdico, siendo generalmente, del 60 al 65%, excepto para
Fusarium moniliforme, cuya homologa con una endoPG de S. sclerotiorum es del 40%.
Aunque tambin se pueden encontrar similitudes de ms del 80%, as varias endoPGs
de S. sclerotiorum muestran homologas del 85 y 90% con endoPGs de B. cinerea
(Kasza y col., 2004). Por otro lado, el porcentaje de homologa entre las endoPGs
fngicas y las de plantas y bacterias baja hasta un 20% (Annis y Goodwin, 1997). Sin
embargo, los estudios con secuencias de genes relativos a estas protenas muestran unas
homologas muy bajas.

Se ha determinado que el tamao de los genes relativos a la mayora de las
endoPGs est entre 1100 y 1350 pb, presentando de uno a cuatro intrones de tamaos
que varan desde los 50 pb hasta los 81 pb (Annis y Goodwin, 1997), aunque se pueden
encontrar endoPGs que carecen de intrones, como ocurre en S. sclerotiorum (Fraissinet-
Tachet y col., 1995) y B. cinerea (ten Have y col., 2001). Otros anlisis han revelado
que la mayora de las endoPGs presentan un pptido seal, de 20 a 40 aminocidos, y
que la protena madura tiene una masa molecular entre 33 y 38 kDa (Annis y Goodwin,
1997).

Introduccin
22
Por otra parte, el gran nmero de endoPGs que aparecen en las bases de datos
podra deberse a la presencia de mltiples genes y/o a la presencia de mltiples
isoenzimas producidas, por modificaciones post-traduccionales (glicosilacin o
proteolisis), a partir de una o muy pocas protenas. Est descrito que los genes de las
endoPGs se organizan en familias cuyos componentes muestran un alto grado de
polimorfismo (DOvidio y col., 2004a), aunque tambin se ha descrito la presencia de
genes nicos como en F. moniliforme que produce cuatro endoPGs a partir de un nico
gen (Caprari y col., 1993). Una posible causa de la presencia de familias multignicas o
de mltiples isoenzimas podra estar relacionada con el nmero de hospedadores
(Wubben y col., 2000) o con una mayor capacidad adaptativa para el patgeno en el
proceso de infeccin (Keon y col., 1987). Aunque tambin hay casos en los que el
elevado nmero de copias de genes relativos a endoPGs, presentes en el genoma de un
hongo, no muestra una correlacin con su rango de hospedador, as ocurre en el
patgeno Phytophthora infestans (Yan y Liou, 2005).

Cabe destacar una regulacin transcripcional para este tipo de genes. Wubben y
col. (2000) enumer cuatro mecanismos de regulacin para los mismos: (i) expresin
basal, (ii) induccin por monmeros de pectina, (iii) represin por glucosa y (iv)
regulacin por pH. Esta clasificacin ha sido avalada por numerosos estudios en hongos
como A. niger (Parenicova y col., 2000a) y B. cinerea (Wubben y col., 2000).

Se ha demostrado la influencia del pH en la expresin de estos genes (Wubben y
col., 2000; de Vries y Visser, 2001). La secuencia consenso reconocida por el factor de
transcripcin PacC, (GCCARG), se ha localizado en los promotores de genes que
codifican endoPGs en numerosas especies del gnero Aspergillus (de Vries y Visser,
2001). Sin embargo, esa secuencia no se ha encontrado en los promotores de estos
genes en B. cinerea (Wubben y col., 2000) aunque se ha observado una clara regulacin
de ellos por pH. El factor PacC est positivamente regulado a pHs altos, as estos genes
se transcriben en condiciones alcalinas y se reprimen en condiciones cidas (Rollins,
2003).

Tambin se ha demostrado que un homlogo del represor por fuente de carbono,
CreA, estara involucrado en la represin de estos genes. Se ha localizado la secuencia
(SYGGRG) de unin a este factor de transcripcin en la mayora de los promotores de
genes relativos a endoPGs que presentaron represin catablica (Di Pietro y Roncero,
1998; Reymond-Cotton y col., 1996; Yan y Liou, 2005). No obstante, se han descrito
tambin genes que no estn sometidos a represin por fuente de carbono como los de la
familia de las endoPGs neutras del hongo necrotrfico S. sclerotiorum (Cotton y col.,
2003).

Por otra parte, el estudio del promotor del gen Clpg2 de C. lindemuthianum
revel la presencia de dos elementos cis (TLE y PLE) relacionados con la expresin del
Introduccin
23
gen durante el crecimiento saproftico del hongo en pectina y durante el ataque a la
planta (Herbert y col., 2002, 2004).

La expresin secuencial de los genes que codifican endoPGs permitira explicar
una actuacin diferencial de sus enzimas sobre la pared de la planta. As, genes que se
expresan constitutivamente originaran las enzimas que actuaran en las primeras etapas
de colonizacin del tejido vegetal para liberar OGAs que, a su vez, provocaran una
induccin de los genes de las endoPGs que actuaran, en las etapas posteriores, en la
maceracin del tejido (Cotton y col., 2003; Kasza y col., 2004). Por otra parte, el
cambio en el pH del medio que ocurre a medida que el hongo interacciona con la planta
determina un cambio en la expresin de los distintos genes y, por tanto, la aparicin
secuencial de endoPGs en el medio (Rollins y col., 2003).

Los patrones de expresin de genes que codifican endoPGs observados in vitro
contribuyen a entender sus expresiones in planta. Estudios realizados con B. cinerea in
planta, han demostrado que variables como el husped, la etapa de infeccin o la
temperatura, afectan tambin a la expresin de este tipo de genes (Wubben y col., 2000;
Herbert y col., 2004).

Hay numerosos estudios que relacionan directamente las endoPGs con la
capacidad virulenta de los hongos. Estudios realizados con dos endoPGs bsicas, no
reprimidas por glucosa, en los hongos fitopatgenos A. flavus y B. cinerea, concluyeron
que stas contribuan a su virulencia (Shieh y col., 1997; ten Have y col., 2001).
Tambin, Oeser y col. (2002), obtuvieron una reduccin en la patognesis del 98%
trabajando con los disruptantes Cppg1 y Cppg2 de Claviceps purpurea. Sin embargo,
estudios realizado en C. carbonum (Scott-Craig y col., 1990) y Cryphonectria
parasitica (Gao y col., 1996), demostraron su no implicacin en virulencia. Y estudios
realizados en F. oxysporum, determinaron que la disrupcin de pg1 o pg5 no provocaba
una disminucin en la patognesis de los mutantes en relacin con la cepa silvestre (Di
Pietro y col., 1998; Garca-Maceira y col., 2001). Mientras que en un estudio realizado
con el mutante A336 de B. cinerea, que es incapaz de colonizar la planta hospedadora,
se observ una elevada produccin de la `protena BcPG1 (Kunz y col., 2006).

Otro aspecto importante de estas protenas es el papel que juegan en la induccin
de respuestas de defensa en la planta, a travs de la produccin de OGAs. Es bien
conocida la capacidad elicitora de los OGAs, ya en 1981, Hahn relacion los
fragmentos de cido galacturnico, con el aumento en la produccin de fitoalexinas en
soja (Hahn y col., 1981). Ridley y col. (2001) analizaron el papel de los OGAs, tanto en
aspectos defensivos como en crecimiento y desarrollo de la planta. En este sentido, las
respuestas de regulacin que los OGAs tienen sobre la planta, estaran relacionadas con
una actividad antagnica a las auxinas (Bellincampi y col., 1996; Mauro y col., 2002;
Ferrari y col., 2008). Por ejemplo, los OGAs inhiben la formacin de las races
adventicias en plantas de tabaco transformadas con el oncogn rolB de Agrobacterium
Introduccin
24
rhizogenes; este oncogn, que se induce por auxinas, es capaz de aumentar la formacin
de races.

En cuanto a su papel en defensa, se ha descrito en planta, como respuesta a
OGAs, desde la acumulacin de fitoalexinas, sntesis de lignina y etileno, aumento del
calcio citoslico, activacin de protenas de unin a GTP y aumento de la produccin de
especies reactivas del oxgeno (ROS) hasta la induccin de protenas inhibidoras de
poligalacturonasas (PGIPs) (DOvidio y col., 2004a) (Figura 8). Todas estas respuestas
son generadas a travs de complejas rutas de sealizacin (Ridley y col., 2001) y son
dependientes del tamao de la molcula elicitora, normalmente entre 10 y 15 residuos
de cido galacturnico (Reymond y col., 1995), de la planta y del tejido vegetal sobre el
que actan (Spiro y col., 1998). Estudios ms recientes, Ferrari y col. (2008), han
mostrado que en plantas de A. thaliana transformadas con la PGII modificada de A.
niger, sin actividad enzimtica, aumentaban los niveles de expresin de genes de
defensa, con un efecto similar al observado en plantas silvestres tras la adicin exgena
de OGAs.

El complejo proteico que forman las endoPGs y las PGIPs ha sido analizado en
numerosos sistemas patgeno-planta. Esta relacin se caracteriza por una alta afinidad,
reversibilidad y especificidad (Kemp y col., 2004). Estas caractersticas plantean la
posibilidad de una coevolucin de endoPGs y PGIPs (Stotz y col., 2000), bien por una
adaptacin de las PGIPs a la variabilidad de las endoPGs, tanto espacial como temporal,
bien por una necesidad de las endoPGs de escapar a la inhibicin de las PGIPs. As,
existe gran variabilidad de inhibidores a la hora de reconocer las endoPGs fngicas (De
Lorenzo y Ferrari, 2002). Por ejemplo, el cambio de un slo aminocido en una endoPG
de Fusarium verticillioides modific el nivel de inhibicin ejercido por una PGIP de
juda sobre esa enzima (Raiola y col., 2008). Analizando las estructuras terciarias de
ambas protenas, se ha comprobado que las endoPGs de plantas poseen un triptfano en
el sitio cataltico que no se encuentra en las de hongos. La insercin de un triptfano en
la endoPG de F. moniliforme, en la posicin correspondiente de las plantas, provoc
que la PGIP-2 de Phaseolus vulgaris fuera incapaz de reconocer esa endoPG. Y, a pesar
de la mutacin, esa endoPG segua siendo funcional pero a niveles mucho menores
(Federici y col., 2001). Este hecho demuestra la capacidad de las endoPGs de plantas
para evitar la inhibicin por sus propias PGIPs.

Introduccin
25



















Figura 8. Representacin esquemtica de la interaccin PG-PGIP, tomado de
(Buchanan y col., 2000).


Por otro lado, el anlisis de la estructura primaria de las pectinasas, ha permitido
determinar que el mecanismo de accin de estas enzimas se lleva a cabo mediante dos
mecanismos, principalmente: retencin e inversin (Davies y Henrissat, 1995).
Estudios posteriores, han demostrado que las endoPGs hidrolizan el sustrato a travs de
un mecanismo de inversin en el carbono anomrico (Biely y col., 1996). Los estudios
realizados con endoPGs de A. niger (van Santen y col., 1999; Armand y col., 2000), F.
moniliforme (Federici y col., 2001) y E. carotovora (Pickersgill y col., 1998), mediante
mutagnesis dirigida o anlisis cristalogrfico de la protena, han permitido determinar
los aminocidos que forman parte del centro cataltico. Estos estudios, junto con anlisis
comparativos de distintas endoPGs desarrollados por Stratilova y col. (1996), han
propuesto cuatro dominios altamente conservados: Asn
178
-X-Asp
180
, Asp
201
-Asp
202
,
Gly
222
-His
223
-Gly
224
y Arg
256
-Ile
257
-Lys
258
. Comparando las secuencias disponibles, en
las bases de datos, para PGs de bacterias, hongos y plantas, van Santen y col. (1999),
determin que slo ocho de estos aminocidos estaran estrictamente conservados, y
dentro de stos, los aminocidos Asp
180
, Asp
201
, Asp
202
e His
223
estaran implicados en
la hidrlisis del sustrato, mientras que los aminocidos Arg
256
y Lys
258
estaran
implicados en la unin al mismo. Stratilova y col. (1996) y Pages y col. (2000) han
mostrado la presencia de la Tyr
291
en 24 PGs analizadas y su importancia en el centro
activo de la enzima. La numeracin de los aminocidos citados corresponde a la
posicin que ocupan en la secuencia de la endoPG de A. niger, PG2.
Introduccin
26

Otro aspecto importante de la estructura primaria de las endoPGs, son las
modificaciones post-traduccionales del extremo amino-terminal, que determinan la
secuencia de la protena madura. De manera general, las endoPGs son sintetizadas como
precursores, presentando una secuencia, de 16 a 21 aminocidos, que constituye el
pptido seal (Bussink y col., 1990, 1991; Parenicov y col., 2000b). No obstante, en
algunas endoPGs, se ha observado la presencia de un prepro-pptido, localizado entre el
pptido seal y la secuencia que codifica para la protena madura (Yan y Liou, 2005).
Otro elemento importante que determina la estructura y funcionalidad de las endoPGs es
el proceso de glicosilacin. El anlisis de los posibles sitios de glicosilacin de la PGA
de A. niger determin su importancia en la interaccin PG-PGIP y, por tanto, en la
patognesis (Woosley y col., 2006).

A pesar de los numerosos estudios de endoPGs fngicas, an existe controversia
sobre el verdadero papel que juegan estas enzimas en la virulencia. La demostracin
directa de que las endoPGs constituiran un factor de virulencia, requiere la aplicacin
de tcnicas de ADN recombinante, como la delecin o sobreexpresin de un nico gen,
y este punto resulta complicado por la presencia de familias multignicas.


5. GENMICA FUNCIONAL


5.1. Concepto

Desde el nacimiento de la biologa molecular, los investigadores han planteado e
intentado resolver los problemas biolgicos estudiando la funcin de genes y productos
gnicos de forma individualizada. Esta aproximacin reduccionista ha demostrado ser
enormemente fructfera y se han llegado a descubrir numerosos principios biolgicos.
Sin embargo, a pesar del considerable xito que ha supuesto la biologa molecular,
muchas preguntas biolgicas fundamentales permanecen sin respuesta. Este hecho se
debe a que la mayora de los productos gnicos actan de forma conjunta y, por tanto,
los procesos biolgicos deben considerarse como redes complejas cuyos componentes
estn interconectados (Ge y col., 2003).

La secuenciacin del primer genoma, el bacterifago X174, abri la era de la
genmica (Sanger y col., 1978). En la actualidad, la genmica est en un momento de
transicin o evolucin, se est pasando del mapeo y secuenciacin de genomas al
estudio de la funcin de los genes. Por esta razn, el anlisis de genomas se divide en
Genmica Estructural (la generacin y anlisis de informacin sobre los genes de un
genoma) y Genmica Funcional (la generacin y anlisis de informacin sobre lo que
hacen los genes). El objetivo de la genmica funcional es conseguir la mayor
informacin posible sobre los genes de la forma ms rpida.
Introduccin
27

A partir del concepto de Genmica han surgido otros trminos que son
equivalentes lingsticos de genmica pero referidos a otros campos de estudio, dentro
de los cuales se incluyen: Protemica, Transcriptmica y Metabolmica.

Protemica es el estudio del proteoma o conjunto de protenas que se expresan
diferencialmente a lo largo de la vida de la clula. Transcriptmica es el estudio del
ARN y de los genes que son transcritos de forma activa. El desarrollo y la
diferenciacin de una clula o un organismo, as como la adaptacin a condiciones
variables, se determina en gran medida por el perfil de expresin gnica. Metabolmica
es el estudio de los metabolitos y de las redes metablicas.

La mayor parte de los proyectos de genmica funcional comienzan por la
obtencin y anlisis de colecciones de Expressed Sequence Tags (ESTs). Estas
colecciones se obtienen a partir de clones de ADNc que se secuencian parcialmente, por
lo que derivan de genes que se expresan en unas condiciones determinadas y a tiempo
concreto. Las ESTs se agrupan en conjuntos de secuencias redundantes (contigs) y no
redundantes (unisecuencias) en los que cada grupo representa un gen putativo nico en
el genoma del organismo (Skinner y col., 2001).

5.2. Genmica funcional de hongos filamentosos

Los hongos filamentosos constituyen la base de muchas aplicaciones
biotecnolgicas: desde el desarrollo y produccin de diferentes frmacos (por ejemplo,
los antibiticos -lactmicos) y enzimas industriales (entre otras muchas, celulasas y
lipasas), hasta su uso como sistemas para la expresin homloga y heterloga de
diferentes productos gnicos. A pesar de la gran importancia de los hongos
filamentosos, los recursos que se destinan a su estudio son muy limitados en
comparacin con el esfuerzo total que se est llevando a cabo en otros campos de la
genmica (Yoder y Turgeon, 2001). En cuanto a Trichoderma, aunque se trata de un
gnero con un gran inters biotecnolgico, su genoma se ha estudiado de forma muy
escasa en comparacin con otros microorganismos.

En los ltimos aos, se han realizado numerosos estudios de ESTs de hongos
filamentosos y oomicetos, incluyendo entre otros Neurospora crassa (Nelson y col.,
1997), Pleurotus ostreatus (Lee y col., 2002), Verticillium dahliae (Neumann y
Dobinson, 2003), Metarhizium anisopliae (Freimoser y col., 2003), Gibberella zeae
(Trail y col., 2003), Aspergillus oryzae (Maeda y col., 2004), Ustilago maydis (Nugent
y col., 2004; Austin y col., 2004), Magnaporthe grisea (Ebbole y col., 2004),
Mycosphaerella graminicola (Keon y col., 2005), P. parasitica (Panabieres y col.,
2005) o Uromyces fabae (Jakupovic y col., 2006).


Introduccin
28
5.3. Genmica funcional de Trichoderma

En cuanto al gnero Trichoderma, hay varios trabajos publicados de genmica.
El primero fue un anlisis de ESTs y microarrays en el que se estudiaba la degradacin
aerobia y anaerobia de la glucosa en T. reesei QM9414 (Chambergo y col., 2002). Se
secuenciaron 2.835 clones de ADNc que correspondan a 1.151 transcritos nicos y el
genoma mitocondrial completo de T. reesei. La base de datos completa de ESTs se
encuentra en la pgina web: http://trichoderma.iq.usp.br/TrEST.hrml.

Foreman y col. (2003) secuenciaron 18.000 ESTs a partir de una nica genoteca
de ADNc, que correspondieron a 5.131 secuencias nicas de T. reesei QM6a. Estos
autores identificaron 12 enzimas implicadas en la degradacin de biomasa y, mediante
un anlisis de microarrays, observaron que estas enzimas estaban reguladas
transcripcionalmente.

Diener y col. (2004) estudiaron, mediante anlisis de ESTs, las rutas de
secrecin y procesamiento de protenas en T. reesei QM6a. Se secuenciaron 21.888
ESTs a partir de dos genotecas diferentes de ADNc, que correspondieron a 7.943
transcritos nicos.

Liu y Yang (2005) identificaron distintos genes implicados en el control
biolgico. Secuenciaron 3.298 ESTs, a partir de una nica genoteca de T. harzianum,
que correspondieron a 1.740 transcritos nicos.

Arvas y col. (2006) identificaron genes que se expresan diferencialmente en
respuesta a determinadas condiciones de estrs en T. reesei Rut-C30. Se secuenciaron
2.047 ESTs a partir de dos genotecas substractivas de ADNc, que correspondieron a 457
secuencias nicas.

Adems de estos trabajos basados en la generacin de ESTs, un proyecto de
genmica estructural realizado por el Joint Genome Institute (JGI, dependiente del
Departamento de Energa de los EE.UU.) ha proporcionado la secuencia completa del
genoma de la cepa QM 9414 de T. reesei (34 Mbp). Toda la informacin relacionada
con los 9.129 genes de este trabajo se encuentra en la pgina web: http://genome.jgi-
psf.org/Trire2/Trire2.home.html (versin 2.0).

En este sentido, Martinez y col. (2008) realizaron un anlisis detallado de un
total de 97 contings del genoma de T. reesei. Mediante una comparacin con otros 13
genomas de hongos, determinaron una baja representacin de genes que codifican
glicosil hidrolasas a pesar de que esta cepa se caracteriza por su habilidadd para
degradar polmeros de plantas.

Introduccin
29
En diciembre de 2007, el JGI liber 31.938 ESTs de calidad del genoma
completo de T. virens Gv29-8 (38.8 Mbp), de las que 6.599 ESTs estn agrupadas en
contigs, con un nmero estimado de 11.643 genes (http://shake.jgi-
psf.org/Trive1/Trive1.home.html) (C. M. Kenerley, comunicacin personal).

Recientemente, en junio de 2008, el JGI termin de secuenciar el genoma de T.
atroviride IMI206040 (36.1 Mbp), con un total de 31.938 ESTs de calidad secuenciadas
de las que 8.051 aparecen agrupadas en contigs, con un nmero estimado de 11.100
genes. El acceso a esta informacin se encuentra en la pgina web (http://shake.jgi-
psf.org/Triat1/Triat1.home.html) protegido por un cdigo de acceso (C.P. Kubicek y C.
M. Kenerley, comunicacin personal). Actualmente, nuestro grupo est colaborando en
la anotacin comparativa de los genomas de T. virens y T. atroviride (M.R. Hermosa y
E. Monte, comunicacin personal).

El proyecto de genmica funcional TrichoEST, consorcio internacional
financiado por la Unin Europea que engloba el presente trabajo, ha tenido como objeto
la identificacin de genes y productos gnicos de Trichoderma spp. con alto valor
biotecnolgico. Se construyeron 26 genotecas de ADNc, utilizando poblaciones de
ARNm obtenidas bajo condiciones que simulaban procesos de biocontrol, estreses
nutritivos e interaccin con planta, a partir de 10 cepas pertenecientes a 8 especies
diferentes de Trichoderma (Rey y col., 2004). Toda la informacin relacionada con este
proyecto se encuentra en la pgina web: http://www. trichoderma.org. De los casi
34.000 clones que se secuenciaron en el proyecto, 8.710 ESTs procedan de 8 genotecas
de ADNc de la cepa T. harzianum T34. Un anlisis in silico de estas ltimas, identific
3.478 transcritos nicos y la abundancia relativa de estas ESTs proporcion una medida
de la expresin gnica. Adems, se identificaron protenas putativas secretadas y se
compararon los datos disponibles de T. harzianum T34 con las colecciones de ESTs de
otras especies de Trichoderma y, a su vez, con las bases de datos de secuencias
genmicas obtenidas de otros hongos, animales y plantas (Vizcano y col., 2006). Del
total de ESTs, 8.160 procedan de 4 genotecas obtenidas a partir de las cepas T.
longibrachiatum T52, T. asperellum T53, T. virens T59 y Trichoderma spp. T78. El
anlisis in silico de estas ESTs revel que el nmero de transcritos nicos era muy
similar en todas las cepas, por ejemplo 1.012 correspondan a T. virens T59 (Vizcano y
col., 2007).









Introduccin
30
6. ESTRATEGIAS PARA EL ESTUDIO DE LA FUNCIN GNICA


6.1. Silenciamiento gnico

Una de las estrategias ms efectivas para determinar la funcin biolgica de una
protena es examinar el fenotipo de organismos que contienen mutaciones en el gen
codificante para la misma. Una va de estudio puede ser aislar mutantes nulos mediante
el escrutinio de una coleccin previamente obtenida por mutagnesis o, si es posible,
mediante la interrupcin del locus de inters utilizando cassettes apropiados,
mostrndose esta ltima aproximacin como la ms til y efectiva. Sin embargo, existen
muchos organismos en los que esta tcnica no representa una herramienta eficaz, ya que
depende directamente de la frecuencia de recombinacin homloga propia de cada
sistema.

Trichoderma representa uno de esos casos en los que la frecuencia de
recombinacin homloga es baja (alrededor del 2% en T. reesei) aunque vara segn la
cepa (Mach y Zeilinger, 1998). Por ello slo se han descrito algunos casos de
interrupciones gnicas con xito en las especies como T. virens, T. atroviride, T. reesei
(Mach y col., 1994; Wilhite y col., 2001; Zeilinger, 2004) y, ms recientemente, en la
cepa T34 de T. harzianum (Rubio, 2007; Rosado y col, 2007; Rubio y col., 2008), con
la que se aborda el estudio del gen Thpg1 en esta Tesis Doctoral.

En T. harzianum, la estrategia de silenciamiento ha permitido asignar funcin a
genes que participan en la ruta de biosntesis de terpenos y, a su vez, relacionarlos con
el biocontrol (Cardoza y col., 2006a; Cardoza y col., 2007). Tambin se han silenciado
genes de respuesta a estrs como Thhog1, que est implicado en la respuesta
hiperosmtica y en la interaccin con hongos fitopatgenos (Delgado-Jarana y col.,
2006).

El silenciamiento gnico mediado por ARN es un mecanismo regulador de la
expresin que suprime, a nivel post-transcripcional, la expresin de un gen por
especificidad de secuencia. Este sistema est descrito en diferentes clases de organismos
eucariotas, hongos como N. crassa (Romano y Macino, 1992), plantas (Napoli y col.,
1990) o animales (Elbashir y col., 2001). Cabe destacar que Andrew Z. Fire y Craig C.
Mello recibieron el Premio Nobel de Fisiologa o Medicina de 2006 por sus trabajos con
siRNA para analizar la regulacin de la expresin gnica en el nematodo
Caenorhabditis elegans (Fire y col., 1998).

El mecanismo comn descrito actualmente, parte del ARN producido por los
transgenes o transposones. Estos ARNs son reconocidos por la maquinaria de
silenciamiento y desencadenan la respuesta. Una ARN-polimerasa dependiente de ARN
es la enzima que reconoce estos ARNs y los convierte en ARNs bicatenarios. stos son
Introduccin
31
procesados por una endonucleasa del tipo RNasa III (Dicer) en una reaccin
dependiente de ATP para generar molculas bicatenarias cortas de ARN, denominadas
ARN de interferencia (siRNA) que contienen tanto la cadena sentido como la
antisentido de la molcula bicatenaria original. Los siRNA, que presentan una longitud
variable segn el organismo, suelen tener entre 21 y 25 nucletidos. Estos ARNs
pequeos se incorporan en un complejo de RNasa multicomponente denominado RNA-
inducing silencing complex (RISC) y sirven como molculas gua que conducen a la
degradacin endonucleoltica del ARNm homlogo (Figura 9) (Agrawal y col., 2003).























Figura 9. Esquema general del proceso de silenciamiento
mediado por siRNA (Dykxhoorn y col., 2003).










Introduccin
32
6.2. Expresin en sistemas homlogos y heterlogos

Otra estrategia para analizar la funcin de los productos gnicos consiste en la
sobreexpresin de los mismos en sistemas homlogos o heterlogos. La sobreexpresin
de genes implicados en el micoparasitismo se ha utilizado como estrategia para
incrementar la capacidad antifngica de numerosas cepas de Trichoderma. Por citar slo
algunos ejemplos, la introduccin de copias adicionales del gen prb1 en T. harzianum,
aument su capacidad antagonista frente a R. solani (Flores y col., 1997). La
sobreexpresin en T. longibrachiatum del gen que codifica para una -1,4-
endoglucanasa increment su capacidad antifngica frente a Pythium ultimum (Migheli
y col., 1998). Y mediante la sobreexpresin constitutiva del gen chit33 en T. harzianum,
se obtuvo un aumento de la actividad antagonista frente a R. solani en ensayos
antifngicos in vitro (Limn y col., 1999). En este sentido, la sobreexpresin del gen
que codifica para la quitinasa CHIT36 de T. asperellum en Pichia pastoris mantuvo su
actividad micoparastica frente a Rhizoctonia solani (Viterbo y col., 2002a). Por otra
parte, transformantes de T. harzianum que sobreexpresan el gen que codifica una heat
shock protein de T. virens (hsp23) mostraron una mayor resistencia a temperaturas
extremas (Montero-Barrientos y col., 2007).

Uno de los sistemas heterlogos con el que se trabaja habitualmente es con
planta. La expresin constitutiva del gen que codifica la quitinasa CHIT42 en plantas de
tabaco y patata confiri resistencia a R. solani, B. cinerea, A. alternata y A. solani
(Lorito y col., 1998). Adems, la expresin de dos genes de T. harzianum, chit33 y
chit42, en plantas de tabaco confiri resistencia a R. solani, a salinidad y a metales
pesados (Dana y col., 2006). Plantas transgnicas de algodn que expresan el gen chit42
de T. virens fueron resistentes al ataque de R. solani y de A. alternata (Chandrakanth y
col., 2003). Otros genes que codifican quitinasas fngicas se han introducido, para
conferir resistencia a hongos patgenos, en plantas como manzano (Bolar y col., 2001),
brcol (Mora y Earle, 2001) o B. juncea (Mondal y col., 2003).

6.3. Tecnologa de microarrays

En el campo de la genmica actual, los microarrays representan una herramienta
til a la hora de estudiar, de manera simultnea, la expresin de miles de genes. El
acceso a colecciones de datos de perfiles de expresin de mutantes, tejidos o
tratamientos, ofrece una herramienta para la identificacin de la funcin de los genes
(Rensink y Buell, 2005). Existen diferentes tipos de microarrays dependiendo del
material de partida con el que se trabaje, protenas, tejidos (TMA), ADN (Comparative
Genomic Hybridization, CGH) o ARN (microarrays de expresin). Las primeras
aproximaciones realizadas con microarrays de Arabidopsis thaliana por Affymettrix,
representaban unos 8.000 genes nicos; en la actualidad, el microarray ATH1 de
Affymetrix, representa unos 24.000 genes nicos de esta especie (Redman y col., 2004).

Introduccin
33
La tecnologa de los microarrays est basada en la sntesis o fijacin de sondas
especficas, probe, que representan los genes, protenas o metabolitos, sobre un sustrato
slido que permitir la hibridacin con la molcula diana, target, cuyo marcaje
depender del tipo de microarray (Rensink y Buell, 2005). Actualmente existen dos
tipos de microarrays de expresin: de ADNc y de oligonucletidos (Schulze y
Downward, 2001). Las ventajas que presentan los microarrays de oligonucletidos con
respecto a los de ADNc, es que tienen una fabricacin rpida y ms robotizada,
presentan una elevada reproducibilidad y especificidad, ya que se utilizan secuencias
cortas y muchas sondas por gen. Por contra, requiere equipamiento ms especializado,
por lo que su coste es elevado, y presenta poca flexibilidad en el diseo experimental.

6.4. Protemica

En la ltima dcada, el uso de la protemica se ha convertido en una herramienta
ms para el estudio de la funcin gnica, tomando como punto de partida el conjunto de
protenas que son producidas por el genoma de un organismo en un momento concreto.
La protemica permite obtener una visin global, de los procesos que ocurren dentro de
la clula, incluyendo variaciones en los niveles de expresin, modificaciones post-
traduccionales, interacciones entre las protenas o su localizacin (Rey y col., 2004).

Las modificaciones que puede sufrir el proteoma de un organismo, pueden ser
visualizadas mediante el uso de electroforesis en dos dimensiones (2D SDS-PAGE). En
los ltimos aos, el uso de esta tcnica ha permitido obtener informacin sobre el perfil
proteico producido en situaciones de patognesis (Lim y Elenitoba-Johnson, 2004). En
este sentido, se han llevado a cabo numerosos estudios relacionados con la interaccin
planta-microorganismo. Por ejemplo, se ha analizado el proteoma de la cepa P1 de T.
atroviride en su interaccin con planta y diferentes hongos fitopatgenos (Marra y col.,
2006) y, el estudio del proteoma de T. harzianum T34 en presencia de diferentes
paredes celulares de hongos, ha permitido la identificacion de una aspartil proteasa
implicada en micoparasitismo (Surez y col., 2005).













































OBJETIVOS







Objetivos
35





Este trabajo se enmarca dentro de un proyecto de genmica funcional del gnero
Trichoderma dirigido a la identificacin de genes con valor biotecnolgico en este
hongo. T. harzianum es conocido por ser un agente de control biolgico. Sus
habilidades como micoparsito estn bien estudiadas y documentadas en numerosos
patosistemas. Sin embargo, todava es escaso el conocimiento que se tiene de su
interaccin con la planta, aunque a nivel emprico se haya demostrado que este hongo es
capaz de estimular el crecimiento de las plantas y aumentar la productividad de
numerosos cultivos. Aunque Trichoderma tiene la capacidad de degradar el material
vegetal, es considerado como un organismo avirulento que induce respuestas de defensa
en la planta. En este sentido, se ha demostrado que la accin de las endoPGs libera
molculas elicitoras que desencadenan estas respuestas. Por tanto, el objetivo general de
este trabajo ha sido el estudio, dentro del sistema pectinoltico, de una
endopoligalacturonasa de T. harzianum y su relacin con la planta. A continuacin se
detallan los objetivos particulares del mismo:

1. Aislamiento y caracterizacin del gen Thpg1 de T. harzianum T34, que codifica
una endopoligalacturonasa y su anlisis funcional mediante silenciamiento
gnico en T. harzianum T34.
2. Anlisis del transcriptoma de A. thaliana en la interaccin con T. harzianum T34
o con el transformante ePG5 silenciado en el gen Thpg1.
3. Obtencin y anlisis de plantas transgnicas de A. thaliana que expresan el gen
Thpg1 de T. harzianum T34.
















































MATERIALES Y MTODOS







Materiales y Mtodos
37





1. ORGANISMOS UTILIZADOS


1.1. Bacterias

E. coli DH5 (Hanahan, 1983). Cepa utilizada en experimentos de transformacin por
choque trmico debido a la alta eficacia que puede conseguirse con ella (hasta 5 x 10
8

transformantes por cada g de ADN). Entre sus caractersticas destaca la de poseer una
delecin en el gen Z del opern lac lo que permite seleccionar por color las clulas
transformadas que contengan plsmidos que complementen dicha delecin, tales como,
pGEM-T

Easy (Promega, Madison, WI, EE.UU.).

E. coli LE392 (Sambrook y Russel, 2001). Cepa susceptible de ser infectada por el
bacterifago lambda y sus derivados. Se utiliz para la amplificacin de genotecas de
ADN realizadas en vectores derivados del fago lambda.

Agrobacterium tumefaciens C58C1 (Deblaere y col., 1985). Cepa utilizada para la
transformacin de plantas silvestres de A. thaliana. Contiene el plsmido binario
desarmado pGV2260 que lleva los genes vir necesarios para la integracin del T-DNA
en el genoma de la planta, y presenta resistencia a la rifampicina.

1.2. Hongos filamentosos

1.2.1. Cepas de Trichoderma

Las cepas de Trichoderma utilizadas en este trabajo se indican en la Tabla 2.

1.2.2. Hongos fitopatgenos

Las cepas de hongos fitopatgenos utilizadas en este trabajo fueron: B. cinerea
cepa 26, aislada de tabaco, y P. ultimum cepa 8 y R. solani cepa 19, aisladas de tomate.
Estos hongos, proporcionados por el. Dr. Matteo Lorito, fueron aislados en el
Dipartamento de Arboricoltura e Patologia Vegetale de la Universidad de Npoles.

1.3. Material vegetal

Se utiliz A. thaliana L. ecotipo Columbia (Col-0) para la expresin heterloga
de genes de Trichoderma utilizando un mtodo de transformacin mediado por A.
Materiales y Mtodos
38
tumefaciens. Este ecotipo forma parte de la coleccin del Arabidopsis Information
Service.

Para la realizacin de estudios de expresin en un sistema de tres componentes
se utilizaron semillas pildoradas de Lycopersicon esculentum var. manitu hibrido
(Ramiro Arnedo S.A., Calahorra, La Rioja).


Tabla 2. Cepas de Trichoderma utilizadas en este trabajo.
Referencia Especie Cepa
a
Fuente
b

Origen
geogrfico
T11 T. atroviride IMI 352941 suelo Francia
T22 Trichoderma spp. ATCC 20847 EE.UU.
T25 T. asperellum IMI 296237 suelo Colombia
T34 T. harzianum CECT 2413 suelo EE.UU.
T52 T. longibrachiatum NBT 52
planta de tratamiento
de agua
Eslovaquia
T59 T. virens NBT 59
suelo de tabaco con
quitosano
Espaa
a
IMI, International Mycological Institute, CABI Bioscience, Egham, Reino Unido.
ATCC, American Type Culture Collection, Manassas, VA, EE.UU.
CECT, Coleccin Espaola de Cultivos Tipo, Burjassot, Valencia, Espaa.
NBT, NewBiotechnic S.A., Sevilla, Espaa.
b
La cepa T22 fue obtenida mediante fusin de protoplastos.


2. VECTORES


2.1. Vectores plasmdicos

- pGEM-T

Easy (Promega) (3015 pb). Plsmido utilizado para la clonacin de

fragmentos de PCR que presenta las siguientes caractersticas: deriva del vector
pGEM

-5Zf(+) digerido con EcoRV y al que se le han aadido dos residuos de timidina
en los extremos 3, esto permite la clonacin de productos de PCR generados por
polimerasas que aaden un nucletido adenina en los extremos 3; contiene un sitio de
clonacin multiple dentro de la regin codificante de la enzima -galactosidasa, lo que
permite identificar los clones recombinantes por el color y por su resistencia a la
ampicilina (Figura 10); posee un origen de replicacin monocatenaria del fago f1.

Materiales y Mtodos
39
- pSIL (Sousa, 2004) (5257 pb). Plsmido utilizado en el silenciamiento de la expresin
gnica del gen Thpg1 de T. harzianum CECT 2413. Se construy mediante la clonacin
sucesiva de diferentes fragmentos en el vector pBluescript SK(+). Contiene el promotor
del gen ta de T. harzianum, un fragmento de 159 pb correspondiente a uno de los
intrones de la secuencia genmica de T. harzianum T34 y el terminador del gen de la
celobiohidrolasa 2 (cbh2) de T. reesei T59 (Figura 10).

- pJL43b1 (Gutirrez y Martn, no publicado) (4488 pb). Plsmido utilizado para la
transformacin de protoplastos de T. harzianum. Contiene el promotor del gen
gliceraldehido 3-P-deshidrogenasa A (gpdA) de Aspergillus nidulans, el terminador del
gen que codifica la citocromo oxidasa 1 (cyc1) de S. cerevisiae y el gen de resistencia a
la fleomicina (ble) de Streptoalloteichus hindustanus (Figura 10).

- pBI121 (Chen, 2003) (14758 pb). Plsmido utilizado para la transformacin de A.
tumefaciens C58C1. Es un vector binario derivado de pBI19 y pBI221. Este plsmido
contiene el gen que codifica la -glucuronidasa (GUS) flanqueado por el promotor 35S
del virus del mosaico de la coliflor (CaMV) y el terminador del gen que codifica la
nopalina sintasa (NOS) de A. tumefaciens. El gen que codifica la neomicina
fosfotransferasa II (NPTII) permite seleccionar los transformantes por su resistencia a la
kanamicina. Esta regin delimitada por el borde derecho (RB) e izquierdo (LB),
constituye el T-DNA que se integrar en el genoma de A. thaliana (Figura 10).

- pGEM-fThpg1 y pGEM-rThpg1 (3464 pb). Vectores derivados de pGEM-T en los
que se subclon un fragmento de 440 pb del gen Thpg1 y su secuencia invertida,
respectivamente. Estos vectores se utilizaron como intermediarios en la construccin del
vector pSIL-Thpg1.

- pSIL-Thpg1 (6139 pb). Este vector se construy a partir del plsmido pSIL mediante
la insercin de dos fragmentos de 440 pb del gen Thpg1 en orientaciones invertidas.
Este vector se utiliz para llevar a cabo el silenciamiento del gen Thpg1 en T.
harzianum T34.

- pJL43b1-Thpg1 (7456 pb). Vector derivado de pJL43b1 en el que se subclon el
fragmento que comprende el promotor del gen ta, las secuencias invertidas del gen
Thpg1 separadas por uno de los intrones de T. harzianum T34 y el terminador del gen
cbh2 de T. reesei. El proceso de construccin del vector se detalla en el apartado 6.1.

- pGEM-Thpg1 (4170 pb). Vector derivado del vector pGEM-T en el que se subclon
el gen Thpg1 de T. harzianum T34. Se utiliz como intermediario en la construccin del
vector pBI121-Thpg1.


Materiales y Mtodos
40
- pBI121-Thpg1 (14011 pb). Vector derivado de pBI121 en el que se sustituy el gen
que codifica la protena GUS por la ORF completa del gen Thpg1 de T. harzianum T34.
Este vector se utiliz en la transformacin de A. thaliana mediada por A. tumefaciens.
El proceso de construccin del vector se detalla en el apartado 6.2.

















Figura 10. Esquema de los vectores plasmdicos utilizados en este trabajo.


2.2. Vectores fgicos

-GEM

-11 (Promega) (43,0 kb). Este vector se utiliz para construir una genoteca de
ADN genmico de T. harzianum T34 (Lora y col., 1995). Los brazos de -GEM-11
(Figura 11) derivan del fago EMBL3, que acepta fragmentos de ADN exgeno de entre
9 y 23 kb. Est formado por tres regiones: brazo derecho (9,2 kb), brazo izquierdo (20,3
kb) y una regin central (13,5 kb), y presenta las siguientes caractersticas:

Un sitio de clonacin mltiple con sitios de reconocimiento para las enzimas
SalI, EcoRI y BamHI, entre otras.

Materiales y Mtodos
41
Los promotores fgicos SP6 y T7 situados uno en cada brazo (SP6, brazo
derecho; T7, brazo izquierdo).
Sitios para SfiI asimtricos flanqueando la regin de clonacin.










Figura 11. Esquema del bacteifago GEM

-11.


3. MEDIOS DE CULTIVO


Salvo que expresamente se indique otro mtodo, los medios se esterilizaron en
autoclave a 120C y 1 atm durante 20 minutos.

3.1. Medios de cultivo para bacterias y bacterifagos

- Medio Luria-Bertani (LB) (Miller, 1972). Se emple como medio general para el
crecimiento de E. coli.
Composicin:
NaCl 10 g
Bactotriptona 10 g
Extracto de levadura 5 g
H
2
O destilada c.s.p. 1 L
Se ajust el pH a 7,5 con NaOH 1 M
Para medio slido se aadieron 15 g de agar por litro.

El medio se suplement con ampicilina (100 g/mL) para la seleccin de
bacterias portadoras de plsmidos con resistencia al antibitico. Para bacterias
portadoras de plsmidos con seleccin por color (-galactosidasa), el medio se
suplement con IPTG (25 M) y X-gal (50 g/mL). Para el crecimiento de bacterias
que van a ser infectadas por bacterifagos, el medio se suplement con maltosa 0,2%
(p/v) y sulfato magnsico 10 mM.


Materiales y Mtodos
42
- Medio NZY (Miller, 1972). Medio empleado para el crecimiento de la cepa de E. coli
LE392 infectada con bacterifagos, y posterior formacin de placas de lisis.
Composicin:
NZ Amina tipo A (Sigma) 10 g
NaCl 5 g
MgSO
4
7H
2
O 2 g
Extracto de levadura 5 g
H
2
O destilada c.s.p. 1 L
Se ajust a pH 7,5 con NaOH
Para medio slido se aadieron 15 g de agar por litro.
Para medio de cobertera se aadieron 7 g de agarosa por litro.

- Medio SM. Medio empleado para el mantenimiento de los bacterifagos.
Composicin:
NaCl 5,8 g
MgSO
4
7H
2
O 2 g
Tris-HCl 1 M, pH 7,5 50 mL
Gelatina al 2% (p/v) 5 mL
H
2
O destilada c.s.p. 1 L

- Medio SOC. Medio empleado para la recuperacin de A. tumefaciens despus de su
transformacin mediante electroporacin y para la preparacin de clulas competentes
de E. coli.
Composicin:
Bacto-triptona 20 g
Extracto de levadura 5 g
NaCl 0,50 g
KCl 0,19 g
H
2
O destilada c.s.p. 1 L
Se ajust el pH a 7,5 y una vez autoclavado y fro se aadieron 2 g de
MgCl
2
.
6H
2
O y glucosa 20 mM filtrados a esterilidad.

3.2. Medios de cultivo para hongos

- CM. Empleado como medio lquido de crecimiento de Trichoderma para la posterior
preparacin de protoplastos.
Composicin:
Extracto de malta 5 g
Extracto de levadura 5 g
Glucosa 5 g
H
2
O destilada c.s.p. 1 L


Materiales y Mtodos
43
- Patata dextrosa agar (PDA). Se emple como medio slido general para el
crecimiento de hongos.
Composicin:
Extracto de patata 20 g
Glucosa 20 g
Agar 20 g
H
2
O destilada c.s.p. 1 L

Este medio se adquiri a Sigma, que lo presenta en forma de polvo, del que se
resuspendieron 39 g en 1 L de agua destilada.

- Caldo de patata dextrosa (Potato Dextrose Broth, PDB). Se emple como medio de
cultivo lquido general para el crecimiento de hongos.
Composicin:
Extracto de patata 20 g
Glucosa 20 g
H
2
O destilada c.s.p. 1 L

Este medio fue adquirido a Sigma, que lo presenta en forma de polvo, del que se
resuspendieron 24 g en 1 L de agua destilada.

- MEA. Se emple como medio slido para el crecimiento de la cepa de B. cinerea
utilizada en este trabajo.
Composicin:
Peptona micolgica 10 g
Extracto de malta 20 g
Agar 15 g
H
2
O destilada c.s.p. 1 L

- Medio Mnimo (MM). Medio lquido de crecimiento de Trichoderma (Penttil y col.,
1987) que se utiliz para estudios de expresin.
Composicin:
KH
2
PO
4
15 g
Glucosa 20 g
Solucin de metales traza (*) 1 mL
Se ajust el pH a 5,5 con KOH 1M
H
2
O destilada c.s.p 1 L

Para los ensayos en medio slido se aadieron 15 g de agar por cada L de medio.




Materiales y Mtodos
44
(*) Solucin de metales traza preparada a una concentracin 1000X:
FeSO
4
.
7H
2
O 5 g/L
MnSO
4
.
H
2
O 1,6 g/L
ZnSO
4
.
H
2
O 1,4 g/L
CoCl
2
2 g/L

Una vez esterilizado en autoclave se aadieron: 20 mL de (NH
4
)
2
SO
4
250
mg/mL (esterilizado en autoclave), 4,1 mL de CaCl
2
1M (esterilizado por filtracin) y
2,4 mL de MgSO
4
1M (esterilizado en autoclave).

Este medio se utiliz en todos los casos para la obtencin de biomasa o de crecimiento (primera fase).
Para realizar los ensayos de expresin (segunda fase), la fuente de carbono y/o nitrgeno vari
dependiendo de las condiciones requeridas en cada caso.

- Medio TSA (Triptic Soy Agar). Este medio se utiliz en la seleccin de trasformantes
de Trichoderma. Se aadieron 30 g/L de triptic soy broth (TSB, Merck) y 15 g/L de
agar tcnico (Difco). Para regenerar los protoplastos se aadi sorbitol 1 M (USB,
Amersham). Este medio se suplement, cuando fue necesario, con fleomicina (200
g/mL) para la seleccin de transformantes.

- Agar-agua (AA). Este medio se emple para los ensayos de interaccin de T.
harzianum T34-tomate-patgeno. Se prepar a una concentracin de agar del 1%.

3.3. Medios de cultivo para plantas

- Medio Murashige y Skoog (MS) (Murashige y Skoog, 1962). Utilizado para la
germinacin de semillas de A. thaliana y de tomate. El medio se suplement, cuando
fue necesario, con kanamicina (50 g/mL) para la seleccin de las plantas
transformadas.
Composicin:
Medio MS bsico 4,9 g
Sacarosa 10 g
MES 500 mg
Agar 8 g
H
2
O destilada c.s.p 1 L

Una vez ajustado el pH a 5,7 con KOH se esteriliz en autoclave.
El medio MS bsico fue adquirido a Duchefa y lleva como componentes:
microelementos, macroelementos y vitaminas.

Para los cultivos de interaccin A. thaliana-Trichoderma (ensayos de microarrays) el medio MS se
prepar sin agar.

Materiales y Mtodos
45
4. CULTIVO DE LOS ORGANISMOS


4.1. Trichoderma

4.1.1. Recogida de esporas

Para la obtencin de esporas, Trichoderma se cultiv en medio PDA a 25-30C
durante 5-7 das, el tiempo suficiente para que la superficie de la placa estuviera
cubierta de esporas. stas se recogieron aadiendo 5 mL de agua destilada estril por
placa y raspando la superficie con una esptula. A continuacin, se filtr la suspensin
de esporas a travs de lana de vidrio para eliminar restos de micelio. Las esporas se
almacenaron a 4C hasta su uso.

En el caso de B. cinerea 26 el proceso fue similar al descrito para Trichoderma.

4.1.2. Cultivo para la obtencin de germnulas

Para la obtencin de germnulas (esporas que slo han desarrollado el tubo
germinativo), se inocularon en medio PDB esporas de Trichoderma a una concentracin
final de 10
6
esporas/mL, y se incubaron a 28C, durante 15 h, en agitacin (150 rpm).
Para recoger las germnulas se centrifug el micelio en condiciones estriles a 4.400
rpm, durante 10 minutos a 4C. Se lav el micelio tres veces con agua estril,
centrifugando cada vez, en las mismas condiciones. Por ltimo, el micelio se
resuspendi en, aproximadamente, 25 mL de agua destilada estril.

4.1.3. Cultivos para la extraccin de ADN

Se utilizaron matraces de 250 mL que contenan 100 mL de medio PDB,
inoculados con esporas de Trichoderma a una concentracin final de 10
6
esporas/mL,
que se incubaron a 28C durante 36-48 h, en agitacin (150 rpm). La biomasa obtenida
se recogi mediante filtracin por vaco a travs de papel de filtro. El micelio se lav
con agua destilada estril, se congel a -80C y se liofiliz durante unas 12 h,
conservndose a -20C hasta su utilizacin.

4.1.4. Cultivos para el anlisis de la expresin gnica

Estos cultivos se hicieron en dos fases. En la primera fase (preinduccin o
produccin de biomasa) se inocularon matraces de 1 L conteniendo 300 mL de MM
(Penttil y col., 1987) con glucosa al 2% (p/v), con esporas de Trichoderma a una
concentracin final de 10
5
esporas/mL. Se incubaron a 28C durante 36-40 h, en
agitacin (150 rpm). Transcurrido este tiempo, los cultivos se filtraron en condiciones
de esterilidad mediante vaco a travs de papel de filtro. Los micelios se lavaron con
Materiales y Mtodos
46
agua destilada estril, y se utilizaron para inocular los medios de induccin (segunda
fase). Estos medios se prepararon a partir del mismo MM (Penttil y col., 1987), en
ausencia de fuente de carbono (glucosa al 0%), y con ciertas modificaciones en las
condiciones nutricionales: presencia de glucosa al 2%, dficit de nitrgeno (usando una
concentracin 100 veces menor de sulfato amnico, 50 mg/L), cido poligalacturnico
(PGA) (Sigma) al 0,1 0,5%, pectina (Sigma) al 0,1 0,5%, planta de tomate al 1%,
paredes celulares de B. cinerea 26, R. solani 19 o P. ultimum 8 al 1%. Los diferentes
medios modificados se cultivaron a 28C y 150 rpm durante un tiempo variable, entre 4
y 24 h.

Para llevar a cabo extracciones de ARN (que se emplean en el anlisis de la expresin gnica), el
micelio obtenido se recogi por filtracin como se ha descrito para las preinducciones en el prrafo
anterior. A continuacin se congel inmediatamente en nitrgeno lquido y se liofiliz durante 12 h,
conservndose a -80C hasta su utilizacin.

Para el estudio de la actividad endopoligalacturonasa se recogieron los sobrenadantes filtrados de los
medios de induccin en todas las condiciones empleadas para realizar los estudios de expresin. Las
muestras se guardaron a -20C hasta su utilizacin.

Plantas de tomate: se utilizaron hojas pulverizadas en un mortero, en presencia
de nitrgeno lquido.

Paredes celulares de hongos: se prepararon segn el mtodo descrito por Fleet
y Phaff (1974) a partir del micelio obtenido tras el crecimiento de B. cinerea 26, R.
solani 19 o P. ultimum 8 en medio lquido PDB durante aproximadamente 7 das, segn
el hongo.

Para la obtencin de las paredes celulares se sigui el siguiente protocolo:

1. Se centrifug el medio con micelio autoclavado a 12000 g durante 10 minutos.
2. Se lav el precipitado dos veces con agua desionizada y se recogi la biomasa
centrifugando de nuevo.
3. Se resuspendi la biomasa en NaCl al 2% y se centrifug en las mismas
condiciones indicadas anteriormente desechando el sobrenadante.
4. Se lav el precipitado tres veces con NaCl al 2% y otras tres veces con agua
desionizada centrifugando cada vez.
5. El precipitado se sec parcialmente prensndolo con papel de filtro.
6. Se congel y liofiliz para eliminar el agua por completo.
7. La biomasa liofilizada se pulveriz en un mortero y se guard a temperatura
ambiente hasta su utilizacin.



Materiales y Mtodos
47
4.1.5. Cultivos para el anlisis de la expresin gnica en un sistema de tres
componentes

Para la obtencin de micelio de la cepa T34 se utiliz un sistema que simulaba
una interaccin T34-planta-patgeno in vivo. Para ello, se utilizaron plntulas de tomate
crecidas durante 15 das en placas de agar-agua (AA). Estas plntulas se infectaron con
una suspensin de B. cinerea 26, o con discos de agar (1 cm
2
) de R. solani 19 o
P.ultimum 8, crecidos previamente en placas de PDA. Despus de 4 das de incubacin
a 28C, se coloc sobre estas placas, un celofn (CM) con micelio de la cepa T34
previamente crecido durante 48 h a 28C en placas de PDA cubiertas con una membrana
de CM estril. Estas placas se inocularon con 100 L de una suspensin de 5.10
5

esporas/mL de la cepa T34. La membrana de CM utilizada permiti separar los
patgenos de la cepa T34 pero permitiendo el paso de micro y macronutrientes (Kullnig
y col., 2000).

4.1.6. Cultivos para la obtencin de protenas intracelulares en un sistema de tres
componentes

Para la obtencin de protenas intracelulares de la cepa T34 se utiliz un sistema
que simulaba una interaccin in vivo, Trichoderma-planta-patgeno. Se utiliz el mismo
sistema empleado para el anlisis de la expresin gnica descrito en el apartado anterior.

4.2. A. thaliana

4.2.1. Desinfeccin de semillas

Las semillas de A. thaliana ecotipo Col-0 se lavaron con una solucin de etanol
al 70% y Triton X-100 al 0,1%. Despus de 20 minutos en un agitador orbital, se retir
el sobrenadante y se aadi una solucin de leja al 2,5 % y Triton X-100 al 0,05%. Las
semillas se agitaron durante 10 minutos, se dejaron precipitar, se retir el sobrenadante,
y se lavaron tres veces con agua destilada estril. Las semillas se estratificaron a 4C
durante 3-5 das en ausencia de luz, como paso previo a su germinacin, con el fin de
sincronizar la germinacin y eliminar la dormicin.

4.2.2. Cultivo en placa

Una vez estratificadas las semillas, se retir el agua, se resuspendieron en una
solucin de agarosa estril al 0,15% y se germinaron en placas de MS durante dos
semanas. Estas placas se incubaron a 21-24C, con un fotoperiodo de 16 h de luz y 8 h
de oscuridad, y una humedad del 70%.



Materiales y Mtodos
48
4.2.3. Cultivo en maceta

Las plntulas de A. thaliana germinadas en placa se pasaron a macetas con una
mezcla de turba (Gramoflor GmbH y Co., Oldenburg, Alemania) y vermiculita en
proporcin 3:1. Las macetas se taparon con papel transparente para mantener una
atmsfera hmeda, y se incubaron durante 4-5 das en las condiciones antes descritas.
Una vez retirado el papel transparente, las plantas se incubaron durante dos meses en las
mismas condiciones, regndose cada tres das. Estas plantas se utilizaron para la
recogida de semillas y de material vegetal.

La mezcla de turba se compone de carbono orgnico al 35% y azufre orgnico al 0,3%, a un pH 6,0.

4.2.4. Cultivo en medio lquido

Para realizar el anlisis del transcriptoma de A. thaliana se prepararon 18
matraces de 10 mL (2 matraces por cada rplica) a los que se aadi 8 mL de medio MS
lquido. Cada matraz se inocul con 10
5
germnulas/mL (segn el protocolo de
obtencin descrito en el apartado 4.1.2) de la cepa T34, del transformante ePG5, o sin
inculo en el control negativo. La raz de A. thaliana se introdujo hasta la roseta en el
medio y sujeta al matraz con Parafilm

. Previamente, la raz se pas varias veces por

agua estril y leja al 50% para desinfectar y eliminar los restos de tierra. El sistema se
incub durante 24 h en agitacin suave a 25C.

4.3. Tomate

4.3.1. Desinfeccin de semillas

De forma previa a la esterilizacin de las semillas, se retir el pildorado por
agitacin en agua. Posteriormente, se realiz la esterilizacin mediante agitacin,
durante 10 minutos, en una solucin de etanol al 70% y descartando el sobrenadante.
Las semillas se lavaron por agitacin, una vez en una solucin de leja al 50% y tres
veces en agua estril, retirando el sobrenadante en cada paso. Las semillas se dejaron
secar y se guardaron en una placa Petri estril a temperatura ambiente hasta su
utilizacin.

4.3.2. Cultivo en tubos

Una vez esterilizadas las semillas, se retir el agua y se germinaron en tubos de
vidrio con MS durante dos semanas. Estos tubos se incubaron a 21-24C, con un
fotoperiodo de 16 h de luz y 8 h de oscuridad, y una humedad del 70%.



Materiales y Mtodos
49
5. Mantenimiento


5.1. Bacterias

Las bacterias se mantuvieron durante cortos periodos de tiempo en placas Petri a
4C selladas con Parafilm

. Para periodos ms largos, se prepararon suspensiones de las

mismas en glicerol al 15% (v/v) o bien en DMSO al 7% (v/v), y se conservaron a -80C.

5.2. Hongos filamentosos

El mantenimiento de las cepas fngicas en el laboratorio se llev a cabo por
resiembras peridicas en placas Petri usando PDA como medio de cultivo. Las placas se
inocularon depositando en el centro cilindros de agar, procedentes de cultivos
anteriores, o con gotas de una suspensin de esporas, y se incubaron a 25-30C. Una
vez que los cultivos haban crecido, las placas se conservaron a 4C selladas con
Parafilm

durante periodos inferiores a un mes. Para preservar la viabilidad de la

coleccin durante periodos ms largos de tiempo, se recogieron las esporas como se
describe en el apartado 4.1.1.1. Posteriormente, se les aadi glicerol hasta una
concentracin final del 20% y se conservaron a -80C.

En el caso de R. solani 19 y P. ultmum 8, se recogieron discos de agar que se mantuvieron en agua
estril y a temperatura ambiente.

5.3. Bacterifagos

Los bacterifagos se mantuvieron a 4C en medio SM con cloroformo al 0,2%
(v/v). Para preservarlos durante largos periodos de tiempo, se conservaron a -80C en
medio SM con DMSO al 7%.

5.4. Plantas

Las semillas de A. thaliana se mantuvieron a temperatura ambiente en tubos,
eppendorf o falcon, agujereados.









Materiales y Mtodos
50
6. CONSTRUCCIN DE LOS VECTORES UTILIZADOS EN ESTE TRABAJO


6.1. Construccin del vector pJL43b1-Thpg1

El vector pJL43b1-Thpg1 se construy a partir del vector pSIL mediante la
insercin de un fragmento de 440 pb del gen Thpg1 de T. harzianum T34, en
orientaciones invertidas (Sousa, 2004). Ambos fragmentos se amplificaron en dos
reacciones de PCR a partir de la ORF del gen Thpg1 con los oligonucletidos pSIL-1 y
pSIL-2 para el fragmento forward, y pSIL-3 y pSIL-4 para el fragmento reverse, que
incluan en su secuencia las dianas para las enzimas SpeI-BamHI y XhoI-HindIII,
respectivamente. Los dos fragmentos amplificados por PCR se subclonaron en dos
pasos sucesivos en el vector pSIL, previamente digerido con las enzimas
correspondientes, SpeI y BamHI para el primer fragmento, y XhoI y HindIII para el
segundo fragmento, dando lugar al plsmido pSIL-Thpg1. Este plsmido se digiri con
SacI, liberando el cassette formado por el promotor del gen ta (ta) de T. harzianum, un
primer fragmento de 440 pb del gen Thpg1, un fragmento de 159 pb correspondiente a
uno de los intrones (I) de la secuencia genmica de T. harzianum T34, un segundo
fragmento de 440 pb del gen Thpg1 en orientacin invertida respecto al primero y el
terminador del gen de la celobiohidrolasa 2 (cbh2) de T. reesei T59. Este cassette se
clon en el plsmido pJL43b1, digerido con la misma enzima de restriccin, dando
lugar al plsmido pJL43b1-Thpg1 con el que se transform T. harzianum T34 (Figura
12).

Los dos fragmentos amplificados con las secuencias dianas fueron subclonados en el vector pGEMT-
Easy dando lugar a los plsmidos pGEM-fThpg1 y pGEM-rThpg1 como paso previo a la construccin del
vector pSIL-Thpg1 para aumentar el porcentaje de xito en el proceso de ligacin de los fragmentos al
vector pSIL.

6.2. Construccin del vector pBI121-Thpg1

El vector pBI121-Thpg1 se construy amplificando la ORF del gen Thpg1 de T.
harzianum T34 utilizando ADN plasmdico como molde y los oligonucletidos pBI-1 y
pBI-2, que portaban sitios de corte para XbaI y StuI, respectivamente. El fragmento
amplificado se subclon en el vector pGEMT-Easy, y ste se digiri con XbaI y StuI,
liberando el gen Thpg1 con un extremo cohesivo y uno romo. Por otro lado, el plsmido
pBI121 se digiri con las enzimas XbaI y EcoICRI, liberando el gen que codifica para la
-glucuronidasa (GUS) y dejando un extremo cohesivo y un extremo romo,
respectivamente. De este modo, la ligacin del gen Thpg1 en el plsmido pBI121
quedaba dirigida de forma correcta (Figura 13).


Materiales y Mtodos
51
Figura 12. Esquema de la construccin del plsmido pJL43b1-Thpg1. Amp: gen de resistencia a
ampicilina; ble: gen de resistencia a fleomicina. Para ms detalles, consultar el texto.











Materiales y Mtodos
52
Figura 13. Esquema de la construccin del plsmido pBI121-Thpg1. Amp: gen de resistencia a
ampicilina; NPTII: gen de resistencia a kanamicina; pNOS: promotor del gen de la nopalina
sintasa, nos; tNOS: terminador del gen nos; CaMV 35S: promotor 35S del virus del mosaico de
la coliflor; LB: Left Border; RB: Right Border. Para ms detalles, consultar el texto.








Materiales y Mtodos
53
7. TRANSFORMACIN DE ORGANISMOS


7.1. Transformacin de bacterias

7.1.1. E. coli

7.1.1.1. Preparacin de clulas competentes

El protocolo utilizado para la preparacin de clulas competentes est basado en
el mtodo de Inoue y col. (1990).

1. Se realiz una siembra en estra en agar LB de E. coli DH5 y se incub a 37C
durante 16 h.
2. De esta placa inicial se inocularon 5 colonias aisladas en un matraz de 2 L con
250 mL de medio SOC y se incub durante 20 h, aproximadamente, a 25C y
200 rpm, hasta alcanzar una D.O. de 0,6 unidades a 600 nm.
3. El cultivo se mantuvo en hielo durante 10 minutos y se centrifug a 5000 x g
durante 10 minutos a 4C.
4. El precipitado se resuspendi en 40 mL de tampn TB fro y se mantuvo en
hielo durante 10 minutos.
5. Se centrifug nuevamente en las mismas condiciones y las clulas se
resuspendieron en 20 mL de tampn TB fro.
6. Se aadieron 1,4 mL de DMSO (concentracin final del 7%) y se mantuvo en
hielo durante 10 minutos.
7. Se prepararon alcuotas, se congelaron rpidamente en nitrgeno lquido y se
almacenaron a -80C.

Tampn TB: PIPES 10 mM; CaCl
2
15 mM; KCl 250 mM. Se ajust el pH a 6,7 con KOH, se aadi
MnCl
2
, se filtr a esterilidad y se conserv a 4C.

7.1.1.2. Transformacin

La transformacin de clulas competentes de E. coli DH5 se realiz mediante
choque trmico, siguiendo el mtodo descrito por Hanahan (1983) y modificado por
Inoue y col. (1990).

1. Las clulas competentes se descongelaron lentamente en hielo.
2. Se incubaron en hielo 90 L de esas clulas competentes con 1-10 L (20-200
ng aproximadamente) del plsmido (individual o de ligacin) con que se quiera
transformar durante 20 minutos.
3. Se pasaron las clulas a un bao a 42C durante 45 segundos.
4. Se incubaron de nuevo en hielo durante 2 minutos.
Materiales y Mtodos
54
5. Se aadi sobre las clulas 1 mL de medio lquido LB y se incub a 37C
durante 1 h.
6. Se tomaron alcuotas del cultivo anterior y se extendieron sobre placas Petri con
medio slido LB. Este medio se suplement con ampicilina (100 g/mL) si el
plsmido era resistente a dicho antibitico. Cuando el plsmido permiti
seleccin por color, el medio LB se suplement tambin con IPTG (25 M) y X-
gal (50 g/mL).
7. Se incubaron las placas en una estufa a 37C hasta la aparicin de colonias (16-
20 h).

7.1.2. A. tumefaciens

7.1.2.1. Preparacin de clulas competentes

1. Se realiz una siembra en estra en agar LB de A. tumefaciens C58C1 y se
incub a 28C durante 48 h.
2. A partir de esta placa inicial se prepar un cultivo saturado en 10 mL de LB
suplementado con rifampicina (0,14 mg/mL), que se incub a 28C durante 2-3
das.
3. Con 1 mL de este cultivo se inocul un matraz de 500 mL con 100 mL de LB y
se incub a 28C durante 20-24 h, hasta obtener una D.O. de 0,5-1,0 unidades a
600 nm.
4. Las clulas se recogieron por centrifugacin a 3000 rpm durante 20 minutos y
4C.
5. El precipitado se lav dos veces con agua ultrapura estril a 4C.
6. Finalmente las clulas se resuspendieron en 4 mL de glicerol al 10% y se
hicieron alcuotas que se mantuvieron a -80C.

7.1.2.2. Transformacin

La transformacin de clulas competentes de A. tumefaciens C58C1 se realiz
mediante electroporacin siguiendo el mtodo de Dower y col. (1988).

1. Las clulas competentes se descongelaron lentamente en hielo. A 30 L de
clulas se aadieron 0,1-0,5 g de plsmido y se mezcl suavemente.
2. La suspensin se aadi a cubetas de electroporacin (Bio-Rad) de 0,1 cm
previamente enfriadas.
3. La electroporacin se llev a cabo en un electroporador (Bio-Rad) en las
siguientes condiciones: 1,2 kV, 1 k y 25 F.
4. Inmediatamente despus del pulso se aadi 1 mL de medio SOC y se incubaron
las clulas a 28C y 200 rpm durante 3 h.
5. Los transformantes se seleccionaron en placas de LB suplementado con
kanamicina (50 g/mL).
Materiales y Mtodos
55
7.2. Transformacin de hongos filamentosos

La transformacin de T. harzianum T34 se realiz mediante protoplastos,
siguiendo el mtodo descrito por Penttil y col. (1987) y optimizado por Cardoza y col.
(2006b). El gen ble se emple como marcador de seleccin de los transformantes.

7.2.1. Preparacin de protoplastos

1. A partir de un stock de esporas en glicerol de T. harzianum T34, se sembraron
placas de PDA y se incubaron a 28C durante 5-6 das. Pasado este tiempo, se
recogieron las esporas (apartado 4.1.1.) y se inocularon 100 mL de medio CM
con aproximadamente 5 x 10
8
esporas totales.
2. Una vez inoculado, el matraz se incub a 28C y 250 rpm durante 13-14 h. En
estas condiciones se consigue que el micelio crezca de forma laxa y con poca
tendencia a la formacin de precipitados.
3. El micelio se filtr a travs de nylon estril de 30 m de dimetro de poro (nytal,
Maissa) y se lav con 100 mL de NaCl al 0,9% (p/v) y con 100 mL de TLA.
Una vez filtrado, se retir el exceso de humedad sin secarlo por completo. A
partir de este momento, se trabaj con 0,5 g de micelio.
4. El micelio se resuspendi en 50 mL de TPA conteniendo DTT 25 mM
(preparado en el momento), y se mantuvo a 30C y 250 rpm durante 2 h.
5. Despus del tratamiento con DTT, los 50 mL se centrifugaron a 3600 x g
durante 10 minutos. Para eliminar los restos de DTT, se lav el precipitado con
50 mL de TPA y se centrifug de nuevo a 3600 x g durante 10 minutos.
6. Se retir el sobrenadante y se resuspendi el precipitado en 20 mL de TPA,
conteniendo enzima ltica a una concentracin final de 5 mg/mL y filtrado a
esterilidad (Lysing Enzymes, Sigma).
7. La preparacin resultante se pas a un matraz y se incub a 30C y 80 rpm
durante aproximadamente 2-3 h, controlando cada hora la formacin de
protoplastos al microscopio.
8. Una vez obtenidos los protoplastos, stos se recogieron por filtracin a travs de
nylon de 30 m de dimetro de poro. Los restos de micelio quedan retenidos y
los protoplastos pasan a travs del nylon, diluyndose posteriormente 1:5 en
solucin ST.
9. La suspensin se centrifug a 3000 x g durante 10 minutos para sedimentar los
protoplastos, y a continuacin se lavaron una vez con solucin ST.
10. Los protoplastos se resuspendieron en, aproximadamente, 450 L de solucin
STC, se pasaron a hielo y se contaron al microscopio en una cmara Thoma. La
concentracin de la solucin se ajust a 10
7
-10
8
protoplastos/mL.
11. Finalmente, se aadi a la solucin de protoplastos 1/10 del volumen de
solucin PTC.


Materiales y Mtodos
56
TLA: tampn fosfato sdico 10 mM; MgSO
4
0,6 M, pH 5,8. Se esteriliz en autoclave.
TPA: tampn fosfato sdico 10 mM; MgSO
4
0,8 M, pH 5,8. Se esteriliz en autoclave.
Solucin ST: Tris-HCl 10 mM, pH 7,5; sorbitol 1 M. Se esteriliz en autoclave.
Solucin STC: Tris-HCl 10 mM, pH 7,5; sorbitol 1 M; CaCl
2
20 mM. Se esteriliz por filtracin.
Solucin PTC: Tris-HCl 10 mM, pH 7,5; CaCl
2
20 mM; PEG 6000 al 60%. Se esteriliz por filtracin.

7.2.2. Transformacin

1. Se mezclaron, en hielo, de 2 a 5 g de ADN con 200 L de la solucin de
protoplastos (conteniendo una concentracin entre 10
7
-10
8
protoplastos/mL).
Los tubos se mantuvieron en hielo durante 20 minutos.
2. Se aadi 1 mL de solucin PTC y los tubos se mantuvieron a temperatura
ambiente durante 20 minutos.
3. Se aadieron 1,2 mL de solucin STC para diluir los protoplastos. Se mezclaron
bien y se sembraron alcuotas de 300 L en 7 mL de agar de cobertura (TSA-
top) sobre placas de medio selectivo (TSA).
4. Las placas se dejaron solidificar unos 5 minutos y se incubaron a 30C hasta que
aparecieron las colonias (5-7 das).

7.3. Transformacin de plantas de A. thaliana

La transformacin de A. thaliana por medio de A. tumefaciens se realiz por el
mtodo de infiltracin in planta (Clough y Bent, 1998).

7.3.1. Transformacin

1. Se prepar un cultivo saturado de A. tumefaciens para inocular 200 mL de medio
LB (3:200) que se incub a 28C durante 24 h.
2. Las clulas se recogieron por centrifugacin (3000 rpm, 15 minutos a 4C) y se
resuspendieron en 400 mL de solucin de infiltracin.
3. Plantas de A. thaliana Col-0 se cultivaron en macetas (6 macetas con 10-15
semillas cada una), en las condiciones descritas en el apartado 4.2.3., durante 6
semanas. Siete das antes de proceder a la transformacin, se podaron las
inflorescencias primarias para estimular la produccin de inflorescencias
secundarias.
4. Las plantas se introdujeron en la solucin de infiltracin, de modo que la parte
area de la planta quedara sumergida en la suspensin celular durante 2 minutos.
5. Despus de la infiltracin, las plantas se mantuvieron en un fitotrn, en las
condiciones mencionadas en el apartado 4.2.3., durante 2-3 das, cubiertas con
plsticos para evitar la prdida de humedad y favorecer su recuperacin.
Materiales y Mtodos
57
7.3.2. Seleccin de semillas transgnicas.

Las plantas infiltradas (T0) se incubaron en un fitotrn hasta la produccin de
semillas. Estas semillas se recolectaron y se secaron a temperatura ambiente durante 2-5
das. Tras esterilizar su superficie, se elimin la dormicin por estratificacin durante 48
h a 4 C y se sembraron en placas con medio MS suplementado con kanamicina (50
g/mL). Para evitar contaminaciones con Agrobacterium, se aadi cefotaxima (250
g/mL). Estas placas se incubaron a 22C, con un fotoperiodo de 16 h de luz y 8 h de
oscuridad, y una humedad del 70%. Las semillas germinadas se dejaron crecer hasta que
emergieron las hojas primarias (10 das). En este momento se pudo diferenciar entre las
semillas resistentes a kanamicina (generacin T1) y las no resistentes (semillas no
transformadas), ya que las primeras eran capaces de germinar y formar plntulas
perfectamente desarrolladas. Tras sucesivas rondas de seleccin en kanamicina, se
obtuvieron las plantas de la tercera generacin (T3) (Figura 14).














Figura 14. Esquema de la obtencin de plantas transgnicas de A.
thaliana. Para ms detalles consultar el texto.








Materiales y Mtodos
58
8. MANIPULACIN DE BACTERIFAGOS


8.1. Preparacin de bacterias para la transduccin

1. Se inocularon 50 mL de LB, conteniendo MgSO
4
10 mM y maltosa al 0,2%, con
1-2 colonias de la cepa E. coli LE392. Este cultivo se incub a 37C y 200 rpm
hasta alcanzar una D.O. a 600 nm de 0,5 a 0,7 unidades.
2. Se recogieron las clulas por centrifugacin a 500 x g durante 15 minutos.
3. Se resuspendieron en la mitad del volumen inicial con MgSO
4
10 mM y se
conservaron a 4C. Las clulas as preparadas son viables durante 1-2 semanas.

8.2. Infeccin de clulas con el bacterifago lambda

1. Se infectaron 200 L de la suspensin de clulas (para placas de 9 cm de
dimetro) o 600 L (para placas de 15 cm de dimetro) con 1-10 L de la
dilucin apropiada de fagos en medio SM.
2. Se incubaron a 37C durante 15 minutos.
3. Se aadieron las clulas infectadas sobre 3 mL (para placas de 9 cm) o 7 mL
(para placas de 15 cm) de medio NZY de cobertera precalentado a 48C, se
mezcl por inversin y se extendi inmediatamente sobre placas con medio
NZY slido.
4. Las placas se incubaron a 37C hasta que aparecieron zonas de lisis (unas 10-12
h).

8.3. Aislamiento de calvas de lisis de fagos en medio slido

1. Se recogi la zona de lisis formada por el fago de inters con la parte trasera de
una pipeta Pasteur estril, y se introdujo en un tubo con 500 L de medio SM y
1 L de cloroformo.
2. Se agit vigorosamente y se mantuvo a 4C durante 2-4 h para permitir la
difusin del fago.

8.4. Amplificacin de fagos en medio slido

1. Se prepar una infeccin con un ttulo de fagos tal que se obtuvieran placas con
zonas de lisis casi confluentes. Se dejaron crecer las clulas tal y como se
describe en el apartado 6.2.
2. Se aadieron 5 mL de medio SM sobre cada placa y se incubaron a 4C con
agitacin suave toda la noche con el fin de permitir la difusin del fago.
3. El medio SM se recogi en un tubo. Se lavaron las placas con 1 mL de medio
SM adicional y se aadi al tubo inicial. Este lisado se puede emplear como
Materiales y Mtodos
59
molde para una PCR de cadena larga. Sin embargo, cuando se pretende extraer
el ADN del fago se contina con los siguientes pasos.
4. Se recogi la cobertura raspando con una esptula y se adicion al lisado. Se
aadi cloroformo hasta una concentracin del 2%, se mezcl y centrifug a
10000 x g durante 10 minutos, a 4C. Se recogi el sobrenadante eliminando as
la agarosa residual.
5. Se procedi a la extraccin del ADN del fago (apartado 9.1.2).


9. EXTRACCIN DE CIDOS NUCLEICOS


9.1. Extraccin de ADN

9.1.1. Extraccin de ADN plasmdico de bacterias

9.1.1.1. Minipreparaciones (boiling minipreps)

Se emple como mtodo de rutina para la obtencin de ADN plasmdico de E.
coli y A. tumefaciens cuando no era necesaria una elevada calidad ni cantidad del
mismo (Sambrook y Russel, 2001).

1. Se inocularon 3 mL de medio LB con una colonia de bacterias suplementado
con ampicilina (100 g/mL).
2. Se incub a 37C y 200 rpm durante 16 h.
3. Se recogieron las clulas contenidas en 700 L del cultivo por centrifugacin a
13000 x g durante 1 minuto. Se descart el sobrenadante.
4. Se aadieron 110 L de tampn STET-L, y se resuspendieron las clulas.
5. Las muestras se hirvieron durante 30 segundos, y posteriormente se
centrifugaron a 13000 x g durante 10 minutos.
6. Se retir el precipitado con un palillo estril impregnado de una solucin de
RNAsa (Ribonucleasa A, Sigma) 10 mg/mL.
7. El ADN plasmdico se precipit aadiendo 100 L de isopropanol. Se mantuvo
a -20C durante al menos 15 minutos.
8. Se centrifug a 13000 x g durante 10 minutos y se desech el sobrenadante.
9. El precipitado se lav con etanol al 70% (v/v) (centrifugando a 13000 x g
durante 5 minutos), se dej secar y, finalmente, se resuspendi el ADN en 20-25
L de agua estril o tampn TE.




Materiales y Mtodos
60
Tampn de lisis STET: Tris-HCl 50 mM, pH 8,0; sacarosa al 8% (p/v); tritn X-100 al 5% (v/v); EDTA
50 mM.
Tampn STET-L: se prepar en el momento de usarlo, aadiendo 10 L de una solucin de lisozima
(Sigma) 10 mg/mL por cada 1400 L de tampn STET.
Tampn TE: Tris-HCl 10 mM, pH 8,0; EDTA 1 mM.

9.1.1.2. Lisis alcalina a pequea escala

Este mtodo se utiliz en el caso de necesitar ADN de mayor calidad (por
ejemplo, para la secuenciacin automtica). Se utiliz el kit comercial Mini Plasmid
Prep UltraClean (MoBio), siguiendo las instrucciones de la casa comercial. Este
mtodo consiste en una lisis alcalina de las clulas seguida de la purificacin del ADN
por afinidad a una resina.

9.1.1.3. Lisis alcalina a gran escala

Este mtodo se utiliz cuando era necesario procesar volmenes de cultivo de E.
coli superiores a 50 mL, para obtener gran cantidad de una preparacin de ADN
plasmdico de alta calidad. Se emple el kit comercial Qiagen Plasmid Midi (Qiagen)
siguiendo las instrucciones del fabricante. Este mtodo consiste en una lisis alcalina de
las clulas, seguida de una purificacin del ADN basada en la afinidad a una resina de
intercambio aninico, en condiciones adecuadas de pH y concentracin salina.

De esta forma se consigui purificar el ADN plasmdico a partir de cultivos de
E. coli de 50-100 mL con un rendimiento aproximado de 400-800 ng/L de ADN en un
volumen final de 500 L.

9.1.2. Extraccin de ADN del bacterifago lambda

Se emple el kit comercial Qiagen Lambda Midi (Qiagen) siguiendo las
instrucciones del fabricante, con algunas pequeas modificaciones, que se detallan a
continuacin. Antes de comenzar se prepararon infecciones con un ttulo de fagos
adecuado tal y como se indica en el apartado 8.4. Se parti del lisado de, al menos, 8
placas (de 9 cm) por fago para llevar a cabo la extraccin. Se parti de un volumen de
lisado de aproximadamente 50 mL siguiendo el protocolo de extraccin para este
volumen. Este mtodo consiste en una lisis alcalina de las clulas, seguida de una
purificacin del ADN basada en la afinidad a una resina de intercambio aninico, en
condiciones adecuadas de pH y concentracin salina.

Una vez aadido el tampn L2, se obtiene un mejor rendimiento si se deja toda la noche.



Materiales y Mtodos
61
9.1.3. Extraccin de ADN genmico de Trichoderma

9.1.3.1. Extraccin a pequea escala

La extraccin de ADN genmico a pequea escala se llev a cabo siguiendo el
mtodo descrito por Paterson y Bridge (1994), que es una modificacin del mtodo de
Raeder y Broda (1985), y se emple para la obtencin de ADN adecuado para
reacciones de PCR.

1. Se pulveriz el micelio liofilizado en un mortero con nitrgeno lquido.
2. Se recogieron aproximadamente 40 mg de micelio pulverizado en un tubo
eppendorf, se aadieron 500 L de tampn de lisis y se homogeneiz utilizando
una punta de pipeta cortada.
3. A continuacin, se aadieron 250 L de fenol saturado con TE y 250 L de CIA
(24:1).
4. Se mezcl cuidadosamente y se centrifug a 13000 x g durante 50 minutos a
4C.
5. La fase acuosa superior se transfiri a un tubo nuevo, se aadieron 10 L de una
solucin 10 mg/mL de RNAsa y se incub a 37C durante 30 minutos, con
objeto de eliminar el ARN.
6. Pasado este tiempo, se aadi un volumen de CIA (24:1). Se mezcl
cuidadosamente y se centrifug a 13000 x g durante 10 minutos a 4C.
7. De nuevo, la fase acuosa superior se transfiri a otro tubo para proceder a la
precipitacin del ADN. Se aadi 1/10 del volumen de acetato sdico 3M pH 5
y 2,5 volmenes de etanol absoluto fro, y se mantuvo a -20C durante al menos
2 h.
8. La muestra se centrifug a 13000 x g durante 10 minutos a 4C y se retir el
sobrenadante.
9. El precipitado se lav con etanol al 70% con objeto de eliminar las sales, y se
centrifug a temperatura ambiente, retirando de nuevo el sobrenadante.
10. Por ltimo, se dej secar el precipitado y se resuspendi en 100 L de tampn
TE.

Tampn de lisis: Tris-HCl 200 mM, pH 8,5; NaCl 250 mM; EDTA 25 mM; SDS al 0,5%.









Materiales y Mtodos
62
9.1.3.2. Extraccin a gran escala

Este protocolo se emple para la obtencin de ADN que posteriormente se us
en hibridaciones tipo Southern.

1. La extraccin se realiz en tubos de 10 mL y se parti de unos 120 mg de
micelio, liofilizado y pulverizado previamente. Despus se aadieron, por este
orden, 2,5 mL de fenol, 2,5 mL de tampn de lisis y 2,5 mL de CIA, y los tubos
se agitaron en un vrtex para homogeneizar bien las muestras.
2. Los tubos se incubaron durante 30 minutos a 50C, agitndolos cada 5 minutos.
A continuacin se centrifugaron a 1900 x g durante 20 minutos, a temperatura
ambiente, y se recogi el sobrenadante, fase acuosa, en tubos limpios.
3. Se hicieron dos extracciones ms con fenol-CIA (1/2 volumen de cada uno) y un
paso final con un volumen de CIA. Los tubos se centrifugaron siempre a 1900 x
g durante 5 minutos y a temperatura ambiente.
4. El ADN se precipit aadiendo 1/10 del volumen de acetato de sodio 3 M pH
7,2 y 2,5 volmenes de etanol absoluto fro. Las muestras se mantuvieron a -
20C durante al menos 2 h.
5. Posteriormente se centrifugaron a 1900 x g durante 20 minutos a 4C, y se retir
el sobrenadante.
6. El precipitado se lav con etanol al 70%, se centrifug a temperatura ambiente y
se retir, de nuevo, el sobrenadante.
7. Finalmente, se dej secar el precipitado y se resuspendi en 500 L de tampn
TE.

Tampn de lisis: Tris-HCl 200 mM, pH 8,0; EDTA 100 mM; SDS al 1 %. El SDS se aadi justo antes
de comenzar la extraccin.

9.1.4. Extraccin de ADN genmico de A. thaliana

9.1.4.1. Extraccin rpida

La extraccin de ADN genmico a pequea escala se llev a cabo siguiendo el
mtodo descrito por Doyle (1991) con pequeas modificaciones, y se emple para la
obtencin de ADN adecuado para reacciones de PCR.

1. Se parti de 100 mg de tejido vegetal fresco, que fue congelado en nitrgeno
lquido y homogeneizado con la ayuda de una esptula.
2. Se aadi 1 mL de tampn de lisis y se mantuvo en un bao a 65C durante 20
minutos.
3. Se centrifug a 11000 x g durante 5 minutos y se recogi el sobrenadante en un
tubo de 2 mL limpio.
4. Se aadi un volumen equivalente de CIA y se centrifug de nuevo.
Materiales y Mtodos
63
5. La fase acuosa se recogi en un tubo nuevo y se aadieron 0,5 volmenes de
NaCl 0,5 M y 1,5 volmenes de etanol absoluto fro. Se mezcl cuidadosamente
y se centrifug a 11000 x g durante 5 minutos.
6. Se retir el sobrenadante y se lav con 1 mL de etanol al 70%. Se centrifug de
nuevo, se dej secar el precipitado al aire y se resuspendi en 50 L de agua
ultrapura estril.

Tampn de lisis: EDTA 20 mM; Tris-ClH pH 8 100 mM; NaCl 1,4 M; CTAB 2%; Na
2
SO
3
1%. Despus
de esterilizado en autoclave se aadi -mercaptoetanol al 0,2%.

9.1.4.2. Extraccin a gran escala

Este protocolo se utiliz para la extraccin de grandes cantidades de ADN que
posteriormente se usaron en hibridaciones tipo Southern. Se utiliz el kit comercial
DNeasy Plant Mini (Qiagen) siguiendo las instrucciones de la casa comercial.

9.2. Extraccin de ARN

Con el fin de reducir el riesgo de degradacin de cidos ribonucleicos por la
actuacin de RNAsas, todas las soluciones se prepararon con agua tratada con
dietilpirocarbonato (DEPC, Sigma) al 0,1% (v/v), durante 12 h, y posteriormente
autoclavada. Adems se emple material de vidrio esterilizado por calor seco, lotes
nuevos de puntas y tubos de plstico estriles.

9.2.1. Mtodo del TRI Reagent


Para llevar a cabo la extraccin de ARN total se utiliz el mtodo del TRI
Reagent

(Molecular Research Center), siguiendo las instrucciones del fabricante. Se

parti de aproximadamente 30 mg de micelio de Trichoderma o 100 mg de tejido
vegetal fresco de A. thaliana o tomate, liofilizados y pulverizados en mortero en
presencia de nitrgeno lquido.

9.2.2. ARN para microarrays

Para la obtencin de ARN de A. thaliana en los ensayos de microarrays se
utiliz el kit comercial "RNeasy Plant Mini" (Qiagen) siguiendo las instrucciones de la
casa comercial.






Materiales y Mtodos
64
10. MANIPULACIN DE CIDOS NUCLEICOS


10.1. Cuantificacin y calidad de los cidos nucleicos

10.1.1. En ensayos generales

La cantidad de cidos nucleicos, en las preparaciones, se determin
espectrofotomtricamente en un equipo GeneQuant
TM
pro RNA/DNA Calculator
(Amersham). El ADN se cuantific midiendo la densidad ptica a una longitud de onda
de 260 nm, considerando que una unidad de densidad ptica equivala a una
concentracin de ADN de 50 g/mL. El ARN se cuantific midiendo la densidad ptica
a la misma longitud de onda, considerando que una unidad de densidad ptica
corresponda a una concentracin de ARN de 40 g/mL.

La calidad de las preparaciones as como la bondad de las cuantificaciones
realizadas, se comprobaron siempre mediante electroforesis en geles de agarosa usando
marcadores de ADN de concentracin conocida.

10.1.2. En microarrays

El anlisis de las muestras de ARN total de A. thaliana se llev a cabo en un
equipo Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, EE.UU.),
siguiendo las instrucciones del fabricante. El sistema est basado en una electroforesis
convencional pero desarrollada sobre un chip. Las molculas fluorescentes (Cy-5) son
intercaladas entre las molculas de ARN que migran en funcin de su tamao. La seal
fluorescente emitida es transformada en bandas (similares a las obtenidas en un gel de
agarosa) y picos (electroferograma). En el electroferograma se determina el rea
obtenida para los picos que se corresponden con el ARN 18S y 28S. Con ayuda de un
marcador, con una relacin concentracin/rea conocida, se extrapolan los resultados de
rea obtenidos para las muestras.

10.2. Manipulacin enzimtica de cidos nucleicos

10.2.1. Tratamiento enzimtico de ADN

10.2.1.1. Digestin

Las enzimas de restriccin se usaron siguiendo las recomendaciones de la casa
comercial (Roche Applied Science, Basilea, Suiza). Cada una de ellas tiene unas
condiciones ptimas de digestin en cuanto a concentracin de sales, temperatura y
tiempo de incubacin. Como norma general, el volumen de la enzima no debe superar
1/10 del volumen total de digestin debido a la alta concentracin en glicerol de las
Materiales y Mtodos
65
soluciones de almacenamiento, condiciones que incluso podran inhibir su propia
actividad. Asimismo, es conveniente que el ADN est lo suficientemente diluido y
limpio con el fin de no alterar las condiciones de reaccin.

1. Se mezclaron en un tubo: 1/10 del volumen total de digestin de tampn de
digestin (10X), la cantidad adecuada de ADN resuspendido en agua o en
tampn TE, las unidades que se consideren necesarias de enzima y agua
destilada estril hasta completar el volumen de digestin.
2. La mezcla se incub a la temperatura adecuada (normalmente 37C) durante 3-7
h.
3. En el caso de digestiones simultneas con dos enzimas, el tampn utilizado fue
aquel en el que ambas enzimas presentaban la mxima actividad. Si las enzimas
no eran compatibles, la digestin se llev a cabo en pasos separados.

10.2.1.2. Generacin de extremos romos

El rellenado de extremos 5 prominentes originados por cortes con enzimas de
restriccin se realiz usando el fragmento Klenow de la ADN polimerasa (Fermentas).

1. Se resuspendi el ADN en 13 L de agua y se aadieron 2 L de tampn
Klenow 10X.
2. Se aadi 1L de dNTPs 10 mM y 1 unidad del fragmento Klenow.
3. La mezcla se incub a 37C durante 10 minutos y la reaccin se par calentando
a 70C durante 10 minutos.

Tampn Klenow 10X: Tris-HCl 500 mM pH 8; MgCl
2
50 mM; DTT 10 mM.

10.2.1.3. Defosforilacin de plsmidos

Las reacciones de defosforilacin se realizaron empleando la fosfatasa alcalina
Shrimp (Roche). La mezcla de reaccin se prepar en un volumen final de 10 L
conteniendo 1 L de tampn de fosfatasa alcalina 10x, proporcionado con la enzima, 50
ng de ADN cortado y 1 U de fosfatasa alcalina. Se incub a 37C durante 10 minutos, y
posteriormente la reaccin se detuvo calentando a 65C durante 15 minutos.

Tampn fosfatasa alcalina Roche 10X: Tris-HCl 500 mM; MgCl
2
50 mM; pH 8,5.

10.2.1.4. Ligacin

Las reacciones de ligacin se llevaron a cabo con la enzima ligasa del fago T4
(Roche). La mezcla de reaccin se prepar en un volumen final de 10 L conteniendo 1
L de tampn de ligasa 10X, proporcionado con la enzima, 10-40 ng de ADN vector,
una cantidad equimolar de ADN inserto y 1 U de ligasa T4. La ligacin se incub
Materiales y Mtodos
66
durante 12 h a 4C para los fragmentos con extremos cohesivos y a 16C para los
fragmentos con extremos romos.

Tampn de ligacin Roche 10X: Tris-HCl 660 mM, pH 7,5; MgCl
2
50 mM; DTT 50 mM; ATP 10 mM.

10.3. Reaccin en cadena de la polimerasa (PCR)

10.3.1. Reaccin clsica

Las reacciones de PCR convencionales se realizaron empleando Taq polimerasa
(Biotools). La mezcla de reaccin se prepar en un volumen final de 50 L conteniendo
el ADN molde, 5 L de tampn de PCR 10X, proporcionado con la enzima, 2 mM de
MgCl
2
, 400 M de dNTPs, 1 M de cada oligonucletido y 2,5 U de polimerasa.

Las condiciones de amplificacin consistieron en un ciclo inicial de
desnaturalizacin a 94C durante 5 minutos, seguido de 35 ciclos que incluan: 30
segundos a 94C (desnaturalizacin), 30 segundos a la temperatura establecida
empricamente para cada par de oligonucletidos (hibridacin), y, finalmente, un tiempo
aproximado de 1 minuto por cada kilobase a amplificar a 72C (extensin). Tras esos 35
ciclos, la amplificacin se complet con una extensin final a 72C durante 7 minutos.

10.3.2. Reaccin de cadena larga

La amplificacin de fragmentos largos de ADN (mayores de 2 kb) se llev a
cabo con el sistema Expand Long Template PCR System (Roche), siguiendo las
recomendaciones del fabricante. Este sistema contiene una mezcla de una Taq ADN
Polimerasa termoestable y Tgo ADN polimerasa, con actividad correctora. Adems, el
sistema contiene tres tampones de reaccin, con diferentes cantidades de MgCl
2
, que se
usaron en funcin del tamao del ADN que se deseaba amplificar. La temperatura
ptima de extensin, en este caso, fue de 68C. Estas reacciones se llevaron a cabo en
dos pasos: 10 ciclos normales y 20 ciclos en los que se iba aumentando el tiempo de
elongacin en 20 segundos en cada ciclo.

10.3.3. Reaccin con polimerasas de alta fidelidad

Para reacciones de amplificacin que requeran una alta fidelidad se emple Pfu
polimerasa (Fermentas), siguiendo las recomendaciones de la casa comercial.






Materiales y Mtodos
67
10.3.4. RT-PCR

Para la sntesis y purificacin del ADNc utilizado en los ensayos con
microarrays, se emple el kit comercial "One-Cycle cDNA Synthesis" (Affymetrix,
Santa Clara, CA, EE.UU.), siguiendo las instrucciones del fabricante. La cantidad de
ARN de partida fue de entre 1 y 15 g.

Para la sntesis y purificacin del ADNc utilizado en otros ensayos, se emple el
kit comercial SuperScript II RNase H-Reverse Transcriptase (Invitrogen), siguiendo las
instrucciones de la casa comercial.

10.3.5. PCR a tiempo real (Real time-PCR)

Las reacciones de retrotranscripcin de ARN total de T. harzianum T34 se
llevaron a cabo mediante la enzima TaKaRa Ex Taq HS (Takara Bio, Inc., Japn) y
utilizando el sistema Smart Cycler (Cepheid, Sunnyvale, CA, EE.UU.). El principio
de esta tcnica consiste en la deteccin de los productos de PCR mediante la deteccin
de la molcula SYBR Green I que emite fluorescencia al unirse a las molculas de ADN
de doble cadena durante la amplificacin. La posterior medida de la intensidad de la
fluorescencia emitida nos permite determinar la cantidad de producto de PCR
amplificado para esa muestra.

La mezcla de reaccin se llev a cabo en un volumen final de 50 L a la
concentracin final que se indica:

19 l H
2
O desionizada
25 l SYBR Premix Ex Taq
TM
, Takara
1 l oligo forward (0.2 M)
1 l oligo reverse (0.2 M)
4 l ADNc (9 ng) como molde en la reaccin

Las condiciones de amplificacin consistieron en un ciclo inicial de
desnaturalizacin a 95C durante 10 minutos, seguido de 40 ciclos que incluan: 15
segundos a 95C (desnaturalizacin), 30 segundos a la temperatura establecida
empricamente para cada par de oligonucletidos (anillamiento), y finalmente, 50
segundos a 72C (extensin). Se realiz una medida continua de la fluorescencia
emitida en un rango de 60-95C aumentando la temperatura 0,2C por segundo.
Finalmente las muestras se mantuvieron a 4C.





Materiales y Mtodos
68
Se determinaron los crossin points (CP) para cada transcrito como modelo
matemtico. Se define CP como el punto en el que el incremento de la fluorescencia se
encuentra por encima del fondo (Pfaffl, 2001). La eficacia de la Real-time PCR fue
calculada segn el protocolo descrito anteriormente (Cardoza y col., 2007; Pfaffl, 2001).
El nivel (ratio) de expresin relativa de Thpg1 fue expresado en funcin del valor
obtenido para el gen control de la -actina, siguiendo la siguiente ecuacin (Pfaffl,
2001):

CP
target
(control-muestra)
(E
target
)
ratio =
CP
ref
(control-muestra)
(E
ref
)


E
target
representa la eficacia de la Real-time PCR para el transcrito del gen de inters. E
ref

representa la eficacia de la Real-time PCR para el transcrito del gen de la -actina.
CP
target
representa la desviacin de CP del control frente a la muestra. CP
target

representa la desviacin de CP del control frente a la -actina.

Las condiciones para la PCR se optimizaron ante un gradiente de temperaturas.

10.3.6. Oligonucletidos empleados en este trabajo

Los oligonucletidos utilizados en este trabajo fueron suministrados por las
casas comerciales Isogen Life Science o Thermo, y se recogen en la Tabla 3.

















Materiales y Mtodos
69
Tabla 3. Oligonucletidos usados en este trabajo.
Nombre Secuencia Utilidad
universal GTTGTAAAACGACGGCCAGT secuenciacin extremos plsmidos
reverso AGGAAACAGCTATGACCATG secuenciacin extremos plsmidos
T7 GTAATACGACTCACTATAGGGG secuenciacin extremos plsmidos
SP6 ATTTAGGTGACACTATAGAATAC secuenciacin extremos plsmidos
18S-u CCGCGAAACTGCGAATGGC obtencin sonda ARNr 18S
18S-r CTTGTTACGACTTTTACTTCCTC obtencin sonda ARNr 18S
act-1 ATCGGTATGGGTCAGAAGGA obtencin sonda -actina
act-2 ATGTCAACACGAGCAATGG obtencin sonda -actina
10663-1 CTCGATCTTAGTGACTTGAATG secuenciacin Thpg1
10663-2 GTTCCGTAGCCGACCACTATGG secuenciacin Thpg1
10663-3 GATGTTCCTCACCAGACCG secuenciacin Thpg1
10663-4 GCCTGATCCCCATTGTCAAG secuenciacin Thpg1
10663-5 CAATGGACTTACCATCACTGG secuenciacin Thpg1
endop-1 CATGACCAAACTATCCCTTCTC obtencin sondasThpg1
endop-2 CTTAACAAGTAGCAACACTTGG obtencin sondasThpg1
endop-3 CCTCTTCATCCATCACCAACC obtencin sondasThpg1
endop-4 GCCCGACAGAGTAATACCTG obtencin sondasThpg1
endop-5 CTTTGGCTTCGTCTTGCCACC obtencin sondasThpg1
endop-6 CACGGGATATGGTATTCTTATTG
pSIL-1 ACTAGTCCCCTTCATCCATCAC obtencin sondasThpg1 (sitio corte SpeI)
pSIL-2 GGATCCGCCCGACAGAGTAGTA
obtencin sondasThpg1 (sitio corte
BamHI)
pSIL-3 CTCGAGCCCCTTCATCCATCA obtencin sondasThpg1 (sitio corte XhoI)
pSIL-4 AAGCTTGCCCGACAGAGTAGT
obtencin sondasThpg1 (sitio corte
HindIII)
Pta-p GATGCACTGCAGTCCACATTG
comprobacin construccin pJL43b1-
Thpg1
INT-F GTGCTAATCGTGTTATGCACAG
comprobacin construccin pJL43b1-
Thpg1
INT-R CTGTGCATAACACGATTAGCAC
comprobacin construccin pJL43b1-
Thpg1
Tcbh2 GAGCTCAACCCAAAGGAGGG
comprobacin construccin pJL43b1-
Thpg1
pBI-1
TCTAGAATGACCAAACTATCCCTTC
TC
obtencin sondas Thpg1 (sitio corte XbaI)
pBI-2
AGGCCTTTAACAAGTAGCAACACTT
GG
obtencin sondas Thpg1 (sitio corte StuI)
pBI-sen CAGAAGACCAAAGGGCAATT
comprobacin construccin pBI121-
Thpg1


Materiales y Mtodos
70
10.4. Electroforesis de cidos nucleicos

10.4.1. Electroforesis de ADN

Los fragmentos de ADN se separaron segn su tamao mediante electroforesis
en geles de agarosa a una concentracin variable del 0,8-1,2 % (p/v), dependiendo del
tamao del ADN que se deseaba separar.

1. Se aadi la cantidad adecuada de agarosa al volumen necesario de tampn TAE
1X y se fundi por ebullicin en un microondas.
2. Se dej enfriar hasta unos 55-60C. En este punto, se aadi bromuro de etidio
hasta una concentracin final aproximada de 1 g/mL.
3. Se verti el gel en la bandeja de electroforesis y se dej que solidificara.
4. Se prepararon las muestras aadiendo tampn de carga 6X.
5. Se llev a cabo la electroforesis en tampn TAE 1X aplicando un voltaje
aproximado de 5 V por cm de longitud de la cubeta, incluyendo marcadores de
ADN de pesos moleculares conocidos.
6. Se visualizaron las bandas mediante iluminacin con luz ultravioleta, y se
fotografi el gel si proceda.

Tampn TAE 50X: Tris-acetato 2 M, pH 8,0; EDTA 50 mM. Se pesaron 242 g de Tris, se aadieron
57,1 mL de cido actico glacial y 100 mL de EDTA 0,5 M pH 8,0.
Tampn de carga 6X: Sacarosa al 40% (p/v); azul de bromofenol al 0,25% (p/v); xileno cianol FF al
0,25% (p/v).

10.4.2. Electroforesis de ARN

Para las electroforesis de muestras de ARN los tampones se prepararon en agua
tratada con DEPC. El resto del material necesario (cubetas, peines, bandejas) se
mantuvo en NaOH 0,2 M durante, al menos, 30 minutos, y posteriormente se lav con
agua destilada tratada con DEPC.

10.4.2.1. En condiciones no desnaturalizantes (geles de agarosa)

Para comprobar la calidad de las extracciones de ARN, se hizo una electroforesis
en un gel de agarosa al 1%, tal y como se indica en el apartado anterior para las
muestras de ADN. Se consider que el ARN extrado era de calidad cuando pudieron
apreciarse, clara y ntidamente, las bandas correspondientes a los ARN ribosmicos 18
y 28S.




Materiales y Mtodos
71
10.4.2.2. En condiciones desnaturalizantes (geles de agarosa-formaldehido)

En este tipo de geles de agarosa se aadi formaldehido como agente
desnaturalizante para evitar la formacin de estructuras secundarias en el ARN. Se
emple en los experimentos de hibridacin tipo Northern. El protocolo seguido fue el
siguiente:

1. Para un gel de 300 mL se aadieron 3 g de agarosa a 252,5 mL de agua destilada
tratada con DEPC. Se calent en un microondas hasta que la agarosa se disolvi
por completo. Se dej enfriar hasta 55C y, seguidamente, se aadieron 30 mL
de tampn MOPS 10X y 17,5 mL de formaldehido al 37%. Esta mezcla se volc
sobre una bandeja de electroforesis y se dej solidificar.
2. El gel, sin las muestras, se corri a 3 V por cm de longitud de la cubeta en
tampn MOPS 1X, mientras se completaba la preparacin de las mismas. El
objetivo de este paso fue calentar la cubeta y el tampn.
3. Se prepararon las muestras:
- ARN: 20-40 g en un volumen mximo de 6,5 L.
- MOPS 10X: 3 L.
- Formaldehido al 37%: 5,5 L.
- Formamida al 100%: 15 L.
- Agua tratada con DEPC c.s.p. 30 L.
4. Se calentaron las muestras a 65C durante 15 minutos e inmediatamente se
enfriaron en hielo durante 3-5 minutos. A continuacin se aadieron 5 L de
tampn de carga 6X.
5. Finalmente, las muestras se cargaron en el gel y se aplic un voltaje aproximado
de 3 V por cm de longitud de la cubeta durante 4-5 h.

MOPS 10X: cido 3-(N-morfolino)-propano-sulfnico (MOPS) 0,2 M; acetato sdico 0,05 M; EDTA
0,01 M. Se ajust a pH 7,0 con NaOH y se esteriliz por filtracin. Esta solucin se debe mantener
protegida de la luz.

10.5. Purificacin de fragmentos de ADN a partir de geles de agarosa

Los fragmentos de ADN de inters se cortaron del gel de agarosa con ayuda de
un bistur y se purificaron con el kit Geneclean

II (Qbio Gene) siguiendo las

instrucciones del fabricante.

10.6. Secuenciacin de ADN

La secuenciacin de ADN se realiz siguiendo las instrucciones del Servicio de
Secuenciacin de la Universidad de Salamanca, utilizando 3 pmoles del oligonucletido
de inters por reaccin. Se usaron 400-600 ng de ADN plasmdico (en un volumen de 5
L de agua destilada estril) extrado de E. coli, tal y como se indica en el apartado
Materiales y Mtodos
72
9.1.1.2. La secuenciacin directa de productos de PCR se realiz a partir de 100 ng de
ADN por kb de longitud del producto; y la secuenciacin de ADN del fago lambda a
partir de 750 ng de molde, siempre en un volumen final de 5 L.

10.7. Primer walking

Para obtener la secuencia completa del gen Thpg1 estudiado en este trabajo se
utiliz la tcnica conocida como primer walking o secuenciacin con oligonucletidos
especficos diseados a partir de la secuencia conocida.


11. EXPERIMENTOS DE HIBRIDACIN EN MEMBRANA


11.1. Transferencia de cidos nucleicos a membranas

11.1.1. Transferencia de ADN de geles de agarosa (Southern blot)

Se realizaron digestiones de aproximadamente 10 g de ADN genmico tal
como se describe en el apartado 10.2.1.1. Los fragmentos originados se separaron por
electroforesis en gel de agarosa al 0,8%, conteniendo bromuro de etidio, aplicando un
voltaje bajo (2 V por cm de longitud de la cubeta). Una vez fotografiado, el gel fue
sometido al siguiente protocolo:

1. Se trat con HCl 0,25 N durante 15 minutos en agitacin moderada, con el fin de
fragmentar las molculas de ADN mayores de 10 kb. A continuacin, se lav
varias veces con agua destilada.
2. Se sumergi el gel en la solucin de desnaturalizacin durante 45 minutos,
tambin en agitacin moderada. Se lav posteriormente con agua destilada.
3. Se sumergi en la solucin de neutralizacin durante 45 minutos, tambin en
agitacin.
4. Posteriormente, el gel se equilibr en tampn SSC 10X durante 45 minutos, en
agitacin.
5. La transferencia se llev a cabo por capilaridad desde el gel a una membrana de
nylon, cargada positivamente, Hybond

N
+
(Amersham). Para ello, el gel se
situ sobre un puente de papel de filtro Whatman

3MM que est en contacto

con un tanque de tampn SSC 10X, y saturado con el mismo. Sobre el gel se
colocaron sucesivamente, la membrana de nylon del tamao del gel, 2 papeles
Whatman 3MM, una pila de papel absorbente y, finalmente, un peso
aproximado de 0,5 kg. Es importante la eliminacin de las burbujas de aire que
se puedan formar al superponer las distintas capas. La transferencia por
capilaridad as dispuesta se mantuvo, al menos, durante 12 h.
Materiales y Mtodos
73
6. Tras la transferencia, la membrana se pas a SSC 2X durante 2 minutos. Se dej
secar al aire y se irradi con luz UV en un Stratalinker (Stratagene) aplicando
120 mJ durante 30 segundos para fijar los cidos nucleicos a la misma.

Solucin de desnaturalizacin: NaOH 0,5 M; NaCl 1,5 M.
Solucin de neutralizacin: NaCl 3 M; Tris-HCl 0,5 M, pH 7,5.
SSC 20X: NaCl 3 M; citrato sdico 0,3 M. Se ajusta a pH 7,0 con NaOH.

11.1.2. Transferencia de ARN de geles de agarosa (Northern blot)

El ARN se someti a electroforesis en gel de agarosa en condiciones
desnaturalizantes (apartado 10.4.2.2). Una vez finalizada la electroforesis, el gel se lav
en agua durante 5-10 minutos para eliminar parte del formaldehido, y seguidamente se
equilibr en tampn SSC 10X durante 30 minutos, en agitacin moderada. La
transferencia y la posterior fijacin del ARN se realizaron como se describe en el
apartado 11.1.1.

11.1.3. Transferencia de ADN de bacterifagos (escrutinios)

Para transferir el ADN de los fagos de placas de lisis a una membrana:

1. Se deposit una membrana de nylon, previamente cortada con el tamao
adecuado, directamente sobre los fagos contenidos en la placa Petri. La
membrana se perfor asimtricamente en los bordes con una aguja para poder
orientarla a la hora de recuperar de la placa el clon o clones de inters, y se
mantuvo as durante 5 minutos. Si fue necesario hacer una rplica, la segunda
membrana se mantuvo durante 10 minutos.
2. La membrana se retir cuidadosamente de la placa (que se conserv a 4C) y se
trat con solucin de desnaturalizacin, seguidamente con solucin de
neutralizacin y, finalmente, con tampn SSC 2X. Estos pasos se realizaron
depositando la membrana (con la cara que estuvo en contacto con los fagos
hacia arriba) sobre papel de filtro empapado con la solucin correspondiente,
durante 5 minutos.
3. La membrana se dej secar al aire, y se fij en un Stratalinker tal y como se
indica en el apartado 11.1.1.

11.2. Marcaje de las sondas

11.2.1. Marcaje radiactivo de ADN

Para este tipo de marcaje se usaron dCTPs marcados con
32
P. El mtodo seguido
para incorporarlos a la sonda fue el de cebadores al azar (random priming), utilizando el
Materiales y Mtodos
74
kit de marcaje Ready to go DNA labelling beads (Amersham), siguiendo las
instrucciones de la casa comercial.

La sonda marcada se purific en columnas "MicroSpin

S-400-HR"
(Amersham), siguiendo las instrucciones del fabricante, con objeto de eliminar los
oligonucletidos no incorporados a la misma.

11.2.2. Marcaje no radiactivo de ADN

Para este marcaje se utilizaron dCTPs con digoxigenina unida. Para incorporar
estos dCTPs, se utiliz una reaccin de PCR y se incluy, en la mezcla de reaccin,
1/10 del volumen de nucletidos marcados del kit "PCR Dig Labeling Mix" (Roche).

El producto de la reaccin de marcaje no radiactivo fue sometido a electroforesis
en gel de agarosa y purificado a partir del gel, empleando el mtodo indicado en el
apartado 10.5.

11.2.3. Marcaje de ADNc con uracilo biotinilado

Para el marcaje del ADNc y posterior purificacin del ARNc, se emple el kit
comercial, "IVT" (Affymetrix), siguiendo las recomendaciones del fabricante.

Para favorecer la hibridacin y reducir las estructuras secundarias, el ARNc se
fragment en productos de 50-100 pb mediante una digestin, tal y como se indica en el
apartado 10.2.1.1.

11.3. Prehibridacin, hibridacin y lavados

11.3.1. Prehibridacin

La prehibridacin tiene como finalidad, adems de equilibrar la membrana con
el tampn de hibridacin, bloquear los sitios activos de la membrana donde no se han
unido los cidos nucleicos transferidos y que pueden unir inespecficamente los
fragmentos de ADN usados como sonda. En todos los casos, se llev a cabo una
prehibridacin en el tampn de hibridacin correspondiente durante un mnimo de 60
minutos. El volumen del tampn aadido no debe superar los 100 L por cm
2
de
membrana.

11.3.2. Hibridacin y lavados

La especificidad de la hibridacin depende tanto de las condiciones utilizadas
durante la incubacin (temperatura, concentracin de sales y detergentes en el tampn
de hibridacin) como de los lavados posteriores.
Materiales y Mtodos
75

11.3.2.1. Hibridacin con sondas radiactivas

Las hibridaciones de este tipo se realizaron a 65C durante, al menos, 12 h en el
tampn de hibridacin correspondiente, al que se le aadi la sonda desnaturalizada. La
desnaturalizacin se realiz por calentamiento durante 10 minutos a 100C y,
posteriormente, enfriamiento en hielo durante, al menos, 2 minutos.

Pasado este tiempo, se retir el tampn de hibridacin con la sonda y se procedi
a hacer los lavados. La membrana se someti a un lavado a temperatura ambiente
durante 1 minuto en tampn fosfato 0,04 M pH 7,2; SDS al 1%, seguido de dos lavados
en el mismo tampn a 65C durante 20 minutos.

Tampn de hibridacin para sondas radiactivas: tampn fosfato 0,5 M pH 7,2; SDS al 7%, EDTA 10
mM.

11.3.2.2. Hibridacin con sondas no radiactivas

Estas hibridaciones se llevaron a cabo tal y como se describe en el apartado
anterior pero empleando un tampn de hibridacin de composicin diferente.

Posteriormente, se retir el tampn de hibridacin con la sonda (se puede
guardar a -20C para ser reutilizado) y se procedi a hacer los lavados. La membrana se
someti a dos lavados con SSC 2X y SDS al 0,1% durante 15 minutos, el primero a
temperatura ambiente y el segundo a 65C. A continuacin, se realiz un lavado ms
con SSC 0,2X y SDS al 0,1% durante 15 minutos a 65C.

Tampn de hibridacin para sondas no radiactivas: para preparar 200 mL, se aadieron en este orden
148 mL de agua, 0,4 mL de SDS al 10%, 2 mL de sarcosina al 10% (p/v) y 50 mL de SSC 20X. Se
mantuvo la mezcla durante 5-10 minutos a 65C y se aadieron despus 2 g de "Blocking Reagent"
(Roche). Se calent y agit la mezcla durante 30-45 minutos a 65C y, posteriormente, se dej enfriar.

11.3.2.3. Hibridacin con sondas no radiactivas (GeneChip)

Se utiliz un "GeneChip Arabidopsis ATH1 Genome Array" (Affymetrix), que
fue hibridado con 15 g de ARNc fragmentado de las distintas muestras. Para llevar a
cabo la hibridacin, se utiliz el sistema GeneChip de Affymetrix siguiendo las
recomendaciones de la casa comercial. El sistema se compone de un horno de
hibridacin (permite realizar la hibridacin de un gran nmero de chips de manera
simultnea), una unidad de procesamiento (realiza el proceso de lavado de los chips,
junto con la inyeccin de una solucin de estreptavidina y anti-estreptavidina
biotinilada, SAPE), y un lser. En la Figura 15 se muestra el proceso completo de
hibridacin del chip.
Materiales y Mtodos
76

Figura 15. Esquema del proceso de marcaje e hibridacin del GeneChip Arabidopsis ATH1 de
Affymetrix.


11.4. Deteccin

11.4.1. Radiactiva

Tras llevar a cabo los lavados, las membranas se envolvieron en papel de
plstico transparente y se expusieron en un cassette BAS 2040 (Fujifilm) con pantalla
intensificadora Imaging Plate BAS-MS 2040 (Fujifilm) durante un tiempo, que se
determin de forma emprica para cada experimento, y la imagen se obtuvo usando un
sistema o equipo Bio-Imaging Analyzer BAS-1500 (Fujifilm). En caso necesario, para
cuantificar la intensidad relativa de las bandas obtenidas en experimentos de tipo
Northern se utiliz el programa ImageGauge v4.0 (Fuji Photo Film Co., Ltd.).

11.4.2. No radiactiva

La deteccin no radiactiva se realiz con anticuerpos frente a digoxigenina
conjugados con fosfatasa alcalina. El revelado de la actividad fosfatasa se llev a cabo
mediante una reaccin quimioluminiscente empleando el reactivo CDP-Star (Roche).
Para ello se sigui, con ligeras modificaciones, el siguiente protocolo que proporciona la
casa comercial:

1. Tras llevar a cabo los lavados, se trat la membrana con tampn de lavado
(washing buffer) a temperatura ambiente durante 5 minutos.
2. Se aadi sobre la membrana la solucin de bloqueo y se incub en agitacin a
temperatura ambiente durante 30 minutos.
3. Se aadi sobre la solucin anterior el anticuerpo AntiDIG-AP Fab fragments
(Roche) a una dilucin 1:20000 y se incub en agitacin a temperatura
ambiente durante 30 minutos.
4. Se hicieron dos lavados de 15 minutos con tampn de lavado.
Materiales y Mtodos
77
5. Se aadi el tampn de deteccin durante 3-5 minutos para equilibrar la
membrana.
6. Se retir el tampn y se aadi el reactivo CDP-Star (Roche), diluido 1:100 en
tampn de deteccin, sobre la membrana y se cubri la misma con un papel de
plstico transparente para facilitar la distribucin del reactivo por toda la
superficie de la membrana. Se incub 5 minutos en oscuridad.
7. Finalmente se expuso a una pelcula radiogrfica (Fujifilm) en un cassette EC-
DW (Fujifilm) durante 1-15 minutos y se revel.

Tampn maleico: NaCl 150 mM; cido maleico 100 mM, pH 7,5.
Tampn de lavado: Tween 20 al 0,3% (v/v) en tampn maleico.
Solucin de bloqueo: Blocking Reagent al 1% (p/v) en tampn maleico.
Tampn de deteccin: Tris-HCl 100 mM, pH 9,5; NaCl 100 mM.

11.4.3. No radiactiva (GeneChip)

La deteccin de la fluorescencia emitida por el chip se realiz con el sistema
Gene Array reader (Affymetrix). Los resultados fueron analizados con un paquete
informtico compuesto por el programa GCOS, que permite digitalizar los datos de
fluorescencia generados por el lser, y el programa Desktop Mining Solution (Micro DB
3.0, Data Mining Tool 3.0), que permite la identificacin de los genes inducidos y/o
reprimidos en cada experimento, mediante el uso de las bases de datos generales junto
con la base de datos de Affymetrix.

11.5. Reutilizacin de membranas

11.5.1. Hibridacin radiactiva

Con objeto de reutilizarlas, las membranas se limpiaron sumergindolas en una
solucin hirviendo de SDS al 0,2%, y se mantuvieron ah hasta que la solucin se enfri
a temperatura ambiente.

11.5.2. Hibridacin no radiactiva

Las membranas se sometieron al siguiente tratamiento para su reutilizacin:

1. Inicialmente se sumergieron en agua destilada estril y, a continuacin, se
realizaron dos lavados de 15 minutos con una solucin de NaOH 0,2 N y SDS al
0,1%.
2. Por ltimo, se mantuvieron durante, al menos, 10 minutos en SSC 2X.



Materiales y Mtodos
78
12. MANIPULACIN DE PROTENAS


12.1. Obtencin de protenas intracelulares

12.1.1. Condiciones de cultivo

Para la obtencin de protenas intracelulares de la cepa T34, sta se creci en
condiciones que simulaban una interaccin in vivo Trichoderma-planta-patgeno, tal y
como se describe en el apartado 4.1.6.

12.3.2. Concentracin y dilisis de las muestras

La obtencin de protenas intracelulares se realiz siguiendo el mtodo descrito
por Gorg y col. (2000), con ligeras modificaciones:

1. Se parti de aproximadamente 1 g de micelio de Trichoderma (obtenido como
se describe en el apartado 4.1.6), que se pulveriz en un mortero en presencia de
nitrgeno lquido. El micelio se resuspendi en 10 mL de una solucin de cido
tricloroactico (TCA) al 20% (p/v) en acetona fra conteniendo ditiotreitol
(DTT) al 0,2%.
2. Las muestras se homogeneizaron con ayuda de una micropipeta y por agitacin
en vrtex. Posteriormente, se mantuvieron a -20 C durante, al menos, 45
minutos, para que las protenas precipitasen.
3. Seguidamente, las muestras se centrifugaron a 15000 x g durante 20 minutos a
4C. El precipitado se lav con 1,5 mL de acetona fra conteniendo DTT al
0,2%.
4. Las protenas se dejaron precipitar de nuevo a -20 C durante, al menos, 1 h.
5. Las muestras se centrifugaron a 15000 x g durante 15 minutos a 4C, y el
precipitado se dej secar al aire, resuspendindolo despus en 1,5 mL de
solucin RHS.
6. Finalmente, las protenas se mantuvieron a temperatura ambiente, durante 2 h, y
en agitacin para ayudar a su completa resuspensin. Transcurrido este tiempo,
se centrifugaron a 20000 x g durante 30 minutos a 20C, y los sobrenadantes
obtenidos se conservaron hasta su uso a -20 -80C.

Solucin RHS: urea 9M; CHAPS 2% (p/v); DTT 1% (p/v); fenilmetilsulfonil fluoride (PMSF) 10mM
(Sigma).

Este protocolo se utiliz para la obtencin de protenas intracelulares que posteriormente se
visualizaran en geles 2D SDS-PAGE.


Materiales y Mtodos
79
12.2. Obtencin de protenas intracelulares de A. thaliana

Para la obtencin de protenas intracelulares de A. thaliana, se resuspendi 1 g
de material vegetal liofilizado, en tampn fosfato 50 mM pH 5,5 y se agit en vortex a
4C durante 30 minutos. Las muestras se centrifugaron 15 minutos a 12000 x g a 4C y
el sobrenadante se guard a -20C hasta su uso.

12.3. Obtencin de protenas extracelulares

12.3.1. Condiciones de cultivo

Para el estudio de la actividad endopoligalacturonasa en T. harzianum se emple
un sistema en cultivo en dos fases similar al utilizado para los estudios de expresin,
descrito en el apartado 4.1.4. Las condiciones de cultivo seleccionadas fueron aquellas
en las que se detect expresin del gen Thpg1.

12.3.2. Concentracin y dilisis de los sobrenadantes

Los sobrenadantes de cultivos de Trichoderma se pasaron a travs de un filtro de
0,22 m y, a continuacin, se concentraron hasta un volumen de 40-50 mL mediante un
Sistema de Ultrafiltracin Minitan (Millipore), empleando una membrana con un
tamao de poro de 10 kDa y siguiendo las instrucciones del fabricante. Los
sobrenadantes concentrados se dializaron utilizando membranas de dilisis (Sigma),
preparadas de acuerdo a las instrucciones de la casa comercial. La dilisis se mantuvo a
4C durante, al menos, 48 h, con cambios de agua destilada cada 6-8 h.

12.4. Cuantificacin de protenas

La cantidad de protena en solucin se determin por el mtodo de Bradford
(1976), utilizando el reactivo Bio-Rad Protein Assay (Bio-Rad) y siguiendo el
procedimiento de microensayo recomendado (para 1-20 g protena/mL). Se utilizaron
800 L de la muestra convenientemente diluida en agua y se aadieron 200 L del
reactivo. Las muestras se incubaron a 37C durante 15 minutos y se midi la densidad
ptica a 595 nm. La cantidad de protena se determin por extrapolacin sobre una recta
patrn realizada simultneamente con diluciones seriadas de seroalbmina bovina
(Sigma) de concentracin conocida en el rango de 1-20 g/mL.

12.5. Ensayos de actividad endopoligalacturonasa

12.5.1. En medio slido

Se realiz un primer ensayo para determinar la actividad de la protena ThPG1,
mediante un ensayo en medio slido. Para ello, se utiliz un sobrenadante concentrado
Materiales y Mtodos
80
200 veces, tal y como se describe en el apartado 12.2.2., de la condicin en la que se
detect mayor expresin, en MM suplementado con pectina al 0,5% durante 24 h. El
ensayo se realiz en placas de tampn acetato sdico 100 mM pH 5,5, con cido
poligalacturnico al 0,5% y agarosa al 1%. Se aadieron 50 L del sobrenadante
concentrado a un cilindro metlico con un dimetro de 0,7 cm colocado sobre la placa.
Se incub a 37 C durante 36 h. Transcurrido este tiempo la placa se revel con HCl 6 N
durante 5 minutos en agitacin suave.

12.5.2. En medio lquido

Para determinar la actividad endopoligalacturonasa en las muestras
seleccionadas se utiliz el mtodo de Somogyi (1952) de determinacin de azcares
reductores. En un tubo se aadieron 150 L de la solucin problema y 150 L de la
solucin Somogyi (Somogyi I: Somogyi II en proporcin 4:1). La mezcla se hirvi
durante 10 min y posteriomente se pasaron los tubos a un bao de hielo. Se aadieron
150 L del reactivo de Nelson y se agitaron vigorosamente el tiempo necesario para
eliminar el CO
2
emergente. Las muestras se diluyeron hasta un volumen de 1 mL con
agua ultrapura y se midi la absorbancia a 520 nm.

Para cuantificar los azcares reductores en la solucin problema se llev a cabo
en paralelo una reaccin de Somogyi-Nelson para disoluciones de glucosa de
concentraciones conocidas en el rango comprendido entre 0 y 400 g/mL. Con los
resultados obtenidos para las muestras de glucosa de concentracin conocida, se hizo
una recta patrn sobre la que se extrapolaron los resultados obtenidos para las muestras
problemas.

La solucin problema se prepar con 50 L de sobrenadante y 100 L de tampn acetato 50 mM pH
5,5 con PGA al 0,2%. Para comprobar si los sobrenadantes haban sido correctamente dializados, no se
aadi el PGA al tampn acetato en sus controles, y se utiliz como blanco una solucin de tampn
acetato con PGA al 0,2%.

Reactivo de Somogyi I: 15 g de tartrato potsico, 30 g de Na
2
CO
3
y 20 g de NaHCO
3
en 300 mL de agua
desionizada. La solucin resultante se aadi sobre una solucin de 180 g de NaSO
4
en 500 mL de agua
desionizada. Finalmente se complet hasta 1 L con agua desionizada y se conserv la solucin a
temperatura ambiente.
Reactivo de Somogyi II: 2 g de CuSO
4
5H
2
O y 18 g de NaSO
4
en 100 mL de agua desionizada. El
reactivo se conserv a temperatura ambiente.
Reactivo de Nelson: se disolvieron 12,5 g de (NH
4
+
)
2M
MoO
4
4H
2
O en 225 mL de agua desionizada y se
mantuvo en agitacin mientras se aadan 10 mL de H
2
SO
4
concentrado. Por otro lado se prepar una
segunda solucin de 1,5 g de NaAsO
3
en 12,5 mL de agua destilada. Ambas soluciones se mezclaron y se
mantuvo la mezcla a 37C durante 48 h. El reactivo se conserv a temperatura ambiente en un frasco
topacio, para protegerlo de la luz.

Materiales y Mtodos
81
12.6. Tcnicas electroforticas: Electroforesis unidimensional de protenas en
condiciones desnaturalizantes (SDS-PAGE)

La separacin de protenas mediante electroforesis unidimensional en
condiciones desnaturalizantes (Weber y Osbern, 1975) se llev a cabo con un sistema
vertical de minigeles Mini-Protean II (Bio-Rad), siguiendo las instrucciones de la firma
comercial. Los geles de separacin se prepararon a una concentracin final de
acrilamida del 12% (v/v), y los de empaquetamiento a una concentracin de acrilamida
del 4%. La polimerizacin de los geles se realiz a temperatura ambiente entre dos
placas de vidrio dispuestas para obtener geles de 0,75 mm de grosor. Las muestras de
protenas se prepararon en un volumen final de 30 L a una dilucin 3:1 en tampn de
carga y se precalentaron a 55C durante 5 minutos para evitar la desnaturalizacin
irreversible de las protenas. La electroforesis se llev a cabo en tampn de
electroforesis aplicando una corriente de 150 V y 70 mA hasta que el colorante alcanz
la parte inferior de la placa (1 h aproximadamente). Como marcadores de peso
molecular se utilizaron protenas de bajo peso molecular (Bio-Rad): beta-galactosidasa
(116,3 kDa), seroalbmina bovina (66,2 kDa), ovoalbmina de gallina (45 kDa),
anhidrasa carbnica bovina (31 kDa), inhibidor de tripsingeno de semilla de soja (21,5
kDa) y lisozima de huevo de gallina (14,4 kDa).

Gel de separacin: 3,35 mL de agua ultrapura; 2,50 mL de Tris-HCl 1,5M, pH 8,8; 100 L de SDS al
10%; 4 mL de solucin de acrilamida-bis:acrilamida (29:1); 50 L de APS al 10% (p/v); 10 L de
TEMED (Bio-Rad).
Gel de empaquetamiento: 3,05 mL de agua ultrapura; 1,25 mL de Tris-HCl 0,5M, pH 6,8; 50 L de
SDS al 10%; 0,65 mL de solucin de acrilamida-bis:acrilamida (29:1); 25 L de APS al 10%; 5 L de
TEMED.
Tampn de carga: Tris-HCl 0,25 M, pH 6,8; glicerol al 40%; SDS al 8%; azul de bromofenol al 0,05%;
2-mercaptoetanol al 20% (v/v).
Tampn de electroforesis: Tris 25 mM; glicina 192 mM; SDS al 0,1%.

12.6.1. Determinacin de la actividad endopoligalacturonasa en geles de acrilamida

El gel resultante tras la separacin electrofortica de las protenas se lav en
tampn de renaturalizacin a 4C durante 1 h con agitacin suave y cambios de tampn
cada 30 minutos. Posteriormente, se lav en tampn acetato 50 mM pH 5,5 a
temperatura ambiente durante 5 minutos. Paralelamente, se prepar un gel de agarosa al
1% (p/v) que contena PGA al 0,5% (p/v). La solidificacin del gel se realiz a
temperatura ambiente entre dos placas de vidrio dispuestas para obtener geles de 1,5
mm de grosor. Los geles de agarosa y acrilamida se colocaron uno sobre otro, y se
incubaron a 37C durante 2 h y 30 minutos. A continuacin, se separaron ambos geles, y
el gel de agarosa se ti, durante 2 h, con una solucin de Rojo Rutenio al 0,02% (p/v).
Transcurrido este tiempo, se equilibr mediante un lavado de 10 minutos en una
solucin de NaCl 1 M y, finalmente, se mantuvo en tampn acetato 50 mM pH 5,5
Materiales y Mtodos
82
(Soler y col., 1999). La actividad endopoligalacturonasa se observ como bandas de
color blanco en el gel de acrilamida.

Tampn de renaturalizacin: Tris-HCl 50 mM, pH 8,2, EDTA 2 mM y casena al 1% (p/v).

12.7. Tcnicas electroforticas: Electroforesis bidimensional de protenas en
condiciones desnaturalizantes (2D SDS-PAGE)

12.7.1. Primera dimensin (isoelectroenfoque, IEE)

Las protenas intracelulares obtenidas tal y como se describe en el apartado
12.1., se separaron utilizando un sistema de isoelectroenfoque en un equipo PROTEAN
IEF Cell system (Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA, EE.UU.). Se aplicaron 400 g
de protenas totales (200 L de la solucin) a lo largo de un cassette de rehidratacin, y
se puso en contacto con unas tiras de isoelectroenfoque de 11 cm (IPG strips, Bio-Rad)
con un gradiente lineal inmovilizado de pH de 3-10, que fueron rehidratadas con una
solucin de rehidratacin (Sigma) durante 1 h a temperatura ambiente y 12 h aplicando
una corriente de 50 V. Tras este paso se aplicaron las siguientes condiciones de IEE:
300 V durante 1 h, 8000 V durante 3 h y 8000 V hasta completar 34000 V/h.

Solucin de rehidratacin: urea 9 M, CHAPS al 2%, DTT al 1%, anfolitos al 2% y fenilmetilsulfonil
fluoride (PMSF) 10mM (Sigma).

12.7.2. Equilibrado de las tiras

Para eliminar el exceso de DTT que pudiera interferir en la separacin que tiene
lugar en la segunda dimensin, las tiras se equilibraron con lavados consecutivos de 10
minutos y en agitacin, en las soluciones de equilibrado I y II.

Solucin de equilibrado I: urea 6 M; Tris-HCl 50 mM, pH 8,8; glicerol al 20%; SDS al 2%; DTT al 2%.
Solucin de equilibrado II: urea 6 M; Tris-HCl 50 mM, pH 8,8; glicerol al 20%; SDS al 2%;
iodoacetamida al 2,5% (p/v).

12.7.3. Segunda dimensin

La separacin de protenas en la segunda dimensin (SDS-PAGE) se llev a
cabo con un sistema vertical de geles Protean II xi 2-D Cell (Bio-Rad), siguiendo las
instrucciones del fabricante.

Los geles de separacin se prepararon a una concentracin final de acrilamida
del 12%. La polimerizacin de los mismos se realiz a temperatura ambiente entre dos
placas de vidrio dispuestas para obtener geles de 1,5 mm de grosor. Las tiras de la
primera dimensin se situaron en la parte superior de los geles polimerizados con ayuda
Materiales y Mtodos
83
de una solucin de agarosa que favoreci el contacto entre la tira y el gel, evitando la
formacin de burbujas. La electroforesis se llev a cabo en tampn de electroforesis
aplicando una corriente constante de 80 V durante 12 h. Como marcadores de peso
molecular se utilizaron protenas de amplio rango de pesos moleculares (Bio-Rad).

Geles de separacin: para preparar 6 geles se mezclan 156,44 mL de agua ultrapura; 89,91 mL de Tris-
HCl 1,5M, pH 8,8; 4 mL de SDS al 10%; 107,89 mL de solucin de acrilamida-bis:acrilamida (29:1);
1,80 mL de APS al 10% y 360 L de TEMED.
Solucin de agarosa: agarosa al 0,5% y trazas de azul de bromofenol en tampn de electroforesis.

12.7.4. Tratamiento informtico de las imgenes

Las imgenes de los geles fueron obtenidas con un escner GS-800 Imaging
Densitometer (Bio-Rad) y fueron analizadas mediante el programa informtico PD-
Quest. La intensidad de la seal de cada spot fue determinada en unidades de densidad
ptica (D.O.), y se normaliz como la suma de las intensidades de todos los spots
incluidos en el gel estndard. Se consider un spot diferencial cuando la variacin de la
intensidad de la seal era de, al menos, dos veces.

12.8. Tincin de protenas en geles de acrilamida: Tincin con azul de Coomassie.

Para la visualizacin de protenas despus de SDS-PAGE, los geles se
mantuvieron en solucin de teido a temperatura ambiente y en agitacin durante al
menos 2 h. Posteriormente, se destieron por lavados repetidos con solucin de lavado.
Finalmente, se fijaron y conservaron en cido actico al 7%. Las protenas se
observaron como bandas de color azul en el gel de acrilamida.

Para la determinacin del peso molecular de protenas se tuvo en cuenta que la
distancia de migracin es inversamente proporcional a su peso molecular. Los valores
reales de peso molecular se calcularon grficamente, representando en abscisas las
movilidades relativas de las protenas patrn respecto al colorante de carga, y en
ordenadas el logaritmo decimal de los pesos moleculares.

Solucin de teido: azul de Coomassie R-250 (Sigma) al 0,25% (p/v); cido actico al 10%; etanol al
45%.
Solucin de lavado: cido actico al 10%; etanol al 45%.

Para la visualizacin de las protenas en los geles 2D SDS-PAGE se utiliz una solucin comercial,
SimplyBlue SafeStain G-250 (Invitrogen, CA, EE.UU.), patentado como Coomassie G-250, siguiendo las
instrucciones del fabricante.



Materiales y Mtodos
84
12.9. Identificacin de protenas

Los spots seleccionados, a los que se les asign un Standard Spot Number (SSP
number) mediante el programa PD-Quest, fueron escindidos del gel y digeridos con
tripsina (Talamo y col., 2003). Los pptidos resultantes de la digestin fueron
resuspendidos en 10 L de una solucin de cido actico al 1% y anlizados mediante
una espectrometra de masas, Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization-Time-Of-
Flight (MALDI-TOF), utilizando la tcnica de identificacin por huella peptdica,
Peptide mass fingerprint (PMF).

12.9.1. Espectrometra de masas

La muestra se embebi en una matriz de cido -ciano-4-hidroxicinmico
(CHCA) mezclado con solventes orgnicos [10 mg/mL de acetonitrilo (ACN)/cido
trifluoroactico al 0,2% (ATF)]. Se deposit 1 L de la mezcla en la placa del
espectrmetro de masas Voyager-DE Pro MALDI-TOF (Applied Biosystem, Foster
City, CA, EE.UU.) que se irradi con un lser a una longitud de onda de 337 nm. Se
utilizaron como controles internos los iones de la adrenocorticotropina humana (ACTH)
(Sigma) y la angiotensina III humana, con pesos moleculares de 2465,1989 Da y
931,5154 Da, respectivamente.

12.9.2. Identificacin por huella peptdica

Los datos de masas obtenidos con la espectrometra se analizaron por
comparacin con las bases de datos del National Centre Biotechnology Information
(NCBI), y de la base de Expressed Sequence Tags (EST) de Trichoderma, Trichobase
(Vizcano y col., 2006, 2007), mediante el programa Mascot (Matrix Science, Londres,
UK) (http://www.matrix-science.com). Este programa compara los valores tericos y
experimentales de pptidos depositados en bases de datos, sometidos a una digestin
virtual, generando una lista de posibles pptidos candidatos que coinciden con el spot
analizado.


13. ENSAYOS DE CRECIMIENTO Y GERMINACIN


13.1. Ensayos con Trichoderma

Para determinar como el silenciamiento del gen Thpg1 podra afectar a la
capacidad pectinoltica de la protena ThPG1, se realiz un ensayo de crecimiento en
placa del transformante silenciado, ePG5, junto con la cepa silvestre T. harzianum T34,
en MM Penttil sin glucosa y suplementado con pectina al 0,5%. Como control se
crecieron las dos cepas en placas de PDA y MM Penttil sin glucosa. El ensayo fue
Materiales y Mtodos
85
realizado por triplicado, incubando las placas a 28C durante 3-4 das. Se tomaron
medidas del dimetro de crecimiento para cada condicin de crecimiento ensayada, cada
24 h.

13.2. Ensayos con A. thaliana

Para determinar el porcentaje de germinacin de semillas de A. thaliana (Col-0
y lneas transgnicas), se sembraron en placas de medio MS suplementado con manitol
100 mM y NaCl 50 100 mM. En paralelo, se realizaron siembras en medio MS que se
utilizaron como control. Se sembraron 100 semillas por placa y el ensayo se realiz por
triplicado.


14. DETERMINACIN DE FITOHORMONAS


Para la determinacin de cido abscsico (ABA), cido jasmnico (JA) y cido
saliclico (SA) se sigui el protocolo descrito por Durgbanshi y col. (2005):

Se parti de 0,5 g de tejido fresco foliar de cada muestra.
Se aadieron, de forma previa a la extraccin, 100 ng de [
2
H
6
]-ABA (preparado
segn Gmez-Cadenas y col., 2005), 100 ng de di-hidro-jasmnico (DHJA,
segn se describe en Kristl y col., 2002) y 5 ng de [
2
H
2
]-IAA (Sigma-Aldrich,
Madrid, Espaa).
El tejido se homogeniz con 5 mL de agua destilada con la ayuda de un
homogenizador (Ultra-Turrax, IKA-Werke, Staufen, Alemania).
La muestra resultante se centrifug a 4000 rpm durante 45 minutos.
Se recuper el sobrenadante y se ajust el pH a 3.0 utilizando una solucin de
cido actico glacial al 15% (v/v).
La solucin resultante se extrajo con 3 mL de ter etlico por evaporacin (grado
ACS, Scharlau, Barcelona, Espaa) utilizando un concentrador centrfugo a
vaco (RC 10.22, Jouan, Saint-Herblain, Francia).
El residuo seco obtenido se resuspendi en 1 mL de una solucin de agua y
metanol en proporcin 9:1 con la ayuda de un bao de ultrasonidos.
El extracto resultante se filtr a travs de filtros de celulosa regenerada de 0,22
m de tamao de poro y se inyect en un equipo de HPLC (Waters Alliance
2860, Waters Corp., Milford, EE.UU.) acoplado en lnea con un espectrmetro
de masas en tndem con interfaz de electrospray (Quattro LC, Micromass,
Manchester, Reino Unido).

Para la deteccin de las distintas hormonas vegetales se optimizaron las
condiciones de ionizacin y fragmentacin mediante la infusin directa de soluciones
patrn (a una concentracin de 1-3 ppm cada una). La separacin de las fitohormonas se
Materiales y Mtodos
86
llev a cabo mediante cromatografa lquida en fase reversa con una columna de C18
(Kromasil 100 C18 5 m 100 2.0 mm, Scharlau) utilizando como solventes agua y
metanol, ambos con una pureza de grado HPLC y suplementados con cido actico a
una concentracin de 0,1%. La deteccin de las fitohormonas se realiz en modo
electrospray negativo (ES) siguiendo las transiciones indicadas en la Tabla 4. La
cuantificacin se realiz mediante la interpolacin, en una curva de calibrado inyectada
previamente, de los valores de respuesta hallados en las diferentes muestras.


Tabla 4. Iones precursores y transiciones para cada una de las fitohormonas analizadas.
Compuesto In precursor (m/z) Transicin
ABA 263,0 263,0>153,0
JA 209,0 209,0>59,0
SA 137,1 137,1>93,1


15. HERRAMIENTAS BIOINFORMTICAS Y SOFTWARE UTILIZADO


15.1. Bsqueda de secuencias similares en bases de datos

15.1.1. FASTA

El algoritmo FASTA (Pearson y Lipman, 1988) es una aproximacin al
algoritmo de Smith-Waterman (1981), que divide la secuencia en palabras solapantes,
con una longitud de dos letras para protenas o seis para cidos nucleicos. Cada
secuencia de la base de datos es dividida de la misma forma. Estas dos listas de palabras
se comparan para encontrar palabras idnticas en ambas secuencias.

Permite diferentes combinaciones entre cidos nucleicos y protenas, sean estos
las secuencias problema o las bases de datos de secuencias. Nos proporciona un valor, el
Z-score, que despus es convertido en un valor E (E-value), como en el caso de BLAST.

Las comparaciones de secuencias usando este algoritmo se llevaron a cabo en el
servidor del European Bioinformatics Institute (EBI) (http://www.ebi.ac.uk/fasta3).

15.1.2. BLAST

BLAST (Basic Local Alignment Search Tools) constituye una coleccin de
diferentes programas que permiten distintas combinaciones entre cidos nucleicos y
protenas, sean estos las secuencias problema o las bases de datos de secuencias. Lleva a
Materiales y Mtodos
87
cabo alineamientos de tipo local entre una secuencia desconocida y una base de datos.
Las mayores ventajas de BLAST son su gran velocidad y la evaluacin estadstica que
realiza de los resultados. El parmetro estadstico correspondiente al valor E se calcula
en funcin de que un alineamiento ocurra por azar. Por ejemplo, si tenemos un valor E
igual a 0, significa que la probabilidad de que ese alineamiento haya ocurrido por azar
es 0.

Las comparaciones de secuencias usando las diferentes variantes del algoritmo
BLAST (BLASTN, BLASTX, BLASTP) se llevaron a cabo en la pgina web del NCBI
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/.

15.2. Alineamiento de secuencias

Hay dos tipos principales de alineamiento de secuencias: global y local. El
global optimiza el alineamiento sobre toda la longitud de la secuencia, mientras que en
el alineamiento local, tienen prioridad fragmentos de la secuencia con una gran cantidad
de coincidencias.

Un alineamiento mltiple de secuencias de protenas de la misma familia nos
proporciona informacin sobre la evolucin de esta familia, ya que el alineamiento
muestra la presin de la evolucin en cada aminocido y muestra tambin las posiciones
que son clave para mantener el plegamiento y la funcin de las protenas.

Para los alineamientos realizados en este trabajo se emple el programa ClustalX
(Thompson y col., 1994).

15.3. Otras manipulaciones de secuencias

La bsqueda de marcos de lectura abierta (Open Reading Frames, ORFs) sobre
las secuencias de ADN, la traduccin de los mismos a la secuencia proteica y un primer
anlisis elemental de esta secuencia proteica se realizaron con el programa EditSeq, que
forma parte del paquete informtico Lasergene (DNASTAR Inc., Madison, EE.UU.).

Para ensamblar las secuencias parciales o los cromatogramas de un mismo clon
se emple el programa Seqman II (Lasergene, DNASTAR Inc.). El programa Chromas
(http://www.technelysium.com.au/chromas14x.html) permiti el manejo de los
cromatogramas y exportar la secuencia a otros formatos.

La bsqueda de motivos o dominios en la secuencia primaria de la protena se
llev a cabo en la base de datos de dominios SMART (Simple Modular Architecture
Research Tool), que se puede consultar en la pgina web http://smart.embl.de.


Materiales y Mtodos
88
15.4. Anlisis estructural de protenas

Los mtodos de prediccin de la estructura secundaria de una protena tratan de
predecir si un residuo concreto pertenece a uno de estos 3 estados: hlice , hoja
plegada o bien, a segmentos irregulares o no ordenados de la protena. Estos mtodos
han evolucionado mucho en los ltimos aos. Al principio se basaban en la probabilidad
estadstica de que un aminocido concreto perteneciera a una de las tres estructuras
posibles. Despus, una segunda generacin de estos mtodos incluy la influencia del
ambiente local en el que se situaba cada aminocido. La exactitud de estos mtodos
nunca super el 60%. En la tercera generacin, se incluyeron alineamientos mltiples
como base de los mtodos de prediccin.

En la actualidad se usan mtodos basados en redes neuronales, tcnicas que
permiten el aprendizaje del mtodo. En este trabajo se us el programa PSIPRED
(Jones, 1999), que alcanza una exactitud del 75%. Est accesible va web en la direccin
http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/.

15.5. Anlisis de los dominios de unin a factores de transcripcin

La bsqueda de los dominios de unin a factores de transcripcin presentes en la
secuencia de ADN de las zonas reguladoras, se realiz con el programa MatInspector
Profesional (Quandt y col., 1995). Este programa emplea la base de datos TRANSFAC
y est disponible en versin de acceso limitado en la pgina web http://genomatix.de.
Tambin puede consultarse de forma gratuita, previo registro, en http://www.gene-
regulation.com/pub/databases.html#transfac.

15.6. Otras herramientas de prediccin

La identificacin de un posible pptido seal sobre la secuencia primaria de la
protena se llev a cabo con el programa SignalP v2.0 (Nielsen y col., 1997), accesible
en la direccin web http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalIP-2.0/. Por otro lado, el
anlisis de la secuencia de la protena mediante la aplicacin Scan Prosite
(www.expasy.org/tools/scanprosite/) revel la presencia de posibles sitios de
glucosilacin, fosforilacin, miristilacin y sulfatacin.

El perfil hidroptico de las protenas se calcul segn el algoritmo de Kyte y
Doolittle (1982) empleando la aplicacin Protean (Lasergene, DNASTAR Inc.).
La prediccin de la posible estructura tridimensional de la protena se llev a
cabo en el servidor web ESyPred3D
(http://www.fundp.ac.be/sciences/biologie/urbm/bioinfo/esypred/) que reconoce el
plegamiento utilizando perfiles de secuencias y multiples programas de alineamiento.
Para analizar los modelos propuestos se emple el programa de visualizacin de
Materiales y Mtodos
89
modelos DeepView-Swiss-PdbViewer disponible en la pgina web
http://www.expasy.ch/spdbv/.

Para el estudio terico previo de oligonucletidos y reacciones de PCR se utiliz
la aplicacin PrimerSelect (Lasergene, DNASTAR Inc.). Una herramienta para predecir
la Tm de los oligonucletidos se encuentra en la web
http://alces.med.umn.edu/rawtm.html.

15.7. Anlisis filogenticos

El objetivo de un anlisis filogentico es caracterizar la evolucin. Puede
llevarse a cabo por atributos morfolgicos de los organismos, o bien, como se ha hecho
en los ltimos aos, siguiendo las mutaciones en el material gentico de los organismos.

Para la construccin de rboles filogenticos se ha utilizado el programa PAUP
(Phylogenetic Analysis Using Parsimony, v4.0, Sinauer Associates, Sunderland, MA,
EE.UU.), usando el mtodo neighbour-joining (NJ). En este caso, la distancia entre dos
secuencias (la longitud de las ramas) en el rbol final corresponde a la similitud entre
dos secuencias.

La estabilidad de las ramas de un rbol filogentico se mide mediante un test
bootstrap (Felsenstein, 1985), el cual se lleva a cabo construyendo un rbol basado en
un subconjunto de las columnas del alineamiento mltiple en el que se basa el rbol
original. Este proceso se repite mltiples veces (en nuestro caso, 1000 veces) y nos da el
nmero de veces, en porcentaje, en el que el anlisis proporciona el mismo rbol final.

15.8. Anlisis estadstico

15.8.1. Datos obtenidos en microarrays

Para el clculo de la seal de expresin por probset de cada uno de los
microarrays se utiliz el algoritmo RMA (Robust Microarray Analysis) (Irizarry y col.,
2003) que incluye 3 pasos: correccin de background, normalizacin por cuantiles y
clculo sumarizado de la seal por probset utilizando una mediana pulida. Se utiliza un
grupo de sondas (probeset) para medir los niveles de expresin de un nico gen. Cada
grupo de sondas consta, a su vez, de mltiples pares de celdas (probe cells), con
millones de copias de la misma sonda. Las celdas se organizan en parejas (probe pairs)
con un Perfect Match (PM), secuencia que coincide exactamente con una parte del gen,
y un Mismatch (MM), secuencia idntica al PM excepto en el nucletido central que es
reemplazado por su complementario.

Materiales y Mtodos
90
Para evitar que la poca variabilidad en la seal de los genes afecte al algoritmo
de expresin diferencial, los datos se filtran a travs de otro algoritmo, IQR
(intercuartile range), que muestra solo aquellos genes que muestran ms variabilidad.

Para el clculo de la expresin diferencial significativa se utiliz el algoritmo
SAM (Tusher y col., 2001), que permite obtener un determinado nmero de genes
significativos para un determinado umbral de FDR (False Discovery Rate) (Benjamini y
Hochberg, 1995), que indica el nmero mximo estimado de falsos positivos que
admitimos en la lista de genes estadsticamente significativos.

15.8.2. Datos obtenidos en otros ensayos

Los datos obtenidos en los diferentes ensayos se sometieron a un anlisis de la
varianza para comprobar si las diferencias entre las cepas analizadas eran
estadsticamente significativas. Para ello se aplic el test de Fisher PLSD (Protected
Least-Significance Difference) utilizando el programa StatView versin 5.0 (SAS
institute Inc., Cary, NC, EE.UU.).

15.9. Herramientas de edicin

En esta memoria se usaron los siguientes programas de edicin especficos de
biologa molecular o manejo de bibliografa:

- pDRAW (www.acaclone.com). Se utiliz para dibujar y editar plsmidos a partir de su
secuencia.

- DNA Strider (CEA, Gif sur Yvette, Francia). Se emple para la edicin de las
secuencias de DNA y protenas.

- Genedoc (www.psc.edu/biomad/genedoc). Se us para la edicin de los alineamientos.

- Endnote (Thompson ISI ResearchSoft, www.endnote.com). Se utiliz para la gestin y
edicin de la bibliografa.


16. CASAS COMERCIALES


Affymetrix: Affymetrix, Santa Clara, CA, EE.UU. (http://www.affymetrix.com).

Agilent: Agilent Technologies, Santa Clara, CA, EE.UU.
(http://www.chem.agilent.com).

Materiales y Mtodos
91
Amersham: Amersham Biosciences AB, Uppsala, Suecia
(http://www.amershambiosciences.com).

Applied Biosystems: Applied Biosystems, Foster City, CA, EE.UU.
(www.appliedbiosystems.com).

Bio-Rad: Bio-Rad Laboratories Inc., Hercules, CA, EE.UU. (www.biorad.com).

Biotools: Biotools B y M Labs, Madrid, Espaa (www.biotools.net).

Cepheid: Cepheid, Sunnyvale, CA, EE.UU. (http://www.cepheid.com).

Difco: Difco Becton Dickinson, Sparks, MD, EE.UU. (www.difco.com).

Duchefa: Duchefa Biochemie B.V, Haarlem, Holanda (www.duchefa.com).

Eppendorf: Eppendorf, Hamburgo, Alemania (www.eppendorf.com).

Fermentas: Fermentas Life Science, Burlington, Ontario, Canad.
(www.fermentas.com).

Fujifilm: Fuji Photo Film Europa, Dsseldorf, Alemania (www.fujifilm.es).

Gramoflor: Gramoflor GmbH y Co. KG, Vechta, Alemania (www.gramoflor.de).

Invitrogen: Invitrogen, Groningen, Holanda (www.invitrogen.com).

Isogen: Isogen Life Science, Maarssen, Holanda (www.isogen-lifescience.com).

Maissa: Maissa, Barcelona, Espaa.

Merck: Merck KGaA, Darmstadt, Alemania (www.merck.com).

Millipore: Millipore, Billerica, MA, EE.UU. (www.millipore.com).

MoBio: MoBio Laboratories, Carslbad, CA, EE.UU. (www.mobio.com).

Molecular Research Center: Molecular Research Center Inc., Cincinnati, OH, EE.UU.
(www.mrcgene.com).

Promega: Promega, Madison, WI, EE.UU. (www.promega.com).

QBio Gene: QBio Gene, Montreal, Quebec, Canad (www.qbiogene.com).
Materiales y Mtodos
92

Qiagen: Qiagen GmbH, Hilden, Alemania (www.qiagen.com).

Roche: Roche Applied Science, Basilea, Suiza (www.roche.com).

Scharlau: Scharlau Chemie S.A., Barcelona, Espaa (www.scharlau.com).

Sigma: Sigma-Aldrich Co., San Luis, MO, EE.UU. (www.sigma-aldrich.com).

Stratagene: Stratagene, La Jolla, CA, EE.UU. (www.stratagene.com).

Takara: Takara Bio Inc., Otsu, Shiga, Japn (http://www.takara-bio.com).

Thermo: Thermo Electron Corporation, Ulm, Alemania (www.thermo.com).

Whatman: Whatman Laboratory Products Inc., Clifton, NJ, EE.UU.
(www.whatman.com).
























































Captulo 1: CLONACIN Y CARACTERIZACIN
DEL GEN Thpg1 DE T. harzianum T34


































RESULTADOS





Resultados
95





1. TRABAJO PREVIO


El trabajo realizado en esta Tesis Doctoral se engloba dentro del proyecto de
genmica funcional TrichoEST, financiado por la Unin Europea, cuyo objetivo era la
obtencin y el estudio de ESTs de diferentes especies del gnero Trichoderma
relacionadas con el proceso del biocontrol y, a su vez, que tuvieran un inters
agroalimentario o industrial.

La secuenciacin del genoma de T. harzianum T34 y otras cepas del gnero
Trichoderma se abord mediante la generacin y el anlisis de ESTs (Rey y col., 2004).
Estas ESTs se obtuvieron a partir de genotecas de ADNc que se construyeron
cultivando el hongo en diferentes situaciones metablicas (estrs, micoparasitismo,
interaccin con plantas, etc.). Actualmente, nuestro grupo dispone de una coleccin de
genotecas de ADNc de distintas cepas, obtenidas en diferentes condiciones de cultivo.

De forma previa a este trabajo, en nuestro grupo se construyeron distintas
genotecas de ADNc para el proyecto de genmica funcional TrichoEST. Entre ellas se
construy una genoteca mix de T. harzianum T34 (que se denomin L15). Para la
construccin de esta genoteca, la cepa T34 se cultiv en un MM (Penttil y col., 1987)
suplementado con cido poligalacturnico (PGA) al 0,1%, carboximetilcelulosa (CMC)
al 0,1%, pectinas al 0,1%, xilano al 0,1% y glucosa al 0,2%, a 28C durante 36 horas.
Los ADNc obtenidos a partir de los ARNm purificados mediante el sistema de perlas
magnticas unidas a poli-T (dynabeads), se clonaron en el vector Lambda Zap
(Stratagene).

Se eligieron al azar diferentes clones de esta genoteca (L15) y se obtuvo una
secuencia parcial de los mismos. Por lo tanto, las secuencias as obtenidas derivan de
genes que se expresan en las condiciones en las que se elabor la genoteca de ADNc. La
funcin hipottica de cada EST o contig (grupo de ESTs correspondientes al mismo
gen) se dedujo a partir de su similitud con otras secuencias presentes en las bases de
datos utilizando diferentes herramientas bioinformticas.

Uno de estos clones, correspondiente a la EST L15T34P120R10663 (a partir de
ahora, EST 10663), se eligi como punto de partida en el trabajo de esta Tesis Doctoral.
La eleccin de esta EST se bas en la similitud que presentaba, en bases de datos, con
endoPGs fngicas, implicadas en la degradacin de la pared celular de las plantas, y en
el hecho de que la cepa de la que proviene se utiliza como agente de control biolgico.
Resultados
96

2. AISLAMIENTO DE Thpg1 A PARTIR DE LA EST 10663


Se dispona de una secuencia de 685 pb de la EST 10663 (entre las posiciones
222 y 1150 en la secuencia del gen, Figura 16). Puesto que faltaban los extremos 5 y 3
del gen Thpg1, el primer paso consisti en la obtencin de una sonda para realizar el
escrutinio de una genoteca de ADN genmico de T. harzianum T34 y completar la
secuencia.











Figura 16. Esquema de la regin genmica secuenciada de Thpg1 de T.
harzianum T34. Se muestra punteada la posicin de la EST 10663
utilizada en el escrutinio de una genoteca de ADN genmico. Se indican
tambin el promotor y los cuatro intrones de Thpg1.


Se disearon los oligonucletidos 10663-1 y 10663-2 (Tabla 5, en Materiales y
Mtodos), sobre los extremos de la secuencia de la EST 10663, y mediante una reaccin
estndar de PCR, empleando ADN plasmdico de la EST 10663 como molde, estos
oligonucletidos amplificaron un fragmento de 618 pb.

A continuacin, se llev a cabo un escrutinio de la genoteca de ADN genmico
de T. harzianum T34, L01, (Lora y col., 1995), construida en el vector GEM11
(Promega). El producto de PCR de 618 pb, se marc con digoxigenina y se emple
como sonda para la hibridacin de filtros que contenan, aproximadamente, 10000 fagos
procedentes de dicha genoteca. Se obtuvieron varios fagos positivos, que se purificaron
en dos rondas sucesivas de infeccin e hibridacin. Se seleccion uno de ellos, el
10663-4-1, y se realiz la extraccin de ADN del fago (tal y como se describe en el
apartado 9.1.2. de Materiales y Mtodos). El ADN del fago obtenido se emple
directamente para secuenciar por primer walking los extremos 5 y 3 del gen con los
oligonucletidos 10663-1, 10663-2, 10663-3, 10663-4 y 10663-5 (Tabla 5, en
Materiales y Mtodos).

Resultados
97
En total, se secuenciaron 2199 pb de los cuales 812 pb correspondieron al
promotor y 1387 pb correspondieron a la secuencia completa del gen Thpg1 (Figura
16). Al traducir esta secuencia a aminocidos se produjo una ruptura en la fase de
lectura, y al compararla con las secuencias de otros genes de endoPGs en las bases de
datos, se dedujo que contena al menos un intrn.


3. ANLISIS in silico DE LA SECUENCIA NUCLEOTDICA Y
AMINOACDICA


3.1. Identificacin de intrones en la secuencia de Thpg1

Para identificar los intrones presentes en la secuencia de Thpg1 se disearon los
oligonucletidos endop-1 y endop-2 a partir de los extremos de la secuencia completa
del gen. Se utilizaron en una reaccin estndar de PCR en la que se us como molde
ADN de fagos amplificados de la genoteca L15, de la que provena la EST 10663. Para
poder comparar los tamaos de las bandas, tambin se llev a cabo la misma PCR
usando ADN genmico de T. harzianum T34 como molde.

En la Figura 17 se muestran los tamaos de ambos productos de PCR. Se puede
apreciar que el tamao de la banda amplificada a partir de la genoteca de ADNc L15 es
ms pequeo que el de la banda amplificada a partir de ADN genmico, debido a que el
ADNc carece de intrones.




Figura 17. Productos de PCR obtenidos a partir de
ADN genmico de T34 (carril 1) y ADN de la
escisin en masa de la genoteca de ADNc L15
(carril 2), usando los oligonucletidos endop-1 y
endop-2. M: marcador 100 pb DNA ladder XIV
(Roche).





Resultados
98
El producto de PCR amplificado a partir de ADNc se purific del gel y se
secuenci directamente. Al comparar esta secuencia con la obtenida a partir de los fagos
amplificados, se confirm la presencia de cuatro intrones: intrn 1, 74 pb (256-330),
intrn 2, 60 pb (753-813), intrn 3, 55 pb (943-998) e intrn 4, 55 pb (1083-1138).
Estos intrones contienen las secuencias consenso tpicas en 5 y 3, as como la
secuencia de formacin del lazo (Tabla 5).


Tabla 5. Intrones de Thpg1. Las secuencias consenso para hongos filamentosos estn tomadas de
Ballance (1986). Las bases que no coinciden con el consenso se indican en minscula.

Inicio del procesamiento del
intrn
Sitio de formacin del
"lazo"
Fin de procesamiento del
intrn
Consenso GTAHGTY WRCTRAC MYAG
Intrn 1 GTtgagTa TACTGAt ATAG
Intrn 2 GTAAGTC AGCTGAg ATAG
Intrn 3 GTAAGTC AtCTAgt ACAG
Intrn 4 GTATGcC AGCTAtt ACAG


3.2. Estudio de la secuencia del promotor de Thpg1

Se secuenciaron 812 pb del promotor de Thpg1 con los oligonucletidos 10663-
5, 10663-6 y 10663-7. La secuencia completa de la regin promotora se encuentra en el
apndice de esta memoria y se deposit en la base de datos de secuencias GenBank con
el nmero de acceso AM489729. Al analizar in silico dicha secuencia, en primer lugar
se buscaron los elementos fundamentales de una regin reguladora de este tipo. En las
posiciones -92 y -453 respecto al codn de inicio, se encontr una secuencia idntica a
una caja TATA (5-TATATAA-3) que se ajustaba perfectamente al consenso 5-
TATA(T/A)AA-3. Tambin se encontr en las posiciones -74 y -254 (en la cadena
codificante), y -355, -506 y -601 (en la cadena complementaria) respecto al condn de
inicio, una caja CCAAT que se ajust perfectamente al consenso 5-CCAWT-3. A esta
ltima caja se une el complejo trimrico HAP2/3/4, implicado en la regulacin de genes
relacionados con el metabolismo del carbono (Zeilinger y col., 2001).

Se llev a cabo un anlisis terico para buscar sitios de unin para factores de
transcripcin cuyas secuencias consenso estn definidas. Se emple la aplicacin
MatInspector usando la base de datos TRANSFAC, restringida a hongos.

Se localizaron tres secuencias 5-SYGGRG-3, todas ellas en la cadena
codificante (en las posiciones -105, -373 y -439). En esta secuencia se une la protena
Mig1/CreA/Cre1 (Mig1 en S. cerevisiae, CreA en A. nidulans, Cre1 en T. reesei),
Resultados
99
responsable de la represin catablica. Reprime un gran nmero de genes en presencia
de glucosa (Kulmburg y col., 1993; Ilmen y col., 1996).

Tambin aparecieron tres secuencias 5 HGATAR 3, dos de ellas en la cadena
codificante (-26 y -565) y otra en la cadena complementaria (-303). Esta secuencia est
implicada en la unin de factores de transcripcin (AreA o Nit2) relacionados con el
metabolismo del nitrgeno. En A. nidulans, AreA regula el metabolismo del nitrgeno
en respuesta a los niveles extracelulares de glutamina (Ravagnani y col., 1997). Su
homlogo en N. crassa es Nit2 (Scazzocchio y col., 2000).

Adems se encontraron, entre otros, posibles sitios de unin para los siguientes
factores de transcripcin:

- AbaA: regulador que interviene en la diferenciacin de los conidios y, por tanto,
en la activacin de genes implicados en el desarrollo (Adrianopoulos y
Timberlake, 1994).
- MCM1: regulador de genes implicados en el control del ciclo celular, en la
sntesis de pared celular, en el metabolismo celular, en la activacin de
glucoproteinas secretadas en condiciones de choque trmico y en el metabolismo
de la arginina (Kuo y col., 1994). Miembro de la familia MADS de factores
trans, regulan los genes por interaccin con distintos cofactores como alpha1,
Ste12 y alpha2 (Mead y col., 2002; Abraham y col., 2005).
- GCR1: regulador de genes glucolticos (Uemura y col., 1997).
- GAL4 y LAC9: activadores que median la respuesta a la presencia de galactosa
(Bram y col., 1986; Wray y col., 1987).
- MAT1: regulador que interviene en la diferenciacin sexual (Kjaerulff y col.,
1997).
- XBP1 (XhoI site-binding protein 1): regulador negativo que acta sobre la
transcripcin de genes especficos, pudiendo causar un retraso pasajero del ciclo
celular bajo condiciones de estrs como choque trmico, alta osmolaridad, estrs
oxidativo o dficit de glucosa (Mai y Breeden, 1997).
- HSF: responsable de la regulacin de la expresin de las protenas de choque
trmico (Fernndes y col., 1994).
- PHO4: en S. cerevisiae activa la expresin de una fosfatasa cida (PHO5) en
condiciones limitantes de fuente de fsforo (Ficher y Goding, 1992).


Tambin se analiz el entorno del lugar de inicio de la traduccin, que presenta
una secuencia consenso caracterstica (Goldman y col., 1998). Las coincidencias se
muestran en la Tabla 6.

Resultados
100
Tabla 6. Regin adyacente al codn de iniciacin de la traduccin que aparece ms frecuentemente en
Trichoderma y la que presenta el gen Thpg1 (Goldman y col., 1998). En negrita se muestran las
coincidencias.
Secuencia consenso -5 -4 -3 -2 -1 +1 +2 +3 +4 +5 +6
Trichoderma T/C C A A A/C A U G A/Y T/G T/A
Thpg1 A C A A C A U G A C C


3.3. Anlisis de la estructura primaria, secundaria y terciaria de la protena
ThPG1

La secuencia del gen Thpg1 tena 1387 pb y al traducirla, teniendo en cuenta ya
la presencia de los intrones, se obtuvo una secuencia de 380 aminocidos. La secuencia
completa de la regin gnica clonada se encuentra en el apndice de esta memoria y se
deposit en la base de datos de secuencias GenBank con el nmero de acceso
AM421521. El peso molecular terico de la protena es de 38,29 kDa y su punto
isoelctrico terico, 5,02. La estructura primaria de la protena deducida consta de 18
aminocidos bsicos (K, R) (5,9%), 25 cidos (D, E) (8,2%), 144 polares (N, C, Q, S, T,
Y) (47,2%) y 118 hidrofbicos (A, I, L, F, W, V) (38,7%). En la composicin de
aminocidos, el que se encuentra en mayor proporcin es la alanina (11,3%), seguido de
la valina (10,4%) y la leucina (9,2%).

Al analizar in silico la secuencia de aminocidos a travs del programa SignalP
v2.0, se detect la presencia de un pptido seal (posible punto de ruptura entre los
aminocidos Ala
21
-Leu
22
). Esto se explica si observamos el perfil hidroptico de ThPG1
(Figura 18), calculado segn el algoritmo de Kyte y Doolittle (1982). La presencia de
pptidos seal se relaciona con un alto grado de hidrofobicidad en esa regin y vemos
que en esta protena hay un marcado carcter hidrofbico al principio de la secuencia.
El anlisis realizado con el programa ProP v.1.0 para determinar prepro-pptidos dentro
de la secuencia, no revel ningn sitio de corte en residuos de arginina o lisina












Resultados
101

















Figura 18. Representacin grfica del perfil hidroptico de ThPG1 calculado
mediante el algoritmo de Kyte y Doolittle (1982). Se indica con una flecha la
zona de ruptura del pptido seal.


Se realiz una prediccin in silico de la estructura secundaria de la protena
mediante el programa PSIPRED (Figura 19). Se observ que en la estructura secundaria
de ThPG1 predominaban las regiones de hojas . Adems, el anlisis de la secuencia de
la protena mediante la aplicacin Scan Prosite revel la presencia de posibles sitios de
fosforilacin, miristilacin, sulfatacin y amidacin en los siguientes residuos (Figura
19):

- fosforilacin por proten kinasa C: serina 55 y treonina 282.
- fosforilacin por proten kinasa II: serinas 119, 185 y 276.
- miristilacin: glicinas 9, 45, 108, 115, 133, 174, 190, 201, 225, 232, 240,
281, 290, 314, 334, 348 y 369.
- glucosilacin: asparaginas 227 y 329.
- amidacin: glicina 365.







Resultados
102

Figura 19. Secuencia de la protena ThPG1 incluyendo la prediccin de su estructura secundaria
llevada a cabo con el programa PSIPRED (Jones, 1999). Se han marcado con fondo verde las
conformaciones en hlice y con fondo amarillo las conformaciones en hoja plegada . Tambin se
incluyen los posibles sitios de fosforilacin (en color gris y negro), miristilacin (en color azul),
glucosilacin (en color rojo) y amidacin (en color verde) segn el programa Scan Prosite
(www.expasy.org/tools/scanprosite).







Resultados
103
La secuencia total de la protena ThPG1 se compar mediante el algoritmo
FASTA con las secuencias presentes en la base de datos UNIPROT. Las protenas que
presentaron un mayor nivel de similitud con ThPG1 se recogen en la Tabla 7. La mayor
parte de estas protenas correspondan a endoPGs descritas en diversos hongos, aunque
la funcin de algunas de ellas era desconocida debido a que sus secuencias procedan de
proyectos de secuenciacin.


Tabla 7. Protenas con mayor similitud de secuencia con ThPG1. El anlisis se llev a cabo empleando el
algoritmo FASTA sobre la base de datos UNIPROT. Las protenas estn ordenadas en funcin de su valor
E. Id: identidad
Protena Organismo N aa E % Id N Acceso Referencia
poligalacturonasa
hipottica
Neosartorya
fischeri
378
3,E-
100
73,6 A1D145_NEOFI
poligalacturonasa
hipottica
Aspergillus
fumigatus
378
1,E-
99
73,4
BOXPA1_ASPF
U

poligalacturonasa
Penicillium
occitanis
384
2,E-
98
72,1
A7LH56_9EUR
O
(Trigui-Lahiani
y Gargouri,
2007)
endopoligalacturonasa
hipottica
Emericella
nidulans
380
1,E-
95
70,9
Q5ATQ3_EMEN
I

poligalacturonasa
Ophiostoma
ulmi
379
1,E-
94
68,2
Q4PJU8_OPHU
L

poligalacturonasa O. novo-ulmi 379
1,E-
94
67,9 O59934_OPHNO
endopoligalacturonasa
PG1
Leptosphaeria
maculans
384
8,E-
91
65,4
Q9P8MO_LEPM
C

endopoligalacturonasa
Alternaria
alternata
379
1,E-
90
66,5
Q9C4AO_ALTA
L
(Isshiki y col,
1997)
endopoligalacturonasa A. citri 379
2,E-
90
66,2 Q9C4A1_9PLEO


En la Figura 20 se muestra el alineamiento de la secuencia de aminocidos de
ThPG1 y algunas de las protenas que aparecen recogidas en la Tabla 7, realizado con el
programa ClustalX. En dicho alineamiento se observan las 4 regiones conservadas de
estas protenas que han sido descritas en bibliografa: Asn
194
-Thr
195
-Asp
196
, Asp
217
-
Asp
218
, Gly
238
-His
239
-Gly
240
y Arg
272
-X-Lys
274
(resaltados con un recuadro rojo y segn
la numeracin correspondiente a la secuencia de la protena ThPG1). Dentro de estas
regiones se localizan los residuos conservados en todas las endoPGs y que forman parte
del centro cataltico; los residuos Asn
194
, Asp
196
, Asp
217
, Asp
218
, His
239
y Gly
240
estaran
Resultados
104
implicados en la hidrlisis del sustrato; los residuos Arg
272
y Lys
274
estaran implicados
en la unin al sustrato (van Santen y col., 1999).

Figura 20. Alineamiento y comparacin de la secuencia de aminocidos de ThPG1 con otras
endopoligalacturonasas descritas en diversos hongos: T. reesei (contig C_1000682; http://genome.jgi-
psf.org/), A. alternata (nmero de acceso GenBank: BAB32924), L. maculans (AAF70169), N. fischeri
(XP_001264035), A. fumigatus (XP_753090), B. cinerea (AAC24955) y F. oxysporum (BAE97103).
Las 4 regiones conservadas descritas en bibliografa aparecen marcadas en recuadros rojos. Los
aminocidos conservados en todas las endopoligalacturonasas que forman parte del centro activo de la
protena aparecen marcados con un asterisco (*). El alineamiento se llev a cabo con el programa
ClustalX (Thompson y col., 1994).


Se estudi la estructura de dominios de ThPG1 en la base de datos SMART
(http://smart.embl.de) y se encontr un domino glicoslico (Glyco_Hydro_28, glucosil
hidrolasas familia 28, pfam 00295) que se extenda desde el aminocido 59 hasta el
final de la protena. Este dominio glicoslico engloba un amplio rango de enzimas
implicadas en la degradacin de la pared celular de las plantas. La prediccin de la
estructura terciaria para la protena ThPG1 se realiz con el programa ESyPred3D v1.0
por comparacin con la cadena A de la endopoligalacturonasa cristalizada de
Colletotrichum lupini (2IQ7_A), con un ndice de similitud del 54,4% (Figura 21). Se
utiliz la secuencia de aminocidos de la regin comprendida entre los aminocidos
Resultados
105
Ala
38
y Cys
380
. El modelo obtenido para ThPG1 muestra la disposicin tpica en hlice
paralela dextrgira, tpica de las enzimas que degradan la pectina (Herron y col.,
2000). Este tipo de dominio est constituido por repeticiones de giros formados por
hlices , que a su vez estn compuestas por varias lminas beta unidas (en amarillo en
la figura). El sitio de unin al sustrato se localiza en la hendidura que se forma en la
parte exterior de la hlice (lnea roja en la figura) y donde se localizan los residuos
que componen el centro cataltico de la protena (sealados en la figura).



















Figura 21. Modelo terico de la estructura tridimensional de la protena ThPG1
utilizando el programa DeepView-Swiss-PdbViewer. En amarillo se representa las
hlices y en verde las hlices . La hendidura que forma el sitio cataltico de la
enzima est representada con una lnea roja discontinua junto a los aminocidos
que constituyen el centro activo.


El destino celular ms probable de ThPG1 se simul mediante el uso del
programa PSORT II (Nakai y Horton, 1999) que le asign, con una probabilidad del
56%, una ubicacin extracelular.






Resultados
106
4. ANLISIS FILOGENTICO


Se llev a cabo un anlisis filogentico tras un alineamiento de Thpg1 con otras
15 secuencias de genes que codifican endoPGs y endoPGs hipotticas depositadas en la
base de datos GenBank. Se incluyeron genes de 8 ascomicetos, 1 basidiomiceto, 1
oomiceto y 4 plantas. Adems se incluy un gen que codifica una exoPG hipottica de
T. reesei. En la Figura 22 se muestra el rbol filogentico neighbour-joining (NJ),
basado en distancias, y valores de un anlisis bootstrap procedentes de 1000
repeticiones. Se pueden observar dos cuerpos principales, uno donde se sitan las
secuencias de hongos y del oomiceto, y otro donde se sitan las secuencias de plantas.
Adems, la secuencia del oomiceto queda separada de las de hongos por un valor
bootstrap del 59%. La secuencia Thpg1 de T. harzianum T34 se agrup con la endoPG
hipottica de T.virens formando un subgrupo soportado por un valor bootstrap del
100%.


Figura 22. rbol filogentico de Thpg1 de T. harzianum T34 con otras 13 secuencias de endoPGs y
una exoPG hipottica de T. reesei (en color azul) (C_33000038, http://genome.jgi-psf.org/). En color
gris se presentan los ascomicetos, en color amarillo el basidiomiceto, en naranja el oomiceto y en verde
las secuencias de plantas. El alineamiento se llev a cabo con el programa ClustalX (Thompson y col.,
1994) y el rbol neighbour-joining se obtuvo utilizando el programa MEGA v 2.1 (Kumar y col., 2001).
Los nmeros en las ramas indican los valores bootstrap procedentes de un anlisis de 1.000
repeticiones. A la derecha de cada especie aparece su nmero de acceso en la base de datos GenBank.
El acceso a la secuencia de T. virens se encuentra en la pgina web http://genome.jgi-psf.org/
(e_gw1.27.146.1). La barra representa 20 sustituciones por cada 100 aminocidos.
Resultados
107

5. ESTUDIO DE LA EXPRESIN DEL GEN Thpg1


El patrn de expresin del gen Thpg1 se analiz mediante hibridaciones tipo
Northern. Para ello, se utilizaron 15 g de ARN total extrado a partir de micelio de T.
harzianum T34 crecido en MM (Penttil y col., 1987), sin glucosa, durante 4, 8 24
horas, bajo distintas condiciones de cultivo, tal y como se describe en el apartado 4.1.4
de Materiales y Mtodos. Se utilizaron condiciones de induccin que simulaban
situaciones de estrs bitico como: presencia de pectina al 0,1 y 0,5%, presencia de
PGA al 0,1 y 0,5%, plantas de tomate al 1% y paredes celulares de los hongos B.
cinerea 26, R. solani 19 o P. ultimum 8 al 1%. Tambin se cultiv T. harzianum T34 en
condiciones de dficit de fuente de carbono, dficit de nitrgeno (sulfato amnico 50
mg/L) y una combinacin de ambas situaciones. Todas estas condiciones se realizaron
en ausencia de glucosa, excepto la condicin con glucosa al 2%. Como sonda se utiliz
la secuencia de la ORF del gen Thpg1. Esta sonda se obtuvo marcando radiactivamente
el producto de PCR obtenido tras amplificar el ADN plasmdico clonado en el vector
pGEM-T

Easy con los oligonucletidos endop-1 y endop-2. Como control de carga se

utiliz el ARNr 18S obtenido, mediante PCR, con ADN genmico de T. harzianum
T34, usado como molde, y los oligonucletidos 18S-u y 18S-r.

Se realizaron hibridaciones tipo Northern en dos membranas diferentes que
fueron procesadas en condiciones idnticas y el tiempo de exposicin fue el mismo para
ambas. Los resultados obtenidos se muestran en la Figura 23.

El gen Thpg1 se expres a tiempos largos (24 horas), en aquellas condiciones
que contenan plantas de planta o componentes de la pared celular de plantas, como la
pectina o el cido poligalacturnico. Los mayores niveles de transcrito se detectaron tras
cultivar la cepa T34 en presencia de pectina al 0,5% durante 24 horas, y en menor
medida, en presencia de PGA al 0,5% durante 24 horas. Tambin se pudo observar una
ligera expresin del gen tras cultivar el hongo en presencia de plantas de tomate al 1%
durante 24 h, pectina al 0,1% durante 24 h y pectina al 0,5% durante 8 h. En el resto de
condiciones analizadas no se observ ninguna seal de expresin.









Resultados
108

Figura 23. (A) Anlisis tipo Northern de la expresin de Thpg1 de T. harzianum T34. El
experimento se realiz con 15 g de ARN total extrado de micelio de la cepa T34 crecido en
MM (Penttil y col., 1987) bajo las siguientes condiciones: glucosa al 2% (g2), ausencia de
glucosa (g0N), glucosa al 2% y dficit de nitrgeno (sulfato amnico 50 mg/L) (g2N0), cido
poligalacturnico al 0,1 (PGA1) 0,5% (PGA5), paredes celulares de B. cinerea (Bot), P.
ultimum (Pyt) o R. solani (Rhi) al 1%, plantas de tomate al 1% (Tom) y pectina al 0,1 (Pec1)
0,5% (Pec5). Los micelios se recogieron a las 4, 8 24 horas de crecimiento de la cepa T34.
Como control de carga se utiliz el ARNr 18S. (B) Niveles relativos de transcrito de Thpg1
frente al ARNr 18S.
Resultados
109

6. ANLISIS SOUTHERN DE Thpg1. PRESENCIA EN OTRAS CEPAS DE
Trichoderma


Se realiz un experimento tipo Southern para determinar el nmero de copias del
gen Thpg1 en el genoma de T. harzianum T34, as como para analizar la presencia de un
gen homlogo en otras especies del gnero Trichoderma. Para ello se emple ADN
genmico de las cepas T. atroviride T11, T. harzianum T22, T. asperellum T25, T.
harzianum T34, T. longibrachiatum T52 y T. virens T59, digerido con las enzimas
BamHI o XhoI. El protocolo de extraccin del ADN genmico se recoge en el apartado
9.1.4.2 de Materiales y Mtodos. Como sonda se utiliz la secuencia completa del gen
Thpg1, marcada con digoxigenina.

Tras hibridar y lavar la membrana, en condiciones restrictivas (65C), se observ
una nica banda en el carril que contena ADN genmico de T. harzianum T34 digerido
con la enzima XhoI, sin dianas nucleotdicas dentro de la sonda utilizada. Por otro lado,
se observaron dos bandas en el carril que contena ADN genmico de T. harzianum T34
digerido con la enzima BamHI, con una diana nucleotdica dentro de la sonda utilizada.
El patrn de bandas de hibridacin indica que Thpg1 se encuentra en una nica copia en
el genoma de T. harzianum T34 (Figura 24).

Por otro lado, se detect una y dos bandas de hibridacin en los carriles que
contenan el ADN obtenido de las cepas T. atroviride T11 digerido con BamHI o XhoI,
respectivamente. Se detect tambin una nica banda en los carriles correspondientes al
ADN de la cepas T. harzianum T22, T. atroviride T25 y T. virens T59 digerido con
BamHI o XhoI. Sin embargo, no se observaron bandas de hibridacin en el carril que
contenan el ADN de T. longibrachiatum T52 digerido con BamHI, aunque si aparece
una banda dbil al digerir con XhoI. Este resultado sugiere la presencia de un gen
homlogo a Thpg1 en todas las cepas analizadas.






Resultados
110

















Figura 24. Anlisis tipo Southern del gen Thpg1 de T. harzianum T34, en
distintas especies de Trichoderma: T. atroviride T11, T. harzianum T22, T.
asperellum T25, T. harzianum T34, T. longibrachiatum T52 y T. virens
T59. El ADN se digiri con las enzimas de restriccin BamHI o XhoI, y la
hibridacin se realiz en condiciones restrictivas usando el gen Thpg1 como
sonda. A la izquierda se representa el marcador de tamaos moleculares de
ADN /HindIII (Roche).


7. CARACTERIZACIN DE LA ACTIVIDAD ENDOPOLIGALACTURONASA
EN LOS CULTIVOS DE T. harzianum T34.


La caracterizacin de la actividad endopoligalacturonasa de T. harzianum T34 se
efectu partiendo de algunas de las condiciones nutricionales donde se detect
expresin del gen Thpg1. Los sobrenadantes se recogieron y dializaron, en la forma que
se describe en los apartados 4.1.4 y 12.3.2 de Materiales y Mtodos.





Resultados
111
7.1. Ensayo en placa

Una primera aproximacin al estudio de la actividad de la protena ThPG1, se
realiz mediante un ensayo en medio slido llevado a cabo como se describe en el
apartado 12.5.1 de Materiales y Mtodos. Se utiliz el sobrenadante recogido tras crecer
la cepa T34 en un MM (Penttil y col., 1987) suplementado con pectina al 0,5% durante
24 h, por ser sta la condicin que present los mayores niveles de expresin del gen
Thpg1. Una vez incubada la placa, el revelado mostr un halo de lisis de 2,3 cm de
dimetro en la condicin analizada, utilizando como control una solucin de medio
mnimo (Figura 25).





Figura 25. Imagen del resultado de un ensayo de
actividad poligalacturonasa en placa. El halo de lisis
que se observa tras aplicar un extracto proteico
concentrado de la cepa T34 corresponde a dicha
actividad. Se us como control una solucin de medio
mnimo.





7.2. Determinacin de azcares reductores (Somogyi-Nelson)

Otra va para determinar la presencia de actividad endopoligalacturonasa en
diferentes condiciones de cultivo del hongo, fue la determinacin de azcares reductores
segn el mtodo de Somogyi, tal y como se describe en el apartado 12.5.2 de Materiales
y Mtodos. Este mtodo est basado en la oxidacin de azcares y sustancias reductoras
por compuestos orgnicos cpricos en una solucin alcalina.

Para este ensayo, se utilizaron los sobrenadantes de las condiciones en las que se
detect expresin del gen Thpg1. Adems, se incluy una nueva condicin en la que se
creci la cepa T34 en MM suplementado con pectina al 0,5% durante 36 horas.

Como se muestra en la Tabla 8, se detect actividad solamente cuando en el
medio de crecimiento se incluy pectina al 0,5% durante 24 36 horas. En el resto de
condiciones de crecimiento (pectina al 0,1%, PGA al 0,1% y 0,5% o tomate al 1%) no
se detect actividad endopoligalacturonasa en las condiciones en las que se realiz el
ensayo.
Resultados
112

Tabla 8. Actividad endopoligalacturonasa, medida como unidades de azcares reductores por mg de
protena total, utilizando como sustrato PGA.
Condicin U mg protena total Actividad especfica (U/mg)
planta de tomate 1% 4 horas 0 0,0815 0
planta de tomate 1% 8 horas 0 0,0865 0
planta de tomate 1% 24 horas 0 0,1302 0
PGA 0,1% 4 horas 0 0,0782 0
PGA 0,1% 8 horas 0 0,0769 0
PGA 0,1% 24 horas 0 0,1777 0
PGA 0,5% 4 horas 0 0,1244 0
PGA 0,5% 8 horas 0 0,1272 0
PGA 0,5% 24 horas 0 0,1425 0
pectina 0,1% 4 horas 0 0,0845 0
pectina 0,1% 8 horas 0 0,0869 0
pectina 0,1% 24 horas 0 0,1645 0
pectina 0,5% 4 horas 0 0,1505 0
pectina 0,5% 8 horas 0 0,1533 0
pectina 0,5% 24 horas 0,491 0,0966 5,08
pectina 0,5% 36 horas 0,504 0,1487 3,38
U, actividad total
Cada valor es media de tres repeticiones + la desviacin estndar


7.3. Determinacin de la actividad endopoligalacturonasa en geles de acrilamida

Puesto que no disponamos de la protena ThPG1 purificada, decidimos abordar
la determinacin del peso molecular mediante una electroforesis unidimensional en
condiciones desnaturalizantes (SDS-PAGE), utilizando como patrn un marcador de
pesos moleculares conocidos (BioRad), como se describe en el apartado 12.6 de
Materiales y Mtodos.

Se utiliz el sobrenadante de la condicin en la que se detectaron los mayores
niveles de expresin del gen Thpg1, en un MM suplementado con pectina al 0,5%
durante 24 horas de crecimiento. Se trabaj a partir de una muestra concentrada 100
veces. El gel con el marcador se ti con azul de Coomassie mientras que para el gel
con el extracto proteico se realiz una deteccin de la actividad endopoligalacturonasa.

En la Figura 26.A se puede observar un halo de lisis en el gel de acrilamida
formado por una actividad endopoligalacturonasa, cuyo peso molecular aproximado se
calcul despus de extrapolar el valor de su distancia de migracin (tomando como
Resultados
113
punto el centro del halo), a la regresin lineal de los valores presentados por los
patrones de peso molecular.


Figura 26. (A) Resultado de la separacin electrofortica unidimensional, realizada en condiciones
desnaturalizantes (SDS-PAGE), de un extracto proteico obtenido tras crecer durante 24 h la cepa
T34 en un MM suplementado con pectina al 0,5%. Posteriormente, se determin la actividad
endopoligalacturonasa en un gel de cido poligalacturnico (para ms detalles consultar el texto).
(B) Se representan los logaritmos de los pesos moleculares del marcador (M) frente a la distancia de
migracin (Rf) medida en unidades arbitrarias.


As, de acuerdo a la SDS-PAGE se obtuvo un valor aproximado del peso
molecular de 28,8 kDa (Fig. 26.B).















Resultados
114
8. SISTEMAS DE INTERACCIN T. harzianum-PLANTA-PATGENO


8.1. Anlisis de la expresin de Thpg1

Con objeto de determinar la funcin que pudiera desempear una
endopoligalacturonasa de T. harzianum T34 en su relacin con la planta, se decidi
abordar el estudio de la expresin del gen Thpg1 mediante Northern, en un sistema que
simulara unas condiciones in vivo, lo ms reales posibles, de interaccin planta-
patgeno-Trichoderma.

El ensayo se realiz segn las condiciones descritas en el apartado 4.1.5 de
Materiales y Mtodos. Se realiz una extraccin de ARN total a partir de los micelios
liofilizados obtenidos en las distintas condiciones ensayadas. El estudio tipo Nothern
revel expresin en las tres condiciones analizadas: (i) T34 vs tomate; (ii) T34 vs tomate
y P. ultimum; (iii) T34 vs tomate y R. solani.

La expresin fue muy baja en todos los casos, ya que el patrn de expresin se
obtuvo despus de 72 horas de exposicin. Adems, la expresin fue ligeramente
superior (1,2 veces mayor) en el caso de T34 vs tomate y P.ultimum (Figura 27).





Figura 27. (A) Anlisis tipo Northern de la
expresin de Thpg1 de T. harzianum T34 en un
sistema de 3 componentes. El experimento se
realiz con 15 g de ARN total extrado de micelio
de la cepa T34 crecido bajo las siguientes
condiciones: planta de tomate (1), planta de tomate
+ P. ultimum (2) y planta de tomate + R. solani (3).
Como control de carga se utiliz el ARNr 18S. (B)
Niveles relativos del transcrito de Thpg1 frente al
ARNr 18S. Para ms detalles consultar el texto.








Resultados
115
8.2. Anlisis protemico: ThPG1

Para determinar el patrn de la protena ThPG1 en un sistema in vivo de tres
componentes, Trichoderma-planta-patgeno, se analiz el proteoma de la cepa silvestre
T34 en las siguientes condiciones: (i) T34-tomate (control), (ii) T34-tomate-B. cinerea,
(iii) T34-tomate-P. ultimum y (iv) T34-tomate-R. solani (Figura 28).

Las condiciones utilizadas en el 2D SDS-PAGE fueron pH3-10 para la primera
dimensin (separacin de las protenas en funcin de su punto isoelctrico) y 14-94 kDa
que para la segunda dimensin (separacin de las protenas en funcin de su peso
molecular). Se emplearon 400 g de protenas totales, que se obtuvieron como se indica
en el apartado 12.1 de Materiales y Mtodos.






















Figura 28. (I) Ampliacin del 2D SDS-PAGE en la zona correspondiente al spot 0303
(sealado con un crculo rojo). El 2D SDS-PAGE se realiz con protenas
intracelulares obtenidas en las siguientes condiciones: A, T34-tomate (control); B,
T34-tomate-B. cinerea; C, T34-tomate-R. solani; D, T34-tomate-P. ultimum. Para ms
detalles, consultar el texto. (II) Representacin grfica de los niveles de intensidad
relativa del spot 0303.


Resultados
116
El anlisis comparativo de los cuatro proteomas, obtenidos como se detalla en el
apartado 12.7 de Materiales y Mtodos, mostr numerosos puntos diferenciales, que
fueron seleccionados de acuerdo a su PD-Quest, para posteriormente ser sometidos a
una espectrometra de masas y un posterior anlisis in silico con objeto de buscar
homologas con protenas conocidas. Uno de los spots expresados diferencialmente en
las distintas situaciones analizadas, mostr un alto grado de homologa con endoPGs
depositadas en bases de datos, concretamente con una endoPG de A. niger (CAB72126).
Este resultado se confirm con nuestra base de datos de ESTs de Trichoderma, al
comprobar que el spot 0303 guardaba relacin con la EST 10663. En la Figura 28.I se
muestra ampliada, la zona correspondiente al spot 0303 del 2D SDS-PAGE realizado
con las protenas intracelulares de la cepa T34 en las condiciones arriba descritas.

Un anlisis de la intensidad relativa del spot 0303 en las cuatro situaciones
analizadas, mostr la seal ms alta con los patgenos de raz, con valores de 13 y 27
veces ms, para P. ultimum y R. solani respectivamente (Figura 28.II). En la Tabla 9 se
detallan los valores de densidad ptica obtenidos en este ensayo.



















Tabla 9. Niveles de expresin relativa del spot 0303 en un sistema Trichoderma-planta-patgeno in vivo.
Condicin D.O. rea
T34-tomate (control) 6
T34-tomate-B. cinerea 12,9
T34-tomate-R. solani 161,7
T34-tomate-P. ultimum 79,8
































DISCUSIN





Discusin
118





Desde hace varias dcadas, las cepas del gnero Trichoderma se vienen
utilizando con xito en el control biolgico de hongos fitopatgenos en ambiente natural
(Monte, 2001). Son numerosos los trabajos que recogen la habilidad de estas cepas para
degradar biopolmeros de la pared celular de hongos patgenos que, por otro lado, no
estn presentes en los tejidos de las plantas. As, muchos genes que codifican una gran
variedad de enzimas lticas (quitinasas, glucanasas, proteasas, etc.) se han relacionado
con las propiedades antifngicas de distintas especies de Trichoderma (Lorito y col.,
1998; Sanz y col., 2004).

En el ao 2001, se inici el proyecto TrichoEST, sobre genmica funcional de
Trichoderma spp., con el objetivo de identificar genes y productos gnicos con valor
biotecnolgico en este hongo (Rey y col., 2004). En el estudio se incluyeron varias
cepas pertenecientes a diferentes especies de Trichoderma, representantes de la
diversidad gentica existente en este gnero (Hermosa y col., 2004). Como resultado del
proyecto se gener una coleccin de ESTs producidas en condiciones que simulaban
procesos de biocontrol como micoparasitismo, interaccin con la planta o distintos
estreses nutritivos (Vizcano y col., 2006b).

De las ms de 20.000 ESTs obtenidas en el proyecto, 8.710 procedan de
genotecas de la cepa T. harzianum T34 que una vez analizadas permiti disponer de
3.478 transcritos nicos. Entre ellas, como caba esperar dadas las condiciones en las
que se prepararon las genotecas, haba un gran nmero relacionadas con actividades
hidrolticas frente a polmeros de paredes fngicas y vegetales. Una de estas ESTs, la
10663 procedente de la genoteca L15, present una alta similitud con genes
relacionados con endoPGs depositados en bases de datos.

No debemos olvidar que la pectina es uno de los principales constituyentes de la
pared celular primaria de las plantas que, de manera general, acta como barrera fsica
frente al ataque de patgenos y que stos ltimos poseen una batera enzimtica capaz
de degradarla, pudiendo actuar como factores de virulencia en la planta (Lang y
Drnenburg, 2000). En este sentido, los trabajos encaminados a desvelar el papel que
tienen las endoPGs fngicas en la patognesis, no permiten asegurar, en todos los casos,
que estas enzimas constituyan un factor de virulencia. Mientras que la disrupcin de
genes que codifican endoPGs demostr, en C. purpurea, una implicacin de stas en
procesos patognicos (Oeser y col., 2002), los trabajos en C. parasitica (Gao y col.,
1996) y F. oxysporum (Garca-Maceira y col., 2001) sugeran que estas enzimas no eran
esenciales en esos procesos. Por otro parte, la actividad enzimtica de estas protenas
Discusin
119
provoca la liberacin de molculas que actan como elicitores de las respuestas de
defensa en planta (DOvidio y col., 2004a).

La gran diversidad de organismos (animales, plantas y microorganismos) que se
encuentran en el suelo, implica una gran variedad de interacciones biolgicas entre
ellos. En este sentido, Trichoderma es un hongo ubicuo, capaz de crecer en sustratos
muy diversos, con una destacada habilidad para competir por el alimento y por el
espacio, caractersticas que lo convierten en un excelente colonizador y descomponedor
de materia orgnica vegetal. Por otro lado, se sabe que Trichoderma, al menos frente a
los hongos fitopatgenos, produce de forma secuencial una batera de CWDEs.
Tambin se sabe, que las endoPGs son las primeras pectinasas que actan durante la
hidrlisis de la pectina (Annis y Goodwin, 1997). Estos hechos nos permitiran suponer
que la produccin de las enzimas de Trichoderma, capaces de degradar material vegetal,
se produciran de manera similar a las inducidas por las paredes celulares de hongos
fitopatgenos. As, las endoPGs permitiran al resto de enzimas secretadas por
Trichoderma el acceso a la hemicelulosa y la celulosa

An no est claro cal es el mecanismo por el que Trichoderma spp. coloniza el
sistema radical de la planta, estableciendo una simbiosis avirulenta y desencadenando
una respuesta defensiva en la misma (Harman y col., 2004). Son pocos los estudios que
reflejan los beneficios que ocasiona Trichoderma spp. en la planta (Yedidia y col.,
1999; Harman y col., 2004; Vinale y col., 2008) pero son ms escasos los trabajos en
los que la interaccin Trichoderma-planta-patgeno se estudia desde un punto de vista
molecular (Marra y col., 2006; Woo et al., 2006; Alfano y col., 2007; Shorest y
Harman, 2008). Teniendo en cuenta las caractersticas que presentan las endoPGs y el
hongo Trichoderma, el estudio de la endoPG aislada en este trabajo se orient hacia su
posible papel elicitor, ya que anteriormente se haban identificado en Trichoderma otras
molculas que actan como inductoras de las respuestas de defensa de las plantas (Woo
y col., 2006).

Se identific la EST 10663, procedente de una genoteca de ADNc de T.
harzianum T34 (L15), por su alto grado de similitud con secuencias, presentes en bases
de datos, que codifican genes relacionados con endoPGs. Esta EST se utiliz como
punto de partida para estudiar el sistema pectinoltico en T. harzianum, una de las
especies ms utilizadas en el control biolgico de hongos fitopatgenos.

Para el aislamiento del gen Thpg1 de T. harzianum T34, a partir de la EST
10663, se utiliz una genoteca de ADN genmico de T. harzianum T34 (L01) y la
genoteca L15 de T. harzianum T34, de la que proceda la EST. Se secuenciaron 2199 pb
de la regin gnica de Thpg1, de los cuales 812 pb correspondieron a la regin
promotora y 1387 pb al resto del gen Thpg1. El ADNc que se amplific a partir de la
genoteca L15 mostr un tamao de 1143 pb. La diferencia de tamao entre ADN
genmico (1387 pb) y ADNc (1143 pb), se debi a la presencia de cuatro intrones de
Discusin
120
74, 60, 55 y 55 pb, en los que se localizaron, como se muestra en la Tabla 5, las
secuencias consenso tpicas de los extremos 5' y 3', y del "lazo", excepto en el intrn 1.
En este ltimo, la secuencia de inicio no mostraba tanta similitud con la secuencia
consenso. En general, los genes que codifican endoPGs fngicas presentan de uno a
cuatro intrones, aunque tambin hay casos de endoPGs que carecen de ellos. La familia
de endoPGs de B. cinerea refleja esta variedad en el nmero de intrones (Wubben y
col., 1999). Adems el tamao de los intrones del gen Thpg1 encaja en el rango de
tamaos, 50 a 81 pb, observado para intrones de genes que codifican otras endoPGs
fngicas.

En cuanto al estudio de la expresin del gen Thpg1 in vitro, los resultados
obtenidos en el anlisis tipo Northern y el anlisis in silico de los 812 pb de la regin
promotora, permiten concluir que la expresin de este gen est regulada a nivel
transcripcional (Lang y Drnenburg, 2000).

Considerando los motivos tericos localizados en la regin promotora de Thpg1
y que la EST 10663 proceda de la genoteca de ADNc L15, preparada con una mezcla
de PGA, CMC, pectinas, xilanos y hambre de glucosa, los estudios de la expresin de
Thpg1 se llevaron a cabo cultivando el hongo en condiciones relativas a estas
situaciones. Del conjunto de condiciones ensayadas, se observ expresin de Thpg1
nicamente tras cultivar el hongo en presencia de plantas de tomate al 1%, pectina al 0,1
0,5%, o uno de sus derivados, PGA al 0,5%, como fuente de carbono. Por tanto, es
evidente que existe una regulacin de la expresin de Thpg1 por sustrato y productos
finales del metabolismo que estn estructuralmente relacionados con el sustrato
(D'Ovidio y col. 2004a). As, la regulacin por sustrato se ha descrito en la mayora de
los genes que codifican endoPGs de hongos (Wubben y col., 2000; Cotton y col., 2003).
Por ejemplo, se ha descrito en los genes pgA y pgB, de A. niger, que la utilizacin de
diferentes fuentes de carbono como cido galacturnico, cido galacturnico en
combinacin con ramnosa o PGA, produce una expresin diferencial de los mismos
(Parenicova y col., 2000). Por otra parte, la mayor expresin de Thpg1 se detect en
presencia de pectina al 0,5%, siendo menor con PGA al 0,5%. Tambin, se detect
mayor expresin de Thpg1 en pectina al 0.5% que al 0,1%. Sin embargo, estudios
realizados sobre la expresin del gen pppg1 de P. parasitica, mostraron que sta
disminua al aumentar la concentracin de pectina en el medio (Yan y Liou, 2005).

Otro de los mecanismos de regulacin de las endoPGs es la represin catablica
(D'Ovidio y col., 2004a). Se ha descrito que varios genes que codifican endoPGs son
reprimidos por la presencia en el medio de catabolitos del carbono, tales como la
glucosa (D'Ovidio y col., 2004a). Sin embargo, tambin se ha visto que este mecanismo
de regulacin no es caracterstico de todos los genes que codifican endoPGs, sirviendo
como ejemplo dos genes de B. cinerea, Bcpg4 y Bcpg1, que se reprimen (Bcpg4) o no
(Bcpg1) por glucosa (Wubben y col., 2000). En este sentido, no se observ expresin de
Thpg1 cuando se aadi glucosa al 2% al medio de cultivo. No obstante, tampoco se
Discusin
121
detect expresin del gen cuando el hongo se cultiv en un medio mnimo con ausencia
de glucosa, por lo que no parece que la represin por glucosa sea un mecanismo de
regulacin de este gen a pesar de que en su promotor se detectaron tres motivos
relacionados con la unin de protenas implicadas en la represin catablica (Cre1).

A pesar de que en la mayora de los promotores de estos genes se localiza la
secuencia consenso (5-GCCARG-3) que es reconocida por el factor de transcripcin
PacC, implicado en la regulacin de genes por pH (Tilburn y col., 1995), como ocurre
en hongos como Aspergillus spp. (De Vries y Visser, 2001), B. cinerea (Wubben y col.,
2000), S. sclerotiorum (Rollins y Dickman, 2001) o F. oxysporum (Caracuel y col.,
2003), no se encontr ninguna secuencia similar en el promotor de Thpg1. En este
estudio se analiz la expresin del gen Thpg1 slo a pH 5,5. Por tanto, no puede
concluirse que no exista una regulacin de este gen por pH nicamente por la ausencia
de este motivo en el promotor.

Otra secuencia localizada en el promotor de Thpg1, que est presente en la
mayora de genes relativos a estas enzimas y, a su vez, en los genes que codifican
CWDEs de Trichoderma spp., es la caja CCAAT a la que se une un complejo trimrico,
Hap2/3/5 (Zeilinger y col., 2001). La funcin de este complejo se ha estudiado en la
expresin de genes como la acetamidasa de Aspergillus spp. (De Vries y Visser, 2001) y
tambin, en los promotores de otras CWDEs como xilanasas o celulasas de
Trichoderma (Mach y Zeilinger, 2003). En este ltimo se ha visto que el complejo
trimrico estara implicado en el aumento de la expresin de estos genes. Por ejemplo,
se ha visto que una mutacin en la secuencia CCAAT del gen que codifica la
celobiohidrolasa II (cbh2) de T. reesei, provocaba una reduccin en su expresin
(Zeilinger y col., 2001). No obstante, no existen estudios sobre la importancia de estos
motivos CCAAT en la regin promotora de genes que codifican endoPGs.

Tambin se encontraron tres secuencias 5-HGATAR-3, a la que se unen
factores de transcripcin como AreA o Nit2, relacionados con el metabolismo del
nitrgeno, en A. nidulans y N. crassa, respectivamente (Ravagnani y col., 1997), y que
regulan la utilizacin de ese compuesto en respuesta a los niveles extracelulares de
glutamina. Sin embargo, los resultados obtenidos en el estudio de expresin de Thpg1
no permiten determinar si las condiciones con dficit de nitrgeno participan en la
regulacin de la expresin del gen.

Otra secuencia localizada en el promotor de Thpg1 fue CCCTGA, presente en
los promotores de muchos genes pectinolticos y que podra participar en su regulacin.
A pesar de que no se ha estudiado en detalle su funcin, se cree que esta secuencia, est
implicada en la activacin de endoPGs de A. niger (De Vries y col., 2002).

Otros dos elementos cis localizados en el promotor del gen Thpg1 fueron la
secuencia consenso 5-CATTCY-3, de unin del factor AbaA, que pertenece a la
Discusin
122
familia de motivos TEA/ATTS (Adrianopoulos y Timberlake, 1994), y la secuencia
consenso 5-WN
(1,2)
AAN
(1,2)
A-3, de unin del factor Ste12 (Mead y col., 2002). El
estudio del promotor de la endoPG Clpg2 de C. lindemuthianum revel la presencia de
estos dos elementos cis dispuestos en tandem, que parecen estar implicados en el
crecimiento del hongo, tanto en condiciones saprofticas en un medio con pectina, como
en condiciones de patognesis, durante el desarrollo del apresorio (Herbert y col., 2002).
A pesar de que estas dos secuencias no se localizaron en tandem en el promotor de
Thpg1, no disponemos de datos para valorar hasta que punto puede ser importante esta
disposicin.

Otro factor a tener en cuenta en los estudios expresin de Thpg1 es el tiempo de
induccin del gen. En el caso de hongos patgenos que presentan familias de endoPGs,
es evidente que la expresin de sus genes es diferencial en el tiempo, es decir, el
organismo producira las endoPGs de manera secuencial, adaptndose a las condiciones
del medio (Cotton y col., 2003; Li y col., 2004). As, por ejemplo, la endoPG de C.
lindemuthianum, CLPG1, se expresa a las 12 horas en un medio con pectina como
fuente de carbono, siendo funcional durante la etapa saproftica del hongo (Centis y col.,
1997). Por otro lado, la familia de genes de endoPGs de B. cinerea se expresan en hojas
de juda dentro de las primeras 24 horas post-inoculacin, pero en hojas de tomate hay
endoPGs que se expresan a las 120 horas post-inoculacin (ten Have y col., 2001). El
nivel ms alto de expresin observado en Thpg1 ocurri tras 24 horas de crecimiento
del hongo en presencia de pectina al 0,5%, tiempo bastante largo si consideramos que
Trichoderma es un hongo saprofito y que estas enzimas deberan abrir camino a otras en
el proceso de degradacin del material vegetal.

Est claro que la regulacin de las endoPGS es muy compleja y est sometida a
ms mecanismos que una simple represin por glucosa o una induccin por sustrato. La
presencia de los motivos de regulacin en su regin promotora, anteriormente citados,
apoyaran la hiptesis de que la regulacin de las endoPGs estara determinada por una
compleja red de seales que se activaran en funcin de la etapa de vida del hongo
(parastica o saproftica) que, a su vez, depende de las condiciones del medio. El anlisis
de numerosas endoPGs ha permitido determinar la especializacin funcional de estas
enzimas, de tal manera que algunas podran estar destinadas a la obtencin de nutrientes
durante el crecimiento saproftico, mientras que otras podran contribuir en los procesos
de patognesis del hongo. En este sentido, la endoPG pppg1 de P. parasitica se expres
mucho ms en una interaccin in vivo con plantas de tomate que en presencia de pectina
al 0,1% (Yan y Liou, 2005) hecho que estara ms relacionado con procesos de
patognesis. Sin embargo, la endoPG Thpg1 de T. harzianum, que mostr in vitro
mayor expresin en pectina 0,1 0,5% que en presencia de plantas de tomate, estara
ms relacionada con procesos saprofticos del hongo.

La traduccin de la ORF del gen, 1143 pb, di una secuencia de 380
aminocidos que correspondan a una protena de un peso molecular terico de 38,29
Discusin
123
kDa y un punto isoelctrico terico (pI) de 5,02. Estas caractersticas son similares a las
observadas en las endoPGs de otros hongos (Annis y Goodwin, 1997). Se llev a cabo
un anlisis in silico.de la protena ThPG1, que determin una ubicacin extracelular con
una probabilidad de un 56%, y adems se detect un pptido seal en las posiciones 21-
22, lo que estara de acuerdo con el carcter de enzima secretada al medio tras su
procesamiento y, que apoyara, los resultados obtenidos con la enzima ThPG1 en el
anlisis protemico, en el que se detecta actividad endopoligalacturonasa en varios de
los sobrenadantes procedentes de cultivos de Trichoderma (resultados que se discutirn
ms adelante). En general, la presencia de pptido seal se ha relacionado con la
hidrofobicidad de la protena (Matoba y Ogrydziak, 1998). En el perfil hidroptico de
ThPG1 que se muestra en la Figura 18, se observa un marcado carcter hidrofbico al
principio de la secuencia aminoacdica. Se ha comprobado que la mayora de las
endoPGs se secretan como precursores, presentando una secuencia de 20 a 40
aminocidos, cuyo tamao depende de la presencia o no de un prepro-pptido (Annis y
Goodwin, 1997). En este sentido, se han descrito tamaos de pptido seal similares al
observado en ThPG1 para PpPG1 de P. parasitica (Yan y Liou, 2005) o PGAII de A.
niger (Bussink y col., 1990). Tambin hay endoPGs que presentan un prepro-pptido,
una secuencia de corte entre el pptido seal y el sitio de inicio de la protena madura,
como es el caso de PGAII de A. niger, con un sitio de corte para proteasas de tipo
tripsina en el aminocido 27 (Bussink y col., 1990). En la secuencia de ThPG1 no se
observ sitio de corte para este tipo de proteasas.

El tamao terico de la protena madura ThPG1 es de 359 aminocidos, con un
peso molecular de 36,2 kDa y un pI de 4,71. Este valor estara muy por encima de los
31 kDa obtenidos para las dos nicas isoenzimas de una endoPG de T. harzianum, PGI
y PGII, purificadas hasta la fecha (Mohamed y col., 2006). Estos autores obtuvieron
este valor de peso molecular tanto a partir de filtracin en gel como de una
electroforesis en condiciones desnaturalizantes (SDS-PAGE). En el presente trabajo, a
pesar de que no trabajamos con la enzima ThPG1 purificada, determinamos mediante
SDS-PAGE un peso molecular aproximado de 29 kDa. Por otro lado, un valor de
aproximadamente 28 kDa se obtuvo a partir del proteoma (2D-SDS-PAGE) intracelular
que se realiz para la interaccin T. harzianum-tomate-patgeno. El valor de 29 kDa
est ms prximo a los 31 kDa obtenidos para PGI y PGII que al valor terico de 36,2
kDa deducido tras el anlisis in silico. Sin embargo, no deja de resultar extrao que el
valor experimental sea ms bajo que el obtenido para el peso molecular terico de la
protena, ya que si nos atenemos a los datos existentes en bibliografa, los valores de
peso molecular experimental suelen ser muy superiores a los tericos debido a las
modificaciones post-traduccionales. As ocurre en las endoPGs de Aspergillus kawachii
(Contreras-Esquivel y Voget, 2004), o la PpPG1 de P. parasitica que presenta un valor
terico de 39,7 kDa y un valor experimental de 48 kDa (Yan y Liou, 2005). Incluso en
una exoPG de C. carbonum el peso molecular terico de 48 kDa pasa a 60 kDa con los
datos experimentales (Scott-Craig y col., 1998).

Discusin
124
Particularmente, para dos isoenzimas de una endoPG de T. reesei (Mohamed y
col., 2003), el tamao de la protena fue aproximadamente de 66 kDa, tanto a partir de
datos SDS-PAGE como de filtracin en gel, mientras que el valor terico fue de 38,3
kD (Mohamed y col., 2003). La glicosilacin explicara perfectamente esa diferencia de
tamao en el peso de las protenas de T. reesei ya que sta provoca un aumento del
tamao molecular mayor que cualquier otra modificacin post-traduccional, que slo
llegara a los 200 Da por sitio (Xie y col., 2005). Sin embargo, resulta extrao la
coincidencia en el valor obtenido a partir de dos tcnicas tan dispares como SDS-
PAGE, condiciones desnaturalizantes, y filtracin en gel, si consideramos otros estudios
realizados con otras hidrolasas de Trichoderma (Montero y col., 2005; Sanz y col.,
2005).

Se llev a cabo un alineamiento de ThPG1 con secuencias depositadas en bases
de datos con las que esta protena mostr un mayor nivel de similitud, siendo muchas de
ellas endoPGs y endoPGs hipotticas resultantes de proyectos de secuenciacin. Se
observaron las regiones conservadas de estas protenas, descritas en bibliografa (Van
Santen y col., 1999), con los residuos Asn
194
, Asp
196
, Asp
217
, Asp
218
, His
239
y Gly
240
,
que estaran implicados en la hidrlisis del sustrato, y los residuos Arg
272
y Lys
274
, que
estaran implicados en la unin al sustrato. Tras el alineamiento, la mayor variabilidad
entre endoPGs, se observ en la regin correspondiente al pptido seal.

Por otro lado, el anlisis in silico de la topologa de ThPG1 determin la
presencia de un dominio glicoslico que se extenda desde la posicin 59 hasta el final
de la protena. Las endoPGs pertenecen a la familia 28 de las glicosil hidrolasas que
muestran una estructura tpica en hlice paralela dextrgira, caracterstica de las
enzimas que degradan la pectina (Herron y col., 2000). A partir del anlisis de endoPGs
cristalizadas, como la PGAII de A. niger, se ha determinado que la hlice se compone
de cuatro lminas paralelas (van Santen y col., 1999). Esta disposicin coincide con
los resultados obtenidos en el analisis in silico de la estructura secundaria de ThPG1 en
la que predominan las lminas frente a tres hlices , dos de ellas localizadas en el
extremo amino-terminal (Figura 19). Adems, el modelo tridimensional obtenido para
la protena ThPG1 se ajusta a los obtenidos para otras endoPGs (Pickersgill y col.,
1998; van Santen y col., 1999; Federici y col., 2001; Bonivento y col., 2008). Una
comparacin de la estructura terciaria de ThPG1 con la estructura cristalizada de la
endoPG de Colletotrichum lupini (2iQ7_A) mostr una similitud del 54,4% (Figura 21),
presentando la tpica disposicin en hlice (en amarillo), aunque no se puedan
apreciar las cuatro lminas y los diez giros completos que forman, y los aminocidos
que constituyen el centro cataltico situados en la hendidura que se forma en la parte
exterior de la hlice (lnea roja).

Para determinar la relacin de Thpg1 con otros genes que codifican endoPGs y
que estn depositados en bases de datos, se realiz un anlisis filogentico.
Inicialmente, la secuencia Thpg1 se aline con las secuencias de otros genes que
Discusin
125
codifican endoPGs y endoPGs hipotticas de hongos ascomicetos y basidiomicetos, de
plantas y de un oomiceto. Tambin se incluy la secuencia de un gen que codifica para
una exoPG hipottica de T. reesei. En el rbol neighbour-joining, basado en distancias,
Thpg1 se localiz junto a una endoPG hipottica de T. virens, formando un subgrupo
soportado por una estabilidad bootstrap del 100%. El conjunto de secuencias se
agruparon de un modo similar al observado en un estudio realizado con 115 PGs
(Markovic y Janecek, 2001), donde el agrupamiento reflejaba las relaciones evolutivas
de los diferentes grupos de organismos. De esta manera, quedaban separados
basidiomicetos, ascomicetos, plantas y oomicetos. Particularmente, la secuencia del gen
que codifica la exoPG hipottica qued separada del resto de endoPGs y ms prxima al
grupo de las plantas. Esta ubicacin podra ser demostrativa del diferente papel
biolgico de estas enzimas respecto a las endoPGs fngicas.

Con objeto de conocer el nmero de copias de Thpg1 en el genoma de T.
harzianum T34, a la vez que explorar la presencia de genes homlogos en otras especies
de Trichoderma representantes de la diversidad gentica existente en este gnero, se
realiz un anlisis tipo Southern. Se incluyeron en el estudio cepas de especies
relacionadas con el biocontrol como T. asperellum (T25), T. atroviride (T11), T.
harzianum (T22 y T34) y T. virens (T59), as como, una cepa de T. longibrachitum
(T52) no relacionada con el control biolgico (Hermosa y col., 2004). Para el anlisis se
utilizaron dos enzimas de restriccin diferentes, BamHI, con un sitio de corte en la
secuencia de Thpg1, y XhoI, sin diana en el gen. El patrn de bandas de hibridracin
observado en la cepa T34 indic que el gen se encuentra como copia nica. En este
sentido, se ha descrito que Fusarium moniliforme presenta una copia nica de un gen
que codifica una endoPG (Caprari y col., 1993), aunque la mayora de los hongos
contienen familias multignicas en su genoma (Fraissinet-Tachet y col., 1995; Wubben
y col., 1999; Gtesson y col., 2002). En las condiciones restrictivas en las que se realiz
la hibridacin (65C) tambin se observ una seal en los carriles que contenan ADN
digerido con XhoI o BamHI de las cepas T11, T22, T25 y T59, pero no se observ seal
en el ADN de T52 digerido con BamHI. Considerando la banda observada en el carril
que contena el ADN de T52 digerido con XhoI y la presencia de un gen homlogo en el
genoma, disponible on line, de T. reesei que es una especie filogenticamente muy
prxima a T. longibrachiatum (T52), parece lgico pensar que la ausencia de banda en
el carril que contena el ADN digerido con BamHI sea debido a la degradacin, y que la
banda que aparece al digerir con XhoI sea por la presencia de un gen homlogo en T52.

En estos momentos, los genomas de algunas cepas de las especies T. reesei, T.
virens y T. atroviride estn disponibles on line. Se realizaron anlisis tipo BlastX con la
secuencia del gen Thpg1 en esas bases de datos. En T. virens aparecieron tres secuencias
que presentaron homologa con el gen Thpg1: una secuencia de 1380 pb que contena 4
intrones y una homologa del 84%; otra secuencia con un tamao de 1087 pb y un nico
intrn, di una homologa del 56% con Thpg1 y del 71% con una endoPG del hongo
fitopatgeno C. lindemuthianum (Clpg1); y, una secuencia de 1595 pb, con cuatro
Discusin
126
intrones, que mostr homologa con una exoPG de F. oxysporum. En T. reesei, dos
secuencias mostraron homologa con Thpg1: una de 1381 pb y 4 intrones di un 85%, y
otra de 1218 pb di un 43%. Por ltimo, en T. atroviride, aparecieron 5 secuencias con
tamaos comprendidos entre 1100 y 1600 pb, conteniendo entre 1 y 6 intrones, y
homologas entre 78 y 91%. Se realiz un alineamiento con todas estas secuencias
(datos no mostrados), la secuencia de Thpg1, y el resto de secuencias utilizadas en el
estudio filogentico cuyos resultados aparecen en la Figura 22. El rbol NJ mostr que
tres secuencias de aproximadamente 1300 pb y con 4 intrones, una de T. virens, una de
T. atroviride y una de T. ressei, quedaban agrupadas con el gen Thpg1 de T. harzianum
con un valor bootstrap de 100. Dos secuencias, una de T. virens y otra de T. atroviride,
de unos 1100 pb que contenan slo un intrn se agruparon juntas, con un valor
bootstrap de 100, y se situaron ms prximas a la secuencia de F. oxyysporum que a
Thpg1. Dos secuencias de T. atroviride y una de T. virens se agruparon con la del gen
que codifica una exoPG hipottica de T. reesei. Sin embargo, dos secuencias, una de T.
reesei y otra de T. atroviride, que presentaron homologa con genes que codifican
exoPGs quedaron localizadas entre las endoPGs fngicas y las de plantas.

Teniendo en cuenta que habamos detectado, mediante un anlisis Southern, que
Thpg1 se encuentra en copia nica en el genoma de T. harzianum T34, y considerando
el nmero de secuencias que mostraron homologa con Thpg1 en las especies de
Trichoderma cuyos genomas estn disponibles on line, podramos pensar que hay una
nica copia para el gen que codifica la endoPG en T. reesei y de dos genes en el caso de
T. virens y T. atroviride. Si adems consideramos que en el ADN de cepas de estas dos
ltimas especies se observ una nica banda de hibridacin en el Southern, realizado
bajo condiciones restrictivas y usando como sonda el gen Thpg1, estaramos en
condiciones de deducir que slo un gen homlogo a Thpg1 y en copia nica estara
presente en el genoma de las especies T. virens y T. atroviride. Sin embargo, la
presencia en los genomas de estas dos especies de dos secuencias con alta homologa
con Thpg1 indicara la existencia de, al menos, otro gen que codifica una endoPG en
esas cepas.

Por otro lado, dos isoenzimas endoPG se han purificado en T. reesei (Mohamed
y col., 2003), este resultado tomado junto a los ya discutidos anteriormente, nos llevara
a pensar que la existencia de esas dos izoenzimas es debida a modificaciones post-
traduccionales y no a la presencia de dos genes que codifican endoPGs. Tambin se han
purificado dos isoenzimas en T. harzianum (Mohamed y col., 2006), por lo que
podramos llegar a la misma conclusin que con T. reesei para el gen Thpg1.

Con el fin de determinar una actividad endopoligalacturonasa se utilizaron los
sobrenadantes recogidos tras incubar la cepa T34 en aquellas condiciones de cultivo en
las que se haba observado expresin del gen Thpg1. Inicialmente, las muestras se
dializaron para descartar los restos de sales del medio de cultivo, as como para eliminar
los restos de azcares o molculas de tamao inferior a 10 kDa producidas durante el
Discusin
127
crecimiento del hongo, que podran interferir en la deteccin de la actividad. Puesto que
no disponamos de la enzima purificada y que son numerosas las enzimas que pueden
actuar sobre la pectina (Willats y col., 2001), necesitbamos aplicar un mtodo que nos
permitiera descartar la accin de otras enzimas con actividad pectinasa. Para ello,
utilizamos como sustrato PGA de naranjo no esterificado (cido pctico), de tal manera
que restringimos la actividad a enzimas exo, endoPGs y pectato liasas, aunque estas
ltimas requieren el in calcio para actuar por lo que su accin se vera limitada por la
presencia o no de las cajas de huevo en el sustrato utilizado (Herron y col., 2003).

En un primer ensayo de actividad realizado en un medio slido conteniendo
PGA al 0,2%, los extractos dializados de T. harzianum T34, crecido durante 24 horas en
MM sin glucosa y suplementado con pectina al 0,5%, producan un halo de lisis. Esta
condicin de crecimiento del hongo era, a su vez, la que produca mayores niveles de
expresin del gen. Este ensayo en el que los resultados se leen como halos de lisis se
us en otros trabajos para medir la actividad endopoligalacturonasa (Scott-Craig y col.,
1990; Gognies y col., 1999). Los halos observados con los extractos de la cepa T34
crecida en las condiciones arriba mencionadas nos permiten confirmar la naturaleza
endopoligalacturonsica de esta enzima, aunque no debemos olvidar que al trabajar con
un extracto proteico crudo habr otras pectinasas, como las exoPGs o las pectato liasas,
que estarn contribuyendo tambin a esa actividad. El resto de sobrenadantes obtenidos
tras crecer la cepa T34 en condiciones donde se observ expresin de Thpg1, no
produjeron halos de lisis en este ensayo. La falta de correlacin entre expresin y
actividad no sera tal, considerando que el nivel de expresin del gen en el cultivo de la
cepa T34 en un medio con pectina al 0,5% fue casi cuatro veces superior al nivel
observado en un medio que contena PGA al 0,5%, pudiendo deberse a que la
acumulacin de la protena en esas condiciones de crecimiento no era suficiente como
para poder detectarla en este ensayo.

En los sobrenadantes utilizados en el ensayo de halos de lisis, se analiz la
actividad especfica, utilizando tambin PGA como sustrato. De igual manera,
solamente se detect actividad especfica cuando el hongo se cultiv durante 24 horas
en un MM, sin glucosa, suplementado con pectina al 0,5% (5,08 U/mg). En una muestra
obtenida tras cultivar la cepa T34 en las condiciones antes mencionadas pero durante 36
horas se detect una actividad especfica de 3,38 U/mg. Este ltimo resultado, nos hace
suponer que el pico ms alto de expresin del gen Thpg1 se producira tras 24 horas de
incubacin.

Si suponemos la presencia en el genoma de T. harzianum T34 de otras endoPGs,
exoPGs o pectato liasas con capacidad para hidrolizar PGA, la duda que se plantea,
considerando los resultados obtenidos en los dos ensayos de actividad realizados, es
por qu no se detecta actividad en otras condiciones de crecimiento del hongo usadas
en el estudio?. Una posible explicacin sera que las condiciones utilizadas en estos
ensayos (sustrato y tiempo) no fueran las adecuadas para la expresin de estos genes.
Discusin
128

Una vez analizada la expresin del gen Thpg1 en un sistema in vitro, se abord
su estudio en un sistema de interaccin in vivo con tres componentes: Trichoderma-
planta-patgeno. Previamente, habamos observado que el nivel de expresin de Thpg1,
tras crecer el hongo in vitro con planta de tomate al 1%, era relativamente bajo, por lo
que no result sorprendente que la seal observada en el anlisis tipo Northern del
sistema de tres componentes, fuera tan baja (se detect seal despus de una exposicin
de ms de 72 horas). No obstante, la expresin del gen fue mayor cuando haba un
patgeno en el sistema (Figura 27) y, particularmente, con un patgeno de raz como el
oomiceto P. ultimum. El hecho de que se detectara ms expresin en las dos
condiciones en las que un patgeno estaba presente que en la condicin control (planta
de tomate-Trichoderma), puede ser indicativo de que de alguna manera los patgenos
estaran afectando a la expresin del gen Thpg1.

Por un lado, podra pensarse que las pectinasas de los patgenos estaran
metabolizando la pectina de la planta y, a su vez, los compuestos liberados actuaran
como inductores de la expresin de Thpg1 en mayor grado que con la planta sola. Y por
otro, que fuera el propio patgeno el que indujera la expresin del gen Thpg1. No
obstante, en este ltimo supuesto no se detectaron secuencias relacionadas con
micoparasitismo en la regin promotora del gen y en la pared de los patgenos no
habra componentes que pudieran inducir a nivel de sustrato la expresin de una
endoPG.

Una de las herramientas desarrolladas dentro del proyecto TrichoEST, para el
anlisis de la funcin gnica, fue la puesta a punto del anlisis protemico en sistemas
de dos y tres componentes (Surez y col., 2005; Marra y col., 2006; Seidl y col., 2006).
Con esta metodologa disponible, se decidi comprobar los resultados obtenidos en el
anlisis Northern desde el punto de vista protemico, a la vez que obtendramos una
visin global del proteoma de T. harzianum T34 en un sistema de tres componentes:
Trichoderma-planta-patgeno. El estudio se complet con la introduccin en el sistema
de un patgeno foliar, como es B. cinerea, para comprobar si la mayor expresin
detectada en el Northern para los patgenos de raz, guardaba relacin con el anlisis
protemico o, por el contrario, se trataba de una respuesta independiente del modelo de
patosistema, rizosfera o filoplano, elegido para realizar el ensayo.

Un total de 360 spots diferenciales se obtuvieron en el proteoma de T.
harzianum T34 cuando estuvo en contacto con la planta de tomate y cada uno de los tres
patgenos (datos no mostrados). Con respecto a los patgenos de raz, R. solani y P.
ultimum, el proteoma de la cepa T34 gener 101-105 spots up-regulated y 10-17 spots
down-regulated. Por el contrario, el patgeno foliar, B. cinerea, slo produjo 46 spots
up-regulated, pero lleg a alcanzar los 26 spots down-regulated. Estos datos son
indicativos de que el proteoma de Trichoderma sufre mayores cambios cuando los
patgenos de raz interaccionan con la planta. Uno de los spots que apareci up-
Discusin
129
regulated, fue el 0303, precisamente el correspondiente a la EST 10663. Este spot
mostr ms intensidad de seal en un sistema de tres componentes, presencia del hongo
patgeno, la planta y la cepa T34 de T. harzianum, que cuando se trataba de un sistema
de dos componentes, planta-cepa T34. Tambin, se detect mayor seal en presencia de
los dos patgenos de raz, siendo a su vez, el valor 2,1 veces mayor para R. solani. Los
resultados obtenidos no fueron exactamente coincidentes con los obtenidos en el
Northern, tal vez, por trabajar por dos vas de anlisis diferentes, protenas y
mensajeros.

A pesar de que los resultados obtenidos en ambos anlisis (proteoma y Northern)
con relacin a los patgenos R. solani y P. ultimum, no fueron coincidentes sobre quin
produca una mayor expresin del gen, si reflejaran la importancia que tiene la
presencia de un patgeno en la expresin de Thpg1.

Los datos discutidos en este captulo indicaran que ThPG1 de T. harzianum T34
est relacionada directamente con la utilizacin de material vegetal en su crecimiento
saproftico. Por otro lado, la obtencin y anlisis de mutantes silenciados (resultados y
discusin en los Captulos 2 y 3), as como de plantas que sobreexpresan Thpg1
(resultados y discusin en el Captulo 4), han permitido profundizar en el estudio de la
relacin de este gen con la planta.






















































Captulo 2: SILENCIAMIENTO DE LA EXPRESIN
DEL GEN Thpg1 EN T. harzianum T34































RESULTADOS







Resultados
132





1. TRABAJO PREVIO


El mtodo utilizado para analizar funcionalmente el gen Thpg1 de T. harzianum
T34 fue el silenciamiento gnico por interferencia de ARN. Para ello, se utiliz el
plsmido pSIL proporcionado por la Dra. Sonia Sousa de la Universidad de Sevilla,
quien demostr que este tipo de construcciones que codifican horquillas de ARN
autocomplementarias (self-complementary hairpin RNA hpRNA) podan ser una
alternativa eficaz en aquellos organismos en los que resulta difcil la obtencin de
mutantes nulos mediante interrupcin gnica, como es el caso de T. harzianum T34.


2. OBTENCIN DE CEPAS DE T. harzianum T34 QUE SILENCIAN EL GEN
Thpg1


Para obtener cepas de T. harzianum T34 que silencian el gen que codifica la
protena ThPG1 de esta misma cepa, se llev a cabo una transformacin homloga con
el plsmido pJL43b1-Thpg1. De manera resumida, se utiliz el plsmido pSIL para
clonar, en orientaciones invertidas, un fragmento del gen Thpg1 de T. harzianum T34.
El cassette de expresin de este plsmido se clon en el vector pJL43b1 para
transformar los protoplastos. El proceso detallado de construccin de este plsmido se
recoge en el apartado 6.1 de Materiales y Mtodos.

El protocolo de obtencin de protoplastos y permeabilizacin de los mismos
(Cardoza y col., 2006b) se detalla en el apartado 7.2 de Materiales y Mtodos. En la
transformacin se utilizaron 10 g del vector, previamente linearizado con KpnI para
facilitar su integracin en el genoma del hongo. Los 16 transformantes obtenidos se
confirmaron tras sucesivas rondas de crecimiento, en medio TSA selectivo (200g/mL
de fleomicina) y no selectivo. Finalmente, se seleccionaron nueve transformantes para
estudios posteriores.





Resultados
133
3. CARACTERIZACIN DE LAS CEPAS TRANSFORMADAS CON pJL43b1-
Thpg1


3.1. Comprobacin y seleccin de los transformantes

En primer lugar, se analiz la integracin del vector pJL43b1-Thpg1 en el
genoma de T. harzianum T34. Para ello, se extrajo ADN genmico de la cepa T34 y de
nueve transformantes, denominados ePG1 hasta ePG9, y se realiz una PCR para
comprobar si llevaban el cassette de expresin. Se utilizaron los oligonucletidos Int-F
y Tcbh2, que amplificaron un fragmento de 1239 pb correspondiente a: parte del intrn,
fragmento invertido del gen Thpg1 y parte del terminador del gen de la celobiohidrolasa
2 (cbh2) de T. reesei T59. La PCR result positiva para siete de los nueve
transformantes (Figura 29).










Figura 29. Productos de PCR obtenidos a partir de amplificaciones de ADN genmico de
T. harzianum T34 (carril 10) y de nueve cepas transformantes (carriles 1 al 9) con los
oligos IntF y Tcbh2: M: marcador X DNA ladder (Roche).


Un criterio para reducir el nmero de transformantes con los que llevar a cabo
los siguientes estudios, fue analizar su comportamiento frente a R. solani en cultivo
dual. En este ensayo solo el transformante ePG8 mostr, en un anlisis visual, un
crecimiento diferencial con respecto a la cepa silvestre T34. Adems de este
transformante se seleccionaron otros tres que no mostraron diferencias.

Con los cuatro transformantes seleccionados se realiz un estudio de la actividad
endopoligalacturonasa, como se indica en el apartado 12.4.2 de Materiales y Mtodos,
para determinar el grado de silenciamiento de estos transformantes. Para ello, se
cultivaron los transformantes ePG4, ePG5, ePG6 y ePG8 y la cepa silvestre T.
harzianum T34 en un MM (Penttil y col., 1987) suplementado con pectina al 0,5%, por
ser esta la condicin en la que se haba detectado mayor expresin del gen Thpg1.

Resultados
134
Como se muestra en la Figura 30 la actividad endopoligalacturonasa se vi
claramente reducida en los cuatro transformantes seleccionados, obtenindose la menor
actividad especfica en el transformante ePG5, con una disminucin de un 91,14%,
respecto a la cepa silvestre T34.















Figura 30. Actividad endopoligalacturonasa especfica (U/mg protena total)
analizada en los sobrenadantes de la cepa silvestre T34 y los transformantes
silenciados ePG4, ePG5, ePG6 y ePG8, despus de 24 horas de crecimiento en
un MM (Penttil y col., 1987) suplementado con pectina al 0,5%. Cada valor
es la media de tres medidas + la desviacin estndar.


Los transformantes ePG5, ePG6 y ePG8, al presentar los niveles ms bajos de
actividad endopoligalacturonasa, se seleccionaron para posteriores estudios.

3.2. Confirmacin de los transformantes: anlisis tipo Southern

Una vez seleccionadas las cepas transformadas con las que se iba a realizar el
resto de estudios, se realiz un anlisis tipo Southern para conocer el nmero de copias
que se haba integrado en el genoma de las cepas transformadas. Se digirieron 10 g de
ADN de cada cepa con SacI, que corta dos veces en el vector de expresin, liberando un
fragmento de 3 kb, adems en la secuencia de Thpg1 no existe diana para esta enzima.
Se us como sonda la secuencia completa del gen Thpg1, marcada radiactivamente con
32
P. Se confirm que esas tres cepas eran transformantes y que junto a la banda
correspondiente al gen endgeno de la cepa T. harzianum T34, se haba integrado una
sla vez el cassette de transformacin (Figura 31). En el transformante ePG8 apareci
una banda adicional de aproximadamente 2,5 Kb que podra corresponder a una
integracin truncada del cassette de expresin.

Resultados
135







Figura 31. Anlisis tipo Southern del gen Thpg1 en
T. harzianum T34 (1) y en los transformantes ePG5
(2), ePG6 (3) y ePG8 (4). El ADN genmico fue
digerido con SacI, la hibridacin se realiz en
condiciones restrictivas y como sonda se utiliz la
secuencia completa del gen Thpg1. M: marcador
/HindIII.










3.3. Anlisis de la expresin de Thpg1 en los transformantes seleccionados

El siguiente objetivo fue conocer si la introduccin de la horquilla del fragmento
de Thpg1 autocomplementaria en el genoma de T. harzianum T34, daba lugar a una
disminucin en la expresin del gen Thpg1, y con ello, confirmara el resultado
obtenido en el ensayo de actividad realizado anteriormente. Para ello, se realiz una
Real-time PCR (como se indica en el apartado 10.3.5 de Materiales y Mtodos) con el
ARN total que se extrajo de micelios obtenidos tras cultivar la cepa silvestre T34 y los
tres transformantes silenciados, en la condicin de crecimiento que ms expresin del
gen Thpg1 se haba detectado: MM (Penttil y col., 1987), sin glucosa, suplementado
con pectina al 0,5% y durante 24 horas.

El ARN total se retrotranscribi utilizando oligo(dT)
15
(como se indica en el
apartado 10.3.4. de Materiales y Mtodos). El ADNc as generado se utiliz como
molde en diferentes reacciones de PCR. Los oligonucletidos endop-1 y endop-5,
utilizados para comprobar el silenciamiento del gen Thpg1, se disearon sobre una zona
que no haba sido utilizada en la construccin del plsmido pJL43b1-Thpg1. Como
control interno se utiliz el gen de la -actina, usando los oligonucletidos act-1 y act-2.
La especificidad de los productos de PCR se confirm mediante electroforesis en un
Resultados
136
gel de agarosa, obtenindose un fragmento de 425 pb para el gen Thpg1, y de 407 pb
para el gen de la -actina.

Los resultados obtenidos se muestran en la Tabla 10.


Tabla 10. Valores de crossin points (CP) y de eficacia de la Real Time (E), junto con los niveles de
expresin relativa de los genes Thpg1 y -actina en la cepa T34 y tres transformantes silenciados en el
gen Thpg1 (ePG5, ePG6 y ePG8).
CP E Ratio
a

Thpg1 -actina Thpg1 -actina
T34 28,55 + 0,02 27,42 + 0,07 1,68 + 0,04 1,75 + 0,10
ePG5 36,96 + 0,97 27,06 + 0,12 1,84 + 0,00 1,76 + 0,00 0,006 + 0,003
b

ePG6 39,01 + 0,26 24,85 + 0,64 2,12 + 0,03 1,76 + 0,06 0,010 + 0,005
b

ePG8 33,49 + 0,80 26,83 + 0,62 1,64 + 0,13 1,79 + 0,07 0,071 + 0,029
b

a
Ratio=(E
target
)
CPtarget(control-sample)
/ (E
ref
)
CPref(control-sample)
b
Valores obtenidos a partir de los datos CP y E de los transformantes silenciados y la cepa T34

Los transformantes ePG5, ePG6 y ePG8 analizados, mostraron niveles de
expresin, en el gen Thpg1, menores que los obtenidos para la cepa silvestre T34 siendo
167, 100 y 14 veces inferiores, respectivamente.

3.4. Ensayos de crecimiento en placa

Con objeto de analizar si el silenciamiento del gen Thpg1 afectaba a su
capacidad de crecimiento en un medio con pectina, se realiz un ensayo de crecimiento
en placa, tal y como se describe en el apartado 13.1 de Materiales y Mtodos. Los
resultados se muestran en la Figura 32.

El crecimiento de T. harzianum T34 y el silenciado ePG5 fue similar tanto en el
medio control de PDA, como en el MM con glucosa al 0%. En cambio, en el MM
suplementado con pectina al 0,5% se observ un menor crecimiento del transformante
silenciado. Esta diferencia fue estadsticamente significativa despus de analizar los
datos mediante el test de Fisher.




Resultados
137













Figura 32. Crecimiento de la cepa silvestre T. harzianum T34 y el silenciado
ePG5 en un MM suplementado con pectina al 0,5%. Como controles se utiliz
el crecimiento de ambas cepas en los medios PDA y MM, sin glucosa,
(Penttil y col., 1987). Cada valor es la media de tres medidas + la desviacin
estndar.
























































DISCUSIN






Discusin
139





El silenciamiento gnico por interferencia de ARN ha experimentado un gran
desarrollo desde su primera descripcin, a principios de los aos noventa, en diferentes
organismos eucariotas (Napoli y col., 1990; Romano y Macino, 1992), convirtindose
en una alternativa real para el anlisis funcional de genes en aquellos organismos en los
que resulta difcil la obtencin de mutantes nulos mediante interrupcin gnica.

Adems de N. crassa, que constituye el hongo modelo en el que se han
analizado los mecanismos genticos y bioqumicos de este fenmeno, otros estudios se
han basado principalmente en patgenos, ya sea de plantas como M. oryzae (Kadotani y
col., 2003) y Venturia inaequalis (Fitzgerald y col., 2004) o de humanos como C.
neoformans (Liu y col., 2002) y A. fumigatus (Mouyna y col., 2004). En estos estudios
se ha demostrado la existencia de interferencia por ARN y su eficacia en la obtencin de
mutantes con menor expresin gnica.

Con objeto de asignar funcin al gen Thpg1 de T. harzianum T34 se obtuvieron
transformantes en los que este gen estaba silenciado. Aunque la forma ms adecuada
para asignar funcin a un gen pasa por la disrupcin gnica, en Trichoderma, la
frecuencia de recombinacin homloga es muy baja y adems vara segn la cepa
(Mach y Zeilinger, 1998). Hasta el da de hoy, hay referencias de interrupcin gnica en
las especies de T. harzianum, T. virens, T. atroviride y T. reesei. En todos los trabajos se
utiliz una extensa regin de ADN genmico (ms all de la zona codificante por ambos
extremos) para favorecer la recombinacin homloga del cassette de interrupcin en el
locus de destino (Zeilinger, 2004; Rosado y col., 2007; Rubio, 2007).

El estudio de la funcin de genes que codifican endoPGs se ha abordado a travs
de mutantes knock-out en M. oryzae, Xylella fastidiosa o F. oxysporum (Garca-Maceira
y col., 2001; Roper y col., 2007; Mori y col., 2008). Por contra, no hay referencias sobre
el silenciamiento de genes que codifican endoPGs fngicas, si bien, ha sido descrito el
silenciamiento del gen que codifica una PG de tomate en el que se obtuvo una reduccin
de los niveles de transcrito del 98% (Brummell y col., 2003). Debido a la baja
frecuencia de recombinacin homloga en Trichoderma optamos, para asignar funcin
a Thpg1, por la obtencin de cepas transformantes de T. harzianum T34 silenciadas en
este gen. Se ha demostrado el potencial de ciertas construcciones que codifican
horquillas de ARN autocomplementarias (self-complementary hairpin RNA o hpRNA)
en el silenciamiento eficaz de genes en plantas (Wesley y col., 2001). Este mtodo ha
sido aplicado con xito para silenciar genes de Trichoderma (Sousa, 2004; Cardoza y
col., 2006) y de hongos patgenos como Aspergillus y Fusarium (McDonald y col.,
2005). En este sentido, la cepa T. harzianum T34 fue transformada con el plsmido
Discusin
140
pJL43b1-Thpg1 que utiliza este tipo de sistema de horquillas de ARN
autocomplementarias.

El proceso de transformacin estuvo mediado por protoplastos (Cardoza y col.,
2006) y se utiliz un fragmento de 440 pb del gen Thpg1 bajo el control del promotor
constitutivo del gen ta de T. harzianum (Sousa, 2004). Tras analizar la insercin del
cassette de expresin en siete transformantes mediante PCR (ePG1, ePG2, ePG3, ePG4,
ePG5, ePG6 y ePG8), se realiz un primer anlisis para seleccionar un menor nmero
de transformantes con los que seguir trabajando. Para ello, se realiz un ensayo de
enfrentamiento dual entre la cepa silvestre T34 y cada uno de los transformantes
seleccionados por PCR, y el patgeno R. solani. A pesar de que fue el transformante
ePG8, con un menor crecimiento y una menor esporulacin, el que controlaba menos al
patgeno, no fue ese transformante el que mostr los menores niveles de actividad
endopoligalacturonasa en ensayos posteriores. Por tanto, los resultados obtenidos en
este tipo de ensayo de antagonismo no fueron determinantes a la hora de seleccionar
uno o dos transformantes, para posteriores estudios, por lo que se opt por continuar
con ePG8 y otros tres transformantes ms (ePG4, ePG5 y ePG6).

Se midi la actividad endopoligalacturonasa de la cepa silvestre T34 y de los
transformantes seleccionados (ePG4, 5, 6 y ePG8), para determinar el grado de
silenciamiento del gen Thpg1 en los mismos. Se observ una disminucin de la
actividad de ThPG1 en los cuatro transformantes, teniendo la menor actividad especfica
(U/mg protena total), el transformante ePG5, que fue un 91,14% inferior a la de la cepa
silvestre T34. Podra resultar sorprendente este grado de silenciamiento, si pensamos en
la presencia de otras pectinasas, pero debemos tener en cuenta que se utiliz PGA como
sustrato para restringir la accin de algunas de ellas. An as, resulta un nivel de
silenciamiento alto si consideramos que en estudios realizados con el doble mutante
knock out en una endoPG y una exoPG en C. carbonum, se detect actividad
poligalacturonasa residual posiblemente por la presencia de otros genes que codifican
PGs (Scott-Craig y col., 1998).

Para comprobar el nmero de copias de insercin del cassette se realiz un
anlisis Southern, y as poder relacionar este nmero con el grado de silenciamiento
obtenido en el ensayo de actividad. Se confirm que la mayora de las cepas
seleccionadas posean junto con el gen endgeno, al menos, una copia adicional del gen.
Puesto que utilizamos una enzima que cortaba el cassette de expresin con un tamao
de 3 kb, no podemos determinar el nmero de copias introducidas en el genoma de T.
harzianum T34. No obstante, la diferencia en la intensidad de seal observada para los
tres transformantes permitira pensar en la insercin de un nmero distinto de copias
para cada uno de ellos, lo que determinara el diferente grado de silenciamiento
obtenido en el ensayo de actividad. Teniendo en cuenta este hecho, si comparamos los
transformantes ePG8 y ePG5, ste ltimo mostr menor intensidad de seal en el
anlisis Southern, pero present menores niveles de actividad endopoligalacturonasa.
Discusin
141
Esta falta de correlacin entre el modelo de insercin del cassette y la actividad en los
transformantes ha sido descrita en transformantes que sobreexpresan distintos genes de
Trichoderma (Limn y col., 1999; Montero-Barrientos y col., 2007).

A la vista de los resultados obtenidos en el ensayo de actividad, pareca que los
niveles de expresin de Thpg1 deban seguir la misma pauta. Se llev a cabo una
cuantificacin, mediante Real-time, de los niveles de transcrito en la cepa T34 y tres de
los transformantes silenciados y, a tenor de los resultados de este anlisis, el mayor
nivel de silenciamiento de Thpg1 ocurra en el transformante ePG5. Estos resultados se
correlacionaban con los obtenidos en el estudio de actividad, es decir, a mayor grado de
silenciamiento del gen Thpg1 menor actividad endopoligalacturonasa en la cepa
silenciada.

Por otro lado, no se observaron diferencias fenotpicas entre las cepas T34 y
ePG5. As, el silenciamiento del gen Thpg1 no pareca afectar ni al crecimiento, ni al
grado de esporulacin de la cepa cuando las comparaciones se realizaban tras crecer los
hongos en un medio de crecimiento general. Con objeto de determinar si ese
silenciamiento podra afectar al comportamiento del hongo en un medio ms selectivo,
ya que se trataba de un gen que tras su caracterizacin se comprob que estaba
relacionado con hidrlisis de material vegetal, se simul esta condicin utilizando un
medio de crecimiento mnimo y aadiendo pectina como nica fuente de carbono. Se
compar el crecimiento de la cepa silvestre T34 y del transformante ePG5, que haba
presentado el mayor nivel de silenciamiento, en tres medios diferentes; los medios PDA
y MM sin glucosa, que se utilizaron como control, y el medio MM suplementado con
pectina. Solamente en el medio que contena pectina al 0,5% se observaron diferencias
significativas de crecimiento entre ambas cepas, siendo en el transformante un 9%
inferior respecto a la cepa silvestre.

Si tenemos en cuenta que Thpg1 se encuentra como copia nica en el genoma de
T. harzianum y que la actividad endoPG del transformantes ePG5 se reduce hasta un
90% respecto a la de la cepa silvestre T34, parece que es menor la capacidad del
transformante para utilizar pectina saprofticamente. Aunque, si consideramos que en el
genoma de este hongo existen otras pectinasas que pueden metabolizar la pectina y que
se ha silenciado un nico gen, el crecimiento tambin podra no haberse visto afectado.
En este sentido, la disrupcin de un gen que codifica una endoPG en C. carbonum,
provoc una disminucin de la actividad entorno al 30% sin afectar el crecimiento en un
medio con pectina, hecho que se podra explicar por la presencia de otras pectinasas,
entre ellas una exoPG (Scoot-Craig y col., 1990). Sin embargo, un doble mutante de C.
carbonum en los genes que codifican una endoPG y una exoPG, mostr una
disminucin drstica en la actividad poligalacturonasa y, a su vez, su crecimiento fue un
20% inferior al de la cepa silvestre (Scott-Craig y col., 1998). Tambin, disruptantes en
un gen que codifica una endoPG en A. citri, mostraron una reduccin de la actividad
endoPG de un 83% y tras crecer el hongo durante 25 das en un medio lquido con
Discusin
142
pectina, una reduccin de 42% en el peso seco del micelio (Isshiki y col., 2001).
Considerando todos los resultados en conjunto parece que el crecimiento en un medio
selectivo disminuye cuando la actividad endopoligalacturonasa se ve seriamente
reducida.

En el Captulo 1 ya se indic la importancia que podra tener la endoPG Thpg1
de T. harzianum en su relacin con la planta. A la vista de los resultados obtenidos en
este captulo se podra asignar a ThPG1 un papel fundamental en el proceso de
maceracin de material vegetal y, por tanto, en el crecimiento saproftico del hongo. En
este sentido, se han descrito endoPGs que no constituyen un factor de virulencia en el
proceso de patognesis (Gao y col., 1996; Di Pietro y col., 1998) y que su papel se
limita a degradar material vegetal. Ya que la mayora de las especies de Trichoderma y,
particularmente, T. harzianum, no son hongos fitopatgenos sino agentes de control
biolgico, en este trabajo se analiz el papel que pudiera tener este gen en el dilogo
con la planta. Son numerosos los estudios que relacionan las endoPGs con la capacidad
para producir molculas elicitoras de tipo OGAs, que desencadenan repuestas de
defensa en plantas (Esquerr-Tugay y col., 2000; Casasoli y col., 2008). As, por un
lado, se estudi el comportamiento de plantas de A. thaliana en interaccin con un
transformante de T. harzianum T34 silenciado en el gen Thpg1 (Captulo 3) y, por otro,
se analiz la expresin de este gen en plantas de A. thaliana (Captulo 4).


























































Captulo 3: ESTUDIO DE LA FUNCIN GNICA
DE Thpg1 MEDIANTE TECNOLOGA DE
MICROARRAYS DE Arabidopsis
































RESULTADOS







Resultados
145





Con objeto de profundizar en los resultados obtenidos en los ensayos in vivo
descritos en el Captulo 1 de resultados de esta Tesis Doctoral, se decidi abordar el
anlisis del transcriptoma de A. thaliana para determinar el papel que pudiera tener el
gen Thpg1 en su relacin con la planta. Adems este estudio tambin nos permiti
obtener una visin global de la respuesta de A. thaliana en la interaccin con T.
harzianum T34. Para ello, se utilizaron microarrays comerciales de A. thaliana:
GeneChip Arabidopsis ATH1 Genome Array (Affymetrix). El proceso completo de
tratamiento e hibridacin de las muestras, as como el anlisis estadstico de los
resultados, se realiz en las Unidades de Genmica y Protemica y de Bioinformtica
de la Universidad de Salamanca.


1. DISEO EXPERIMENTAL Y PREPARACIN DE LAS MUESTRAS


Para obtener las muestras de ARN total de partida de A. thaliana, se utilizaron
plantas de 25 das, crecidas en tierra-vermiculita (Figura 33).






Figura 33. Fotografa de plantas de A. thaliana ecotipo
Col-0 tomadas a los 25 das de crecimiento.







Para determinar el efecto que el silenciamiento del gen Thpg1 en la cepa T.
harzianum T34 pudiera tener en A. thaliana, se colonizaron las races de la planta con el
transformante silenciado ePG5, por ser el que presentaba los menores niveles de
actividad endopoligalacturonasa. De forma paralela, se realiz el mismo procedimiento
con la cepa silvestre T34. En la Figura 34 se muestra el diseo experimental utilizado
para el anlisis del transcriptoma de A. thaliana, como se describe en el apartado 4.2.4
Resultados
146
de Materiales y Mtodos Se utilizaron tres rplicas biolgicas por cada condicin, y dos
plantas por cada rplica. Los controles utilizados fueron A. thaliana (negativo) y A.
thaliana colonizada con la cepa silvestre T34 (positivo).


Figura 34. Fotografa del diseo experimental con las interacciones planta-hongo realizado para el
anlisis llevado a cabo mediante microarrays.


Las plantas (parte area) utilizadas por cada rplica y condicin, se congelaron
inmediatamente en nitrgeno lquido, se liofilizaron y se mezclaron para realizar la
extraccin de ARN total, siguiendo el protocolo descrito en el apartado 9.2.2 de
Materiales y Mtodos.


2. TRATAMIENTO DE LAS MUESTRAS


Una vez obtenido el ARN total de cada rplica, ste se envi a la Unidad de
Gnmica y Protemica de la Universidad de Salamanca donde se realiz el nalisis del
ARN, la obtencin del ADNc, el marcaje de las sondas y su posterior hibridacin con
los GeneChip Arabidopsis ATH1 Genome Array (Affymetrix), como se describe en los
apartados 10.1.2, 10.3.4, 11.2.3 y 11.3.2.3 de Materiales y Mtodos, respectivamente.




Resultados
147
3. ANLISIS DE LOS RESULTADOS


El tratamiento estadstico de los datos se realiz en la forma descrita en el
apartado 15.8.1 de Materiales y Mtodos.

El estudio estadstico se llev a cabo sobre tres situaciones: (i) control vs T.
harzianum T34 (Figura 35.A); (ii) control vs transformante silenciado (Figura 35.B), y
(iii) T. harzianum T34 vs transformante silenciado (Figura 35.C).


































Resultados
148

















Figura 35. Representaciones del algoritmo SAM formando una diagonal de
observados frente a esperados, con indicacin de los que no varan (en negro)
y de los que s varan (separados de la diagonal en verde). Por encima de la
diagonal aparecen los genes sobreexpresados y por debajo los genes
reprimidos. (A) control (C) vs T. harzianum T34 (T34). (B) control (C) vs
transformante silenciado (ePG5). (C) T. harzianum T34 (T34) vs
transformante silenciado (ePG5).


En la Figura 35 se representan los grficos que evalan las permutaciones del
algoritmo SAM de las tres situaciones a comparar. En la diagonal se sitan los genes
observados frente a los esperados, distinguiendo los genes que no varan (en negro), los
genes que s varan entre los dos estados contrastados (en verde), por arriba los
sobreexpresados y por debajo los reprimidos. Tanto en la situacin (i) como en (ii), se
trabaj con un mximo del 10% de falsos positivos, apareciendo 398 y 804 genes
diferenciales, respectivamente. En la situacin (iii) slo se detectaron 10 genes
diferenciales (nicamente sobreexpresados) pero aceptando un FDR de 0.33, lo que
significa asumir ms del 30% de falsos positivos. Para mantener un mximo del 10% de
falsos positivos (un FDR no superior a 0.11), slo se pueden aceptar los 5 primeros
genes diferenciales.

Los resultados se expresaron en funcin de su R.fold que representa el nmero
de veces que se detecta ms o menos expresin del gen correspondiente en presencia del
transformante silenciado ePG5 o la cepa silvestre T34 dependiendo de la situacin
analizada.
Resultados
149
Para el anlisis de la funcin del gen Thpg1 en su relacin con la planta, la
condicin que ms nos interesaba era la situacin (iii), en la que se comparaba el
transcriptoma de A. thaliana en presencia del transformante silenciado, ePG5. El listado
de los 10 genes diferenciales se recoge en la Tabla 11.


Tabla 11. Anlisis comparativo de los transcriptomas planta-T34 y planta-ePG5.
n Locus R.fold Gen
1 AT5G07550 11,92887791 GRP19
2 AT3G15400 6,655773599 ATA20
3 AT1G66850 8,399332109 NA
4 AT4G14130 3,746860025 XTR7
5 AT3G28500 2,876740474 NA
6 AT5G07560 2,386025521 GRP20
7 AT2G31980 4,089263646 NA
8 AT5G13930 1,779304888 c("AT5G13930.1", "CHS")
9 AT4G03210 2,673671315 XTH9
10 AT1G75930 2,891639768 EXL6
R.fold, representa el nmero de veces que aumenta la expresin de un determinado gen de la planta en
presencia de la cepa T34 frente a la cepa silenciada ePG5.


Los genes marcados en amarillo en la Tabla 11, se describen a continuacin:

GRP19 y GRP20: protenas ricas en glicina, de la familia de las oleosinas. Se
encuentran en la mayora de plantas y constituyen, junto con las protenas ricas
en prolina y las extensinas, un grupo de protenas estructurales de la pared
celular (Ringli y col., 2001).
ATA20: protena rica en glicina que se expresa diferencialmente en la antera
(Rubinelli y col., 1998).
NA: inhibidor de proteasas de la familia de las LTPs (lipid transfer proteins). Se
han relacionado con respuesta de defensa a bacterias y hongos patgenos
(Carvalho y Moreira, 2007).
XTR7 y XTH9: codifican para xiloglucosil transferasas que actan sobre los
polmeros de xiloglucano de la pared celular. Se ha determinado su expresin en
sistemas de interaccin planta-micorrizas (Maldonado-Mendoza y col., 2005).
CHS (Chalcona sintasa): enzima que forma parte de la ruta de biosntesis de
flavonoides. Se ha relacionado con respuesta a patgenos (Shaw y col., 2006).



Resultados
150
Aunque nuestro inters principal ha sido la determinacin del papel del gen
Thpg1 en su relacin con la planta, este estudio tambin nos permiti obtener una visin
global de la respuesta de A. thaliana en una interaccin con la cepa silvestre T.
harzianum T34. Algunos de los genes que se expresaron diferencialmente en esta
situacin, se muestran en la Tabla 12. Los genes inducidos en A. thaliana por la
presencia de T. harzianum, se muestran en rojo, mientras que los que aparecieron
reprimidos, se muestran en verde.


Tabla 12. Anlisis comparativo de los transcriptomas de planta y planta-T34.
n Locus R.fold Gen
1 AT4G09460 0,66897190 ATMYB6
2 AT3G16770 0,58412851 AT3G16770.1
3 AT4G34590 1,92767787 GBF6
4 AT1G33560 1,44719568 ADR1
5 AT1G08980 0,65650827 ATAMI1
6 AT3G03470 0,61416963 CYP89A9
7 AT4G35770 0,30387645 SEN1
8 AT1G15520 2,39539234 AT1G15520.1
9 AT5G17220 2,65619581 ATGSTF12
10 AT5G13000 1,29257096 ATGSL12
R.fold, representa el nmero de veces que la expresin del gen de la planta se encuentra inducida (en
rojo) o reprimida (en verde) por la presencia de la cepa T34.


Los genes enumerados en la Tabla 12, se describen a continuacin:

ATMYB6: protena de la familia de los factores de transcripcin myb, que
regulan genes implicados en el desarrollo y la respuesta de defensa en planta
(Chen y col., 2006).
AT3G16770.1: protena de la familia de los factores de respuesta a etileno
ERF/AP2, algunos de los cuales se activan en respuesta a diferentes estreses
(Gutterson y Reuber, 2004).
GBF6: protena de la familia de los factores de transcripcin bZIP, que se
inducen por respuesta a diferentes estreses (Jakoby y col., 2002).
ADR1: protena con dominios NBS-LRR, ricos en leucinas, que participa en la
respuesta a patgenos biotrficos mediada por SA (Grant y col., 2003).
ATAMI1: protena de la familia de las amidasas, relacionadas con la biosntesis
de IAA (Pollmann y col., 2003).
CYP89A9: protena de la familia de los citocromos P
450
, que juegan un
importante papel en la biosntesis de un gran nmero de compuestos lipoflicos
como fitoalexinas o giberelinas (Narusaka y col., 2004).
Resultados
151
SEN1: protena implicada en procesos de defensa y senescencia en planta
(Schenk y col., 2005)
AT1G15520.1: protena de la familia de los transportadores ABC, que facilitan
el paso de metabolitos secundarios a travs de la membrana (Yazaki, 2006).
GSTF: protena relacionada con la sntesis de antocianinas (Kitamura y col.,
2004).
ATGSL12: protena que participa en la sntesis de callosa (Ostergaard y col.,
2002), cuyos depsitos se han relacionado con respuestas de defensa SAR.

Adems de los genes que se enumeran en la Tabla 12, tambin se encontraron
varios genes, tanto inducidos como reprimidos, relacionados con el metabolismo de la
pared celular como arabinofuranosidasas, xiloxidasas o galactosidasas.


4. CONFIRMACIN DE LOS RESULTADOS MEDIANTE Northern


Con objeto de confirmar los resultados obtenidos en los microarrays, se realiz
un anlisis tipo Northern para algunos de los genes descritos en las Tabla 11 y 12
(Figuras 36 y 37). Para ello, se utilizaron 15 g del ARN total obtenido para el anlisis
con microarrays en las tres situaciones descritas en el apartado 3. Como sonda se utiliz
una zona de 1219, 911, 450 y 900 pb de las secuencias que codifican las protenas
ATA20, CHS, SEN1 y el transportador ABC, respectivamente. Estas sondas se
obtuvieron marcando con digoxigenina el producto de PCR obtenido tras amplificar el
ADN genmico de A. thaliana con los oligonucletidos ATA-1 y ATA-2, para el gen
ATA20; CHS-1 y CHS-2, para el gen codifica la chalcona sintasa; SEN1-f y SEN1-r,
para el gen SEN1; y ABC-f y ABC-r, para el gen que codifica el transportador ABC.
Como control de carga se utiliz el ARNr 18S obtenido, mediante PCR, con ADN
genmico de T. harzianum T34, usado como molde, y los oligonucletidos 18S-u y
18S-r.

En las situaciones planta-T34 frente a planta-ePG5, no se observaron diferencias
significativas en el nivel de expresin respecto al gen que codifica la chalcona sintasa
que presentaba un R.fold de 1,78. Por otro lado, el nivel de expresin del gen ATA20 fue
mayor en la situacin planta-T34 (Figura 36). Estas diferencias se observaron despus
de realizar tres medidas independientes de la seal obtenida para este gen, utilizando el
programa de cuantificacin Quantity One (BioRad). Este ltimo resultado estara de
acuerdo, a pesar de no coincidir en cantidades, con los datos obtenidos en el
microarray, en el que se observa una expresin diferencial (R.fold) entre planta-T34 y
planta-ePG5 de 6,65.



Resultados
152

























Figura 36. (A) Anlisis tipo Northern de la expresin de ATA20 y CHS de A.
thaliana. El ensayo se realiz con 15 g de ARN total extrado de material
vegetal liofilizado. Las plantas se mantuvieron en medio MS durante 24 horas
en las siguientes situaciones: (i) A. thaliana inoculada con germnulas de T.
harzianum T34 (T34) y, (ii) A. thaliana inoculada con germnulas del
transformante silenciado ePG5 (ePG5). Como control de carga se utiliz el
ARNr 18S. (B) Niveles relativos de transcrito de ATA20 y CHS frente al
ARNr 18S.


Aunque en este trabajo de Tesis Doctoral no se incluyen todos los resultados
obtenidos en las situaciones, control (C) vs T. harzianum T34 (T34) y control (C) vs
transformante silenciado (ePG5), los resultados obtenidos en el Northern con los genes
SEN1 y ABC (Figura 37), confirman los resultados de los microarrays para estos dos
genes. En relacin con el gen SEN1, se observ que su expresin era mayor en
presencia del hongo. Y con respecto al gen ABC, su expresin es ligeramente mayor en
la planta sola. De manera similar a los resultados obtenidos con los genes ATA20 y
CHS, en este caso tampoco haba una correlacin entre las diferencias de expresin y
los valores R.fold obtenidos en los microarrays.


Resultados
153






















Figura 37. (A) Anlisis tipo Northern de la expresin de SEN1 y ABC de A.
thaliana. El experimento se realiz con 15 g de ARN total extrado de
material vegetal liofilizado. Las plantas se mantuvieron en medio MS durante
24 horas en las siguientes situaciones: (i) A. thaliana (C-) y, (ii) A. thaliana
inoculada con germnulas de T. harzianum T34 (T34). Como control de carga
se utiliz el ARNr 18S. (B) Niveles relativos de transcrito de SEN1 y ABC
frente al ARNr 18S.















































DISCUSIN






Discusin
155





En la actualidad hay un creciente inters por conocer cmo ciertos organismos,
incluidos patgenos virulentos y avirulentos (Tuzun y Kuc, 1991), hongos micorrcicos
(Borowicz, 1997) y rizobacterias (Benhamou y col., 1998), son capaces de
desencadenar diferentes reacciones de defensa en las plantas. Esta respuesta se ha
dividido en dos tipos: inmunidad localizada e inmunidad sistmica. La respuesta
localizada consiste en el reconocimiento de diferentes molculas producidas por los
patgenos como son la flagelina, la quitina, etc., en el mismo lugar donde se produce la
infeccin (Bittel y col., 2007). El reconocimiento de estas molculas desencadena la
activacin de una respuesta hipersensible (HR) que, a su vez, puede llegar a povocar la
muerte celular en la zona de infeccin.

Adems, las plantas son capaces de activar otro tipo de respuestas dependiendo
del microorganismo con el que interacten (Pieterse y Van Loon, 1999). As, existe la
respuesta sistmica adquirida (SAR) que es desencadenada por organismos biotrficos
que, a su vez, es dependiente de la produccin de cido saliclico (SA) y conlleva la
sntesis de protenas PR. Y, la respuesta sistmica inducida (ISR) que se produce por
una colonizacin de las races de las plantas por rizobacterias y hongos micorrcicos
(RISR), y que es dependiente de la produccin de cido jasmnico (JA) y etileno (ET).
En este ltimo caso, no se producen protenas PR pero al igual que ocurre con la
respuesta SAR es dependiente del regulador transcripcional NPR1.

En el caso de T. harzianum, el estudio de la respuesta de defensa que
desencadena en la planta resulta, si cabe, un modelo ms interesante, por ser una especie
beneficiosa para la planta y que se utiliza como agente de control biolgico. En este
sentido, en los ltimos aos han aparecido varios trabajos que describen la respuesta
elicitora de Trichoderma spp. en la planta (Harman y col., 2004; Shoresh y Harman,
2008).

Son varios los estudios que proponen una similitud entre la respuesta sistmica
inducida por rizobacterias (RISR) y la respuesta desencadenada por Trichoderma
(Alfano y col., 2007; Segarra y col., 2008). No obstante, tambin se han descrito
respuestas de tipo SAR desencadenadas por T. virens (Howell, 2003) y T.
longibrachiatum (Martnez y col., 2001). El hecho de que la lnea que separa ambas
respuestas no est claramente delimitada y que, actualmente, se hable de un dilogo
entre ambas rutas, nos indujo a estudiar la respuesta que desencadena la cepa de T.
harzianum T34 en plantas de A. thaliana y, de este modo, tener una visin global de
dicha interaccin.

Discusin
156
De esta manera, el anlisis del transcriptoma de un organismo mediante el uso
de microarrays permite conocer los cambios que se producen en el perfil de expresin
de sus genes, de forma general y en un momento dado. Por este motivo, se utiliz el
chip comercial Affymetrix GeneChip Arabidopsis ATH1 Genome Array, que representa
unos 24.000 genes del genoma de la planta modelo A. thaliana, para analizar los
cambios provocados tanto por la cepa silvestre T34 como por una cepa silenciada en el
gen Thpg1, en el transcriptoma de esta planta.

Un anlisis de las diferencias entre los transcriptomas de A. thaliana y A.
thaliana colonizada por la cepa silvestre T34 mostr que 398 genes sufran cambios en
el perfil de expresin debido a la presencia de la cepa T34 (algunos genes que aumentan
o disminuyen su expresin en ambas situaciones se recogen en la Tabla 12).

De estos 398 genes expresados diferencialmente: el 56% se anotaron como
desconocidos, el 27% estaran relacionados con el metabolismo, el 16% se relacion
con la regulacin de la transcripcin y en la transduccin de seales, y un 12% estara
involucrado en la respuesta de la planta a diferentes estreses.

Entre los genes que se inducan en el transcriptoma de A. thaliana por la
presencia de T. harzianum destacan varios factores de transcripcin de las familias ERF
(ethylene response factor), bZIP (bassic domain leucine zipper), WRKY y MYB.
Algunos de estos factores se han relacionados con el metabolismo de la pared celular,
por ejemplo la familia de genes myb participa en la regulacin genes que participan en
su biosntesis (Zhong y Ye, 2007). Adems son numerosos los estudios que relacionan
algunos de los genes de esta familia con respuesta de defensa en planta (Daniel y col.,
1999; Lee y col., 2001; Gigolashvili y col., 2007; Van der Ent y col., 2008). En el
anlisis del transcriptoma de A. thaliana en presencia de T. harzianum encontramos que
tres genes de la familia gnica myb estaban inducidos por la presencia del hongo. En
este sentido, se ha relacionado el factor de transcripcin MYB72 con la induccin de
ISR en A. thaliana mediada por T. asperellum T34 (Segarra y col., 2008). No obstante,
son numerosos los genes myb a los que todava no se les ha asignado una funcin. Otros
factores de transcripcin que se activaron en la planta tras la colonizacin de T.
harzianum son algunos relacionados con la respuesta a etileno (ERF), concretamente,
un factor de la familia AP2. As, se ha descrito como el ERF1, un factor de esta familia,
participa en la activacin de genes de respuesta a patgenos (Lorenzo y col., 2003).

Otros genes que se encuentran inducidos por la presencia de Trichoderma son
aquellos que codifican los citocromos 89A9, 71B34 y 71B23. stos pertenecen a la
superfamilia de citocromos P
450
que estn implicados en respuestas a estreses biticos y
abiticos (Narusaka y col., 2004). Se ha descrito cmo en plantas de pimiento un
citocromo de la familia CYP89A se expresa en respuesta a la interaccin con una cepa
avirulenta de Xanthomonas axonopodis (Kim y col., 2006).

Discusin
157
Entre el grupo de genes relacionados con la biosntesis del IAA, una hormona de
la familia de las auxinas, destaca la induccin del gen ATAMI1que participa en su
sntesis (Pollmann y col., 2003). Est descrito como las auxinas de la planta son
inhibidas por SA para contrarrestar el ataque del patgeno (Wang y col., 2007).
Adems, se ha descrito que Trichoderma es capaz de regular los niveles de auxinas en la
rizosfera (Bjrkman, 2004).

Tambin se encuentra inducido por la cepa T34 un gen que codifica una protena
implicada en defensa y senescencia en planta (SEN1). Este gen est regulado tanto por
SA como por JA (Schenk y col., 2005).

Entre los genes que se encuentran reprimidos en el transcriptoma de A. thaliana
por la presencia de T. harzianum T34 estn el factor de transcripcin
GBF6/ATB2/bZIP11, cuya expresin se reprime por la presencia de sacarosa (Hanson y
col., 2008). Este hecho nos lleva a pensar que los niveles de sacarosa en A. thaliana
estaran aumentados por la presencia de Trichoderma, sin embargo, uno de los genes
cuya expresin se reprime cuando los niveles de este azcar son altos es la asparragina
sintetasa (ASN1) (Blsing y col., 2005) y, en esta interaccin, la expresin de ASN1
aumentaba, por lo que T34 no estara incrementando los niveles de sacarosa. Por tanto,
respecto a la expresin del gen GBF6, cabe pensar que haya otros factores que repriman
su expresin, ya que este gen regula en la planta procesos de desarrollo, de defensa o de
respuesta a diferentes estreses (luz o temperatura) (Jakoby y col., 2002).

Otro gen cuya expresin est reprimida por la presencia de Trichoderma es
ADR1, que est relacionado con protenas ricas en leucinas, del tipo NBS-LRR, y que es
inducido por SA en respuesta a patgenos biotrficos pero no por JA (Grant y col.,
2003). Tambin se observ la represin de otros genes inducidos por SA como el
ATGSTF12, que codifica una glutation transferasa (Gruhler y col., 2005), y el
ATGSL12, que codifica una callosa sintasa y que estn relacionadas con las defensas de
planta (Kohler y col., 2002).

Un gen que codifica un transportador ABC tambin se encuentra reprimido por
la presencia de T. harzianum T34. Este tipo de genes est regulado tanto por SA como
por JA (Stukkens y col., 2005). No obstante, un anlisis de la expresin de un
transportador ABC de Nicotiana plumbaginifolia (NpPDR1) en interaccin con varias
cepas de Pseudomonas spp. que no causan una respuesta hipersensible en esta planta,
inducan la expresin de este transportador, y por el contrario, una cepa de
Pseudomonas syringae que causa respuesta hipersensible en N. plumbaginifolia apenas
induca la expresion de este gen (Stukkens y col., 2005). En este sentido, T. harzianum
T34 no parece mediar respuestas hipersensibles de tipo SAR, por lo que resulta extrao
una represin para este transportador, ya que estara ms relacionado con la ruta del JA
(Stukkens y col., 2005). No obstante, el estudio de un gen homlogo a NpPDR1 en A.
thaliana (AtPDR12) revel que su expresin era mayor en respuesta a SA (Campbell y
Discusin
158
col., 2003). Otra funcin descrita para los transportadores ABC es su implicacin en
procesos de destoxificacin de plomo (Lee y col., 2005).

A la vista de los resultados obtenidos en los microarrays de A. thaliana podra
decirse que T. harzianum T34 activa la expresin en la planta de numerosos genes
relacionados con procesos de crecimiento y desarrollo, as como genes regulados por JA
y ET, lo que indicara una implicacin de T. harzianum en respuestas de tipo ISR. Por el
contrario, los genes que son activados por SA parecen no parecen estar activados y,
algunos incluso se encontraran reprimidos. No obstante, hay que tener en cuenta que
son numerosos los genes que forman parte de estas familias cuya funcin no est
descrita y que actuaran como inductores o represores en las distintas rutas de
sealizacin. Adems, la expresin de alguno de los 398 genes diferenciales parece
mucho ms relacionada con SAR ms que con una respuesta ISR. Por tanto, pese a que
la respuesta que desencadena T. harzianum T34 en la planta parece estar nicamente
mediada por JA/ET y a que no se detectaron cambios en la expresin de genes
marcadores, como pr1, implicado en la respuesta SAR, no podra descartarse que, al
menos la cepa T34 pudiera estar tambin implicada en la defensa mediada por SA.

Respecto al anlisis de la funcin del gen Thpg1, tras comparar los
transcriptomas de las interacciones A. thaliana-T34 (cepa silvestre) y A. thaliana-ePG5
(cepa silenciada en Thpg1), se obtena una lista de 10 genes que se inducan en la planta
solamente en presencia de la cepa silvestre T34. Este nmero de genes se debera tomar
con cierta precaucin ya que se trabaj con un valor FDR de 0,33 lo que significaba una
probabilidad de falsos positivos del 33%.

Algunos de esos genes como GRP19, GRP20, ATA20, XTR7 y XTH9 codifican
protenas que se han relacionado con la pared celular vegetal, tanto a nivel estructural
como de metabolismo, incluso, a algunos se les ha asignado una segunda funcin
relacionada con defensa. As los genes GRP19 y GRP20, que pertenecen a un grupo que
codifica protenas estructurales de la pared celular, constituyen un sistema de reparacin
de la planta (Mousavi y Hotta, 2005). Si se tiene en cuenta que estos 5 genes se
expresan menos en presencia del transformante que lleva el gen Thpg1 silenciado,
podramos relacionar la accin enzimtica de la endoPG con una hidrlisis de la pared
de la planta y como consecuencia, en presencia de la cepa silvestre T34, se inducira la
expresin de estos genes en A. thaliana. En este sentido, la aplicacin de una
preparacin de glucanos del patgeno Phytophthora megasperma a plantas de tabaco
provocaba la expresin mxima de un gen de la familia de las GRPs a las 4 horas de la
inoculacin (Brady y col., 1993). Por otro lado, los genes XTR7 y XTH9, codifican
protenas que degradan el xiloglucano, el principal constituyente de la hemicelulosa de
la pared celular de las plantas. En estudios realizados en la simbiosis de la micorriza
Glomus versiforme con la planta Medicago truncatula, se ha propuesto que es necesara
una expresin, en la planta, de genes de la familia de las XTH para favorecer la
colonizacin de las races por parte de la micorriza (Maldonado-Mendoza y col., 2005).
Discusin
159
Estos resultados estaran de acuerdo con el hecho de que el primer desencadenante de la
respuesta de defensa en la planta es la degradacin de la pared celular, a travs de la
produccin de OGAs (Esquerr-Tugay y col., 2000). En este sentido, se conoce muy
bien la capacidad elicitora de las endoPGs en la planta (Ridley y col., 2003).

Tambin se ha comprobado la capacidad de los OGAs para inducir la expresin
de genes como el que codifica la chalcona sintasa, que se expresa diferencialmente en
presencia de la cepa silvestre T34 y se ha relacionado con respuestas de defensa (Shaw
y col., 2006). Junto a estos genes, tambin se expres diferencialmente en ambas
interacciones, un gen relacionado con la familia de las LTPs, protenas que tambin
estn implicadas en respuestas de defensa en planta (Carvalho y Moreira, 2007).

En relacin con las protenas que degradan el xiloglucano, un estudio reciente
basado en un anlisis 2D DIGE demuestra como los OGAs inducen la expresin de
protenas del apoplasto en A. thaliana (Casasoli y col., 2008). Sin embargo, este estudio
tambin muestra la disminucin de los niveles de una alpha-xilosidasa, dato que no
estara de acuerdo con los resultados obtenidos para Thpg1 mediante microarrays.
Aunque estos autores tambin proponen que slo algunos de estos genes estaran
reprimidos por la necesidad de la planta de ralentizar la degradacin de los polmeros de
la pared celular durante la infeccin.

En cuanto a los genes de la planta expresados diferencialmente en presencia de
T. harzianum T34 que habramos esperado encontrar, y no fue as, estn aquellos que
codifican PGIPs; no obstante como se recoge en la discusin del Captulo 4 de esta
memoria, A. thaliana parece no tener PGIPs que inhiban la protena ThPG1.

A pesar de que los resultados obtenidos en los microarrays para los genes
ATA20, CHS, SEN1 y ABC se confirmaron por Northern, los resultados no mostraron
una clara correlacin a nivel cuantitativo entre las diferencias de expresin y los valores
R.fold.

Por tanto, el gen Thpg1 adems de ser un factor fundamental en el proceso de
degradacin de material vegetal durante la etapa saproftica de T. harzianum, como se
indica en los Captulos 1 y 2 de esta Tesis Doctoral, tambin tendra un papel relevante,
a travs de la produccin de OGAs, en la induccin de respuestas de defensa en la
planta. No obstante, todava falta dilucidar, sin temor a equivocarnos, que adems de la
respuesta ISR de la planta, T. harzianum tambin sea capaz de activar, de forma
secuencial o simultnea, las respuestas de tipo SAR.





































Captulo 4: SOBREEXPRESIN DEL GEN Thpg1 EN
PLANTAS DE A. thaliana
































RESULTADOS





Resultados
162





1. OBTENCIN DE PLANTAS DE A. thaliana QUE EXPRESAN EL GEN Thpg1


1.1 Construccin del vector de expresin pBI121-Thpg1

El siguiente objetivo de este trabajo fue la obtencin de plantas transgnicas de
A. thaliana que expresaran el gen Thpg1 de T. harzianum T34. Para ello, se construy el
plsmido pBI121-Thpg1, que deriva del plsmido pBI121 (Chen, 2003) y que contiene
el promotor constitutivo 35S CaMV, el gen completo Thpg1, el terminador NOS de A.
tumefaciens y el gen nptII (neomicina fosfotransferasa II) que confiere resistencia a la
kanamicina. Este cassette de expresin se encuentra situado entre los bordes derecho e
izquierdo (RB y LB) del plsmido, formando el T-DNA que se integrar en el genoma
de la planta. El proceso de construccin de este plsmido est recogido en el apartado
6.2 de Materiales y Mtodos.

1.2. Transformacin de A. tumefaciens con pBI121-Thpg1

Puesto que la transformacin de las plantas de A. thaliana se realiza mediante la
infeccin con A. tumefaciens, el primer paso fue la introduccin del plsmido pBI121-
Thpg1 en esta bacteria.

Se eligi la cepa de A. tumefaciens C58C1 que contiene el plsmido binario
desarmado pGV2260 (Deblaere y col., 1985). Este plsmido contiene los genes vir,
necesarios para la integracin del T-DNA en el genoma de la planta, y confiere
resistencia a la rifampicina. La transformacin se realiz mediante electroporacin
(proceso descrito en el apartado 7.1.2 de Materiales y Mtodos) segn el mtodo de
Dower y col. (1988). Se utilizaron 0,5 g de ADN plasmdico y 30 L de clulas
competentes de A. tumefaciens. La seleccin de colonias se realiz en placas de agar LB
suplementado con kanamicina (50 g/mL).

Para confirmar que las colonias resistentes a kanamicina llevaban el vector de
expresin pBI121-Thpg1, se realiz una extraccin de ADN plasmdico y, mediante una
reaccin de PCR utilizando los oligonucletidos pBI-sen y endop-2, se amplific un
fragmento de 1482 pb correspondientes a parte del promotor 35S CaMV y el gen
Thpg1. La PCR result positiva para las 6 colonias analizadas (Figura 38).
Resultados
163










Figura 38. Productos de PCR obtenidos a partir de amplificaciones
de ADN plasmdico de seis colonias de A. tumefaciens
transformadas con el vector pBI121-Thpg1. M: marcador X
(Roche).


1.3. Infeccin de plantas de A. thaliana con las cepas transformadas de
Agrobacterium

Para la transformacin se utilizaron plantas de A. thaliana ecotipo Col-0. En
primer lugar se sembraron las semillas, previamente esterilizadas, en macetas con tierra
y vermiculita en una proporcin de 3:1. Se incubaron a 22C con un fotoperiodo de 8
horas de oscuridad y 16 horas de luz, y una humedad del 70%. Una vez formadas las
inflorescencias primarias, stas se cortaron para promover el desarrollo de
inflorescencias secundarias. Cuando las plantas tenan numerosas inflorescencias y los
primordios florales an permanecan cerrados, se procedi a infectarlas con las cepas de
A. tumefaciens que llevaban el plsmido pBI121-Thpg1.

El proceso de infeccin se realiz por el mtodo de Clough y Bent (1998), tal y
como se describe en el apartado 7.3 de Materiales y Mtodos. Brevemente, se prepar
un cultivo saturado de A. tumefaciens que se resuspendi en una solucin de
infiltracin. Las inflorescencias de las plantas de A. thaliana se sumergieron en esta
solucin durante dos minutos y se cubrieron con plsticos para mantener una atmsfera
hmeda. A los tres das, se retiraron los plsticos y las plantas se incubaron en las
condiciones antes descritas, hasta que produjeron semillas. Las semillas
correspondientes a la primera generacin (T1) se sembraron en placas de agar MS,
suplementado con kanamicina (50 g/mL), y se aadi cefotaxima (250 g/mL) para
evitar contaminaciones por Agrobacterium. Finalmente, se obtuvieron seis lneas
resistentes a kanamicina, correspondientes a la tercera generacin: T2b1, T2c1, T2d2,
T2e1, T2g3 y T2k5. En la Figura 39 se muestran cuatro de las seis lneas transgnicas
crecidas en un medio MS suplementado con kanamicina.
Resultados
164



Figura 39. Crecimiento de la lnea silvestre Col-0 de
A. thaliana y cuatro lneas transformadas con el
plsmido pJL43b1-Thpg1 que mostraban resistencia a
kanamicina (T2b1, T2c1, T2e1 y T2k5).








2. CARACTERIZACIN DE LAS CEPAS TRANSFORMADAS CON pJL43b1-
Thpg1


2.1. Comprobacin y seleccin de los transformantes

Para confirmar que el gen Thpg1 se haba integrado en el genoma de las plantas,
se extrajo el ADN genmico de las seis lneas transgnicas y de la lnea silvestre (Col-
0), y se realiz una PCR utilizando los oligonucletidos pBI-sen y endop-2. En las seis
lneas transgnicas se obtuvo el fragmento de PCR de 1482 pb esperado (Figura 40).













Figura 40. Productos de PCR obtenidos a partir de amplificaciones de ADN
genmico de plantas de A. thaliana T2d2 (1), T2c1 (2), T2b1 (3), T2k5 (4),
T2g3 (5), T2e1 (6), L2 (7) y Col-0 (8), utilizando los oligonucletidos pBI-sen
y endop-2. M: marcador X (Roche).

Resultados
165
2.2. Confirmacin de los transformantes: anlisis tipo Southern

Para conocer el nmero de copias del gen Thpg1 en el genoma de A. thaliana se
realiz un anlisis tipo Southern de las lneas transformadas y de Col-0. Se digirieron 10
g de ADN genmico de cada lnea con EcoRI que corta una vez en el plsmido
pBI121-Thpg1 y que no tiene sitio de corte en la secuencia de Thpg1. Como sonda se
utiliz el gen Thpg1 marcado con
32-
P. Se confirm que al menos cinco de las lneas
eran transformantes y que cada una de ellas llevaba al menos una copia del gen Thpg1
(Figura 41).







Figura 41. Anlisis tipo Southern del gen Thpg1 en
la lnea silvestre Col-0 (1) y en las lneas
transgnicas T2c1 (2), T2b1 (3), T2d2 (4), T2g3 (5),
T2e1 (6) y T2k5 (7). El ADN genmico fue
digerido con EcoRI, la hibridacin se realiz en
condiciones restrictivas y como sonda se utiliz la
secuencia completa del gen Thpg1. Marcador
/HindIII (Roche).







Se decidi seguir trabajando con las lneas T2b1 y T2c1 por presentar una y dos
copias del gen Thpg1, respectivamente.

2.3. Anlisis de la expresin de Thpg1 en los transformantes seleccionados

Para conocer si el gen Thpg1 de T. harzianum T34 se expresaba en las plantas
transformadas, se realiz un anlisis tipo Northern. Se utilizaron 15 g de ARN total
extrado de plntulas de 10 das de crecimiento, germinadas en medio MS. Como sonda
se utiliz el gen Thpg1 y como control de carga el ARNr 18S (Figura 42).



Resultados
166




Figura 42. (A) Anlisis tipo Northern de la
expresin del gen Thpg1 de T. harzianum T34
en plantas de A. thaliana ecotipo Col-0 y las
lneas transgnicas T2b1 y T2c1. El ensayo se
realiz con 15 g de ARN total extrado de
tejido liofilizado de plntulas crecidas durante
10 das en medio MS. (B) Niveles relativos de
transcrito de Thpg1 frente al ARNr 18S.







Se observ expresin del gen Thpg1 en las dos lneas analizadas. El mayor nivel
de transcrito se observ en la lnea T2c1.

2.4. Anlisis de la actividad endopoligalacturonasa en los transformantes
seleccionados

Para comprobar si la protena codificada por el gen Thpg1 era funcional en A.
thaliana se realiz un ensayo de actividad utilizando la parte area de plantulas de 10
das crecidas en medio MS. Una vez liofilizado el material se realiz una extraccin de
protenas intracelulares tal y como se indica en el apartado 12.2 de Materiales y
Mtodos.

Se detect actividad en las tres lneas, siendo 3,5 veces mayor en la lnea
transgnica T2c1 que en Col-0. La diferencia entre los valores de actividad medios en
T2c1 y Col-0 fue estadsticamente significativa (*) tras analizar los datos mediante el
test de Fisher (Figura 43).








Resultados
167













Figura 43. Actividad endopoligalacturonasa especfica (U/mg protena
total) analizada en plantas de A. thaliana: lnea silvestre (Col-0) y dos
lneas transgnicas (T2b1 y T2c1). Cada valor es la media de tres
medidas + la desviacin estandar. El asterisco (*) representa diferencias
de actividad estadsticamente significativas.


2.5. Ensayos de resistencia a estreses abiticos

Para comprobar si la expresin heterloga del gen Thpg1 en A. thaliana afectaba
a su resistencia a algn tipo de estrs abitico, se analiz la germinacin de las semillas
en condiciones que simulaban un estrs osmtico (manitol) y uno salino (NaCl)
(apartado 13.2 de Materiales y Mtodos). Para ello se sembraron semillas de las lneas
transgnicas y de Col-0 en medio MS, suplementado con manitol 100 mM o NaCl 50 o
100 mM. Las placas se incubaron a 22C durante 10 das y se realiz un recuento del
nmero de semillas germinadas. Los resultados se muestran en la Tabla 13.


Tabla 13. Porcentajes de germinacin de las semillas de Col-0 y de las dos lneas transgnicas que
expresan el gen Thpg1, tras una incubacin a 22C durante 10 das en medio MS suplementado con
manitol (estrs osmtico) o NaCl (estrs salino). Cada valor es la media de tres experimentos
independientes su desviacin estndar. Los valores marcados con un asterisco mostraron diferencias
significativas respecto a la lnea silvestre (P< 0,05) en un anlisis estadstico tipo ANOVA.
% Germinacin MS Manitol 100 mM NaCl 50 mM NaCl 100 mM
Col-0 96,6 + 0,6 83,3 + 1,5 85,0 + 1,7 30,0 + 1,0
T2b1 90,0 + 1,0 86,6 + 1,7 94,2 + 2,3* 65,0 + 1,7*
T2c1 90,0 + 1,0 90,0 + 1,5* 95,0 + 0,6* 81,6 + 1,1*


Resultados
168
En ausencia de un estrs abitico (medio MS), el porcentaje de germinacin de
semillas en las dos lneas transgnicas fue un 6,6% menor que el observado en la lnea
Col-0. Sin embargo, ambas lneas transgnicas mostraron mayores porcentajes de
germinacin que Col-0 bajo un estrs osmtico o uno salino. Las mayores diferencias se
observaron tras el crecimiento en un medio con alta concentracin de NaCl (100 mM) y,
a su vez, las mayores diferencias se observaron entre Col-0 y la lnea T2c1 que posea
dos inserciones del gen Thpg1 de T. harzianum T34. Las diferencias de germinacin
entre Col-0 y ambas lneas transgnicas fueron estadsticamente significativas, bajo
todas las condiciones de estrs analizadas, excepto para la lnea T2b1 en manitol 100
mM, tras analizar los datos mediante el test de Fisher.

2.6. Anlisis morfolgico (fenotpico)

Para determinar si la expresin heterloga del gen Thpg1 en A. thaliana afectaba
a su desarrollo, se cultivaron plantas de la lnea silvestre y las dos lneas transgnicas en
tierra-vermiculita a 21-24C, con un fotoperiodo de 16 horas de luz y 8 horas de
oscuridad, y una humedad del 70%, durante 40 das. Se pudo observar que el fenotipo
de las lneas transgnicas era diferente al de la lnea silvestre. El tamao de la roseta era
dos veces mayor en la lnea silvestre que en las lneas transgnicas y la inflorescencia
primaria emergi antes en estas ltimas, presentando un porte ms fino y alargado que
en la lnea silvestre. Por otro lado, no se pudo observar diferencias entre las dos lneas
transgnicas, a simple vista (Figura 44).




















Resultados
169
Figura 44. Imgenes de la lnea silvestre de A. thaliana ecotipo Col-0 y las dos lneas
transgnicas, T2b1 y T2c1, despus de 40 das de crecimiento.


Para comprobar si este crecimiento diferencial de la parte area, que presentaban
las lneas transgnicas, afectaba tambin a su parte radical, se sembraron semillas de la
lnea silvestre y de los dos transformantes, en placas MS dispuestas de manera vertical
en condiciones similares a las descritas anteriormente. El ensayo se realiz con 5
semillas por placa hasta un total de 10 placas por cada lnea.

Se observ que en las lneas transgnicas la longitud de la raz era menor que en
la lnea silvestre (Figura 45), y que estas diferencias eran estadsticamente significativas
despus de analizar los datos mediante el test de Fisher. Por otra parte, la longitud de la
raz entre la lnea transgnica T2b1 era mayor que la de la lnea T2c1.




Resultados
170












Figura 45. Ensayo de crecimiento radical de la lnea silvestre Col-0 y
de las dos lneas transgnicas, T2b1 y T2c1, que expresan el gen Thpg1
de T. harzianum T34. Las semillas se sembraron en medio MS y las
placas se incubaron, en oscuridad y en posicin vertical, a 22C durante
10 das.


2.7. Anlisis de hormonas en las lneas seleccionadas

A la vista de los resultados fenotpicos obtenidos, se realiz un anlisis de
hormonas [cido abscsico (ABA), cido jasmnico (JA) y cido saliclico (SA)] en la
lnea silvestre y las dos lneas transgnicas. Para ello, se sembraron semillas y se
crecieron en tierra-vermiculita durante 40 das, en las mismas condiciones descritas para
el estudio fenotpico. Se recogi la parte area de las plantas y se congel en N
2
lquido
para, posteriormente, liofilizar el material. Las datos hormonales se obtuvieron tal y
como se describe en el apartado 14 de Materiales y Mtodos. Las medidas de las
hormonas se realiz en colaboracin con el grupo del Dr. Aurelio Gmez Cadenas del
Departamento de Ciencias Agrarias y del Medio Natural de la Universidad Jaume I,
Castelln.

Los resultados obtenidos se recogen en la Figura 46, donde se representa los ng
de ABA, JA o SA obtenidos para las dos lneas transgnicas, T2b1 y T2c1, y la lnea
silvestre Col-0. En las dos lneas transformadas se obtuvieron mayores niveles de ABA
y JA que en la lnea silvestre. No obstante, slo se obtuvieron diferencias significativas
para la lnea T2c1. Por otro lado, los niveles de SA fueron menores en las dos lneas
transgnicas, siendo estas diferencias estadsticamente significativas para ambas lneas.





Resultados
171


















Figura 46. Medida de hormonas (ABA, JA y SA) en A. thaliana ecotipo Col-0 y los
transformantes T2b1 y T2c1, despus de 40 das de crecimiento. El resultado es la
media, con su desviacin estndar, de los valores obtenidos en tres experimentos
independientes. El asterico (*) representa diferencias en la cantidad de hormona
estadsticamente significativas.


























































DISCUSIN






Discusin
173





Algunos genes de Trichoderma, sobre todo aquellos que codifican hidrolasas, se
han utilizado como herramientas moleculares para aumentar la resistencia a
enfermedades fngicas en plantas como tabaco y patata (Lorito y col., 1998), brcol
(Mora y Earle, 2001) o algodn (Chandrakanth y col., 2003). En este sentido, apenas
existen referencias sobre transformacin de plantas con genes que codifiquen endoPGs
de hongos (Boudart y col., 2003; Capodicasa y col., 2004). Por contra, hay varios
trabajos sobre plantas transformadas con endoPGs de origen vegetal (Osteryoung y col.,
1990; Atkinson y col., 1990; Sander y col., 2001). En este trabajo se introdujo el gen
Thpg1 de T. harzianum T34 en la planta modelo A. thaliana con el objetivo de analizar
el efecto que tiene la expresin de un gen que codifica una endoPG de Trichoderma en
una planta y, ms en particular, el comportamiento de estos transformantes frente a
diferentes tipos de estrs.

Aunque hubiera sido ms til introducir Thpg1 en un cultivo con importancia
agronmica y la extrapolacin de resultados entre distintas especies debe tomarse con
cautela, en este trabajo se eligi A. thaliana porque presenta una serie de caractersticas
que la hacen idnea para este tipo de estudios. Esta planta posee un ciclo de vida corto,
se puede cultivar sin grandes dificultades, es muy prolfica (capaz de producir hasta
10.000 semillas por planta), es autgama y posee un genoma haploide muy pequeo (
157 Mb) repartido en 5 cromosomas que han sido secuenciados (Bennett y col., 2003).
Adems, los sistemas de transformacin son sencillos, obtenindose una alta eficacia de
transformacin (Clarke y col., 1992), y se dispone de numerosas colecciones de
mutantes (Salinas y Snchez-Serrano, 2006).

Se expres Thpg1 en A. thaliana bajo el control del promotor constitutivo 35S
CaMV y la transformacin se realiz mediante la infeccin de los primordios florales
con A. tumefaciens. Las semillas se seleccionaron por su resistencia a kanamicina,
obtenindose varias lneas transgnicas correspondientes a la tercera generacin, en la
que el gen introducido se encuentra en homocigosis. La insercin del cassette de
expresin se confirm mediante PCR en las seis lneas analizadas y, posteriormente, se
realiz un anlisis tipo Southern para conocer el nmero de copias de Thpg1 que se
haba introducido en los transformantes. Se confirm que cuatro de las seis lneas
llevaban una copia del gen Thpg1 y que la lnea T2c1 tena dos copias. Result curioso
que en las cuatro lneas, la banda que corresponda al cassette de transformacin fuera
de idntico tamao, si se tiene en cuenta que la integracin del T-DNA en el genoma de
la planta se produce al azar (Tzfira y col., 2004). Sin embargo, algunos estudios han
mostrado la existencia de preferencia por algunas regiones intergnicas (Alonso, 2003).
Discusin
174
Por otro lado, una de las dos inserciones que se observaron en la lnea T2c1 era
de un tamao inferior a 4 kb, y el tamao del T-DNA despus del corte con la enzima
EcoRI sera de aproximadamente 4,7 kb. El hecho de que el tamao ms pequeo que
puede tener el inserto sea de este tamao, nos hizo suponer que la copia de 4 kb estara
truncada.

El siguiente paso fue analizar la expresin de Thpg1 en dos de las lneas
transformantes, T2b1, que presentaba una nica insercin, y T2c1, que presentaba dos
inserciones, adems de incluir como control la lnea silvestre Col-0. Como era de
esperar, utilizando el gen Thpg1 de T. harzianum T34 como sonda en el anlisis
Northern, slo se observ seal en las dos lneas transgnicas. En este sentido, la baja
homologa nucleotdica entre Thpg1 y otros genes que codifican endoPGs de planta
explicaba la ausencia de otras seales de hibridacin en el carril que contena el ARN de
la lnea silvestre Col-0. A su vez, el nivel de expresin fue mayor en la lnea T2c1 que
en la lnea T2b1, estando el resultado de acuerdo con el nmero de copias insertadas,
dos y una, respectivamente, como se dedujo del anlisis Southern. La explicacin ms
probable para el mayor nivel de expresin en la lnea T2c1, sera que la banda de 4 kb
fuera una copia truncada pero funcional, ya que la otra explicacin sera que el nmero
de inserciones en la misma regin del genoma fuera mayor, pero parece poco probable
debido a que la intensidad de la banda de 10 kb fue similar en ambos transformantes.

El bajo nmero de copias insertadas tras transformar A. thaliana con el gen
Thpg1 est de acuerdo con el observado en plantas de tabaco, transformadas con el gen
AnPGII de A. niger (Capodicasa y col., 2004), y de manzano, que sobreexpresaban un
gen que codifica una endoPG especfica de fruto (Atkinson y col., 2002),
respectivamente. No obstante, en este ltimo caso, un mayor nmero de copias no fue
acompaado de un mayor nivel de expresin del transgn.

Uno de los principales problemas que presenta la introduccin de genes de
hongo en planta es que durante el procesamiento de los transcritos se producen
protenas no funcionales debido a que parece que el pptido seal fngico no es
procesado por la maquinaria celular de la planta (Boudart y col., 2003). En nuestro caso,
decidimos transformar utilizando el propio pptido seal de ThPG1, ya que estaba
descrito que una planta de tabaco transformada con un gen que codifica una
endoquitinasa de T. harzianum, portando el gen la parte nucleotdica relativa al pptido
seal, secretaba una protena funcional (Lorito y col., 1998). La actividad
endopoligalacturonasa, medida en hojas liofilizadas, fue mayor en las dos lneas
transgnicas que en Col-0, auque la diferencia respecto a la lnea silvestre fue slo
estadsticamente significativa para T2c1, siendo su actividad 3,5 veces mayor a la de
Col-0. Los valores de actividad medidos en las lneas transgnicas demuestran que el
transcrito del gen Thpg1 estara siendo procesado correctamente por la maquinaria de la
planta.

Discusin
175
Por otro lado, debemos tener en cuenta que las plantas de A. thaliana obtenidas
por transformacin con Thpg1 estaban expresando una endoPG y es sabido que las
plantas producen protenas inhibidoras de poligalacturonasas (PGIPs). En este sentido,
plantas de tabaco transformadas con la endoPG de C. lindemuthianum, CLPG1, y que
no producan PGIPs frente a esta enzima, mostraron altos niveles de actividad (Boudart
y col., 2003). Un anlisis realizado en colaboracin con el grupo de la Dra. Giulia de
Lorenzo (Universidad de Roma) con la protena ThPG1 de T. harzianum T34 y con
PGIPs de A. thaliana y P. vulgaris (datos no mostrados), revel que eran necesarios 50
ng del inhibidor PvPGIP1 y 130 ng del PvPGIP2 de P. vulgaris, respectivamente, para
inhibir 1 unidad de ThPG1 en un ensayo en placa de agarosa (Ferrari y col., 2003). Sin
embargo, los dos PGIPs de A. thaliana ensayados no inhiban la protena ThPG1 de T.
harzianum T34. Este resultado est de acuerdo con otros trabajos en los que se ha
descrito tambin que endoPGs de A. niger y F. moniliforme no son inhibidas por PGIPs
de A. thaliana (De Lorenzo y Ferrari, 2002).

Por otra parte, la cantidad de PvPGIP2 necesaria para inhibir a ThPG1 fue muy
superior a la que se necesit para inhibir endoPGs de hongos fitopatgenos como A.
niger, F. moniliforme, C. acutatum o B. cinerea (DOvidio y col., 2004b). Estos
resultados determinan la importancia de la especificidad de la interaccin entre
endoPGs y PGIPs (De Lorenzo y Ferrari, 2002).

Una vez determinada la funcionalidad de la protena ThPG1, se realizaron varios
ensayos para comprobar el efecto de la expresin del gen Thpg1 en A. thaliana. En un
primer ensayo se comprob el comportamiento de los transformantes frente a estreses
abiticos de tipo osmtico (100 mM manitol) y salino (50 100 mM NaCl). A pesar de
que los porcentajes de germinacin de semillas para las dos lneas transgnicas fueron
inferiores a los mostrados por Col-0 en el medio MS (control), los valores fueron
superiores cuando sus semillas se crecieron bajo condiciones de estrs, tanto osmtico
como salino. En particular, la lnea T2c1 mostr diferencias significativas en el
porcentaje de germinacin de semillas, respecto a Col-0, en las tres condiciones de
estrs analizadas, mientras que para la lnea T2b1 las diferencias con Col-0 slo fueron
estadsticamente significativas ante un estrs salino. Tambin, los resultados mostraron
que un aumento de las condiciones de estrs conlleva una mayor diferencia en
resistencia respecto a Col-0. Estos resultados estaran de acuerdo con los mayores
niveles de expresin de Thpg1 observados en la lnea T2c1. En este sentido, se ha
observado una mayor resistencia a un estrs salino en plantas de A. thaliana que
sobreexpresan el gen XTH que codifica una xiloglucan endotransglucosidasa/hidrolasa
de pimiento (Cho y col., 2006). La protena codificada por XTH est implicada en la
modificacin de la pared celular, al igual que lo estn las endoPGs. Adems las lneas
T2b1 y T2c1 haban mostrado una alteracin en su crecimiento.

Por otro lado, los resultados de los microarrays mostraban como la expresin de
dos genes de A. thaliana que codifican enzimas relacionadas con el metabolismo de la
Discusin
176
pared celular se vea afectada cuando una cepa de T. harzianum T34 silenciada en el gen
Thpg1 colonizaba la raz de la planta. En este sentido, se podra pensar que la
sobreexpresin de Thpg1 en plantas de A. thaliana, a la vez que alterar la composicin
de la pared celular, inducira la expresin de genes que codifican enzimas implicadas en
el metabolismo de la misma. La relacin de Thpg1 con una mayor resistencia a estreses
abiticos, en las lneas transgnicas, podra explicarse por los cambios de porosidad de
la pared debido a la modificacin a la que se ve sometida la pectina por la accin de
ThPG1 y de otras enzimas. As, se han descrito fenotipos enanos y adaptaciones a
estreses salinos e hdricos debidos a modificaciones en la composicin de la pared
celular (Iraki y col., 1989).

En cuando a la morfologa de las lneas transgnicas, se observ un fenotipo
enano que afectaba tanto a la parte area como a la raz. Estos resultados estn de
acuerdo con aquellos obtenidos en plantas de A. thaliana ecotipo Wassilewskija, que
expresaban el gen pgII que codifica una endoPG de A. niger (Capodicasa y col., 2004).
Estos autores observaron que el fenotipo enano iba acompaado de una reduccin del
contenido de la planta en HGA. Todos los resultados indicaran que la alteracin en el
crecimiento observada en las lneas transgnicas es debida a la accin de la endoPG
sobre la pared celular.

Por otro lado, considerando la posible relacin entre ThPG1 y la resistencia a
diferentes estreses abiticos, se realiz un anlisis hormonal en las lneas transgnicas y
en Col-0. Se pudo observar que los niveles de ABA y JA eran mayores en las dos lneas
transgnicas que en la lnea silvestre Col-0, pero slo en T2c1 las diferencias eran
significativas. Los mayores niveles de ABA y JA se han relacionado con una mayor
resistencia a estreses osmticos y salinos (LaRosa y col., 1985, 1987; Wang y col.,
2001). Tambin est descrito que los mayores niveles de ABA retrasan la germinacin
de las semillas y, en el presente trabajo, se ha observado menores porcentajes de
germinacin en las dos lneas transgnicas cuando se crecieron en un medio control
(MS). Por tanto, la expresin constitutiva del gen Thpg1 en plantas de A. thaliana
estara incrementando los niveles de estas dos hormonas, por lo que los mayores
porcentajes de germinacin obtenidos en las lneas transgnicas, bajo condiciones de
estrs abitico, se deberan a una mayor resistencia de las plantas a estos estreses.

Por otro lado, los niveles de SA fueron menores en las dos lneas transgnicas,
siendo estas diferencias estadsticamente significativas para ambas lneas. As se ha
descrito que la expresin constitutiva de una endoPG de A. niger en plantas de A.
thaliana y tabaco, induca la expresin de genes de defensa en stas (Federici y col.,
2007). A pesar de que en este trabajo no se determinaron los niveles hormonales, el
aumento de los niveles de JA detectados en el presente estudio, podran estar
induciendo una ruta de defensa en la planta dependiente de esta hormona, pudiendo
tener un efecto negativo sobre la produccin de SA.
































CONCLUSIONES






Conclusiones
178





1. El gen Thpg1, que codifica una endopoligalacturonasa, se encuentra como copia
nica en el genoma de T. harzianum T34, y existe un gen homlogo en cepas
pertenecientes a otras especies de Trichoderma. Adems, la existencia en los
genomas de Trichoderma, disponibles on line, de genes que codifican otras
endopoligalacturonasas hipotticas, sugiere que la cepa T. harzianum T34 posee
otros genes que codifican este tipo de protenas.

2. Los datos obtenidos en los estudios de expresin del gen Thpg1 revelan que est
inducido por componentes de la pared celular de las plantas como pectina o
PGA, siendo stos, a su vez, sustratos caractersticos de las endoPGs fngicas.

3. La protena ThPG1, que presenta una alta homologa con endoPGs fngicas,
poseee en su secuencia los aminocidos tpicos del dominio cataltico de las
endoPGs de hongos.

4. La actividad poligalacturonasa detectada en los sobrenadantes obtenidos tras
cultivar la cepa T34 en un medio mnimo suplementado con pectina al 0,5%,
demuestra la capacidad enzimtica de esta protena para hidrolizar el cido
poligalacturnico.

5. La presencia en los transformantes ePG de la cepa T34 de al menos una copia
adicional del gen Thpg1, junto a menores niveles de expresin y de actividad
endopoligalacturonasa, demuestra que stos estn silenciados en el gen Thpg1.

6. La expresin del gen Thpg1 en presencia de material vegetal relaciona este gen
con procesos saprofticos del hongo. Adems, los resultados de los estudios de
expresin gnica y de anlisis protemico obtenidos en sistemas de tres
componentes (Trichoderma-planta-patgeno) indican que el gen Thpg1 es
inducido por la pared celular de la planta y que la presencia de patgenos,
fundamentalmente de raz, incrementa la expresin del mismo.

7. Las diferencias observadas en los transcriptomas de A. thaliana colonizada por
la cepa T34 o por el transformante ePG5, silenciado en el gen Thpg1, muestran
que algunos genes relacionados con el metabolismo de la pared celular y con la
defensa de la planta slo son inducidos en presencia de la cepa T34. Estos
resultados revelan la capacidad de Thpg1 para activar mecanismos de defensa en
las plantas.

Conclusiones
179
8. Lneas de A. thaliana con al menos una copia del gen Thpg1 de T. harzianum
T34, presentaron expresin del mismo, as como una mayor actividad
endopoligalacturonasa que la cepa silvestre Col-0. Estos resultados demuestran
que son lneas transgnicas y la protena ThPG1 es funcional en A. thaliana.

9. El fenotipo enano observado en las lneas transgnicas T2b1 y T2c1 de A.
thaliana, parece indicar que la protena ThPG1 provoca alteraciones en la pared
celular de la planta a nivel estructural.

10. El menor porcentaje de germinacin de semillas, observado en condiciones
control, en las lneas transgnicas de A. thaliana, as como la mayor resistencia
de las mismas a estreses abiticos, guarda relacin con el incremento de sus
niveles de ABA. Los mayores niveles de JA y menores de SA detectados en las
lneas transgnicas sugieren que ThPG1 podra estar relacionada con la
regulacin de las defensas de la planta.




























































APNDICE






Apndice
181
SECUENCIA DEL GEN Thpg1 Y SU PROMOTOR


1 ttcattcttattttcgttttttcccatcataacctcttattcgatacctatagtagagctgaagttgatcgtcataagatcaatgaatgtaagacgcagt 100

101 tctcacatcaagtttcacgaatatacgtggagaatactcccgtatgtaacactcttttgtaattgagctactcccaaaaggattttataaccgaatcagg 200

201 gtatatgattggcacgtacggctcaaattatgcaagtcggataagtaaataccgaagcgccgacctgctgcatacggcccgggaaaatatcccaggcatc 300

301 ggattggtgcgcttttgggctttaatttgcggctgtaacttcaaagaagatcttatataatagaatccggggtttacctacttgtaatactcgatcggat 400

401 gcatcgggcaccaaactggttggtggaaagatgtggggtatatgtggcgatcaaatggctttttgaacgacaaaacacttgcaagcatttgtttttcccc 500

501 ctattatctgtttcacaatgcctttataatgtcgtattttatcctgcagaggccccaatattgcatagtcctcataaagttgggttgcgttcatgaaact 600

601 caacttcaaaacggcggcaaatatgaggtctcgatcctgaactatagactacagcctgttgtctccaacagcctgagatcatgacatgtagtttataata 700

701 caggggttgacatctatataactctgcctgatccccattgtcaagtaccaagaagctgagaagtcatcgactcatcaagataataaaacttacatcaaaa 800

801 agtgtatacaac ATG ACC AAA CTA TCC CTT CTC CTC GGA GCG CTC GCA GCA TCG GTC TGT GTT CAA TCC CAT GCT CTT 878
1 M T K L S L L L G A L A A S V C V Q S H A L 22

879 CCA TCT CCT CCT ACA GTT ACA CAA GCA CCC GAG CTT GAA GAT CGA GCT ACT ACT TGC ACT TTC TCT GGT GCC AAT 953
23 P S P P T V T Q A P E L E D R A T T C T F S G A N 47

954 GGA GCA TCT TCA GCA AGC AAG TCG CAG AAG TCG TGC GCT ACC ATC GTG CTG TCA AAT GTT GCT GTC CCT TCG GGT 1028
48 G A S S A S K S Q K S C A T I V L S N V A V P S G 72

1029 GTG ACT CTC GAT CTT AGT GAC TTG AAT GAT GGC ACT ACT gttgagtaatactaaaatgacaaaattagacgcgcaatacaacgata 1114
73 V T L D L S D L N D G T T 86

1115 ctgattagacggcttttaaaactatag GTC ATT TTT CAG GGG ACC ACT ACT TGG GGC TAC AAG GAG TGG TCT GGC CCT CTG 1195
87 V I F Q G T T T W G Y K E W S G P L 103

1196 CTC CAA ATC GAG GGC AAT GAT ATC ACC ATC CAG GGT GCC AGT GGT TCA GTT TTG GAT CCC CAG GGC TCC CGT TGG 1270
104 L Q I E G N D I T I Q G A S G S V L D P Q G S R W 128

1271 TGG GAT GGC GAA GGC AGC AAC GGT GGC AAG ACG AAG CCA AAG TTC TTT GCT GCT CAT GAT CTA ACC CCT TCA TCC 1345
129 W D G E G S N G G K T K P K F F A A H D L T P S S 153

1346 ATC ACC AAC CTG AAC ATC AGG AAC ACA CCT GTC CAA GCC GTC AGC GTG AAT GGT GTC AAT GGA CTT ACC ATC ACT 1420
154 I T N L N I R N T P V Q A V S V N G V N G L T I T 178

1421 GGA ATG ACA ATT GAC AAC AGT GCT GGT GAC AGT GGT GGC GGC CAC AAC ACC GAC GGA TTT GAC ATT GGC TCT AGC 1495
179 G M T I D N S A G D S G G G H N T D G F D I G S S 203

1496 TCG AAT GTT GTC ATT AGC GGA GCC AAA GTT TAT AAC CAA GAT GAC TGC GTT GCC GTC AAC TCT GGA ACA gtaagtca 1572
204 S N V V I S G A K V Y N Q D D C V A V N S G T 226

1573 ctttctactgaagatcaagaaagctgaggaaattcttgactaaacaatatag AAC ATC ACA TTC ACT GGA GGT CTT TGC TCT GGT GGA 1660
227 N I T F T G G L C S G G 238

1661 CAT GGA TTG TCA ATC GGT AGC GTC GGC GGC CGA GAT GAC AAC ACT GTT CAA ACA GTT ACT TTT AGC AAC TCG CAG 1735
239 H G L S I G S V G G R D D N T V Q T V T F S N S Q 263

1736 GTT ACC AAG TCA GCC AAT G gtaagtcgtttagagaaatctagtttttttagattattgactaagcactttacag GC ATT CGT ATC AAG 1823
264 V T K S A N G I R I K 274

1824 GCA TCG GCT GGT GAT ACC GGG ACA ATC AAG GGA GTG ACC TAC ACA GGT ACT ACT CTG TCG GGC ATC ACG GG gtatg 1899
275 A S A G D T G T I K G V T Y T G T T L S G I T G 298

1900 ccaccgtccaaatccattaatttagctcattaataacctgtgactcacag A TAT GGT ATT CTT ATT GAG CAA AAC TAC GAT GGT GGT 1986
299 Y G I L I E Q N Y D G G 310

1987 GAC CTG CAC GGA AGC CCC ACG AGC GGT ATC CCC ATT ACC AAC CTC GTA CTC CAG AAC ATC TCT GGA AGT GGC GGC 2061
311 D L H G S P T S G I P I T N L V L Q N I S G S G G 335

2062 GTC TTA TCA AGC GCC AAC AAT ATC GCC GTC GTT TGT GGA AGT GGA GCT TGT TCT AGC TGG ACC TGG AGC AAC GTC 2136
336 V L S S A N N I A V V C G S G A C S S W T W S N V 360

2137 GTC GTC ACT GGA GGA AAG AAA TAT GGC AGC TGC CAG AAC GTA CCA AGT GTT GCT ACT TGT TAA 2199
361 V V T G G K K Y G S C Q N V P S V A T C * 381










































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