UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA

FACULTAD DE CIENCIAS
ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE BIOTECNOLOGÍA

INFORME DE PRACTICAS PREPROFESIONALES I, II Y III

(Del 16 de Septiembre al 16 de Diciembre del 2019)

““Micropropagación de Saccharum officinarum y Vaccinium
corymbosum L. cv. Biloxi hasta su establecimiento en vivero
en el proyecto Especial Chinecas”

Autor:
Ivan Gonzalo Zavaleta Reyes

Asesor:
Blgo. Microb. Eterio Alva Muñoz
 UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA
FACULTAD DE CIENCIAS
ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE BIOTECNOLOGÍA

INFORME DE PRACTICAS PREPROFESIONALES I, II Y III

(Del 16 de Septiembre al 16 de Diciembre del 2019)

““Micropropagación de Saccharum officinarum y Vaccinium

corymbosum L. cv. Biloxi hasta su establecimiento en vivero
en el proyecto Especial Chinecas”
Autor:

Ivan Gonzalo Zavaleta Reyes

Revisado y Aprobado por el Asesor:

_____________________________

Blgo. Microb. Eterio Alva Muñoz

 DEDICATORIA

A Dios por la oportunidad, la vida y el entendimiento, a mis padres y a mis hermanos

por su apoyo incondicional y constante durante todo mi desarrollo profesional y proceso
de prácticas pre profesionales , a mis seres queridos más cercanos en general por
impulsarme a seguir creciendo, y a todos quienes hicieron posible está investigación.
 AGRADECIMIENTO

Agradecer en primer lugar a Dios porque sin él, nada sería posible, gracias por las
fuerzas, el entendimiento y el aliento de vida a cada día para enfrentar las adversidades
sin perder nunca la esperanza ni desfallecer en el intento, también agradezco a mis
padres y a mis hermanos porque, gracias a ellos, a su consideración cariño y amor,
tengo la voluntad y la fuerza extra para continuar con las prácticas pre profesionales.

Agradecer al Proyecto Especial Chinecas y a sus colaboradores por la oportunidad de

realizar mis prácticas en dicho establecimiento, por las facilidades y el conocimiento
brindado.

Agradecer a mis profesores por el conocimiento brindado en el transcurso de mi

desarrollo profesional.

A mi familia y amigos por su apoyo constante.

 PRESENTACIÓN
Con el objetivo de consolidar mis conocimientos teóricos y reforzar los prácticos en el
área de Biotecnología Agrícola y cumplir con lo dispuesto en el reglamento de Prácticas
Preprofesionales de la Escuela Profesional de Biotecnología de la Universidad Nacional
del Santa para optar al grado académico de Bachiller en Biotecnología, presento a
ustedes miembros del Jurado Evaluador y lectores en general el presente informe que
corresponde a mis prácticas preprofesionales I, II y III, que se titula: “Micropropagación
de Saccharum officinarum y Vaccinium corymbosum L. cv. Biloxi hasta su
establecimiento en vivero en el proyecto Especial Chinecas”, realizado en el periodo
comprendido entre el 16 de Septiembre al 16 de Diciembre del 2019.

El presente informe demuestra los procesos y conocimientos adquiridos durante el

periodo de prácticas Preprofesionales I, II y III en el que principalmente se resalta los
procedimientos para la micropropagación, aclimatación y establecimiento de S.
officinarum y V. corymbosum L. cv. Biloxi bajo condiciones in vitro y ex vitro
(invernadero, vivero y campo) y la formulación de un proyecto que pretende dar
solución a un problema dentro de la institución y conducir a un mayor rendimiento de
las plántulas de V. corymbosum L. cv. Biloxi.

Satisfecho de haber aprendido y adquirido mayor conocimiento en el área de

biotecnología agrícola en el transcurso de las prácticas, dejo a su criterio y observación
el presente informe.

Ivan Gonzalo Zavaleta Reyes

 ÍNDICE

DEDICATORIA....................................................................................................................... I

AGRADECIMIENTO........................................................................................................... II

PRESENTACIÓN................................................................................................................. III

ÍNDICE DE CUADROS...................................................................................................... VI

ÍNDICE DE FIGURAS....................................................................................................... VII

ÍNDICE DE ANEXOS....................................................................................................... VIII

I. INTRODUCCIÓN...................................................................................................... 1

II. OBJETIVOS................................................................................................................ 2

2.1. Objetivo general.................................................................................................................... 2

2.2. Objetivos específicos.............................................................................................................. 2

III. DESCRIPCIÓN GENERAL DEL CENTRO DE PRÁCTICAS......................2

3.1. Datos generales...................................................................................................................... 2

3.2. Objetivos............................................................................................................................... 2

3.3. Ubicación geográfica............................................................................................................. 3

3.4. Estructura organizacional..................................................................................................... 4

3.5. Misión.................................................................................................................................... 4

3.6. Visión..................................................................................................................................... 4

IV. MARCO TEÓRICO................................................................................................... 4

4.1. Cultivo in vitro...................................................................................................................... 4

4.2. Manejo integrado de cultivo.................................................................................................. 5

4.2.1. Estadio 0 - Selección de la planta madre y obtención de los explantes...........................5
4.2.2. Estadio 1 - Establecimiento in vitro del explante...........................................................5
4.2.3. Estadio 2: Multiplicación in vitro..................................................................................6
4.2.4. Estadio 3: Enraizamiento in vitro..................................................................................6
4.2.5. Estadio 4: Aclimatación bajo condiciones ex vitro.........................................................6
4.2.6. Estadio 5: Establecimiento ex vitro (invernadero o vivero)...........................................7
4.2.7. Estadio 6: Multiplicación o propagación ex vitro (invernadero o vivero)......................7

4.3. Vaccinum corymbosum........................................................................................................... 7

4.4. Saccharum officinarum.......................................................................................................... 8

V. DESARROLLO DE LA PRÁCTICA.....................................................................8

5.1. Preparación del ambiente de trabajo.....................................................................................8

5.2. Micropropagación de arándanos........................................................................................... 9

5.2.1. Estadio 0........................................................................................................................ 9
5.2.2. Estadio 1...................................................................................................................... 10
5.2.3. Estadio 2...................................................................................................................... 10
5.2.4. Estadio 3...................................................................................................................... 11
5.2.5. Estadio 4...................................................................................................................... 11
5.2.6. Estadio 5...................................................................................................................... 11

5.3. Micropropagación de caña de azúcar..................................................................................13

5.3.1. Estadio 0...................................................................................................................... 13
5.3.2. Estadio 1...................................................................................................................... 14
5.3.3. Estadio 2...................................................................................................................... 17
5.3.4. Estadio 3...................................................................................................................... 17

5.4. Control de senescencia en arándanos...................................................................................17

VI. CONCLUSIONES.................................................................................................... 21
VII. RECOMENDACIONES......................................................................................... 21

VIII. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS.............................................................21

IX. ANEXOS.................................................................................................................... 23

PROYECTO DE INVESTIGACIÓN..............................................................................26
 ÍNDICE DE CUADROS
Cuadro 1. Medio de cultivo para caña en el estadio 1................................................................16
Cuadro 2. Tratamientos para el control de senescencia en arándanos.........................................18
 ÍNDICE DE FIGURAS
Fig. 1 Vista aérea de las oficinas y laboratorio del Proyecto Especial Chinecas ubicado en
Tangay.........................................................................................................................................3
Fig. 2 Tallo de arándano joven en sustrato de vivero...................................................................9
Fig. 3 Plántulas de arándano en medio WPM.............................................................................10
Fig. 4 Aclimatación, introducción ex vitro y enraizamiento en invernadero de plántulas de
arándano.....................................................................................................................................11
Fig. 5. Proceso de Establecimiento ex vitro, traslado de plantines.............................................12
Fig. 6 Arándanos ya colocados en las bolsas con tierra y aseguradas con turba.........................12
Fig. 7 Periodo de 24 horas del tratamiento de hidroterapia........................................................13
Fig. 8 Uninodales dispuestos en la malla para el proceso de hidroterapia y el tratamiento con el
fungicida....................................................................................................................................14
Fig. 9 Selección de los brotes de caña con tallo más grueso.......................................................14
Fig. 10 Corte del brote de caña desde la yema...........................................................................15
Fig. 11 Enjuague de los brotes de las yemas..............................................................................15
Fig. 12 Remoción de las capas superficiales..............................................................................15
Fig. 13 Tratamientos de control de senescencia en arándanos. Las plantas con hojas naranja se
encuentran en estado de senescencia, los palitos con papel contienen el número de tratamiento.
...................................................................................................................................................17
Fig. 14 Tratamientos T0, T1, T2 y T3 en los primeros días de tratamiento................................19
Fig. 15 Tratamientos de control de senescencia en arándano, primeros días..............................20
 ÍNDICE DE ANEXOS
Anexo 1. Limpieza de la cabina de flujo laminar.......................................................................23
Anexo 2. Estante con ruedas con los materiales de trabajo en el laboratorio..............................23
Anexo 3. Composición del WPM para arándano........................................................................24
Anexo 4. Almacenamiento de las muestras de brotes de caña para evitar la fenolización..........24
Anexo 5. Meristemos de caña cortado, vista a estereoscopio, selección de muestra..................25
I. INTRODUCCIÓN
La micropropagación in vitro permite obtener una producción de plantas libres
de virus, con características genotípicas y fenotípicas similares y reducir la
dificultad en aquellas que no se propagan fácilmente, [ CITATION Ort07 \l 10250 ].
La exportación del arándano se ha incrementado en los últimos años, en más del
200 % desde 2012 al 2016 según MINAGRI (2016). Por otro lado, la caña es
una planta de interés industrial desde hace ya bastantes años por agroindustriales
aledañas como Agroindustrias San Jacinto, la micropropagación de plántulas
libre de virus y con un alto rendimiento son necesarias y de gran relevancia para
la industria local y satisfacer también la demanda mundial.
La demanda es cada vez mayor y las técnicas convencionales de obtención de
plántulas no son suficientes para satisfacerla, es por ello que métodos
biotecnológicos como la industria de la micropropagación están desplazando a
los tradicionales (Ojeda - Zacarías, et. al, 2012). Para el caso de caña la
micropropagación se suele dar por meristemos para obtener plántulas de gran
calidad fitosanitaria y en mayores cantidades [ CITATION Aré05 \l 10250 ] . El
mercado global de berries es altamente competitivo y se enfoca en lograr un
abastecimiento global durante el transcurso de todo el año, y Perú cumple con
dicha característica [ CITATION MIN16 \l 10250 ], es debido a ello que se encuentra
muchas empresas que ofertan dicho fruto, a nivel industrial mediante
micropropagación in vitro. La producción industrial de Vaccinium corymbosum
(arándanos) y Saccharum officinarum (caña de azúcar) incluye conocer todas las
etapas de la micropropagación hasta su establecimiento ex vitro y control
agronómico, ya que al estar libre de patógenos y teniendo plántulas clones con
características óptimas de rendimiento, sabor y propiedades beneficiosas para la
salud, asegurar su correcto desarrollo es importante y necesario.
Tras lo expuesto, el presente informe presentará una descripción detallada de la
metodología de micropropagación in vitro y el manejo integrado ex vitro de
Vaccinium corymbosum L. variedad Biloxi y Saccharum officinarum hasta su
establecimiento en vivero en el Proyecto Especial Chinecas.
II. OBJETIVOS
II.1. Objetivo general
- Profundizar los conocimientos en la micropropagación de Saccharum
officinarum y Vaccinium corymbosum hasta su establecimiento en
campo en el proyecto Especial Chinecas.

II.2. Objetivos específicos

- Ejecutar los métodos de micropropagación utilizados para S.
officinarum y V. corymbosum L. variedad Biloxi.
- Manejar el cultivo in vitro de S. officinarum y V. corymbosum L.
variedad Biloxi hasta su establecimiento en vivero.
- Proponer un proyecto de investigación para solucionar un problema
identificado dentro de la institución.

III. DESCRIPCIÓN GENERAL DEL CENTRO DE PRÁCTICAS

III.1. Datos generales
Principalmente el Proyecto Especial Chinecas presenta una infraestructura
hidráulica que comprende un conjunto de obras destinadas a la captación y
conducción del recurso hídrico para fines de riego y abastecimiento de
agua para uso poblacional.

El esquema hidráulico principal, que atraviesa los valles de Santa –

Lacramarca, Nepeña y Casma, está constituido por dos sistemas de
captación y conducción: La Huaca y la Víbora, que contemplan los valles
de Nepeña- Casma y Santa- Chimbote, respectivamente.

El Laboratorio de Biotecnología Vegetal del Proyecto Especial Chinecas

se construyó con el objeto de aprovechar el potencial de las semillas de
diversas plantas de relevancia para la agricultura, el consumidor local e
internacional para obtener plantas de gran calidad genética y satisfacer a
los potenciales clientes.

III.2. Objetivos
 Mejorar los sistemas de riego en los valles de Lacramarca, Nepeña,
Casma y Sechín y ampliar la frontera agrícola.
  Optimizar el uso de los recursos agua-suelo, considerando la
utilización conjunta de las aguas superficiales y subterráneas
disponibles en el ámbito del Proyecto Especial Chinecas.
 Propiciar la generación de energía eléctrica mediante Centrales
Hidroeléctricas o uso de energías no convencionales.
 Mejorar los niveles de producción y productividad agraria.
 Promocionar la agroindustria y la exportación en los valles de
influencia.
 Generar empleo y reducir la pobreza en el ámbito regional mejorando
los niveles de ingreso per cápita.
 Promover la inversión pública y privada, nacional y/o extranjera en el
desarrollo integral del proyecto.

III.3. Ubicación geográfica

El laboratorio de Biotecnología del Proyecto Especial CHINECAS se
encuentra ubicado en el departamento de Áncash, campamento Tangay
Medio a 8 Km. de Nuevo Chimbote. Vista aérea en la Fig. 1.

Fig. 1 Vista aérea de las oficinas y laboratorio del Proyecto Especial Chinecas
ubicado en Tangay.

III.4. Estructura organizacional

Presidente
Ing. Juan Carlos Morillo Ulloa
 Representante del GRA
Ing. Fidel Bazán Blaz

Gerente General de Desarrollo

Agropecuario y Promoción de la
Inversión
Ing. Jorge Luis Espinoza Campos

Jefe del Laboratorio de

Biotecnología
Ing. Rubino Mejía Anaya

Practicantes Trabajadores Tesistas

III.5. Misión
Ejecutar y administrar la infraestructura hidráulica que permitan derivar
aguas del río Santa, contamos con autonomía Técnica, Económica,
Financiera y Administrativa. Promocionar la agroindustria y
agroexportación para el desarrollo regional. Contribuir a la generación de
empleo permanente en las zonas rurales y de mejorar la calidad y el nivel
de vida de la población asentada en el ámbito de influencia del Proyecto
Especial Chinecas que abarca las provincias de Santa y Casma.

III.6. Visión
Ser un órgano líder en la planificación y gestión de desarrollo estratégico,
que fortalezca el crecimiento y la integración a la economía regional y
nacional.

IV. MARCO TEÓRICO

IV.1. Cultivo in vitro
Las diversas técnicas del cultivo de tejidos vegetales in vitro se
fundamentan en la totipotencia celular y consisten en cultivar un explante
aséptico en un medio artificial de composición química definida e
 incubado en condiciones ambientales controladas [ CITATION Kum09 \l
10250 ].
La micropropagación es la aplicación más destacada en el cultivo de
tejidos; a partir del cultivo de meristemos es posible obtener plantas
genéticamente idénticas a la planta madre y propagar a gran escala
especies élite, amenazadas, en peligro de extinción, nuevas variedades o
las que tienen baja tasa de reproducción de manera natural [ CITATION
Geo08 \l 10250 ].
IV.2. Manejo integrado de cultivo
En la micropropagación comercial pueden identificarse cinco etapas bien
definidas: estadio 0: selección de la madre ó planta élite (PE), estadio 1:
establecimiento de los cultivos in vitro, estadio 2: multiplicación, estadio
3: elongación y enraizamiento y estadio 4: aclimatación [ CITATION Caa14 \l
10250 ].
No obstante, el manejo integrado de cultivo incluye no solo conocer las
etapas in vitro sino también las ex vitro para lograr un control y un
aseguramiento de la calidad de la planta hasta su venta. Es por ello que
para el manejo integrado del cultivo añadimos dos etapas o estadios más
quedando de la siguiente manera:
4.2.1. Estadio 0 - Selección de la planta madre y obtención de los
explantes
Para poder establecer el cultivo en condiciones de asepsia, se
deben obtener explantes con un nivel nutricional y un grado de
desarrollo adecuado. Para obtener estos explantes es
recomendable mantener a las plantas seleccionada, ó planta
donante de yemas, durante un período que puede oscilar entre
unas semanas o varios meses en un invernadero bajo condiciones
controladas. En ese ambiente se cultiva la planta en condiciones
sanitarias óptimas y con un control de la nutrición y riego
adecuados para permitir un crecimiento vigoroso y libre de
enfermedades nos dice [ CITATION Cas04 \l 10250 ].
4.2.2. Estadio 1 - Establecimiento in vitro del explante
El explante seleccionado se pone en medio de cultivo estéril. En
un período de una semana o quince días, comienza el proceso de
 germinación o regeneración de nuevos tejidos vegetales, iniciando
el ciclo de cultivo in vitro [ CITATION Cas04 \l 10250 ].
4.2.3. Estadio 2: Multiplicación in vitro
Durante esta fase se espera que los explantes que sobrevivieron el
estadio 0 y 1 originen brotes (de procedencia axilar o adventicia)
con varias hojas. En la base de cada hoja hay una yema que se
desarrollará luego de ser puesta en contacto con el medio de
cultivo. Periódicamente estos nuevos brotes se deben recultivar en
un nuevo medio mediante divisiones y resiembras en tubos de
cultivo u otros recipientes adecuados. Estas operaciones se
realizan en la cabina de flujo laminar o en un lugar aislado que
nos permita mantener las condiciones de asepsia. De esta forma
aumenta el número de plantas en cada repique o división de las
plantas. El número de plantas que se obtiene dependerá de la
especie vegetal y de las condiciones del medio de cultivo. El
número de plantas que se obtiene por la vía de la
micropropagación permite alcanzar incrementos exponenciales,
considerando que todos los factores que afectan el crecimiento
hayan sido optimizados [ CITATION Cas04 \l 10250 ].
4.2.4. Estadio 3: Enraizamiento in vitro
Para enraizar los explantes se utilizan principalmente plantines
individuales de un tamaño aproximado de 2 centímetros. Los
brotes obtenidos durante la fase de multiplicación se transfieren a
un medio libre de reguladores de crecimiento o que solo contenga
hormonas del tipo auxinas. Algunas especies de plantas no
necesitan pasar por esta etapa y emiten sus raíces en el mismo
medio de cultivo donde desarrollan yemas nuevas, por lo tanto, el
proceso de multiplicación y enraizamiento transcurren en forma
simultánea [ CITATION Cas04 \l 10250 ].
4.2.5. Estadio 4: Aclimatación bajo condiciones ex vitro
Los plantines enraizados, deben ser aclimatados a las condiciones
de humedad del invernadero disminuyendo progresivamente la
humedad relativa e incrementando progresivamente la intensidad
de luz. Estos plantines se plantarán en contenedores
 (almacigueras) cubiertos por un plástico, para mantener la
humedad relativa elevada. La elección de un sustrato con buenas
características físicas, es clave para el éxito de esta etapa
[ CITATION Cas04 \l 10250 ].
4.2.6. Estadio 5: Establecimiento ex vitro (invernadero o vivero)
Implica la introducción de las plantas a condiciones ex vitro, con
condiciones similares a las de campo y producción. Muchas veces
el estadio 4 y 5 se dan al mismo tiempo si es que solo se cuenta
con un invernadero o vivero.
4.2.7. Estadio 6: Multiplicación o propagación ex vitro (invernadero
o vivero)
La multiplicación ex vitro se puede dar por semillas
(reproducción sexual o progenie con distinto genotipo) y por
reproducción vegetativa por bulbos, esquejes, estacas, tubérculos
(reproducción asexual, progenie con idéntico genotipo, o
descendencia uniforme) según [ CITATION Lóp18 \l 10250 ]. Se da
por propagación por esquejes por lo general como paso preliminar
para la producción en campo.
IV.3. Vaccinum corymbosum
La selección de la zona geográfica es una de las características
primordiales para el establecimiento del cultivo de arándano y se deben
cuidar las condiciones edafoclimáticas como el tipo de suelo, la
luminosidad, la temperatura y otros factores como la disponibilidad,
calidad del agua y las prácticas de manejo, especialmente la nutrición
necesaria en la producción y calidad del cultivo (Gwathmey et al., 2009).
Los arándanos que se cultivan en Estados Unidos y Canadá, son plantas
adaptadas para crecer en condiciones de suelos ácidos (pH 4.3 - 4.8),
donde se tiene una alta disponibilidad de algunos nutrientes como el hierro
y manganeso cuyos requerimientos porcentuales en la planta de arándano
son superiores a otras especies frutales (Hirzel y Rodríguez, 2003); además
de desarrollarse en suelos arenosos pobres en nutrientes y ricos en materia
orgánica; por lo que son generalmente considerados sensibles a la
fertilización excesiva (Smolarz y Mercik, 1989; Hanson y Hancock, 1996;
Hanson, 2006; Ochmian et al., 2008).
 IV.4. Saccharum officinarum
La caña de azúcar es originaria del sudeste asiático. Los árabes
extendieron sus cultivos por el Mediterráneo, y los españoles y portugeses
la llevaron a América en el siglo XVI. De ella se obtiene el azúcar de caña,
así como la melaza, que es el residuo en forma de jarabe que queda
después de separar del jugo de la caña, el azúcar cristalizado [ CITATION
Pam06 \l 10250 ]. Para lograr avances que impacten en el sistema de
producción de caña de azúcar, es necesario implementar estrategias de
innovación, tales como el cultivo in vitro [ CITATION Cas14 \l 10250 ] , que
sea eficiente para la obtención de lotes de plantas libres de enfermedades
disponibles para determinar relaciones de etiología y estudios de sanidad
[ CITATION Bho13 \l 10250 ], [ CITATION Lóp08 \l 10250 ].

V. DESARROLLO DE LA PRÁCTICA

V.1. Preparación del ambiente de trabajo

El trabajo se desarrolló en una cabina de flujo laminar dónde se siguió un
protocolo para la mayoría de actividades (cultivo in vitro, multiplicación,
dispensación de medio de cultivo, etc.). Dicho protocolo fue el siguiente:
Primero se limpió la superficie de la cabina de flujo laminar con una
concentración de lejía al 10 % con la ayuda de un algodón (Anexo 1).
Todos los trabajadores o practicantes contábamos con un estante con
ruedas dónde colocamos el estuche con materiales de metal (tijeras, pinzas,
bisturís de acero inoxidable), una piseta con lejía al 10 %, una piseta con
alcohol, un encendedor, un táper con algodón y una toalla (Anexo 2).
Segundo se colocó la toalla y sobre la misma se colocó los materiales de
metal, un mechero en la parte superior derecha de la cabina, una bolsa de
plástico que contiene hojas de papel A4 estériles cortadas por la mitad, en
la parte inferior izquierda una placa con algodón humedecido con lejía al
10 % y en la parte inferior derecha una placa con algodón humedecido con
alcohol. En tercer lugar, se vertió un poco de alcohol en las manos y con la
yema de los dedos se sustrae de la bolsa una mitad de hoja bond estéril y
se colocó en la parte superior izquierda dónde se puso los materiales
estériles, se limpió los materiales con el algodón humedecido con alcohol
 antes de flamear con el mechero, para las tijeras y bisturís se esterilizó con
la ayuda de las pinzas y las pinzas se esterilizaron flameando los extremos.
Una vez esterilizados los materiales, se regresó el mechero a su posición
inicial, se vertió un poco de alcohol en las manos y se colocó 2 mitades de
hoja de papel al costado de los materiales estériles de metal para colocar
ahí el material biológico (explantes principalmente).
La esterilización se volvió a efectuar tras retirar el papel del material
biológico y se procedió a limpiar con el algodón con lejía la superficie,
para volver a flamear y colocar los materiales en una nueva hoja (o colocar
en el estuche todo para apagar la cabina si se culminó con el trabajo).

V.2. Micropropagación de arándanos

V.2.1. Estadio 0

Se cortó piezas de tallo de 25 cm y se colocaron en un recipiente

con papel toalla húmedo. Posteriormente se desinfectó con agua y
jabón antibacterial, se enjuagó con agua destilada para tratar
después con lejía al 10 % por 15 min. En la figura 2 podemos
apreciar la anatomía de una planta joven de arándano.

Fig. 2 Tallo de arándano joven en

sustrato de vivero.

El sustrato estuvo
conformado por tierra lavada y el plantín colocado en sustrato de
 corteza (también conocido como turba) de los Productos – Kekkilä
Professional de Israel.

V.2.2. Estadio 1

Se recortó los tallos por los extremos hasta tener aproximadamente

8 cm y se sembró en medio WPM (Anexo 3) en tubos de ensayo y
se mantuvo por 15 días hasta empezar con la multiplicación.
Plántulas de arándano en medio WPM listas para multiplicar (Fig.
3).

Fig. 3 Plántulas de arándano en medio WPM.

V.2.3. Estadio 2

Para la multiplicación se dispensó medio de cultivo estéril

previamente en bolsas de propileno estéril y siguiendo el protocolo
descrito previamente con la ayuda de una tijera se cortó
transversalmente la bolsa con el medio, aproximadamente 2 a 4 cm.

Posterior a eso se procedió a obtener el explante, sosteniendo la

plántula con una pinza y cortando con una tijera desde el cuello del
tallo, para algunos casos si la plántula es demasiado grande puede
 obtenerse dos o tres explantes, un brote también se cortó y se
utilizó como explante.

Los explantes se colocaron en la hoja bond estéril para material

biológico y con la ayuda de una pinza se colocaron en un nuevo
medio, aproximadamente de 9 a 12 explantes por medio, medio
WPM con 1 ml de 2 isopentil adenina (2iP) 350 ppm. Se utilizó la
citoquinina 2iP debido a la gran relación que tiene en cuánto a su
costo y la proliferación de brotes en el estadio de multiplicación.

V.2.4. Estadio 3
Se llevó las plántulas al invernadero y se colocó en bandejas
rellenadas con turba para ponerlas en contacto con las hormonas de
enraizamiento. Cada bandeja tenía una capacidad de 200 plantines.
Aclimatación y enraizamiento paralelo (Fig. 4).

V.2.5. Estadio 4

Se dio paralelo al estadio 3 de enraizamiento, ya que también se dio

en condiciones ex vitro el proceso de aclimatación al mismo tiempo
en el invernadero.

Fig. 4 Aclimatación, introducción ex vitro y enraizamiento en

invernadero de plántulas de arándano.

V.2.6. Estadio 5

De las bandejas de invernadero traspasamos a bolsas con tierra

lavada como sustrato, primero se regó las bolsas con sustrato, luego
se substrajo de las bandejas con ayuda de una varilla o un palito de
similar diámetro al agujero de los casilleros de la bandeja para
remover los plantines con todo y turba, posterior a ello con un palo
de diámetro similar a los casilleros de la bandeja se hizo agujeros
en la tierra de las bolsas para introducir los plantines, finalmente se
vertió un poco de turba líquida para asegurar que los arándanos no
se movieran con el riego ni con el viento (Fig. 5). Plantines de
arándanos ya establecidos en su sustrato (Fig. 6).

Fig. 5. Proceso de
Establecimiento ex vitro,
traslado de plantines.
 Fig. 6 Arándanos ya colocados en las
bolsas con tierra y aseguradas con
turba.

V.3. Micropropagación de caña de azúcar

V.3.1. Estadio 0
Para elegir la planta donante se buscó las plantas más vigorosas y
que tengan las yemas en buen estado. Las semillas de caña
proporcionadas eran de la variedad México 73 – 0523 procedentes
de Agroindustrias San Jacinto SAC.

Las semillas de la caña (tallos con yema) se desinfectaron

lavándolos en una solución de detergente para retirar los residuos
sólidos que pudieran contener y posterior a eso se enjuagó.

Después se procedió a cortar las semillas para obtener los

uninodales y se colocaron en un balde con agua para evitar la
deshidratación. Dichos uninodales se sometieron a un
pretratamiento de hidroterapia que consistió en: envolver los
uninodales dentro de una malla y colocar en un cooler con agua a
50 °C por 10 minutos y 10 minutos en agua fría para evitar que se
siga cocinando. Tras ello se colocó papel periódico en una “cama
de arena”, se humedeció con agua vertida con un atomizador y se
colocó los uninodales para volver a cubrir con papel periódico y
humedecerlo (Fig. 7). Se tuvo que mantener hermético para ayudar
a mantener el agua tras la evapotranspiración.

Fig. 7 Periodo de 24 horas del tratamiento de hidroterapia.

Después de 24 horas se sacó de la cama de arena los uninodales

para hacer un nuevo tratamiento de hidroterapia, esta vez a 50 °C
por media hora para posteriormente con ayuda de una malla se
sumergió en el fungicida Homai al 2 % por 30 minutos, se
enjuagó y así estuvo listo para sembrarse en una cama de arena
(Fig.8).
 Fig. 8 Uninodales dispuestos en la malla para el proceso de
hidroterapia y el tratamiento con el fungicida.

V.3.2. Estadio 1
Se seleccionaron los brotes más vigorosos de la cama de arena (Fig.
9) y se cortaron desde la base de la yema para obtener el explante y
se recortó desde la parte superior hasta tener aproximadamente 4 a
5 cm el explante (Fig. 10), se guardó en un frasco y se mantuvo en
oscuridad con una bolsa negra (Anexo 4).

Fig. 9 Selección de los brotes de caña con tallo más grueso.

Fig. 10 Corte del brote de caña desde la yema.

 Se enjuagó varias veces con agua para remover la tierra y luego se
lavó con un poco de detergente y se eliminó el remanente de
detergente con agua destilada (Fig. 11). Con la ayuda de un bisturí
se removió las capas más superficiales de la caña y se removió
también las espinas, se recortó nuevamente a 3 cm de la parte
superior (Fig. 12).

Fig. 11 Enjuague de los brotes de las yemas.

Fig. 12 Remoción de las capas superficiales.

Se realizó un proceso de hidroterapia sumergiendo los explantes por

8 a 15 minutos dependiendo al grosor del explante para evitar
cocinarlos, el proceso se realizó con agua destilada estéril y luego se
colocó en agua destilada fría estéril.

En la cabina de flujo laminar con la ayuda de un bisturí y un

estereoscopio se obtuvo el meristemo para la siembra en tubos de
ensayo en el medio descrito en el Cuadro 1. Vista del meristemo en
el estereoscopio (Anexo 5).

Se hizo la resiembra del meristemo mientras que no existiera la

presencia de brotes laterales, paso previo a la multiplicación.
 Cuadro 1. Medio de cultivo para caña en el estadio 1.

Ingrediente Concentración (g/L)

NH4NO3 1.75
KNO3 1
CaCl2.2H2O 0.44
KH2PO4 0.17
H3BO3 0.0062
MnSO4.4H2O 0.0223
MnSO4.H2O 0.0109
ZnSO4.7H2O 0.0086
ZnSO4.H2O 0.00614
KI 0.00082
Na2MoO4.2H2O 0.0000025
CuSO4.5H2O 0.0000025
CoCl2.6H2O 0.000025
MgSO4.7H2O 0.37
Na2EDTA 0.03725
FeSO4.7H2O 0.02785
Mioinositol 1
Tiamina HCl 0.0001
Glicina 0.002
Ácido nicotínico 0.0005
Piridoxina HCl 0.0005
Azúcar 20
Azul de metileno 2

V.3.3. Estadio 2
La multiplicación se dio cada 15 días y dependiendo del número de
brotes se puede dividir hasta en 3 plántulas.

Para este estadio se le añade además del medio del anterior estadio
2 ml de bencilaminopurina (BAP), 2 ml de zeatina, 8 ml más de
azul de metileno y 2 ml de NaOH.

V.3.4. Estadio 3
Se individualiza los tallos y se coloca en un nuevo medio de cultivo
hasta que las plántulas desarrollaran las raíces.

V.4. Control de senescencia en arándanos

Se presentó un gran porcentaje de plántulas con muy buen desarrollo tras su
aclimatación en los invernaderos, no obstante, se evidenció un problema un tanto
crítico, una creciente cantidad de plantines muertos de arándano en el vivero
(Fig. 13).

Fig. 13 Tratamientos de control de senescencia en arándanos. Las plantas con

hojas naranja se encuentran en estado de senescencia, los palitos con papel
contienen el número de tratamiento.

Fue entonces que el equipo de practicantes encargado de los arándanos y el

ingeniero a cargo del laboratorio llevamos a cabo un ensayo (un ensayo similar
se había realizado anteriormente también) para determinar si se podría revertir la
senescencia o controlarla (regresar los plantines de color naranja a verde o
simplemente evitar que más verdes se tornen naranja) con una serie de 9
diferentes reactivos y diferentes concentraciones en 20 tratamientos que será
mostrada en el Cuadro 2 a continuación:

Cuadro 2. Tratamientos para el control de senescencia en arándanos.

Cantidad de
Tratamiento
Reactivo Concentración emulsificante
(clave)
Citowet en gotas
T0 Agua   0
T1 15 % v/v 6
T2 Lejía 5 % v/v 6
T3 1 % v/v 6
T4 Kaptan 5 g/L 6
T5 Sumislex DC 5 g/L 6
T6 Ácido fosfórico 1.5 % v/v 0
T7 0.25 % v/v 0
T8 20 g/L 0
T9 15 g/L 0
T10 Cupravit 10 g/L 0
T11 5 g/L 0
T12 2.5 g/L 0
T13 0.2 g/L 0
T14 Farmathe 0.15 g/L 0
T15 0.1 g/L 0
T16 0.5% v/v 0
T17 Phyto - Cu 0.25% v/v 0
T18 0.05% v/v 0
T19 Dithane 2.5 g/L 0
T20 Benlate 1 g/L 0

Por cada tratamiento y de igual forma para el control (T0), se tomaron

bolsas con 6 plantines de arándano de los cuales, 4 eran arándanos en
estado de senescencia (plantines color naranja) y 2 plantines de hojas
verdes y buena apariencia. Se removieron 2 plantines de hojas naranja (2
de los 4 en estado de senescencia) y se reemplazaron por 2 plantines
verdes nuevos del invernadero, posterior a eso se vierte un poco de turba
líquida de ser necesario para mantener erguidos los 6 plantines de cada
tratamiento. Primeros 3 tratamientos y el control (Fig. 14).
Fig. 14 Tratamientos T0, T1, T2 y T3 en los primeros días de tratamiento.

Del Cuadro 2 anteriormente mostrado se prepararon 400 ml de solución

por cada tratamiento y se distribuyeron entre los 6 plantines por
tratamiento, regando de tal manera que solo se moje la tierra y la base del
tallo para evitar excedo de humedad que podría beneficiar a patógenos. Se
aplicaron los tratamientos una vez por semana durante un mes.
 Fig. 15 Tratamientos de control de senescencia en arándano, primeros días.

Los tratamientos que mostraron mejores resultados fueron los tratamiento

T4 (Kaptan 5g/L), T12 (Cupravit 2.5 g/L) y T18 (Phyton – Cu 0.05 %)
quienes lograron mantener en buen estado los 4 plantines iniciales verdes,
no obstante, solo el tratamiento T8 (Cupravit 20 g/L) mostró una reversión
del daño volviendo verde uno de los plantines de hoja naranja, sin
embargo, al no ser homogéneo con los 6 plantines se descartó su uso en los
plantines con daño. La serie de tratamientos se puede apreciar en la figura
anteriormente mostrada (Fig. 15).
Se tomaron los mejores tratamiento para la aplicación de las camas de
tierra con arándano (aproximadamente 40 L por cada cama) y se logró una
disminución de senescencia solo en aquellas camas dónde además se tenía
un control de salinidad, y acidez de los sustratos.

VI. CONCLUSIONES
Se logró profundizar en el técnica biotecnológica de la micropropagación de
plantas tan relevantes como: la caña de azúcar (S. officinarum) y los arándanos
azules (V. corymbosum L. cv Biloxi) desde escoger la planta madre, pasando por
los estadios in vitro hasta llegar a los ex vitro cuidando de ellos con el apoyo de
los manejos agronómicos del ing y blgo. hasta su comercialización.

Se pudo aplicar la técnica de micropropagación a las dos especies mencionadas

con anterioridad, familiarizando el procedimiento con las habilidades técnicas
adquiridas en el desarrollo profesional.
 Se pudo manejar el cultivo in vitro de S. officinarum con un porcentaje de éxito
en invernadero de 99 % y 98 % en el vivero que posteriormente se entregó a las
Agroindustrias San Jacinto 3 150 plantines y V. corymbosum L. cv Biloxi en
invernadero en un 99 % sin embargo un 60 % de éxito de 10 000 plantines en el
vivero que se tuvieron que mantener saludables con los bioensayos a V.
corymbosum L. cv Biloxi, teniendo como mejores tratamientos a Kaptan,
Cupravit y Phyton-Cu.

VII. RECOMENDACIONES
Se recomienda realizar una investigación más profunda y prolija en el control de
senescencia de V. corymbosum L. cv. Biloxi utilizando agentes biológicos para
contrastar los resultados obtenidos con agentes químicos.

VIII. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

Arévalo Armas, F. (2005). Evaluación de medios de cultivo en la propagación in vitro de
caña de azúcar (Saccharum officinarum) a partir de meristemos. Tarapoto: Universidad
Nacional de San Martín.

Bhojwani, S. S., & Dantu, P. (2013). Plant Tissue Culture: An Introductory Text. New
Delhi: Springer.

Caamal Velázquez, J. H., & Bello Bello, J. J. (2014). Manual de Micropropagación de

caña de azúcar (Saccharum spp.). Campeche, México: Fundación Produce Campeche.

Castañeda-Castro, O., Gómez-Merino, F., Trejo-Téllez, L., Morales-Ramos, V., Gonzáles-

Arnao, M., Martínez-Ocampo, Y., . . . Pastelín-Solano, M. (2014). Aplicaciones del cultivo
de tejidos vegetales en caña de azúcar (Saccharum spp.). . Agroproductividad 7, 16-21.

Castillo, A. (2004). Propagación de plantas por cultivo in vitro: una biotecnología que. Las
Brujas, Uruguay: INIA.

George, E., & Debergh, P. C. (2008). Micropropagation: uses and methods in: Plant
Propagation by Tissue Culture. Vol. 1 . Springer: The Background.

Kumar, S., & Singh, M. (2009). Plant Tissue Culture. New Delhi: APH Publishing
Corporation.

López Fernandez, A. (2018). Técnicas de cultivo in vitro. Genetica Forestal, 2-3.

López-Estrada, M., Acosta-Rodríguez, M., Otero-Colina, G., Michel-Aceves, A., &
Noriega-Cantú, D. (2008). Manejo de plántulas de mango (Mangifera indica L.) obtenidas
in vitro para estudios de sanidad vegetal. Revista Mexicana de Fitopatología 26, 184-187.

MINAGRI. (2016). El arándano en el Perú y el mundo. Producción, Comercio y

Perspectivas 2016. Dirección de Estudios Económicos e Información Agraria. Primera
Edición , 1-42.

Ojeda - Zacarías, M. d.-A., Santos-Haliscak, J. A., Moreno-Degollado, G., Aguirre-Arzola,

V., Iracheta-Donjuan, L., & López-Gomez, P. C.-J. (2012). Micropropagación de pitahaya,
Hylocereus undatus (HAWORTH). RESPYN, 119-128.

Ortiz, R., López, A., Ponchner, S., & Segura, A. (2007). El cultivo del Banano. San José,
Costa Rica: Editorial Universidad Estatal a Distancia (EUNED).

Pamplona Roger, J. D. (2006). Salud por las Plantas Medicinales. Madrid: Safeliz.
IX. ANEXOS
Anexo 1. Limpieza de la cabina de flujo laminar.

Anexo 2. Estante con ruedas con los materiales de trabajo en

el laboratorio.
 Anexo 3. Composición del WPM para arándano.

Anexo 4. Almacenamiento de las muestras de

brotes de caña para evitar la fenolización.

Anexo 5. Meristemos de caña cortado, vista a estereoscopio, selección

de muestra
PROYECTO DE INVESTIGACIÓN

I. GENERALIDADES

1. Titulo
 Efecto de las diferentes concentraciones de Isopentenil adenina (2ip) y
Bencilaminopurina (BAP) en medio MS para la multiplicación in vitro de
microtallos a partir de segmentos nodales de Vaccinium corymbosum L. cv.
Biloxi en vivero del Proyecto Especial CHINECAS.
2. Personal investigador

2.1. Autor: Ivan Gonzalo Zavaleta Reyes

2.2. Asesor: Eterio Alva Muñoz

3. Tipo de investigación
3.1. Por su propósito: Aplicada
3.2. Por su naturaleza: Investigación explicativa
4. Localidad e institución donde se desarrollará el proyecto
Proyecto Especial CHINECAS
5. Cronograma de trabajo

SEMANAS
ACTIVIDAD
1 2 3 4 5 6 7

Recolección del
x            
material vegetal

Preparación de
los reguladores x            
de crecimiento

Preparación del
x            
Medio MS
 Inserción de
  x          
explantes
Descarte de
medios
contaminados   x x        
(fenolizados y
necrosados) .
Tomas de
      x x    
muestra
Determinaciones
        x    
analíticas
Evaluación del
crecimiento       x x x  
vegetal

Elaboración del
reporte final y             x
conclusiones

6. Recursos
6.1. Disponibles: Recursos humanos, bienes y servicios
- Investigador
- Ingeniero a cargo
- Técnico de Laboratorio

COSTO / TOTAL
Material vegetal CANTIDAD
UNID. (S/.) (S/.)
Vaccinium corymbosum 20 plantines S/. 6.00 S/. 120

COSTO / TOTAL
Materiales de laboratorio CANTIDAD
UNID. (S/.) (S/.)
Placas Petri 10 und S/. 3.00 S/. 30.00
Tubos de ensayo 10 und S/. 1.50 S/. 15.00

Vaso de precipitación 50
10 und S/. 8.00 S/. 80.00
ml

Pipetas 1 ml 3 und S/. 3.00 S/. 9.00

Pipetas 10 ml 3 und S/. 7.00 S/. 21.00

Probeta 250 ml 1 und S/. 64.00 S/. 64.00

Mecheros de alcohol 4 und S/. 13.00 S/. 52.00

Matraz Erlenmeyer 4 und S/. 40.00 S/. 160.00

Bolsas de polietileno de 2 paquetes (100 und x

S/. 2 x 1 paquete S/. 4.00
4’’x4’’x2 mm paquete)

Bisturí 10 und S/. 1.00 S/. 10.00

TOTAL     S/. 565.00

Equipos e Instrumento de COSTO / TOTAL

CANTIDAD
medición UNID. (S/.) (S/.)

Balanza analítica/Precisa
1 und S/. 3,000.00 S/. 3,000.00
gravimétrica

Incubadora 1 und S/. 7,600.00 S/. 7,600.00

S/.
Cabina de flujo laminar 1 und S/. 10,600.00
10,600.00
Autoclave 1 und S/. 700.00 S/. 700.00
Estufa 1 und S/. 3,450.00 S/. 3,450.00
Cocina eléctrica 1 und S/. 99.00 S/. 99.00

Destilador de agua 1 und S/. 7,500 S/. 7,500

Agitar magnético 1 und S/. 350.00 S/. 350.00

Espectrofotómetro 1 und S/. 8,536.34 S/. 8,536.34

S/.
TOTAL
42,400.34
 6.2. No disponibles

COSTO / UNID.
Materiales, Reactivos CANTIDAD TOTAL (S/.)
(S/.)
Agar nutritivo 200 g S/. 62.68 S/. 62.68
NH4NO3 100 ml S/. 420.00 S/. 420.00
Caldo común 500g S/. 570.00 S/. 570.00
KNO3 100 g S/. 50.00 S/. 50.00
CaCl2.2H2O 100 g S/. 150.00 S/. 150.00
KH2PO4 100 g S/. 100.00 S/. 100.00
H3BO3 100 g S/. 120.00 S/. 120.00
MnSO4.4H2O 100 ml S/. 80.00 S/. 80.00
ZnSO4.4H2O 100 g S/. 30.00 S/. 30.00
KI 100 g S/. 150.00 S/. 150.00
NaMoO4.2H2O 100 ml S/. 90.00 S/. 90.00
CoCl2.6H2O 100 ml S/. 80.00 S/. 80.00
MgSO4.7H2O 100 g S/. 130.00 S/. 130.00
Na2EDTA 100 g S/. 60.00 S/. 60.00
FeSO4.7H2O 100 g S/. 120.00 S/. 120.00
Mioinositol 100 g S/. 55.00 S/. 55.00
Tiamina HCL 100 g S/. 90.00 S/. 90.00
Glicina 100 g S/. 145.00 S/. 145.00
Ácido nicotínico 100 g S/. 70.00 S/. 70.00
Piridoxina HCL 100 g S/. 45.00 S/. 45.00
BAP 100 g S/. 90.00 S/. 90.00
2ip 100 g S/. 90.00 S/. 90.00
Carbón activado 100 g S/. 160.00 S/. 160.00
Encendedor 1 S/. 12.00 S/. 12.00
hilo 1 S/. 5.00 S/. 5.00
Clips (paq. 50) 1 S/. 5.00 S/. 5.00
Cinta Adhesiva 1 S/. 4.50 S/. 4.50
Marcador 1 S/. 3.50 S/. 3.50
Ron 100 ml S/. 10.00 S/. 10.00
Detergente 1 S/. 5.50 S/. 5.50
H2O destilada 100 ml S/. 35.00 S/. 35.00
Espátula 1 und S/. 15.00 S/. 15.00
Algodón 1 und S/. 15.00 S/. 15.00
Papel de aluminio 1 caja S/. 7.00 S/. 7.00
Etanol 6L S/. 11.00 S/. 66.00
hipoclorito de sodio
100 ml S/. 1.50 S/. 1.50
(lejía)
Guantes 50 und 1 caja S/. 12.00 S/. 12.00
       
TOTAL S/. 3,154.68

7. Presupuesto y financiamiento

Financiamiento Aporte (S/.) Participac

ión (%)
Proyecto S/. 42,400.34 93.08
Especial
CHINECAS
Autofinanciami S/. 3,154.68 6.92
ento
TOTAL S/. 45,555.02 100

II. PLAN DE INVESTIGACIÓN

1) Antecedentes
El arándano (Vaccinium corymbosum L.) contiene alrededor de 450 especies y
pertenece a la familia Ericaceae (Madriz, 1999). Sus frutos son ricas en
antocianos y minerales, por lo que se les atribuye un alto valor medicinal y
nutricional (INTA, 2011). Es una especie de gran interés económico en países
como Estados Unidos, Canadá y más recientemente Argentina y Chile, donde la
demanda está aún insatisfecha (Plata, 1998, Fabiani, 2002).
En América Latina, Chile, Argentina, Uruguay y México han experimentado un
fuerte auge en la producción de arándanos (Bañados, 2006). Uno de los factores
asociados a este dramático incremento es la demanda de la fruta por parte de los
consumidores con base en su valor nutricional y sus beneficios en la salud
humana (Howell 2009, Finn et ál. 2014). Los frutos de arándano poseen un alto
contenido de antocianinas, proantocianidinas y otros flavonoides (Kalt et ál.
1999).
Los arándanos se propagan comercialmente en forma vegetativa, mediante el
enraizamiento de estacas de tallo herbáceas o leñosas. Sin embargo, esta práctica
es lenta, hay genotipos que presentan bajos porcentajes de enraizamiento y
puede contribuir a la diseminación de enfermedades (González et ál. 2000,
Ostrolucká et ál. 2004, Meiners et ál. 2007, Trevisan et ál. 2008, Fischer et ál.
2012).
Es por tal motivo que el uso de cultivos in vitro permite obtener una
propagación con una gran cantidad de plantas en menor tiempo y libres de
agentes patógenos como virus, hongos y otros (González et ál. 2000, Prodorutti
et ál. 2007). En adición, se ha demostrado que las plantas de arándano derivadas
de cultivo de tejidos, en comparación con su contraparte, propagada mediante
estacas de tallo, tienen un hábito de crecimiento más tupido, con mayor
brotación lateral, desarrollo de corona y cantidad de yemas florales por planta, lo
que se traduce en mayor cantidad de frutos y rendimiento, aunque pueden existir
diferencias entre cultivares (Morrison et ál. 2000, Litwin´czuk et ál. 2005,
Debnath et ál. 2012, Mariano et ál. 2014)
Existen en la bibliografía numerosas referencias de cultivo in vitro del género
Vaccinium. Así Mora (2010) emplea medio WPM con 2ip 2 mg/L, Hine-Gómez
& Abdelnour-Esquivel (2013) emplean WPM con 2ip 2,5 mg/L, Ruzic et al.
(2012) usan medio MS con Zeatina y AIB. Debnath (2009) recomienda medios
con baja concentración de sales como hacen Rache y Pacheco (2010) con el
medio MS 1/3, siendo recomendado también el uso de Zeatina (Ostrolucká, et
al., 2004; Reed & Abdelnour-Esquivel, 1991). Respecto a los medios de
enraizamiento, González, et al. (2000) vieron que los brotes procedentes de
cultivos in vitro podían enraizar en condiciones ex vitro en ausencia de
tratamiento con auxinas, mientras que Cüce & Sökmen (2015) usan medios de
enraizamiento con AIB y carbón activado.
Otros estudios, se han centrado en la búsqueda de las citoquininas adecuadas
para el establecimiento y multiplicación in vitro, donde destacan, la isopentenil-
adenina (2iP) y la zeatina (Reed y Abdelnour, 1991; Debnath y McRae, 2005;
Fira et al., 2008). También se ha estudiado el empleo de tidiazurón (TDZ) para
inducir brotes adventicios, no obstante, la mayoría de las investigaciones han
observado una baja respuesta del arándano respecto a esta hormona (Cao y
Hammerschlag, 2000; 2002; Debnath, 2005a; 2005; Meiners et al., 2007). Otro
factor es la concentración de sacarosa, donde se ha reportado la proliferación de
brotes en arándano en medios contenidos desde 15 mM (Cao et al., 1998) a 88
mM (Zimmerman y Broome, 1980; Wolfe et al., 1983).
También existen trabajo sobre micropropagación, donde se compara el efecto de
dos citoquininas; 2-isopenteniladenina (2ip) y zeatina, donde se demostró que la
proliferación de brotes in vitro tinene un mejor resultado en cultivos con zeatina,
en comparación con 2ip, pero Chandler y Draper (1986) y Zhidong (2006)
determinaron que si bien el uso de zeatina producía mejores resultados en la
proliferación de brotes, tenía un costo muy elevado en comparación con el 2ip,
con lo cual obtuvieron una relación entre la tasa de proliferación de brotes y el
costo de la producción.
Zimmerman y Broome (1980) se probaron diferentes concentraciones de 2ip y
se evaluó du efecto en la proliferación de brotes de arándano. En estos trabajos
se determinó que una alta concentración de 2ip (mayor de 15 – 20 mg/L)
produce mayor número de microtallos, pero de menor longitud. Debnath y
McRae (2001) determinaron además que estas dosis altas de 2ip producían un
aumento de la producción de callos, y brotes con menor numero de hojas y bajo
vigor. Por último, en estudios realizados en Chile se determinó que la
concentración óptima de 2ip varía entre 5 y 10 mg/L, dependiendo de la especie
(Muñoz, 1991).
Klerk, G. (2000) Utilizó diferentes variedades de arándano para evaluar cinco
dosis de BAP, que fueron las siguientes: 1, 2, 3, 4, 5 mg/L, debido a que existían
referencias de trabajos realizados en otros países, como resultado de esto, se
obtuvo mayor respuesta en los primeros tratamientos. Zimmerman y Broome
(1980), utilizaron dosis de 5, 6, 7, 8, 9 mg/L de BAP, obteniendo una gran
cantidad de callos, en vez de incrementar el número de microtallos deseados.
Sin embargo, hay que tener en cuenta que el éxito en la micropropagación de
una especie vegetal varía en función del genotipo con el que se trabaje (Debnath,
2009) por lo que es necesario adaptar las condiciones del cultivo in vitro a cada
variedad.
 En base a lo expuesto anteriormente, se formula el siguiente problema, ¿Cuál es
el efecto de las diferentes concentraciones de Isopentenil adenina (2ip) y
Bencilaminopurina (BAP) en medio MS para la multiplicación in vitro de
microtallos a partir de segmentos nodales de Vaccinium corymbosum L.
(Arándano). cv. Biloxy en el Proyecto Especial CHINECAS?
2) Justificación del problema
El arándano tiene una gran demanda a nivel mundial, por los diferentes
beneficios que brinda a la salud humana, en los últimos años, la producción de
arándano ha ido incrementando en nuestro país, ya que Perú es el único
exportador de arándano que lo produce todo el año por el clima que aporta las
horas frio necesarias para la producción, mientras que, en otros países como
Chile y Argentina, las producciones son temporales.
Sin embargo, la propagación tradicional utilizada para este fruto no es una buena
opción para la producción masiva, ya que se necesitaría grandes cantidades de
plantas madre, y el enraizamiento no garantizaría una gran cantidad de tallos, lo
que llevaría a una baja producción.
Por tal motivo, la propagación in vitro, es la técnica más recomendable para una
obtención rápida de material. Es por ello que varias empresas, tanto públicas
como privadas, vienen investigando como obtener un mayor número de
plantines en el menor tiempo posible, sin restar la calidad del producto. Y para
lograr esto, se parte desde el medio de cultivo y las concentraciones de
hormonas utilizadas. Es así que, el Proyecto Especial CHINECAS, busca
investiga la formulación del medio nutritivo óptimo para la producción de
arándano, ya que, hasta la fecha, no se tiene un protocolo estándar para el medio
de cultivo, con las hormonas adecuadas para su óptimo crecimiento.

3) Importancia
Por la gran importancia que ha tomado en los últimos años la producción de
arándano, se han realizado múltiples investigaciones para estandarizar un medio
de cultivo óptimo que garantice una planta sana y con excelente producción.
La importancia de la investigación del efecto de las diferentes concentraciones
de 2ip y BAP en medio MS para la multiplicación in vitro de microtallos a partir
de segmentos nodales, es que daría una posible respuesta a los múltiples intentos
que se han dado en el Proyecto Especial CHINECAS, por encontrar un medio de
 cultivo, que cumpla con los parámetros que se buscan dentro de una
multiplicación de microtallos.
4) Objetivos

4.1. Objetivo general

Evaluar el efecto de las diferentes concentraciones de Isopentenil

adenina (2ip) y Bencilaminopurina (BAP) en medio MS para la
multiplicación in vitro de microtallos a partir de segmentos nodales de
Vaccinium corymbosum. L. (Arándano). cv. Biloxy en el Laboratorio
de Biotecnología del Proyecto Especial CHINECAS.

4.2. Objetivos específicos

a. Evaluar el efecto de Isopentenil adenina (2ip) en medio MS para la

multiplicación in vitro de microtallos a partir de segmentos nodales de
Vaccinium corymbosum. L. (Arándano). cv. Biloxy.
b. Evaluar el efecto de Bencilaminopurina (BAP) en medio MS para la
multiplicación in vitro de microtallos a partir de segmentos nodales de
Vaccinium corymbosum. L. (Arándano). cv. Biloxy.
c. Multiplicar in vitro Vaccinium corymbosum. L. (Arándano). cv. Biloxy
en medio MS suplementado con Isopentenil adenina (2ip) y
Bencilaminopurina (BAP) a partir de segmentos nodales.
d. Determinar la concentración óptima de Isopentenil adenina (2ip) y
Bencilaminopurina (BAP) en medio MS para la multiplicación in vitro
de Vaccinium corymbosum. L. (Arándano) a partir de segmentos
nodales.
5) Hipótesis
Si se utiliza una concentración de 9 ppm de Isopentenil adenina (2ip) y 3 ppm de
Bencilaminopurina (BAP)en la micropropagación de arándano a partir de
segmentos nodales se obtendrá una mayor multiplicación in vitro de microtallos.
6) Diseño experimental. Diseño de investigación
Para el análisis de los resultados se empleará un Diseño Completamente al Azar
(DCA) con 9 tratamientos y un testigo, cada uno con tres repeticiones, para
garantizar los resultados obtenidos en la investigación.
 Teniendo como variable independiente las concentraciones de las hormonas de
crecimiento, tal cómo, se especifica en la siguiente tabla:

Tabla 04. Muestra los valores mínimos (-) y máximos (+) de las
variables 2ip y BAP a evaluar en el proyecto.
-1 0 +1
Variables Nivel Punto Nivel
bajo central alto
2ip 5 ppm 7 ppm 9 ppm

BAP 1 ppm 2 ppm 3 ppm

Se tiene el siguiente diseño para el procedimiento de los experimentos:

Tabla 05. Descripción de tratamientos que

fueron considerados para el proyecto.
DESCRIPCION DE
CLAV
TRATAMIENTO
E
2ip BAP
T0 - -
T1 5 ppm -
T2 7 ppm -
T3 9 ppm -
T4 5ppm 1 ppm
T5 7 ppm 2 ppm
T6 9 ppm 3 ppm
T7 - 1 ppm
T8 - 2 ppm
T9 - 3 ppm

7) Análisis Estadístico
A los datos se les aplicará un análisis estadístico de varianza (ANOVA) y una
prueba paramétrica de rangos de Tukey con un nivel de significancia de 0.05.
Formula del modelo empírico extraído del análisis ANOVA:
Y ij=¿ μ+α +ε
i ij ¿
 Donde:
Yij: Valor observado
µ: Media total
αi: Efecto del factor
εij: Error
i: número de tratamientos
j: número de repeticiones

8) Estrategia de trabajo

 Preparación de material vegetal y de laboratorio

 Obtención de muestra
Las plantas madre utilizadas para el experimento serán proporcionadas por el
Ing. Rubino Mejía. Para todo el proceso se necesitaron 20 plantones de arándano
de la variedad Biloxy, para poder obtener todo el material biológico necesario.

 Limpieza y desinfección
Las ramas escogidas para la propagación serán llevadas al Laboratorio de
Biotecnología. Ahí serán cortadas en fragmentos lavadas con agua corriente y
detergente para remover todo rastro de tierra. Se colocarán las muestras en un
vaso de precipitación para realizar la desinfección de la muestra dentro de la
cámara de flujo laminar, donde pasarán por un proceso de desinfección que
consta en:
Lavado con alcohol al 70% por un periodo de 30 segundos, agitando siempre, se
retirará el alcohol y se enjuagará con agua destilada estéril, posteriormente se
lavará con lejía al 2.5% por un periodo de 2 minutos y medio, luego se retirará la
lejía y enjuagará tres veces con agua destilada estéril.
Los materiales como las placas petri y papel se llevarán al horno (180 ºC) por 50
min. Las pinzas, tijeras, porta bisturí se lavarán enérgicamente con detergente y
agua corriente para retirar cualquier contaminante, para luego pasar por
desinfección en la cámara de flujo laminar, esto se realizará pasando
cuidadosamente por todo el instrumento un algodón humedecido en alcohol al
80% para luego ser expuesto a la llama del mechero, hasta quedar
completamente estéril.
También se prepararán otros materiales como bolsas de polipropileno para la
introducción del medio de cultivo, estas también serán llevadas al horno (180
ºC) por 50 minutos, en paquetes de papel que contienen 33 de estas bolsas.

 Preparación de medio de cultivo.

 Preparación de soluciones Stock
El medio de cultivo que se utilizará será el Murashige & Skoog (MS), que está
compuesta por 5 soluciones concentradas, que contienen macromoléculas,
micromoléculas, vitaminas y FE-EDTA tal y como especifica en la Tabla 01
mostrada anteriormente.
Cada uno de los componentes serán diluidos uno tras otro, verificando la
dilución completa de este antes de agregar el siguiente, así se evitan
precipitados. Las soluciones stock, serán rotuladas y refrigeradas para su
conservación y uso posterior.

 Preparación de Medios de cultivo

Se preparará medio para 9 tratamientos y un control, cada uno con 10 muestras,
y se realizarán 3 repeticiones.
Para esta cantidad de muestras, se preparará 3 L de medio de cultivo, donde se
agregaron 1 L de agua destilada, 300 ml de stock A, luego 150 mL de stock B,
150 mL de stock C, 150 mL de stock D y por último 6 mL de stock E
(vitaminas). A esto se le añadirá azúcar en proporción a 30 g/L para luego
ajustar el pH entre 5.6 -5.8. Aforamos a 3 L.
Los 3 L se separarán en matraces con capacidad de 500 mL, donde se añadirán
300 mL a cada uno. A estos se les añadirá las hormonas respectivas según la
Tabla 05.
Al final se adicionará agar en proporción de 7 g/L, para luego cerrar cada uno de
los matraces con papel aluminio y papel común antes de llevar a la autoclave
(121 ºC a 15 lb) por 15 min.
El medio ya estéril será llevado a la cámara de flujo laminar para ser dispensada
en las bolsas de polipropileno antes esterilizadas, se colocará 10 mL de medio
por cada bolsa, las cuales serán dobladas y cerradas herméticamente con un clip.
Una vez que se hayan dispensado todos los medios, se sacarán todas las bolsas
hacia el anaquel, para que puedan solidificar y comenzar con el sembrado.
  Siembra in vitro
Para la siembra, se utilizará la cámara de flujo laminar, la cual debe estar
previamente desinfectada con lejía al 10%, y con un flujo continuo de aire
estéril. Antes de comenzar el sembrado, se desinfectan las manos con un
algodón humedecido con alcohol al 96%, para luego comenzar con el proceso de
desinfección del material de metal utilizado para la siembra, como se explicó
anteriormente.
Para el proceso de inserción del explante, se retira con las pinzas los segmentos
que están dentro del vaso, para colocarlos sobre el papel estéril, que absorberá el
exceso de agua, luego se cortará con ayuda del bisturí las partes necrosadas o
dañadas de la muestra, cada fragmento tiene que tener una medida aproximada
de 4 cm de largo, que deben contener 4 nudos, se colocaron 3 fragmentos en
cada bolsa, los cuales den estar introducidos a 0.5 cm aproximadamente dentro
del medio.
Las bolsas serán rotuladas con sus respectivas claves, según el tratamiento que
contenga el medio, estas serán llevadas a los estantes dentro de la sala de
incubación donde se mantendrán a una temperatura de 21 ºC y en condiciones de
oscuridad por 8 días, pasado este tiempo, se llevará a fotoperiodos de 16 h de luz
y 8 de oscuridad.

 Monitoreo y evaluación
Todas las evaluaciones se realizarán por observación del explante, para evitar
cualquier tipo de contaminación, todo esto se dará en un periodo de 40 días,
desde el momento de la inserción de los fragmentos. Los parámetros a evaluar
serán los siguientes:

 Numero de microtallos
Después de 10 días, se realizará la primera evaluación del número promedio de
micro tallos, después de esta primera evaluación, se realizarán en periodos de 6
días para poder calcular la tasa de velocidad de multiplicación en el periodo de
40 días.
Como en cada bolsa se tendrá 3 segmentos, al momento de la cuantificación se
sumará la cantidad de brotes desarrollados y se dividir a entre 3, para obtener un
promedio, esto se realizó en cada muestra, por cada tratamiento.
  Altura de microtallos
Esta evaluación se realizará cada 5 días, para esto se empleará una regla
milimetrada, con la cual se medirá cada segmento, desde la unidad propagativa,
proyectando la regla sobre el plástico transparente para luego sacar un promedio
por cada repetición.

 Tasa de velocidad de multiplicación de microtallos

Esta expresa la relación entre el número de microtallos obtenidos al final de la
multiplicación, entre el tiempo de duración del ciclo.
Esto se calculó con la siguiente formula:

Nº de brotes
TVM =
Tiempo(días )

9) Referencias bibliográficas
 Abdelnour-Esquivel, A., (2013). Establecimiento in vitro de arándano
(Vaccinium corymbosum L.). Tecnología en Marcha, pp. 64-71.
 Aitken-Chrisie, J.; Kozai, T.; Smith, M. (1994). Automation and
environmental control in plant tissue culture. Kluwer Academic
Publishers. Dordrecht, The Netherlands.
 Bañados M. 2006. Blueberry Production in South America. Acta
Hort. 715:165-172.
 Cao, X.; Hammerschlag, F.A. (2000). Improved shoot organogenesis
from leaf explants of highbush blueberry. HorScience 35: 945-947.
 Cao, X.; Liu, Q.; Rowland, L.J.; Hammerschlag, F.A. (1998). GUS
expression in blueberry (Vaccinium spp.): factors
influencing Agrobacterium-mediated gene transfer efficiency. Plant
Cell Reports 18: 266-270
 Chandler, C K. and Draper, A. D. (1986). Effect of zeatin and 2ip on
shoot proliferation of three bush blueberry clones In vitro.
HotScience 21:1065-1066.
 Cüce, M. & Sökmen, A., (2015). Micropropagation of Vaccinium
myrtillus L. (Bilberry) naturally growing in the Turkish flora. Turkish
Journal of Biology, pp. 233-240.
 Debnath, S., (2009). Propagation and cultivation of Vaccinium
species and less known small fruits. Latvian Journal of Agronomy,
pp. 22-29.Hine-Gómez, A.
 Debnath, S., McRae KB. 2005. An efficient shoot regeneration
system on excised leaves of micropropagated lingonberry (Vaccinium
vitis-idaea L.). Journal of Horticultural Science Biotechnology, 77
(6): 744-752.
 Fabiani, A., Martínez, C. & Carlazara, G. (2002). Cultivo de
arándano en la zona del Río Uruguay (en línea). Argentina.
Consultado 6 de septiembre 2004. Disponible en http://
www.inta.gov.ar/ediciones/idia/fruta/pdf/arandano.pdf . (Consultado
Marzo 01 de 2019).
 Faotat (Food And Agriculture Organization Of The United Nations
Statistics Division) (2015). [En línea]. Disponible en
www.faostat3.fao.org/home/E. (Consultado Marzo 03 de 2019).
 Finn C., Olmstead J., Hancock J., Brazelton D. (2014). Welcome to
the Party! Blueberry Breeding Mixes Private and Public with
Traditional and Molecular to Create a Vibrant New Cocktail. Acta
Hort. 1017:51-61.
 Fira, A.; Clapa, D.; Badescu, C. (2008). Aspects regarding the in
vitro propagation of highbush blueberry cultivar blue crop. Bulletin
UASVM, Horticulture 65(1):104-109.
 Fisher D.L., Vignolo G., Aldrighi M., Fachnello J., Antunes L.
(2012). Rooting of Blueberry Hardwood Cuttings as Affected by
Wood Type. Acta Hort. 926:273-278
 González, M., López, M., Valdés, A. & Ordas, R., (2000).
Micropropagation of three berry fruit species using nodal segments
from field-grown plants. Annals of Applied Biology, pp. 73-78
 Hammerschlag, F. (2002). A two step pretreatment significantly
enhances shoot organogenesis from leaf explants of Highbush
Blueberry c.v. Bluecrop. HortScience 37 (5): 819-821.
 Hine-Gómez, A. & Abdelnour-Esquivel, A., 2013. Establecimiento in
vitro de arándano (Vaccinium corymbosum L.). Tecnología en
Marcha, pp. 64-71.
 Howell A. (2009). Update on Health Benefits of Cranberry and
Blueberry. Acta Hort. 810:779-784
 INTA (Instituto Nacional de Nutrición y Tecnología de Alimentos).
(2011). Análisis de antioxidantes: Qué y cómo se deben medir.
Consultado 25 octubre 2011. Disponible en
http://portalantioxidantes.com/analisis-de-antioxidantes/ (Consultado
Marzo 02 de 2019).
 KalT W., Forney C. Martin A., Prior R. (1999). Antioxidant capacity,
vitamin C, phenolics, and anthocyanins after fresh storage of small
fruits. J. Agr. Food Chem. 47(11):4638–4644
 Klerk, G. 2000. Rooting treatment and the ex vitrum performance of
micropropagated plants. Acta Hort: 530:277-288.
 Litwin´czuk W., Szczerba G., Wrona D. (2005). Field performance of
highbush blueberries (Vaccinium corymbosum L.) cv. ‘Herbert’
propagated by cuttings and tissue culture. Scientia Horticulturae
106:162- 169
 Madriz, J.P. (1999). Vaccinium: Especies silvestres neotropicales,
perspectivas para la domesticación de nuevos frutales arbustivos en
los bosques montanos del neotrópico. Memorias IX Congreso
Nacional Agronómico, p. 295.
 Mariano S., Williamson J., Olmstead J. (2014). Vegetative Growth of
Three Southern Highbush Blueberry Cultivars Obtained from
micropropagation and Softwood Cuttings in Two Florida Locations.
HortScience 49(5):556-561.
 Meiners J., Schwab M., Szankowski I. (2007). Efficient in vitro
regeneration systems for Vaccinium species. Plant Cell Tiss Organ
Cult 89:169-176
 Mora, H. V., (2010). Organogénesis in vitro de arándano Vaccinium
corymbosum L.. Tesis de Maestría: Instituto Politécnico Nacional,
Michoacán.
 Morrison S., Smagula G., Litten W. (2000). Morphology, growth, and
rhizome development of Vaccinium angustifolium Ait. seedlings,
rooted softwood cuttings, and micropropagated plantlets. HortScience
4:550-570.
 Muñoz, C. (1991). Propagación de las especies de Arándano y
cultivares en Chile. Pp 50. In: Seminario Internacional Arándano.
Talca, Chile 3-4 octubre, 1991.Universidad de Talca. Talca, Chile.
 Ostrolucká, M. G., Libiaková, G., Ondrusková, E. & Gajdosová, A.,
(2004). In vitro propagation of Vaccinium species. Acta Universitatis
Latviensis, pp. 207-212.
 Plata, MI. (1998). Micropropagación de cultivares comerciales de
arándano libres de enfermedades en Argentina. In: Resúmenes del
REDBIO 98. III Encuentro latinoamericano de biotecnología vegetal,
REDBIO`98. La Habana. Pp 91-92.
 Prodorutti D., Pertot I., Giongo L., Gessle C. (2007). Highbush
Blueberry: Cultivation, Protection, Breeding and Biotechnology. The
European Journal of Plant Science and Biotechnology 1(1):44-56
 Rache, L. Y. & Pacheco, J. C., (2010). Propagación in vitro de
plantas adultas de Vaccinium meridionale (Ericaceae). Acta Botanica
Brasilica, pp. 1086-1095
 Rconsulting S.A., (2013). Situación mundial de los arándanos frescos
y procesados y perspectivas próxima temporada 2013/2014. Perú.
 Reed, B. M. & Abdelnour-Esquivel, A., (1991). The use of zeatin to
initiate in vitro cultures of Vaccinium species and cultivars.
HortScience, pp. 1320-1322.
 Ruzic, D., Vujovic, T., Libiakova, G., Cerovic, R., Gajdosova, A.,
(2012). Micropropagation in vitro of highbush blueberry (Vaccinium
corymbosum L.). Journal of Berry Research, pp. 97-103.
 Soto, R. (1993). Efecto de las Características Físicas y Químicas de
Diferentes Mezclas de Sustratos en el Crecimiento de Arándanos en
Maceta. Tesis Ing. Agr. Santiago, Universidad de Chile, Facultad de
Ciencias Agrarias y Forestales.
 Trevisan R., Franzon R., Neto R., Da Silva R., Dias G., Correa A.
(2008). Enraizamento de estacas herbáceas de mirtilo: Influência da
lesão na base e do ácido indolbutírico. Ciênc. Agrotec. 32:402-406.
 Valenzuela, J.; (1988); Requerimientos agroclimáticos de las especies
de arándano; Instituto de investigaciones agropecuarias. Seminario:
 El cultivo del arándano. Estación Experimental Carillanca; Temuco
Chile. 30 de Noviembre y 1 y 2 de Diciembre de 1988.
 Wolfe, DE.; Eck, P.; Chee-kok, C. (1983). Evaluation of seven media
for micropropagation of highbush blueberry. HortScience 18: 703-
705.
 Zhidong Z., Liu H., Wu L., Li Y. 2006. Technical System of
Blueberry Micropropagation in China. Acta Hort. 715:421-425
 Zimmerman, RH.; Broome, O.C. (1980). Blueberry
micropropagation. In: Proceedings of the Conference on Nursery
Production of Fruit Plants through Tissue Culture USDA-SEA, Agr.
Res. Results ARR-NE. 11: 44-47.
 Zimmerman, R.H. (1995). Environmental effects and their control in
plant tissue culture - review. ActaHorticulturae 393: 11-14.
 CutzTax, A. J. (2004). Micropropagación de Tres Variedades de Arándano
(Vaccinium ashei Readel). Guatemala
 Fowler, M., & Warren, G. (1988). Plant Biotechnology.New York:
PergamonPress.
 RodriguezBerault, M. (2010). Propagación de arándanos.Escuel de
Agronomía , Universidad Cáolica de Temuco.
 Rosell, C., & Villalobos, V. (1990). Fundamento teórico-práctico del cultivo
de tejidos vegetales. In FAO. Roma.