Validacion de Metodos Analiticos
Validacion de Metodos Analiticos
Validacion de Metodos Analiticos
La Paz- Bolivia
Pruebas de aptitud
del sistema
Calificacin de los
instrumentos analticos
Validacin de los
mtodos analticos
DEFINICIN
Es el establecimiento de la evidencia
General
METODO
PROCEDIMIENTO
Particular
PROTOCOLO
TECNICA
METODO
Es la adaptacin de una
tcnica para
un propsito especifico
PROCEDIMIENTO
Un procedimiento consiste en
la informacin escrita necesaria
para
la correcta utilizacin de un
METODO
PROTOCOLO :
Un PROTOCOLO es una serie de
direcciones precisas y definitivas que
deben seguirse si se quiere que los
resultados analticos se acepten para
un propsito especfico dado
Documentacin de la validacin
Protocolo de validacin
Realizacin de la validacin
Informe de validacin
Certificado de validacin
Documentacin de la validacin
Protocolo de validacin :
Objetivo
Responsabilidad
Factores crticos
Parmetros a evaluar y metodologa
Muestras
Instrumentos
Mtodos analticos
Criterios de aceptacin
... validacin
tcnica
vlido ?
mtodo
resultado
procedimiento
no vlido ?
protocolo
jr
Documentados
JR
Entorno de trabajo.
oficiales.
Mtodos de Anlisis para Materias Primas.
Se consideran vlidos. No es necesario realizar
ninguna revalidacin a la hora de poner el
mtodo en marcha en cualquier laboratorio.
Estos mtodos han sido sometidos a ensayos
inter-laboratorios para confirmar su buen
funcionamiento.
El equipo
Los reactivos
El muestreo
3 DESARROLLAR EL METODO
Estandarizar el mtodo
Prctico : tiempo,
recursos
4
VALIDAR
Fiable
DETERMINACIN DE ESTABILIDAD DE LA
MUESTRA
Se prepara suficiente cantidad de una muestra homognea
Condiciones
Normales
T emp
40 C
Luz solar
directa
Oscuridad
0 horas
1 hora
2 horas
4 horas
18 horas
- Parmetros cromatogrficos:
Factor de capacidad (K)
Nmero de platos tericos (N)
Factor de asimitra o de cola
Resolucin (R)
-Lmites de deteccin o cuantificacin
K = (tr-to) / to
Valores bajos de K indican que el pico eluye puy prximo
al frente de solvente , pudiendo verse comprometida la
selectividad. Son recomendables valores superiores a 1,
lo ptimo son valores mayores a 2
N 16(tn / wtan )
FA= W0.05% / 2 F
Posibles causas de asimetra:
Muestra sobrecargada, disolvente no apropiado o mal
inyectado
Volumen vacio o suciedad en la columna
Envejecimiento de la columna
p H de la fase mvil
TIPOS DE VALIDACION
Prospectiva : proceso de validacin para
metodologas nuevas
Retrospectiva : para mtodos utilizados a
diario no validados anteriormente y de los
cuales se dispone de suficiente documentacin
para probar la bondad del mtodo
TIPOS DE VALIDACION...
Revalidacin : repeticin total o parcial de una
validacin, por la introduccin de algn cambio que
se espera afecte la bondad de un mtodo ya validado
Aplicacin: Demostrar que el mtodo sigue vlido
- Cambios en la muestra
- Cambio de instrumentos o materiales
- Modificaciones de parmetros analticos
Procedimiento: La revalidacin est determinada
por el criterio , experiencia y conocimiento del
mtodo del analista, siendo fundamental que est
justificada y documentada adecuadamente.
Caractersticas de fiabilidad
Especificidad (USP) Selectividad (IUPAC,AOAC)
Linealidad Rango
Precisin:
Exactitud
Lmite de Deteccin
Lmite de cuantificacin
Robustez
impurezas
Clase C: Para determinar
cuantitativamente la concentracin
Clase D: Para evaluar las
caractersticas, disolucin,
uniformidad de contenido
Clasificacin OMS (Inf. 32, Anexo 5 Validacin de
mtodos analticos)
A
Identificacin
lmite
cuantitativa
lmite
cualitativa
Cuntitativ
as
caractersticas
Exactitud
X*
Precisin
Robustez
Linealidad e intervalo
Especificidad selectividad
Lmite de deteccin
Lmite de cuantificacin
X
X
X
X
Categoras A,B,C,D segn OMS, La USP las clasifica como categora I, II, III, IV
Especificidad / Selectividad
La capacidad de un mtodo para determinar el analito
sin interferencias de impurezas, productos de
degradacin, excipientes u otras sustancias presentes
en la muestra, se relaciona con el trmino selectividad.
SELECTIVIDAD: Capacidad de un mtodo analtico
para medir y/o identificar simultnea o
separadamente los analitos de inters, de forma
inequvoca, en presencia de otras sustancias qumicas
que puedan estar presentes en la muestra
Especificidad
Determinacin
En el estudio de la especificidad, se comparan los
resultados del anlisis de muestras con y sin analito, en
presencia o ausencia de impurezas, productos de
degradacin, sustancias relacionadas y/o excipientes.
La eleccin de la concentracin podra ser la terica de
trabajo para el principio activo y las interferencias a su
lmite permitido, puede evaluarse a partir del anlisis
de 6 rplicas y el grado de discrepancia entre las
determinaciones en presencia o ausencia de las
posibles interferencias, mediante la frmula siguiente:
Determinacin
1)
( Di D s )
% discrepancia
*100
Ds
Donde:
Di = respuesta media con interferencia
Ds = respuesta media sin interferencia
espectrofotometra
Tiempos de retencin estandar y muestra: HPLC
adicionando % de cada posible interferencia (excipiente o
auxiliar de formulacin)
Espectro de Absorcin
A
b
s
o
r
b
a
n
ci
a
ESTANDAR
MUESTRA + EXCP
l Max
Longitud de onda (nm)
PARAMETROS CROMATOGRAFICOS
Parmetros de un Cronograma
Parmetros de un Cronograma
Tiempo Cero
t0
Pico 1
t1
0,72
Base de Pico
Pico 2
t2
1,788
W1
9,289
W2
0,07
Resolucion entre Picos
R=(tn+1-tn)/(1/2(Wn+1+Wn))
Numero de Platos Teoricos
N=16(ti/Wi)2
Conclusion de la Resolucion
Conclusion de la Eficiencia
Conclusion del Metodo para el Pico
R(1,2)
14,99
W3
0,2397
R(2,3)
48,44042622
N1
Pico 3
t3
0,3498
R(3,4)
19,3418151
N2
-85,70611778
N3
10439,00082
24028,23332
29382,1545
Resolucion Aceptable Resolucion Aceptable Resolucion no Aceptable
Eficiencia Aceptable Eficiencia Aceptable Eficiencia Aceptable
Cafeina
Acido Acetilsalicilico Acido Salicilico
16.15
15.90
2
3
4
5
6
16.10
16.00
16.10
16.15
16.10
15.90
15.85
15.90
15.95
15.90
P.a+ Excp
P.A
16.1
15.9
DESVIACION
ESTANDAR
0.0547
0.0316
COEFICIENTE
DE VARIACION
0.34%
0.199%
PROMEDIO
Donde:
Di = respuesta media con interferencia
Ds = respuesta media sin interferencia
Para PFT 2 %
Para impurezas 4 a 5 %
3. Prueba t de student
Para varianzas homogneas.
1. Calcular una estimacin conjunta de la S a partir de las S
individuales
nn 1s 2A nb 1sB2
nA nB 2
2. Calcular t experimental:
x A xB
t
1
1
s
nA
nB
3. Interpretacin de la Hiptesis:
H0: Xa=Xb
Hi: Xa Xb
P.a+ Excp
P.a SOLO
PROMEDIO
16.1
15.9
ESVIACION
ESTANDAR
0.05477
0.03162
NUMERO DE
DETERMINACIONES
Linealidad y Rango
La linealidad es la capacidad del mtodo para
proporcionar resultados que son directamente
proporcionales a la concentracin del analito en la
muestra dentro de un rango establecido.
Siempre que sea posible se buscar una respuesta de
tipo lineal que facilite su trazado, interpolacin e
interpretacin.
El Rango se define como el intervalo entre la
concentracin superior e inferior de analito para el
cual se ha demostrado precisin, exactitud y linealidad
del mtodo descrito
mbito de aplicacin
Se recomienda estudiar la linealidad en todos los
mtodos de tipo cuantitativo :
Valoracin del contenido del principio activo: productos 90110%, materia prima 99-101% las ICH 80-120%
Uniformidad de Contenido: las especificaciones son 85-115%,
se recomienda evaluar entre 70 -130%
Velocidad de Disolucin: se establece un rango de Q+/-20%
Cuantificacin de impurezas: basado en el perfil toxicolgico
de la impureza y la dosis mxima del frmaco en cuestin.
La linealidad debe cubrir el rango desde el lmite de
cuantificacin 50% hasta el 120% del valor nominal de dicho
principio activo
Linealidad
Dos tipos de estudios de linealidad:
Linealidad del Sistema, donde se realizan los
Determinacin
Se recomienda 5 niveles de concentracin y analizar por
triplicado (n=15) Ej: 80, 90, 100, 110 y 120 % del contenido
terico. Estadsticamente lo correcto es analizar las muestras
de forma aleatoria, pero, se establece como criterio prctico
analizarlas en sentido creciente de concentracin.
Lo ideal es hacer pesadas independientes (para preparar las
diferentes concentraciones), ya que a s se elimina el posible
error sistemtico que se podra arrastrar partiendo de una
sola pesada.
No obstante, se acepta una pesada madre y posteriores
diluciones si se asegura una precisin y exactitud en la
pesada madre y en las posteriores diluciones.
Estimadores de la regresin
1. Coeficiente de correlacin r: evala el ajuste al
modelo lineal propuesto y es una medida de la
cercana de las observaciones a una lnea recta.
2. Ordenada al origen a: evala la proporcionalidad
de la funcin analtica. Es una medida del error
sistemtico potencial del mtodo.
3. Pendiente b: constituye una medida de la
sensibilidad del mtodo
4. Coeficiente de determinacin r2 : relacin entre la
variacin explicada, definida por un modelo de ajuste
y la variacin total
Anlisis de Regresin
y
b
bx
Coeficiente de Determinacin
y
. .
.
.
. .
alto
bajo
y
y
r2= 1
x
.
x
x
y
. .
.
. .
y
r2
x
Valores para r :
principios activos
0.997
impurezas
0.980
productos biolgicos
0.950
RESPUESTA
3.5
0.278
3.5
0.224
6.5
0.408
6.5
0.406
10.0
0.620
10.0
0.628
11.5
0.711
11.5
0.722
13
0.797
13
0.796
a= Intercepto
b= Pendiente
r= Coeficiente de correlacin
r= Coeficiente de determinacin.
y= Sumatoria de las Resp. Instrum.
y = Sumatoria del cuadrado
x= Sumatoria de los valores de Conc.
p/c Resp.
x = Sumatoria al cuadrado de los
valores de Conc. p/c Resp.
xy= Sumatoria del producto d los
valores de Conc p/c Resp. Instrumental
por la Resp. Instrumental.
n= N total de respuestas
a= 0.0398
b= 0.0583
r= 0.9975
r= 0.9950
y= 5.59
y =3.53
x= 89
x = 911.5
xy= 56.7165
n= 10
de la
H0: b = 0
Hi: b0
y el resultado es que b0
H0: a = 0
Hi: a0
y el resultado es que a0
tr= tr calculado
tt= valor de tabla de t
student para una p=0.05 y
GL= n-2
tt= 2.306
c.
0.502
0.2520
yj 2
0.814
0.6626
yj 3
1.248
1.5575
yj 4
1.433
2.0535
yj 5
1.593
2.5376
yj Total
5.59
7.063
m=2
d.
e.
f.
Tabla de Anova.
K= N de Concentraciones. K=5
Fuente De Grados de
Variacin libertad
(gl)
Fv
Suma de
cuadrados
(SC)
Fs
SCr
SCr/gl
CM/Cmep
K-2
SCl
SCl/gl
CM
/CMep
n-k
SCep
SCep/gl
Regresin
Linealidad
Error Puro
Ft
1.
ANOVA PARA LA REGRESION:
Valor de tabla F de Snedecor, para un gl para el numerador y (n-k=5), 5 gl para el
denominador, con una probabilidad p=0.05
Fs>>Ft
2. ANOVA PARA LA LINEALIDAD:
Valor de tabla F de Snedecor, para (k-2=3), 3 gl para el numerador y (n-k=5),5 gl para
el denominador, con una probabilidad p=0.05
Fs<Ft
f.
Tabla de Anova.
K= N de Concentraciones. K=5
Fuente De Grados de
Variacin libertad
(gl)
Fv
Suma de
cuadrados
(SC)
Fs
Ft
Regresin
SCr
0.4064
SCr/gl
0.4064
CM/Cmep
1353.33
6.61
Linealidad
K-2
SCl
1*10
SCl/gl
3.33*10
CM
/CMep
1.11
5.41
Error Puro
n-k
SCep
1.553*10
SCep/gl
3.1*10
1.
ANOVA PARA LA REGRESION:
Valor de tabla F de Snedecor, para un gl para el numerador y (n-k=5), 5 gl para el
denominador, con una probabilidad p=0.05 y Ft=6.61
Yi Resp.
3.5
0.244
6.5
0.419
10.0
0.623
11.5
0.710
13.0
0.798
Xi
3.5
0.2607
0.2374
6.5
0.4282
0.4092
10.0
0.6309
0.6147
11.5
0.7199
0.7004
13.0
0.8097
0.7857
Hiprbolas de Confianza
inexacto e
impreciso
Exacto y preciso
preciso
pero
inexacto
Exacto pero
impreciso
Precisin
La precisin expresa el grado de concordancia o grado
de dispersin entre una serie de medidas de tomas
mltiples a partir de una misma muestra homognea .
La procedencia de las muestras pueden ser muestras
reales o preparadas en el laboratorio.
El objetivo del estudio es conocer el mas o menos o la
variabilidad del mtodo de ensayo.
Precisin
Repetibilidad: estudia la variabilidad del mtodo
Repetibilidad
Repetibilidad Instrumental.
Estudia
EJEMPLO
Anlisis realizado por HPLC
No de inyecciones
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Area media
CV (%)
Areas
3503
3517
3510
3504
3506
3504
3506
3504
3509
3507
3507
0.12
Para
especialidades
farmacuticas y
materia prima
suelen aceptarse
valores inferiores
al 1 2 %
Repetibilidad
Repetibilidad del Mtodo.
Determina la repetibilidad de todo el proceso de
Precisin
La precisin de un mtodo analtico se
S
CV (%) *100
X
respuesta ( A)
0.604
0.61
0.599
0.613
0.609
0.611
0.607666667
0.004749269
0.781558247
Precisin intermedia
IFAs y PFT
Especificacion Farmacopeica(%) n=1
n=2
99,0-101,0
0,39
98,5-101,5
0,58
98,0-102,0
0,78
95,0-105,0
1,94
90,0-110,0
3,88
85,0-115,0
5,81
n=5
0,78
1,16
1,55
3,88
7,75
11,63
0,87
1,3
1,73
4,33
8,67
13
ANALISTA
ENSAYO
DIA 1
DIA 2
DIA 3
1
2
3
51.59
49.16
47.27
52.27
49.41
53.35
49.86
47.37
48.00
1
2
3
50.51
52.02
51.11
49.07
50.69
50.67
51.48
53.62
50.25
1
2
3
98.82
97.81
97.88
102.92
101.71
101.42
97.96
98.28
101.57
1
2
3
100.40
102.43
100.99
104.52
103.74
103.42
102.28
102.89
101.09
1
2
3
108.25
108.65
107.43
109.98
110.81
111.78
106.60
107.97
107.11
1
2
3
112.59
110.79
110.41
113.31
116.84
113.00
111.57
110.63
107.83
50%
100%
110%
1.Taller P. INTERMEDIA
INSTRUMENTO
ANALISTA
ENSAYO
DIA 1
DIA 2
DIA 3
1
2
3
X= 49.34
DS= 2.16
CV= 4.37
X= 51.67
DS= 2.03
CV= 3.93
X= 48.41
DS= 1.29
CV= 2.67
1
2
3
X= 51.21
DS= 0.76
CV= 1.48
X= 50.14
DS= 0.93
CV= 1.85
X= 51.78
DS= 1.70
CV= 3.29
1
2
3
X= 98.17
DS= 0.56
CV= 0.57
X= 102.01
DS= 0.79
CV= 0.71
X= 99.27
DS= 1.99
CV= 2.01
1
2
3
X= 101.3
DS= 1.02
CV= 1.01
X= 103.9
DS= 0.56
CV= 0.54
X= 102.08
DS= 0.91
CV= 0.89
1
2
3
X= 108.11
DS= 0.57
CV= 0.62
X= 110.85
DS= 0.90
CV= 0.81
X= 107.2
DS= 0.69
CV= 0.64
1
2
3
X= 111.26
DS= 1.16
CV= 1.04
X= 114.38
DS= 2.13
CV= 1.86
X= 110.01
DS= 1.94
CV= 1.77
Precisin
Intermedia
X=
50.43
DS=
1.84
CV=
3.65
X=
101.12
DS=
2.15
CV=
2.13
X=
110.31
DS=
2.65
CV=
2.4
REPETIBILIDAD:
DETERMINAR
COEFICICIENTE
DE VARIANZA DE
CADA TRIPLICADO
EFECTUADO
PARA CADA
CONCENTRACION
P INTERMEDIA:
DETERMINAR
COEFICICIENTE
DE VARIANZA DE
18 DATOS
EFECTUADOS
PARA CADA
CONCENTRACION
EXACTITUD
La exactitud de un procedimiento analtico expresa la
proximidad entre el valor que es aceptado
convencionalmente como valor verdadero y el valor
experimental encontrado.
Concordancia entre el valor determinado y el valor
verdadero.
Generalmente la recuperacin del analito agregado
sobre un intervalo de concentraciones se toma como
medida de exactitud
GENERALIDADES
No deben confundirse exactitud y precisin.
La precisin esta relacionada con la dispersin de una
serie de mediciones pero no da ningn indicativo de lo
cerca que est del valor verdadero.
Se puede tener mediciones muy precisas pero poco
exactas, sin embargo, para que un mtodo sea exacto se
requiere un cierto grado de precisin.
No siempre se obtienen valores de recuperacin
cercanos al 100 %, ya que esta depende de la matriz
de la muestra, de la efectividad del mtodo de
preparacin y extraccin, y de la concentracin del
analito.
GENERALIDADES
Aplicacin.
Valoracin en materia prima
Valoracin en producto acabado
Cuantificacin de impurezas
Determinacin.
La exactitud debe demostrarse en todo el rango
especificado para el mtodo analtico, se debe realizar
como mnimo 9 determinaciones, sobre 3 niveles de
concentracin del analito, por Ej. 3 determinaciones por
3 niveles de concentracin , que podran ser la
concentracin central y las concentraciones en los
extremos del rango.
DETERMINACION
En funcin del tipo de mtodo a validar y de cada caso
concreto se deber tener en cuenta el rango de
concentraciones de trabajo:
Riqueza de un pa en materia prima o en producto
acabado.80-120%
Impurezas: desde el 50% hasta 120%
Ensayo de disolucin: si se trata de un producto de
liberacin inmediata Q +/- 20%, si se trata de un producto
de liberacin controlada sobre cada lmite de disolucin en
cada perodo de tiempo se aplicar +/- 20 %
La exactitud se expresa en % de recuperacin
III. EXACTITUD
%C
terico
C1
C2
C3
PRO
MEDIO
50
50.27
50.91
50.09
50.42
0.43
0.18
100
99.73
102.95
100.68
101.12
1.66
2.75
110
109.69
112.62
108.62
110.31
2.07
4.29
2. Test G de Cochran
Gs= G calculado
Gt= valor de tabla para una
p=0.05 ; n=3 ; k=3
Gt= 0.7977
2. Prueba de T de Student
Expresar los resultados como %R.
%C terorico
C1
C2
C3
50
100.54
101.82
100.18
100
99.73
102.95
100.68
110
99.71
102.38
98.74
Lmite de Deteccin.
Es la mnima cantidad de analito en la muestra que se
puede detectar aunque no necesariamente cuantificar
bajo las condiciones experimentales. (cualitativo)
APLICACIN
El LD en la evaluacin de impurezas mediante ensayos
lmite.
El LC en mtodos destinados a la determinacin
cuantitativa de impurezas.
Para mtodos de anlisis que se empleen en la
determinacin de impurezas o trazas de p.a.
Permite un mejor conocimiento del mtodo, saber
cuales son los LD y LC es til en el ensayo de
disolucin, determinacin de trazas de p.a. y en la
validaciones de limpieza.
DETERMINACIN
1 Mtodo basado en el examen visual:
La determinacin del LD: CCF aplicado al anlisis de
Pico A
LD 3 veces sup
Lnea basal
ruido
DETERMINACIN
Se prepara un nmero adecuado de muestras,
RANGO: 1-15g/Ml
ECUACION DE LA RECTA :
Y= 200.65x+3.7
Y es la respuesta del equipo
X es la concentracin
200
180
160
140
120
100
80
60
40
20
0
0
0,2
0,4
0,6
[C]g/mL
Respuesta rea
66
120
178
59
126
192
63
130
185
rea
Promedio
62.66
125.33
185.00
DS
rea
3.51
5.03
7.00
0,8
0.3
0.6
0.9
Y AREA PROM.
62.67
125.33
185
ECUACION DE LA RECTA :
CURVA DE CALIBRACION
Y= 203.88x+ 2.0
200
160
AREA m*Aus
180
y = 203,88x + 2,00
R = 0,9998
140
120
100
80
60
40
20
0
0,2
0,4
0,6
[C]g/mL
0,8
0.3
0.6
0.9
Y DS AREA
3.51
5.03
7.0
CURVA DE CALIBRACION
ECUACION DE LA RECTA :
8
Y= 5,81x+ 1.69
y = 5,8167x + 1,69
R = 0,9945
Sbl=1,69.00
DS AREA
6
5
4
3
2
1
0
0
0,2
0,4
0,6
[C]g/ml
0,8
Robustez
Es una medida de la capacidad de un procedimiento
analtico de permanecer inalterado por variaciones
pequeas pero deliberadas del procedimiento y
proporciona una indicacin de su confiabilidad
durante las condiciones normales de uso.
Guias como ICH, USP definen robustez junto con los
parmetros de la validacin, pero no es considerado,
todavia, un requisito necesario para el registro de
especialidades
Robustez
ICH recomienda incluir la robustez en una fase
Robustez
DETERMINACIN
La forma mas eficaz de estudiar la robustez es el diseo
factorial , de esta forma, sin realizar todas las
combinaciones posibles, se puede concluir con un
nmero asequible y razonable de experimentos qu
variables son las que mas influyen en el resultado y en
qu magnitud.
Normalmente se usan dos tipos de diseos factoriales:
Revalidacin
Es la verificacin mediante pruebas documentadas de
que un mtodo analtico previamente validado,
contina siendo suficientemente fiable en el tiempo o
tras realizar modificaciones respecto al mtodo inicial
Es la repeticin total o parcial de la validacin de un
procedimiento para asegurar de que es capaz de
alcanzar los resultados previstos
Revalidacin
Se revalida cuando:
Cambio de uno de los componentes crticos de la
formulacin o cambios en el proceso de fabricacin.
Cambio o remplazo de una pieza crtica en un sistema o
equipo.
Cambio en la composicin del producto.
Unidades producidas fuera de especificaciones en lotes
consecutivos.
Cambio importante en el procedimiento, o cambios en
parmetros analticos.
Comentarios y conclusiones
Los mtodos oficiales de Farmacopea no necesitan
validarse, no obstante, puede ser necesaria una
comprobacin o revalidacin de algn parmetro para
confirmar la validez de los mtodos en casos
concretos.
Los mtodos cromatogrficos se deben ajustar para
cumplir el ensayo de idoneidad del sistema , en dicho
caso se debe demostrar que los ajustes realizados son
los adecuados.