Acta Toxicol. Argent.

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Validación de un método rápido en orina por LC/MS/MS para la búsqueda

de compuestos empleados en sumisión química y su aplicación a muestras reales
Validation of a fast screening method in urine by LC/MS/MS for compounds used
in drug-facilitated crime (DFC) and its application to real samples
Rubio, Nélida Cristina1*; Márquez, Cecilia2; Confalonieri, Adriana2

1
Laboratorio de Toxicología, San Martín 565, Cipolletti,-Río Negro, Argentina. 2Centro de Alta Tecnología Analítica (CATA), B.Mitre
3690, Munro, Bs.As. Te: 54-11-4509-9000
*cristinarubio2@gmail.com

Recibido: 1 de mayo de 2015

Aceptado: 22 de marzo de 2016

Resumen. La Oficina de Naciones Unidas contra la Droga y el Delito (UNODC) en 2011 señala que “El delito facilitado por drogas
(DFD) es una expresión general que abarca la violación y otras agresiones sexuales, el robo con violencia o intimidación, la extor-
sión de dinero y los malos tratos deliberados de ancianos o niños bajo la influencia de sustancias sicotrópicas”. En este trabajo
se validó un método cualitativo y rápido a partir de muestras de orina por LC/MS/MS para 39 compuestos comprendidos en los
listados de sumisión química. El objetivo fue alcanzar un límite de detección un 50 % por debajo de la concentración propuesta
como “Límites mínimos de funcionamiento exigidos (MRPL)” por la UNODC, para poder ser aplicado a muestras reales.

Palabras claves: Delitos facilitados por droga; Sumisión química; LC/MS/MS; Validación

Abstract. The United Nations Office on Drugs and Crime (UNODC) in 2011, states that "The Drug-facilitated crime (DFC) is a
general term that includes rape or other sexual assault, robbery, money extortion, as well as the deliberate maltreatment of the
elderly or children under the influence of psychotropic substances". In this work we validated a qualitative and fast method from
urine samples by LC/MS/MS for 39 compounds included in the Drug-facilitated crime lists.
The aim was to reach a detection limit of 50% below the proposed concentration as "minimum required performance limits
(MRPL)" by UNODC in order to be applied in real samples.

Keywords: Drug-facilitated crime; DFSA; LC/MS/MS; Validation

Introducción
En los últimos años los delitos facilitados por tra incapacitada de rechazar a su atacante y
drogas (DFP) han tomado notoriedad en los está presente la agresión sexual facilitada por
medios y en el ámbito científico se ha incre- drogas (ASFD) o DFSA (Drug-facilitated se-
mentado el número de publicaciones científi- xual assault) según sus siglas en inglés.
cas como así también las recomendaciones y En este tipo de delitos el victimario le suminis-
procedimientos a seguir en la investigación y tra a la víctima (voluntaria o involuntariamente)
análisis toxicológico cuando se aborda este en el alimento o bebida alguna sustancia con
tema como consecuencia del aumento de las el objeto de menoscabar su capacidad de de-
denuncias en prácticamente todo el mundo cidir. La víctima podrá sentirse relajada, eufó-
(LeBeau 1999; EMCDDA 2008; García-Re- rica, desinhibida, con dificultades en el habla
petto y col. 2011; UNODC 2011; García-Ca- y el equilibrio, pudiendo estar somnolienta, in-
ballero y col. 2014; Xifró y col. 2014). consciente o incluso llegar a la muerte. A esto
La UNODC (2011) establece que: “El delito debemos sumar que la víctima recuperada tie-
facilitado por drogas (DFD) es una expresión ne afectada en general su memoria. La razón
general que abarca la violación y otras agre- de que muchas de las drogas que se emplean
siones sexuales, el robo con violencia o inti- para cometer este tipo de ilícitos afectan la
midación, la extorsión de dinero y los malos memoria hace que el hecho no se denuncie o
tratos deliberados de ancianos o niños bajo la se lo haga con retraso.
influencia de sustancias sicotrópicas”. Dentro Las sustancias que mayoritariamente son
de este grupo de delitos la víctima se encuen- encontradas en la comisión de estos delitos

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(Djezzar 2009; LeBeau 2010; Jones y col. mínimos de funcionamiento exigidos (MRPL)”
2012), son el alcohol, otras como el hidrato por la UNODC (2011) (LeBeau 2010). En la Ta-
de cloral, GHB o los z-hipnóticos, las benzo- bla 1 se detalla el listado de sustancias bus-
diacepinas, etc. y raramente son detectadas cadas, sus MRPL y la concentración objetivo
en medios biológicos, en parte debido a sus a alcanzar.
cortas vidas medias o porque al momento de Se empleó una técnica de cromatografía lí-
la toma de la muestra están por debajo del lí- quida acoplado a tándem espectrometría de
mite de detección del método a ser empleado. masa (LC/MS/MS), utilizando un equipo Agi-
El laboratorio de toxicología forense requiere lent Technologies UPLC 1290 Infinity, Triple
para la resolución analítica de las muestras a Quad LC/MS 6460.
analizar (sangre y orina o cabello en los casos El método se validó siguiendo la guía de va-
que el incidente sea denunciado con retraso lidación propuesta por el Scientific Working
de varios días), de técnicas analíticas sensi- Group for Forensic Toxicology (SWGTOX,
bles y específicas. Como aconseja la UNODC 2013) para métodos cualitativos de identifi-
aquellas técnicas como los inmunoensayos cación/confirmación y los parámetros valida-
y técnicas enzimáticas que tienen límites de dos fueron: carryover, interferencias, efecto
detección muy altos deberían evitarse o bien matriz (Ionization suppression/enhancement),
interpretarse con cautela los resultados nega- límite de detección, estabilidad y criterios de
tivos. Son recomendados “encarecidamente” identificación según la Guía Alemana de la
(UNODC 2011) los métodos de cromatografía Sociedad de Toxicología y Química Forense
liquida- espectrometría de masas (LC/MS), - GTFCh (2009).
cromatografía liquida- tándem masas (LC/ Los objetivos propuestos se cumplieron para
MS/MS) y cromatografía gaseosa- tándem toda la lista de sustancias ensayadas por di-
masas (CG/MS/MS) por su sensibilidad y se- lución e inyección, con excepción de la mor-
lectividad más elevada. fina para lo cual se utilizó un método de ex-
El objetivo de este trabajo fue validar una téc- tracción líquido-líquido empleado para scree-
nica cualitativa a partir de orina por LC/MS/ ning en cromatografía liquida- arreglo de dio-
MS que cumpla con los niveles de detección dos (HPLC/DAD) según Pragst y col. (2004).
recomendados para las sustancias investiga- El método desarrollado se aplicó a cinco
das. Se empleó un método directo de inyec- muestras provenientes de víctimas que de-
ción conocido como “diluir e inyectar” (“dilute nunciaron haber sido abusadas sexualmente,
and shoot”) para la mayoría de ellas y para pero que no recordaban que había sucedido
aquellos compuestos que no cumplían con durante los momentos previos al despertar,
el requerimiento de detección se empleó una en lugares y con personas del sexo opuesto,
extracción líquido-líquido. Se aprovechó, en en general desconocidas. No se dispuso del
este caso, una de las ventajas del LC/MS/MS tiempo exacto del momento de la toma de la
sobre el CG/MS que es su mayor sensibilidad, muestra, pero se estimó mayor a 24 horas de
poder inyectar directamente o previa dilución ocurrido el hecho.
una muestra de orina sin la necesidad de so-
meterla a un tratamiento térmico que puede Materiales y métodos
afectar a moléculas térmicamente lábiles y Solventes y reactivos
sin necesidad de extracciones y/o derivatiza- Los solventes usados en la fase móvil y en
ciones previas. Esto hace que se disminuya la extracción fueron: acetonitrilo: Carlo Erba
el tiempo de análisis y según Fitzgerald y col. –HPLC-Gold-ultragradiente; agua: ultrapu-
(2012) también el costo al no necesitarse el ra partiendo de agua grado HPLC ultra pura
empleo de cartuchos de extracción. y obtenida en el purificador Barnstead Easy
Se monitorearon 39 sustancias de las repor- Pure II; ácido fórmico: Drowil grado HPLC; di-
tadas comúnmente en la bibliografía inter- clorometano: Panreac Química Sau-España,
nacional en casos de ASFD (Djezzar y col. grado HPLC.
2009; García-Repetto y col. 2011; European El Tris empleado fue de grado de pureza ana-
Monitoring Center for Drugs and Drug Addic- lítica de Merck Argentina.
tion (EMCDDA) 2008; García-Caballero y col.
2014) y se estableció como objetivo fijar el Sustancias de referencia
límite de detección del método en un 50 % Las sustancias de referencia fueron obtenidas
de la concentración propuesta como “Límites del Programa Internacional de Aseguramiento

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Tabla 1. Clasificación de los compuestos analizados, concentraciones MRPL, concentración

objetivo a alcanzar y concentración a la cual son detectadas con el método empleado.

SUSTANCIA MRPL1 Objetivo Concentración

(ng/mL) (50 % MRPL) (ng/mL)
0,5 5,0 20 40 100 200
Alprazolam 10 5,0 D D D D D D
Bromazepan 10 5,0 ND D D D D D
Clonazepan 5 2,5 D D D D D D
Clordiazepóxido 10 5,0 D D D D D D
Diazepam 10 5,0 ND D D D D D
Flunitrazepán 5 2,5 D D D D D D
7-aminoflunitrazepán 5 2,5 D D D D D D
Lorazepam 10 5,0 ND D D D D D
Lormetazepam 10 5,0 D D D D D D
Midazolam 10 5,0 D D D D D D
Nordiazepán 10 5,0 D D D D D D
Oxazepán 10 5,0 D D D D D D
Prazepam 10 5,0 D D D D D D
Temazepam 10 5,0 D D D D D D
Clobazam 10 5,0 D D D D D D
Zolpidem y metabolitos 10 5,0 D D D D D D
Zopiclona y metabolitos 10 5,0 D D D D D D
Amitriptilina 10 5,0 D D D D D D
Nortriptilina 10 5,0 D D D D D D
Fluoxetina 10 5,0 D D D D D D
Haloperidol 10 5,0 D D D D D D
Codeína 10 5,0 ND D D D D D
Metadona 10 5,0 D D D D D D
Dextropropoxifeno 10 5,0 D D D D D D
Tramadol 10 5,0 D D D D D D
6-monoacetilmorina (MAM) 10 5,0 ND D D D D D
Codeína 10 5,0 ND D D D D D
Morfina (*) 10 5,0 ND ND ND D D D
Benzoilecgonina 50 25,0 D D D D D D
Cocaína 50 25,0 D D D D D D
Metilecgonina 50 25,0 ND D D D D D
Anfetamina 10 5,0 D D D D D D
Metanfetamina 10 5,0 D D D D D D
MDA 10 5,0 D D D D D D
MDEA 10 5,0 D D D D D D
MDMA 10 5,0 D D D D D D
Ketamina 1 0,5 D D D D D D
Norketamina 1 0,5 D D D D D D
Carbamacepina No incluida 0,5 D D D D D D
Mirtazapina No incluida 0,5 D D D D D D
1
MRPL: límites mínimos de funcionamiento exigidos por la UNODC en orina.
D= detectado
ND= no detectado
(*) Con la técnica de dilución-inyección. (Con la extracción Líq-Líq se lograron detecciones de 5 ng/ml).

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Tabla 2. Iones precursores y transiciones (MRM), energías de colisión, celda de aceleración,

tiempo de retención, ventana de medición y polaridad de los compuestos analizados.

Compuesto Ion Ion EC Celda Tpo.ret. Ventana de

Polaridad
Precursor Proucto (V) Acel. (V) (min) medición

1 7-Aminoflunitrazepam 284,1 135,1 26 7 4,1 1 Positiva
7-Aminoflunitrazepam 284,1 77,1 74 7 4,1 1 Positiva
2 Alprazolam 309,1 205,1 46 7 7,88 1 Positiva
Alprazolam 309,1 151,1 74 7 7,88 1 Positiva
3 Amitriptilina 278,2 105,1 22 7 7,83 1 Positiva
Amitriptilina 278,2 91 20 7 7,83 1 Positiva
4 Anfetamina 136,1 119,1 4 7 2,48 1 Positiva
Anfetamina 136,1 91,1 16 7 2,48 1 Positiva
5 Benzoylecgonine 290 168 17 7 4,05 1 Positiva
Benzoylecgonine 290 105 35 7 4,05 1 Positiva
6 Bromazepam 316 288 20 7 6,28 1 Positiva
Bromazepam 316 209 30 7 6,28 1 Positiva
7 Carbamazepina 237 194 15 7 7,7 1 Positiva
Carbamazepina 237 179 35 7 7,7 1 Positiva
8 Clordiazepóxido 300,1 227 22 7 5,54 1 Positiva
Clordiazepóxido 300,1 89,1 74 7 5,54 1 Positiva
9 Clobazam 301 259 29 7 8,1 1 Positiva
Clobazam 301 224 47 7 8,1 1 Positiva
10 Clonazepam 316,1 270 22 7 7,9 1 Positiva
Clonazepam 316,1 214 46 7 7,9 1 Positiva
11 Cocaína 304,3 182,3 20 7 5,2 1 Positiva
Cocaína 304,3 82,2 25 7 5,2 1 Positiva
12 Codeína 300,2 215 24 7 2,45 1 Positiva
Codeína 300,2 165 48 7 2,45 1 Positiva
13 Dextropropoxifeno 340,3 266,3 5 7 7,82 1 Positiva
Dextropropoxifeno 340,3 58 13 7 7,82 1 Positiva
14 Diazepam 285,1 193,1 32 7 8,08 1 Positiva
Diazepam 285,1 91,1 52 7 8,08 1 Positiva
15 EME 201 182,1 18 7 0,33 1 Positiva
EME 201 82,1 26 7 0,33 1 Positiva
EME 201 67,1 66 7 0,33 1 Positiva
16 Flunitrazepam 314,1 268,1 25 7 8 1 Positiva
Flunitrazepam 314,1 239,1 37 7 8 1 Positiva
17 Fluoxetina 310 43,7 10 7 7,9 1 Positiva
18 Haloperidol 376 165,1 15 7 7,6 1 Positiva
Haloperidol 376 123,1 20 7 7,6 1 Positiva
19 Ketamine 238,1 179 15 7 3,9 1 Positiva
Ketamine 238,1 125 20 7 3,9 1 Positiva
20 lorazepam 321 303 8 7 7,9 1 Positiva
lorazepam 321 229 28 7 7,9 1 Positiva
21 Lormetazepam 335 289 20 7 8,1 1 Positiva
Lormetazepam 335 177 40 7 8,1 1 Positiva

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Tabla 2. Continuación

Compuesto Ion Ion EC Celda Tpo.ret. Ventana de

Polaridad
Precursor Proucto (V) Acel. (V) (min) medición
22 6-MAM 328,2 211 15 7 3,23 1 Positiva
6-MAM 328,2 165 20 7 3,23 1 Positiva
23 MDA 180,1 163,1 4 7 2,9 1 Positiva
MDA 180,1 105,1 24 7 2,9 1 Positiva
24 MDEA 208,1 163,1 8 7 3,7 1 Positiva
MDEA 208,1 105,1 28 7 3,7 1 Positiva
25 MDMA 194,1 163,1 8 7 3,17 1 Positiva
MDMA 194,1 105,1 24 7 3,17 1 Positiva
26 Metanfetamina 150,1 119,1 8 7 2,86 1 Positiva
Metanfetamina 150,1 91,1 20 7 2,86 1 Positiva
27 Metadona 310,3 265 10 7 7,84 1 Positiva
Metadona 310,3 105 25 7 7,84 1 Positiva
28 Midazolam 326,1 291,1 29 7 6,7 1 Positiva
Midazolam 326,1 249,1 41 7 6,7 1 Positiva
29 Mirtazapina 266 195 25 7 3,87 1 Positiva
Mirtazapina 266 72 20 7 3,87 1 Positiva
30 Morfina 286,2 181 40 7 0,36 2 Positiva
Morfina 286,2 165 44 7 0,36 2 Positiva
31 Nordiazepam 271 165 27 7 7,8 1 Positiva
Nordiazepam 271 140 25 7 7,8 1 Positiva
32 Norketamina 224 207 10 7 3,7 1 Positiva
Norketamina 224 125 33 7 3,7 1 Positiva
33 Nortriptilina 264 233 10 7 7,8 1 Positiva
Nortriptilina 264 91 25 7 7,8 1 Positiva
34 Oxazepam 287,1 269 8 7 7,84 1 Positiva
Oxazepam 287,1 241 20 7 7,84 1 Positiva
35 Prazepam 325 271 31 7 8,4 1 Positiva
Prazepam 325 141 53 7 8,4 1 Positiva
36 Temazepam 301,1 283 10 7 8,02 1 Positiva
Temazepam 301,1 255,1 18 7 8,02 1 Positiva
37 Tramadol 264 246 5 7 4,6 1 Positiva
Tramadol 264 58 15 7 4,6 1 Positiva
38 Zolpidem 308,2 263,1 24 7 5,5 1 Positiva
Zolpidem 308,2 235,1 36 7 5,5 1 Positiva
39 Zoplicona 389,1 245 13 7 4,66 1 Positiva
Zoplicona 389,1 217 33 7 4,66 1 Positiva

EC (V)=Energía de Colisión (voltio)

Celda de Acel. (V): Celda de Aceleración (voltio)
Tpo. Ret. (min.): tiempo de retención (minutos)

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de la Calidad (IQAP) organizado por UNODC Parámetros de la validación

(United Nations Office on Drugs and Crime) Se siguieron los lineamientos de GTFCh
y de Cerillant-US. Todas ellas fueron previa- (2009) y SWGTOX (2013).
mente monitoreadas por HPLC/DAD y CG/MS
para constatar su identidad y pureza. Interferencias
Se analizaron diez (10) muestras de orina pro-
Instrumental y software venientes del staff del laboratorio quienes de-
Equipo: Agilent Technologies UPLC 1290 In- clararon no haber tomar medicación o haber
finity, con bomba binaria, ALS con termosta- tomado fármacos que no estaban en el lista-
tizador, compartimiento de columna y detec- do de los compuestos a investigar.
tor Triple Quadrupolo Agilent LC/MS 6460, Límite de detección (LD): se determinó fortifi-
fuente de ionización ESI con tecnología Jet cando en tres días distintos, tres blancos de
Steam, y software de adquisición y de aná- orina de diferente origen corridos por dupli-
lisis de datos Mass Hunter revisión B.06.00 cado, con una mezcla de los compuestos a
buscar en seis concentraciones distintas: 0,5
ng/mL, 5,0 ng/mL, 20 ng/mL, 40 ng/mL, 100
• Compartimiento de columna: ng/mL y 200 ng/mL. Como criterio de LD se
4 Columna: Agilent Eclipse Plus consideró aquella señal del analito que fuera
C18 RRHD, 1,8 µm 2,1 x 50 mm igual o superior 3 veces al nivel de ruido de la
4 Temperatura: 25 °C línea de base cercana al pico, este criterio fue
4 Filtro pre-columna “1290 Infinity aplicado para todos los iones (transiciones)
In-line Filter, Agilent” analizados. Como criterio de identificación
• Bomba: (para todas las señales por encima del LD) se
4 Fase móvil: A: agua 0,1 % aplicaron:
ácido fórmico. B: acetonitrilo 1. El modo dinámico Multiple Reaction Mo-
0,1 % ácido fórmico. nitoring (dMRM), con selección de un pre-
4 Flujo: 0,4 mL/min cursor con dos transiciones (Tabla 2) y se
4 Gradiente: adoptaron las siguientes tolerancias expre-
n T0 = 95 % A sadas como un porcentaje del ión o tran-
n T1 = 95 % A sición tomando la media de testigos puros
n T7 = 70 % A corridos en idénticas condiciones (Tabla 3):
n T8 = 5 % A
n T10 = 5 % A Tabla 3. Tolerancias aceptadas de las
n T10,50 = 95 % A intensidades relativas de los iones de diagnóstico.
• Volumen de inyección: 10 µL con
Intensidad relativa Tolerancia
lavado de aguja
(% del pico base) permitida
• Temperatura del inyector
automático: 5°C
≤ 10 % ± 50 %
• Detector Triple Cuadrupolo:
4 Modo de ionización: ESI (+) (-) 10-20 % ± 30 %
• Parámetros de la fuente: 20-50 % ± 25 %
4 Gas Temp: 350 °C > 50 % ± 20 %
4 Gas flow: 10 L/min
4 Nebulizer: 40 psi
4 Sheath gas heater: 300 °C En el caso de la fluoxetina se empleó un ión
4 Sheath gas flow: 11 L/min precursor con una sola transición.
4 VCap: 4000 V+ y 4000 V- 2. La variación del tiempo de retención
comparado con el testigo puro ± 5 %
En la Tabla 2 se muestran para cada com-
puesto el ión precursor y el o los iones pro- Efecto matriz
ductos, la energía de colisión (CE), Celda de Se valoró el efecto matriz sobre diez mues-
aceleración (CELL ACC), los tiempos de re- tras de orina inyectadas con el solo trata-
tención, la ventana de medición y polaridad. miento de una dilución al medio en fase móvil
La adquisición fue hecha en modo dMRM (di- a la concentración propuesta como objetivo
namic multi reaction monitoring). a alcanzar de 5 ng/mL en la mayoría de los

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compuestos a analizar. Se comparó si hubo Procedimiento

efecto de disminución o incremento de la ioni- Se emplearon dos métodos de preparación
zación (Ionization supresion or enhancement) de las muestras de orina:
con una mezcla de testigos puros diluidos al 4 Dilución-inyección: un (1) mL de orina se
medio con fase móvil a igual concentración. centrifugó a 10000 rpm durante 5 minutos.
Se obtuvieron las medias de las diez áreas de Se tomó 0,5 mL del sobrenadante y se le
las orinas fortificadas a 5 ng/mL (Área 2) y las agregó 0,5 mL de fase móvil (0,1 % de áci-
áreas medias de los testigos puros inyectados do fórmico en agua), se pasó por filtros de
por triplicados a 5 ng/mL (Área 1), se estimó el celulosa 13/20 de 0,2 µm marca Agilent.
efecto matriz de supresión /aumento aplican- El filtrado fue colocado en insertos marca
do la fórmula: Agilent para su inyección.
4 Extracción líquido-líquido de orina con
diclorometano (Pragst y col. 2004): 0,5 ml
(%) EFECTO MATRIZ= (ÁREA media 2 / ÁREA media 1 -1) x 100 de orina se colocaron en un tubo Eppen-
dorf, se le agregó 0,1 mL de solución Tris
(24,3 g en 1 L de H2O, pH 9,0) y 0,4 mL de
Estabilidad diclorometano. Se agitó en vortex por 1 mi-
Congelado/descongelado: tres muestras de nuto y se centrifugó por 5 minutos a 10000
orinas blancos fortificadas a una concentra- rpm. Se separó el diclorometano y se eva-
ción de 10 ng/mL con los compuestos a in- poró a sequedad en corriente de nitrógeno.
vestigar es analizada por triplicado inmedia- El residuo se disolvió en 0,2 mL de fase mó-
tamente (tiempo 0) y luego de dos secuencias vil, se filtró y el filtrado se colocó en insertos
de congelado y descongelado de la muestra marca Agilent para su inyección.
de orina a 24 hs y 48 hs. Se compararon las
áreas a las 24 hs y 48 hs con las áreas obte- Resultados
nidas a tiempo 0. El criterio seguido para la Como se muestra en la Tabla 1 la mayoría de
selección de la concentración a ensayar de los compuestos tienen un límite de detección
10 ng/mL fue por ser, en general el máximo entre 2 y 20 veces por debajo de 10 ng/mL,
límite de detección propuesto para la mayoría valor fijado por el MRPL. La excepción fue
de las sustancias del listado y además puede la morfina que no alcanzó el límite de detec-
ser detectado el analito hasta con una pérdi- ción deseado de 5 ng/mL. Su límite detección
da del 50 %. diluyendo la muestra con fase móvil 1:1 se
Permanencia en el vial de inyección en la encontró a una concentración de 40 ng/mL.
bandeja del inyector automático durante 24 En estas condiciones se observó un efecto
horas de las primeras muestras analizadas en matriz de supresión de la señal de la morfina
el punto anterior. cercano al 100 %, habiendo sido este efecto
ya reportado por otros autores (Fitzgerald y
Carryover col. 2012). El empleo de la extracción líquido-
Se analiza la existencia de carryover inyec- líquido con diclorometano permitió llegar al lí-
tando muestras de orina blanco inmediata- mite de detección deseado de 5 ng/mL.
mente luego de inyectar mezclas de testigos El método cumplió los criterios de identifica-
de las sustancias analizadas. Las concentra- ción para todos los compuestos ensayados,
ciones empleadas para determinar la existen- con excepción de la fluoxetina en la que se
cia de carryover fueron 20 ng/mL, 100 ng/mL investigó solo un ión precursor y una tran-
y 200 ng/mL. sición, no reuniendo los requisitos para su
identificación por este método. Los hallazgos
Muestras de orina positivos deberán ser confirmados.
Diez muestras de orina blanco obtenidas del No se observó a la concentración de 0,5 ng/
staff del laboratorio. mL señales de interferencias con los com-
Muestras de orina blanco fortificadas con la puestos analizados.
mezcla de testigos a seis diferentes concen- La metodología de dilución e inyección genera
traciones. 0,5 ng/mL, 5 ng/mL, 20 ng/mL, 40 un importante efecto matriz, la cual se observó
ng/mL, 100 ng/mL y 200 ng/mL. en la mayoría de las sustancias investigadas.
Cinco (5) muestras de orina de víctimas de La buena sensibilidad del instrumental permi-
agresión sexual. tió trabajar con este método. Los valores halla-

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Acta Toxicol. Argent. (2016) 24 (1): 21-32

Figura 1. Cromatogramas de la orina de una víctima de sumisión química. A) EME:

metilecgonina; B) BEG: benzoilecgonina; C) COC: cocaína; D) ALP: alprazolám.

A) EME: metilecgonina
2 + MRM CF=0.000 DF=0.000 (201.00000 -> 182.10000) Ar_o_1 ml.d
x10

1.1
1 1

EME Cualificador
0.364
87

0.9

0.8
Transición 201,0→ 182,1
0.7

0.6

0.5

0.4

0.3

0.2

0.1

-0.1
2 + MRM CF=0.000 DF=0.000 (201.00000 -> 82.10000) Ar_o_1 ml.d
x10

1.1
1 1

EME Cuantificador
1
0.366
1920

0.9

0.8 Transición 201,0→ 82,1

0.7

0.6

0.5

0.4

0.3

0.2

0.1

-0.1
2 + MRM CF=0.000 DF=0.000 (201.00000 -> 67.10000) Ar_o_1 ml.d
x10

1.1
1 1

EME Cualificador
1
0.366
341

0.9

0.8 Transición 201,0→ 67,1

0.7

0.6

0.5

0.4

0.3

0.2

0.1

-0.1
0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6 1.8 2 2.2 2.4 2.6 2.8 3 3.2 3.4 3.6 3.8 4 4.2 4.4 4.6 4.8 5 5.2 5.4 5.6 5.8 6 6.2 6.4 6.6 6.8 7 7.2 7.4 7.6 7.8 8 8.2 8.4 8.6 8.8
Counts (%) vs. Acquisition Time (min)

B) BEG: benzoilecgonina
2 + MRM CF=0.000 DF=0.000 (290.00000 -> 168.00000) Ar_o_1 ml.d
x10

1.1
1 1

1.05

1
0.95
4.066
3339
BEG Cuantificador
Transición 290,0→ 168,0
0.9

0.85

0.8

0.75

0.7
0.65

0.6

0.55

0.5

0.45
0.4

0.35

0.3

0.25

0.2

0.15
0.1

0.05

-0.05

-0.1
2 + MRM CF=0.000 DF=0.000 (290.00000 -> 105.00000) Ar_o_1 ml.d
x10

1 1

1.05

1
0.95
4.060
965
BEG Cualificador
Transición 290,0→ 105,0
0.9

0.85

0.8

0.75

0.7
0.65

0.6

0.55

0.5

0.45
0.4

0.35

0.3

0.25

0.2

0.15
0.1

0.05

-0.05

-0.1
0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6 1.8 2 2.2 2.4 2.6 2.8 3 3.2 3.4 3.6 3.8 4 4.2 4.4 4.6 4.8 5 5.2 5.4 5.6 5.8 6 6.2 6.4 6.6 6.8 7 7.2 7.4 7.6 7.8 8 8.2 8.4 8.6 8.8
Counts (%) vs. Acquisition Time (min)

- 28 -
 Acta Toxicol. Argent. (2016) 24 (1): 21-32

C) COC: cocaína
2 + MRM CF=0.000 DF=0.000 (304.30000 -> 182.30000) Ar_o_1 ml.d
x10

1
1.1 1

1.05

1 5.163
6114
0.95

0.9

0.85 COC Cuantificador

0.8

0.75 Transición 304,3→ 182,3

0.7
0.65

0.6

0.55

0.5

0.45
0.4

0.35

0.3

0.25

0.2

0.15
0.1

0.05

-0.05

-0.1
2 + MRM CF=0.000 DF=0.000 (304.30000 -> 82.20000) Ar_o_1 ml.d
x10

1
1.1 1

1.05

1 5.162
3753
0.95

0.9

0.85 COC Cualificador

0.8

0.75 Transición 304,3→ 82,2

0.7
0.65

0.6

0.55

0.5

0.45
0.4

0.35

0.3

0.25

0.2

0.15
0.1

0.05

-0.05

-0.1
0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6 1.8 2 2.2 2.4 2.6 2.8 3 3.2 3.4 3.6 3.8 4 4.2 4.4 4.6 4.8 5 5.2 5.4 5.6 5.8 6 6.2 6.4 6.6 6.8 7 7.2 7.4 7.6 7.8 8 8.2 8.4 8.6 8.8
Counts (%) vs. Acquisition Time (min)

D) ALP: alprazolám
2 + MRM CF=0.000 DF=0.000 (309.10000 -> 205.10000) Ar_o_1 ml.d
x10

1
1.1 1

1.05

ALP Cuantificador
1 7.896
3330
0.95

0.9

0.85

0.8
Transición 309,1→ 205,1
0.75

0.7
0.65

0.6

0.55

0.5

0.45
0.4

0.35

0.3

0.25

0.2

0.15
0.1

0.05

-0.05

-0.1
2 + MRM CF=0.000 DF=0.000 (309.10000 -> 151.10000) Ar_o_1 ml.d
x10

1
1.1 1

1.05

ALP Cualificador
1 7.897
765
0.95

Transición 309,1→ 151,1

0.9

0.85

0.8

0.75

0.7
0.65

0.6

0.55

0.5

0.45
0.4

0.35

0.3

0.25

0.2

0.15
0.1

0.05

-0.05

-0.1
0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6 1.8 2 2.2 2.4 2.6 2.8 3 3.2 3.4 3.6 3.8 4 4.2 4.4 4.6 4.8 5 5.2 5.4 5.6 5.8 6 6.2 6.4 6.6 6.8 7 7.2 7.4 7.6 7.8 8 8.2 8.4 8.6 8.8
Counts (%) vs. Acquisition Time (min)

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Acta Toxicol. Argent. (2016) 24 (1): 21-32

dos de efecto matriz de disminución/aumento cativas cuando se dejaron en la bandeja del

de la señal están en un rango que van desde inyector, siendo importante señalar que el in-
-100 a +260, con algunas excepciones fue- yector de marca Agilent es refrigerado.
ra de este rango, la benzoilecgonina (+430) Se observó carryover a concentraciones de
y la norketamina (+850), no atribuidas a in- 100 y 200 ng/mL que desaparecieron con una
terferencias en las muestras de orina blanco segunda inyección de muestra blanco de ori-
analizadas. Peters y col. (2012) mencionan na. No se observó carryover a 20 ng/mL.
diversos rangos de disminución/aumento de En las muestras de orina analizadas, prove-
la señal debidos al efecto matriz en orina y nientes de víctimas que sufrieron algún tipo
otras muestras biológicas. de agresión sexual, se detectó en todas ellas
Los compuestos investigados resultaron ser alprazolam y en dos cocaína, benzoilecgo-
estables cuando se congelan y descongelan nina y metilecgonina (Figura 1). Se investigó
a las 24 y 48 hs. Se tuvieron pérdidas no ma- además en este tipo de muestras la existen-
yores a un 15 %, que están por debajo del cia de etanol por cromatografía gaseosa de-
límite de detección propuesto para cada sus- tector de llamas (GC-FID), que no se detalla
tancia. No se observaron variaciones signifi- por realizarse con otra tecnología.

Figura 2. Cromatograma de los testigos en concentración de 20 ng/mL.

2 + MRM CF=0.000 DF=0.000 (325.00000 -> 271.00000) Est-o 20ng-ml A 140115.d

x10

1
1.1 1

1.075

1.05

1.025

1 * 8.377
41

0.975

0.95

0.925

0.9

0.875

0.85

0.825

0.8

0.775

0.75

0.725

0.7

0.675

0.65

0.625

0.6

0.575

0.55

0.525

0.5

0.475

0.45

0.425

0.4

0.375

0.35

0.325

0.3

0.275

0.25

0.225

0.2

0.175

0.15

0.125

0.1

0.075

0.05

0.025

-0.025

-0.05

-0.075

-0.1

0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6 1.8 2 2.2 2.4 2.6 2.8 3 3.2 3.4 3.6 3.8 4 4.2 4.4 4.6 4.8 5 5.2 5.4 5.6 5.8 6 6.2 6.4 6.6 6.8 7 7.2 7.4 7.6 7.8 8 8.2 8.4 8.6 8.8
Counts (%) vs. Acquisition Time (min)

Discusión tratamiento, pero el empleo de un filtro pre-

El método desarrollado cumple con todos los columna o un guarda columna puede contra-
puntos de la validación propuestos en la guía rrestar este proceso, discutido por Fitzgerald
de validación de Scientific Working Group for y col. (2012).
Forensic Toxicology (SWGTOX, 2013) para Dado que se utilizó una columna de resolu-
métodos cualitativos de identificación/confir- ción rápida de 1,8 µm de tamaño de partí-
mación. Resulta ser un método rápido, que re- cula y de 5 cm de largo, se logró una buena
quiere bajo volumen de muestra y no tiene tra- separación de los compuestos investigados
tamiento previo de la misma, lo que disminuye con un tiempo de análisis no mayor a 8,5 mi-
el costo del empleo de cartuchos de extracción nutos (Figura 2) y un límite de detección por
y el tiempo de una extracción líquido-líquido. debajo de los sugeridos por la UNODC para
El tiempo útil de la columna puede verse muestras de orina provenientes de causas de
disminuido al inyectar la muestra sin previo sumisión química.

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 Acta Toxicol. Argent. (2016) 24 (1): 21-32

El método permite analizar 39 analitos en me- Fitzgerald R.L., Griffin T.L., Yu Y-M., Go-
nos de 9 minutos. Es posible seguir agregan- dfrey R.A., Robert W., Pesce A.J., Herold
do otros compuestos a esta lista y por sus D.A. Analysis of Drugs of Abuse Using Se-
exigencias en cuanto a bajos límites de de- lected Reaction Monitoring for Quantification
tección, este método puede ser empleado and Full Scan Product Ion Spectra for Iden-
en toxicología post-mortem y en toxicología tification. Journal of Analytical Toxicology.
clínica. En estos casos como es de esperar 2012;36:106-111.
mayores concentraciones, puede iniciarse el
análisis empleando diluciones mayores que García-Caballero C., Cruz-Landeira A., Quin-
disminuirían el efecto matriz y la acción del tela O.J. Sumisión química en casos de pre-
carryover. suntos delitos contra la libertad sexual anali-
El hallazgo de benzodiacepinas en muestras zados en el Instituto Nacional de Toxicología
de orina de víctimas que habían denunciado y Ciencias Forenses (Departamento de Ma-
abuso sexual, que previamente arrojaron re- drid) durante los años 2010, 2011 y 2012. Rev
sultados negativos por la técnica de CG/MS y Esp Med Legal. 2014;40(1):11-18.
HPLC/DAD corrobora la importancia de ava-
lar la sugerencia dada en el manual de UNO- García-Repetto R., Soria M.L. Sumisión quí-
DC (2011) sobre la necesidad de emplear téc- mica: reto para el toxicólogo forense. Rev
nicas por tándem-masa como la acá emplea- Esp Med Legal. 2011;37(3):105-112.
da y trabajar en este tipo de muestras con los Munich L.D.P., Bonn F.M. Guideline for qua-
“Límites mínimos de funcionamiento exigidos lity control in forensic-toxicological analyses
(MRPL)”. Otros autores han reportado simila- [en línea]. Gesellschaft für Toxikologische und
res resultados cuando no se emplean técni- Forensische Chemie (GTFCh). 2009. [Con-
cas de cromatografía tándem- masa (Tomina- sulta: 14 de octubre de 2014]. Disponible en:
ga y col. 2015). https://www.gtfch.org/cms/index.php/en/
En las muestras de orina no es raro encon- guidelines
trar concentraciones superiores a 100 ng/
mL por lo que sería de buena práctica inyec- Jones A.W., Holmgren A., Ahlner J. Toxico-
tar un blanco luego de una muestra de orina logical analysis of blood and urine samples
para asegurar no arrastrar compuestos a la from female victims of alleged sexual assault.
siguiente corrida. Clinical Toxicology 2012;50:555–561.
Muchos de los compuestos analizados son
eliminados como glucurónidos, el empleo de LeBeau M., Andolo W., Hearn W.L., Baselt
enzimas β-glucuronidasas previo a la dilu- R., Cone E., Finkle B., Fraser D., Jenkins A.,
ción e inyección de la muestra puede favo- Mayer J., Negrusz A., Poklis A., Walls H.C.,
recer la detección de los analitos a menores Raymomd l., Robertson M., Saadi J. Recom-
concentraciones. mendations for toxicological investigations of
En estudios preliminares se han obtenido drug–facilitated sexual assaults. Special Com-
buenos resultados en otras matrices biológi- munication. J Forensic Sci. 1999;44:227-230.
cas como sangre, humor vítreo y bilis, de uso
frecuente en toxicología forense post mortem. LeBeau M.A., Montgomery Madeline A. Drug-
facilitated sexual assault. Forensic Science
Bibliografía citada Review. 2010;22(1):1-113.
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