Determinación de Mesofilos Aerobios Metodo Petrifilm

DETERMINACIÓN DE MESOFILOS AEROBIOS Página: No.
METODO PETRIFILM 1 de 11
DETERMINACIÓN DE MESOFILOS AEROBIOS

METODO PETRIFILM
TABLA DE CONTENIDO
ELABORADO POR REVISADO POR APROBADO POR
1. OBJETIVO..........................................................................................................3
2. ALCANCE...........................................................................................................3
3. RESPONSABILIDAD..........................................................................................3
4. DEFINICIONES..................................................................................................3
5. RECURSOS.......................................................................................................3
6. PROCEDIMIENTO.............................................................................................4
6.1. GENERALIDADES:......................................................................................4
6.1.1. Principio.................................................¡Error! Marcador no definido.
6.2. DESCRIPCIÓN DEL PROCEDIMIENTO.....¡Error! Marcador no definido.
6.3. CÁLCULOS..................................................¡Error! Marcador no definido.
7. OBSERVACIONES............................................................................................9
8. SEGURIDAD INDUSTRIAL..............................................................................10
9. FORMATOS RELACIONADOS.......................................................................10
10. CONTROL DE CAMBIOS..............................................................................10
.
1. OBJETIVO
Establecer un procedimiento operativo estándar para la determinación

microbiológica de Mesófilos Aerobios aplicado a materias primas, producto
terminado, superficies, ambientes y personal, utilizando el método de Petrifilm
2. ALCANCE
Este procedimiento aplica para materias primas, producto terminado,

superficies, ambientes y personal.
3. RESPONSABILIDAD
Es responsabilidad del Analista capacitado, entrenado y autorizado por el

Director Técnico a través del formato “Autorización del Personal del
Laboratorio”, realizar la determinación microbiológica de Mesófilos Aerobios
en las diferentes matrices de las muestras ha llegadas al laboratorio.
4. DEFINICIONES
 Placas Petrifilm para Recuento de Aerobios (Aerobic Counting AC):

Son un medio de cultivo listo para ser empleado, que contiene nutrientes
del Agar Standard Methods, un agente gelificante soluble en agua fría, y un
tinte indicador de color rojo que facilita el recuento de las colonias. Las
Placas Petrifilm AC se utilizan para el recuento de la población total
existente de bacterias aerobias en productos, superficies, etc.
 Colonia: Grupo o conjunto de microorganismos que se multiplican sobre

una superficie sólida como la de un medio de cultivo con agar; la colonia se
observa a menudo directamente, pero también puede verse con la ayuda
de un microscopio.
 Mesófilo: Microorganismo que tiene un crecimiento optimo entre 20 y 45

°C, y máximo de alrededor 45°C. El hábitat de estos organismos incluye el
suelo, el cuerpo de un animal, etc. Su temperatura óptima de crecimiento se
encuentra en los 37ºC, la temperatura normal de un cuerpo humano.
 Inoculación: Introducción de una sustancia en un organismo
5. RECURSOS
 Placas Petrifilm específicas para Mesófilos Aerobios.

 Dispersor
.
 Vial de caldo letheen 9ml.

 Jeringa de 1ml y/o 5 ml.
 Cabina de flujo laminar calificada.
 Marcador permanente
6. PROCEDIMIENTO
6.1. GENERALIDADES:
La Placa 3M™ Petrifilm™ para Recuento de Aerobios (AC) es un sistema

con medio de cultivo de muestras listo para usar que contiene nutrientes de
Métodos estándar, un agente gelificante soluble en agua fría y un indicador
tetrazolio que facilita la enumeración de las colonias. Las Placas 3M Petrifilm
AC se usan para la enumeración de bacterias aerobias en la industria de los
alimentos y las bebidas. Los componentes de la Placa 3M Petrifilm AC están
descontaminados, pero no esterilizados. El diseño y la fabricación de 3M
Food Safety cuentan con la certificación correspondiente de la Organización
Internacional para la Estandarización (ISO) 9001.
6.2. PREPARACIÓN DE LA MUESTRA
Utilice diluyentes estériles apropiados: Solución amortiguadora de fosfato

Butterfield4 , 0,1% de agua peptonada4 , diluyente de sal peptonada5 , agua
peptonada amortiguada5 , solución de hidrogenofosfato de dipotasio5 ,
solución salina (0,85 a 0,90%), caldo Letheen libre de bisulfito o agua
destilada. No utilice diluyentes que contengan citrato, bisulfito o tiosulfato en
Placas 3M Petrifilm AC; ya que estos pueden inhibir el crecimiento. Si se
indica el uso de una solución amortiguadora de citrato en el procedimiento
estándar, sustitúyala por una de las soluciones amortiguadoras mencionadas
más arriba, calentada a una temperatura entre 40 y 45 °C (104 y 113 °F). 2.
Mezcle u homogenice la muestra. 3. Para un crecimiento y recuperación
óptimos de los microorganismos, regule el pH de la suspensión de la muestra
entre 6,6 y 7,2. Para productos ácidos, regule el pH con 1N de NaOH. Para
productos alcalinos, regule el pH con 1N de HCl.
6.3. INOCULACIÓN DE LAS PLACAS
 Tomar 1mL de la muestra con una jeringa estéril y adicionar al vial de caldo
letheen, agitar fuertemente.
 Coloque la Placa Petrifilm en una superficie plana y nivelada. Levante la
película superior.
 Luego tomar 1mL de la mezcla con jeringa estéril y colóquela en el centro
de la película cuadriculada inferior.
.
 Libere la película superior dejando que caiga sobre la dilución. No la deslice

hacia abajo.
 Con el lado rugoso hacia abajo, coloque el dispersor o esparcidor sobre la

película superior, cubriendo totalmente la muestra.
 Presione suavemente el dispersor para distribuir la muestra sobre el área
circular. No gire ni deslice el dispersor. Recuerde distribuir la muestra antes
de inocular una siguiente placa.
 Levante el dispersor o esparcidor. Espere por lo menos 1 minuto a que se
solidifique el gel y proceda a la incubación.
6.4. INCUBACIÓN
Incube las placas a 35°C (± 2°C) por 48 hrs. (± 3 hrs.) (AOAC método oﬁcial
986.33) cara arriba en grupos de no más de 20 piezas. Puede ser necesario
humectar el ambiente de la incubadora con un pequeño recipiente con agua
estéril, para minimizar la perdida de humedad.
.
6.5. INTERPRETACIÓN
 Las Placas Petrifilm pueden ser contadas en un contador de colonias

estándar u otro tipo de lupa con luz.
 Los mesófilos aerobios se identifican por las colonias formadas de color
rojo.
 El número de colonias de la placa se debe multiplicar x 10.
 Se escriben los resultados en la hoja de control y luego se genera el
certificado de análisis, se debe escanear la placa como soporte de los
resultados.
.
.
.
6.6. ANÁLISIS DE MATERIAS PRIMAS
Se debe seguir el mismo procedimiento descrito del numeral 6.2 hasta 6.4 para
materias primas liquidas, para materias primas sólidas en el momento del
muestreo se debe pesar únicamente 1g (gramo) y se adiciona a la bolsa estéril
directamente el caldo letheen. Se debe ajustar pH a las muestras de materia
prima.
Ajuste el pH de la muestra diluida entre 6.6 y 7.2. Para productos ácidos usar una
solución 1N de NaOH, para productos básicos usar una solución 1N de HCl.
6.7. ANÁLISIS DE AMBIENTES
 Se inoculan las placas con 1 mL caldo letheen únicamente y se sigue

procedimiento 6.3.
 Luego se colocan en refrigeración durante 2 horas.
 Se sacan del refrigerador y se temperan por 15 minutos.
 Las placas se colocan en cada una de las áreas a muestrear, levantando la
película cuidadosamente durante 15 minutos.
 Se incuban según el numeral 6.4.
 Resultados: # de colonias en 40 cm2 x 15 minutos de exposición.
6.8. ANÁLISIS DE SUPERFICIES
 Seguir procedimiento del numeral 6.3.

 Hacer impresión sobre la superficie a analizar, en el caso de áreas se debe
tomar en cinco puntos como mínimo.
 Incubar de acuerdo al numeral 6.4.
 Resultados: # de colonias en 60 cm2.
6.9. REGISTRO DE ANALISIS MICROBIOLOGICO
Los análisis deben registrarse en el formato “Hoja de Trabajo Analítico –

Microbiología”, OBSERVACIONES
RECOMENDACIONES DE ALMACENAMIENTO
.
Almacene los paquetes cerrados Para cerrar un paquete Mantenga los paquetes
a una temperatura <8 °C (<46 abierto, doble el cerrados (según se indica en
°F). Las placas deben usarse extremo y séllelo con el punto 2) a temperatura <25
antes de su fecha de caducidad. cinta adhesiva para °C (<77 °F) y una humedad
En áreas de alta humedad, evitar el ingreso de relativa <50%. No refrigere
donde la condensación puede ser humedad y, por lo los paquetes que ya hayan
un inconveniente, es tanto, la alteración de sido abiertos. Utilice las
recomendable que los paquetes las placas. Placas Petrifilm máximo un
se atemperen al ambiente del mes después de abierto el
lugar de trabajo antes de abrirlos. paquete.
Las Placas Petrifilm tienen un
tiempo de vida útil de 18 meses
desde su fecha de elaboración.
Observe la fecha de caducidad
en la parte superior de la placa.
7. SEGURIDAD INDUSTRIAL
 Durante la ejecución de un análisis es obligatorio usar el equipo de

protección personal que sea necesario: bata, gafas, guantes, tapabocas,
entre otros.
 Antes de utilizar cualquier producto químico se debe tener conocimiento de
la información contenida en las Fichas de Seguridad.
Disponer de los residuos generados en el análisis de acuerdo al procedimiento

Manejo y Disposición de Residuos.
8. FORMATOS RELACIONADOS
 “Autorización del Personal del laboratorio”,.

 “Hoja de Trabajo Analítico – Microbiología”, .
9. CONTROL DE CAMBIOS
.
CONTROL DE CAMBIOS
Fecha Realizó el cambio
Versión Descripción
(aa-mm-dd) Cargo Nombre

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DETERMINACIÓN DE MESOFILOS AEROBIOS

Establecer un procedimiento operativo estándar para la determinación

Este procedimiento aplica para materias primas, producto terminado,

Es responsabilidad del Analista capacitado, entrenado y autorizado por el

 Placas Petrifilm para Recuento de Aerobios (Aerobic Counting AC):

 Colonia: Grupo o conjunto de microorganismos que se multiplican sobre

 Mesófilo: Microorganismo que tiene un crecimiento optimo entre 20 y 45

 Inoculación: Introducción de una sustancia en un organismo

 Placas Petrifilm específicas para Mesófilos Aerobios.

 Vial de caldo letheen 9ml.

La Placa 3M™ Petrifilm™ para Recuento de Aerobios (AC) es un sistema

6.2. PREPARACIÓN DE LA MUESTRA

Utilice diluyentes estériles apropiados: Solución amortiguadora de fosfato

6.3. INOCULACIÓN DE LAS PLACAS

 Libere la película superior dejando que caiga sobre la dilución. No la deslice

 Con el lado rugoso hacia abajo, coloque el dispersor o esparcidor sobre la

 Las Placas Petrifilm pueden ser contadas en un contador de colonias

6.6. ANÁLISIS DE MATERIAS PRIMAS

6.7. ANÁLISIS DE AMBIENTES

 Se inoculan las placas con 1 mL caldo letheen únicamente y se sigue

6.8. ANÁLISIS DE SUPERFICIES

 Seguir procedimiento del numeral 6.3.

6.9. REGISTRO DE ANALISIS MICROBIOLOGICO

Los análisis deben registrarse en el formato “Hoja de Trabajo Analítico –

 Durante la ejecución de un análisis es obligatorio usar el equipo de

Disponer de los residuos generados en el análisis de acuerdo al procedimiento

 “Autorización del Personal del laboratorio”,.

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