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Oxidaciones Biologicas
Oxidaciones Biologicas
Oxidaciones Biologicas
Fundamento
Las enzimas son biomoléculas de naturaleza proteica que aceleran la velocidad de reacción
hasta alcanzar un equilibrio. Constituyen el tipo de proteínas más numeroso y especializado
y, actúan como catalizadores de reacciones químicas específicas en los seres vivos o
sistemas biológicos. Muchas de las enzimas no trabajan solas, se organizan en secuencias,
también llamadas rutas metabólicas, y muchas de ellas tienen la capacidad de regular su
actividad enzimática.
Las enzimas se designan y clasifican de acuerdo con el tipo de reacción que catalizan, siendo
6 los grupos principales: 1. Oxidoreductasas, 2. Transferasas. 3. Hidrolasas. 4. Liasas. 5.
Isomerasas., 6. Ligasas. 7. Traslocasas
Las enzimas son sustancias que poseen una extraordinaria capacidad catalítica, tienen un
alto grado de especificidad por sus sustratos, aceleran reacciones químicas específicas y
funcionan en soluciones acuosas bajo condiciones suaves de temperatura y pH. Las
enzimas, actuando en secuencias organizadas, catalizan los cientos de reacciones que
ocurren en una vía metabólica mediante la cual un nutriente es degradado o biosintetizado
asegurando la supervivencia y proliferación celular. Algunas de las enzimas son reguladoras,
esto es, que pueden responder a varias señales metabólicas cambiando de acuerdo a éstas
su actividad catalítica. A través de la acción de las enzimas reguladoras, los sistemas
enzimáticos están altamente coordinados para formar un conjunto armónico entre las
diferentes actividades metabólicas y de esta manera sostener la vida.
Se conoce un cierto número de enzimas vegetales que son activadas o inhibidas por su
estado de oxidación o al menos por la presencia de ciertos oxidantes o reductores en sus
soluciones. Para mayor claridad consideremos por una parte a aquellas enzimas que son
reguladas por un sistema compuesto por la ferredoxina y la tiorredoxina, que comprende
algunas enzimas de los cloroplastos, y por exclusión tenemos otro grupo cuyas enzimas son
sensibles a ciertos compuestos redox. Enzimas reguladas por el sistema ferredoxina-
tiorredocina: como ya se indicó estas enzimas están localizadas en el cloroplasto. El
estímulo básico regulador de esas enzimas proviene de la luz. La acción de la luz se efectúa
a nivel del fotosistema I. El flujo de electrones ocasionado por la luz pasará el aceptor P430
y de allí a la ferredoxina soluble. Por acción de la NADP-tiorredoxina reductasa, enzima cuya
estructura corresponde a una flavoproteína, el electrón de la ferredoxina es utilizado para
reducir la tiorredoxina. La tiorredoxina es una proteína de bajo peso molecular capaz de
transportar electrones. Contiene un grupo cisteina que sufre reducción reversible a la forma
de sulfhidrilo. Además de la reducción enzimática a nivel fisiológico, la ferredoxina puede
ser reducida químicamente por DTT (ditiotreitol). Finalmente hay una reducción de las
enzimas del grupo por la tiorredoxina. Las enzimas activadas por este sistema son: fructosa-
1, 6-bisfosfatas, sedoheptulosa-1, 7- bisfosfatasa, NAD-gliceraldehído, 3-fosfato
deshidrogenasa, ribulosa-5-fosfato quinasa que forman parte del ciclo del Calvin
(fotosíntesis). Además, este mecanismo también activa la NADP-malato deshidrogenasa y
la fenilalanina amonio liasa.
Normalmente se considera que el ciclo de Calvin está situado en lo que se denomina la fase
oscura de la fotosíntesis, sin embargo, algunas enzimas del ciclo prácticamente no son
funcionales en la oscuridad, por tanto, la diferenciación tradicional entre fase oscura y
luminosa de la fotosíntesis carece de validez. Mecanismo de desactivación enzimática en la
oscuridad: no habría un único mecanismo de desactivación de este grupo de enzimas. Se
pueden clasificar en tres tipos considerando sus mecanismos de desactivación. El primer
tipo, a los que pertenece la fructosa-1, 6-bisfosfata, la ribulosa-5-fosfato quinasa y la
fenilalanina amonio liasa, es desactivado por un oxidante soluble como el glutatión oxidado
(GSSG) o por el ácido dehidroascórbico. En el segundo tipo tendríamos, únicamente, la
NADP-malato deshidrogenasa, que requeriría un oxidante ligado a membranas. Las enzimas
del tercer grupo, tales como NADP-gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa, no poseen
mecanismos conocidos de desactivación. Tanto la desactivación de las enzimas activadas
por tiorredoxina, como su activación se hacen a una velocidad menor a la de la catálisis, es
decir, se trataría de enzimas histeréticas.
Modulación redox de la actividad enzimática
Fosfoenoloxidasas
Para la mayoría de las especies frutales cuyo destino es el consumo en fresco, la calidad se
basa en sus características intrínsecas, organolépticas y aspecto externo, sobre todo, en la
forma, tamaño, color y ausencia de lesiones. El tamaño final que adquiere el fruto, la
ausencia de magulladuras y de mancha púrpura, como desorden fisiológico, son aspectos
valorados por el consumidor y, por tanto, son problemas importantes a los que se enfrentan
los cultivadores en todo el mundo. Cualquiera de estos daños, cambian la textura o el color
del tejido, debido a la destrucción de los compartimentos celulares del fruto, que permiten
que los sustratos de naturaleza fenólica sean accesibles a la enzima polifenol oxidasa, dando
lugar a polímeros oscuros (Sellés et al., 2007, Martínez et al., 2013). En general, todos los
tipos de daños pueden resultar de una inapropiada manipulación o inadecuado embalaje.
En el caso específico de pardeamiento por impacto, la incidencia de la severidad dependerá
de la altura en que el fruto se deja caer y del tipo de superficie de impacto (Crisoto et al.,
1993, 1996). Cualquier daño mecánico puede incrementar la tasa de respiración y
producción de etileno lo que conlleva a una aceleración en la maduración, ablandamiento,
pérdida de agua y deterioro general de los frutos (Crisoto et al., 1993). Además, el daño por
impacto causa heridas superficiales en el fruto lo que facilita la entrada de microorganismos
y el desarrollo de putrefacciones (Crisoto et al., 1996, Mishra y Gautam, 2013).
En las plantas existe una gran cantidad y diversidad estructural de compuestos fenólicos
pertenecientes a diversas familias como ácidos fenólicos, cumarinas, lignanos, ligninas y
flavonoides (Lee y Whitaker, 1995; Tomás-Barberán y Espín, 2001). Estos compuestos
desempeñan funciones importantes en las plantas, siendo las más relevantes las de
protección frente a radiación ultravioleta y frente a condiciones de estrés biótico gracias a
las propiedades antimicrobianas de los propios compuestos fenólicos y mediante el sellado
de heridas por lignificación (Hermann, 1976; Ke y Salveit, 1988; Macheix et al., 1991). La
composición de fenoles en los tejidos vegetales varía considerablemente según la especie
de que se trate, grado de madurez de los frutos y manejo post-cosecha de los mismos
(Tomás-Barberán y Espín, 2001).
Entre los diversos tipos de inhibidores de PPOs se destacan cuatro grupos: sulfitos, agentes
antioxidantes o reductores, acidulantes y compuestos quelantes. Los sulfitos son los
compuestos más efectivos en prevenir el pardeamiento enzimático (Sapers, 1993). Aunque
el mecanismo de actuación de los sulfitos para prevenir el pardeamiento no está claro,
pueden provocar una inhibición directa de la enzima, como se ha observado en la inhibición
de PPO de fresa por metabisulfito de sodio (Wesche-Ebeling y Montgomery, 1983), pueden
interaccionar con los intermedios evitando que estos participen en la formación de
pigmentos (Sayavedra-Soto y Montgomery, 1986) o pueden actuar como agentes
reductores convirtiendo a las quinonas en difenoles (Valero et al., 1988). A pesar de su
efectividad en la prevención de la calidad de frutos y vegetales, estos compuestos están
sujetos a restricciones debido a que provocan efectos adversos en la salud en personas
sensibles. Entre los antioxidantes, se han empleado compuestos fenólicos sintéticos como
butilhidroxitolueno (BHT) y butilhidroxianisol (BHA), ampliamente empleados en
alimentación para proteger el sabor y color de los alimentos y algunos compuestos fenólicos
naturales como tocoferol, derivados del ácido cinámico y flavonoides como la quercetina y
el kaemferol (Ashie et al., 1996). Una de las mejores alternativas al uso de los sulfitos es el
ácido ascórbico (Wang et al., 2013), este compuesto es altamente efectivo en la inhibición
del pardeamiento por su habilidad de reducir las quinonas producidas por la PPO a los
fenoles antes de que la reacción de formación de pigmentos tenga lugar. Sin embargo, el
ácido ascórbico es muy reactivo y se oxida rápidamente a ácido dehidroascórbico (DHAA),
pudiendo reaccionar con otros compuestos que conllevan a cambios en la calidad de los
frutos. A veces se utiliza en combinación con acidulantes, siendo el más utilizado el ácido
cítrico debido a su presencia natural en tejidos. Otros inhibidores son los compuestos
sulfhidrilos como mercaptoetanol, ditiotreitol y tiourea por su habilidad como agentes
reductores, sin embargo, las concentraciones necesarias para prevenir el deterioro del fruto
no son permitidas en alimentación. La cisteína se ha mostrado como un inhibidor fuerte de
PPO en banana y manzana, siendo incluso más efectivo que el metabisulfito (Ashie et al.,
1996; Richard-Forget et al., 1992b; Valero et al., 1988), sin embargo, la concentración
necesaria para alcanzar altos niveles de inhibición tiene efectos negativos en el sabor de los
frutos. Además se han empleado agentes frutos (manzana) y vegetales (champiñón y
berenjena) crudos y procesados (Billaud et al., 2005).
Hidrolasas vegetales
Dentro del grupo de las enzimas hidrolasas en los vegetales están involucradas en procesos
metabólicos vitales para el crecimiento, desarrollo y mantenimiento de los mismos. Muchas
de estas enzimas, entre ellas proteasas, pectinasas, xilanasas, esterasas,
poligalacturonidasas, celulasas, son de gran interés industrial por la variedad de procesos
en que pueden ser aplicadas. La mayoría de estas enzimas se encuentran presentes en el
látex de muchas especies. El látex es una de las características más salientes de las familias
Asclepiadaceae, Apocynaceae, Euphorbiaceae y Moraceae (Rajesh et al., 2005). El látex es
el fluido lechoso contenido en la o las células de los tubos laticíferos. Está compuesto por
una suspensión/solución de una mezcla compleja de diferentes sustancias: enzimas,
terpenos, alcaloides, vitaminas, glúcidos, lípidos y aminoácidos libres y se han detectado
componentes subcelulares, tales como núcleo, mitocondrias, ribosomas y vacuolas. La
presencia de látex ha sido reportada en al menos 12000 especies de plantas pertenecientes
a 900 géneros diferentes. Las enzimas detectadas en látex, tales como proteasas y
quitinasas, sugieren un rol en el mecanismo de defensa de las plantas contra patógenos,
parásitos y herbívoros (Freitas et al., 2007). Las pectinasas son enzimas que digieren la
pectina, sustancia presente en las paredes de las células vegetales y en la lámina media
(péctica) y se emplean en el procesamiento de alimentos vegetales. La pectina es un
polisacárido constituido principalmente por la unión de muchas moléculas de ácido
galacturónico parcialmente metoxilado. En los extractos comerciales de pectinasas usados
para la fabricación de jugos de fruta coexisten tres enzimas: pectinliasa, poligalacturonasa
y pectinmetilesterasa.
Procedimiento
Esta práctica abarca tres procedimientos para determinación de la cinética enzimática y
construir de una curva.
Primera parte:
1. Mezclar 10g de levadura, 400mL de agua destilada y 2mL de jabón líquido (Después de
licuar guardar tapado que exista el mínimo contacto con el aíre y la luz).
2. Mezclar una papa licuada, 400mL de agua destilada y 2mL de jabón líquido. (Después
de licuar guardar tapado que exista el mínimo contacto con el aíre y la luz)
3. Marcar dos tubos de ensayo, en el tubo 1 agregar 2mL de la solución de levadura y
en el tubo 2 agregar 2mL de la solución de papa. (Si no tenemos tubos de ensayo usar
vasos de vidrio o copas de aguardiente).
4. A cada tubo añadir 1 gota de peróxido de hidrogeno (H 2O2) al 30% (Lo podemos
medir usando un gotero o un pitillo, el peróxido lo podemos conseguir en una farmacia)
5. Agitar los tubos de ensayo y observar que empieza a formarse espuma (si no estamos
trabajando sobre tubos podemos agitar ayudados por un pitillo o una cuchara o
cuchillo desechables)
6. Anotar el tiempo transcurrido (en segundos) hasta que termina la formación de
espuma:
Ahora analicemos
a) La altura de la espuma formada (en milímetros) sobre el tiempo (en segundos) durante
el cual se forma la espuma equivale a la velocidad de la reacción. Calcular la velocidad de
reacción para cada uno:
Segunda parte:
1. Tomar seis tubos de ensayo (si no tengo tubos sobre copas aguardienteras o vasos de
vidrio o frascos de compota) y numerarlos de 1 a 6.
2. Añadir en cada tubo de ensayo 2 mL de solución de levadura (La solución de levadura
se prepara mezclando 2 g de levadura en 100mL de agua previamente hervida y reposada)
3. Añadir a cada tubo 2 gotas de H2O2 al 1, 2, 4, 8, 15 y 30% respectivamente (para
preparar las diluciones del peróxido partimos del más concentrado y por dilución del 50%
preparamos las otras), mezclar y medir la altura de la espuma (en milímetros) formada
en cada tubo durante 5 segundos y consignar los resultados en la siguiente tabla:
Tubo de ensayo o recipiente 1 2 3 4 5 6
Solución de Levadura en mL 2 2 2 2 2 2
2 gotas de H2O2 al: 1% 2% 4% 8% 15% 30%
Altura de la espuma en mm
Velocidad mm/seg*
* 5 segundos
Tercera parte:
Tubo de ensayo 7 8 9 10 11 12
Solución de papa en mL 2 2 2 2 2 2
2 gotas de H2O2 al: 1% 2% 4% 8% 16% 30%
Altura de la espuma en mm
Velocidad mm/seg*
* 5 segundos
Cuarta parte:
Cálculos y preguntas:
a) De las graficas deducir los valores de Km para la levadura y la papa, y compararlos.
Quinta parte
Un incremento de 10C duplicaría la velocidad de reacción química. Cada enzima tiene una
temperatura a la cual trabaja mejor. Para los vegetales esta temperatura es
aproximadamente 50C, por enzimas de esta temperatura la velocidad de reacción decrece
ya que el medio es menos favorable para la enzima. A 80C las enzimas son destruidas.
3. Pasados los 5 min ordene los tubos de acuerdo con el color del más claro al más
oscuro y anote la secuencia.
Ramirez EC, Withaker JR. En: J. R. Whitaker, A.G. J. Voragen & D.W.S. Wong, editores.
Polyphenol Oxidase: Handbook of Food Enzymology. Nueva York: Marcel Dekker Inc; 2003.
p. 509-523