MÉTODO ELISA UTILIZADO EN LA INDUSTRIA ALIMENTARIA, TÉCNICA DE INMUNOENSAYO

PARA DETERMINAR ANTIGENOS.

MÉTODO ELISA UTILIZADO EN LA INDUSTRIA ALIMENTARIA,

TÉCNICA DE INMUNOENSAYO PARA DETERMINAR ANTIGENOS.

METHOD ELISA USED IN THE INDUSTRY FOOD, TECHNIQUE OF

IMMUNOASSAY FOR DETECTING ANTIGENS.

Julián Esteban Noreña*, Cristina Díaz Alfaro 1*

RESUMEN
El ELISA se basa en el uso de antígenos o anticuerpos marcados con una
enzima, de forma que los conjugados resultantes tengan actividad, tanto
inmunológica como enzimática. Al estar uno de los componentes
(antígeno o anticuerpo) marcado con una enzima e insolubilizado sobre
un soporte (inmunoadsorbente) la reacción antígeno-anticuerpo
quedará inmovilizada y, por tanto, será fácilmente revelada mediante la
adición de un substrato especifico que al actuar la enzima producirá un
color observable a simple vista o cuantificable mediante el uso de un
espectrofotómetro o un colorímetro.

Palabras clave: Elisa, antígeno, anticuerpo, inmunoabsorción.

ABSTRACT
The ELISA is based on the use of antigens or antibodies marked with an
enzyme, so them conjugated resulting have activity, both immune as
enzymatic. To the be one of them components (Antigen or antibody)
marked with an enzyme e insolubilizado on a support (inmunoadsorbente)
the reaction Antigen-antibody will be immobilized and, therefore, will be
easily revealed by the addition of a substrate specific that to the Act the
enzyme will produce a color observable to simple view or quantifiable by
the use of a spectrophotometer or a colorimeter.

Key words: Elisa, Antigen, antibody, inmunoabsortion.

1
1: Facultad de Ciencias Farmacéuticas y Alimentarias, Universidad de Antioquia, Medellín
Colombia.
 Autores a quien debe dirigirse la información: cisabel.diaz@udea.edu.co
 INTRODUCCIÓN

ELISA es un ensayo comúnmente cELISA o ELISA de bloqueo si la

utilizado para la detección de densidad óptica se reduce en un
anticuerpos antivirales en los porcentaje definido en
laboratorios de diagnóstico. El comparación con el de una muestra
principio básico de ELISA es la no bloqueada. (Reddy, C.2007)
reacción antígeno-anticuerpo, la
cual puede medirse mediante una No competitivo: Consiste en
enfrentar la muestra con el antígeno
reacción colorimétrica (densidad
óptica) entre el anticuerpo o anticuerpo que está en la fase
marcado con enzima y el sustrato sólida. A diferencia del cELISA, una
muestra es positiva si se forma un
(Truant, Allan L. 2002). Su gran
utilidad se debe a tres factores complejo antígeno-anticuerpo y al
agregar el conjugado reaccionará
importantes, la prueba es barata,
sensible y rápida (Self, Ron. 2005); el con el respectivo sustrato
factor analizado se puede medir desarrollando color. (Reddy, C.2007)
cualitativamente (positivo- Otros tipos de ELISA son constituidos
Negativo) según el color que se por los anticuerpos marcados, estos
presente y cuantitativamente son:
mediante la titulación de
anticuerpos. Según la actividad ELISA directo: Permite la detección
enzimática el método ELISA se divide del antígeno con un anticuerpo
en dos tipos, competitivo y no específico conjugado con una
competitivo (Truant, Allan L. 2002). enzima como sistema de
marcaje. Esto se realiza por medio
Competitivo: El ELISA competitivo de la incubación de anticuerpos
(cELISA) o ELISA de bloqueo utiliza un marcados, los cuales indican la
presencia de un antígeno en la
anticuerpo viral específico
solución analizada, para esto es
conocido para competir con el
necesario incluir controles negativos
conjugado por un número limitado que serán muestras del mismo tipo
de sitios de unión del antígeno. Para que las analizadas, pero en las que
analizar el resultado de debe tener se tenga la certeza de la ausencia
en cuenta que el color desarrollado del antígeno buscado. (Ruth de
(añadiendo un sustrato de enzima L,2009)
cromogénico) es inversamente
ELISA indirecto: se realiza de forma
proporcional a la cantidad de
similar al ELISA directo, pero en este
anticuerpo antiviral presente en el caso se añade primero un
suero de prueba. Una muestra de anticuerpo sin enzima y después uno
suero se considera positiva en el con enzima. De esa forma, la señal

2
que emite el enzima es mucho más MATERIALES Y MÉTODOS
potente y la prueba es más sensible.
La detección tiene mayor 1. Comparación de los métodos
sensibilidad por presentar una ELISA y PCR en tiempo real
amplificación de señal debida a la para la detección de la carne
unión de dos o más anticuerpos de cerdo en los productos
secundarios por cada primario.
cárnicos elaborados.
(Ruth de L,2009)
ELISA sándwich: Se trata de un Adquisición de muestras y
ensayo muy empleado en el que se preparación comercial: Se
recubre el pocillo con un primer recogieron un total de 30 muestras
anticuerpo anti-antígeno. Después comerciales consistentes en
de lavar el exceso de anticuerpo, se diferentes carnes molidas,
aplica la muestra problema en la embutidos cocidos, golosinas para
que se encuentra el antígeno, que mascotas y carnes enlatadas de
será retenido en el pocillo al ser carne de cerdo, para identificar
reconocido por el primer especies de antígenos mediante los
anticuerpo. Después de un segundo métodos de PCR y ELISA en tiempo
lavado que elimina el material no real. Cada muestra de carne
retenido, se aplica una solución con comercial se preparó para la
un segundo anticuerpo anti- extracción de ADN y ELISA, con la
antígeno marcado. Así, pues, cada excepción de que las muestras de
molécula de antígeno estará unido carne cocinada no fueron tratados
a un anticuerpo en la base que lo térmicamente y se añadió que el 60
retiene y un segundo anticuerpo, al ± 0,5 ml de agua desionizada estéril
menos, que lo marca. Este ensayo a 20 ± 2 g de la mascota muestras a
tiene una gran especificidad y tratar antes de su uso del Stomacher
sensibilidad debido a la para permitir una mejor mezcla de
amplificación de señal que permite los productos de bajo contenido de
el segundo anticuerpo. (Luis, S. 1998) humedad.
La sensibilidad, reproducibilidad y PCR en tiempo real
especificidad del ELISA depende de
tres factores principales: (i) PCR en tiempo real se llevó a cabo
concentración óptima y estabilidad en todas las muestras de ADN
del reactivo inmovilizado o duplicadas usando un Rotor-Gene ®
recubrimiento, usualmente el Ag; (Ii) ciclador térmico Q (Qiagen) en
reducción de las actividades no combinación con cebadores
específicas mediante el bloqueo de específicos de especie y las sondas
los reactivos; Y iii) elección del TaqMan desarrollados
sistema de indicadores. Estos anteriormente para la detección de
factores se discuten a continuación cerdo y ternera. Las reacciones se
debido a su importancia para el llevaron a cabo en un formato
diseño y el éxito del ensayo (Reddy, singleplex y dirigidos 166-bp (cerdo)
C. 2007). y 183 pb (carne) regiones del gen
que codifica para el citocromo b.

3
Los cebadores fueron sintetizados Especies ELISA-TEK cocido y el Kit de
por Integrated DNA Technologies cerdo Especies ELISA-TEK cocido
(Coralville, IA, USA) y las sondas se (ELISA Technologies, Gainesville, FL,
obtuvieron de Applied Biosystems EE.UU.) siguiendo el protocolo del
(Austin, TX, EE.UU). Cada tubo de USDA para la identificación de
reacción contenía 10 l de TaqMan especies animales en productos de
Fast PCR Universal Master Mix (2X) carne. Un lavador de microplacas
(Applied Biosystems), sonda de 2,0 l Thermo Scientific ACCUWASH se
de TaqMan MGB (2,5 M), 2,0 l de utilizó para completar todos los
cada cebador de oligonucleótido pasos de lavado. Cada prueba
(3,0 M de carne de vacuno, 9,0 M de incluyó cuatro controles positivos y
carne de cerdo), 2.0 l de agua de cuatro controles negativos
grado molecular, y 2,0 l de ADN o de suministrados en el kit. Los resultados
control negativo para un volumen se leyeron con un lector de
de reacción total de 20,0 l. Un microplacas BMG Labtech FLUOstar
control no plantilla (NTC) que Omega (Cary, NC, EE.UU.). Las
contiene agua en lugar de ADN se muestras se determina que si es
incluye junto con cada conjunto de positivo si el valor de DO bruta de
muestras analizadas con PCR en uno o ambos de los pocillos
tiempo real. Cada reacción de PCR replicados fue mayor que 0,250 y si
también incluía tres controles los resultados de todos los controles
positivos de las especies objetivo de estaban de acuerdo con las pautas
la carne diluidos a 250 pg / l, 25 pg / del USDA.
l, y 2,5 pg / mL. Las condiciones de
los ciclos fueron seguidos como se
describe: 95 ° C durante 20 s, En este ensayo, tanto ELISA como
seguido de 35 ciclos de 95 ° C PCR en tiempo real mostraron 100%
durante 1 s y 60 ° C durante 20 s. Los de especificidad durante la prueba
resultados de cada ejecución se de muestra de referencia, sin
analizaron con el software v.2.2.3 detectar reactividad cruzada para
Rotor-Gene Q y una muestra se las especies en las mezclas binarias
determinó que era positivo si tenía de cerdo / carne de vaca. Sin
un valor de Ct para la especie de embargo, en términos de
carne que se está probando. Los sensibilidad, ELISA fue capaz de
resultados obtenidos fueron detectar sistemáticamente carne
reportados como presencia o de cerdo en la mezcla binaria en
ausencia de las especies objetivo. niveles de hasta 10.0% w / w y se
detectó cerdo a niveles de 5,00% w
ELISA
/ w, según estos datos la prueba
ELISA se llevó a cabo para todas las ELISA-beef específica mostró una
muestras por duplicado utilizando los mayor sensibilidad en comparación
sobrenadantes preparados. Cada con el ensayo de PCR (Adam T.
muestra duplicada fue probada 2017).
tanto con el kit de la carne de vaca

4
 2. ELISA Sandwich para la anticuerpo de detección único o el
determinación de anticuerpo de mezcla completa.
tropomiosina de crustáceos
en los alimentos Se utilizó suero de sangre humano de
un anónimo donante femenino
El pescado se clasifica como uno de (#M99869, Golden West Biologicals,
los principales alimentos alergénicos. Temecula, CA). Para quitar materia
Sin embargo, un ensayo fiable para de partículas, el suero fue rota a 15
detectar la presencia de proteínas 000 g por 20 min a 4 ° C y el
de pescado no está disponible. sobrenadante se utilizó para el
Shellfish es un término genérico que análisis. Para evitar la saturación de
incluye todos los animales acuáticos la mayoría de pruebas ELISA de
que tienen un caparazón o concha antígenos presentes en el suero, el
exoesqueleto y en general se suero se diluyó al 1% en PBS/0.1%
pueden dividir en dos categorías; caseína. Una mezcla de todos los
crustáceos y moluscos. antígenos excepto CA15-3 y CatL
(ver tabla 1) fue agregada a la
Los anticuerpos de captura fueron solución de suero diluido y en la
suspendidos en tampón fosfato misma solución sin suero. La
salino, pH 7.2 (PBS), en concentración de cada uno de los
concentraciones de 0.5 a 1.0 antígenos con picos fue aproximado
mg/mL. Los anticuerpos fueron
"intervalo lineal" de la curva
impresos en 25 × 75 mm láminas de estándar apropiada.
vidrio utilizando una impresora de
NanoPlotter NP2 sin contacto
(GeSiM, Alemania).
3. ELISA para las sulfamidas y su
Whatman No. 4 papel de filtro aplicación para la detección
(Whatman, Piscataway, NJ, EE.UU.). de la contaminación del
La concentración de proteína se agua.
determinó mediante el kit de ensayo
de proteínas II. Los extractos de Se usaron fármacos tal cómo,
proteínas claras se almacenaron a - Sulfacetamida, sulfaguanidine,
sulfatiazol, sulfadiazina,
20 ° C hasta su uso. Se realizaron
pruebas realizadas usando sulfapiridina, sulfameter,
solamente una sola concentración sulfamethoxypyridine,
sulfamerazina, sulfametizol,
de la mezcla de antígeno en el 11%
de la concentración máxima que sulfametazina (SMZ),
figuran en la tabla 2. Similares a los sulfachloropyridine,
antígenos, todos de sulfadimethoxine,
detectionantibodieswerecombinedi sulfabenzamide, sulfaquinoxaline
nasinglesolutionin0.1% de caseína en y sulfasalazina.
PBS, menos que se indique lo También se usaron filtros de fibra
contrario. Para evaluar los reactivos de vidrio G4 se obtuvo de Fisher
individuales, se prepararon mezclas científicos (Pittsburgh, PA). Se
especiales que contenían un adquirieron cartuchos de Oasis

5
 HLB de extracción de fase sólida evaluación de la calidad de los
de las aguas (Milford, MA). La artículos seleccionados, análisis de
producción de conejo anti-SMX y la variabilidad, fiabilidad, validez de
anticuerpos de conejo anti-SMZ los artículos, organización de la
en estos ELISAS fueron publicados información y la redacción del
previamente (18, 24), y estos artículo. (Dr. Oscar V. 2009).
reactivos fueron incorporados en
kits de análisis por Abraxis LLC Después de tener el objetivo en
específico acudimos a unas
(Warminster, PA).
preguntas tales como ¿Qué se sabe
Se recolectaron muestras de del tema?, ¿Qué características
aguas residuales de dos plantas presenta este?, ¿Cuál es su
diferentes en el valle del río rojo funcionalidad?, ¿Para qué sirve?,
(un sistema de goteo, un ¿Qué caracteriza el método? Con
tratamiento de lodos activados) estas preguntas acudimos a la
a lo largo de la frontera entre literatura, y abordamos el tema con
Dakota del norte y Minnesota tres tipos básicos de fuentes, entre
(EEUU). las cuales se encuentran fuentes
primarias, secundarias y terciarias. En
Las muestras fueron las fuentes primarias se incluyen
transportadas en hielo al todos los artículos científicos
laboratorio. Aguas residuales
desarrollados desde la actualidad
crudas se obtuvo de dos hasta el año 2000, las fuentes
instalaciones de cría de cerdos. términos de sensibilidad, ELISA fue
Las muestras se almacenaron a- capaz de detectar
20 ° C en la oscuridad antes del sistemáticamente carne de cerdo
procesamiento.
en la mezcla binaria en niveles de
hasta 10.0% w / w y se detectó cerdo
a niveles de 5,00% w / w, según estos
datos la prueba ELISA-beef
específica mostró una mayor
METODOLOGIA DE REALIZACIÓN DEL
sensibilidad en comparación con el
ARTÍCULO
ensayo de PCR (Adam T. 2017).
Para la realización de este artículo
Secundarias nos ayudaron a
de revisión se tuvo en cuenta una
encontrar referencias y permitieron
sucesión de pasos o requerimientos,
localizar fuentes primarias y las
los cuales ayudaron a precisar la
fuentes terciarias fueron utilizadas
información que se quería y así
para dar una mayor generalidad al
recopilar los datos de acuerdo al
tema, ya que nos permite acumular
objetivo que era la revisión del
gran información e ir identificando
método ELISA y sus diferentes formas
con esta los objetivos generales y
de uso. Estos pasos fueron;
específicos de nuestro tema a
búsqueda bibliográfica, criterios de
tratar. (Dr. Oscar V. 2009).
selección, recuperación de la
información, fuentes documentales,

6
Para la selección de los artículos se límites de detección de la
manejó distintas bases de datos adulteración es de 4% w / w de
como Science Direct, Access carne de cerdo y el 1% w / w de
pharmacy, Knovel entre otras, esto carne de vacuno en las mezclas
con el fin de tener una mayor binarias de extractos de la muestra
fiabilidad con la información cuando se utiliza el ELISA-TEK ™ Kits
encontrada. Se utilizaron palabras de ensayo Especies carne cocida,
claves con los conceptos a con la advertencia de que la
investigar, seleccionando así los sensibilidad y especificidad de cada
artículos de mayor interés y ensayo puede variar dependiendo
relevancia. También se organizó la del lote que se está probando
información de acuerdo al cuerpo (USDA, 2005).
que debe considerase para un
artículo de revisión y por último se Al comparar las categorías de
dispuso a la redacción de este. (Dr. productos comerciales probados,
Oscar V. 2009). las muestras de carne de ternera
fueron los más identificables
mediante pruebas de ELISA. Las
muestras cárnicas y embutidos
RESULTADOS Y DISCUSIÓN delicatessen sólo mostró un
1. Comparación de los resultado incompatible ELISA cada
métodos ELISA y PCR en uno entre los dos productos. Por PCR
tiempo real para la en tiempo real, la carne picada,
detección de la carne de salchichas, carnes frías y las muestras
cerdo en los productos fueron todos identificables y mostró
cárnicos elaborados. resultados consistentes entre las
muestras duplicadas. La golosina
En este ensayo, tanto ELISA como para animales domésticos y
PCR en tiempo real mostraron 100% productos cárnicos enlatados
de especificidad durante la prueba también mostraron un alto nivel de
de muestra de referencia, sin coherencia entre las muestras
detectar reactividad cruzada para duplicadas tanto para ELISA y PCR
las especies en las mezclas binarias en tiempo real, con sólo un resultado
de cerdo / carne de vaca. Sin incoherente encontrado por una de
embargo, en términos de las muestras analizadas con PCR en
sensibilidad, ELISA fue capaz de tiempo real.
detectar sistemáticamente carne
de cerdo en la mezcla binaria en
niveles de hasta 10.0% w / w y se 2. ELISA Sándwich para la
detectó cerdo a niveles de 5,00% w determinación de
/ w, según estos datos la prueba tropomiosina de
ELISA-beef específica mostró una crustáceos en los
mayor sensibilidad en comparación alimentos
con el ensayo de PCR (Adam T.
2017). En comparación, el USDA los

7
ELISA su potencial para volúmenes
de muestra de alto rendimiento,
3. ELISA para las sulfamidas y
bajo costo y mínimo que hace que
sea una tecnología ideal para la su aplicación para la
validación de biomarcadores detección de la
potenciales. Para la gran mayoría contaminación del agua.
de las proteínas, las La sensibilidad (50% B/B0) y límite de
concentraciones no típicamente detección (90% B/B0) junto con la
variaron más de 20 o 30% para un reactividad cruzada en relación con
individuo en las muestras que se el mensurando patrón [(50% B/B0)
recolectaron 6 meses. Esto se compuesto probado / (50% B/B0)
compara con la variabilidad SMX o SMZ] se dan en la tabla 1. El
interindividual que osciló entre 2 y 5- anticuerpo SMX reconoce varios
fold. El caso más dramático fue para structurallyrelated sulfonamidas
TGFR, que varió más de 40-fold (Figura 1),
personas, pero demostró una pero showinghighcrossreactivity con
demostró una relación de 6 meses sulfamethoxypyridazine (175%),
promedio de 0.71 y un coeficiente sulfachloropyridazine (142%) y
de variación de 42% para los cuatro sulfadimethoxine (61%).
individuos.
Tabla 1. Parámetros de rendimiento
del sulfametoxazol y sulfametazina
ELISA

Los resultados para el uso de SMX-

ELISA para mediciones de agua de
río y aguas residuales se muestran
niveles importantes de las
sulfonamidas (expresadas como
equivalentes SMX) para todas las
etapas de tratamiento de aguas
residuales en ambos análisis de
EDARs. Confirmatory con LC-MS
demostraron QUE SMX estaba
presente. Los resultados de ELISA
mostraron niveles de SMX
disminuyeron ∼50% para WWTP1, en

8
las diferentes etapas del proceso de BIBLIOGRAFÍA
tratamiento de EDAR, aunque las
1. Truant, Allan L. (2002). Manual
concentraciones mostraron
variaciones dentro del proceso de of Commercial Methods in
tratamiento, así como en los tiempos Clinical Microbiology - 14.1.5.1
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Figura 1. Estructuras de sulfamidas

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