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    Ensayo Inmunoenzimáticos

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    Livia Nina
    Este documento describe el procedimiento para realizar un ensayo inmunoenzimático (ELISA). Explica que ELISA se basa en la detección de un antígeno inmovilizado mediante anticuerpos marcados enzimáticamente. Luego detalla los materiales necesarios, los pasos del procedimiento que incluyen incubaciones y lavados, y algunas aplicaciones comunes de ELISA como detección de enfermedades en animales y plantas.

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    Ensayo Inmunoenzimáticos

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    Este documento describe el procedimiento para realizar un ensayo inmunoenzimático (ELISA). Explica que ELISA se basa en la detección de un antígeno inmovilizado mediante anticuerpos marcados enzimáticamente. Luego detalla los materiales necesarios, los pasos del procedimiento que incluyen incubaciones y lavados, y algunas aplicaciones comunes de ELISA como detección de enfermedades en animales y plantas.

    Descripción original:

    ELISA para HIV

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    Ensayo Inmunoenzimáticos

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    Livia Nina
    Este documento describe el procedimiento para realizar un ensayo inmunoenzimático (ELISA). Explica que ELISA se basa en la detección de un antígeno inmovilizado mediante anticuerpos marcados enzimáticamente. Luego detalla los materiales necesarios, los pasos del procedimiento que incluyen incubaciones y lavados, y algunas aplicaciones comunes de ELISA como detección de enfermedades en animales y plantas.

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    de 7

    Ao

    de La
    Consolidacin del
    Mar de Grau
    Ensayo
    inmunoenzimtico
    (ELISA)
    Alumna: Livia Quispe Huamn
    PRCTICA N 7
    |

    Livia Quispe Huamn |

    ENSAYO
    INMUNOENZIMTIC
    O (ELISA)
    INFORME N 7
    Asignatura: Inmunologa
    Docente: Cristhian Villar
    Aula: 212

    PGINA 1

    Ensayo inmunoenzimtico (ELISA)


    Alumna: Livia Quispe Huamn
    PRCTICA N 7

    ENSAYO INMUNOENZIMTICOS (ELISA)

    1. Introduccin
    La tcnica ELISA (ensayos de inmunoabsorbencia ligada a enzimas) se basa en la
    deteccin de un antgeno inmovilizado sobre una fase slida mediante anticuerpos que
    directa o indirectamente producen una reaccin marcada enzimticamente cuyo
    producto, puede ser medido espectrofotomtricamente. La cantidad de antgeno se
    determina comparando la curva estndar generada con cantidades conocidas del
    antgeno.
    Ventajas: verstil, robusto, simple en su realizacin, emplea reactivos econmicos y
    consigue, mediante el uso de la fase slida, de una separacin fcil entre la fraccin
    retenida y la fraccin libre, es fcil de adaptar a analizadores automticos. Este se
    caracteriza por ser un mtodo cuantitativamente exacto por la medicin de la velocidad
    de la reaccin y la duracin de la reaccin en un instante fijo nico
    Desventajas: para adaptarlo a analizadores automticos se necesitan de reactivos muy
    purificas, lo que aumenta el costo de las pruebas.

    2. OBJETIVOS
    -

    Conocer los principios en los que se basa la prueba de ELISA

    Familiarizarse con el equipo utilizado para la elaboracin de la prueba de ELISA.

    Conocer la importancia de este tipo de pruebas y su aplicacin en el mbito de


    la medicina.

    3. ANTECEDENTES DISPOSITIVOS
    EMPLEADOS EN ELISA
    Se han ensayado numerosas fases slidas, desde los tubos de cristal de los
    orgenes a las actuales microplacas de 96 pocillos de plstico tratado para aumentar su
    capacidad de absorcin de molculas y con fondos de pocillo pticamente claros para
    poder realizar las medidas de densidad ptica en instrumentos especficos,
    espectrofotmetros de lectura de placas que han recibido el nombre de lectores ELISA.
    Actualmente se estn desarrollando dispositivos de mayor capacidad, por ejemplo con
    384 y 1536 pocillos, adecuados para los sistemas de screening masivo de los
    sistemas robotizados (HTS, High throughput system). Los lectores ELISA son
    espectrofotmetros capaces de realizar lecturas seriadas de cada uno de los pocillos de
    la placa ELISA. A diferencia de un espectrofotmetro convencional, con capacidad de
    PGINA 2

    Ensayo inmunoenzimtico (ELISA)


    Alumna: Livia Quispe Huamn
    PRCTICA N 7

    leer todas las longitudes de onda del ultravioleta y el visible de manera continua, los
    lectores de ELISA disponen de sistemas de filtros que slo permiten la lectura de una o
    pocas longitudes de onda. Son la que se corresponden con las necesarias para
    determinar la densidad ptica de los cromgenos ms comnmente utilizados.

    TIPOS DE ENSAYOS ELISA


    Se han desarrollado mltiples variantes de ensayos ELISA que permiten desde la
    cuantificacin de un antgeno en solucin, la deteccin de un anticuerpo en una solucin
    por ejemplo en el clonaje de anticuerpos monoclonales, o la determinacin de la
    subclase (idiotipo) de un anticuerpo. A continuacin se describen los ms comunes. La
    versin ms comn de ELISA es el ensayo sandwich.
    -

    Ensayo directo: (Ensayo ELISA simple de dos capas). Las placas ELISA se
    preparan recubriendo los pocillos con las soluciones en las que se sospecha se
    encuentra el antgeno. Se incuban con anticuerpos marcados. Indican la
    presencia de antgeno en la solucin analizada. Es necesario incluir controles
    negativos que sern muestras del mismo tipo de las analizadas (sangre, orina,
    etc.) pero en las que se tenga la certeza de la ausencia del antgeno buscado.
    Asimismo se incluyen controles positivos (soluciones donde se encuentra el
    antgeno buscado, o bien se le ha aadido).

    Ensayo indirecto: Las placas ELISA se preparan de una forma idntica a la


    anterior. Los controles positivos y negativos son los mismos. El sistema de
    deteccin emplea dos anticuerpos: uno primario contra el antgeno, y uno
    secundario marcado contra el primario. La deteccin tiene mayor sensibilidad
    por presentar una amplificacin de seal debida a la unin de dos o ms
    anticuerpo secundarios por cada primario. Es el ensayo ms popular, como lo es
    la inmunofluorescencia indirecta, pues un mismo secundario marcado y un
    mismo sistema enzimtico permite cuantificar una gran cantidad de antgenos.

    Ensayo sandwich: (Ensayo de captura de antgeno y deteccin mediante


    inmunocomplejos). Se trata de un ensayo muy empleado en el que se recubre el
    pocillo con un primer anticuerpo anti-antgeno. Despus de lavar el exceso de
    anticuerpo se aplica la muestra problema en la que se encuentra el antgeno,
    que ser retenido en el pocillo al ser reconocido por el primer anticuerpo.
    Despus de un segundo lavado que elimina el material no retenido se aplica una
    solucin con un segundo anticuerpo anti-antgeno marcado. As pues cada
    molcula de antgeno estar unida a un anticuerpo en la base que lo retiene y un
    segundo anticuerpo, al menos, que lo marca. Este ensayo tiene una gran
    especificidad y sensibilidad debido a la amplificacin de seal que permite el
    segundo anticuerpo.

    APLICACIONES
    Este mtodo ha tenido una enorme aplicacin en todos aquellos campos en los
    que se precisaba la cuantificacin de productos mediante anticuerpos: diagnstico
    clnico, deteccin viral, clasificacin de anticuerpos en isotipos, bsqueda de
    anticuerpos monoclonales, etc.
    PGINA 3

    Ensayo inmunoenzimtico (ELISA)


    Alumna: Livia Quispe Huamn
    PRCTICA N 7

    1. MATERIALES
    -

    Algodn

    Kit de reactivos para ELISA

    Agua destilada

    Envase para el agua

    Pipetas automticas de 100 uL

    Pipetas automticas de 1000 uL

    Puntas azules para pipetas de 200-1000uL

    Puntas amarillas para pipetas de 200-1000uL

    2. PROCEDIMIENTO
    -

    Permitir que los reactivos alcancen la temperatura ambiente.

    Rotular los pocillos como:


    1. Blanco
    2. Control negativo
    3. Control negativo
    4. Control negativo
    5. Control positivo
    6. Control positivo
    7. Control antgeno
    8. Muestra

    Aadir 100 uL de diluyente a todos los pocillos excepto al blanco.

    Agregar 50 uL en los pocillos de control negativo, control negativo y suero en el


    pocillo de muestra.

    Cubrir los pocillos con cinta e incubar a 37C por 30 minutos.

    Decantar y lavar llenando cada pocillo con 350 uL de solucin de lavado. Repetir
    el procedimiento por 5 veces.

    Aadir 100 ul de conjugado a todos los pocillos.

    Cubrir los pocillos con cinta e incubar a 37C por 30 minutos.


    PGINA 4

    Ensayo inmunoenzimtico (ELISA)


    Alumna: Livia Quispe Huamn
    PRCTICA N 7

    Decantar y lavar llenando cada pocillo con 350 uL de solucin de lavado repetir
    el procedimiento por 5 veces.

    Aadir el conjugado N 2 (Estreptilisina).

    Decantar y lavar llenando cada pocillo con 350 uL de solucin de lavado repetir
    el procedimiento por 5 veces.

    Agregar sustrato 100 uL e incubar por 10 min. a T Ambiente.

    Aadir 20 ul de solucin de parada (cido sulfrico al 4 %)

    Resultados

    Investigue los diferentes anlisis que se pueden realizar utilizando en ensayo de ELISA
    Aplicaciones del ELISA.

    Soluciones ELISA

    Patologa Animal

    Enfermedades producidas por parsitos

    Babesias y tripanosomas

    Toxocara canis

    Toxoplasmosis

    Triquinosis

    Enfermedades producidas por Micoplasmas

    Enfermedades producidas por bacterias

    Mycobacterium tuberculosis

    Brucelas

    Enterotoxinas

    Vibrio cholerae

    Estreptococos

    Salmonelas

    Enfermedades producidas por virus

    Enfermedad de Aujeszky

    Enfermedad de Newcstle

    Fiebre aftosa

    Leucemia felina

    Peste porcina africana


    PGINA 5

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    Peste porcina clsica

    Rinotraqueitis infecciosa

    Rotavirus

    Artritis vrica

    Otras aplicaciones

    Hormonas

    Gonadotropina corinica

    Progesterona

    Testosterona

    Hormonas tiroideas

    Cuantificacin de inmunoglobulinas

    IgG

    IgE

    IgA

    Inmunopatologa

    Anticuerpos anti-DNA

    Factor reumatoide

    Inmunocomplejos circulantes

    Protocolo y Tcnicas

    Patologa Vegetal

    Enfermedades producidas por virus

    En frutales

    PPV

    CLSV

    TRSV

    En ctricos

    CTV

    En patata

    PLRV

    PVY
    PGINA 6

    Ensayo inmunoenzimtico (ELISA)


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    PVX

    PVA

    TRV

    En cereales

    En guisante

    En lpulo

    En soja

    En ornamentales

    En plantas hortcolas

    Enfermedades producidas por bacterias

    Enfermedades producidas por Micoplasmas

    Enfermedades producidas por hongos

    3. BIBLIOGRAFA
    -

    Parslow t, Stites d et al. Inmunologa bsica y clnica 10 Ed. 2002. Editorial El


    manual moderno Mxico. P.917 (Pg. 254 257).

    4. CUESTIONARIO
    Indique cual es la funcin de los siguientes pasos en la prueba de ELISA
    a. Incubacin inicial de la muestra en el pocillo

    b. Lavados

    c. Adicin del conjugado

    d. Adicin del cromgeno

    e. Cubrir los pozos del ELISA una vez que se ha agregado el cromgeno

    PGINA 7

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