BIOLUMINISCENCIA:

Verificación de
Limpieza y Desinfección
de superficies y equipos

© 2008. AgroBioTek
 DIRECTRICES PARA VERIFICACIÓN
DE LIMPIEZA Y DESINFECCIÓN

• La FDA indica que para establecer

Programas Operativos Estándar de
Saneamiento (SSOP) se debe usar
un método que VERIFIQUE que el
procedimiento operacional de
saneamiento es efectivo.

• Los métodos recomendados son:

análisis microbiológicos y
bioluminiscencia.

© 2008. AgroBioTek
 Limpieza: Dos Métodos de
Verificación
Verificación de la
Detección de efectividad de limpieza
microorganismos
• Método Bioluminiscencia:
• Método tradicional de Placas Petri Detecta ATP y AMP en
microorganismos y material
• Resultados de 2-7 días orgánico
• Lectura UFC/ gramo o cm2 • Resultado 10 segundos
• Lectura URL (Unidades Relativas
de Luz)

© 2008. AgroBioTek
 ¿QUÉ ES
BIOLUMINISCENCIA?

© 2008. AgroBioTek
 BIOLUMINISCENCIA:
• Es la detección de Adenosina Trifosfato (ATP) y/o
Adenosina Monofosfato (AMP) que son la fuente de
energía de toda célula
• Altas concentraciones de ATP/AMP están directamente
relacionadas con la presencia de microorganismos y/o de
material orgánico que sirve de “alimento” para el
crecimiento de microorganismos

Se usa como “Indicador de Limpieza”

[ATP/AMP] = presencia de materia orgánica y/o microorganismos
[ATP/AMP] = ausencia de materia orgánica y/o
microorganismos
© 2008. AgroBioTek
 ¿QUÉ ES ATP?

ATP: (Adenosina TriPhosfato) es la principal molécula que

provee energía a toda célula viva y esta involucrada
en el metabolismo y crecimiento celular.

© 2008. AgroBioTek
 ¿QUÉ ES AMP?
AMP: (Adenosina MonoPhosfato) se deriva de ATP durante
el proceso metabólico de la célula o durante
calentamiento o fermentación de los alimentos

© 2008. AgroBioTek
 DETECCIÓN DE ATP y AMP
La empresa Japonesa Kikkoman ha inventado y patentado un método
que usa la enzima PPDK (Piruvato ortofosfato dikenasa) para
„regenerar‟ ATP, permitiendo detectar ATP y AMP durante el ciclo de
bioquímico que genera ATP
TECNOLOGIA TRADICIONAL TECNOLOGIA KIKKOMAN
Piruvato + Pi Fosfofenol piruvato (PEP)
ATP
(Alimento/bacteria)
AMP + PPi Mg2+
Mg2+ PPDK
Luciferasa

ATP AMP + PPi

Luciferina + O2 Mg2+
Oxiluciferina + CO2 + LUZ
(reactivo del hisopo) Luciferasa Señal
amplificada
de luz
Luciferina + O2 Oxyluciferina + CO2 +

La generación CÍCLICA de ATP-AMP resulta en una señal

fluorescente más intensa y más estable.
© 2008. AgroBioTek
 Luminometros e hisopos
Kikkoman detectan ATP y AMP

Hisopo RECICLAJE DE ATP - AMP

“LuciPac Pen” Luciferasa

Mg2+
Luciferina
Oxiluciferina
Hisopode O2
algodon Tecnologia CO2
Reactivo de ATP Patentada de AMP
extraccion Kikkoman’
Pi PPi
Reactivo PEP
luminiscente Piruvato
Mg2+

Piruvato dikinasa fosfato

（PPDK）

*AMP: Adenosina monofosfato *ATP: Adenosina trifosfato

© 2008. AgroBioTek
 Correlación entre niveles de
ATP+AMP e intensidad de luz (URL)

ATP: Curva de calibración

Luciferina + O2 + ATP
106

Bioluminescence (URL)
Luciferasa Mg2+ 105

104
AMP+Oxiluciferina+CO2+PPi
103
+
102
Luz
101
10-17 10-16 10-15 10-14 10-13 10-12
ATP (mol/prueba)

© 2008. AgroBioTek
 DETECCIÓN DE ATP+AMP = ALTA SENSIBILIDAD
INTENSIDAD DE LUMINISCENCIA (URL)

Cerveza Cafe Jugo de Leche Chorizo Queso Hamburguesa

manzana de soja congelada

ATP + AMP KIKKOMAN

ATP LUMINOMETRO „B‟
ATP LUMINOMETRO „A‟

© 2008. AgroBioTek
 %CV: Reproducibilidad
(N = 20)

200
Intendidad Relativa BL (%)

175

150

125

100

75

50

25

0
LuciPac Pen ULTRASNAP CleanTrace AccuPoint PocketSwab MVP Devices

Valor CV 11% 14% 15% 30% 29% 34%

(ATP 10-12mol/prueba)
Enzima Liquida (como % del promedio de intendidad BL)

Hisopos Lucipac Pen tienen ALTA REPRODUCIBILIDAD

© 2008. AgroBioTek
 Ventajas del Hisopo Lucipac Pen
1. Es el ÚNICO hisopo en el mercado que detecta Adenosina
Trifosfato (ATP) y Adenosina Monofosfato (AMP)
¿Porqué es importante la detección de AMP?
 Bacterias en reposo (esporas) derivan su energía de AMP
 Residuos de alimentos acumulados (no frescos) contienen solo
AMP (ATP que es inestable y se degrada a AMP)
 Alimentos cocidos, procesados y calentados contienen solo AMP,
bajo cocción ATP se degrada a AMP (MOSTRAR VIDEO)

2. El sistema de bioluminiscencia ATP+AMP genera una reacción

cíclica que emite una luz mas estable y mas duradera
3. Los hisopos Lucipac Pen emiten una señal (URL) con un
bajo coeficiente de variación
4. Los hisopos Lucipac Pen son estables a temperatura
ambiente © 2008. AgroBioTek
 PANTALLA

Hisopo
“LuciPac Pen”
Uso del Luminometro PD-20

PD-20 y el hisopo
Lucipac Pen

© 2008. AgroBioTek
PROCEDIMIENTO de MEDICIÓN

1. Retirar la bolsa de hisopos del refrigerador y permitir que alcancen

temperatura ambiental (aproximadamente a 24 °C)

2. Activar el luminómetro presionando „POWER‟

3. Retirar el hisopo del protector plástico y humedecerlo con agua del grifo.

(Si la superficie que se va a analizar esta húmeda, no hay necesidad de

humedecer el hisopo antes de usarlo)

© 2008. AgroBioTek
PROCEDIMIENTO de MEDICIÓN (cont..)
4. Con el hisopo, tomar muestra del objeto o de la superficie deseada

5. Inserte de nuevo el hisopo en su protector plástico

6. Agite el hisopo para que baje al fondo el liquido y disuelva el reactivo

fluorescente.

© 2008. AgroBioTek
PROCEDIMIENTO de MEDICIÓN (cont..)
7. Inserte el hisopo en la cámara del luminómetro y apriete la tecla „ENTER‟
para iniciar la medición de intensidad de luz fluorescente (URL)

Realizar la lectura sin inclinar el luminómetro mas de 60°

8. Al terminar la lectura, retirar el hisopo del luminómetro y si no se va usar

por mucho tiempo, se recomienda sacar las baterías.

© 2008. AgroBioTek
 Técnica de Toma de Hisopado de
Superficie

10 cm2

Hisopado de Insertar el Sacudir el Insertar el

Superficie Hisopo de hisopo para Hisopo en el
vuelta en el empujar el Lumitester y
tubo y reactivo hacia realizar la
romper la el fondo del lectura
capsula del tubo
reactivo

© 2008. AgroBioTek
INTERPRETACIÓN DE
RESULTADOS DE
BIOLUMINISCENCIA
Microorganismos

Residuo de comida
Tabla de cortar

© 2008. AgroBioTek
INTERPRETACIÓN: CONTEO DE MICROORGANISMOS EN
PLACAS PETRI Y BIOLUMINISCENCIA
POR ATP+AMP
MÉTODO BIOLUMINISCENCIA
TRADICIONAL Microorganismos MÉTODO ATP
PLACAS PETRI

CONCLUSIÓN CONCLUSIÓN

Residuo de comida
SUCIO SUCIO
Tabla de cortar

Residuo de comida
LIMPIO Tabla de cortar SUCIO

LIMPIO Tabla de cortar LIMPIO

© 2008. AgroBioTek
 INDICADOR DE HIGIENE y BPM:
BIOLUMINISCENCIA POR ATP-AMP

Contaminación orgánica y por microorganismos

Microorganismos
aerobios

Residuo de Indicadores
alimento

Patógenos

© 2008. AgroBioTek
IMPLEMENTACIÓN DE UN
PROGRAMA DE
VERIFICACIÓN DE
LIMPIEZA

© 2008. AgroBioTek
 ¿Qué implica?
• Dos etapas para
implementarlo.

• Métodos de muestreo
estandarizados.

• Registro de toma de
datos.

© 2008. AgroBioTek
 Bioluminiscencia ATP+AMP:
Monitoreo Higiénico “Paso a Paso”

1. Establecer los puntos para toma de muestras

ETAPA 1

2. Establecer niveles de “puntos de corte” (URL numérico)

3. Establecer programa de toma de muestras

ETAPA 2
4. Establecer valores numéricos URL de “puntos de corte”:
- Limpio (valor numérico bajo de URL)
- Sucio (valor numérico alto de URL)

© 2008. AgroBioTek
 ETAPA I:
(sin intervención)

© 2008. AgroBioTek
 1. Establecer los puntos para toma
de muestras

Criterios de selección
• Áreas difíciles de limpiar: nichos
para el crecimiento de
microorganismos

• Áreas donde no solo se limpia,

sino que también se desinfecta

• Áreas que tienen contacto con

alimentos „listos para consumir‟

• Áreas expuestas a contaminación

cruzada; como ser, las manos y
dedos de los empleados que
manipulan alimentos
© 2008. AgroBioTek
 2. Establecer niveles de „puntos de corte”
(URL numérico)

- Superficies lisas de metal o vidrio (no porosas): seleccionar 200 URL

como punto de control

- Superficies porosas de plástico: seleccionar 500 URL como punto de

control

“Estos valores de corte no son aplicables en todos lugares

y superficies; la meta es seleccionar „puntos de corte‟ que
se puedan alcanzar implementando un plan de limpieza
eficiente y verificable con un muestreo adecuado”

- Escoger una manera de tomar la muestra que sea acorde con el objeto
y lugar que se desea evaluar; tomando la muestra de la misma manera
y áreas de similar tamaño de superficie (10 cm2)

© 2008. AgroBioTek
 Ejemplo de toma de muestra en manos y
dedos de manipuladores de alimentos

- Tomar muestra con el hisopo en la palma de la mano, los dedos

y las uñas. Hacerlo siempre de la misma manera.

PUNTOS DE CORTE SUGERIDOS

LIMPIO: igual o menor a 1500 URL
SUCIO: igual o mayor de 3000 URL

© 2008. AgroBioTek
 ETAPA II:
(Intervención)

© 2008. AgroBioTek
 3. Establecer un programa de toma de
muestras

• Utilizar de luminómetro para

determinar cantidades de ATP+AMP.
 Realizar análisis microbiológico: UFCs (Unidades
formadoras de colonias).
 Cantidades altas de ATP/AMP y UFCs son
indicadores de un Punto Crítico de Control.
Frecuencia de toma de muestras: diaria
 Cantidades bajas de ATP/AMP y UFCs son
indicadores de un Punto de Control: Frecuencia
de toma de muestras: semanal

• Tomar las muestras después de realizar las

tareas de limpieza y antes proceder con la
desinfección (inactiva la luciferina)
• Tomar muestras antes de iniciar el proceso
de producción del día (pre-operativas )
© 2008. AgroBioTek
Ejemplo de toma de muestra en utensilios
de cocina

LIMPIO SUCIO TOMA DE MUESTRA

500 1000 10 cm2 al centro

200 400 10 cm2 en 5 puntos diferentes

200 400 ambas superficies, unión con el mango

200 400 en las esquinas

200 400 3 áreas (fondo, mitad y arriba)

200 400 en toda la superficie

500 1000 10 cm2 al centro de la parilla

© 2008. AgroBioTek
 4. Establecer valores numéricos (URL)
de “puntos de corte”

PUNTO DE CORTE
(URL) ACCION 2da
1ra MUESTRA
CORRECTIVA MUESTRA
SITIO LIMPIO SUCIO

760 450
Tabla de cortar 500 1000 LIMPIAR
(ADVERTENCIA) (LIMPIO)

Superficie de mueble 200 400 130 (LIMPIO) NINGUNA

300 120
Cuchillo 200 400 LIMPIAR
(ADVERTENCIA) (LIMPIO)
Tonel (acero 44
200 400 NINGUNA
inoxidable) (LIMPIO)
174
Caldero redondo 200 400 NINGUNA
(LIMPIO)
820 187
Perilla de refrigerador 200 400 LIMPIAR
(SUCIO) (LIMPIO)
Refrigerador 2000 391
500 1000 LIMPIAR
(adentro) (SUCIO) (LIMPIO)

© 2008. AgroBioTek
!Gracias!

© 2008. AgroBioTek