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Diferenciación de tejidos en la regeneración de plantas a partir de callos

organogénicos de caña de azúcar

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4 authors, including:

Marcela A Hernández Osvaldo Arce

Fundación Miguel Lillo National University of Tucuman
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 Díaz et al. Diferenciación de tejidos en callos de caña de azúcar

Diferenciación de tejidos en la regeneración de plantas a partir de callos organogénicos

de caña de azúcar
Differentiation of tissues in the regeneration of plants from organogenetic callus of sugar cane

Lucía P. Díaz1, Marcela Hernández2 , Salvador Chaila 1 y Osvaldo Arce3

1.- Universidad Nacional de Tucumán, Facultad de Agronomía y Zootecnia, Laboratorio de Cultivo de

Tejidos Vegetales, Cátedra Caña de Azúcar. 2- Fundación Miguel Lillo. Laboratorio de Morfología Vegetal.
Miguel Lillo 251. 4000. Tucumán. Argentina.
E-mail: mteran@csnat.unt.edu.ar 3. Cátedra Biometría y Técnica Experimental. CC 125. 4000. Tucumán,
Argentina. E- mail: ldiaz@manant.unt.edu.ar

Resumen incremento de la proporción de células xilemáticas que

presentaron, ontogenéticamente, engrosamientos
Lucía P. Díaz,; Marcela Hernández; Salvador Chaila anillados, espiralados y escalariformes; simultáneamente
y Osvaldo Arce. 2006. Diferenciación de tejidos en la se observaron agrupaciones de tejidos conductores. Se
regeneración de plantas a partir de callos organogénicos verificó un incremento de la actividad meristemática,
de caña de azúcar . Anales de Botánica Agrícola. observándose zonas con células isodiamétricas con
13:5-13 núcleos grandes y células parenquimáticas de gran
tamaño.
El objetivo de este trabajo es el estudio de procesos de
diferenciación tisular en la regeneración de plantas a Palabras clave: Anatomía, callos, in vitro, Saccharum
partir de callos organogénicos de caña de azúcar spp híbrido, cultivo de tejidos.
(Saccharum spp híbrido) c.v. NA 63-90 proveniente
del campo Experimental Finca El Manantial, FAZ- Abstract
UNT. Se utilizaron vainas foliares sin expandir y se
las incubó en Murashige y Skoog(MS) 1962 modificado, Lucía P. Díaz , Marcela Hernández, Salvador Chaila
con el agregado de 2,4-D (3ppm), cinetina (1ppm), and Osvaldo Arce. 2006. Differentiation of tissues in
hidrolizado de caseína (1 g/l), extracto de levadura (1 the regeneration of plants from organogenetic callus of
g/l), ácido cítrico (150 ppm), agar (6 g/l) (MSI), pH sugar cane (Saccharum spp). Anales de Botánica
5,6 en la oscuridad a 25-27 °C. Los callos formados Agrícola 13:5-13
cada 20 días se transfirieron a medio fresco y se
subdividieron periódicamente. A los 120 días, los callos The aim of this work is the study of tissue differentiation
se incubaron en MSI pero sin el agregado de 2,4-D processes in the regeneration of plants from sugar cane
(MSII), a 25-27 °C y 12 horas de luz. Para los estudios organogenetic callus of sugar cane (Saccharum spp).
histológicos se muestrearon 2 callos /día incubados Unfolded leaf sheath from the apical part of the stem
en MS(II). Y las muestras se fijaron en FAA (formol, of the variety NA 63-90, were used from the
etanol 70 %, ácido acético) y se las incluyó en parafina Experimental Field “El Manantial” FAZ- UNT.
(Johansen,1940) para realizar los cortes con micrótomo The leaf sheaths were incubated in Murashige Skoog
rotativo a 12 m de espesor. Se utilizaron dos coloraciones ,1962 (MS) modified with the addition of 2-4 D (3ppm),
diferenciales: safranina-fast green y ácido tánico-azul kinetin (1ppm), casein hidrolysate (1g/l), yeast extract
de resorcina y una coloración metracromática: violeta (1g/l), citric acid (150 ppm), agar (6g/l) ( MSI), pH 5,6.
de crescilo. The conditions of the culture were: darkness and 25-
Al inicio de regeneración de plantas se observó 27ºC. The new callus formed were transferred to a fresh
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 Anales de Botánica Agrícola 13 (2006)

medium every 20 days, and were periodically entonces, se la utiliza para la obtención de variabilidad
subdivided. After 120 days, the callus were incubated genética y para la multiplicación de variedades
in a MS medium without 2-4 D (MSII), at 25-27ºC comerciales difundidas al medio cañero, o para propagar
and 12 hours of light. For the histological studies 2 caña semilla de calidad en los semilleros (Hendre et al,
callus per day were sampled incubated in MSII. The 1993; Díaz et al.1997). Para evaluar los cultivares
samples were fixed in FAA and included in paraffin obtenidos in vitro, ya sea por micropropagación directa
(Johansen, 1940). The callus were cut with a rotating o por cultivo de callos, es necesario iniciar estudios
microtome at 12 m. Two differential stains: safranine histológicos básicos que en las variedades de caña de
and fast green and tannic acid and resorcine blue, and azúcar sería útil, tanto para encontrar caracteres
a metachromatic dye: crescyl violet. diferenciales entre una variedad y otra, como para
At the beginning of the differentiation an increase of buscar correlaciones entre los caracteres histológicos
the number of xilematic cells was verified, vessel y la riqueza en sacarosa. Liu y Chen (1978) en su
elements were solitary at the beginning and tend to estudio de la organogénesis de los callos de caña de
aggregate with ring thickening to scalariform. azúcar, mencionaron la aparición de las traqueidas
Simultaneously groups of conducting tissue were dentro de los treinta primeros días después del cultivo.
observed. An increase of the meristematic activity was Liu y Chen (1974) encontraron que el protoxilema se
verified with areas with isiodiametric cells with big forma a los 17 días, en los callos inducidos a
nuclei The nucleus possesses a single electron diferenciación. Ellos observaron dos patrones en la
microscope dense nucleolus and big parenchimatic diferenciación de los callos: 1) Se forman primero los
cells. brotes y luego las raíces. 2) Las células pierden la
capacidad de regenerar brotes y sólo se forman raíces
Key words: anatomy, callus, , in vitro, sugarcane, tissue a partir de los callos.
culture. El objetivo de este trabajo es el estudio de procesos
INTRODUCCIÓN de diferenciación tisular en la regeneración de plantas
a partir de callos organogénicos de caña de azúcar del
La caña de azúcar ( Saccharum spp.híbrido) es una cultivar NA 63-90. Se trata de un estudio en etapas
planta perenne perteneciente a la tribu Andropogoneae, iniciales de los procesos de diferenciación y
familia Poaceae (Gramineae). En condiciones de cultivo desdiferenciación de callos, para compararlos en una
produce, en corto período, un alto rendimiento de etapa posterior con callos de estructura embriogénica
materia verde, energía y fibras, por lo que se la considera ( Díaz, Chaila y Arce. 2001)
una de las plantas con mayor eficiencia fotosintética.
En regiones tropicales y subtropicales de numerosos MATERIALES Y METODOS
países, se realizan plantaciones comerciales para la
obtención de azúcar, alcohol y otros subproductos. Para la producción de callos de la variedad comercial
Debido a su importancia económica, en los países NA 63-90 se utilizó como explanto discos de vaina de
azucareros del mundo se encuentran en marcha hojas sin expandir de la parte apical del tallo. Dichos
programas de mejoramiento por la vía sexual, los cuales explantos se incubaron en medio de Murashige y Skoog.
requieren de 12 años de trabajo, por lo menos, y de una 1962 (MS), modificado con el agregado de 2,4-D
gran superficie de terreno. Como método (3ppm), cinetina (1ppm), hidrolizado de caseína (1
complementario se usan las herramientas del Cultivo gr/l), ácido cítrico (100 ppm), sacarosa (30 gr/l ), agar
de Tejido Vegetales in vitro iniciado en Hawaii por (5-8 gr/l): MSI; pH: 5,7 (Martínez Zuccardi y Díaz.
Nickel en 1961 y Heinz y Mee (1969), dieron los 1982).
fundamentos para la aplicación de esta técnica en la
producción de plantas de caña de azúcar. A partir de Las condiciones de cámara de cultivo fueron: oscuridad
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 Díaz et al. Diferenciación de tejidos en callos de caña de azúcar

y 25-27 °C. Una vez formados los callos, se ácido tánico- azul de resorcina, que es un colorante
subdividieron cada veinte días y se incubaron en medio específico de la calosa.
de cultivo fresco. A los 120 días, para favorecer la
formación de órganos, el material fue transferido a MS El análisis estadístico se realizó con el estudio de todos
II sin 2,4-D y a condiciones de 25-27 ° C y 12 horas los tipos de células presentes en 20 campos de
de luz. A fin de observar la ontogenia de los callos, se microscopio óptico, con un aumento de 400x y el
realizaron los estudios histológicos correspondientes procedimiento se repitió cada 5 días. Se analizó la
entre los 120 y hasta los 160 días. Se tomaron muestras composición porcentual de los distintos tipos de células
de dos callos cada cinco días, repitiéndose el muestreo en cada fecha de observación graficándose el proceso.
al año siguiente. Para encontrar la relación entre los totales para los
distintos tipos de células y el tiempo transcurrido, se
Los callos se fijaron 48 horas en formol, ácido acético hicieron ajustes mediante regresión polinomial de
y alcohol 70 % (FAA). Luego se los incluyó en parafina, diferentes grados.
con la serie del alcohol etílico (Johansen, 1940).
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Los cortes de 10 a 15 micrones de espesor, se realizaron
con el micrótomo rotativo Leitz. Un tercio de los mismos En el proceso de regeneración de plantas a partir de
se trató con la coloración diferencial: Safranina-Fast callos organogénicos de caña de azúcar, se observó que
Green (Dizzeo de Strittmater, 1979); otro tercio con en un primer momento (Fig. 1 a) son friables, con una
ácido tánico-azul de resorcina (D'Ambroggio, 1986) y estructura no compacta, poseen forma irregular, se
el último tercio con coloración metracromática violeta separan fácilmente y diferencian las plántulas en el día
de crescilo (D'Ambroggio, 1986). Las muestras para 40 de iniciado dicho proceso de regeneración, es decir
M.E.T. y M.E.B. se fijaron en glutaraldehido y fueron luego de los 120 días iniciales (Ho y Vasil,1983; Aguiar
procesadas en el Servicio de Microscopía Electrónica, Costa Lima et al., 2000 reportaron resultados similares).
Insibio. UNT. CONICET. Los callos fueron tratados Se notó un marcado predominio de células
con un baño de oro paladio. Se tomaron fotografías parenquimáticas indiferenciadas (Fig. 1 b) y la aparición
con un equipo Jeol JSM 35 CF (CONICET, Tucumán). de elementos del xilema a partir del día 1, lo que
Se obtuvieron los índices estomáticos según Salisbury significa el 8 % de las células observadas en los 20
(1927). campos de microscopio. En cambio Liu y Chen (1978)
Para el estudio de los distintos tejidos presentes en mencionaron la aparición de elementos del xilema
cada uno de las muestras, se trabajó con los índices dentro de los treinta primeros días de cultivo en MSII
obtenidos del modelo formulado por Salisbury (op.cit.) mientras que Liu y Chen (1974), observaron elementos
: del xilema a los 17 días de inducida la diferenciación
de los callos en plantas.
ne x 100
I
n e + nt Los índices estomáticos obtenidos según el modelo
Dónde: de Salisbury(1927), para los distintos tejidos de las
I = Indice muestras obtenidos de callos organogénicos de caña
ne = número de células estudiadas de azúcar y aplicados en células parenquimáticas,
nt = número de células totales meristemáticas, xilemáticas y en fibras se muestran en
el Cuadro 1.
Se aplicó dicho índice para células parenquimáticas,
meristemáticas, xilemáticas, floemáticas y fibras. Para Las células xilemáticas observadas aumentaron su
la caracterización del floema se utilizó la coloración de proporción desde un 8 hasta un 30% durante el período

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 Anales de Botánica Agrícola 13 (2006)

Figura 1: Secuencia de la regeneración de plantas a partir de callos organogénicos de caña de azúcar. a) primeros momentos. b) células parenquimáticas
indiferenciadas. c,d,e,f) elementos del xilema con engrosamientos anillados, espiralados y escalariformes.

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 Díaz et al. Diferenciación de tejidos en callos de caña de azúcar

Figura 2: Diferenciación celular en la regeneración de plantas a partir de callos organogénicos de caña de azúcar (ver texto para axplicación)

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 Anales de Botánica Agrícola 13 (2006)

Cuadro 1: Indices de Salisbury para diferentes tipos de tejidos obtenidos a partir de callos organogénicos de caña de azúcar en distintas fechas de
muestreo. Tucumán. 2003.

de estudio; por otro lado, los elementos del xilema aparecieron a partir del día 15, con un porcentaje del
presentaron, cronológicamente, engrosamientos 1%, aumentando su proporción hasta llegar a 8% el
anillados, espiralados y escalariformes (Fig. 1c,d,e,f). día 40. A medida que transcurrieron los días y los tejidos
Simultáneamente se observaron agrupaciones de comenzaron a diferenciarse, hubo una disminución del
elementos xilemáticos (Fig. 2). Se comprobó la presencia porcentaje de células parenquimáticas, desde un 78 %
de traqueidas con engrosamientos en la pared secundaria, el día 1, hasta un 35% el día 40. Con respecto a las
constituida por dos espirales en sentido contrario (Liu células meristemáticas y los elementos del xilema
y Chen, op. cit.). Se verificó un incremento de la tienden a agruparse, encontrándose menor cantidad de
actividad meristemática y un aumento del porcentaje elementos dispersos. Se diferencian zonas con células
de células meristemáticas con respecto a otros tejidos, isodiamétricas (meristemáticas) con núcleos grandes
desde un 15 hasta un 28 % (Fig. 3). Las fibras, y células parenquimáticas de hasta 100m que presentan

Figura 3: Composición porcentual de los distintos tipos de células

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 Díaz et al. Diferenciación de tejidos en callos de caña de azúcar

Figura 4: Evolución del xilema Figura 5: Análisis de formación de células parenquimáticas.

Figura 6: Análisis de formación de células meristemáticas. Figura 7: Análisis de formación de fibras.

abundantes amiloplastos (Figs. 1 d y 2 a) los cuales Los resultados observados a nivel de ultraestructura
cubren la mayor parte de los tejidos parenquimáticos muestran cambios significativos a nivel celular debido
en los campos del microscopio, en todas las fechas de a su intensa actividad metabólica, lo que coincide con
muestreo (Fig. 2 d). En el día uno del proceso de lo observado por Carrillo-Castañeda, Vargas y Vargas-
diferenciación los callos presentaban, en el 90 % de Villanueva. (1986). Al M.E.T. Se observaron células
los campos, tejido parenquimático poco diferenciado con citoplasma denso, retículo endoplasmático bien
además de tejido meristemático (Fig. 1 e). También se desarrollado y ribosomas dispersos en el citoplasma
observaron traqueidas en forma esporádica y poco frecuente celular; los núcleos presentaron de uno a tres nucleolos
y en todos los casos con engrosamientos anillados. grandes (Fig. 2 f, g y h), lo que indica una intensa
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 Anales de Botánica Agrícola 13 (2006)

síntesis proteica. En algunos casos los núcleos son cúbico como se observa en la Fig. 6, y responde a un
alargados en el sentido de la célula por la presencia de R 2 = 0.79874, para la ecuación siguiente:
una gran vacuola central que desplaza al núcleo hacia Cél. Mer. = 198.830959 + 4.341329 Días - 0.858908
la periferia y se observaron numerosas mitocondrias Días2 + 0.021635 Días3
esféricas o alargadas en las células. Al M.E.B. los callos
mostraron células alargadas, laxas, de aspecto Las fibras es el tejido que más tarde aparece y es el
desordenado y con amplios espacios entre las mismas, que se presenta con menor proporción (siempre inferior
observándose una clara diferenciación entre una célula al 10%). Se analiza en la Fig. 7 el proceso para la
y las adyacentes (Fig. 2 e). formación de fibras, con un ajuste cuadrático para un
El análisis del tejido xilemático muestra que desde el R2 = 0.95537, en la ecuación siguiente:
primer día existió un aumento constante del número Fibras = -3.518015 + 1.623663 Días + 0.024644
de elementos xilemáticos, lo que se observa en las Días2.
figuras 3 y 4. Las características de los elementos
conductores se modificaron durante su formación: Se observó un incremento en relación directa con el
inicialmente los engrosamientos son anillados y a partir aumento del tamaño del callo y del tejido conductor.
del día 10 presentaban engrosamientos espiralados, En el caso del floema, no se ha verificado la presencia
mientras que entre los días 35 y 40 se observaron de elementos de este tejido en ninguno de los estadios
elementos con engrosamientos netamente estudiados ya que la coloración ácido tánico y azul de
escalariformes. La gráfica de porcentajes (Fig.3) permite resorcina fue negativa. En esta etapa de la evolución
visualizar la distribución de tejidos en cada una de las de los callos, por otra parte, no hay datos bibliográficos
fechas de muestreo. En la Fig. 4, con la finalidad de que indiquen la formación de floema por otra parte los
observar la evolución del xilema, se realizó un ajuste autores de este trabajo, en coincidencia con lo antedicho,
cuadrático con un R2 = 0.87581, que responde a la no han verificado su presencia. Sobre los estudios
ecuación: histológicos de callos de caña de azúcar, según la
Xilema=65.511811 + 20.870233 Días - 0.302766 bibliografía consultada, los elementos xilemáticos
Días 2 aparecen aislados y en número reducido a partir del
primer día, desde el momento de la inducción de la
En el análisis del parénquima se observa, entre los diferenciación de los tejidos (Hernández et al.,1996).
días 1 y 5, la mayor proporción de este tejido. Las En conclusión los resultados obtenidos en este trabajo
células parenquimáticas poseen gran cantidad de granos demostraron una aparición más temprana de tejido
de almidón compuesto que se presentan, en la mayoría xilemático ya que a partir del día 10 el número de
de los casos, en cantidades equivalentes a las existentes dichos elementos se hace importante .
en el parénquima no amiláceo. En la Fig. 5 el ajuste
que se realiza para un R2 = 0.81478 tiene AGRADECIMIENTOS
correspondencia con la expresión siguiente:
Parénquima = 888.338237 - 8.333350 Días + 0.586372 Los autores agradecen la inestimable colaboración
Días2 - 0.015060 Días3. Al incrementar el porcentaje del Ing. Agr. Jorge G. Latife y del Sr. Sebastián Bollati,
de tejido meristemático, pueden observarse verdaderos en la recolección de muestras, para el seguimiento del
meristemas, que coincide con el tipo usual en las proceso de regeneración de plantas .
Angiospermas según Fahn (1974). Se verificaron
claramente el meristema superficial, las células centrales BIBLIOGRAFÍA
y los meristemas marginales y centrales, rodeados de
células parenquimáticas (Fig. 2 c ). El análisis para 1.Aguiar Costa Lima, M.; Garcia Oliveira, R.; Sachetto
células meristemáticas se realiza mediante un ajuste Martins, G. y E. Mansur. 2001. Morfogênese in

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 Díaz et al. Diferenciación de tejidos en callos de caña de azúcar

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